DK170061B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af modificerede stammer af viral kvægdiarrevirus samt fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine mod infektion med viral kvægdiarrevirus - Google Patents

Description

DK 170061 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt modificeret stamme af viral kvægdiarrévi-rus (BVD) , der er egnet til vaccinationsbrug, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne, 5 samt en fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine mod infektion med viral kvægdiarrévirus, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 6's kendetegnende del angivne.

Viral kvægdiarrésygdom er en af de mest udbredte og økonomisk vigtige kreatursygdomme. Den blev først registreret i USA 10 (Olafson et al., Cornell Vet. 36:205-213, 1946), da hjordudbrud af et akut, hyppigt dødeligt kvægpestlignende syndrom med kroniske sårdannelser i fordøjelsesslimhinden samt diarré konstateredes. Samtidig blev lignende tilfælde med variationer i graden af alvorlighed, kronicitet og udbredelse be-15 skrevet og omtalt som slimhindesygdom (Ramsey F.K. et al.,

North Am. Vet. 34:629-633, 1953). I nogen tid blev det antaget, at flere forskellige infektioner var til stede. Det blev til sidst konkluderet, at det samme virus var ansvarligt for begge syndromer, men dette skete ikke før efter, at begge 20 udtryk var blevet rodfæstet i litteraturen, og udtrykket slimhindesygdom var almindeligt brugt. I overensstemmelse med fortrinsret blev sygdommen kaldt viral kvægdiarré.

Det etiologiske BVD-stof er et RNA-virus, der klassificeres som et pestvirus inden for familien Togaviridae (Andrewes C.

25 et al., Viruses of the Vertebrates, 4. udgave, London;

Bailliere Tindall, 1978).

Manifestationerne af kliniske sygdomme i marken varierer betydeligt. Generelt efterfølges en inkubationstid på 7-11 dage af en et- eller tofaset pyrexi på 39,5-41,5°C, anorexi og 30 diarré. Undertiden udvikler diarreen sig til udtømning af udfordøjet føde, blodfnugget slim og difteristrenge ledsaget af voldsom tenesmus. På trods af en samtidig forøget tørst bliver dyrene dehydrerede og mister hurtigt kondition.

Selvom BVD hovedsaglig er knyttet til en infektion i fordøjelseskanalen, har det været antaget, at rækkef ølgen af symptomer 2 DK 170061 B1 sædvanligvis begynder med inddragelse af åndedrættet. En serøs eller slimet nasal udtømning, der senere bliver materiehol-dig, tillige med forøget respirations sekvens og hoste (S.P. Rosner,

Iowa Vet. 35: 11-14, 1964). Talrige forfattere har også om- * 5 talt nasal udtømning, der udvikler sig fra at være serøs til at være materieholdig slim.

De væsentligste patologiske ændringer, der er forbundet med sygdommen, er hyperæmi, blødning, ødem, erosion og sårdannelser i fordøjelsesslimhinden. Forøget blodtilførsel· i slimhinde-10 overfladerne i åndedrætskanalen iagtages også tillige med lungeødem. En vidtgående formindskelse af blodets antal af hvide blodlegemer forekommer sædvanligvis, især i de tidlige infektionstrin. Samlede optællinger af hvide blodceller viste sig at vende tilbage til normale niveauer ca. 14 dage efter 15 eksperimentel podning (Scott F.W. et al., Cornell Vet. 63: 536-560, 1973).

På denne baggrund antog Mills J.H.L. et al. (Am. J. Vet. Res.

29: 1367-1375, 1968), at "overførsel ad respirationsvejen er en mulig spredningsmåde".

20 Medfødt immuno tolerance overfor BVD-infektion har været anklaget som en potentiel årsag til den sjældent dødelige sygdom, og det vides, at immunoundertrykkelse fremkaldt af corticoid-behandling forstærker virulensen af kunstig infektion med BVD. De immunoundertrykkede dyr bukker ofte under for en 25 almindelig udbredt viræmi (Rohde, G. el al., Zbl. Vet. Med.

17 B: 686, 1970, og Shope R.E. et al., Can. J. Comp. Med., 40:355-359, 1976).

* Når først åbenlyse kemiske tegn iagtages i en hjord, er infektionen sædvanligvis veletableret i angrebne individuelle 30 dyr og i hjorden. Bestemte terapeutiske foranstaltninger står ikke til rådighed til behandling af kliniske tilfælde.

Hvis angrebet er alvorligt, bukker de sædvanligvis under.

Hvis angrebet er mildt, kan helbredelsen fremskyndes ved 3 DK 170061 B1 hjælp af antibiotika til bekæmpelse af sekundær infektion.

Under sædvanlige bedriftsbetingelser har forsøg på at bevare en "lukket hjord" vist sig utilstrækkelige til at hindre infektion med BVD-virus. Præventive metoder er derfor i det 5 store og hele baseret på vacciner.

Der er sket betydelig undersøgelse af inaktiverede vacciner (McClurkin A.V. et al., Pro. US Anim. Healt Assoc. 79:114-123, 1975). Indtil nu er disse ikke kommercielt tilgængelige. 10 Deres praktiske anvendelse forringes af manglen på en passende metode til fremstilling af acceptable doseringsformer til indgivelse af påkrævede antigeniske mængder på en økonomisk acceptabel måde.

15 Visse kommercielle levende BVD-vacciner kendes. Som omtalt af R.M. Phillips et al. (Am. J. Vet. res 36: 135-140, 1975) 'tekete den tidlige udvikling af vaccine til bekæmpelse af BVD på grundlag af fortyndning af det virale middel ved hjælp af rækkevise passager i kaniner eller i kvægnyrecellekulturer. 20 Disse vacciner viste sig effektive til forhindring af virale BVD-infektioner i kreaturer, men der blev rapporteret om komplikationer efter vaccination". I den samme artikel beskrev forfatterne også udviklingen af en svinecelleliniefortyndet levende BVD-virusvaccine.

25

Ikke desto mindre fjerner de til rådighed stående levende BVD-vacciner ikke de andre iboende risici ved de tidligere kendte vacciner (Terpstra, C., Eikelenboom, J.L. og Glas, C., Proceedings og the Xllth world congress on diseases of 30 cattle, vol. 1:177, 1982).

Flere plausible årsager, bortset fra virulensen af selve vaccinestammen, har været postuleret i forsøg på at forklare de alvorlige postvaccinale komplikationer, der forekommer med varierende hyppighed på området. Ikke desto mindre 4 DK 170061 B1 « er deres oprindelse vanskelig at fastslå, og vaccinerne har været draget alvorligt i tvivl.

Den foreliggende opfindelse går uden om risiciene ved de i dag kendte levende BVD-vacciner ved angivelse af modificere-5 de stammer, der er temperaturfølsomme (ts) mutantstammer af BVD-viruset, d.v.s stammer, der udviser en formeringsevne, der er temmelig begrænset ved dyrets legemstemperatur, men som er i stand til at fremkalde immunitet hos kvæg uden alvorlige bivirkninger.

10

De ifølge opfindelsen fremstillede modificerede stammer fremstilles ved hjælp af mutagenese af BVD-virusstammer, nærmere betegnet ved behandling af en BVD-virusstamme med et kemisk mutagen, såsom salpetersyrlingbehandling af et BVD-virus, der 15 er isoleret fra et inficeret dyr, f.eks. en BVD-stamme af vild type, der er isoleret og i overensstemmelse med reglerne i den europæiske patentkonvention (EPC) deponeret i " Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" i "Institut Pasteur" i Paris den 20. juli 1982 under accessionsnummeret 20 1-198.

Mutagenese ved hjælp af kemiske midler er en metode, der kendes, og kemiske midler, som vides at fremkalde mutagenese, og som kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge den forelig-25 gende opfindelse, er f.eks. foruden salpetersyrling som ovenfor anført N-methyl-N-nitroso-N-nitroguanidin, methylmethan-sulfonat, ethylmethansulfonat, 5-bromuracyl, 2-aminopurin, , hydroxylamin og acridinfarvestoffer, såsom 5-aminoacridin og proflavin. Nærmere betegnet beskriver USA patentskrifterne 30 nr. 3.907.986 og nr. 3.962.424 fremstillingen af temperaturfølsomme virusmutanter ved hjælp af salpersyrlingbehandling samt anvendelsen af nævnte mutanter til fremstilling af levende virusvacciner, der kan anvendes til forhindring af åndedrætssygdomme hos kreaturer. Ikke desto mindre var tem- 5 DK 170061 B1 peraturfølsomme mutanter af BVD-virus ikke kendt før den foreliggende opfindelse blev gjort.

Til fremstilling af en vaccinestamme udfra en BVD-virusstamme af vild type lader man ifølge den foreliggende opfindelse 5 stammen reagere med det kemiske mutagen - f.eks. salpetersyrling - under driftsbetingelser, der formindsker den indledningsvise virustiter med 2 til 3 log^Q, og ved dyrkning af de resulterende mutanter ved henholdsvis 35°C og 39,5°C isoleres derpå en temperaturfølsom (ts) mutant, der ved 39,5°C 10 (som er temperaturen i kvægs indre organer) udviser en vækstevne, der er ca. 3 x log·^ mindre end dens vækstevne ved 35°C. Den temperaturfølsomme mutantstamme isoleres ved kloning i en hvilken som helst vævskultur, der er kendt for at tillade vækst af viral kvægdiarrévirus (f.eks. enten den kvægnyrecel-15 lelinie, der uden begrænsning med hensyn til tilgængelighed er deponeret i the American Type Culture Collection under accessionsnr. ATCC CC144, eller et monolag af topformede kvægceller som beskrevet af McClurkin A.W. et al. i Arch. Gesam. Virusforsch. 45: 285-=-289, 1974) ved en passende for-20 tynding, der muliggør udvælgelse af kloner ved hjælp af slutpunkts fortynding .

Nærmere betegnet lader man en stamme af vild type, der er i-soleret fra et dyr, som udviser typiske symptomer på den virale 25 kvægdiarré - f.eks. C.N.C.M. I-198-virusstammen - formere sig i en vævskultur, der muliggør vækst af kvægdiarrévirus - f.eks. en cellelinie, såsom en kvægnyrecellelinie eller en topformet kvægcellelinie - til sidst efter tilpasning af stammen til nævnte vævskultur, og en suspension af nævnte 30 kvægdiarrévirus lades ved stuetemperatur reagere med et kemisk mutagen, f.eks. en puffert vandig opløsning af salpetersyrling - f.eks. salpetersyrling i eddikesyrepuffer, idet koncentrationen af salpetersyrling og acetation i mediet er henholdsvis 4 N og 1 N, i 1 til 15 min. - f.eks. 6 (+ 1) min. - ved en pH-værdi mellem 5 og 6 - f.eks. ved pH 5,7 6 DK 170061 B1 (+0,1) - hvorefter reaktionen standses, f.eks. ved hjælp af pH-indstilling til 7,5 (+0,5) ved dråbevis tilsætning af 1 N natriumhydroxid. Suspensionen bliver derpå fortrins-vis dialyseret, og man lader fortyndede aliquot mængder vokse 5 i en vævskultur som ovenfor anført. De positive kulturer dyrkes derpå til sammenligning og titreres ved 35°C og 39,5°C, idet der udvælges en kultur, der udviser en titerforskel på ca. 3 log^Q TCIDj.q mellem de to temperaturer. En sådan temperaturfølsom mutant bliver derpå til sidst formeret i en 10 vævskultur, der muliggør vækst at viruset som ovenfor anført, og klones ved hjælp af mindst én slutpunktsfortyndingspassage med henblik på isolation af dai temperaturfølsomme mutant, f.eks. C.N.C.M. 1-199-virusstammen.

15 Et laboratorieforsøg, der blev udført i immunoundertrykte dyr med en vaccine indeholdende en C.N.C.M. I-199-stamme, viste et kraftigt tegn på en signifikant forbedring af denne ifølge opfindelsen fremstillede vaccine i forhold til de tidligere eksisterende vacciner.

20

Det lave niveau af- symptomer, der blev iagtaget med C.N.C.M. I-199-stamme, står i virkeligheden i skarp kontrast til det alvorlige kliniske billede, der beskrives ved undersøgelser, hvor enten virulente eller "fortyndede" BVD-stammer blev 25 benyttet i immunoundertrykte dyr. Resultater af undersøgelser med virulente stammer er blevet offentliggjort af Shope R.E. et al. i Can. J. Vomp. Med. 40:355-359, 1976, og resultater af undersøgelser med en "fortyndet stamme" er blevet publiceret af Bittie J.S. og House J.A., J.A.V.M.A. 163: 878-30 879, 1973, i denne dyremodel. I dette sidstnævnte tilfælde behandlede Bittie to kalve med dexamethason i 11 dage og * bemærkede, at dyrene forblev normale indtil vaccination med et "fortyndet virus (C24V) " og derpå udviste typiske tegn på slimhindesygdom ledsaget af feber og leukopeni, så snart den immunoundertrykkende behandling blev afbrudt. Et dyr 7 DK 170061 B1 døde 24 dage efter vaccination, medens det andet til sidst kom sig.

I forsøget/'.hvor en vaccine indeholder C.N.C.M. I-199-staminen fremstillet ifølge opfindelsen blev benyttet til immunounder-5 trykte kalve, iagtoges ingen kliniske tegn, der er typiske for slimhindesygdom, med undtagelse af forskellige grader af diarré, der stilnede af på begivenhedsløs måde. BVD-viru-set blev imidlertid ikke reisoleret fra de vaccinerede dyr på trods af daglige forsøg på at udvinde i det tidsrum, hvor 10 fordøjelsesproblemer blev iagtaget. De kliniske resultater var således ikke forbundet med tilstedeværelsen af vaccinevirus i de vaccinerede dyrs afføring eller i deres øjen-næse-sekretioner. De iagtagede symptomer var heller ikke forbundet med viræmi. Det er også værd at bemærke, at fremkomst af 15 genetisk ændret vaccinevirus ikke blev iagtaget.

Endvidere og i kontrast til de hidtil kendte vacciner, hvis aktive bestanddel er en temperaturfølsom mutant, og som administreres på et koldt sted i organismen, er vaccinerne 20 fremstillet ifølge-opfindelsen ikke effektive, når de administreres ad en sådan vej, og de skal administreres ad den klassiske parenterale vej, d.v.s. enten subkutant eller i dyrets muskler, med det forbehold, at den parenterale admi-nistation må efterfølges af en "booster" noget senere, f.eks. 25 nogle få uger senere.

Doseringsenheden af en ifølge opfindelsen fremstillede vacci- 3 5 ne indeholder fortrinsvis mindst 10 ' TCID,-q og fortrinsvis

A

mindst 10 TCID^q modificeret virus. Laboratorieforsøg ud-30 ført med en kombineret vaccine indeholdende en ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnået modificeret BVD-virus og en anden levende respirationsvirusvaccine til kreaturer, der kan administreres ad parenteral vej (d.v.s. kvæg-respirations-syncytisk (BRS) virusvaccine) afslører, at det modificerede BVD-virus ikke generer - d.v.s. ikke påvirker - immunogenisi- 8 DK 170061 B1 teten af det andet vaccinationsvirus.

Opfindelsen illustreres ved hjælp af de følgende eksempler, der ikke skal opfattes som begrænsende opfindelsens rammer.

* EKSEMPEL 1 5 Mutagenese og udvælgelse af mutant

En stamme af kvægdiarrévirus fra næseslimhinden i en kalv, der udviser typiske symptomer på sygdommen, blev tilpasset til kalvetestikelcellekultur ved hjælp af 10 passager i nævnte vævskultur og i overensstemmelse med reglerne i den 10 europæiske patentkonvention (EPC) deponeret i"Colletion Nationale de Cultures de Microorganismes" (C.N.C.M.) i Institut Pasteur i Paris den 10. juli 1982 under accessionsnummeret 1-198.

Viruset blev derpå formeret ved hjælp af 6 passager i en 15 kvægnyrecellelinie, her omtalt som NLBK4-cellelinie, under anvendelse af et medium bestående af en 50/50 (v/v) blanding af "Basal" og Minimal Eagle's medium suppleret med 0,25% (vægt/volumen ) kvæglactalbuminhydrolysat.

Et 1,25 ml volumen virussuspension hidrørende fra den 16.

4 0 20 passage og indeholdende lo ' TCID^q/0,1 ml blev blandet med 1,25 ml 1 molær eddikesyre/natriumacetatpuffer samt 1,25 * ml af en 4 molær vandig natriumnitritopløsning. Blandingens pH-værdi var til slut 5,7. Blandingen fik derpå lov til at reagere i 6 min. ved laboratorietemperatur, hvorefter reak- * 9 DK 170061 B1 tionen blev standset ved hjælp af dråbevis tilsætning af 1 N natriumhydroxid indtil pH 7,5 (+ 0,5). pH-indstillingen efterfulgtes af ændringer af farven af phenolrødtindika-toren, der fandtes i virussuspensionen.

5

Den behandlede virussuspension blev øjeblikkelig dialyseret i 5 timer ved 5°C (+ 1°) i phosphatpuffersaltvand bestående af NaCl (8 g), KCl (0,2 g), Na2HP04 (1,15 g), KH2P04 (0,2 g) i destilleret vand (indtil 800 ml) blandet med en 10 opløsning af MgCl2, 6H20 i 100 ml destilleret vand og derefter med en opløsning af CaCl2 (0,1 g) i 100 ml destilleret vand, idet den endelige opløsning steriliseredes ved filtrering, og den endelige pH-værdi lå mellem 7,2 og 7,4. Efter dialyse blev virussuspensionen opbevaret i flydende nitrogen. 15

Infektivitetstitreringsforsøg blev udført ved 37°C og anvendelse af 4 kanyler pr. tidobbelt fortynding. Den opnåede 1 7 virussuspensions tilbageværende infektivitet var 10 ' TCID^q/0,1 ml af infektiviteten af den indledningsvise 20 C.N.C.M. I-198-virusstammesuspension. Aliquot mængder (0,1 ml) af virussuspension, der var fortyndet 1/9 i en 50/50 (v/v) blanding af "Basal" og Minimal Eagle's medium suppleret med 0,25% (vægt/volumen) af kvæglactalbuminhydrolysat, blev podet i 80 kulturer af NLBK4-kvægnyrecellelinie, som derpå 25 blev inkuberet ved 37°C i 5 dage. Blandt de 80 kanyler udviste 31 cytopatogen virkning som følge af virusformering.

Hver af disse sidstnævnte blev til sammenligning dyrket og titreret ved 35°C og 39,5°C. Disse inkubationstempera-30 turer blev valgt som tilladende og begrænsende, fordi udgangsviruset (C.N.C.M. 1-198) voksede lige godt ved de to temperaturer og blev hæmmet ved 40°C. Et af isolaterne udviste en titerforskel på 3,0 log^g TCID^-q (vævskulturinfektiv dosis i 50% af kulturen) mellem 35°C og 39,5°C, hvilket viser 35 dets temperaturfølsomhed. Det blev beriget ved en supplerende passage (den 19.) under de samme driftsbetingelser som 10 DK 170061 B1 ved de forudgående passager og derpå frysetørret. ·

Viruset blev derpå formeret ved hjælp af to passager i topformet kvægcellelinie, i det følgende omtalt som NLBT^, under 5 anvendelse af det samme medium som ovenfor anført, og et virusforråd blev fremstillet ved passage nr. 21.

Fra dette virusforråd udførtes en yderligere kloningspassage ved en lo ' -fortynding under de samme betingelser, idet 10 der blev benyttet 96 kulturer, blandt hvilke 8 var positive.

En af dem blev beriget ved en yderligere passage (den 24.) under de samme betingelser og udgjorde en podesamling, der 3 9 blev frysetørret i små glasflasker, der hver indeholdt 10 ' TCID^q virus. Prøver af klonen er i overensstemmelse med 15 reglerne i den europæiske patentkonvention (EPC) blevet deponeret i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (C.N.C.M.) i Institut Pasteur i Paris den 20 juli 1982 under accessionsnummeret 1-199.

20 EKSEMPEL 2

Vaccinefremstilling

En prøve af podemængden (C.N.C.M. 1-199) blev rehydratiseret 25 og indpodet i NLBT^-cellekulturer, som derpå blev dækket med det ovenfor beskrevne vedligeholdelsesmedium.

Cellerne blev inkuberet ved tilladelsestemperaturen (35°C + 0,5 C) i 5 dage. Den overliggende væske blev derpå nyind- 30 podet i en anden række af kulturer. Når den cytopatogene effekt fremkom i 50% af monolagene, blev de overliggende væ- * sker høstet og samlet, "casitone" (6% vægt/volumen ) blev sat dertil, og blandingen blev lagret ved -70°C. Denne virussuspension blev optøet, fordelt på små glasflasker og fryse- 35 tørret til at indeholde 10 TCID^q eller multipla deraf pr.

glas.

11 DK 170061 B1 Før administration rehydratiseres vaccinen improviseret med saltvand (NaCl, 0,9% i sterilt destilleret vand) under anvendelse af 2,0 ml pr. dosis. Vaccinen administreres ad intra-muskulær vej, og fortrinsvis administreres to doser, f.eks.

5 med et interval på 3 uger.

EKSEMPEL 3

Den modificerede stammes temperaturfølsomhed 10

Effektiviteten af plaquedannelse (EOP) udtrykt som log1Q PFU (plaquedannende enheder) pr. 0,2 ml efter inkubation ved forskellige temperaturer er blevet bestemt for hver af stammerne C.N.C.M. 1-198 og 1-199. Resultaterne er angivet i 4 5 5 0 15 tabel 1, som viser, at EOP ligger mellem 10 ' og 10 ' for den vilde stamme C.N.C.M. 1-198, medens mutanten C.N.C.M.

1-199 har en optimal EOP ved 35-37°C, som formindskes med 1,5 log^p ved 39°C og med 3,0 log10 ved 39,5°C , idet intet in-fektiøs virus udvindes fra de podede kulturer, der ikke er 20 positive for CPE ved 39,5°C.

TABEL 1 STAMME EFFEKTIVITET AF PLAQUEDANNELSE (EOP) ved

25__35°C 37°C 38,5°C 39°C 39,5°C

C.N.C.M. 1-198 4,8 4,8 NT NT 4,8 C.N.C.M. 1-199 4,2 4,2 3,6 2,7 1,2

Titerne ved 35°C og 39,5°C blev også bestemt for viruset på 30 forskellige passageniveauer, og resultaterne er anført i tabel 2, der viser, at forskellen mellem titerne ved 35°C og 39,5°C er stabil over virusets forskellige passageniveauer.

TABEL 2 12 DK 170061 B1 SAMMENLIGNENDE TITERE PÅ NLBT^-CELLELINIE * VED TILLADENDE OG BEGRÆNSENDE TEMPERATURER 5 VIRUS PASSAGE ANTAL FORSØG FORHOLD 35°/39°C~ (x)

NIVEAU GEOMETRISK STANDARD

MIDDELTAL AFVIGELSE

2.N.C.M. 1-198 17 17 0,2 0,1 10 —----- C.N.C.M. 1-199 21 6 2,4 0,3 23 2 2,1 24 15 3,0 0,4 28 16 3,2 0,4 15 ----

(x) log TCID50 eller PFU ved 35°C

log TCID5q eller PFU ved 39,5°C

20 EKSEMPEL 4

Fortynding til normale kalve

Vaccinepodemængden blev afprøvet i 5 seronegative dyr. Med 25 henblik herpå blev 10 vaccinedoser rehydratiseret i 2 ml normalt saltvand og ad intramuskulær vej podet til hvert dyr.

Den samme vaccinedosis blev på lignende måde administreret 3 uger senere.

* 30 Klinisk undersøgelse, rektale temperaturregistreringer samt tællinger af hvide blodceller blev udført dagligt i 14 dage * efter administrationen af den første dosis.

Ingen symptomer blev iagtaget. Som det ses af tabel 3 registreredes ingen stigning i legemstemperatur udover 39,2°C.

13 DK 170061 B1 TABEL 3 DAG REKTALE TEMPERATURREGISTRERINGER (i °C) (x) _KALV NR._ (x) 010 012 431 432 . 433 - 10 38.2 38.5 38.5 38.7 38.6 - 9 38.0 38.0 38.5 38.7 38.6 - 8 38.1 37.8 38.8 38.7 39.2 - 7 38.0 38.0 39.0 38.8 38.7 - 3 38.2 38.0 38.8 ’ 39.0 38.7 - 2 38.0 38.2 39.0 38.9 38.7 - 1 38.5 38.2 38.2 38.6 38.0 0 38.3 38.0 39.0 38.9 38.7 1 38.4 38.0 38.7 38.9 38.8 5 38.3 38.3 38.9 38.6 38.6 6 38.0 38.2 38.8 38.6 38.6 7 38.2 38.2 38.5 38.8 38.4 8 38.4 38.6 39.0 38.7 38.5 11 38.2 _ 38.4 38.8 38.5 38.5 12 38.4 38.4 38.8 38.5 38.0 13 38.4 38.2 38.4 38.4 38.4 14 38.6 38.1 38.8 39.0 38.7 (x) dag 0 foretages indpodning af den første dosis.

Den gennemsnitlige optælling af antal hvide blodceller (WBC) forblev normal under hele observationsperioden.

Som påvist ved hjælp af deres seroomdannelse mod BVD var alle dyr immuniseret.

14 EKSEMPEL 5 DK 170061 B1

Fortynding til immunoundertrykte dyr. * 5 Ni kalve, der var seronegative overfor både BVD-virus og kvæg-respirationssyncytisk virus (BRS-virus), blev dagligt behandlet med dexamethason, 0,1 mg/kg, i løbet af et tidsrum på 12 efterfølgende dage begyndende på dag 5 før administrationen af den første vaccinedosis.

10

Fire dyr (nr. 16, 30, 82 og 83) blev intramuskulært podet med podemængden på dag 0 og felev på lignende måde indpodet en identisk dosis på dag 21. Vaccinationen på dag 0 omtales her som den første vaccination, og vaccinedosen, der blev benyttet 5 15 til første vaccination, var 10 TCID5Q af vaccinen opnået ifølge eksempel 2.

På dag 0 og dag 21 blev tre dyr (d.v.s. nr. 13, 14 og 19) vaccineret med en kombineret BRS/BVD-virusvaccine indeholden- c 7 5 20 de 10 ' TCID^q BRS-virus og 10 TCID^q BVD-virus. To dyr (dvs. nr. 80 og 81} blev vaccineret på dagene 0 og 21 med 5 7 den samme BRS-virusvaccine indeholdende 10 ' TCID^q virus pr. dosis.

25

Klinisk undersøgelse, legemstemperaturregistreringer og WBC-tællinger blev udført i 14 dage efter den første dosis. Virusisolation blev forsøgt dagligt fra blodprøver, øjen-næsevat- f pinde samt fækalt materiale fra fire af de podede kalve i 30 løbet af samme tidsrum. Resultaterne og deres fortolkning er angivet i tabellerne 4 og 5. * DK 170061 B1 15 [m · S lo oi-o g cm cm t- E-ι g LO lo o-i H 0 *- Z-------

W I

S H ' H S £h S M J OlO-LOO "3- LO CO o to g |j Γτ| «s «s #s *s «* »s Λ m 2 3 r-OOr- N Ol to <c

g Η P t— r- CM r- r- CM

r- I I I I I I I I III

CM I I I I I I I I III

*M.

X

LO I I I I I I I I III

T- I I I I I I I I III

O LO

«3- IOOO - I I O - I I

r- I T- CM T— Ollr- CM I I

lo in

to IOOO -IIO -II

r- I t— LO to CM I I T- CM I I

CM

LO O

CM IOOO -IOO -II

r- I y— LO r— CM I r- tO Oil

• +J · LO O

CCTt- IOOO -IOO -II

Η K 'c- It-LOt— CM I t— to Oil 0 g - -

& Fh LO O

SOIOOO -100-11 CU 5 r- I «3- LO CM ΓΜΙΝΟΟ Oil P M 5 ™ n M ® U o

™ 2 CJ Ol Ο Ο O © -o o-o - I I

£5 -c -rf! to <5· o to O to O-o CM I I

E-I Ή 5 *3- to i—I r vj _ lo ο o w * 00 OOOO -IOO -IO - H r- mt lo to tM|Oco lo i to lo

Mf· to γ- Ή ^ Λ ΓτΊ Ο» Ο Ο Ε Ρ» ο Ο Ο Ο -ΙΟΟ -ΙΟ

bH S Lt) W Μ Ο I Ο LO LO I to LO

m lo to r- w LO o o μΌΟΟΟΟ - - o o o -io -

in CO LO LO tO cmcmvOlo o i to LO

s « P lo o

M-LO Ι010 -ΙΟΟ -II

to CM CM to to LO

ΕΊ *“ ^ 5 LO o H *3- ΙΟΙΟ -IOO -Il

O to CM CM to tO LO

A r- r- ta lo o S to I O 1 O -too -Il

to CM CM ro to LO

M v— t—

P

n CM I I I O LO I I O LO I I

f£ CM to - Q Γ"

Μ τ- I I I III II O

o I I I 111 II ·Η +> ---—-----" rt ø* θέ s± “ < J O to ™ Ό HØ-, O to 'T Ha O r- Hlr,

Pg tO oo 00 r- Pgg c- r- _ P^ CO CO glgj .· ^__C; S CO_ Éull_1 16 DK 170061 B1 TABEL 5

Metode til udregning af kliniske point.

i PARAMETER GRAD POINT POINT KLINISK Γ ___enhed (1) vægtning (2) apati ingen 0 sum af en smule 1 10 decubitus 2 anorexi ingen 0 (1) formindsket 1 20 appetit fuldstændig 2 diarré normal affø- 0 multipli- ring ceret blød afføring 1 vandig affø- 2 10 ring moelena 3 nekrose 4 med (2)

Det ses, at forskellige grader af anorexi og diarré blev iag-taget hos alle vaccinerede kalve« Imidlertid havde ingen af dem hverken hypertermi eller leukopeni, og intet BVD-virus blev reisoleret fra de opsamlede prøver. Ingen kumulativ pato-5 genicitet som følge af kombinationen af BRS og BVD eller interferens blev iagtaget.

EKSEMPEL 6 10 Effektivitet af C.N.C.M. stamme 1-199 mod en kunstig smitte.

$

Dyrene blev vaccineret under immunoundertrykkende behandling og seroomdannet efter administration af den anden dosis. De blev lige som de to kontroldyr (dyr, der kun er vaccineret med 15 BRS) smittet på dag 35 efter administration af den første dosis.

17 DK 170061 B1

Det til smitten benyttede BVD-virus var Osloss-stammen (Rohde G. og Liess B., Zbl. Vet. Med. 17, B:686, 1970). Det blev 6 8 administreret intranasalt under anvendelse af 10 ' TCDI^q pr. dyr.

5

Kliniske symptomer, legemstemperatur og tællinger af hvide blodceller blev foretaget i 14 dage efter smitte. Virus-reiso-lation blev forsøgt fra alle dyrenes blod.

10 Intet klinisk symptom eller hypertermi blev iagtaget.

Kalve, der var blevet indgivet to doser af vaccinen, havde intet fald i WBC-tælling efter smitte, hvorimod kontroldyrene (dyr nr. 80 og 81) havde formindsket antal hvide blodlege-15 mer i blodet.

Endog ved den høje dosis på 106'8 TCID50/dyr var Osloss-stam-men ikke patogen. Hverken hypertermi eller kliniske symptomer blev iagtaget hos kontroldyr nr. 80 og nr. 81, som var blevet 20 vaccinet med kun BRS-virusvaccinen. Disse to dyr havde imidlertid lavere WBC-tællinger end de kalve, der modtog to doser BVD-vaccine, og viræmi blev påvist i disse kalve. Dyr, der var vaccineret med den kombinerede BVD/BRS-vaccine, var lige så godt beskyttede (nr. 19, 13 og 14).

25

Resultaterne er opført i tabel 6 18 DK 170061 B1 TABEL 6 ___ i VIKEMI Lir'lER SMITTE. . '__

KALV VACCINE DAG EETER PODNING INDEKS

NR. O 2 4 5 6 7 8 9 10 13 16 BVD ---------- 30 - - - -- -- -- - 82 — — — — — + - + — — S3 - - - - - - - - - - ____ 2/68 13 BVD/BRS - -- --NT---- 14 - - - - - NT - - - - 19 - - - - - - - - - - 80 BRS -- + + + + + -- - SI + + + + - 9/20 t t _ _____________________________ -IF (immunofluorescensforsøg) negativ +IF (immunofluorescensforsøg) positiv NT ikke undersøgt 5 Disse resultater står ikke i kontrast til litteraturens resultater, eftersom det er kendt, at eksperimentel infektion med vild type BVD sjældent resulterer i alvorlige kliniske symptomer (Saurat P. et al.. La Maladie des Muqueuses, Ed. L1expansion Scientifigue Franpaise, Paris 1972, side 76).

10

Indekset (d.v.s. antal af positive prøver som andel af antal- * let af undersøgte prøver) var signifikant højere (9/20) for gruppen af dyr, der kun var vaccineret med BRS, end for de andre kalve, blandt hvilke to kalve var forbigående positive .

EKSEMPEL 7 19 DK 170061 B1

Effektivitet af C.N.C.M. I-199-stammen i marken.

5 103 kalve i en alder fra 15 dage til 18 måneder med lave (d.

v.s. mindre end eller lig med 8) antistoftitere mod BVD blev 4 0 ad intramuskulær vej indgivet to doser på 10 ' TCID^q af vaccinen ifølge eksempel 2 med tre ugers mellemrum. Ingen klinisk reaktion, der kan tilskrives vaccinen, blev rappor-10 teret, hvilket viser sikkerheden af vaccinen under betingelser i marken.

Resultaterne er opført i tabel 7.

15 TABEL 7 ANTISTOFTITERE ANTAL SEROOMDANNENDE DYR/ ANTAL DYR I ALT FØR Π VACCINATION <1 1-8 i alt 20__r—i______ ALDER (+) 42 >2 i alt 42 >2 i alt i alt ANTAL I ALT 9/20 51/57 60/77 2/6 6/10 8/16 68/9 PROCENTER 45 90 78 30 60 50 73 25 (+) i måneder

Som det fremgår af tabel 7 havde i alt 73% af dyrene en signifikant antistofstigning efter vaccination. Betragtes imidlertid kun de kalve, der ved vaccination var seronegative, 3Q var der en tydelig forskel (p < 0,001) i seroomdannelsesgra-den i de dyr, der var ældre end to måneder (90%), sammenlignet med de yngre dyr (45%). De seropositive dyr udviser samme tendens. En bedre reaktion i ældre dyr blev iagtaget. 1 seronegative dyr, der er mere end to måneder gamle, fremkaldte den temperaturfølsomme stamme C.N.C.M. 1-199 90% se-

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en modificeret stamme af viral kvægdiarrévirus, der er egnet til vaccinationsbrug, 2Q kendetegnet ved, at en stamme af viral kvægdiarrévirus bringes i kontakt med et kemisk mutagen ved stuetemperatur under sådanne driftsbetingelser, at den indledningsvise virustiter formindskes fra 2 til 3 log^o' °9 at ^er ve<^ dyrkning og titrering ved henholdsvis 35°C og 39,5°C isole-25 res en temperaturfølsom mutant, der udviser en titerforskel på ca. 3 l°?i0 TCID5o meHem 35°C og 39,5°C.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det kemiske mutagen er salpetersyrling.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, * 2q at virusstammen bringes i kontakt med salpetersyrling i 1 til 15 min. i en pufferet vandig opløsning ved en pH-værdi mellem 5 og 6. DK 170061 B1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at reaktionstiden er 6 min. (+ 1 min.), at pH-værdien er 5,7 (+1), og at reaktionsmediet er 4 N salpetersyrling i 1 N acetat/eddikesyrepuffer.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den isolerede modificerede stamme er stammen C.N.C.M. 1-199.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine mod infektion med viral kvægdiarrévirus, kendetegnet ved, at 1° den omfatter vækst af en ved fremgangsmåden ifølge krav 1 isoleret mutant i en passende cellevævskultur med henblik på formering af mutanten samt kombination af det modificerede virus med en bærer til parenteral administration.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, 15 at den isolerede mutant er stammen C.N.C.M. 1-199.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, kendetegnet ved, at det modificerede virus yderligere blandes med en anden levende kvæg-respirationsvirusvaccine.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, 20 at den anden levende kvæg-respirationsvirusvaccine er en levende kvæg-respirationssyncyntisk virusvaccine.