实施例6.稳定表达新城疫HN基因的传染性喉气管炎重组病毒的构建及其免疫效力评价。
1.稳定表达新城疫HN基因的重组病毒的构建:
按照本发明构建重组病毒方法,具体地按针对本研究团队克隆的鸡新城疫CK/CH/HLJ/1/06株(该毒株已记载在文献:“新城疫病毒单克隆抗体制备及部分NP蛋白抗原表位鉴定分析,刘培欣,2011年,东北农业大学博士论文”中,现由中国科学院哈尔滨兽医研究所保存)病毒HN基因设计引物,上游引物和下游引物插入Xho I和Not I位点,所述上游引物NDVHN-F:5’
CATCTCGAGATGGACCGCGCGGTTAACAG 3’;下游引物NDV HN-R:5’
AATGCGGCCGCTTAAACTCTATCATCCTTG 3’。转移载体pILTΔUS9-EGFP作为基础。应用限制性内切酶Xho I和Not I双酶切切去小片段,即EGFP基因,回收获得的大片段作为线性化载体备用,限制性内切酶购自NEB公司,反应条件为37℃60min,反应体系如下:模板,1μg;10X CutSmart Buffer,5μl;Xho I,1μl;Not I,1μl;ddH2O,up to 50μl。利用限制性内切酶Xho I和Not I消化NDV HN基因PCR产物获得的线性DNA作为目的片段,应用T4DNA连接酶连接上述线性载体。反应体系:线性DNA,150ng;载体,50ng;10X Buffer,1μl;T4DNA连接酶,1μl;ddH2O,Up to 10μl。反应条件:16℃振荡水浴过夜。最终获得新城疫HN基因转移载体pILT△US9-NDV HN。
依照实施例1中步骤(6)所述方法将pILT△US9-NDV HN转移载体与实施例1中步骤(5)获得的重组病毒rILTVΔUS9-EGFP基因组共转染获得的重组病毒液,用无血清DMEM做10-1~10-4倍稀释,将生长良好的LMH细胞单层用PBS轻洗3次,加入病毒稀释液,37℃孵育2h后,吸弃病毒液,加入10%DMEM培养基,所述培养基含1%低熔点琼脂糖,室温放置30min培养基凝固后,移入37℃5%CO2恒温箱中继续培养。待蚀斑出现后,在荧光显微镜下观察选择不表达绿色荧光蛋白的蚀斑进行筛选,待蚀斑增长至合适大小,挑取不表达荧光蛋白的蚀斑于无血清DMEM中,反复冻融三次后,再次接种于LMH细胞继续进行重组病毒增殖和蚀斑纯化,针对NDV HN基因设计引物:5’
-CATCTCGAGATGGACCGCGCGGTTAACAG-3’,NDV HN-R,5’
-AATGCGGCCGCTTAAACTCTATCATCCTTG-3’,对纯化的重组病毒进行以PCR鉴定。
将纯化的重组病毒反复冻融三次,取200μL病毒液提取重组病毒基因组,方法如下:取200μL病毒液,加入5μL质量浓度为20mg/mL蛋白酶K和20μL质量浓度为10%SDS,置于56℃水浴消化2h;酚氯仿各200μL抽提一次,加入200μL氯仿抽提一次;加入1/10体积NaAC,其摩尔浓度为3M(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇,置于-20℃15min后,4℃,离心15min收集病毒基因组,加入适量去离子水溶解后,以该重组病毒基因组为模板,利用引物US9L-F、US9R-R对重组病毒进行PCR初步鉴定,PCR产物经0.9%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,切胶回收目的片段,将其克隆至pMD18-T载体,经筛选鉴定后阳性质粒进行测序,结果与SEQ ID NO:11所示序列一致,说明含有CMV启动子序列的NDV HN表达盒已插入病毒基因组中,重组病毒构建成功。重复以上病毒纯化步骤,经过3轮蚀斑纯化,获得纯净的重组病毒。
2.应用间接免疫荧光技术(IFA)检测新城疫HN蛋白的表达:
IFA步骤:
(1)重组病毒低剂量接种在六孔板上长成单层的LMH细胞,接种24h后用PBS洗涤三次。同时设置亲本病毒以及LMH细胞空白对照。
(2)用4%多聚甲醇进行固定,每孔约1ml,室温作用30min。用PBS洗涤三次。
(3)一抗加入1:100倍稀释的阳性血清(用PBS稀释)0.5ml/孔,37℃作用1h。用PBS洗三次。
(4)二抗加入1:320稀释的兔抗鸡IgY FITC抗体(Sigma,0.2ml/孔),37℃作用lh。用PBS洗涤三次。
(5)荧光显微镜下观察结果。通过IFA可在病变处见到绿色荧光,而亲本毒病变处以及LMH对照则观察不到典型绿色荧光。证明新城疫HN蛋白基因已经表达。
获得稳定表达新城疫HN基因的传染性喉气管炎重组病毒rILTV△US9-NDV HN,重组病毒的筛选和纯化方法同实施例1中步骤(6)所述,依照实施例2中步骤(二)的方法对重组病毒rILTV△US9-NDV HN进行了生长稳定性和遗传稳定性测定,发现重组病毒rILTV△US9-NDV HN经连续传代均能保持遗传稳定性,并持续表达鸡新城疫病毒HN蛋白。
3.重组病毒rILTV△US9-NDV HN接种鸡后的免疫效力评价
(1)试验材料
rILTV△US9-NDV HN株重组病毒由本研究团队构建并在LMH细胞增殖,鸡新城疫强毒北京株由本研究团队保存。
SPF试验鸡:来自中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
(2)试验方法
将rILTV△US9-NDV HN株重组病毒分别以0.1ml点眼途径接种10只28日龄SPF鸡,另外10只作为对照,免疫后21天分别将免疫鸡和对照鸡攻击新城疫强毒北京株观察14天,统计发病和死亡情况。
(3)试验结果
rILTV△US9-NDV HN株重组病毒接种鸡后21天,免疫组鸡均产生了针对新城疫的抗体,强毒攻击保护率达到9/10,而对照组鸡则在攻毒后10天全部死亡(详见表5)。
表5 rILTV△US9-NDV HN株重组病毒免疫鸡后血清抗体值和保护力测定结果
试验结果表明,以本发明以重组病毒构建方法构建的传染性喉气管炎重组鸡新城疫病毒HN基因获得的重组病毒作为疫苗免疫鸡能够产生针对新城疫病毒的抗体并产生显著保护效力,说明本发明具有良好的应用价值。
以上所述仅为本发明的优选实例,对本发明而言仅是说明性的,而非限制性的;本领域普通技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效变更,但都将落入本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 一种表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用
<130>
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> US9基因
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ttgtccaatt atacccagcc tattccctgg aaccctaaat tctgcagcgc gcgcggggaa 180
tctgacaacc acgcgtgtaa agacactttt tatcgcagga cgtgctgcgc atcgcgctct 240
accgtttcca gtcaacccga ttccccccac acacccatgc ctactgagta tgggcgcgtg 300
ccctccgcaa agcgcaaaaa actatcatct tcagactgcg agggcgcgca ccaaccccta 360
gtatcctgta aacttccgga ttctcaagca gcaccggcgc gaacctatag ttctgcgcaa 420
agatatactg ttgacgaggt ttcgtcgcca actccgccag gcgtcgacgc tgttgcggac 480
ttagaaacgc gcgcggaact tcctggcgct acgacggaac aaacggaaag taaaaataag 540
ctccccaacc aacaatcgcg cctgaagccg aaacccacaa acgagcacgt cggaggggag 600
cggtgcccct ccgaaggcac ggtcgaggcg ccatcgctcg gcatcctctc gcgcgtcggg 660
gcagcgatag caaacgagct ggctcgtatg cggagggcgt gtcttccgct cgccgcgtcg 720
gcggccgctg ccggaatagt ggcctgggcc gcggcgaggg ccttgcagaa acaagggcgg 780
tag 783
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<211> 2517
<212> DNA
<213> NDV-F 表达盒
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taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 60
taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 120
ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 180
gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 240
ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 300
ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 360
atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 420
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ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 540
gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ctaccggact 600
cagatctcga gatgggctcc aaaccttcta ccaggatccc agcacctctg atgctggtca 660
cccggattat gctgatattg ggctgtattc gttcgacaag ctcccttgat ggcaggcctc 720
ttgcagctgc aggaattgta gtaacaggag ataaggcagt caatgtatac acctcgtctc 780
agacagggtc aatcatagtc aagttgctcc cgaatatgcc cagggataag gaggcgtgtg 840
cgaaagcccc attagaggca tataacagaa cactgactac tttgctcact cctcttggcg 900
actccatccg caagattcaa gggtctgtgt ccacgtctgg aggaaggaga caaaaacgct 960
ttataggtgc tgttattggc agtgtagctc ttggggttgc aacagcggca cagataacag 1020
cagctgcggc cctaatacaa gccaacaaga atgctgccaa catccttcgg cttaaggaga 1080
gcattgctgc aaccaatgaa gctgtgcatg aagtcaccga cggattatca caactatcag 1140
tggcagttgg gaagatgcag cagtttgtca atgaccagtt taataatacg gcgcgagaat 1200
tggactgtat aaaaatcaca caacaggttg gtgtagaact caacctatac ctaactgaat 1260
tgactacagt attcgggcca cagatcacct ctcctgcatt aactcagctg accatccagg 1320
cactttataa tttagctggt ggcaatatgg attacttatt aactaagtta ggtataggga 1380
acaatcaact cagctcatta attggtagcg gcctgatcac tggttaccct atactgtatg 1440
actcacagac tcaactcttg ggcatacaag tgaatttgcc ctcagtcggg aacttaaata 1500
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cacttgtccc gaaagtagtg acacaagtcg gttctgtgat agaagagctt gacacctcat 1620
actgtataga gtccgatctg gatttatatt gtactagaat agtgacattc cccatgtccc 1680
caggtattta ttcctgtttg agcggcaaca catcagcttg catgtattca aagactgaag 1740
gcgcactcac tacgccgtat atggccctta aaggctcagt tattgccaat tgtaagataa 1800
caacatgtag atgtacagac cctcctggca tcatatcgca aaattatgga gaagctgtat 1860
ccctgataga tagacattcg tgcaatgtct tatcattaga cgggataact ctgaggctca 1920
gcggagaatt tgatgcaact tatcaaaaga acatctcaat actagattct caagtcatcg 1980
tgacaggcaa tcttgatata tcaactgaac ttggaaacgt caacaattca atcagcaatg 2040
ccttggataa gttggcagaa agcaacagta agctagaaaa agtcaatgtc agattaacca 2100
gcacatctgc tctcattacc tatattgttc taactgtcat ttctctagtt ttcggtgcac 2160
ttagtctggg tttagcgtgt tacctgatgt acaaacagaa ggcacaacaa aagaccttgc 2220
tatggcttgg gaataatgcc cttgatcaga tgagagccac tgcaagagca tgagcggccg 2280
cgactctaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac 2340
ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg 2400
tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 2460
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<212> DNA
<213> NDV-F基因
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ctgatattgg gctgtattcg ttcgacaagc tcccttgatg gcaggcctct tgcagctgca 120
ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180
atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agggataagg aggcgtgtgc gaaagcccca 240
ttagaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300
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gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420
ctaatacaag ccaacaagaa tgctgccaac atccttcggc ttaaggagag cattgctgca 480
accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600
aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660
ttcgggccac agatcacctc tcctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720
ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780
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caactcttgg gcatacaagt gaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900
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aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020
tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080
tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga 1200
tgtacagacc ctcctggcat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat 1260
agacattcgt gcaatgtctt atcattagac gggataactc tgaggctcag cggagaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380
cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggataag 1440
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ctcattacct atattgttct aactgtcatt tctctagttt tcggtgcact tagtctgggt 1560
ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620
aataatgccc ttgatcagat gagagccact gcaagagcat ga 1662
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<211> 553
<212> DNA
<213> CMV启动子
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atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120
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<212> DNA
<213> US9L基因
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tttttcacgt tgttgcaatc gagaggccgt ttgtctgtct gtgtctgtgc ggagctaggc 180
tttcccgggc ggccccgttc caccgttcgg ttaggccggt ggcgacggga catagagaaa 240
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<212> DNA
<213> US9R基因
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ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 1320
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<213> EGFP 基因
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ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
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ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
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ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
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tttgattctg ccaataatta tgtgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120
tggcatctgc aagggggtgc ttatgcagta gtgaattcta ctaattatac tagtaatgcc 180
ggttctgcaa gtgagtgcac tgttggtgtt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240
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