PT85845B

PT85845B - Processo para a preparacao de uma vacina contra a hepatite a

Info

Publication number: PT85845B
Application number: PT85845A
Authority: PT
Inventors: Jens-Peter Gregerseen; Gabriele Noll; Rudolf Mauler
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1986-10-02
Filing date: 1987-10-01
Publication date: 1990-07-31
Also published as: EP0263361A3; DE3633550A1; FI874276A; EP0263361A2; JPS6391329A; DK516287A; AU7928187A; FI874276A0; PT85845A; DK516287D0

Description

Memória descritiva

A presente invenção refere-se a uma vacina contra a hepatite A que contém o vírus da hepatite A isolado a partir de material humano e que foi multiplicado exclusivamente sobre células de origem humana. Esta vacina é também adequada para a administração oral.

A hepatite A é uma doença infecciosa do ser humano espalhe, da por todo o mundo, e que é endémica especialmente nos países com um baixo nível higiénico. 0 seu agente infeccioso (o vírus da hepatite A, HAV) é um picorna-vlrus da sub-familia dos enterovírus. A transmissão da infecção faz-se em geral por meio de infecção fecal-oral com a água de beber ou também através de alimentos infectados. Enquanto que as criançaE muitas vezes não apresentam sintomas após a infecção, ou apenas desenvolvem uma forma benigna da doença, 50% dos adultos infectados desenvolvem uma hepatite aguda.

Nos países desenvolvidos cerca de 20-25% das hepatites sãc do tipo A, sendo afectados em especial adultos jovens residen • tes em lares, campos de trabalho ou instituições militares, bem como os viajantes em países em vias de desenvolvimento.

Na EP-A-0 008 559 £ descrito um processo para multiplicação de um vírus da hepatite A humana em cultura celular após passagem prévia do vírus em primatas sub-humanos, a fim de utilizar o vírus assim multiplicado após a sua destruição ou atenuação da sua virulência como uma vacina.

Na EP-A-0 025 745 é descrito um processo para a multiplicação directa invitro de um vírus da hepatite A sem passagem prévia pelo primata.

Uma modificação deste último método com posterior utiliza çao de células de origem humana é também descrita na patente americana 4.506.016 (corresponde à ΞΡ-Α-0 074 119). 0 desenvolvimento de uma vacina de vírus vivo atenuado é descrito em pormenor na Proc. Soc. Exp. Biol. Ned. 170, 8-14 (1982) e na Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 172, 357-363 (1983): o vírus atenuado após passagens por culturas de células foi administrado a macacos por via intravenosa; os macacos desenvolveram então anticorpos contra a hepatite A que os protegeram da doença provocada por vírus não atenuados.

Uma vacina deste último tipo tem no entanto a desvantagem de ser administrada por via parenteral.

Seria desejável uma vacina que produzisse imunidade após a sua administração oral. Uma tal vacina seria não só mais fácil de administrar, como poderia também estimular uma resposta imunológica correspondente à sua imunidade natural que impede através dos mecanismos imunológicos entéricos a progressão e multiplicação do vírus virulento da hepatite A no organismo.

A patente publicada WO 86/01826 (Appl. No. PCT/ US 85/017 69) descreve o isolamento da estripe virai da hepatite A HM 175 e a sua utilização como vacina viva, sendo também descri, ta uma aplicação oral. Esta estripe virai apresenta no entan to a desvantagem de o vírus utilizado ser cultivado em células renais primárias de gatos verdes africanos, verificando-se portanto a possibilidade da vacina assim obtida conter outros vírus indesejáveis das células de macacos.

Existe perigo em especial no que se refere à contaminação

com vírus da família dos retrovírus estreitamente apresentados com o agente infeccioso da SIDA. A presença de tais vírus numa vacina viva excluiria a sua aplicação no ser humane» 0 objectivo da presente invenção consistia em desenvolver uma vacina viva para administração oral que protegesse da doença provocada pelo vírus da hepatite A e que devido à utilização de culturas celulares de origem humana, testadas e insentas de vírus estranhos susceptíveis de multiplicação, não contivesse vírus indesejáveis susceptiveis de se multiplicarem.

Descobriu-se de forma surpreendente que o vírus da hepatite A obtido a partir de material humano é, após 15 a 30 passagens sobre células humanas,adequado como antigênio em vacinas também utilizáveis por via oral.

objectivo da presente invenção é portanto uma vacina contra a hepatite A contendo uma quantidade eficaz de um vírus da hepatite A que foi isolado de material humano e multiplicado exclusivamente em células de origem humana, caracterizada pelo facto de para a multiplicação do vírus este ter sofrido 15 a 30 passagens..

De preferência fazem-se 20 a 30 passagens. Uma tal vacina pode com vantagens ser administrada por via oral.

Como material de partida utiliza-se um vírus da hepatite A obtido a partir de material humano contendo o vírus. O material contendo vírus pode ser, por exemplo, fezes, sangue, saliva, urina ou um extracto tecidular. Os vírus ou parte de vírus aí contidos são introduzidos directamente num sistema de multiplicação invitro produzido a partir de material celular humano, com o objectivo de multiplicar o virus e/ou partes do vírus relevantes do ponto de vista imunológico. como sistema de multiplicação são adequadas uma série de cul turas celulares primárias, cultivadas continuamente ou permanentes. No entanto são utilizadas de preferência culturas celulares de células de origem humana que já foram utilizadas para a preparação de outras vacinas virais utilizadas no ser humano e que se encontram isentas de outros agentes infecciosos.

Durante esta multiplicação in vitro é atenuado o efeito patogénico do vírus da hepatite A. Após uma adaptação sufici ente dos vírus a um tal sistema de multiplicação é possível obter vírus da hepatite A ou as suas partes relevantes do ponto de vista imunológico em quantidade suficiente para após administração oral desencadear in vivo uma resposta imunológica protectora sem que se obtenha o efeito patológico. Surpreendentemente a administração oral revelou-se mais vantajosa do que uma administração parenteral. Apesar de ter sido imitada a via natural de infecção, a vacina a que se re | fere a presente invenção não provocou após administração oral no ensaio animal qualquer hepatite, enquanto que ap^s a administração parenteral (i.v.) da mesma preparação_virai foram observados indícios de uma ligeira hepatite.

Assim é possível considerar a administração oral desta vacina viva contra a hepatite A mais segura do que a sua adm inistração parenteral.

O sobrenadante da cultura, em porções contendo uma quantidade suficiente de vírus e filtrado para esterilizar, cons titui já uma preparação adquada que atinge os objectivos dese jados. No entanto, por motivos de ordem prática pretende-se conservar ainda melhor o vírus assim obtido, através da adi| ção de compostos estabilizadores do vírus e/ou através de liofilização, a fim de o administrar directamente após a sua reconstituição ou então num excipiente farmacologicamente tolerável (por exemplo, cubos de açúcar).

Descreve-se em seguida em exemplo a preparação de uma vacina a qual se refere a presente invenção,, para administração de preferência oral, que protege contra a doença provoca·· da pelo vírus da hepatite A. Para além disso descreve-se a sua aplicação e eficácia no ensaio animal.

Exemplo 1

Multiplicação do vírus in vitro.

* 0 vírus da hepatite A isolado conforme descrito na USP 4, • 506,016 (HAV/GBN) foi multiplicado através de repetidas e sucessivas passagens in vitro. Tal facto faz-se através da inoculação de sobrenadante de culturas contendo o vírus em culturas de fibroblastos embrionais humanos de rim ou pulmão, mantidos de acordo com as técnicas laboratoriais usuais em meio de Eagles com adição de 10% de soro de feto de vitela.

Após uma incubação das culturas de cerca de uma semana a 37°C foi possível detectar uma grande quantidade de partículas virais no sobrenadante das culturas e antigénios virais na cultura celular.

Exemplo 2

Adaptação do vírus da hepatite A a culturas celulares.

Através da reinoculação repetida de sobrenadantes de culturas ricas em vírus de uma cultura celular em células novas não infectadas obtém-se um rendimento crescente dos vírus no sobrenadante das culturas. Enquanto que no início quase não se obtinham quantidades detectáveis de vírus infeccioso, esse rendimento aumenta com o número crescente de passagens.

Para além disso, o vírus infeccioso surge cada vez mais cedo no sobrenadante das culturas, pelo que o tempo de multiplicação pode ser reduzido para poucos dias. Do mesmo modo é possível adaptar o vírus da hepatite A a uma cultura celular, multiplicando continuamente uma cultura celular infecta da. Os intrevalos entre as diferentes passagens celulares pç) dem ser reduzidos de inicialmente várias semanas para poucos dias, pois com a continuação da adaptação o vírus multiplica-se cada vez mais rapidamente. Ambos os métodos são indicados para obter com cerca de 20 passagens virais (ou passagens 6 8 celulares) um rendimento virai de 10 a 10 partículas infec ciosas por mililitro de sobrenante das culturas.

Exemplo 3

Processo de preparaçao de composição virais isentas de so ro. Após infecção com vírus da hepatite A de células MRC-5 adultas quase confluentes através de mudança do meio de cul-

tura para um meio idêntico com 5% de soro de feto de vitela

7 e vírus da hepatite A aí contido (10 -10 ΚΙΏ^θπιΙ)* estas c culturas celulares foram incubadas durante alguns dias (3-6 dias) a 37°C. Depois disso retirou-se o meio de culturas e as células foram lavadas três vezes com meio isento de soro e de novo abastecidos com meio isento de soro.

Passados mais 3 a 7 dias procedeu-se à colheita deste sobrenadante da cultura e determinou-se o seu teor virai.

Exemplo 4

Ensaio da imunoperoxidade para detenção e determinação quantitativa de vírus da hepatite A infecciosa.

Três semanas após a infecção retirou-se o sobrenadante das culturas celulares infectadas e aplicou—se sobre as células remanescentes uma solução de formalina a 4% em PBS (soro fisiológico tamponado com fosfatos* pH 7,2).

Após pelo menos 12 horas de tratamento a 4°C retirou-se de solução a formalina e substituiu-se por uma solução deter de ^RTriton X 100 a 1% em PBS.

Depois de esta actuar durante 30 minutos à temperatura ambiente foi retirada e lavaram-se os restos de detergente com PBS ao qual se adicionou 1% de soro de feto de vitela ( tampão de lavagem) . Sobre as células agora fix'adas e descober tas aplicou-se uma preparação purificada de IgG com um elevado teor de anticorpos contra o vírus da hepatite A# marcada com peroxidase* que fôra diluída em tampão de lavagem.

Após uma hora de incubação com amino-etil-carbazol (0*4 mg/ml) num tampão de acetato de pH 5*5 com 0*003% de HgOg * as células infectadas apresentam uma coloração rosa a vermelho acastanhado que pode ser observada ao microscópio* enquar to que as células não infectadas se mantêm incolores.

Para determinação do teor de partículas virais infecciosas numa preparação virai esta é diluída em séries de 1:10 e em

-1 —7 cada diluição de 10 até 10 inoculam-se numa lamela de mi. croteste 8 culturas celulares.

, Após 3 semanas de incubação a 37 C procede-se à determina-

ção da infecção como acima descrito a fim de, a partir do nú mero de culturas infectadas, calcular através dos métodos estatísticos conhecidos a quantidade de unidades .infecciosas indicadas como dose infecciosa da culturas a 50% (KIDj-θ).

Exemplo 5

Ensaios de protecção no chimpanzé.

Para testar se era adequado como vacina, o sobrenadante das culturas contendo vírus das 2-_t 203, 313 e 51* passagem de cultura foi inoculado em chimpanzés . Semanalmente foram então colhidas amostras de soro a fim de as analizar quanto ao seu teor de anticorpos contra a hepatite A e às taxas de enzimas hepáticas. Com intervalos de 1-3 semanas foram feitas biópsias hepáticas a fim de detectar indícios histológi5 o cos de uma hepatite. A administração de 10 ' KIDç-θ de vírus da hepátite A da 23 passagem de cultura provocou um aumento dos enzimas hepáticos, em especial da GGTP (gama-glutamiltra nspeptidase), e indícios de uma hepatite aguda na biópsia.

8

A administração da 203 passagem de cultura (10 ' de vírus da hepatite A, administrado por via oral) provocou, pelo contrário, a formação de anticorpos contra a hepatite A sem uma subida dos enzimas hepáticos e sem indícios de uma hepatite no exame histólogico das biópsias hepáticas colhidas. Uma quantidade igual da mesma preparação virai foi também

8 administrada por via parenteral a um chimpanzé (10 * ΚΙΌ^θ, 203 passagem de cultura, intravenoso). Ao contrário dos animais vacinados por via oral, este macaco desenvolveu mesmo assim uma ligeira hepatite aguda e ilustrou assim as vantagens da vacinação por via oral. Com vírus da 313 θ da 513 passagem de cultura não se provocou qualquer formação de anticorpos. Numa infecção de sobrenadante com vírus da 23 passa gem de cultura, que se havia revelado patogénico, foi possível demonstrar que um chimpanzé após administração prévia da 23 passagem de cultura se encontrava protegido contra uma hepatite A (Tabela 1).

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Claims

- lã

Processo para preparação de uma vacina viva um vírus da in vitro o contra a hepatite A, caracterizado por se isolar hepatite A de material humano# se multiplicar referido vírus exclusivamente em células de ori gem humana mediante a inoculação do sobrenadante de culturas contendo o vírus em culturas de fibroblastos de rim ou de pulmão embrionais humanos de preferência em meio de Eagle adicionado de soro de feto de vitela, se proceder no número de passagens de multiplicação do vírus suficiente para atenu ar a sua virulência e se processar a cultura por forma a ob ter-se uma quantidade desses vírus de virulência atenuada qu actue eficazmente como vacina.

Processo de acordo com a reivindi cação 1# caracterizado por se proceder pelo menos a quinze a trinta passagens# de preferência# vinte a trinta passagens.

- 3- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a vacina se preparar por originar melhores resultados e mais seguros# sob uma forma de administração por via oral.