CN101659966A - 禽ⅰ型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的构建方法及其应用。包括该通用载体(T－Us)的构建：主要包括设计合成了绿色荧光和新霉素基因(S－g－n)，在SV40早期启动子调控下高效融合表达作为通用载体的报告和筛选基因；选择了MDV复制非必须区US10作为外源基因插入位点，同时筛选了通用载体同源臂(U)的最适长度，左、右长度分别为1000－2000bp之间；新合成改造了多克隆位点，并引入合适的间隔子，构建表达盒(C－M－A)，以上元件连接后构建通用载体(T－Us)。应用该通用载体与禽I型马立克病毒共转染，获得了一株重组禽I型马立克病病毒CVI988－26株，为新型马立克病疫苗的研制奠定了坚实的基础。

Description

禽Ⅰ型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种禽I型马立克病病毒疫苗株基因工程通用载体的构建方法和在获得的重组禽I型马立克病病毒疫苗毒株方方面的应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

马立克病病毒(Marek′s Disease Virus，MDV)，学名为禽疱疹病毒2型(Gallidherpesvirus 2)，是鸡的重要传染病病原，并具有致肿瘤特性(陆承平主编.兽医微生物学.第四版，中国农业出版社，2007，359)。马立克病病毒Marek′s Disease Virus，MDV)引起鸡一种高度接触性传染性肿瘤病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和各内脏器官的淋巴样细胞浸润、增生和肿瘤形成为特征，传播速度快、潜伏期长。它在世界范围内流行，使严重危害养禽业发展的三种主要疫病之一。利用血清学技术，可将马立克病病毒其分为3个血清型：I型马立克病病毒强病毒株及其致弱毒株(MDV)，天然不致瘤株(MDV2)，天然不致病的HVT。在MDV基因组中含有许多病毒复制的非必须区，这为重组马立克病病毒的构建提供了理论基础。

在MDV三个血清型的疫苗毒株中，禽I型马立克病病毒更适于构建重组疫苗病毒，如CVI988株比火鸡疱疹病毒(HVT)更具优越性，因为其与流行毒株抗原性更接近，除此以外作为重组病毒载体还具有如下优点：(1)MDV为细胞结合性病毒，可持续感染。经疫苗免疫的鸡可终生带毒，产生持久的免疫力。(2)MDV疫苗接种后，病毒在细胞间传播，因而不受母源抗体的干扰。(3)MDV的基因组较大，可插入多个外源基因，现在已经研究清楚US区有多个外源基因插入位点，在US基因中插入外源基因片段不会影响病毒的复制。(4)该病毒的自然宿主只有禽类，对其它家畜和人类是安全的。

随着对MDV的毒力相关的基因或分子位点和结构研究的深入，研究方向转向马立克病病毒基因工程重组疫苗，即利用已有的马立克病病毒疫苗毒株作为活载体，表达其它病原的保护性抗原基因，如以HVT为载体表达IBDV的VP2基因及NDV F基因等。其技术核心是利用同源重组原理，将外源抗原基因插入MDV中并表达，具有抗多种病毒的效果。重组MDV构建中最关键的一步，是构建MDV转移载体。李永清、周雪媚、张培君等发明的是一种转移载体pUS2-LacZ，其特征在于重组质粒pUS2上的US2基因片段由CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点基因替换。通过与MDV疫苗病毒同源重组并纯化筛选，获得LacZ标记基因的重组病毒MDV(《重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用》(公开号：CN1763205；)。

现在已有报道的MDV转移载体，筛选基因和标记基因都是单独使用，这造成现有的MDV转移载体，在应用中存在一些问题和缺点。如果单独使用筛选基因，如氨苄青霉素、新霉素标记基因，其缺点在于无法直观显示重组病毒的数量和重组病毒的纯度，造成实验的盲目性。若是单独采用标记基因，如李永清；周雪媚；张培君等单独使用的标记基因是LacZ，缺点在于重组病毒筛选过程中，无法抑制母源MDV的污染，导致不能有效区分重组病毒和母源MDV，影响筛选效率，造成筛选时间长，易失败。另一方面，已有的载体只能允许一个外源抗原基因的插入表达(《重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用》(公开号：CN1763205；)。以上的缺点限制了现在已有转移载体的应用，无法快速构建重组病毒，阻碍了重组MDV的生产应用。

本发明设计所构建禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体，可以克服已有MDV转移载体的缺点，从而可以快速构建、筛选获得重组MDV，有利于重组MDV疫苗的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是构建一种高效的禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体，为重组马立克病毒基因工程疫苗生产用毒株的研制提供新的可靠技术保障。

发明简述

本发明公开了一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体构建方法及其在构建疫苗生产用重组马立克氏病病毒上的应用。

本发明公开了构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因(S-g-n)的如序列1所示的核苷酸序列。

本发明公开了构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的筛选同源臂(U)，如序列6所示的核苷酸序列。

本发明公开了构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的的表达盒基因，(C-M-A)，如序列9所示的核苷酸序列。

本发明将以上元件的核苷酸序列连接后构建禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体质粒，命名为：T-Us；将该质粒与禽I型马立克病病毒共转染，获得重组病毒，同时还可以验证载体的有效性。

本发明通过基因工程的方法构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体，可通过如下步骤实现：

1)由设计合成的序列2，3和序列4，5所示的两对引物经扩增后获得具有序列1所示的报告和筛选基因核苷酸序列；

2)由设计合成的序列7，8所示的一对引物经扩增后获得具有序列6所示的同源臂基因(U)的核苷酸序列，连入pMD18-T质粒中，构建通用载体同源臂质粒T-U；

3)由设计合成的序列10，11所示的一对引物经扩增后获得具有序列9所示的表达盒核苷酸序列；

4)将以上元件的核苷酸序列在体外连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建成通用载体T-Us。

5)与禽I型马立克病病毒共转染，获得重组MDV同时也进一步验证了通用载体(T-Us)的有效性。

本发明还涉及获得绿色荧光标记基因和新霉素抗性基因的重组MDV，同时通用载体上具有多克隆位点，可插入多个外源病毒基因，通过同源重组得到的重组病毒，可不受母源抗体影响，刺激机体产生对多种病毒的抗体，且能有效保护禽类免遭禽马立克病毒的攻击。

发明详述

本发明公开了一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体构建方法及其在构建疫苗生产用重组马立克氏病病毒上的应用。

本发明公开了构建高效的禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因，该基因是本发明人设计合成了绿色荧光和新霉素基因(S-g-n)，在SV40早期启动子调控下高效融合表达作为通用载体的报告和筛选基因，如序列1所示的核苷酸序列。

本发明选择了MDV复制非必需区US10作为外源基因插入位点，同时筛选了通用载体同源臂的最适长度，左、右长度分别为1000～2000bp之间，如序列6所示的核苷酸序列。将扩增得到的同源臂基因(U)连入T质粒(T即为质粒pMD18-T，是TAKARA公司产品，由pUC18质粒改建，是用于克隆基因的专用质粒)中，构建通用载体同源臂质粒(T-U)。

本发明新合成改造了多克隆位点，并引入合适的间隔子，构建表达盒(C-M-A)，如序列9所示的核苷酸序列。

将以上元件连接后构建通用载体(T-Us)。

与禽I型MDV共转染，获得重组病毒验证载体的有效性。

本发明将增强型绿色荧光基因(来源于pEGFP-C1载体，经扩增改造获得)和新霉素基因(来源于pCDNA3.1(+)质粒，经扩增改造获得)共同作为禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因，以独立的早期启动子调控，高效融合表达，这样获得的重组病毒既可进行药物筛选，同时可以方便直观的检测病毒滴度和含量。为扩增如上所述的报告筛选基因(S-g-n)，本发明设计并合成了如下相应引物：

序列2(G1)：5′-GTGGGTCGACTAGTTATTAATAGTAATC-3′；

序列3(G2)：5′-TGAGATCTACGCGTTAAGATACATTG-3′；

序列4(N1)：5′-GGATCCATGATTGAACAAGATGGA-3′；

序列5(N2)：5′-CTCGAGTCAGAAGAACTCGTCAAG-3′；

构建过程如下：将以引物G1/G2经PCR扩增得到的增强型绿色荧光基因经限制性内切酶BglII和SalI酶切后，回收；以引物N1/N2经PCR扩增得到的新霉素基因经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后，回收(因基因经BglII和BamHI、XhoI和SalI酶切后可分别产生具有互补的序列，因此可以相互连接)与前面回收的增强型绿色荧光基因连接后作为PCR模板，使用引物G1和G2扩增即得到通用载体的报告和筛选基因(S-g-n)。

本发明分析了禽I型马立克病毒的基因组结构和功能，筛选病毒复制的非必需区，在对这些非必需区分析基础上选择基因组中的US10基因作为外源基因的插入位点。这样既能保证不影响禽I型马立克病毒的复制，同时又能保证外源基因的高效、稳定表达，增强了重组马立克病毒的遗传稳定性。本发明选取US10基因两侧的序列作为禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的同源臂(U)，设计合成了一对PCR引物，优选序列7(M1)和序列8(M2)所示序列的引物进行扩增后，将扩增产物连入T载体(T即为载体pMD18-T，是TAKARA公司产品，由pUC18载体改建，是用于克隆基因的专用载体)构建通用载体的同源臂质粒(T-U)。

为扩增通用载体的同源臂(U)设计合成了如下引物：

序列7(M1)：5′-GAGTATTGTGAAGCACT-3′；

序列8(M2)：5′-GAAACTGGTCAGTGGAG-3′；

本发明采用基因工程的方法构建禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的表达盒(C-M-A)。具体过程如下：设计一对PCR引物，优选序列9(C1)和序列10(C2)所示序列的引物进行扩增得到的产物，包含有巨细胞病毒(CMV)早期启动子(Promoter)、多克隆位点(MCS)和转录终止信号polyA基因，在下游引入SalI酶切位点；同时选择合适的间隔子(IR)经EcoRV酶切后连入多克隆位点(MCS)内，构建成表达盒(C-M-A)，这样保证在一个启动子的调控下同时高效表达多个外源基因。

为扩增通用载体的通用载体的表达盒设计合成了如下PCR引物，如序列10(C1)和序列11(C2)：

序列10(C 1)：5′-GTTCTGCTGGTTGACATTGATTATTGA-3′；

序列11(C2)：5′-TAGTCGACCCATAGAGCCCACCGC-3′；

如上所述禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体的核苷酸序列连接后构建通用载体(T-Us)，具体过程如下：

将PCR扩增得到的具有序列1所示的报告基因和筛选基因(S-g-n)和PCR扩增得到的具有序列9所示的表达盒基因(C-M-A)，分别经限制性内切酶SalI酶切，回收，体外连接后作为PCR模板，使用如上引物G1和G2，用可产生平端的Taq酶，经PCR扩增得到包含报告基因和筛选基因(S-g-n)以及表达盒基因(C-M-A)的基因序列(具有平末端)，将报告基因和筛选基因(S-g-n)、表达盒基因(C-M-A)回收；用限制性内切酶PstI酶切并用DNA聚合酶I将两端补平，得到了同源臂基因质粒(T-U)(T即为载体pMD18-T，是TAKARA公司产品，由pUC18载体改建，是用于克隆基因的专用载体)，最后将报告基因和筛选基因(S-g-n)、表达盒基因(C-M-A)一同连入同源臂基因质粒(T-U)，连接产物再转化入大肠杆菌，获得禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体(T-Us)。

禽I型MDV的重组方法如下：

将通用载体(T-Us)质粒转染已经感染CVI988的鸡胚成纤维细胞。待病毒蚀斑出现后，荧光显微镜下观察绿色的荧光病毒蚀斑，结果表明外源性的基因已经被重组到马立克病毒基因组中。经药物筛选5代后(用含0.4mg/ml G418培养液加压24h的CEF细胞，接种重组病毒，37℃继续培养，每24h更换50％的培养液维持G418筛选压力不变，于第5天将感染的细胞消化下来，再接种于新鲜的细胞上，如此重复4次)，即获得纯化的禽I型重组MDV CVI988-26株(或称Gallid herpesvirus 2 CVI988-26，2009年06月18日已将本病毒株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.3132)。

以上结果表明本发明构建的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体(T-Us)可以调控外源基因的高效表达，具备高效、快捷、稳定的特点，克服了已有转移载体的缺点。

本发明的积极意义

本发明构建了禽I型马立克病毒的通用载体(T-Us)，只需几代药物筛选和荧光筛选，实现了在短时间内即获得稳定高效表达外源基因重组病毒的设计目标。同时，本发明也提供了一套重组马立克病毒筛选纯化的工艺，获得了一株重组禽I型马立克病病毒CVI988-26株，该病毒携带有禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us，用该病毒免疫动物可不受母源抗体影响，刺激机体产生对多种病毒的抗体，且能有效保护禽类免遭禽马立克病毒的攻击。为新型马立克病疫苗的研制奠定了坚实的基础。

附图说明

图1绿色荧光蛋白基因的扩增结果该图是本发明实施例通用载体绿色荧光蛋白基因的扩增结果图，其结果与预期结果一致，约1600bp，表明成功扩增得到标记基因绿色荧光蛋白基因。

图2通用载体的表达盒(C-M-A)基因的扩增结果该图显示表达盒(C-M-A)基因的扩增结果的与预期结果一致，片段大小约1000bp，表明成功扩增得到表达盒。

图3同源臂的PCR扩增结果该图显示结果表明成功扩增得到同源臂，约2000bp。

图4重组马立克病毒通用载体鉴定是本发明实施例重组马立克病毒通用载体鉴定图，结果与预期片段大小一致，表明成功构建了通用载体。

图5重组MDV通用载体的构建是本发明实施例重组MDV通用载体的构建图，由图可见重组病毒转移质粒构建的技术路线。

图6重组MDV在CEF细胞上形成的荧光蚀斑是重组马立克病毒在CEF细胞上形成的荧光蚀斑图，结果表明获得了表达荧光的重组马立克病毒，说明禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体是有效的，设计合理，可用于重组病毒的构建。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施进行具体说明：

1.禽I型马立克病毒的繁殖

自液氮中取出冻存的禽I型马立克病毒(毒株名CVI988-1，青岛易邦生物工程有限公司保存提供)，快速置于37℃水浴，快速溶化，低速离心弃上清，以含有8％犊牛血清的1640培养液悬浮细胞，取适量的病毒接种已经长满单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)(按常规方法制备的)上，37℃CO₂温箱培养，待70％病变出现后收集细胞，冻存细胞于液氮中。

2.PCR扩增通用载体的报告筛选基因(S-g-n)、表达盒基因(C-M-A)、同源臂基因(U)克隆与序列测定。(参考附图1、图2、图3)，图1为报告筛选基因(S-g-n)的扩增结果，与预期结果一致，约2400bp，电泳结果表明成功得到报告筛选基因。图2为表达盒基因的扩增结果，由图可见扩增得到约1000bp的目的片段(C-M-A)。图3为同源臂(U)的扩增结果，预期的片段大小一致，约2700bp，琼脂糖电泳结果表明成功扩增同源臂。

3.禽I型马立克病毒的通用载体(T-Us)的构建

将扩增得到的同源臂基因(T-U)经限制性内切酶PstI酶切用DNA凝胶回收试剂盒(购自上海生物工程有限公司)回收，再使用DNA聚合酶I(Klenow Fragment)将两端补平；报告筛选基因(S-g-n)、表达盒基因(C-M-A)分别经SalI酶切后，回收，16℃定向连接，再与补平的同源臂基因(T-U)连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆质粒，构建成通用载体(T-Us)，结果见图4、5。

图4为通用载体的酶切鉴定结果。图4中第1道为标准marker(TAKATADL15000)，具体条带大小见图；第2、3道为通用载体的酶切结果与预期片段大小一致，分别约为650bp和9000bp；第4道为标准marker(TAKATA DL2000)，具体条带大小见图。酶切电泳结果证明，构建的通用载体正确。

测序验证序列和读码框。测序结果表明，构建的禽I型马立克病毒的通用载体(T-Us)与试验设计一致正确，含有完整的报告筛选基因(S-g-n)，同时将CMV启动子及其多克隆位点(C-M-A)与之连接，构成CMV启动子和增强子控制下的外源基因表达盒，插入到含有马立克病毒(MDV)复制非必需区基因(短独特区US10)的克隆片段(T-U)中，构建成重组MDV的通用载体。在该载体中，表达盒的两端分别与两段约1000bp的MDV同源片段连接，用于在病毒内的同源重组。构建成重组马立克病毒的通用载体(T-Us)经测序证明各部件正确连接，且未发生突变和读码框错位。具体构建过程和结果见图5。

碱裂解法(按照《分子克隆》第二版中的方法)大量提取质粒并纯化，用于转染细胞获得重组病毒。

4.按照脂质体介导转化法(依照Lipfectin2000，Invitrogen Corp.的产品说明书操作)用重组MDV的通用载体质粒(T-Us)转染已经感染CVI988的鸡胚成纤维细胞获得重组MDV：

(1)转染前1天，传代CEF，接种6孔细胞培养板，待细胞单层长至80％融合准备转染。

(2)用无血清培养液洗涤，然后用禽I型马立克病毒疫苗株(毒株号CVI988-1)感染细胞，感染量为200PFU，在37℃感作2h，其间每20min摇动病毒感作液一次，然后倒掉感染液，洗涤细胞；

(3)取两只1.5ml无菌Eppendorf管。管A加入2～10μL LIPOFECTIN 2000(购自Invitrogen公司)和100μL无血清培养基OPTI-MEM(购自Invitrogen公司)，混匀后室温静置5min。其间于管B中加入100μL无血清培养基OPTI-MEM和2.0μg/μL的重组MDV的通用载体质粒(T-Us)。

(4)将管A中的LIPOFECTIN 2000和OPTI-MEM混合液滴加至管B中，混匀后于室温静置20min。加入已经感染禽I型马立克病毒的CEF细胞上，37℃5％CO₂培养箱5～8小时，吸弃转染液，加入含5％牛血清的DMEM培养液，37℃培养至72h出现典型的细胞病变，于荧光显微镜下观察荧光(附图6)。出现80％的细胞出现细胞病变后收获病毒。

5.重组马立克病毒的筛选、纯化

将部分收获的重组马立克病毒继续感染用含0.4mg/ml G418培养液(Sigma)筛选重组病毒，重组病毒可表达抗G418的酶因此可以良好增殖，而母源病毒CVI988-1的生长被G418抑制而无法增殖，这样经过4轮的筛选获得纯化的重组马立克病病毒，命名为马立克病病毒CVI988-26株。

具体的筛选、纯化方法如下：

以常规方法使用SPF鸡胚制备原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，37℃培养24h后胰酶消化传代，细胞接入六孔细胞培养板，每孔接入6×10⁶CEF细胞，37℃继续培养细胞长满至80％～90％，接入0.4mg/ml G418，12h后接入收获的重组马立克病毒，37℃继续培养，每24h更换50％的培养液维持G418筛选压力(浓度为0.4mg/ml)不变，于第5天将感染的细胞消化下来，再接种于新鲜的细胞上，如此重复4次，筛选到重组病毒(见图6)。

序列表

<110>青岛易邦生物工程有限公司

<120>禽I型马立克病病毒疫苗株基因工程通用载体

<130>

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2422

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：禽I型马立克病病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因基因

<400>1

TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG     60

CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT     120

GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA     180

ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC     240

AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA     300

CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC     360

CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG     420

ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG     480

GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT     540

ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA     600

CCGGTCGCCA CCATGGTGAG CAAGGGCGAG GAGCTGTTCA ATGATTGAAC AAGATGGATT     660

GCACGCAGGT TCTCCGGCCG CTTGGGTGGA GAGGCTATTC GGCTATGACT GGGCACAACA  720

GACAATCGGC TGCTCTGATG CCGCCGTGTT CCGGCTGTCA GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT  780

TTTTGTCAAG ACCGACCTGT CCGGTGCCCT GAATGAACTG CAGGACGAGG CAGCGCGGCT  840

ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG CGCAGCTGTG CTCGACGTTG TCACTGAAGC  900

GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT GCCGGGGCAG GATCTCCTGT CATCTCACCT  960

TGCTCCTGCC GAGAAAGTAT CCATCATGGC TGATGCAATG CGGCGGCTGC ATACGCTTGA  1020

TCCGGCTACC TGCCCATTCG ACCACCAAGC GAAACATCGC ATCGAGCGAG CACGTACTCG  1080

GATGGAAGCC GGTCTTGTCG ATCAGGATGA TCTGGACGAA GAGCATCAGG GGCTCGCGCC  1140

AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGCG CATGCCCGAC GGCGAGGATC TCGTCGTGAC  1200

CCATGGCGAT GCCTGCTTGC CGAATATCAT GGTGGAAAAT GGCCGCTTTT CTGGATTCAT  1260

CGACTGTGGC CGGCTGGGTG TGGCGGACCG CTATCAGGAC ATAGCGTTGG CTACCCGTGA  1320

TATTGCTGAA GAGCTTGGCG GCGAATGGGC TGACCGCTTC CTCGTGCTTT ACGGTATCGC  1380

CGCTCCCGAT TCGCAGCGCA TCGCCTTCTA TCGCCTTCTT GACGAGTTCT TCTGACCGGG  1440

GTGGTGCCCA TCCTGGTCGA GCTGGACGGC GACGTAAACG GCCACAAGTT CAGCGTGTCC  1500

GGCGAGGGCG AGGGCGATGC CACCTACGGC AAGCTGACCC TGAAGTTCAT CTGCACCACC  1560

GGCAAGCTGC CCGTGCCCTG GCCCACCCTC GTGACCACCC TGACCTACGG CGTGCAGTGC  1620

TTCAGCCGCT ACCCCGACCA CATGAAGCAG CACGACTTCT TCAAGTCCGC CATGCCCGAA  1680

GGCTACGTCC AGGAGCGCAC CATCTTCTTC AAGGACGACG GCAACTACAA GACCCGCGCC  1740

GAGGTGAAGT TCGAGGGCGA CACCCTGGTG AACCGCATCG AGCTGAAGGG CATCGACTTC  1800

AAGGAGGACG GCAACATCCT GGGGCACAAG CTGGAGTACA ACTACAACAG CCACAACGTC  1860

TATATCATGG CCGACAAGCA GAAGAACGGC ATCAAGGTGA ACTTCAAGAT CCGCCACAAC  1920

ATCGAGGACG GCAGCGTGCA GCTCGCCGAC CACTACCAGC AGAACACCCC CATCGGCGAC  1980

GGCCCCGTGC TGCTGCCCGA CAACCACTAC CTGAGCACCC AGTCCGCCCT GAGCAAAGAC  2040

CCCAACGAGA AGCGCGATCA CATGGTCCTG CTGGAGTTCG TGACCGCCGC CGGGATCACT  2100

CTCGGCATGG ACGAGCTGTA CAAGTCCGGA CTCAGATCTC GAGCTCAAGC TTCGAATTCT  2160

GCAGTCGACG GTACCGCGGG CCCGGGATCC ACCGGATCTA GATAACTGAT CATAATCAGC  2220

CATACCACAT TTGTAGAGGT TTTACTTGCT TTAAAAAACC TCCCACACCT CCCCCTGAAC  2280

CTGAAACATA AAATGAATGC AATTGTTGTT GTTAACTTGT TTATTGCAGC TTATAATGGT 2340

TACAAATAAA GCAATAGCAT CACAAATTTC ACAAATAAAG CATTTTTTTC ACTGCATTCT 2400

AGTTGTGGTT TGTCCAAACT CA                                          2422

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因基因的引物G1：

<400>2

GTGGGTCGAC TAGTTATTAA TAGTAATC                                    28

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因基因的引物G2：

<400>3

TGAGATCTAC GCGTTAAGAT ACATTG                                      26

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因基因的引物N1：

<400>4

ATGATTGAAC AAGATGGA    18

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因基因的引物N2：

<400>5

TCAGAAGAAC TCGTCAAG    20

<210>6

<211>2730

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的同源臂(U)

<400>6

AGTTATTAAT AGTAATCAAT TACGGGGTCA TTAGTTCATA GCCCATATAT GGAGTTCCGC     60

GTTACATAAC TTACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCTGACCGC CCAACGACCC CCGCCCATTG     120

ACGTCAATAA TGACGTATGT TCCCATAGTA ACGCCAATAG GGACTTTCCA TTGACGTCAA     180

TGGGTGGAGT ATTTACGGTA AACTGCCCAC TTGGCAGTAC ATCAAGTGTA TCATATGCCA     240

AGTACGCCCC CTATTGACGT CAATGACGGT AAATGGCCCG CCTGGCATTA TGCCCAGTAC     300

ATGACCTTAT GGGACTTTCC TACTTGGCAG TACATCTACG TATTAGTCAT CGCTATTACC     360

ATGGTGATGC GGTTTTGGCA GTACATCAAT GGGCGTGGAT AGCGGTTTGA CTCACGGGGA     420

TTTCCAAGTC TCCACCCCAT TGACGTCAAT GGGAGTTTGT TTTGGCACCA AAATCAACGG     480

GACTTTCCAA AATGTCGTAA CAACTCCGCC CCATTGACGC AAATGGGCGG TAGGCGTGTA     540

CGGTGGGAGG TCTATATAAG CAGAGCTGGT TTAGTGAACC GTCAGATCCG CTAGCGCTAC     600

CGGTCGCCAC CATGGTGAGC AAGGGCGAGG AGCTGTTCAA TGATTGAACA AGATGGATTG     660

CACGCAGGTT CTCCGGCCGC TTGGGTGGAG AGGCTATTCG GCTATGACTG GGCACAACAG     720

ACAATCGGCT GCTCTGATGC CGCCGTGTTC CGGCTGTCAG CGCAGGGGCG CCCGGTTCTT     780

TTTGTCAAGA CCGACCTGTC CGGTGCCCTG AATGAACTGC AGGACGAGGC AGCGCGGCTA     840

TCGTGGCTGG CCACGACGCG CGTTCCTTGC GCAGCTGTGC TCGACGTTGT CACTGAAGCG     900

GGAAGGGACT GGCTGCTATT GGGCGAAGTG CCGGGGCAGG ATCTCCTGTC ATCTCACCTT     960

GCTCCTGCCG AGAAAGTATC CATCATGGCT GATGCAATGC GGCGGCTGCA TACGCTTGAT     1020

CCGGCTACCT GCCCATTCGA CCACCAAGCG AAACATCGCA TCGAGCGAGC ACGTACTCGG     1080

ATGGAAGCCG GTCTTGTCGA TCAGGATGAT CTGGACGAAG AGCATCAGGG GCTCGCGCCA     1140

GCCGAACTGT TCGCCAGGCT CAAGGCGCGC ATGCCCGACG GCGAGGATCT CGTCGTGACC     1200

CATGGCGATG CCTGCTTGCC GAATATCATG GTGGAAAATG GCCGCTTTTC TGGATTCATC     1260

GACTGTGGCC GGCTGGGTGT GGCGGACCGC TATCAGGACA TAGCGTTGGC TACCCGTGAT     1320

ATTGCTGAAG AGCTTGGCGG CGAATGGGCT GACCGCTTCC TCGTGCTTTA CGGTATCGCC     1380

GCTCCCGATT CGCAGCGCAT CGCCTTCTAT CGCCTTCTTG ACGAGTTCTT CTGACCGGGG     1440

TGGTGCCCAT CCTGGTCGAG CTGGACGGCG ACGTAAACGG CCACAAGTTC AGCGTGTCCG     1500

GCGAGGGCGA GGGCGATGCC ACCTACGGCA AGCTGACCCT GAAGTTCATC TGCACCACCG  1560

GCAAGCTGCC CGTGCCCTGG CCCACCCTCG TGACCACCCT GACCTACGGC GTGCAGTGCT  1620

TCAGCCGCTA CCCCGACCAC ATGAAGCAGC ACGACTTCTT CAAGTCCGCC ATGCCCGAAG  1680

GCTACGTCCA GGAGCGCACC ATCTTCTTCA AGGACGACGG CAACTACAAG ACCCGCGCCG  1740

AGGTGAAGTT CGAGGGCGAC ACCCTGGTGA ACCGCATCGA GCTGAAGGGC ATCGACTTCA  1800

AGGAGGACGG CAACATCCTG GGGCACAAGC TGGAGTACAA CTACAACAGC CACAACGTCT  1860

ATATCATGGC CGACAAGCAG AAGAACGGCA TCAAGGTGAA CTTCAAGATC CGCCACAACA  1920

TCGAGGACGG CAGCGTGCAG CTCGCCGACC ACTACCAGCA GAACACCCCC ATCGGCGACG  1980

GCCCCGTGCT GCTGCCCGAC AACCACTACC TGAGCACCCA GTCCGCCCTG AGCAAAGACC  2040

CCAACGAGAA GCGCGATCAC ATGGTCCTGC TGGAGTTCGT GACCGCCGCC GGGATCACTC  2100

TCGGCATGGA CGAGCTGTAC AAGTCCGGAC TCAGATCTCG AGCTCAAGCT TCGAATTCTG  2160

CAGTCGACGG TACCGCGGGC CCGGGATCCA CCGGATCTAG ATAACTGATC ATAATCAGCC  2220

ATACCACATT TGTAGAGGTT TTACTTGCTT TAAAAAACCT CCCACACCTC CCCCTGAACC  2280

TGAAACATAA AATGAATGCA ATTGTTGTTG TTAACTTGTT TATTGCAGCT TATAATGGTT  2340

ACAAATAAAG CAATAGCATC ACAAATTTCA CAAATAAAGC ATTTTTTTCA CTGCATTCTA  2400

GTTGTGGTTT GTCCAAACTC A                                            2421

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的同源臂(T-U)的引物M1：

<400>7

GAGTATTGTGAAGCACT    17

<210>8

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的同源臂(T-U)的引物M2：

<400>8

GAAACTGGTCAGTGGAG    17

<210>9

<211>1529

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的表达盒基因

<400>9

GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTGCACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 60

CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120

CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 180

TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 240

GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 300

TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 360

CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC 420

ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT  480

ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT  540

ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA  600

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG  660

ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC  720

AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG  780

GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCA GACCCAAGCT GGCTAGCGTT  840

TAAACTTAAG CTTGGTACCG AGCTCGGATC CACTAGTCCA GTGTGGTGGA ATTCTGCATT  900

ATGCCCAGTA CATGACCTTA CGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA  960

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACACCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG  1020

ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC  1080

AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTGCGA TCGCCCGCCC CGTTGACGCA  1140

AATGGGCGGT AGGCGTGTAC GGTGGGAGGT CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAGTGAACCG  1200

TCAGATCACT AGAAGCTTTA TTGCGGTAGT TTATCACAGT TAAATAGCAC AGTGGCGGCC  1260

GCTCGAGTCT AGAGGGCCCG TTTAAACCCG CTGATCAGCC TCGACTGTGC CTTCTAGTTG  1320

CCAGCCATCT GTTGTTTGCC CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC  1380

CACTGTCCTT TCCTAATAAA ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC  1440

TATTCTGGGG GGTGGGGTGG GGCAGGACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG  1500

GCATGCTGGG GATGCGGTGG GCTCTATGG                                    1529

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的表达盒基因的引物C1：

<400>10

GACGGATCGG GAGATCTCCC G    21

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的表达盒基因的引物C2：

<400>11

CCATAGAGCC CACCGCATCC CC    22

Claims (5)

1.一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us，其特征在于该通用载体含有：

1)如序列1所示的核苷酸序列的报告和筛选基因S-g-n；

2)如序列6所示的核苷酸序列的同源臂U；

3)如序列9所示的核苷酸序列的表达盒基因C-M-A。

2.一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us的构建方法，其特征在于构建方法包括以下步骤：

1)由设计合成的序列2，3和序列4，5所示的两对引物经扩增后获得具有序列1所示的报告和筛选基因核苷酸序列；

2)由设计合成的序列7，8所示的一对引物经扩增后获得具有序列6所示的同源臂基因U的核苷酸序列，连入pMD18-T质粒中，构建通用载体同源臂质粒T-U；

3)由设计合成的序列10，11所示的一对引物经扩增后获得具有序列9所示的表达盒核苷酸序列；

4)将以上元件的核苷酸序列在体外连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建成通用载体T-Us。

3.一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us的应用，其特征在于是将通用载体T-Us与禽I型马立克病病毒共转染，获得重组MDV CVI988-26株，2009年06月18日已将本病毒株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.3132。

4.如权利要求3所述的一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us的应用，其特征在于提供了一种重组禽I型马立克病毒的筛选方法是：用含0.4mg/ml G418培养液加压24h的CEF细胞，接种重组病毒，37℃继续培养，每24h更换50％的培养液维持G418筛选压力不变，于第5天将感染的细胞消化下来，再接种于新鲜的细胞上，如此重复4次，筛选到重组病毒，同时，结合荧光观察重组病毒的含量和纯度。

5.如权利要求3所述的一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us的应用，其特征在于所得到的重组禽I型马立克病病毒CGMCC No.3132病毒携带有禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us，用该病毒免疫动物可不受母源抗体影响，刺激机体产生对多种病毒的抗体，且能有效保护禽类免遭禽马立克病毒的攻击。

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