JP2002512504A

JP2002512504A - 機能が不全な７１遺伝子領域を含む組換えウマヘルペスウィルス１型（ｅｈｖ−１）、および、そのワクチンとしての使用

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Publication number: JP2002512504A
Application number: JP52634398A
Authority: JP
Inventors: モイラブラウン、スザンヌ; スン、イー; ジョンフィールド、ヒュー
Original assignee: ザユニヴァースティコートオブザユニヴァースティオブグラスゴウ; ケインブリッジユニヴァースティテクニカルサーヴィスィズリミテッド
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2002-04-23
Also published as: WO1998026049A1; HUP0002374A3; HUP0002374A2; EP0946714A1; AU738684B2; GB9625968D0; AU5401898A; CA2274900A1

Abstract

(57)【要約】ＥＨＶ−１の７１遺伝子の機能不全型変異体を含むワクチン処方剤、およびその使用。

Description

【発明の詳細な説明】機能が不全な７１遺伝子領域を含む組換えウマヘルペスウィルス１型（ＥＨＶ− １）、および、そのワクチンとしての使用本発明は、ゲノム中に遺伝子欠失をもつ弱毒化ＥＨＶ−１ウィルスを含むウィルスワクチンと、その使用、およびＥＨＶ−１関連疾患を治療する方法に関する。特に、本発明は、ウマヘルペスウィルス１型（ＥＨＶ−１）に対して使用するためのウィルスワクチン組成物に関する。ＥＨＶ−１は、アルファヘルペスウィルス亜科の一員で、ウマの重要なウィルス病原体である。ＥＨＶ−１によってもたらされる臨床上の問題としては、呼吸器病、流産、および神経学的障害などがある（Bryans J.T.,およびAllcn,G.P., クルーワー・アカデミック・パブリシャー（Kluwer Academic Publisher）、マサチューセッツ州ノーウエル（Norwell,MA）、1989）。このように、ＥＨＶ−１は、馬産業における重大な経済的損失の原因となる。ＥＨＶ−１ゲノムは、約150kbpの大きさの直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子で、共有結合した２つの成分である、Long（長い）領域とShort（短い）領域とに分けることができる。Long領域は、短い倒置反復配列（IR_LとTR_L）が隣接したユニークな配列（Ｕ_L）からなる。Short領域は、長い倒置反復配列（IRsとTRs）が隣接したユニークな配列（Us）からなる。ＥＨＶ−１は、病原性株および非病原性株として生じるが、最近になって、病原性株Ab4の全ＤＮＡ配列が決定され、この配列は、登録番号：M96664として、G enBankライブラリーに登録されている（Telford,E.A.R.ら、Virology,189,pp.30 4-316(1990)）。このゲノムは、長さが150,223bpで、ポリペプチドをコードしていると予測される81個のオープンリーディングフレームを含んでいる。その成分の長さは、Ｕ_L が112,870bp、TR_L/IR_Lが32bp、U_sが11,861bp、IR_s/TR_sが12,714bpである。興味深いことに、今までに配列決定されたヘルペスウィルスのいずれとも相同性をもたない、すなわち、ＥＨＶ−１にとってユニークな５つの遺伝子、１、２、６７、７１および７５がある。遺伝子１、２、６７、７１および７５の各遺伝子は、タンパク質をコードしていると考えられているが、各タンパク質の機能ははっきりしていない。最近、ＥＨＶ−１の遺伝子７１の産物が、ウィルスの吸着/貫入、および感染細胞の核からウィルスの出現に関与することが明らかになった（Sun Y.ら、Journal of Gen eral Virology 77,pp.493-500(1996)）。機能不全の遺伝子７１の領域を含む、ＥＨＶ−１の遺伝子７１の欠失変異体を製品において使用すること、およびＥＨＶ−１関連疾患に対してワクチンとして使用することは、先行技術において教示または示唆されていない。ＥＨＶ−１感染をワクチン接種によって制御することは、長年の努力目標であった。最近のＥＨＶ−１ワクチンは、化学的に不活性化したウィルスワクチンと、改変されたウィルス生ワクチンとがある。不活性化ワクチンは、一般的に、誘導できる免疫レベルが低く、付加的に免疫化が必要となり、製造するのにも費用がかかる。このようなワクチンの使用は、不活性化処理において生き残る感染性ウィルス粒子があり、動物に投与した後病気を惹き起こす、という危険を伴う。一般的に、弱毒化生ワクチンは長期間継続する（しばしば液性と細胞性との両方の）免疫応答をひき起こし、製造するのがより簡単であるため、弱毒化生ワクチンの方が好ましい。組織培養において病原性株を連続継代培養して弱毒化した生存ＥＨＶ−１ウィルスを基にした弱毒化生ワクチンを利用することができる。しかしながら、病原性株の連続継代は、ウィルスのゲノムに制御不能な変異を生じさせ、病原性と免疫特性において不均一なウィルス粒子の集団をもたらすことがある。また、このようなＥＨＶ−１の弱毒化生ワクチンは、病原性株に復帰して、接種された動物に病気をもたらし、また、別の動物に病原体を蔓延させる可能性をもたらすことがある。本発明者らは、ＥＨＶ−１ウィルスゲノムのユニークなShort領域の中に存在する機能不全領域を含む生存ＥＨＶ−１変異ウィルスであって、ＥＨＶ−１生ワクチン処方剤において用いることのできる、適切な株を同定した。具体的には、本発明者らは、遺伝子７１によってコードされるタンパク質の産生について機能が不全なＥＨＶ−１変異体がＥＨＶ−１生ワクチン処方剤に使用できることを発見した。このような変異体は、野生型のＥＨＶ−１ウィルスよりも、実質的に病原性が低いことが分かった。さらに、遺伝子７１は、細胞培養において、ＥＨＶ−１の増殖に必須でないことが分かっている（Sun Y.とBrown,S.M.、Virology,199，pp.4 48-452(1994)）。また、本発明者らは、ゲノム中に遺伝子７１の機能不全領域を含むＥＨＶ−１ウィルスには免疫原性があることを見つけた。このようなウィルスは、ワクチン処方剤の成分として、また、ＥＨＶ−１感染に対する治療用組成物として使用できる。このように、本発明に関係するのは、遺伝子７１タンパク質をコードする領域中、特に、天然のゲノムのヌクレオチドの129,096番目と131 ,489番目との間に存在する機能不全領域を含むＥＨＶ−１ウィルスである。発明の説明本発明の第一の局面は、ウィルスゲノムのＵ_S領域の中に存在する機能不全な遺伝子７１領域を含むように改変された組換え生存ＥＨＶ−１ウィルスと、薬学的に許容される担体とを含むワクチン処方剤を提供する。「機能不全な遺伝子７１領域」とは、天然のポリペプチドまたは機能的に等価なポリペプチドをコードすることが実質的にできない領域のことである。すなわち、「機能不全な遺伝子７１領域」とは、遺伝子７１領域が、天然のＥＨＶ−１の遺伝子７１のポリペプチドまたはその機能的に等価な産物を発現しないように、欠失、挿入、または置換（または、再配列などによる、ＤＮＡ配列の別の変化）によって、遺伝子７１領域が改変されていることを意味する。ＥＨＶ−１の遺伝子７１は、797個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードしており、このペプチドは、192kDaのO−結合糖タンパク質であることが分かっている（Sun Y.ら、Journal of General Virolog y 75,pp.3117-3126(1994)）。したがって、本発明の改変ＥＨＶ−１ウィルスを含むワクチン処方剤は、組換えＤＮＡ技術による、一もしくはそれ以上の方法で改変したウィルスを含んでもよい。作出される改変のタイプの例には、以下のものが含まれうる。（i）野生型ＥＨＶ−１ウィルスのゲノムの遺伝子７１全部の欠失。例えば、約129,096番目から約131,489番目のヌクレオチドの間にある野生型ＥＨＶ−１ウィルスのゲノムから塩基配列を欠失させること。（ii）野生型ＥＨＶ−１ウィルスのゲノムからの遺伝子７１の一部の欠失。「遺伝子７１の一部」とは、遺伝子７１の欠失変異体によってコードされたポリペプチドをもたらすのに充分で、それによって、野生型ＥＨＶ−１によって産生される天然のポリペプチドの生理学的活性と同様の活性を実質的に発現させることができない欠失を意味する。この欠失は、野生型ＥＨＶ−１ゲノムの約129,096番目から約131 ,489番目のヌクレオチドの間にある塩基配列を50％から100％欠失させたものでもよい。また、この欠失は、遺伝子７１の塩基配列の70％から100％、または、遺伝子７１の塩基配列の70％から90％、例えば、遺伝子７１の塩基配列の80％でもよい。（iii）上記の（i）および（ii）で説明されているような、遺伝子７１またはその一部の欠失によって、ＥＨＶ−１ゲノムの中に遺伝子７１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはその一部に対応した「すき間（gap）」ができる。この「すき間」の中に、マーカー遺伝子などの適当な遺伝子または複数の遺伝子を挿入することができる。適当なマーカー遺伝子には、例えば、大腸菌（ E.coli）からのｌａｃ−Ｚ遺伝子、ヒグロマイシン、ネオマイシンなどの抗生物質マーカー遺伝子のような酵素マーカー遺伝子が含まれるが、これらに限定はされない。このようなマーカー遺伝子は、当技術分野において広く用いられている。一般的に、本発明の遺伝子７１欠失変異体に用いることのできるマーカー遺伝子は、もし用いるとすれば、受容動物にとって実質的に有害な、または長期間継続する副作用をひき起こすものであってはならない。好ましい態様においては、野生型ＥＨＶ−１ウィルスの遺伝子７１またはその一部の欠失によって作出された「すき間」に遺伝子を挿入して充填せず、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて、ゲノムの２つの断片の切断末端を連結させる。当業者は、「欠失変異」という用語には、遺伝子７１の部分的な、または全体的な欠失によってできる「すき間」を、例えば、マーカー遺伝子、またはナンセンスな塩基配列（すなわち、タンパク質またはポリペプチド産物を作ることができない配列）などの遺伝子の挿入によって充填している状態と、またはすき間を非相同性のまたはその他の塩基配列で充填していない状態との双方が含まれることを理解していよう。このような場合、ゲノムの２つの断片の適当な遊離末端を一緒に連結させる。（iv）遺伝子７１領域内部の欠失は、少数のヌクレオチド、例えば、１個、２個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含むことができる。このような欠失は、組換えＤＮＡ技術を用いて行なうことができる。すなわち、翻訳ＯＲＦを変更して、天然の遺伝子７１ポリペプチドの生理学的機能をもたないタンパク質を産生させることができる。また、当業者は、遺伝子７１の翻訳ＯＲＦのこのような欠失によって、ポリペプチド全体や、トランケートされたペプチドもしくはいずれのペプチドでさえもコードすることができない機能不全な遺伝子７１を生じるであろうことも理解していよう。このようなタンパク質は、産生されるとすれば、一般的に、正常な遺伝子７１のＯＲＦのタンパク質産物の生理学的機能を持たない。（v）機能的な活性を実質的にもたない機能不全の遺伝子７１ポリペプチドを産生させる組換えＤＮＡ技術を用いて、ＥＨＶ−１の遺伝子７１領域にヌクレオチドを挿入することもできる。例えば、遺伝子７１領域に終止コドンを挿入して、天然の遺伝子７１によってコードされるポリペプチドの非機能的な断片を産生させることができる。当業者は、このようなヌクレオチド挿入は、１もしくはそれ以上のヌクレオチドから、例えば、翻訳ＯＲＦを変更して、ポリペプチドを産生させなくするか、または遺伝子７１の天然のポリペプチドの生理学的機能をもたないタンパク質を実際に産生させるような効果をもつナンセンス塩基配列を作出する多数のヌクレオチドに至るまで、どのような長さでもよいことを理解していよう。また、当業者は、遺伝子７１の翻訳ＯＲＦのこのような挿入によって、ポリペプチド全部やトランケートされたペプチドもしくはいずれのペプチドでさえもコードすることができない機能不全な遺伝子７１を生じるであろうことも理解していよう。このようなタンパク質は、産生されるとしても、一般的に、生理学的機能を持たない。勿論、当業者は、上記で概述されているような、野生型でないＥＨＶ−１ウィルスからの遺伝子７１の欠失および挿入が、本発明に含まれることを理解していよう。好ましい態様において、弱毒化された免疫原性のある組換えＥＨＶ−１遺伝子７１の欠失変異生存ウィルスと、薬学的に許容される担体とを含むワクチン処方剤が提供される。本発明の第二の局面において、ワクチン接種用薬剤として、またはワクチン処方剤中で使用するための機能不全な遺伝子７１領域を含む組換え生存ＥＨＶ−１が提供される。好ましくは、ワクチン接種用薬剤として、またはワクチン処方剤中で使用するための、弱毒化された免疫原性のある、ＥＨＶ−１遺伝子７１の組換え欠失変異生存ウィルスが提供される。組換え生存ＥＨＶ−１は、遺伝子７１の実質的な一部、または遺伝子７１全部に代わって、遺伝子７１の位置にある挿入された遺伝子を任意に含むことができる。一般的に、ワクチンまたはワクチン処方剤は、流産の原因となるために、妊娠していない動物には使用されない。本発明の第三の局面において、ＥＨＶ−１に対する抗体または細胞媒介性免疫を産生するための組換え生存ＥＨＶ−１ウィルスの使用が提供され、このウィルスはＥＨＶ−１感染を予防、および/または治療するためのＥＨＶ−１ワクチンを製造するために、ウィルスのゲノムのＵ_S領域の中にある機能不全の遺伝子７１領域を含むウィルスである。好ましくは、ＥＨＶ−１感染を予防、および/または治療するためのＥＨＶ−１ワクチンを製造するために、弱毒化された免疫原性のあるＥＨＶ−１の遺伝子７１の組換え生存欠失変異ウィルスを使用することが提供されている。もっとも好ましくは、この使用は馬で行われる。本発明の第四の局面において、ウィルスのゲノムのＵ_S領域の中にある機能不全の遺伝子７１領域を含むように改変された組換え生存ＥＨＶ−１ウィルスを含むワクチン組成物を、それを必要とする動物に投与することを含む、動物を治療する方法が提供されている。好ましくは、その動物は馬である。好ましくは、さらに、弱毒化されて免疫原性のあるＥＨＶ−１遺伝子７１の組換え生存欠失変異ウィルスを含むワクチン組成物を、必要のある動物に投与することを含む、動物を治療する方法が提供されている。勿論、ワクチン処方剤は、経口投薬（例えば、腸溶性コート錠剤として）、または非経口、その他の方法によって投与するための処方とすることができる。本発明は、また、改変されたＥＨＶ−１ウィルス生ワクチンを調製するための方法において、本発明に係るウィルスを適当な担体またはアジュバントと混合することを含む方法を提供する。弱毒化生ワクチンを調製するために、常法を用いることができる。本発明のワクチンを投与する方式は、免疫予防的な用量の本発明のウィルスを患者に輸送するものであれば、どのような経路によってでもよいが、好ましくは、筋肉内経路または皮下深部経路によって非経口的にワクチンを投与する。望むなら、経口投与、またはその他の非経口経路、すなわち皮内、鼻腔内、または静脈内など、この他の投与方式を用いることもできる。一般的に、ワクチンは、通常、例えば、生理食塩水または発熱性物質を含まない（apyrogenic）水などの注射可能な担体などのような担体または賦形剤を含む薬学的な処方剤として提供される。処方剤は、常法に従って調製することができる。このような免疫予防的で非毒性の適切なワクチンの用量は、当業者が容易に決定することができる。すなわち、本発明のワクチンに含まれる、免疫予防的で非毒性の適切な用量のウィルスは、従来の全ウィルスワクチンにおける、抗原の有効量の範囲内となるであろう。しかし、それぞれの受容動物に対する具体的な投薬レベルは、年齢、全身の健康状態、ならびに性別、投与時期、投与経路、投与されている別の薬品との協働効果、および求められている防御の程度などを含むさまざまな要素に依存する。勿論、必要であれば、適当な間隔を置いて、繰り返して投与することができる。以下の図面と実施例によって、本発明の態様を具体的に説明する。図１：遺伝子７１を欠失、置換するために構築された、ＥＨＶ−ＩＤＮＡとプラスミドの配列構成を示す概略図。行番号１は、Ｕ_LとＵ_S、および倒置反復配列領域（IR_LとTR _S ）からなるＥＨＶ−１ゲノムである。拡大されたクローン断片：ｐＵ７１の5.8 -kbのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片（行番号２）。行番号３は、遺伝子の位置と方向。行番号４は、構築された遺伝子７１の欠失置換プラスミドｐＤ７１の配列構成である（行番号４）。直線の間のすき間は、ｌａｃＺ（四角）によって置換された欠失領域を示す。関係する制限酵素部位：Ｂａ、Ｅｃ、ＥｃｏＲＩ；Ｍｓ、Ｓｇ、およびＢａｍＨＩ。図２：欠失置換変異体のゲノム構造。遺伝子７１を包含するゲノム領域内にある制限酵素部位が示されている。野生型ウィルスゲノムが行番号１で示されており、欠失と置換が行番号２で示されている。ＳｍａＩで消化して作製された関連断片が示されている。断片の大きさはkbで示されている。関係する制限酵素部位は、Ｍｓ、Ｓｍ、Ｓｇである。図３：Ａｂ４ｐを接種したマウスのウィルス力価（titre）図４：ＥＤ７１を接種したマウスのウィルス力価図５：ＥＤ７１の復帰変異体を接種したマウスのウィルス力価図６：予めＲＫ細胞溶解液で免疫した、攻撃誘発（チャレンジ）マウスで見られるウィルスの平均力価図７：予めＡｂ４ｐで免疫した、攻撃誘発（チャレンジ）マウスで見られるウィルスの平均力価図８：予めＥＤ７１で免疫した、攻撃誘発（チャレンジ）マウスで見られるウィルスの平均力価標準的な方法は、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning- A Laboratory Manual）」、第２版、サムブルック（Sambrook J.）ら、コールドスプリングハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、198 9）において説明されている。実施例第一部方法細胞とウィルス新生児ハムスター腎臓クローン１３（BHK-21/C13；Macpherson I.およびStoke r M.G.(1962)Virology 16,pp.147-151）を既述された（Brownら、1973 J.Gen.Virol.18 pp.32-346）ようにして増殖させた。本研究においては、ＥＨＶ−１Ａｂ４株を野生型株として用いた。１％ウシ胎児血清入りのＭＥＭ中に維持されているウマ上皮ＮＢＬ−６細胞に低い感染多重度で感染させて、継代回数１３回目のウィルスのストック調製物を作製した。遺伝子７１のＯＲＦを除いて、大腸菌のｌａｃＺ遺伝子で置換したＥＤ７１の変異体と、ＥＤ７１の欠失が回復された復帰変異体Ｒｅ７１とについては既に説明されている（Sun Y.とBrown,S.M.、（1994）Virology 199,pp.448-452；Sun Y.ら( 1994)J.Gcn.Virol.75,pp.3117-3126）。ウィルス粒子の精製と定量 Cunningham C.(1991)J.Gen.Virol.27,pp.661-668、およびSunら、（1994）前記によって述べられているところにしたがった。回転培養瓶中のＢＨＫ−２１/Ｃ１３の単層に、細胞当りの感染多重度（multiplicity of infection:m.o.i.）0. 01または５p.f.u.でウィルスを感染させた。感染後（post-infection:p.i.）72 時間または20時間後に、上清を回収し、2500r.p.m.で20分間遠心分離して、細胞残滓を取り除いた。12000r.p.m.で２時間遠心分離して、上清中のウィルスをペレット化し、このペレットを、フェノールレッドを入れない１mlのイーグル培地に穏やかに再懸濁して、５％から15％のフィコール濃度勾配上に置いてから、４ ℃、２時間、12000r.p.m.で遠心分離した。側面を破って回収したウィルス粒子のバンドを希釈して、４℃、２時間、21000r.p.m.でペレット化した。ウィルス粒子のペレットを、200μlのイーグル培地に穏やかに再懸濁し、−70℃で保存した。ＢＨＫ−２１/Ｃ１３細胞に関して滴定を行なって、感染度を測定した。電子顕微鏡によって粒子数を測定した。精製した変異型および野生型のウィルスの比感染度（粒子p.f.u.比率）を表１に示す。表１：ＥＤ７１および野生型ＥＨＶ-１ウィルスの比感染度（粒子/p.f.u.比） ^*細胞当り0.01p.f.u.のm.o.i.でウィルスに感染させ、感染から72時間後に回収された、４×10⁸個のＢＨＫ−２１/Ｃ１３細胞からのウィルス +細胞当り５p.f.u.のm.o.i.でウィルスに感染させ、感染から20時間後に回収された、４×10⁸個のＢＨＫ−２１/Ｃ１３細胞からの精製ウィルス粒子本発明の適切な遺伝子７１欠失変異ウィルスは、Sun Y.とBrown S.M.の教示するところ（前記）に従って調製した。実施例１要約すると、遺伝子７１を含む断片をクローン化するために、ウマの上皮細胞（NBL-6）に、ＥＨＶ−１Ａｂ４株（Gibson J.S.ら、Arch.Virol.124,pp.351- 366(1992)）を細胞当り0.01pfuで感染させ、Dumasら、J.Gcn.Virol.47,pp.233-2 35(1980)によって述べられているようにして、後代のウィルス粒子を５〜55％（ w/v）スクロース密度勾配上で遠心分離して精製した。ＥＨＶ−１Ａｂ４のゲノムＤＮＡを、精製したウィルス粒子から抽出して、いろいろな制限酵素で消化した。例えば、関連する断片である5.8kbのＢａｍＨＩ/ＥｃｏＲＩ断片（126,517 から132,305番目の残基）をベクターｐＵＣ１９の中にクローニングして、ＢａｍＨＩ/ＥｃｏＲＩ部位に挿入された5.8-kbのＢａｍＨＩ/ＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＵ７１を構築した（図１）。欠失プラスミドを構築するために、クローン化したプラスミドを、単一の部位で切断する制限酵素によって消化して、遺伝子７１のコーディング配列の大部分を取り除いた。隣接配列を、単一のＳｐｅＩ部位を含む相補的な合成オリゴヌクレオチドによって再連結して、ｌａｃＺ遺伝子と、その上流の同じ読み枠にある終止コドンを挿入し、ｌａｃＺの融合蛋白質の合成を防止した。ｐＦＪ３からの4.1-kbのＸｂａｌ断片上のｌａｃＺ遺伝子（Rixon F.J.とMcLauchlan J.,J.Gen.Virol.71,pp.2931-2939(1990)）を、このＳｐｅｌ部位に挿入した。ｌａｃＺは、遺伝子転写産物と同じ方向に向いていた。この構築物は、欠失した遺伝子に残っているN末端側アミノ酸からなる非常に短いポリペプチドだけをコードしているかもしれない。このようにして、ｐＵ７１のＭｓｃＩ部位からＳｇｒａＡＩ部位まで（129, 211−131,022番目の残基）が欠失した欠失プラスミドｐＤ７１を作製した（図１）。実施例２ウィルスの変異体を作出するために、１-２μgのＥＨＶ−１Ａｂ４のＤＮＡを、さまざまな量（0.2から４μg、約２倍から20倍過剰なモル濃度）の直鎖化した欠失プラスミドｐＤ７１により、子ウシ胸腺担体ＤＮＡの存在下、Stow N.D. とWilkie N.M.,J.Gen.Virol.33 pp.447-458(1976)によって説明されているリン酸カルシウム沈殿/ＤＭＳＯ法を用いて、ＢＨＫ−２１／Ｃ１３細胞（MacPherso n I.とStoker M.G.,Virology 16,pp.147-151(1962)）に共感染（コトランスフェクト）させた。この細胞を５％のウシ新生児血清を含むイーグル培地中、37℃でインキュベートした。c.p.e.が行き渡ったところで、ウィルスを回収して、メチルセルロースの下にあるＢＨＫ２１/Ｃ１３細胞について滴定した。感染２日目に、各培養皿に、0.7mg/mlのＸ−ｇａｌを含むメチルセルロース培地をさらに２ ml加えた。それぞれの青色のプラークを分離して、さらにプラーク精製を繰り返した。ｌａｃＺ置換をもつ変異体を単離した。遺伝子７１の2393bpのＯＲＦから 1811bpが欠失したＥＤ７１である。³²Ｐ標識化欠失配列のプローブによるサザンブロッティングによって、変異体の欠失領域を確認した。サザンブロッティングと、ウィルス保存液を調製する前に、³²P標識化ウィルスＤＮＡの制限酵素消化とによってこのウィルス変異体の構造を確認した。³²Ｐ標識化ウィルスＤＮＡの制限酵素消化を図２に図解した。遺伝子７１は、野生型ウィルスＤＮＡの3.8-kbのＳｍａＩ断片の中に存在する。遺伝子７１の欠失と、ｌａｃＺ遺伝子による置換によって、3.8-kbの断片の消失と、新たなより大きい6.2-kbの断片の生成がもたらされる。この変異体は、予想通りのゲノム構造をもち、その他には、野生型のウィルスＤＮＡとの検出できるような違いは見られなかった。実施例３組織培養における、変異体の増殖特性も調べた。ＢＨＫ−２１／Ｃ１３細胞の単層に、細胞当りの５pfuと0.01pfuの感染多重度（m.o.i.）で、野生型ウィルスとその欠失置換変異体ＥＤ７１を別々に感染させた。培養液を回収して、全部で７２時間の間、間隔をとって超音波破砕によってウィルスを放出させた。プラークアッセイによってウィルスの力価を測定し、その増殖パターンを野生型ウィルスの増殖パターンと比較した。変異体のプラークの形態は、野生型ウィルスのプラークと明確な差異はなかった。変異体ＥＤ７１は、増殖が遅く、最終収量を野生型ウィルスと比較すると、約５倍減少していた。同様の結果が、感染多重度が高いときにも見られた（データは示さない）が、ＥＤ７１変異体の収量の低下は、多重度が低いときよりも少なかった。この変異体が温度感受性であるかどうか、または宿主範囲表現型を持っているかを判定するために、さまざまな温度（31℃、37℃および38.5℃）で、細胞当りの５pfuという高m.o.i.でＢＨＫ−２１／Ｃ１３細胞の中で増殖させ、さらに、37℃で、ＮＢＬ−６細胞、ベロ（Vero）細胞、ＨＦＬ細胞、および３Ｔ６細胞の中で増殖させた。感染24時間後に、この培養液を回収して、ＢＨＫ−２１／Ｃ１３細胞中で後代ウィルスの力価を調べた。ＥＤ７１変異体は、38℃では、 31℃のときよりも10倍増殖が遅くなり、38.5℃のときの野生型ウィルスと比較される（データは示さない）。ＥＤ７１変異体の増殖が僅かに低下することが、ＢＨＫ−２１／Ｃ１３細胞だけでなく、ＮＢＬ−６細胞、ベロ（Vero）細胞、ＨＦＬ細胞、および３Ｔ６細胞でも見られた。したがって、遺伝子７１は、細胞培養においては、ＥＨＶ−１の増殖に必須ではないと結論される。実施例４：感染実験：死亡率と病徴材料と方法ウィルス株野生型ウィルスと変異ウィルスを、ケンブリッジの臨床獣医学科において、ＲＫ細胞中で増殖させるか、グラスゴーのウィルス研究所において、ＢＨＫ細胞中で増殖させた。一次感染実験用の野生型は、ＥＨＶ−１のＡｂ４ｐ株であった。予め免疫したマウスに攻撃誘発（チャレンジ）するために用いられたウィルスは、ＥＨＶ−１のＡｂ４株であった。マウスのモデル３-４週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（Bantin and Kingman，英国）を入手した。イソフルオラン/酸素麻酔下で、鼻腔内からマウスに接種した。組織培養ＲＫ細胞の単層を、10％の新生ウシ血清とアール（Earle）の塩類を含むイーグル最少必須培地（EMEM）で培養した。ウィルス力価測定各グルーブ当り３匹のマウスから得られた組織サンプルを、ウルトラターラックス（Ultraturrax）電動ホモジナイザーを用いて破砕した。そして、氷冷した水槽中で、サンプルを超音波破砕してから、低速度で遠心分離し細胞残滓を分離した。上清の１０倍連続希釈液を作って、各希釈液100μlをＲＫ細胞の集密状態の単層に接種し、２回反復した。細胞層にウィルスを45分間吸着させてから、４％ウシ胎児血清と２％カルボキシメチルセルロースを含む培地によって、すべてのサンプルを覆った。37℃で約３日間培養皿をインキュベートしてから、 20％エタノール中のクリスタルバイオレットで固定・染色する前に、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。実験プロトコール３匹のマウスからなる、感染後１日目、３日目、５日目のグループを、０.15m lのペントバルビトン・ナトリウせ、組織を取り出して、１mlのウィルス分離用培地の中に入れ、-70℃で凍結させてから、ウィルスの増殖について力価を測定した。取り出した組織サンブルは、肺、鼻甲介、嗅球、および三叉神経節であった。別のマウスグループにおいて、感染後０日目から８日目までの病徴を観察した。免疫学的な検査を行なうために、感染後８日目、16日目、23日目、および30日目に、血液サンプルを採取した。次いで、生き残った動物のグループに、マウス１匹当り５×10⁸pfuの用量のＥＨＶ−１Ａｂ４株で攻撃誘発（チャレンジ）を行った。組織サンプルを上記のようにして採取して、病徴を観察した。死亡率と臨床結果を表２に示す。ウィルスの力価測定結果を図３から図８と表４（ａ）−４（ｄ）に示す。死亡率と病徴表２ ^*病徴は、感染後１日目と８日目に観察した。実施例５：免疫学−ＥＬＩＳＡ TEwari D.ら（1994）Journal of Gen.Virol.75,pp.173 5-1741のプロトコールに従った。結果を表３に示す。表３ＥＬＩＳＡ急性段階攻撃誘発（チャレンジ）後表４（ａ）攻撃誘発（チャレンジ）後１日目表４（ｂ）攻撃誘発（チャレンジ）後３日目表４（ｃ）攻撃誘発（チャレンジ）後５日目表４（ｄ）攻撃誘発（チャレンジ）後８日目実施例第二部１．実験の詳細試験は、ポニーの仔ウマで行ない、ワクチンを接種するグループと接種しないグループ（対照グループ）である、１グルーブ当り３頭からなる２つのグループを用いて行なった。この試験動物は、ＥＨＶ−１中和抗体とＥＨＶ−１補体結合（CF）抗体とを全く持っていないか、少ししか持っていないことに基づいて選ばれた。実験グループは、別々の部屋で、出入りする空気を濾過して隔離しながら飼った。仔ウマ７、１５、および２０に、それぞれ、ネオマイシン（100μg/ml ）、２％のγ照射ウシ胎児血清（Fcs）（ティシューカルチャーサービス（Tissu e Culture Service）社）を含む2.0mlのＭＥＭ（ギブコ（Gibco）社）中に加えた6.0log₁₀TCID₅₀の遺伝子７１欠失ＥＨＶ−１（ED71）を、1.0mlずつ鼻孔の中に投与して、経鼻的にワクチンを接種した。ワクチン接種後、ワクチンを接種した試験用仔ウマ（内部番号７、１５、および２０）と対照用仔ウマ（内部番号５、８、および１６）の両方について、２週間の間毎日鼻腔のスワブ（swab）を採って、上気道部におけるウィルス複製を調べた。６頭の動物はすべて、時折採血して、ＥＨＶ−１中和抗体とＣＦ抗体について、それらの血清を調べた（表７）。ワクチン接種から51日後に、野生型株ＡＢ−４の鼻腔内攻撃誘発（チャレンジ）による感染を行ない、２つのグループの仔ウマに、それぞれ、２％ＦＣＳを添加した2.0mlのＭＥＭ培地中に6.0 log₁₀TCID₅₀のＡＢ−４を加えたものを与えた。攻撃誘発（チャレンジ）後に行われた処理手順は、ワクチン接種後の処理と同じであった。すなわち、上気道部におけるウィルスの増殖を評価した（表５）。表５実験グループと処理手順２．結果２.１上気道部におけるＥＤ７１ウィルスの複製常法に従って、ウィルスを鼻腔スワブから、上記のような添加物を加えたＭＥＭ培地の中で分離した。鼻腔内にワクチン接種した後の日毎の鼻腔スワブからウィルスを分離した結果を表６に示す。低い力価のＥＤ７１ウィルス（ほとんどが、3.0log₁₀ TCID₅₀/ml以下であった）が、ワクチンを接種した３頭の仔ウマうち２頭から、すなわち、仔ウマ７号からは２日目と３日目に、および仔ウマ15号からは１−５日目に分離された。対照用の仔ウマからは、14日を過ぎても、日毎の鼻腔スワブからＥＨＶ−１は回収されなかった。２.２ワクチン接種後の血清学的反応血清で、ウィルス中和（ＶＮ）抗体と補体結合（ＣＦ）抗体との力価を調べた。ワクチン接種と攻撃誘発（チャレンジ）の両者についてのThompson G.R.ら、E quine Vet.Journal Vol.8 pp58-65の方法に従って行なったＶＮ試験の結果を表７に示し、Thompsonらの前記の方法（ワクチン接種のみ）に従って行なったＣＦ試験の結果を表８に示す。２つの異なるＥＨＶ−１の株、すなわち、ＥＤ７１ウィルス（親株はＡＢ−４）とM３に対するＶＮ試験では、力価に関して有意な違いは示されなかった。ワクチンを接種したグループにおいては、３頭の仔ウマはすべて、鼻腔内ワクチン接種時において、僅かに検出できる程度のＶＮ抗体陽性であった。３頭の動物はすべて、すなわち、７号と２０号は、４週目までに、また15号は２週目までに有意な抗体反応（４倍以上の増加）を示した。攻撃誘発（チャレンジ）するまでは、対照用動物ではＶＮ抗体の生成はなかった。ＥＨＶ−１に対するＣＦ試験によって、３頭の仔ウマのうち２頭（15および 20）が、ワクチン接種後２週目までに有意な上昇（４倍以上の増加）を示し、仔ウマ７号は、ワクチン接種時において高い活性を有していた（表８）。対照用動物（５、８、および16）は、ＣＦ抗体力価について、有意な変化は示さなかった。ウィルス分離の結果に合致して、対照用動物においてはセロコンバージョンが見られず、野外感染もＥＨＶ−１の再燃もなかったことを示していた。３．攻撃誘発（チャレンジ）の結果３.１上気道部における攻撃誘発（チャレンジ）ウィルスの複製鼻腔スワブからウィルスを分離した結果を表９に示す。低力価のウィルス（2.0log₁₀ TCID₅₀/ml）が、３頭の仔ウマのうち１頭だけ（７号）から２回（１日目と２日目）分離された。これは、対照用の仔ウマ（５、８、および16号）からは、３日間（５号）から５日間、６日間（８号と16号）ウィルスがずっと高い力価で回収されたのとは顕著な対照をなしている。３.２攻撃誘発（チャレンジ）ウィルスによる血症（viraemia）白血球から、攻撃誘発（チャレンジ）ウィルスＥＨＶ−１を分離した結果を表１０に示す。ＥＤ７１をワクチン接種した仔ウマでは、攻撃誘発（チャレンジ）ウィルスは検出されなかった。これに対して、対照用の仔ウマはすべて血症（vi raemia）に罹り、ピーク時には、２×10⁷個の細胞当り12から200個の感染白血球を生じた。表６上気道部におけるワクチンウィルスの複製 aは、ウマの上皮細胞において、４×200μlの最低希釈率（10^-1）の鼻腔スワブ希釈液測定ではEHV-1が分離されなかったことを意味する。表７ウィルス中和（VN）抗体反応 a VN試験は、ED71ウィルス（左）とEHV-1 M8（右）に対して行なった。力価は完全に中和する血清希釈率の逆数を意味している。200（ED71）から316（M8） TCID₅₀のEHV-1。 b Vacは、０週目のワクチン接種を意味する。 c 攻撃誘発（チャレンジ）は７週目に行なった。表８ EHV-1に対する補体結合（CF）抗体反応 a Vacは、０週目のワクチン接種を意味する。表９上気道部における攻撃誘発（チャレンジ）ウィルスの複製表１０鼻腔内からのＥＨＶ−１による攻撃誘発（チャレンジ）の後の白血球血症（Leuk ocyte viraemia） a クエン酸を添加した血液10mlからのバフィーコート細胞層を、パーコール（percoll）緩衝剤上で分離し、リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄して、希釈液当り８つの単層と、３つの10倍希釈液（ＭＥＭ、ネオマイシンを添加した、10％の γ線照射ＦＣＳ）を用いて、ウマ上皮細胞の単層（アニマル・ヘルス・トラスト（Animal Health Trust）、サフォーク州ニューマーケット（Newmarket,Suffolk ））中で測定した。 b 37℃で２回連続継代した後は、EHV-1は分離されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者ブラウン、スザンヌモイライギリス国ジー12 ０エスエヌグラスゴウベルスホーロード５キルーア (72)発明者スン、イーイギリス国ジー12 ８エルジーグラスゴウサウスパークテラス８／ジー (72)発明者フィールド、ヒュージョンイギリス国スィービー３７ジェイビーケインブリッジヘイズリングフィールドモスドライブ５

Claims

【特許請求の範囲】１．ウィルスゲノムのＵ_S領域の中にある機能不全の遺伝子７１領域を含むように改変された、組換え生存ＥＨＶ−１ウィルスと、薬学的に許容される担体とを含むワクチン処方剤。２．弱毒化され、免疫原性を有する組換え生存ＥＨＶ−１遺伝子７１欠失変異ウィルスと、薬学的に許容される担体とを含む請求項１に記載のワクチン処方剤。３．組換えＥＨＶ−１ウィルスの機能不全遺伝子７１の領域が、野生型ＥＨＶ −１のゲノムの129,096番目のヌクレオチドから131,489番目のヌクレオチドまでの間に、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失を含むものである、請求項１または請求項２に記載のワクチン処方剤。４．組換えＥＨＶ−１がマーカー遺伝子を含む、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン処方剤。５．ワクチン接種用の薬剤として使用するための、機能不全な遺伝子７１の領域を含む組換え生存ＥＨＶ−１。６．ワクチン接種用の薬剤として使用するための、弱毒化され、免疫原性を有する組換え生存ＥＨＶ−１遺伝子７１欠失変異ウィルス。７．ＥＨＶ−１感染を予防、および/または治療するためのＥＨＶ−１ワクチンの製造における、組換え生存ＥＨＶ−１遺伝子７１欠失変異ウィルスの使用。８．ウィルスゲノムのＵ_S領域の中にある機能不全の遺伝子７１領域を含むように改変された、組換え生存ＥＨＶ−１ウィルスを含むワクチン組成物を動物に投与することを備える動物の治療方法。９．前記動物がウマである、請求項８に記載の方法。１０．ワクチン組成物が、弱毒化され、免疫原性を有する組換え生存ＥＨＶ− １遺伝子７１欠失変異ウィルスを含む、請求項８または請求項９に記載の方法。