CN111041004A

CN111041004A - 一种表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN111041004A
Application number: CN201911420496.7A
Authority: CN
Inventors: 刘胜旺; 邵昱昊; 韩宗玺; 孙军峰
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-04-21

Abstract

一种表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用，属于重组病毒疫苗技术领域。本发明针对传染性喉气管炎外源免疫原基因的重组病毒构建和应用的问题，本发明提供了一种传染性喉气管炎病毒重组疫苗株，命名为rILTV△gC‑NDV‑F，微生物保藏号是：CGMCC No.18534，该病毒株是用新城疫病毒F基因(NDVF)替换传染性喉气管炎病毒非必须基因gC基因，构建获得缺失gC基因并在其相应位置插入NDVF表达盒的重组新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎病毒，本发明获得的重组传染性喉气管炎病毒株可用于制备预防鸡传染性喉气管炎和新城疫的活载体疫苗。

Description

一种表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用

技术领域

本发明具体涉及一种表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用，属于重组病毒疫苗技术领域。

背景技术

传染性喉气管炎(InfectiousLaryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitisvirus,ILTV)引起一种鸡急性上呼吸道病毒性传染病。传染性喉气管炎病毒主要感染鸡呼吸系统，尤其是气管上皮是病毒主要繁殖场所。感染鸡发病时表现为张口呼吸、咳血、结膜炎、流泪等症状，部分强毒感染致死率达100％。本病1925年在美国首次报道后，现已遍及世界许多养鸡地区。本病传播快，死亡率较高，在我国较多地区发生和流行，给养鸡业造成巨大经济损失，是危害养鸡业的重要疫病之一。

传染性喉气管炎病毒的自然感染仅限于鸡，幼龄火鸡、野鸡、鹌鹑和孔雀也可感染，但以成年鸡症状最为特征。鸭、鸽、珍珠鸡、麻雀及所有哺乳动物不易感。病鸡、康复后的带毒鸡和无症状的带毒鸡是主要传染来源。传染性喉气管炎病毒与其它疱疹病毒一样，ILTV的潜伏和激活都可以引起该病在鸡群中爆发。病毒的感染与品种、年龄和性别无关，成年鸡感染率较幼龄鸡高。本病一旦传入鸡群，则迅速传开，感染率可达90％以上，死亡率一般在10％以上，部分强毒死亡率达到70％。传染性喉气管炎病毒只有一个血清型，免疫接种是防治该病的最有效手段。目前国内外预防传染性喉气管炎使用较广泛的是弱毒疫苗，此类疫苗具有免疫效果好、免疫保护力产生快的特点，给鸡群进行免疫接种能有效预防该病。然而，随着畜禽集约化养殖业的发展，单价疫苗已显示出其一定的弊端，多次免疫的防控措施费时费力，多价联合疫苗便成为养殖业最受欢迎的疫病防控产品，因而开展鸡病多价联合疫苗成为必然选择。

ILTV属疱疹病毒科，疱疹病毒甲亚科，传喉炎病毒属，禽疱疹病毒I型(Herpesviridae，Alphaherpesvirinae，Iltovirus Gallid，herpesvirus 1)。其基因组为双股线性DNA，大小约155kb，基因组具有典型的疱疹病毒结构，具有典型的疱疹病毒D型结构。疱疹病毒基因组包含大量的复制非必需基因，包括TK、gC、gG、gK、US1、US2、US9、UL41、UL42、US7和US8等。在相关研究中将外源基因插入或替代疱疹病毒的非必须基因，构建重组病毒疫苗，这被认为是一种良好的重组活疫苗病毒载体，目前有关疱疹病毒作为载体的报道包括伪狂犬病载体、传染性喉气管炎病毒载体、马力克氏病毒载体以及火鸡疱疹病毒载体等。随着对传染性喉气管炎病毒研究的不断加深，以ILTV为病毒活载体受到更加广泛的关注，ILTV作为载体的优势在于该病毒宿主范围较窄，对鸭、鸽、珍珠鸡、麻雀及所有哺乳动物均不易感，无致病性，因此即使这些非自然宿主呼吸道瞬时增殖也不会对人和其他动物的健康安全造成影响，这对开发ILTV病毒活载体疫苗具有重要意义。

目前，针对ILTV病毒载体研究进展顺利，在已有报道中，已有20个独立基因已从ILTV基因组中成功缺失，大量基因缺失毒株已获得(Fuchs etal.,2007；Mundtetal.,2011；Pavlova etal.,2010,2013)。在这些基因缺失毒株中，大约有8株在体内评价了毒株的致弱和免疫保护效力。这些毒株缺失的基因分别是胸苷激酶(UL23)(Han et al.,2002；Schnitzlein et al.,1995)、糖蛋白G(US4)(ILTVlin et al.,2006)，糖蛋白J(US5)(Fuchset al.,2005；Mundt et al.,2011)、糖蛋白C(UL44)(Pavlova et al.,2010)、dUTPase(UL50)(Fuchset al.,2000)、IC蛋白(ORF C)(Maricarmen Garcia 2016)、膜蛋白(UL47)(Helferich et al.,2007)和编码未知功能的核蛋白(UL0基因)(Veits et al.,2003b)。这些基因缺失重组毒株的生长动力学分析表明它们对于细胞培养物中的病毒复制是非必需的(Fuchs et al，2007)。

发明内容

针对传染性喉气管炎外源免疫原基因的重组病毒构建和应用的问题，本发明提供了一种表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株(InfectiousLaryngotracheitis Virus)，名称为rILTV△gC-NDV-F株，(建议分类命名为：表达新城疫病毒F蛋白的重组传染性喉气管炎病毒)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC No.18534，保藏日期为2019年10月23日。

本发明还提供了上述传染性喉气管炎重组病毒株的构建方法，步骤如下：

(1)构建含有EGFP表达盒的重组转移载体：通过PCR扩增获得传染性喉气管炎病毒gC基因两侧的侧翼序列，分别记为左同源臂gCL和右同源臂gCR；将左同源臂gCL、右同源臂gCR分别插入PUC18载体中，获得中间载体pILT△gC；然后插入EGFP表达盒，获得重组转移载体pILTΔgC-EGFP；所述重组转移载体pILTΔgC-EGFP中EGFP表达盒上下游分别连有左同源臂gCL与右同源臂gCR；所述传染性喉气管炎病毒gC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)提取传染性喉气管炎病毒的完整基因组DNA；

(3)转染：将步骤(1)中获得的重组转移载体pILTΔgC-EGFP与步骤(2)中获得的传染性喉气管炎病毒的完整基因组DNA共转染LMH细胞，通过蚀斑纯化法获得表达EGFP的传染性喉气管炎重组病毒rILTΔgC-EGFP；

(4)构建NDV-F表达盒的重组转移载体：将步骤(1)所述pILTΔgC-EGFP重组载体中EGFP基因切除，然后插入新城疫病毒F蛋白基因，获得重组转移载体pILTΔgC-NDV-F，其中，NDV-F表达盒上下游分别连有左同源臂gCL与右同源臂gCR；

(5)提取步骤(3)中获得的表达EGFP的传染性喉气管炎重组病毒rILTΔgC-EGFP的完整基因组DNA；

(6)转染：将步骤(4)中获得的重组转移载体pILTΔgC-NDV-F与步骤(5)中获得的表达EGFP传染性喉气管炎重组病毒rILTΔgC-EGFP的完整基因组DNA共转染LMH细胞，通过蚀斑纯化法获得表达NDV-F的传染性喉气管炎重组病毒株。

进一步地限定，所述左同源臂gCL，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述右同源臂gCR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述新城疫病毒F蛋白基因的核苷酸序列如SEQID NO:4所示；所述EGFP表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述EGFP核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

进一步地限定，所述左同源臂gCL与右同源臂gCR扩增所用的模板为鸡传染性喉气管炎病毒CK/CH/LHLJ/120305株基因组，引物设计所参考的序列GenBank登陆号为NC_006623.1，所述ILTV病毒CK/CH/LHLJ/120305株，其微生物保藏号为CGMCC No.15482。

进一步地限定，所述左同源臂gCL扩增用的引物序列如下：gCL-F：5’-CGCGGATCCatctcaacgcctccttaa-3’，gCL-R：5’-CGGAATTCacttgacgcgcaagctct-3’；所述右同源臂gCR扩增用的引物序列如下：gCR-F：5’-CCCAAGCTTctttctacgaaagaggca-3’gCR-R：5’-CGCGGATCCgttgagtcgtgaatgccc-3’。

进一步地限定，步骤(1)所述构建含有EGFP表达盒的重组转移载体的具体方法为：首先应用引物扩增获得左同源臂gCL，经EcoRI和BamHI双酶切后插入到经EcoRI和BamHI酶切后的PUC18载体中，获得中间载体pILT△gC-L；然后应用引物扩增获得右同源臂gCR，经HindIII和BamHI双酶切后插入到经HindIII和BamHI酶切后的中间载体pILT△gC-L中，获得的中间载体pILT△gC，经BamHI单酶切后再进行平端化；

将pEGFP-N1载体经AseI和Afl II酶切获得EGFP表达盒，然后进行平端化，所述EGFP表达盒由CMV启动子、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因以及PolyA终止子组成，将平端化的EGFP表达盒插入到所述平端化处理的中间载体pILT△gC中，构建获得重组转移载体pILTΔgC-EGFP。

进一步地限定，所述平端化通过Klenow酶实现。

本发明还提供了上述重组病毒株在制备预防鸡病毒性传染病疫苗中的应用。

进一步地限定，所述鸡病毒性传染病疫苗为传染性喉气管炎病毒疫苗、新城疫疫苗或传染性喉气管炎和鸡新城疫的二价疫苗。

进一步地限定，所述重组病毒株直接用于或灭活后用于制备预防鸡病毒性传染病疫苗。

有益效果

新城疫是由新城疫病毒引起的禽类烈性传染病，由于其宿主涉及至少250种禽类以上，虽然在某些禽类并不产生临床症状，但是可以在这些禽类体内繁殖传播，成为病毒的天然宿主，因此对该病的防控和净化显得异常艰难。另一方面NDV毒株尽管只有一种血清型，但通过遗传进化分析发现NDV毒株分为两类16个基因型，多基因型毒株的普遍存在和流行加速了病毒的进化，尤其是新城疫活病毒疫苗株在禽群中的广泛应用也在一定程度上推进了这类RNA病毒的重组和进化，因而更加难以消灭该病。亚单位疫苗或新型重组基因工程疫苗则能克服传统弱毒活疫苗潜在的缺点，可以预见在疫病防控和净化中能够起到重要的作用。

NDV具有两个主要抗原糖蛋白F和HN，F蛋白不仅是NDV的主要免疫保护抗原，而且与NDV基因型分类具有紧密的关系。因此，本发明以F蛋白作为免疫原进行新型亚单位疫苗或重组基因工程疫苗具有重要的实际应用价值。

传染性喉气管炎是由传染性喉气管炎病毒引起一种鸡急性上呼吸道病毒性传染病，传染性喉气管炎病毒只有一个血清型，免疫接种是防治该病的最有效手段。目前国内外预防传染性喉气管炎使用较广泛的是弱毒疫苗，此类疫苗具有免疫效果好、免疫保护力产生快的特点，给鸡群进行免疫接种能有效预防该病。

本发明利用重组克隆技术，将包含新城疫病毒F基因NDV-F和CMV启动子序列的NDV-F表达盒替换传染性喉气管炎病毒的gC基因，构建获得缺失gC基因并在其相应位置插入CMV-NDV-F表达盒的重组新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎病毒，经实验证明gC基因位点缺失并插入外源基因并不影响病毒复制能力，而且能够有效表达外源基因，这便给构建能够表达外源免疫原基因提供了良好的理论依据。

本发明制备的表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒是一种预防传染性喉气管炎和鸡新城疫的二价疫苗的候选毒株，因此该毒株可以作为二价疫苗对预防传染性喉气管炎病毒及新城疫有重要的实际应用价值。

附图说明

图1为本发明重组传染性喉气管炎病毒株基因组gC缺失区域插入的CMV启动子、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和PolyA终止子序列的EGFP表达盒(SEQ ID NO:5所示)示意图，虚下划线为引入的酶切位点酶切后的残基，虚下划线前阴影部分为病毒基因组gCL，虚下划线后阴影部分为病毒基因组gCR，双实下划线为CMV启动子序列，波浪下划线为EGFP基因序列，斜体为PolyA终止子序列，加黑序列为表达盒内酶切位点，按顺序为Xho I和Not I，用于引入外源基因，阴影部分加黑为引物序列；

图2为本发明重组传染性喉气管炎病毒株基因组gC缺失区域插入的CMV启动子、新城疫病毒F蛋白(NDV-F)基因和PolyA终止子序列(NDV-F表达盒)示意图，其中，虚下划线为引入的酶切位点酶切后的残基，虚下划线前阴影部分为病毒基因组gCL，虚下划线后阴影部分为病毒基因组gCR，双实下划线为CMV启动子序列，波浪下划线为NDV-F基因序列，斜体为PolyA终止子序列，加黑序列为表达盒内酶切位点，按顺序为Xho I和Not I，用于引入外源基因，阴影部分加黑为引物序列；

图3为重组转移载体pILTΔgC-EGFP的载体图谱；

图4为重组转移载体pILTΔgC-NDV-F的载体图谱；

图5为重组病毒rILTV△gC-NDV-F株PCR鉴定结果，M：DL2000 DNAMarker；1：NDV-F1700bp；

图6为重组病毒rILTV△gC-NDV-F株间接免疫荧光鉴定结果。

具体实施方式

本发明制备的新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株缺失传染性喉气管炎病毒gC基因，并在该缺失位置插入NDV-F表达盒；所述NDV-F表达盒由CMV启动子、NDV-F基因以及PolyA终止子组成；所述gC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述NDV-F表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述NDV-F表达盒上下游分别连有位于传染性喉气管炎病毒gC缺失基因两侧的侧翼序列：左同源臂gCL，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；右同源臂gCR，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

本发明中所述表达盒：是指含有启动子，目的基因和终止子的基因序列的组合。

本发明所用的内切酶购买自NEB公司，PCR扩增、鉴定用基因组基因组提取方法按Axygen(康宁)AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒操作，所述胶回收所用试剂盒购自Omega bio-tek公司，按说明书操作，本发明所述PUC18、pEGFP-N1载体、其他试剂或酶等如无特殊说明，均可通过商业化购买获得。

本发明所用的培养基DMEM购自Sigma，用去离子水按说明书配制成标准溶液。使用时添加购自sigma公司的胎牛血清(FBS)，2％DMEM是指在DMEM中添加了体积比为2％的FBS，10％DMEM是指在DMEM中添加了体积比为10％的FBS；蚀斑筛选时在DMEM中添加了低熔点琼脂糖，含1％低熔点琼脂糖的DMEM是指在每100mlDMEM中添加了1克低熔点琼脂糖。

本发明所述ILTV病毒CK/CH/LHLJ/120305株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，命名为：鸡传染性喉气管炎病毒，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC No.15482，保藏日期为2018年03月01日。

实施例1.表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株的构建方法。

(1)表达EGFP蛋白的重组转移载体的构建：

以ILTV病毒基因组为引物设计的参考序列，GenBank登陆号为NC_006623.1，应用Oligo 6.0软件设计2对引物，用于扩增gC基因序列侧翼序列gCL、gCR。

引物序列如下：

gCR-F：5’-CCCAAGCTTctttctacgaaagaggca-3’(划线部分为HindIII酶切位点)

gCR-R：5’-CGCGGATCCgttgagtcgtgaatgccc-3’(划线部分为BamHI酶切位点)

gCL-F：5’-CGCGGATCCatctcaacgcctccttaa-3’(划线部分为BamHI酶切位点)

gCL-R：5’-CGGAATTCacttgacgcgcaagctct-3’(划线部分为EcoRI酶切位点)

以ILTV病毒CK/CH/LHLJ/120305株基因组为扩增模板，PCR反应体系：dNTP，4μl；10X ExTaq Buffer，5μl；模板，4μl；上游引物、下游引物各2μl；ExTaqDNA聚合酶，0.5μl；H₂O，Up to 50μl。

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃1min；50℃1min；72℃2min，PCR 30个循环72℃2min。

首先应用引物gCL-F和gCL-R扩增gC基因左同源臂gCL，扩增产物回收纯化后经EcoRI和BamHI双酶切，PUC18载体经EcoRI和BamHI双酶切，回收大片段，与上述gCL双酶切产物连接，获得中间载体pILT△gC-L载体；用引物gCR-F和gCR-R扩增gC基因右同源臂gCR，扩增产物回收纯化后经HindIII和BamHI双酶切，将中间载体pILT△gC-L载体经HindIII和BamHI双酶切，回收大片段，与上述gCR双酶切产物相连，获得的中间载体pILT△gC经BamHI单酶切后经Klenow Fragment平端化；

将pEGFP-N1载体经AseI和Afl II酶切切去载体复制等元件部分，获得的EGFP表达盒，所述表达盒由CMV启动子、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因以及PolyA终止子组成，用Klenow Fragment平端化；具体地，带有CMV启动子的EGFP表达盒是将pEGFP-N1载体先用限制性内切酶AseI酶切，回收线性化片段，再用限制性内切酶Afl II将EGFP表达盒切下，然后用Klenow Fragment平端化处理，将平端化的EGFP表达盒插入到上述平端化处理的中间载体pILT△gC中，构建获得重组转移载体pILTΔgC-EGFP，该载体中EGFP表达盒上下游分别连有左同源臂gCL与右同源臂gCR；载体图谱如图3所示，所述EGFP表达盒的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，其中EGFP核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，CMV启动子核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示；

上述双酶切体系分别为：

1.gC基因左右同源臂的双酶切体系：

DNA模板，1μg；10X CutSmart Buffer，5μl；HindIII or EcoRI，1μl；BamH I，1μl；ddH₂O，up to 50μl；反应条件为37℃，60min。

2.pILT△gC单酶切反应体系：

pILT△gC质粒，1μg；10X CutSmart Buffer，5μl；BamH I，1μl；ddH₂O，up to 50μl；反应条件为37℃，60min。

3.Klenow Fragment平端化反应体系：

带平端化的DNA模板25ng，加入随机引物2nmol，加灭菌水补至19μl混匀后于95℃保温3min，冰浴5min，加入2.5μl 10X Klenow Fragment Buffer、2.5μl dNTP和1μl KlenowFragment，37℃反应3h，65℃加热5min。

4.AseI单酶切体系：

pEGFP-N1载体1μg；10XBuffer 3.1，5μl；AseI,1μl；ddH₂O，up to 50μl；反应条件为37℃，60min。

5.Afl II单酶切体系：

pEGFP-N1载体AseI单酶切线性片段，1μg；10X CutSmart Buffer，5μl；Afl II，1μl；ddH₂O，up to 50μl；反应条件为37℃，60min。

(2)传染性喉气管炎病毒基因组的提取。

将CK/CH/LHLJ/120305细胞毒株以0.001个MOI接种于铺满LMH单层的5mL细胞瓶中(LMH细胞的培养和传代参照《体外培养的原理与技术》操作(薛庆善，2001))，37℃吸附2h，弃掉病毒液，换2％DMEM细胞维持液，待细胞病变达到80％～90％后，弃掉细胞维持液，加入细胞消化液500μL，所述消化液每2ml组成为：1860μL STE；100μL质量浓度为10％SDS；40μL质量浓度为20mg/mL蛋白酶K，37℃消化过夜，加入500μL酚抽提一次，加入酚氯仿各500μL抽提一次，加入500μL氯仿抽提一次；加入1/10体积NaAC，其摩尔浓度为3M，pH5.2，以及2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃沉淀过夜，4℃离心15min，风干后加入适量去离子水溶解病毒基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性，储存于-20℃备用。

(3)转染。

Day 1：准备细胞

预先将LMH细胞传代并铺于5mL细胞瓶中，37℃5％CO₂恒温培养箱培养。

Day 2：转染

1)于转染前3-4h更换细胞培养液。

2)转染体系：A液：18μL2 M CaCl₂，10μg DNA，其中转移载体与病毒基因组质量比为3:1，加去离子水补足体积至150μL。B液：150μL2×Hepes Buffered Saline(HBS)。

3)用移液器将A液逐滴加入B液，在加A液的同时利用另一个移液器向B液中缓慢吹入空气，此过程应在1-2min之内完成。

4)将AB混合液置于室温孵育30min。

5)将混合液加入细胞培养液中。

6)将细胞置于37℃5％CO₂恒温培养箱培养中继续培养。

Day 3：更换细胞培养液并对细胞进行休克

1)更换细胞培养液。

2)用1×PBS轻洗细胞2次。

3)利用DMSO对细胞进行休克。

1.用1×PBS配制15％(v/v)DMSO。2.将2mL DMSO休克液加入轻洗后的细胞中。3.室温孵育2.5min。4.弃掉DMSO加入新鲜的细胞培养液。

(4)将细胞置于37℃5％CO₂恒温培养箱培养中继续培养。

细胞置于37℃，5％CO₂恒温培养箱培养中继续培养。每天观察至出现细胞病变(CPE)，荧光显微镜下观察是否有表达绿色荧光蛋白的CPE，待CPE达到80％～90％后收获病毒，-20℃反复冻融3次，作为蚀斑纯化的种毒，储存于-70℃备用。

表达EGFP重组病毒的筛选及鉴定：

1.病毒的筛选

将收获的含有重组病毒的病毒液用无血清DMEM做10^-1～10^-4倍稀释，将生长良好的LMH细胞单层用PBS轻洗3次，加入病毒稀释液，37℃孵育2h后，吸弃病毒液，加入10％DMEM培养基2ml，该10％DMEM培养基中1％低熔点琼脂糖，室温放置30min培养基凝固后，移入37℃5％CO₂恒温箱中继续培养；待蚀斑出现后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达进行重组病毒蚀斑的筛选，待蚀斑增长至合适大小，挑取表达荧光蛋白的蚀斑于无血清DMEM中，-20℃反复冻融三次后，再次接种于LMH细胞继续进行蚀斑纯化。重复以上步骤，经过3轮蚀斑纯化，获得纯净的表达EGFP的传染性喉气管炎重组病毒rILTΔgC-EGFP。

2.病毒的鉴定

将上述获得纯化的重组病毒反复冻融三次，取200μL病毒液提取重组病毒基因组，方法如下：

取200μL病毒液，加入5μL质量浓度为20mg/mL的蛋白酶K和20μL质量浓度为10％SDS，置于56℃水浴消化2h；酚氯仿各200μL抽提一次，加入200μL氯仿抽提一次；加入1/10体积的NaAC，其摩尔浓度为3M，pH5.2和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃静置15min后，4℃，离心15min收集病毒基因组，加入适量去离子水溶解后，以该重组病毒基因组为模板，利用引物gCL-F、gCR-R对重组病毒进行PCR初步鉴定，PCR产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收目的片段，将其克隆至pMD18-T载体，经筛选鉴定后阳性质粒进行测序，结果与SEQID NO:5所示序列一致，说明含有CMV启动子序列的EGFP表达盒已插入病毒基因组中，重组病毒构建成功。

(4)表达新城疫F蛋白的转移载体的构建。

以步骤(1)中所述转移载体pILTΔgC-EGFP作为基础，应用限制性内切酶Xho I和Not I双酶切切去小片段，即EGFP基因，回收获得的大片段作为线性化载体备用；所述双酶切体系：pILTΔgC-EGFP质粒，1μg；10X CutSmart Buffer，5μl；Xho I，1μl；Not I，1μl；ddH₂O，up to 50μl；反应条件为37℃，60min，制备获得去除EGFP基因的线性化载体片段。

新城疫病毒F蛋白基因的克隆：具体地按针对本研究团队克隆的鸡新城疫CK/CH/HLJ/1/06株(该毒株已记载在文献：“新城疫病毒单克隆抗体制备及部分NP蛋白抗原表位鉴定分析，刘培欣，2011年，东北农业大学博士论文”中，现由中国科学院哈尔滨兽医研究所保存)病毒F基因设计引物，NDVF-F：catctcgaga tgggctccaa accttct，NDVF-R：aatgcggccgctcatgctct tgcagtggc，上游引物和下游引物插入Xho I和Not I位点。利用限制性内切酶Xho I和Not I消化PCR产物获得的线性DNA作为目的片段，应用T₄ DNA连接酶连接上述去除EGFP基因的线性化载体片段。反应体系：线性DNA，150ng；载体，50ng；10X Buffer，1μl；T₄DNA连接酶，1μl；ddH₂O，Up to 10μl。反应条件：16℃振荡水浴过夜，构建获得含有F蛋白基因表达盒的重组转移载体pILTΔgC-NDV-F，载体图谱如图4所示。

所述NDV-F表达盒由CMV启动子、NDV-F基因以及PolyA终止子组成；所述NDV-F表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其中NDV-F基因序列如SEQ ID NO:4所示。

(5)表达EGFP的传染性喉气管炎重组病毒的完整基因组DNA的提取。

将rILTVΔgC-EGFP毒株以0.001个MOI接种于铺满LMH单层的5mL细胞瓶中(LMH细胞的培养和传代参照《体外培养的原理与技术》操作(薛庆善，2001))，37℃吸附2h，弃掉病毒液，换2％的DMEM细胞维持液，待细胞病变达到80％～90％后，弃掉细胞维持液，加入细胞消化液500μL，所述消化液每2ml组成为：1860μL STE；100μL质量浓度为10％SDS；40μL质量浓度为20mg/mL蛋白酶K，37℃消化过夜，加入500μL酚抽提一次，加入酚氯仿各500μL抽提一次，加入500μL氯仿抽提一次；加入1/10体积NaAC，其摩尔浓度为3M，pH5.2，以及2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃沉淀过夜，4℃离心15min，风干后加入适量去离子水溶解病毒基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性，储存于-20℃备用。

(6)转染。

Day 1：准备细胞

Day 2：转染

1)于转染前3-4h更换细胞培养液。

4)将AB混合液置于室温孵育30min。

5)将混合液加入细胞培养液中。

6)将细胞置于37℃5％CO₂恒温培养箱培养中继续培养。

Day 3：更换细胞培养液并对细胞进行休克

1)更换细胞培养液。

2)用1×PBS轻洗细胞2次。

3)利用DMSO对细胞进行休克：1.用1×PBS配制15％(v/v)DMSO。2.将2mL DMSO休克液加入轻洗后的细胞中。3.室温孵育2.5min。4.弃掉DMSO加入新鲜的细胞培养液。

4)将细胞置于37℃5％CO₂恒温培养箱培养中继续培养。

细胞置于37℃，5％CO₂恒温培养箱培养中继续培养。每天观察至出现细胞病变(CPE)，待CPE达到80％～90％后收获病毒，-20℃反复冻融3次，作为蚀斑纯化的种毒，储存于-70℃备用。

表达新城疫F蛋白重组病毒的筛选及鉴定：

1.病毒的筛选

将步骤(4)中获得的pILTΔgC-NDV-F转移载体与步骤(6)中获得的重组病毒rILTVΔgC-EGFP的完整基因组DNA共转染LMH细胞，获得的重组病毒液用无血清DMEM做10^-1～10^-4倍稀释，将生长良好的LMH细胞单层用PBS轻洗3次，加入病毒稀释液，37℃孵育2h后，吸弃病毒液，加入DMEM培养基2ml，该10％DMEM培养基中含1％低熔点琼脂糖，室温放置30min培养基凝固后，移入37℃5％CO₂恒温箱中继续培养。待蚀斑出现后，在荧光显微镜下观察选择不表达绿色荧光蛋白的蚀斑进行筛选，待蚀斑增长至合适大小，挑取不表达荧光蛋白的蚀斑于无血清DMEM中，反复冻融三次后，再次接种于LMH细胞继续进行重组病毒增殖和蚀斑纯化，针对NDV-F基因设计引物：NDVF-F，5’catctcgagATGGGCTCCAAACCTTCT-3’，NDVF-R，5’-aatgcggccgcTCATGCTCTTGCAGTGGC-3’，对纯化的重组病毒进行PCR鉴定。

2.病毒的鉴定

将纯化的重组病毒反复冻融三次，取200μL病毒液提取重组病毒基因组，方法如下：取200μL病毒液，加入5μL质量浓度为20mg/mL的蛋白酶K和20μL质量浓度为10％的SDS，置于56℃水浴消化2h；酚氯仿各200μL，抽提一次，加入200μL氯仿抽提一次；加入1/10体积NaAC，其摩尔浓度为3M(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃15min后，4℃，离心15min收集病毒基因组，加入适量去离子水溶解后，以该重组病毒基因组为模板，利用引物NDVF-F、NDVF-R对重组病毒进行PCR初步鉴定，PCR产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳鉴定后(鉴定结果如图5所示)，切胶回收目的片段，将其克隆至pMD18-T载体，经筛选鉴定后阳性质粒进行测序，结果与SEQ ID NO:2所示序列一致，说明含有CMV启动子序列的NDV-F表达盒已插入病毒基因组中，重组病毒构建成功。重复以上病毒纯化步骤，经过3轮蚀斑纯化，获得纯净的重组病毒。

实施例2.表达新城疫F蛋白重组病毒蛋白表达及稳定性检测。

(一)应用间接免疫荧光技术(IFA)检测新城疫F蛋白的表达。

IFA步骤：1、重组病毒低剂量接种在六孔板上长成单层的LMH细胞，接种24h后用PBS洗涤三次。同时设置亲本病毒以及LMH细胞空白对照。

2、用4％多聚甲醇进行固定，每孔约1ml，室温作用30min。用PBS洗涤三次。

3、一抗加入1：100倍稀释的阳性血清(用PBS稀释)0.5ml/孔，37℃作用1h。用PBS洗三次。

4、二抗加入1：320稀释的兔抗鸡IgY FITC抗体(Sigma，0.2ml/孔)，37℃作用lh。用PBS洗涤三次。

5、荧光显微镜下观察结果。通过IFA可在病变处见到绿色荧光(结果如图6所示)，而亲本毒病变处以及LMH对照则观察不到典型绿色荧光。证明新城疫F蛋白基因已经表达。

(二)表达新城疫F蛋白重组病毒稳定性的测定。

1、生长稳定性(复制动力学/一步生长曲线)

将预先制备好的LMH细胞传代并铺于24孔细胞培养板中，计算细胞数量。24h后将重组病毒以0.001个MOI接种于生长良好的LMH单层，37℃孵育2h，弃掉病毒液，加入2％DMEM细胞维持液，置于37℃5％CO₂恒温培养箱培养。分别于0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h后收获病毒，每个时间点做3个平行重复，-20℃反复冻融三次，-20℃贮存备用。

本研究中采用蚀斑形成单位(PFU)测定病毒滴度，LMH细胞传入六孔板，待细胞长成单层，PBS洗3次后，将无血清DMEM稀释的病毒液接入，10^-1到10^-6，每个滴度2个孔，孵育2h后，吸净病毒液，在第四日，高稀释度的孔中可见明显蚀斑。此时，在每孔胶的上面加入1ml将含1％低熔点琼脂糖凝胶和中性红(m/v,1:28000)的10％DMEM培养基，待胶完全凝固后，用锡纸闭光，置于37℃5％CO₂培养箱继续培养24h，经中性红染色的可用肉眼观察到，计数后计算病毒滴度。

将不同时间点收获的病毒液做10^-1～10^-6倍稀释。将病毒原液与无血清DMEM细胞培养液以1：10的比例充分混匀。吸取100μL病毒稀释液加入至装有900μL无血清DMEM细胞培养液的EP管中，重复以上步骤直至病毒稀释至10^-6倍，将病毒稀释液接种于预先铺满LMH单层的6孔细胞培养板中，每个稀释度2个重复，37℃孵育2h，弃掉病毒液，将含1％低熔点琼脂糖凝胶的2％DMEM铺于细胞表面，置于4℃10min，待胶完全凝固后放入37℃5％CO2培养箱继续培养。每个时间点收获的5个不同孔的病毒液按照以上方法进行平行测定。12h后开始观察细胞病变情况，连续观察，在第四日，高稀释度的孔中可见明显蚀斑。此时，在每孔胶的上面加入1ml将含1％低熔点琼脂糖凝胶、中性红(m；v,1:28000)的2％DMEM培养基，待胶完全凝固后，用锡纸闭光，置于37℃5％CO₂培养箱继续培养24h，经中性红染色的可用肉眼观察到，计数后计算病毒滴度。同时对亲本病毒ILTV的生长规律进行平行测定，以0.001个MOI接种于生长良好的LMH单层，分别于接种后0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h后收获病毒，每个时间点做3个平行重复。经测定，rILTV△gC-NDV-F在48h收获的重组病毒滴度最高，为10^5.8PFU/mL，随着感染时间的增加，病毒的复制对细胞的损伤越来越大，活细胞数目逐渐减少，导致病毒的复制由于宿主细胞的死亡而受到抑制，病毒滴度在48h达到最高后逐渐下降。亲本病毒ILTV在48h收获的滴度达到最高，为10^5.9PFU/mL，随着感染时间的增加，其滴度逐渐下降。

2、重组病毒遗传稳定性测定

将重组病毒接种于LMH细胞连续传代。将重组毒以0.001MOI接种LMH细胞，37℃，5％CO₂孵育2h，弃掉病毒液，加入2％DMEM细胞生长维持液。显微镜下观察CPE，当CPE达到80％～90％时收获病毒。连续传代至20代，每5代进行鉴定。显微镜下观察细胞CPE，并提取病毒基因组DNA进行PCR鉴定和序列测定，结果表明，重组病毒经连续传代均能保持遗传稳定性。

实施例3.稳定表达新城疫F基因的传染性喉气管炎重组病毒的应用评价。

1.试验材料

1.1rILTV△gC-NDV-F株重组病毒，由实施例1构建获得并在LMH细胞增殖，鸡新城疫强毒北京株和传染性喉气管炎强毒株王岗株由本研究团队保存。

1.2SPF试验鸡：来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

2.试验方法

将rILTV△gC-NDV-F重组病毒分别以0.1ml点眼接种24只28日龄SPF鸡，另外20只作为对照，免疫后21天分别将其中12只免疫鸡和10只对照鸡攻击新城疫强毒北京株。同时将另外12只免疫鸡和10只对照鸡攻击传染性喉气管炎强毒株王岗株，观察20天，统计发病率和死亡率。攻毒后观察期间免疫组和对照组鸡均在4天、8天、12天、16天和20天分别采集口咽拭子和泄殖腔拭子，新城疫病毒分离鉴定通过QPCR扩增NDV保守基因M基因鉴定(M1:5’-AGTGATGTGCTCGGACCTTC-3’；M2:5’-CCTGAGGAGAGGCATTTGCTA-3’)，传染性喉气管炎病毒分离鉴定通过PCR扩增ILTV的保守基因gB基因鉴定(引物：gB-S:5’-CAGTATCTGGCATCGCCTCAT-3’；gB-A:5’-CCTGGGAACAGAACCTGAACT-3’)，统计攻毒后病毒在鸡体中的排毒情况。

3.试验结果

rILTV△gC-NDV-F株重组病毒接种鸡后20天，免疫组鸡不仅产生了针对免疫亲本毒传染性喉气管炎病毒的免疫效力，并产生了针对新城疫的免疫保护效力，针对ILTV强毒攻击的免疫保护率均达到12/12，而攻击传染性喉气管炎病毒强毒株的对照组鸡则在攻毒后全部发病，其中2只在攻毒后8天内死亡；针对NDV强毒攻击的免疫组鸡保护率达到11/12，攻击新城疫病毒强毒株的对照组鸡则在攻毒后10天全部死亡，结果详见表1和表2，其中dpi为免疫后的天数。

表1 rILTV△gC-NDV-F株重组病毒及对照组对ILTV强毒株攻击保护结果

表2 rILTV△gC-NDV-F及对照组对NDV强毒株攻击保护结果

试验结果表明，本发明以传染性喉气管炎重组新城疫病毒F基因获得的rILTV△gC-NDV-F重组病毒作为疫苗，免疫鸡能够产生针对新城疫病毒免疫保护力，说明本发明具有良好的应用价值。

核苷酸序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈

尔滨分中心)

<120> 一种表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应

用

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1099

<212> DNA

<213> gC 基因

<400> 1

atctgtatgc atgttcatag cctcttatga cgcacacgta attagaggca gattgaaatg 60

tatcctccgg tggtagtttt atgacgtcca ttagtgtaac gatatttttc ccctcgggct 120

catccaaaac aaaggtctgg tgtgggctcg tcgaaattct attatctacg atccattcaa 180

taaatcctcg gccgtctata atattagctg ctctacacag ggcataggca ggagggacga 240

attgtaccgt gatgcggggc ttgctaatcc agctgggagt caaccttaac aagcgagttt 300

caggtcgtag catttcaaag tcctcaggag gggtccatcg atatacaaat tgaattttgg 360

aagggagggg ctggctggct tctccacgta tttccagttc ccatgtctga tccaccgatc 420

cattctctcc tgatgcataa agaactcttc tttctaaact gtatttttca gcaagagatg 480

cattatgtat catccatgta cccagcgcag cagatggagg ataagcgcca agcgcttcaa 540

cacttaagtg cgaagcctta tctgagtctt cgtacagttc ttctgatttg atgcggacag 600

ttgtaggtgg tcttgccaaa aagacgtcga taaaagagct atttagtttt gtagaccctc 660

gacttgcggt ccactgataa cgcgccatgt gagatctcat gctagacttg atagagacat 720

tgaaaaaacc tgaacgacag tcgtccaaat atggtgggtt aattccatct tcaccaatgt 780

atcctaggtc cttgattgaa tcagtagcgg catcatatgt gtagagagtt cttggagtag 840

ctctccatgg atctagcgaa ggggggatcc cgtaggcgct tagcgcagtt tcaactaagc 900

tggctgggtg tcgaattact tctactttta cagattcttc gtgggttaga ggtctgtcgc 960

tgaagcattg caatagaatg gggtcaccga gctgccctcg aaaaacgtgt ggcggatcac 1020

agaaaaattc aaacgcaagg ctttgcaggc tcaagagcaa aagtatactc gaaactagcg 1080

cagtactctg atgctgcat 1099

<210> 2

<211> 1864

<212> DNA

<213> 左同源臂gCL基因

<400> 2

acttgacgcg caagctcttt ggagaaggac tgaaatggaa gtggcttttc aagaagtctc 60

caagcgcgga tcaaagtctc ctgcacgcta catagatcac cacagcggac gactctacat 120

tatctatgga ggatgcatct actcgatctc tactcgcggg ccgataaaaa atattaccaa 180

attcggtttt aggatcaaac accctaccat gtgtgcgatt attaacactg aactgaatcg 240

tttgaatggg atgccttttg accgccagga ggaagaatac atttttactt ctcatcttgg 300

tgaaatttca gaatctccac atgatgaatt gattgataat tttaccgtgg agatcagacg 360

accgatcttg tgcaaaatat ttgtcggcct gcaggtttcc gaaacgctag aaatacgagt 420

tggggaagtc tctctgagga ataaagtact gaggttattt agaaccccgg atctaatcaa 480

tacgacgaca ggatttaggt atcaagtaga tagtagtgcg ctggtgctaa cgcaggcaca 540

tattactact ctgccgaagt tcatagaaga agatttagaa gatttattct tgaactccct 600

aacaagagaa ccgattcatg aacaatcaca gatttttact cctattatta ttacgggagg 660

taaaatcatt agtacggtcg cagtaggaaa tgagaaaaaa gccctgcgtg ggtgtaagaa 720

aaaaactatc ctctcagatc atgtgcaggt gaaacacatt taccccgacc aaatgttcga 780

cgaagatgta gaaaatttct gggaatgttg gaaagtatta aagcgactct ggaagatgtt 840

aatgatcgtg gatgcggcca cgatttcacg acatggactt ctcgcaacta tcggactttc 900

atgggagact gatggagcaa aactgaaaag tacattgcgc gacgaggctg acattctggt 960

cacgctgcca taccctggcc aacgatgcct cagcaaagca tcattcgggc gaagctcagt 1020

gattccttat actctgttta attatttact tatgctcggg cactatcctt gtcactttga 1080

cgaaattaca gttgtctgtg aaagatatat tgaaaaaagc gggctcaaaa aaatccagag 1140

ccccgaaact ctacaattac aagaattgtc ggaagttgtt ctcaatatat tgaaaacttt 1200

gctggccacg cactatgttt tgcaagatgc actagtcagc tgttgtttga atcccaaagt 1260

gcaacccaaa ccgagatgtt cgtatccacc agagagtatc ccgttaatcc cagaaacagc 1320

ggtactcctc gatgcggcaa aaacccgttt aatgaaagat gtaagtaccg cagcgtgcct 1380

tcgaactaaa attccacaag aaattttggt caacactgca aagcgaaccg ccgcggctct 1440

cgtctgcatt tacttgtacg aggaggcata cgcggccagt gaggtttctg aaattactgg 1500

aaattttgag cttgggcgca aaatcgaaga tctgtggaag atgactaagg aagaaatttc 1560

tccaatcatt tgggaatatc ggacggatct ggtagaaata ttgaaatcta taatatcgtt 1620

taggcttgct tgagactacc tgccagtgca aggtttccga tgaaataaat tggacagaca 1680

gtagtgcacg tttgtaatgt catttattaa atgagcgttt atgttgtctt ccagcaccat 1740

gcgcccaagc aagcaactag taacccaccc acaaaagcga tactaattat aataaaaatc 1800

gcagcgactg cggggaatcc ttgccgcatt ggcagattat ctatcattaa ggaggcgttg 1860

agat 1864

<210> 3

<211> 1729

<212> DNA

<213> 右同源臂gCR

<400> 3

gttgagtcgt gaatgcccta gtctccagat cgcggtaatt tagctactat ggacacagtc 60

cgcccgaata atatgaaaat ttttgcgttt tcgcacgtgg aaacactcct agcgcgagag 120

aatcgaactt gtaactttct ctctcgacga attacacgaa tgcaaacttt gcatagtaca 180

tgtgctttat taacaatgtc aaaatataga ttgcatccga agcaatactg catcatgttc 240

gtgactatga caatcctcga caatatagtt ccagttgtta agtagtgaaa gttgaaggcc 300

gcctgttagg ttattctcta gcattttctc cagtaaacgg ttgctcggtg gaatgtagat 360

ctgtttctaa tgtcctcgtt ccgaatttct gcagctcggc gaaggcagtt tcgaggcgac 420

agtctcctgc gtgccatgtt tgatttctat tcgattgccg accattagta ctttggtact 480

ggatgatgtg gtattcgcaa tacaaaaatc gtacaactaa gaacatctta ggtttggagg 540

aaaacattca gagcaggctg aaactcaagg taactttaaa agttaaagca agccatgtta 600

gcgatgcatt catcttgttg gaatgttcaa gctagcgcgt aaattgagga aggcatttgt 660

gttggcttag ggcgttgtca gaattggcac gtctccctta gacaagaatt cagagcttgt 720

actcacacac aagcggcgcg gcaattggaa tgaaaaggga gcagaaaaga agggcgcatg 780

aaatccatcc ttgtgtatgg gtggccgttt ttaattctcg gaaaaagagg gctccaactt 840

gaaacagaca agaaaccgat gcaagaatga caccaaatgg aatgccagct gggtcctcaa 900

tcaacttaat cagtgatagc agagacacga aggttaatag tatgcttatc acgaaccata 960

caacgatatg gattttgcat agttttccaa tgcaagtaga tccaaatgcc aaaaccgaac 1020

cgcacgctac catgaggatt ttaaaattcg tttgcatgcc gatgcgtaca gtacctaaat 1080

ctttgcccag gaacggtaat gataatgtgc aggcgaaagc ggcagtaacc aatgttgtag 1140

atacgagaat acagtaaccg caccaccgag ttggtccgtc attcagtgaa gggcgagtat 1200

ctttatgttg tcttgggggt gtataaatcg tgttatcttc ggaaaatggt tctatactgc 1260

ccgtcagagt tatcatgctg gtcttaaaaa aatcactctt gagcaaaaaa cgagagggat 1320

tgtatgccaa aatgttaata gtaaaaaggg ccaacggttc caagtatcta gggtttactc 1380

gaaggtgcat caagttccaa gaaagtacgg tcaaatttag gagcatggct tcaagaaaga 1440

gccaggtcat gtttatgctg cagaaaatgg ccggtcggag ttgaaatccc aaaatcagta 1500

tcaagcaaac ttccgaaaaa acggagaata gccccataac tatcgcggca ttggggctgt 1560

tggaatggat gagaaatata attattactg cgctcgccat agaaagcatc accagaaaat 1620

aaattcggac tgttttgtga gccgagtatt gaatatccag aaaactggca gtaatcgtag 1680

ccaccaatag tccgatcatc catccgaatc ttgcctcttt cgtagaaag 1729

<210> 4

<211> 1662

<212> DNA

<213> NDV-F基因

<400> 4

atgggctcca aaccttctac caggatccca gcacctctga tgctggtcac ccggattatg 60

ctgatattgg gctgtattcg ttcgacaagc tcccttgatg gcaggcctct tgcagctgca 120

ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180

atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agggataagg aggcgtgtgc gaaagcccca 240

ttagaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300

aagattcaag ggtctgtgtc cacgtctgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct 360

gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420

ctaatacaag ccaacaagaa tgctgccaac atccttcggc ttaaggagag cattgctgca 480

accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540

aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600

aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660

ttcgggccac agatcacctc tcctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720

ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780

agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacagact 840

caactcttgg gcatacaagt gaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900

acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960

aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020

tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080

tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140

acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga 1200

tgtacagacc ctcctggcat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat 1260

agacattcgt gcaatgtctt atcattagac gggataactc tgaggctcag cggagaattt 1320

gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380

cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggataag 1440

ttggcagaaa gcaacagtaa gctagaaaaa gtcaatgtca gattaaccag cacatctgct 1500

ctcattacct atattgttct aactgtcatt tctctagttt tcggtgcact tagtctgggt 1560

ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620

aataatgccc ttgatcagat gagagccact gcaagagcat ga 1662

<210> 5

<211> 1637

<212> DNA

<213> EGFP表达盒基因

<400> 5

taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 60

taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 120

ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 180

gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 240

ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 300

ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 360

atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 420

agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 480

ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 540

gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ctaccggact 600

cagatctcga gctcaagctt cgaattctgc agtcgacggt accgcgggcc cgggatccac 660

cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg 720

tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 780

atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 840

cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg 900

accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc 960

gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg 1020

gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 1080

tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca 1140

agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg 1200

tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc 1260

ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 1320

atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 1380

tgtacaagta aagcggccgc gactctagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt 1440

tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc 1500

aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 1560

cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 1620

catcaatgta tcttaag 1637

<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> EGFP 基因

<400> 6

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 7

<211> 2517

<212> DNA

<213> NDV-F表达盒

<400> 7

taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 60

taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 120

ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 180

gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 240

ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 300

ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 360

atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 420

agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 480

ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 540

gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ctaccggact 600

cagatctcga gatgggctcc aaaccttcta ccaggatccc agcacctctg atgctggtca 660

cccggattat gctgatattg ggctgtattc gttcgacaag ctcccttgat ggcaggcctc 720

ttgcagctgc aggaattgta gtaacaggag ataaggcagt caatgtatac acctcgtctc 780

agacagggtc aatcatagtc aagttgctcc cgaatatgcc cagggataag gaggcgtgtg 840

cgaaagcccc attagaggca tataacagaa cactgactac tttgctcact cctcttggcg 900

actccatccg caagattcaa gggtctgtgt ccacgtctgg aggaaggaga caaaaacgct 960

ttataggtgc tgttattggc agtgtagctc ttggggttgc aacagcggca cagataacag 1020

cagctgcggc cctaatacaa gccaacaaga atgctgccaa catccttcgg cttaaggaga 1080

gcattgctgc aaccaatgaa gctgtgcatg aagtcaccga cggattatca caactatcag 1140

tggcagttgg gaagatgcag cagtttgtca atgaccagtt taataatacg gcgcgagaat 1200

tggactgtat aaaaatcaca caacaggttg gtgtagaact caacctatac ctaactgaat 1260

tgactacagt attcgggcca cagatcacct ctcctgcatt aactcagctg accatccagg 1320

cactttataa tttagctggt ggcaatatgg attacttatt aactaagtta ggtataggga 1380

acaatcaact cagctcatta attggtagcg gcctgatcac tggttaccct atactgtatg 1440

actcacagac tcaactcttg ggcatacaag tgaatttgcc ctcagtcggg aacttaaata 1500

atatgcgtgc cacctatttg gagaccttat ctgtaagtac aaccaaagga tatgcctcag 1560

cacttgtccc gaaagtagtg acacaagtcg gttctgtgat agaagagctt gacacctcat 1620

actgtataga gtccgatctg gatttatatt gtactagaat agtgacattc cccatgtccc 1680

caggtattta ttcctgtttg agcggcaaca catcagcttg catgtattca aagactgaag 1740

gcgcactcac tacgccgtat atggccctta aaggctcagt tattgccaat tgtaagataa 1800

caacatgtag atgtacagac cctcctggca tcatatcgca aaattatgga gaagctgtat 1860

ccctgataga tagacattcg tgcaatgtct tatcattaga cgggataact ctgaggctca 1920

gcggagaatt tgatgcaact tatcaaaaga acatctcaat actagattct caagtcatcg 1980

tgacaggcaa tcttgatata tcaactgaac ttggaaacgt caacaattca atcagcaatg 2040

ccttggataa gttggcagaa agcaacagta agctagaaaa agtcaatgtc agattaacca 2100

gcacatctgc tctcattacc tatattgttc taactgtcat ttctctagtt ttcggtgcac 2160

ttagtctggg tttagcgtgt tacctgatgt acaaacagaa ggcacaacaa aagaccttgc 2220

tatggcttgg gaataatgcc cttgatcaga tgagagccac tgcaagagca tgagcggccg 2280

cgactctaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac 2340

ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg 2400

tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 2460

gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaa 2517

<210> 8

<211> 553

<212> DNA

<213> CMV启动子基因

<400> 8

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agc 553

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> gCL-F

<400> 9

cgcggatcca tctcaacgcc tccttaa 27

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> gCL-R

<400> 10

cggaattcac ttgacgcgca agctct 26

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> gCR-F

<400> 11

cccaagcttc tttctacgaa agaggca 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> gCR-R

<400> 12

cgcggatccg ttgagtcgtg aatgccc 27

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> NDVF-F

<400> 13

catctcgaga tgggctccaa accttct 27

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> NDVF-R

<400> 14

aatgcggccg ctcatgctct tgcagtggc 29

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> M1

<400> 15

agtgatgtgc tcggaccttc 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> M2

<400> 16

cctgaggaga ggcatttgct a 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> gB-S

<400> 17

cagtatctgg catcgcctca t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> gB-A

<400> 18

cctgggaaca gaacctgaac t 21

Claims

1.一种表达新城疫病毒F蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株，名称为rILTV△gC-NDV-F株，其微生物保藏号是：CGMCC No.18534。

2.权利要求1所述的传染性喉气管炎重组病毒株的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(2)提取传染性喉气管炎病毒的完整基因组DNA；

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述左同源臂gCL，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述右同源臂gCR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述新城疫病毒F蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述EGFP表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述EGFP核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述左同源臂gCL与右同源臂gCR扩增所用的模板为鸡传染性喉气管炎病毒CK/CH/LHLJ/120305株基因组，引物设计所参考的序列GenBank登陆号为NC_006623.1，所述ILTV病毒CK/CH/LHLJ/120305株，其微生物保藏号为CGMCC No.15482。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述左同源臂gCL扩增用的引物序列如下：gCL-F：5’-CGCGGATCCatctcaacgcctccttaa-3’，gCL-R：5’-CGGAATTCacttgacgcgcaagctct-3’；所述右同源臂gCR扩增用的引物序列如下：gCR-F：5’-CCCAAGCTTctttctacgaaagaggca-3’gCR-R：

5’-CGCGGATCCgttgagtcgtgaatgccc-3’。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述构建含有EGFP表达盒的重组转移载体的具体方法为：首先应用引物扩增获得左同源臂gCL，经EcoRI和BamHI双酶切后插入到经EcoRI和BamHI酶切后的PUC18载体中，获得中间载体pILT△gC-L；然后应用引物扩增获得右同源臂gCR，经HindIII和BamHI双酶切后插入到经HindIII和BamHI酶切后的中间载体pILT△gC-L中，获得的中间载体pILT△gC，经BamHI单酶切后再进行平端化；

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述平端化通过Klenow酶实现。

8.权利要求1所述的重组病毒株在制备预防鸡病毒性传染病疫苗中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述鸡病毒性传染病疫苗为传染性喉气管炎病毒疫苗、新城疫疫苗或传染性喉气管炎和鸡新城疫的二价疫苗。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组病毒株直接用于或灭活后用于制备预防鸡病毒性传染病疫苗。