NO137307B - Fremgangsm}te til fremstilling av en sterkt svekket levende rubellavirus-vaksine. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av en sterkt svekket levende rubellavirus-vaksine som har langt mindre bivirkninger enn de man hittil har kjent ved lignende vaksiner.

Rubella eller røde hunder er en meslinglignende infeksjonssykdom som skyldes en infeksjon av rubellavirus, og som er karakterisert ved en svak feber, utslett og lymfekjertel-betennelse, noe som opptrer etter en inkubasjonsperiode på et par uker. Sykdommen har vanligvis ingen alvorlige symptomer hos spebarn og andre barn, men kan være' alvorligere hos voksne pasienter som ofte får leddbetenneIse, leddsmerter og lignende. Spesielt far-lig er det når gravide får denne sykdommen på et tidlig trinn under svangerskapet, ettersom infeksjonen da går forbi morkaken og inn til fosteret, noe som resulterer i en baby med misdannelser, foruten at det ofte opptrer grå eller gronn stær, hjertesvikt og horevanskeligheter. Det er videre kjent at rode hunder vanligvis opptrer sterkt periodevis. Det har derfor vært meget onskelig blant leger å kunne få utviklet en effektiv måte for å bekjempe rode hunder.

Fra det som er nevnt ovenfor, er det innlysende at rode hunder bor bekjempes på enhver måte, og muligheten for en vaksinasjon mot rode hunder har vært undersokt meget inngående etter at Weller et al. og Parkman et al. i 1962 oppdaget det virus som frembringer rode hunder. Som et resultat av disse undersøkelser har man hittil dyrket rode hunder-virus i embnoniske vevskulturer fra pattedyr eller nons, og man har også kunnet vise at nevnte rode hunder-virus kan svekkes gjennom én serie passasjer gjennom nevnte kultur, hvorved man oppnår en grad av virulens som gjor det mulig å inokulere viruskulturen i mennesker som en levende, svekket vaksine, noe som gjor de vaksinerte immune uten alvorlige side-effekter.

Man har videre klinisk kunnet påvise at når en svekket levende rode hunder-vaksine inokuleres hos spebarn og barn, så kan man få frembragt den tilsvarende antilegemereaksjon" uten uheldige kliniske reaksjoner, og~ at de som har oppnådd nevnte antilegemer kan beskyttes mot rode hunder. Fra- tid til annen .har man i laboratorier kunnet isolere rode. hunder-virus fra strupen på vaksinerte personer, men det er kjent at kontaktinfeksjon aldri har blitt påvist hos barn og voksne personer i nærliggende om-råder, ettersom kontaktpersonene aldri har vist kliniske angrep av rode hunder og serologisk bevis på infeksjon av rode- hunder-virus.

Når man på den annen side imidlertid har inokulert de hittil kjente svekkede levende virusvaksiner mot rode hunder ho.s voksne personer, da spesielt-hos kvinner som kan få barn, så har reaksjonene vært- forskjellige fra de som opptrer hos spebarn og barn, og man kan ofte observere såkalte rode hunder-lignende symptomer som feber, utilpasshet, utslett, leddsmerter, leddbetendelse og lignende. Det er derfor stadig et vanskelig problem å inokulere de hittil kjente svekkede levende virusvaksiner mot røde hunder i utsatte voksne pasienter.

Det er videre ikke kjent hvorvidt de kjente vaksiner er fullstendig frie for tendenser til misdannelser hos fostere eller toksiske reaksjoner i dette, når vaksinen inokuleres i svangre kvinner.

Under sammenlignende undersøkelser av mange forskjellige rubella-virusstammer, hvorav noen har vært isolert i forbin-delse med foreliggende oppfinnelse, mens andre har vært gitt av andre undersøkelsesgrupper i verden, har man funnet at visse abnormaliteter tilsvarende de man finner etter en infeksjon av røde hunder hos svangre kvinner, frembringes i avkommet når man inokulerer hunder med en rubellavirus på et tidlig trinn av deres svangerskap .-

Man har videre funnet at blant de prøvede virustyper, har rubellavirus,. stamme To-335, som er en av de som nå har blitt isolert, i alt vesentlig ingen toksisitet hos fosteret, ikke bare hos kaniner, men også hos mus og rotter (se prøver 1 og 2 mer detaljert beskrevet i det følgende). Ved en ytterligere, svekkelse av denne .stamme har man nå oppnådd en sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder som hos voksne personer ikke gir de uønskede bivirkninger som er nevnt ovenfor.

Hensikten ved foreliggende oppfinnelse er å fremstille en sterkt svekket levende rubellavirusvaksine som er ny og effektiv, men som etter vaksinasjon ikke frembringer symptomer som ligner røde hunder og misdannelser eller toksisitet hos fosteret,.noe som har vært meget vanskelig fullstendig å elimi-' nere fra de hittil kjente.virusvaksiner mot røde hunder. Videre er det ønskelig å oppnå en fremgangsmåte som er lett å gjennom-føre og økonomisk rimelig.

Videre er det en hensikt å fremstille.et produkt som ved bruk representerer en effektiv og tryggere immunologisk måte for å. hindre at voksne personer, da spesielt kvinner som kan få barn, infiseres av rubellavirus uten at det skapes misdannelser hos fosteret eller toksisiteter hos dette, samt uheldige reaksjoner rent generelt.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således, tilveiebragt en fremgangsmåte til fremstilling av en sterkt svekket levende rubellavirusvaksine ved hvilken man underkaster en stamme av rubellavirus, som har vært underkastet minst 10 gangers passasje, ytterligere dyrkningspassasjer i en vevskultur inneholdende levende celler av et varmblodig dyr, hvilke celler har evne til å understøtte viruset, ved en temperatur på fra 28-36°C inntil det er oppnådd ønsket svekkelse, hvoretter den således svekkede levende virus inkorporeres i en fysiologisk akseptabel bærer for frembringelse av en rubellavirus-titer på 2 0 2 5 4-5

minst 10 ' og fortrinnsvis.10 ' -10 ' InD^/ml eller utvinnes med angitte rubellavirus-titer.fra dyrkningsmediet etter fraskillelse av faste stoffer, og- denne fremgangsmåte er kjenne-tegnet ved at det som stamme av rubellavirus anvendes stammen To-336, deponert i American Type Culture Collection, Maryland, USA, under nr. ATCC-VR-553.

Rubellavirusstamme To-336 er blitt isolert fra•en prøve tatt fra strupen på en pike som hadde røde hunder i Japan. Stamme To-336 inokuleres således i en vevskultur inneholdende egnede primære celler av et varmblodig.dyr, og inkuberes stasjonært eller i. bevegelse ved en temperatur mellom 28 og 36°C~ (vanligvis fra 29 til 32°C) i tidsrom fra 5 til 10 dager (vanligvis ca. 1 uke) ,. hvoretter den oppformerte virus overføres til en ny vevskultur inneholdende.primære celler av den type som er nevnt ovenfor.for en ny dyrkning. Svekkingen skjer meget raskt etterhvert som dyrkningen gjentas suksessivt. Cellene for vevskulturen kan egnet velges blant vev eller, celler av varmblodige dyr, f.eks. pattedyr og hønsefugler, og kan eksemplifiseres ved primære.nyreceller av forskjellige dyr (slik. som aper, kveg, svin, hunder og kaniner), embryoceller fra forskjellige fugler (som kyllinger eller ender) og lignende.

For selve serie-dyrkningspassasjene kan man også anvende diploide cellekulturer fra menneskefostere.

Alternativt kan stamme To-336 inokuleres i foster-hinnehulrommet i et embryonert egg (f.eks. på den 7. eller 8. dag etter legging av et hønseegg eller andeegg) og inkuberes ved temperaturer fra 3 0 til 36°C i. tidsrom fra 7 til 10 døgn.. Den inokulerte fosterhinne blir så fjernet aseptisk og behandlet i et egnet medium slik som Hanks' balanserte saltoppløsning (beskrevet detaljert nedenfor) eller lignende, hvorved man får fremstilt en ca. 10 % suspensjon, som så sentrifugeres for å utskille den ovenstående væske. Denne væske vil inneholde oppformet virus og kan underkastes fornyet dyrkning på samme måte.som nevnt ovenfor, hvorved man får en rask svekking.

For en ny dyrkning med en vevskultur eller et embryonert egg kan kulturvæsken fra .den forutgående dyrkning vanligvis fortynnes ca. 10 ganger pr. volum, og den fortynnede væske anvendes som en frøkultur for videre inokulasjon. Hvis det imidlertid er ønskelig, kan man anvende en ikke-fortynnet kulturvæske.eller man kan eventuelt anvende den såkalte begrensende fortynningsmetode. En eller flere kulturer i fosterhinnehulrom hos egg kan følges av en eller flere dyrk-ninger med en vevskultur inneholdende primære celler av et varmblodig dyr eller diploide celler fra mennesker, og vice versa.

I anvendte kulturmedia kan man tilsette antibiotika, et eller flere, slik som streptomycin, -dihydrostreptomycin, neomycin eller penicilliner, slik at man kan hindre at kulturen blir forurenset ved en tilfeldig forurensning av andre mikro-organismer.

På en slik måte som er beskrevet ovenfor kan rubella--virus stamme To-336 underkastes gjentatte dyrkningspassasjer inntil det er bekreftet at virusen er tilstrekkelig svekket, noe som kan skje ved en forsøksvis inokulering i et sero-negativt menneske som er mottagelig for rubellavirus.

Den således svekkede stamme To-336 brukes som frø-kultur for fremstilling ifølge oppfinnelsen av den sterkt svekkede rubellavirusvaksine. Selve frøkulturen kan inokuleres i et kultursystem valgt fra de som er beskrevet ovenfor og som kan brukes for svekkingen av nevnte virus. Man kan bruke samme system eller et annet system enn det man anvendte for svekkingen av nevnte virusstamme. Ved valg av vevskultur for fremstilling av vaksinen, er det anbefalt at virusen får formere seg i et kulturmedium som ikke inneholder slike stoffer som måtte kunne virke som et antigen når den resulterende vaksine inokuleres i menneskekroppen.

Fra den således fremstilte kulturvæske blir faste stoffer slik som celler, cellefragmenter og lignende fjernet, f.eks. ved filtrering eller sentrifugering, hvoretter filtratet eller den overliggende væske kan brukes som sådan, eller det kan fortynnes med et egnet fortynningsmiddel, slik som en fysiologisk saltoppløsning eller destillert vann, avhengig av dets

virustiter.

Den således fremstilte sterkt svekkede virusvaksine mot røde hunder kan brukes, som sådan, men kan også konserveres i frossen form med eller uten tilsetning av et eller flere stabilisering.smidler slik som sukrose, laktose, glutamater, fosfater og lignende. Alternativt kan den lyofiliseres med eller uten tilsetning av et eller flere stabiliseringsmidler slik som mehneskesefumalbumin, gelatin og^ lignende for videre lagring, og det lyofiliserte produkt kan oppløses når det skal brukes med et egnet fortynningsmiddel slik som en fysiologisk saltoppløsning elier sterilt destillert vann.

For å oppnå en tilfredsstillende vaksinasjon, vil det vanligvis være n■ ødvendig å inok■ ulere minst 10 2 0InD50 (50% interfererende dose) virustiter pr. person, fortrinnsvis subku-tant på én gang. Spesielt foretrukket dose er 10 ' til 10 ' InD^Q. En høyere dose øker ikke risikoen for uønskede bivirkninger ettersom vaksinen er-sterkt svekket og dermed meget sikker, men det vil vanligvis være meningsløst å anvende så høy dose ettersom man ikke oppnår særlig- økning med hensyn til den ønskede vaksinasjonseffekt.

For en subkutan inokulasjon kan en dose av den nød-vendige virustiter være tilsatt en vandig sammensetning med et volum fra 0,1 til 1,0 ml, fortrinnsvis fra 0^25 til 0,5 ml. Således kan den fremstilte vaksinen justeres ved bruk slik at den omfatter den sterkt svekkede rubellavirus-stamme To-336 i en virustiter mot røde hunder i en mengde på minst 10 2 ' oInD,-n/ ml, fortrinnsvis'og ønskelig 10 ' til 10 ' InD^g/ml, samt et fysiologisk akseptabelt bærestoff eller fortynningsmiddel.

Når den sterkt svekkede virusvaksine mot røde hunder inokuleres i spebarn og mindre barn, kan man observere en etter-følgende bemerkelsesverdig økning i nivået av antilegemer i serumet, noe som vel hindrer én infeksjon av rubellavirus. Når vaksinen anvendes på_voksne personer, inkludert kvinner som kan få barn., kan man også observere en økning av serumantilege-mer i blodet, og det er bemerkelsesverdig at man ikke kan observere noen av de rubella-lignende symptomer som anses far å være uønskede bivirkninger, og som ofte opptrer ved en vaksinasjon med de hittil kjente virusvaksiner mot røde hunder. Den fremstilte nye og sterkt svekkede virusvaksine mot røde hunder kan således brukes trygt selv for voksne pasienter som- effek-tivt skal immuniseres mot en infeksjon av rubellavirus.

Sikkerheten ved den sterkt svekkede virusvaksine mot røde hunder vil ytterligere bli forklart ved hjelp av eksempler i de følgende prøver. Deretter vil den. foreliggende oppfinnelse bli mer detaljert beskrevet ved hjelp av en del eksempler.

Prøve 1 ( Fostertoksisitetsprøve hos kaniner) ;

Friske 8 måneder gamle japanske hvite hun-kaniner

ble parret, og 8 dager etter besvangringen ble 1,0 ml av en prøve inokulert i et øre på de svangre kaninene. Som prøver anvendte man følgende:

(a) - Infisert vevskulturvæske fra en ikke-svekket rubellavirus-stamme To-336, kultivert 3 ganger i nyreceller fra cercopithecus aethiops (afrikansk apeart, heretter betegnet "AGMK"), (b) Sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder fremstilt ifølge eksempel 1, mer detaljert beskrevet nedenfor, (c) Infisert vevskulturvæske av ikke-svekket rubellavirus Brown stamme"^ , kultivert 5 ganger med AGMK-celler (positiv kontroll), og (d) Ikke-infiserende vevskulturvæske av AGMK-celler (negativ kontroll).

Etter en normal fødsel ble kaninungene observert i

30 døgn, hvoretter de overlevende ble obdusert for makroskopiske

og histopatologiske observasjoner. Resultatene av observasjonene er angitt i tabell 1.

I gruppe (c) hvor mødrene ble infisert med rubella-virus Brown stamme, overlevet bare^ syv kaninunger av femtiåtte fødte, og blant fire av de syv overlevende kunne man observere typiske misdannelser som grå stær, irisdefekter, ugjennomskinne-. lighet i cornea, kapillære angrep i cornea, staftylomi og mikroftalmi, enten bilateralt eller unilateralt. I de andre gruppene (a), (b) og (d) overlevet henholdsvis 58, 56 og 61 kaninunger, alle uten misdannelser.

I gruppe (c) hvor mødrene var infisert med rubellavirus Brown stamme, fant de fleste 51 dødsfall sted innen tre døgn etter fødselen, og dødeligheten blant de kaninunger som overlevet syv dogn. etter fodselen, . var den samme som i de andre gruppene..

Prove 2 ( Fostertoksisitetsprbve hos mus og rotter) :

Friske 10 til' 12 uker gamle hunnmus ..(CF-l.) og rotter (Spragué Dawley) ble parret henholdais, og fem dogn etter besvangringen ble InD^ Q 10 ' /0,2 ml av en vevskulturvæske av rubella-virus, stamme To 336, kultivert '3 ganger med AGMK-celler, inokulert intravenost i de svangre dyrene. Dagen for den forventede fodsel, dvs. på den 19. 'svangerskapsdag for musene og den 21. dag for rottene,' ble de operert med keisersnitt, og fostrene ble tatt ut og underkastet en makroskopisk- observasjon, heri innbefattet en skjelettfarging med Dowsons metode (se Dowsons,' A.B., Stain Technology, 1, 123 til 124 (1926)), og histopatologiske undersok-eiser av bynene og hbresystemet. Som en negativ kontroll ble en kontrollgruppe tilfort ikke-infiserende vevskulturvæske. Resultatene av observasjonene sammenlignet med den negative- kontroll, er angitt i tabell 2, og det fremgår at de mbdrene som var infisert med stamme To-336 ikke gav opp-hav til unormale fostere.

Prove ^ ( Inokuleringsprbve med ap. er) :

Tre grupper som hver bestod av fem friske afrikanske aper av ovennevnte type, ble henholdsvis, inokulert med den sterkt svekkede virusvaksine mot rode hunder produsert som angitt i eksempel 1, og som viser en virustiter på minst 10^'^ InD^^/ml: (a) intratalamisk (1,0 ml, dvs. 0,5 ml til hver hemi-sfære ),

(b) intraspinalt (0,2 ml), og

(c) intramuskulært (1,0 ml).

Apene ble observert i 28 dogn, og deretter underkastet en histopatologisk undersbkelse,. og man kunne ikke. finne noen misdannelser eller abnormaliteter.

Prove- 4 ( Sikkerhetsprbve) :

Den sterkt svekkede virusvaksine mot rode hunder frem-.stilt ifolge eksempel 1, ble underkastet prover på den måten som er -beskrevet i avsnitt. 73,114 av Public Health Service Regulation.: tittel 42, del 73, U.S.A., for sikkerhetsprover for "p-oliomyeliti; ■ vaksine, levende, oral," og på den måte som er beskrevet i avsnitt 73,73 i samme bestemmelser for sterilitetsprbver. Som et resultat av inokuleringsprbver i forskjellige ..iyper .dyr " (f. eks. kaniner, voksne mus, musunger og marsvin), vevs-kulturprbver med forskjellige typer primære celler (f.eks. nyrer av aper., menneskeamnion, . menneskenyre-r og .kaninnyrer) og negative prover med fremmede midler, ble det bekreftet- at den provede vaksine tilfredsstillet ethvert krav stilt i ovennevnte reguler-ingsbestemmelser.

Eksempel 1

Nyren ble fjernet aseptisk fra friske afrikanske aper av den-type som er nevnt ovenfor. Nyrene (AGMK) ble vasket med Hanks balanserte saltopplbsning ^ og deretter knust. Det knuste vev ble suspendert- i ca. 50 ganger, sitt eget volum av en 0,25 $ trypsin-supplementert Hanks opplbsning, og ble så videre nedbrutt under roring. De resulterende frie celler ble oppsamlet ved en sentrifugering ved 1.000 r.p.m. i 5 minutter, og fortynnet med en

5)

slik-mengde av en laktalbumin Hanks opplosning , som var til-, fort 5 i° inaktivert kalveserum, at den resulterende cellesus-pensjon inneholdt ca. 5 x 10 celler pr. milliliter. Suspensjon-en ble inkubert' stasjonært i Roux-kolber ved 36°C. Etter 7 dager da cellene hadde festet seg og oppformert seg på innerveggen av kolbene, ble cellene vasket tre ganger med et TC-medium 199 6), hvorved man fikk fremstilt et AGMK-cellekulturmedium.

En frbkultur av rubella-virus, stamme To-336, ble inokulert i cellene og absorbert på disse ved 37°C i 90 minutter. Deretter ble., væsken kastet og cellene vasket tre ganger med TC-medium 199. Til slutt ble 40 ml Tc-medium 199 som var tilsatt 2 io inaktivert kalveserum tilsatt kolbene, og inkuberingen utfort

ved 32°C i 7 dogn. Kulturvæsken ble så sentrifugert ved 3.000 r.p.m. i 5 minutter, hvorved man fikk fremstilt en supernatant eller overliggende væske som så kan brukes som frokultur for neste kultivering etter en fortynning 10 ganger pr. volum med

TC-medium 199.

På denne måte ble AGMK-vevskulturen kultivert 24 ganger etter isoleringen av den ville stamme TO-336, hvorved man oppnådde en froviruskultur for fremstilling av en virusvaksine mot rode hunder. Denne froviruskultur ble inokulert i cellene som som ble inkubert i 40 ml ser-umfritt TC-medium 199 ved 32°C i 7 dogn. Kulturvæskene ble oppsamlet og umiddelbart frosset for lagring ved -70°C.. Ytterligere 40 ml friskt serumfritt TC-medium 199 ble tilsatt til de gjenværende kulturceller r og inkuberingen ble fortsatt ved 32°C i 24 timer. Kulturvæskene ble igjen oppsamlet og frosset. Denne fremgangsmåte ble gjentatt opptil den lo. dag etter inkuberingen. Alle de frosne kulturvæsker ble raskt opptint, slått sammen og sentrifugert ved 3-000 omdreininger pr. minutt i 5 minutter, for derved å'få utskilt den overliggende væske som' er en sterkt svekket virusvaksine mot rode hunder. Denne væske viser en virustiter mot rode hunder på 10 ' InDcr./ml målt

7) 50'

med ECHO-ll''-systemet og i AGMK.

Produktet ble frosset for lagring ved -70°C. Etter 100 dbgns lagring ble det opptint og fortynnet 3 ganger méd en fysiologisk saltopplosning. Den fortynnede vaksine ble subkut-ant inokulert i en arm, hvorved man fikk frembragt den for-ønskede immuniseringseffekt såvel hos voksne som hos barn og spebarn.

Bemerkninger:

4) Hanks balanserte saltopplosning består av fblgende bestanddeler: destillert vann (trippeldestillert), i en mengde til totalt 1 liter. . 5) Laktalbumin Hanks opplbsning ble fremstilt ved'å opp-lose 5 g laktalbuminhydrolysat i Hanks balanserte saltopplosning. til totalt 1.000 ml. 6) TC-medium 199 er en steril vandig opplosning justert til pH 7,2 inneholdende aminosyrer, purinbaser, pyrimidinbaser, vitaminer, sukkere, nukleotider, uorganiske salter, etc-. Detaljert sammensetning er blant annet angitt i Morgan, J.P. et al, Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 73 sidene 1 til 8 (1950). 7) EC.HO-11 betyr ECHO-virus type 11 (Gregory-stamme), den stamme som oftest brukes for infeks.j onsproven med rode hunder-virus.

Eksempel 2

Andeembryo (heretter betegnet "DE") ble aseptisk fjernet fra eggene etter 13 dogns ruging og etter fraskjæring av hodene bearbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1, hvorved man fikk., fremstilt et DE-cellekulturmedium i Roux-kolber. Dette kulturmedium ble inokulert med en frbkultur av rubella-virus, stamme To-336, kultivert 20 ganger med AGMK-celler slik det er beskrevet i eksempel 1. Dette inokulum ble inkubert under samme betingelser som angitt i eksempel 1. Kultiveringen med DE-cellekulturen ble utfort 4 ganger, og kulturvæsken etter den fjerde kultur ble sentrifugert, hvorved man oppnådde en froviruskultur for fremstilling av en virusvaksine mot rode hunder.

Froviruskulturen ble inokulert i DE-cellene i Roux-kolber og bearbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1 ved å bruke et serumfrii;t medium TC 199, hvorved man fikk fremstilt en sterkt svekket virusvaksine mot r':de hunder. Vaksinen viste etter siste sentrifugering en rode hunder-virustiter på 10^'^ InD^ø/ml målt med samme system som angitt i eksempel 1.

På samme måte som angitt i eksempel 1 ble produktet frosset for lagring og deretter opptint og brukt for vaksinasjon, hvorved man fikk en tilfredsstillende immunisering såvel hos voksne og barn og spebarn.

De DE-celler som her ble brukt som her ble brukt som vevskultur fer vakaineprodulsjonen og kultiveringen, er negative i Cofal-prbven (for referanse se Sarma, P.S. et al, Virology, 23, side 313 «t seq. (1964)).

Eksempel 3

Nyrer aseptisk fjernet fra friske kaniner (heretter betegnet "RK") ble opparbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1 for fremstilling av et RK-cellekulturmedium i Roux-kolber. Kulturmediet ble inokulert med en frøkultur av rubellavirus, stamme To-336, kultivert 5 ganger med AGMK-celler som beskrevet i eksempel 1. Inokulumet ble inkubert under samme betingelser som angitt i eksempel 1. Kultiveringen med RK-cellekulturen ble gjentatt 54 ganger, og kulturvæsken etter den 54. kultivering ble sentrifugert, hvorved man oppnådde en frøviruskultur for fremstilling av en virusvaksine mot røde hunder.

Frøviruskulturen ble inokulert RK-cellene i Roux-kolber og bearbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1, idet man anvendte et serumfritt TC-medium 199, slik at man fikk fremstilt en sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder. Den vaksine som ble oppnådd ved siste sentrifugering, viste en røde hunder-virustiter på 10 4 ' 2 InD^g/ml, slik det kunne bedømmes med samme system som angitt i eksempel 1.

På samme måte som i eksempel 1 ble produktet frosset for lagring og deretter opptint og brukt for vaksinasjon, og man oppnådde tilfredsstillende immunisering såvel hos voksne som barn og spebarn.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en sterkt svekket levende rubellavirus-vaksine ,hvorved man underkaster en stamme av rubellavirus, som har vært underkastet minst 10 gangers passasje, ytterligere dyrkningspassasjer i en vevskultur inneholdende levende celler av et varmblodig dyr, hvilke celler har evne til å understøtte viruset, ved en temperatur på fra 28-36°C inntil det er oppnådd ønsket svekkelse, hvoretter det således svekkede levende virus inkorporeres i en fysiologisk akseptabel bærer for frembringelse av en rubellavirus-titer på minst 10 2 ' 0 , fortrinnsvis 10 2 ' 5 -10 4 ' 5 InD^/ml, eller utvinnes med angitte rubellavirus-titer fra dyrkningsmediet etter fraskillelse av faste stoffer, karakterisert ved at det som stamme av rubellavirus anvendes stammen To-336, deponert i American Type Culture Collection, Maryland, USA, under nr. ATCC-VR-553.