CN101497650A - 一种抗猪蓝耳病的转移因子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天然高效抗猪蓝耳病的转移因子，使用本发明的转移因子可以起到预防猪蓝耳病、保护正常机体细胞免受猪蓝耳病病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭受到猪蓝耳病病毒感染的猪使用该转移因子进行治疗，可以有效改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。该转移因子的制备方法包括：制备病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪、从免疫猪的脾脏中提取抗猪蓝耳病转移因子等步骤。

Description

一种抗猪蓝耳病的转移因子

技术领域

本发明涉及药物及其制剂领域，更具体地说，是涉及一种抗猪蓝耳病的转移因子。

背景技术

猪蓝耳病以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，现已经成为规模化猪场的主要疫病之一。

该病曾称为“神秘猪病”、“新猪病”、“猪流行性流产和呼吸综合症”、“猪生殖与呼吸综合症”、“蓝耳病”、“猪蓝耳病疫”等，我国将其列为二类传染病。

猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒为单股正链RNA病毒，属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。不凝集哺乳动物或禽类红细胞，有严格的宿主专一性，对巨噬细胞有专嗜性。病毒的增殖具有抗体依赖性增强作用，好在中和抗体水平存在的情况下，在细胞上的复制能力反而得到增强。

猪蓝耳病是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。PRRSV只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉及子宫内接种等多种途径而感染病毒，猪感染病毒后2～14周均可通过接触将病毒传播给其他易感猪。从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。易感猪与带毒猪直接接触或与污染有PRRSV的运输工具、器械接触均可受到感染。感染猪的流动也是本病的重要传播方式。持续性感染是PRRS流行病学的重要特征，PRRSV可在感染猪体内存在很长时间。PRRSV可通过血液循环穿过胎盘使胎猪受到感染，从而引起妊娠后期母猪流产等繁殖障碍。

该病的潜伏期差异较大，引入感染后易感猪群发生PRRS的潜伏期，最短为3天，最长为37天。本病的临诊症状变化很大，且受病毒株、免疫状态及饲养管理因素和环境条件的影响。低毒株可引起猪群无临诊症状的流行，而强毒株能够引起严重的临诊疾病，临诊上可分为急性型、慢性型、亚临诊型等。

1、急性型：发病母猪主要表现为精神沉郁、食欲减少或废绝、发热，出现不同程度的呼吸困难，妊娠后期(105～107天)，母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊胎、弱仔。母猪流产率可达50％～70％，死产率可达35％以上，木乃伊可达25％，部分新生仔猪表现呼吸困难，运动失调及轻瘫等症状，产后1周内死亡率明显增高(40％～80％)。少数母猪表现为产后无乳、胎衣停滞及阴道分泌物增多。

1月龄仔猪表现出典型的呼吸道症状，呼吸困难，有时呈腹式呼吸，食欲减退或废绝，体温升高到40℃以上，腹泻。被毛粗乱，共济失调，渐进性消瘦，眼睑水肿。少部分仔猪可见耳部、体表皮肤发紫，断奶前仔猪死亡率可达80％～100％，断奶后仔猪的增重降低，日增重可下降50％～75％，死亡率升高(10％～25％)。耐过猪生长缓慢，易继发其他疾病。

生长猪和育肥猪表现出轻度的临诊症状，有不同程序的呼吸系统症状，少数病例可表现出咳嗽及双耳背面、边缘、腹部及尾部皮肤出现深紫色。感染猪易发生继发感染，并出现相应症状。

种公猪的发病率较低，主要表现为一般性的临诊症状，但公猪的精液品质下降，精子出现畸形，精液可带毒。

2、慢性型：这是目前在规模化猪场PRRS表现的主要形式。主要表现为猪群的生产性能下降，生长缓慢，母猪群的繁殖性能下降，猪群免疫功能下降，易继发感染其他细菌性和病毒性疾病。猪群的呼吸道疾病(如支原体感染、传染性胸膜肺炎、链球菌病、附红细胞体病)发病率上升。

3、亚临诊型：感染猪不发病，表现为PRRSV的持续性感染，猪群的血清学抗体阳性，阳性率一般在10％～88％。

尽管目前市场上有一些抗猪蓝耳病的临床用药，但是现有药剂的争对性不强，疗效有限，而且，治疗性制剂多是发病后采用的，不能起到预防的作用。对于易感染猪蓝耳病的猪群。每年定期的对猪接种猪蓝耳病病毒疫苗是预防猪蓝耳病的有效方法，其次应增强营养或药物干预，提高自身免疫力，通过药物提高机体抵抗力或免疫力也是一种预防猪蓝耳病的有效方法。

转移因子(TF，Transfer Factor)是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物，具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体非特异性细胞免疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发剂，细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。转移因子分子量小、无毒、无抗原性、不起过敏反应，不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点。自美国著名的免疫学专家Lawrence发现和研究转移因子以来，世界各国不但进行了许多理论研究，而且进行了大量的临床应用研究，使得转移因子成为目前应用广泛的增强免疫制剂。

目前已报道的提取的转移因子大多数都是关于非特异性转移因子的制备方法。本发明采用特殊病毒株免疫抗原的方法提取特异性的转移因子，提取方法在已报道的传统方法基础上加以改进，缩短生产时间，简化生产工艺。

采用特殊病毒株免疫抗原提取抗猪蓝耳病病毒的转移因子，具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种天然高效的抗猪蓝耳病的病毒转移因子。

本发明的第一个目的是提供一种简单有效的抗猪蓝耳病转移因子的制备方法，步骤包括：

(1)先用注射用水洗净用猪蓝耳病病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；

(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入1～2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机1000～3000rpm捣碎3～5次，每次3～5min，制得猪脾匀浆液；

(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5～10min；

(4)将步骤(3)中得到的匀浆液用HCl调pH5.0～6.0或者加入0.1～0.3％柠檬酸，4℃，3000～8000rpm离心10～30min，收集上清液；

(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；

(6)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，即得到抗猪蓝耳病病毒转移因子原液，4℃保存。

在具体实施方案中，实施上述步骤之前，步骤还包括制备病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪的步骤。这些步骤，可选用常规技术实施。其中，所述的制备病毒抗原步骤，优选：将猪蓝耳病病毒接种于9～11日龄鸡胚尿囊液30～40℃培养24～72h。取鸡胚尿囊液，-20℃反复冻融4～8次，3000～8000rpm离心10～30min，弃去沉淀收集上清液。其中，所述的猪蓝耳病病毒株选自欧洲株经典毒株LV和北美株经典毒株VR2332。在一个优选实施方案中，猪蓝耳病病毒株选自本申请人保藏的VR2332(Genbankaccession NO.217415)和/或LV(Genbank accession NO.96262)。

所述的提取病毒抗原步骤，优选：上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为10％～80％，150000～200000rpm离心2～4小时，根据猪蓝耳病病毒分子量确定猪蓝耳病病毒所在离心管的位置，吸出备用；

所述的病毒抗原免疫猪步骤，优选：挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫3～5次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫7～10天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20℃保存，备用。

本发明的第二个目的在于提供通过上述方法所制备的转移因子。

在一个优选实施方案中，上述方法使用的猪蓝耳病病毒株选自本申请人保藏的VR2332(Genbank accession NO.217415)和/或LV(Genbankaccession NO.96262)。

由于转移因子是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物，目前并没有明确的组分或结构，制备方法或所用病毒株的不同，所得的转移因子也会差异，因此通常在生产过程中是通过限定制备方法和所用病毒株来明确转移因子。在本发明中，由于限定了具体的制备方法和特异的病毒株，因此所得到的转移因子具有组分稳定、纯度高、活性好等特点，具有很好的应用前景。

技术效果

本发明的一种抗猪蓝耳病病毒的转移因子，具有以下优点：

1、猪脾脏属于屠宰场的下脚料，原料来源容易；

2、组织经组织捣碎机捣碎后，采用大功率的超声波设备处理，缩短反复冻融时间，而且也避免了因高压均质机破壁处理时由于筋膜的存在而堵塞高压均质机；

3、离心前用稀盐酸调节pH，使大部分蛋白絮凝，使得离心后的上清液的澄清度明显好于以前的方法；而且有利用后续的微滤、超滤操作；

4、在匀浆液中加入0.1～0.3％柠檬酸也起到使蛋白絮凝的作用，简化后面的离心处理；

5、本发明既可基于前期的常规病毒抗原免疫步骤，又可优选本发明的免疫步骤，具有灵活高效的优点。

6、所述转移因子的提取方法，显著地缩短了生产时间，简化了生产工艺。

7、提取物经体外生物活性试验及药理、毒性试验等证明，具有纯度高、免疫活性起效快而维持时间长、易吸收、无任何不良反应等特点，其疗效确切，安全可靠，既可治疗又可增强抗病能力。该提取物可做成口服、注射、喷雾等剂型，便于使用。

8、本发明所用的病毒株，属于申请人保藏的VR2332(Genbank accessionNO.217415)和LV(Genbank accession NO.96262)，与常规蓝耳病毒株相比，具有更高的免疫原性，因而采用该病毒株免疫抗原的方法所提取的转移因子，包含特异性好和纯度高的低分子肽与核苷酸复合物，其活性水平明显优于常规方法和常规病毒株所制备的转移因子。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1：抗猪蓝耳病转移因子的制备

1、将猪蓝耳病病毒VR2332(Genbank accession NO.217415)或LV(Genbank accession NO.96262)接种于9～11日龄鸡胚尿囊液37℃培养48h。取鸡胚尿囊液，-20℃反复冻融5次，5000rpm离心30min，弃去沉淀收集上清液；

2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，150000rpm离心4小时，根据猪蓝耳病病毒分子量确定猪蓝耳病病毒所在离心管的位置，吸出备用；

3、得到的猪蓝耳病病毒抗原免疫猪，挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫4次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫7天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20℃保存，备用；

4、从得到的猪脾脏提取抗猪蓝耳病转移因子：

(1)先用注射用水洗净脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；

(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机2000rpm捣碎3次，每次5min，制得猪脾匀浆液；

(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5min；

(4)将(3)中得到的匀浆液用HCl调pH5.0，4℃，5000rpm离心30min，收集上清液；

(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，收集滤出液；

(6)滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；

(7)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤；

(8)分装，4℃保存，即得到抗猪蓝耳病病毒转移因子原液。

实施例2：抗猪蓝耳病转移因子的制备

1、将猪蓝耳病病毒接种于9～11日龄鸡胚尿囊液37℃培养72h。取鸡胚尿囊液，-20℃反复冻融5次，5000rpm离心30min，弃去沉淀收集上清液；

2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为15％、30％、45％、60％、75％，180000rpm离心3小时，根据猪蓝耳病病毒分子量确定猪蓝耳病病毒所在离心管的位置，吸出备用；

3、得到的猪蓝耳病病毒抗原免疫猪，挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫4次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫10天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20℃保存，备用；

4、从得到的猪脾脏提取抗猪蓝耳病转移因子：

(1)先用注射用水洗净脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；

(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机1500rpm捣碎3次，每次5min，制得猪脾匀浆液；

(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理10min；

(4)将(3)中得到的匀浆液用加入0.1％柠檬酸，混匀，4℃，6000rpm离心30min，收集上清液；

(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，收集滤出液；

(6)滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；

(7)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤；

(8)分装，4℃保存，即得到抗猪蓝耳病病毒转移因子原液。

实施例3：对本发明所述工艺制备的抗猪蓝耳病转移因子的检测

对实施例1、2所述工艺制备的抗猪蓝耳病转移因子进行以下检测：

1、紫外分光光度测定：上述所得样品在252±2nm处有一吸收峰，且ABS₂₆₀/ABS₂₈₀>2.0。

2、标准液为淡黄色，pH值在6.0～8.0之间。

3、细菌学检验：上述所得样品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。

4、20％磺基水杨酸检测：上述所得样品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均成阴性，其不含大分子蛋白质。

5、核酸含量测定：上述所得样品经地衣酚法测定核酸含量分别为615.08μg/mL、586.75μg/mL。

6、多肽含量测定：上述所得样品经Lowry法测定多肽含量分别为：7.35mg/mL、6.94mg/mL。

7、转移因子活性测定：根据转移因子可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其受体功能，从而反应转移因子的生物活性。上述所得样品形成E玫瑰花结的百分率分别为31.1％、29.3％，比对照组分别增加20.4％、18.6％(P≤0.01)。

8、过敏性、毒性试验：取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品浓缩液，相当于正常口服剂量的100倍，观察小白鼠的生存能力的变化，结果：无任何过敏、毒性反应，也无任何死亡出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。

9、用猪蓝耳病抗原做皮试检测，有弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。

通过上述实施例，我们发现所提取的抗猪蓝耳病转移因子可以全面抑制猪蓝耳病病毒，能保护正常机体细胞免受猪蓝耳病病毒的感染。因此使用本发明的转移因子可以起到预防猪蓝耳病、保护正常机体细胞免受猪蓝耳病病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭受到猪蓝耳病病毒感染的猪使用该转移因子进行治疗，可以有效改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。

Claims (7)

1、一种抗猪蓝耳病的转移因子。

2、权利要求1所述的转移因子，其制备方法包括：

(1)先用注射用水洗净用猪蓝耳病病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；

(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入1～2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机1000～3000rpm捣碎3～5次，每次3～5min，制得猪脾匀浆液；

(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5～10min；

(4)将步骤(3)中得到的匀浆液用HCl调pH5.0～6.0或者加入0.1～0.3％柠檬酸，4℃，3000～8000rpm离心10～30min，收集上清液；

(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；

(6)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，即得到抗猪蓝耳病病毒转移因子原液，4℃保存。

3、权利要求2所述的转移因子，其中在实施上述步骤之前，还包括制备病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪等步骤。

4、权利要求3所述的转移因子，其中所述的制备病毒抗原步骤，包括：将猪蓝耳病病毒株接种于9～11日龄鸡胚尿囊液30～40℃培养24～72h。取鸡胚尿囊液，-20℃反复冻融4～8次，3000～8000rpm离心10～30min，弃去沉淀收集上清液。

5、权利要求3所述的转移因子，其中所述的提取病毒抗原步骤，包括：上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为10％～80％，150000～200000rpm离心2～4小时，根据猪蓝耳病病毒分子量确定猪蓝耳病病毒所在离心管的位置，吸出备用。

6、权利要求3所述的转移因子，其中所述的病毒抗原免疫猪步骤，包括：挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫3～5次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫7～10天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20℃保存，备用。

7、权利要求1或2或3所述的转移因子，其中猪蓝耳病病毒株选自本申请人保藏的VR2332(Genbank accession NO.217415)或LV(Genbank accessionNO.96262)。