JPS6391329A - Ａ型肝炎ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト材料から単離されそしてヒト超厚の細胞中
でのみ生育したＡｍ肝炎ウィルスな含有する、Ａ型肝炎
ワクチンに関する。このワクチンは経口投与にも適する
。

Ａ型肝炎は世界中に分布しており、特に衛生基準が低い
国々で流行しているヒトの感染性疾患である。この病原
体（Ａｍ肝炎ウィルス、略称ＨＡＶ）は二ンテロウイル
スの亜科に属するピコルナウィルスである。一般に、感
染の伝播は飲料水での排泄物−経口塗擦感染によるか、
または食料品の汚染により起る。小児は感染後にしばし
ば無症候の１１かまたは軽く罹病するが、一方感染した
成人の５０％が急性肝炎となる。

発達した国々では肝炎疾患の約２０〜２５％がＡ型であ
り、特に寄宿舎、キャンプおよび軍隊組織中の若い成人
ならびに発展途上国の旅行者がかかる。

ヨーロッパ特許Ａ−０．００８，５５９号には、生育し
たウィルスを用いこれを殺すかまたはその毒性を減弱さ
せたのちワクチンとして使用するために、ヒトのＡｌｌ
肝炎ウィルスを人間に近い霊長類中で予め継代後細胞培
養物中で培養する方法が記載されている。

ヨーロッパ特許人−α０２５，７４５号には予め霊長類
での継代な行うことなくＡＩＪ肝炎ウィルスを直接イン
ビトロで生育させる方法が記載されている。

後者方法に続き、ヒト超厚のｋＪｉ胞を使用する改良法
も米国特許第４．５０へ０１６奇（ヨーロッパ特許Ａ−
α０７４，１１９号に相当）に記載されている。

減弱された生ウイルスワクチンの開発はｒＰｒｏｃ。

Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、Ｊ　　１７０．８
”１４　　（１９８２）およびｒＰｒｏｃ、　８ｏｃ、
　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、Ｊ　１７２．３５７
〜５６５　（１９８３）に詳細に記載されている。細胞
継代培養後に弱毒化されたウィルスを猿に静脈経路で投
与し、そこでＡ！！！肝炎に対する抗体が生成し、この
ものが非弱毒化されたウィルスにより惹起される疾患か
らの保護を与える。

しかしながら後者の釜のワクチンは、それが非経口経路
で投与されねばならないという欠点を有する。

経口投与により免疫が形成されるワクチンが望ましい。

かかるワクチンはより簡単に投与できるのみならず、天
然の免疫に相当する免疫応答を刺激しそして腸内免疫メ
カニズムにより有毒なＡ型肝炎ウィルスがそれ以上身体
に侵入および生育するのを阻止しうる。

国際特許出願公開ｗｏ　８６１０１８２６　（出願番号
ＰＣ’Ｉ’　／米国８５１０１７６９）にはＡ型肝炎つ
ィルス株ＨＭ１７５の単離および生ウイルスワクチンと
してのその使用が記載されているが、そこでは経口使用
も記載されている。しかしながらこのウィルス株は、使
用されたウィルスがアフリカミドリザルの一次腎臓細胞
中で培養され、従ってサルの１１ｆｌ胞からの他の望ま
しからぬウィルスがそれから得られたワクチン中和含有
される可能性が存在するという欠点を有する。特に、エ
イズ病原体と密接に関連するレトロウィルス科のウィル
スによる危険が存在する。生ウイルスワクチン中にかか
るウィルスが存在するとヒトでのその使用は排除されよ
う。

本発明の目的は、経口投与でき、Ａａ肝炎ウィルスによ
り惹起される疾患から保護するものであり、そして生存
能力のある異積ウィルスを含有しないヒト超厚の検査さ
れた細胞培養物を使用するゆえに望ましからぬ生存能力
のあるウィルスを含有する危険とは関係ない生ウイルス
ワクチンを開発することにあった。

驚くべきことに、ヒト材料から得られたＡ型肝炎ウィル
スがヒトの細胞中で１５〜５０回継代後に経口でも投与
できるワクチンにおける抗原として適当であることが見
出された。

それゆえ本発明はヒト材料から単離されそしてヒト超厚
の細胞でのみ生育したＡ戯肝炎ウィルスの有効量を含有
しており、ウィルスを生育させるのに１５〜３０回の継
代が行われることからなるＡ減肝炎ワクチンに関する。

２０〜３０回継代が行われることが好ましい。かかるワ
クチンは経口投与されうろことが好ましい。

出発物質としてはヒトのウィルス含有物質から得られる
Ａｆｆｉ肝炎ウィルスが用いられる。かかるウィルス含
有物質の例をあげれば糞便、血液、唾液、尿または組織
抽出物である。その中に含有されるウィルスまたはウィ
ルスの一部分を、ウィルスおよび／または免疫学的に意
味あるウィルスの部分を生育させる目的で、ヒトのａ胞
物質から誘導されたイン・ビトロ生育系中に直接加える
。生育系としては多数の一次の、連続的に培養されたか
、または永久的な細胞培養物が適当である。しかしなが
ら、ヒトに投与された他のウィルスワクチンの製造にす
でに使用されそして他の感染性病因物を含有しない、ヒ
ト起源の細胞から得られる細胞培養物が使用されるのが
好ましい。

このイン・ビトロ生育期間中にＡｇ肝炎ウィルスの病原
性が減弱される。かかる生育系にウィルスを充分く適応
させたのちには、Ａ型肝炎ウィルスまたはその免疫学的
に意味ある部分はそれを経口投与後に疾患を惹起するこ
となくイン・ビボ・において保！！性免疫応答な酵起す
るに充分な量で得られうる。

その際驚くべきことに、経口投与が非経口投与より好都
合でるることが判明した。天然の感染径路を模倣しては
いるが本発明によるワクチンは動物実験で経口投与後に
何ら肝炎を惹起することがなく、一方弁経口投与後（ｉ
、ｖ、）ではこのウィルス製剤は軽い肝炎の徴候が確認
された。

従って、かくの如くこのＡｆｆｉ肝炎生ワクチンの経口
投与は非経口より安全であると見なされうる。

小区分に分けられ、充分にウィルスを含有し、滅菌濾過
された培養上澄み液は、それ自体すでに必要な目的を達
成するのに適当な製剤である。

しかしながら実際上の理由から、それが再構成されたの
ちに直接注入するかまたは薬理学的て受容されうる担体
（例えば穂立方体）中にて投与スルために、含有される
ウィルスなウィＡ／ス安定化物質の添加によるかおよび
／または凍結乾燥によりより安定なものとなすことが適
当である。

Ａ溢肝炎ウィルスによる疾患に対して保護な与える好ま
しくは経口使用されうる不発明忙よるワクチンの製法に
ついて以下に例示する。さらに実験動物におけるその使
用および効力についても説明する。

実施例　１ ウィルスのイン・ビトロ生育 米国特許第４，５０６，０１６号明細書の記載により得
られるＡ型肝炎つィルス単離＊　（ＨＡＹ／ＧＢＭ）を
反復して連続してイン・ビトロ継代させることに゛より
生育させた。

これはつ７胎児血清１０％を添加したイーグル培地中に
慣用の実験室技法に従い保持されたヒトの胚性の腎臓ま
たは肺繊維芽細胞からなる培養物にウィルス含有培養上
澄み液を接種することにより行われた。培養物を３７℃
で約１週間インキエベークヨンしたのちに、培養上澄み
液中に放出された大量のウィルス粒子が検出できかつ細
胞培養物中にウィルス抗原が検出できた。

実施例　２ ａｍ培養へのＡ型肝炎ウィルスの適応 １つの細胞培養物のウィルス含有培養上澄み液を新たな
、未感染＃Ｂａに反復して移すことにより培養上澄み液
中におけるウィルス収皺がますます増大する。初めは検
出できる菫の感染性ウィルスがほとんど存在しないが、
その収斂は継代数が増すにつれて高まる。さらに、感染
性ウィルスは培養土泣み液中にますます早くに出現して
き、従って生育期間が２〜３日に短縮されうる。同様の
方法で、感染した細胞培養物を連続的にさらに生育させ
ることによりＡ型肝炎ウィルスを細胞培養に適応させる
ことができる。

その際それぞれの細胞継代の間の間隔は、適応が進渉す
る間にウィルスがますます速やかに生育するので、初め
の数週間から２〜３日まで短縮することができる。これ
ら２種の方法はウィルス継代（または場合により細胞継
代）約２０回以内で培養土淀み液１−当り１０６〜１０
８個の感染性粒子が存在するウィルス収量を得るのに適
している。

実施例　３ 血清を宮まないウィルス製剤の製法 はとんど集密的に生育したＭＲＣ−５細胞に、培養基を
ウシ胎児血清５チおよびＡａ肝肝炎クイスス　１０”〜
１０７　ＴＣＩＤ５Ｑ／ｓｄ　）を含有する等価培地と
５ｅ換することによりＡ型肝炎ウィルスを感染させた。

次にｍ胞培養物を数日間（３〜６日）３７℃でインキエ
ベーションした。次に培養基を除去し、細胞を血清を含
有しない培地で３回洗いそして再び血清を含有しない培
地を供給した。さらに３〜７日経過後この培養上澄み液
を収穫してそのウィルス含量を測定した。

実施例　４ 感染性のＡ型肝炎ウィルスの検出および量の測定のため
の免疫ペルオキシダーゼ分析 感染した細胞培養物から感染３週間後に培養上置み液を
とり出し、そして残留する細胞にＰＢＳ（燐酸塩緩衝さ
れた食塩溶液、ｐＨ７，２）の４％ホルマリン溶液を加
えた。４℃で少くとも１２時間作用させたのち、ホルマ
リン溶液を除去しそしてＰＢＳ中のトリトン（Ｔｒｉｔ
ｏｎ）■×１００洗浄剤の１％溶液と置換した。これを
３０分間室温で作用させたのち、とり出して、ウシ胎児
血清１％を添加したＰＢＳ　（洗浄用緩衝液）を用いて
洗浄剤残分な洗い去った。今や固定され崩壊されたｍ胞
に、Ａ捜肝炎ウィルスに対する高含斂の抗体を含有し、
ペルオキシダーゼで標識された精製ＩｇＧ製剤を洗浄用
緩衝液中に希釈したものを加えた。１１００３チのＨ２
Ｏ２を含有するｐ）１５．５の酢酸塩緩衝液中のアミノ
エチルカルバゾール（α４　ｑ／ｄ　）と１時間インキ
エペーションしたのちには感染したＩＩＢ胞は顕微鏡で
観察されうる桃色ないし褐赤色を示すが、−１未感染細
胞は無色の１まである。ウィルス製剤中における感染性
ウィルス粒子の含量を測定するには、これを１０倍ずつ
の段階で希釈しセして１０−１〜１叶７の各希釈段階物
をミクロアッセイプレート中の８個の細胞培養物に接種
する。

３７℃で３週間インキュベーションしたのち、感染した
培養物の数から、知られた統計的方法を用い、培養物−
５０％感染１ｋ　（ＴＣＩＤｓｏ）として表わされる感
染単位量を計算するために、感染の検出を前記のように
して実施する。

実施例　５ チンパンジーでの免疫化実験 ワクチンとしての適合性を検査するために、２．２０，
３１または５１回継代培養物から得られるウィルス含有
培養土泄み液をチンパンジーに接種した。Ａ型肝炎に対
する抗体についておよびその中に存在する肝臓酵素レベ
ルについて試験するために１週間間隔で血清試料を採取
した。

肝炎の組織学的徴候を検出するために１〜３週間隔で肝
臓バイオプシーを採取した。２継代代培養物から得られ
る１　０５．０πＩＤ５ＯＡ型肝炎ウイルスを投与する
と肝臓酵素特に（）ＧＴＰ　（γ−グルメミルトランス
ペプチダーゼ）レベルの上昇、およびバイオプシーにお
ける急性肝炎の徴候を生じた。これに対し２０回継代培
養＠（１０７，８ＴＣＩＤＳＯＡ型肝炎ウィルス、経口
投与）を投与すると肝臓酵素の増大を伴うことなくＡ型
肝炎に対する抗体が形成されそして採取された肝臓バイ
オプシーな組織学的に検査すると何ら肝炎の徴候を示さ
なかった。同量の同じウィルス製剤を同様にしてチンパ
ンジーに非経口投与した（　１０７．８　ＴＣＩＤ５０
．２０回継代培養、静脈投与）。

経口により免疫された動物と反対にこの猿では軽い急性
肝炎が発生し、従って経口ワクチン化の利点が明らかと
なった。３１回および５１回継代培養から得られたウィ
ルスでは何ら抗体形成が惹起されなかった。病原性が証
明されている２継代代培養から得られるウィルスを用い
る挑戦感染においては、２０回継代培養物を予め投与し
たチンパンジーはＡ製肝炎に対し保護されることが証明
された（第１表参照）。

）ＴＡＶ−接種 量 １　　　　　２　　　　１０５　　　　静脈内　　１２
　　　　２０　　　　１０７・８　　静脈内３　　３１
　　１０７・４　経口 ４　　５１　　１０７・２　経口 ５　　　　　　　　２０　　　　　　　１０７・６　　
　　経　　口　　　　１挑戦感染 ５　　　　　　　　　　２　　　　　　　１０５・０　
　　　　経　　口　　　　１１表 Ｃ Ｏ〜１２　　１２８　　　　７．５　　　　　急性肝炎
８〜９　　　　１４　　　　５．５　　　　　門脈浸潤
、緩和な、急性肝炎 ７〜１０１１　　　　　陰性　　　　肝臓組織未変化５
〜１０１１　　　　　陰性　　　　肝臓組織未変化８〜
２１　　　２２　　　　２．６　　　　　肝臓組織未変
化ｉｔｌ記 組織正常

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒト材料から単離されそしてヒト起原の細胞でのみ
   生育したＡ型肝炎ウィルスの有効量を含有しており、ウ
   ィルスを生育させるのに１５〜３０回の継代が行われる
   ことからなるＡ型肝炎ワクチン。 ２）２０〜３０回継代させることからなる特許請求の範
   囲第１項記載のワクチン。 ３）経口投与されうる製剤である特許請求の範囲第１項
   記載のワクチン。 ４）経口投与されうる製剤である特許請求の範囲第２項
   記載のワクチン。