WO2015060650A2 - 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2015060650A2 WO2015060650A2 PCT/KR2014/009971 KR2014009971W WO2015060650A2 WO 2015060650 A2 WO2015060650 A2 WO 2015060650A2 KR 2014009971 W KR2014009971 W KR 2014009971W WO 2015060650 A2 WO2015060650 A2 WO 2015060650A2
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- hgf
- sequence
- pck
- cells
- isoforms
- Prior art date
Links
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 78
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 title claims abstract description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 42
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 claims 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 109
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 20
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 14
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 13
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 12
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 102220020162 rs397508045 Human genes 0.000 description 10
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 102000057308 human HGF Human genes 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 101150022655 HGF gene Proteins 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 7
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 7
- GQMMRLBWXCGBEV-YVMONPNESA-N (nz)-n-[(3-nitrophenyl)methylidene]hydroxylamine Chemical compound O\N=C/C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 GQMMRLBWXCGBEV-YVMONPNESA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 3
- 101150024147 bax gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 3
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 3
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100230980 Homo sapiens HGF gene Proteins 0.000 description 2
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 2
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006909 anti-apoptosis Effects 0.000 description 2
- 108700041737 bcl-2 Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 2
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 101150108397 Abcd2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101100232904 Homo sapiens IL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100232919 Homo sapiens IL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 101150102264 IE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103227 IFN gene Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241001028048 Nicola Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003340 calcium silicate Drugs 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000007674 genetic toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical group [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000009163 protein therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000001032 spinal nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
Definitions
- the present invention relates to a composition for preventing or treating atrophic lateral sclerosis comprising two or more heterologs of hepatocyte growth factor or polynucleotides encoding the heterologs as an active ingredient.
- ALS Amyotrophic Lateral Sclerosis
- ALS a progressive neurodegenerative disease characterized by the following characteristics: ALS, neurological disorders, neurological disorders, and many others: ALS, neurological disorders, and many others: ALS, neurological disorders, and many others: ALS, neurological disorders, and many others: ALS, neurological disorders, and many others: ALS, neurological disorders, and many others: ALS, neurological disorders, and many others: ALS, neurological disorders, and many others: ALS, neurological disorders, and many others: ALS, neurological disorders, neurological disorders, and others.
- Molecular genetic testing which can be used in clinical trials involving several genes related to ALS, plays an important role in genetic type diagnosis and genetic counseling.
- ALS can be inherited by autosomal dominant, autosomal recessive, or X-linked methods. Genetic counseling and risk assessment depend on the exact diagnosis of a specific genetic diagnosis.
- Ri luzol e is known as a drug that delays the progression of ALS disease. have. Rirusol is known to slow down the progression of ALS by inhibiting excess glutamic acid, which is thought to be one of the causes of motor neuron destruction.
- the clinical effects of rilusol do not improve the symptoms of ALS and the results are not clear in increasing the duration of tracheostomy-free survival in patients with ALS.
- the true clinical effects of rilusol which is beneficial to ALS patients, have been reported to be very limited and ambiguous (Stewart et al, 2001). Nevertheless, since there is no effective prophylactic or therapeutic agent for ALS in addition to the ambiguous clinical usefulness of the rurusol, there is a need for the development of drugs that exhibit a prophylactic or therapeutic effect on ALS.
- PCT / KR03 / 000548 discloses a composition for treating or preventing ischemic disease or liver disease, including the pCK-HGFX7 recombinant vector used in the present invention. All contents of PCT / KR99 / 000855 and PCT / KR03 / 000548 are incorporated herein by reference. Throughout this specification, many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
- the present inventors made diligent research efforts to develop a drug capable of preventing or treating amyotrophic lateral sclerosis. As a result, the present invention has been found by identifying that two or more hepatocyte growth factor (HGF) isoforms or a composition comprising a polynucleotide encoding the variants as an active ingredient can be used to treat ALS. It was completed.
- HGF hepatocyte growth factor
- the object of the present invention is Amyot rophi c Lateral Scleros is) to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment.
- Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating Amyotrophi c Lateral Scleros is.
- the invention is HGF (Hepatocyte Growth)
- ALS can be treated using a composition comprising two or more Hepatocyte Growth Factor (HGF) isoforms or polynucleotides encoding the variants as an active ingredient.
- HGF Hepatocyte Growth Factor
- the therapeutic strategies of the present invention can be broadly classified into two groups: protein therapy and gene therapy.
- protein therapeutic strategy of the present invention two or more types of heterologous proteins of HGF are used.
- gene therapy strategy of the present invention one or more nucleotide sequences encoding two or more types of heterologs of HGF are used.
- Two or more types of HGF isoform-encoding nucleotide sequences may be provided as one polynucleotide or as separate polynucleotides.
- two or more types of HGF isoform-encoding nucleotide sequences of HGF are provided as one polynucleotide.
- HGF isoform 1 refers to all alleles.
- HGF isoforms have the meaning encompassing both the normal form or wild type of HGF, and various variants of HGF (eg, splicing variants and deletion variants).
- two or more isoforms of the HGF of the invention comprise full length HGF (ful l length HGF; f lHGF) and a variant HGF (del eted var i ant HGF; dHGF).
- HGF full length HGF
- f lHGF full length HGF
- dHGF variant HGF
- f lHGF refers to the amino acid 1-728 sequence of an animal, preferably a mammal, more preferably a human HGF.
- dHGF refers to a deleted variant of the HGF protein produced by selective spooling of the HGF gene in an animal, preferably a mammal, more preferably the first chunk of the alpha chain from the full length HGF sequence.
- human HGF consisting of 723 amino acids missing five amino acids (F, L, P, S and S) in the ringle domain.
- the full length HGF of the invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
- the deleted variant HGF of the invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
- the variants of the HGF of the invention are encoded by separate nucleotide sequences or by a single polynucleotide.
- the pharmaceutical composition of the present invention comprises two or more polynucleotides when different types of HGFs are encoded by separate polynucleotides, and different types of variants of HGF are encoded by a single polynucleotide Where included, one or more polynucleotides comprising the single polynucleotide.
- the polynucleotides of the invention may be operably linked to one or more regulatory sequences (eg, promoters or enhancers) that regulate the expression of HGF isoforms.
- expression cassettes can be constructed in two ways.
- an expression cassette is constructed by linking an expression control sequence to a CDS (cod ing sequence) for each of the variants.
- a CDS cod ing sequence
- the second method using an IRESG nt erna lri bosoma entry site or a 2k peptide in the same manner as "expression control sequence-first variant CDS-IRES-second variant CDS-transcription sequence”.
- Construct an Expression Cassette IRES allows the translation of genes to begin at the IRES sequence so that two or more genes of interest are extracted from the same construct.
- the polynucleotides encoding both of the two or more types of variants are operably linked to a single expression control sequence.
- the variants of HGF may be encoded by a hybrid HGF gene which simultaneously expresses two or more different types of variants, such as f lHGF and dHGF.
- the hybrid HGF gene comprises cDNA corresponding to exons 1 to 18 of human HGF, and intron 4 or a fragment thereof of human HGF gene inserted between axons 4 and 5 of the cDNA.
- the hybrid HGF gene comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to 10 sequences.
- the hybrid HGF gene comprising intron 4 is 7113 bp in length and comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
- the hybrid HGF gene may optionally comprise a fragment of intron 4 between axons 4 and 5 of the HGF cDNA. have.
- the sequence additionally inserted between exons 4 and 5 is intron 4 of the human HGF gene, nucleotides 392 to 2247th of the sequence 3rd sequence, 392th to 727th Nucleotides 2229 th to 5471 th and nucleotides, 5117 th to 5471 th nucleotides, 3167 th to 5471 th nucleotides, 4167 thru 5471 th Nucleotides or combinations thereof.
- the sequence additionally inserted between axons 4 and 5 of the therapeutic nucleotide sequence used in the present invention comprises (i) the nucleotides 392 to 2247 of the 3rd sequence in SEQ ID NO: 3 and the 2229 th to 5471 th Nucleotides of (ii) the 392 th to 2247 th nucleotides of sequence 3rd sequence and the nucleotides 5117 to 5471 th of (3) the 392 th to 2247 nucleotides and 3167 th of sequence 3rd sequence Nucleotides 5471 through 5471, (iv) nucleotides 392 through 2247 of the sequence 3rd sequence and nucleotides 4167 through 5471, and ( v ) 392 through 727th sequence of the 3rd sequence Nucleotides and nucleotides 2229 to 5471, (vi) SEQ ID NO: 3 sequence Nucleotides 392 through 727 and nucleotides 5117 through 5471, (vi) S
- the therapeutic nucleotide sequence of the present invention according to the sequence additionally inserted between the axons 4 and 5 is as follows: (i) (axons 1 to exon 4)-(SEQ ID NO: 392 to 2247) Nucleotides from -2229 to 5471 nucleotides)-(exon 5 to axon 18); (ii) (exons 1 to axon 4)-(nucleotides 392 to 2247 of SEQ ID NO: 3-nucleotides from 5117 to 5471)-(axons 5 to exon 18); (iii) (axons 1 to exon 4)-(nucleotides 392 to 2247 of SEQ ID NO: 3-nucleotides 3167 to 5471)-(exon 5 to exon 18); (iv) (axons 1 to axon 4)-(nucleotides 392 to 2247 of SEQ ID NO: 3-nucleotides 4167
- HGF-X the hybrid HGF gene including the fragment of Intron 4
- HGF-X has HGF-X2, HGF- having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 to 10 X3, HGF-X4, HGF-X5 HGF-X6, HGF-X7 and HGF—X8.
- HGF-X7 is preferably used.
- HGF isoforms "HGF-X”, “HGF-X7”, and the like have been reported in the prior art PCT / KR03 / 000548, and the disclosures of the patent documents are described herein in their entirety. Is inserted by reference.
- the amino acid or nucleotide sequence of the HGF isoforms usable in the present invention are also construed to include amino acid or nucleotide sequences that exhibit substantial identity with the sequence of wild type human HGF isoforms.
- the substantial identity is minimal when the amino acid or nucleotide sequence of the wild-type human HGF isoform is aligned with the maximal correspondence with any other sequence, and when the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
- Biol. 215: 403-10 (1990)) are accessible from the National Center for Biological Information (NBCI) and the like, and sequence analysis such as blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx on the Internet. Can be used in conjunction with the program.
- BLSAT is available at http: //www.ncbi. Accessible at nlm.nih.gov/BLAST/. Sequence homology comparison methods using this program can be found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
- prevention refers to the administration of the compositions of the present invention. By all means any action that inhibits or delays progression of amyotrophic lateral sclerosis.
- treatment refers to (a) inhibition of the development of amyotrophic lateral sclerosis; (b) alleviation of amyotrophic lateral sclerosis; Or (c) removal of amyotrophic lateral sclerosis.
- composition of the present invention enables the prevention or treatment of amyotrophic lateral sclerosis through neural pole germination and growth in neurons, and the growth and death of motor neurons.
- compositions of the present invention can be applied in vivo through various delivery methods commonly known in the art of gene therapy.
- the polynucleotide of the present invention is naked DNACnaked DNA) or is included in a gene carrier.
- gene carriers include plasmids, vectors and viral vectors.
- Plasmids can be used as carriers to carry the polynucleotides of the invention.
- the polynucleotides included in the vector are preferably present in a suitable expression cassette.
- the polynucleotide in the expression cassette is preferably operably linked to a promoter.
- operably linked refers to a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences or transcriptional regulator binding sites) and other nucleic acid sequences, whereby the regulation The sequence will control the transcription and / or translation of said other nucleic acid sequence.
- a promoter bound to a polynucleotide sequence is a promoter derived from a mammalian virus, capable of controlling transcription of the nucleotide sequence by operating in an animal cell, preferably a mammalian cell, and more preferably a human cell.
- promoters derived from genomes of mammalian cells including, for example, the cyt omega lo virus (CMV) promoter, the late adenovirus promoter, the vaccinia virus 7.5K promoter, the SV40 promoter, the tk promoter of HSV, the RSV promoter, EF1 alpha Promoter, metallothionine promoter, beta-actin promoter, promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphospecific gene and promoter of human GM-CSF gene Including but not limited to.
- CMV cyt omega lo virus
- the late adenovirus promoter the late adenovirus promoter
- the vaccinia virus 7.5K promoter the SV40 promoter
- the tk promoter of HSV the RSV promoter
- EF1 alpha Promoter metallothionine promoter
- beta-actin promoter promoter of human IL-2 gene
- the promoter used in the present invention is a promoter or EF1 alpha promoter derived from an IE (immediately early) gene of human CMV (hCMV), most preferably the promoter / enhancer and exon 1 whole of the hCMV IE gene. 5'-UTR (untranslated region) comprising the sequence from immediately before the ATG start codon of exon 2.
- the expression cassette used in the present invention may comprise a polyaninated sequence, for example, a plastic field hormone terminator (Gimmi, ER, et al., Nucleic Acids Res. 17: 6983—6998 (1989)), derived from SV40 Poly adenylation sequence (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12: 5386-5393 (1992)), HIV-1 polyAC lasens, BIF, et al. , Nucleic Acids Res. 26: 1870-1876 (1998)), ⁇ —globin polyA (Gil, A., et al, Cell 49: 399-406 (1987)), HSV TK polyA (Cole, CN and TP Stacy, Mol. Cell. Biol 5: 2104—2113 (1985)) or polyomavirus polyA (Batt, D. B and GG Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15: 4783-4790 (1995)).
- a pCK, pCP, pVAXl or pCY vector may be used as a carrier of the polynucleotide, and more preferably, a pCK vector may be used.
- the pCK vector is disclosed in detail in WO 2000/040737, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
- Retroviruses are widely used as gene transfer vectors because they insert their genes into the host genome, carry large amounts of foreign genetic material, and have a broad spectrum of infectable cells.
- the polynucleotide sequence of the present invention is inserted into the retrovirus genome instead of the sequence of the retrovirus to produce a nonreplicating virus.
- constructing packaging cell lines containing gag, pol, and env genes but without LTR (long terminal repeat) and ⁇ sequences Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983)).
- the ⁇ sequence enables the production of RNA transcripts of the recombinant plasmid, which transcript is packaged as a virus, and the virus is Discharged to the medium (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)).
- the medium containing the recombinant retrovirus is collected, concentrated and used as a gene delivery system.
- Adenoviruses are widely used as gene transfer vectors due to their medium genome size, ease of manipulation, high titers, wide range of target cells and excellent infectivity. Both ends of the genome contain 100-200 bp of Inverted Terminal Repeat (ITR), which is a cis-element essential for DNA replication and packaging.
- ITR Inverted Terminal Repeat
- the genome's E1 regions (E1A and E1B) represent the transcriptional and host cell genes. Encode proteins that regulate transcription.
- the E2 regions (E2A and E2B) encode proteins that are involved in viral DNA replication.
- the polynucleotide sequence of the present invention is preferably inserted into the deleted E1 region (E1A region and / or E1B region) or E3 region.
- the nucleotide sequence may be inserted into the deleted E4 region.
- deletion as used herein in connection with a viral genome sequence has the meaning including not only a complete deletion of the sequence, but also a partial deletion.
- adenovirus can pack up to about 105% of the wild-type genome, about 2 kb can be additionally packaged (Ghosh— Choudhury et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987)).
- the above-described foreign sequence inserted into the adenovirus may additionally bind to the genome of the adenovirus.
- Adenoviruses have 42 different serotypes and subgroups of A-F. Of these, adenovirus type 5 belonging to subgroup C is the most preferred starting material for obtaining the adenovirus vector of the present invention. Biochemical and genetic information for adenovirus type 5 is well known. Foreign genes carried by adenoviruses replicate in the same way as episomes, and have very low genetic toxicity to host cells. Therefore, gene therapy using adenovirus gene delivery system is considered to be safe.
- Adeno-associated virus is suitable as the gene delivery system of the present invention because it can infect non-dividing cells and has the ability to infect various kinds of cells. Details of the manufacture and use of MV vectors are disclosed in detail in US Pat. Nos. 5,139,941 and 4,797,368. Studies on AAV as a gene delivery system are described in LaFace et al, Viology, 162: 483486 (1988), Zhou et al. , Exp. Hematol. (NY), 21: 928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest. 94: 1440-1448 (1994) and Flotte et al. Gene Therapy, 2: 29-37 (1995). Recently, MV vectors have been conducting clinical I as a treatment for cystic fibrosis.
- MV viruses are plasmids containing the gene sequence of interest, with two MV terminal repeats located next to them (McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963-1973 (1988); and Samulski et al. , J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)) and the expression #rasmid (McCarty et al., J. Virol., 65: 2936-2945 (1991), including the wild type V. coding sequence without terminal repeats. Prepared by co-transfection).
- viral vectors can also be used to carry the polynucleotide sequences of the invention in vivo. Basinian virus (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10: 649—657 (1999); Ridgeway, "Mammal i an expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses.Rodrigue and Denhardt Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred ⁇ genes," In: Kucher 1 apat i R, ed.
- Liposomes are automatically formed by phospholipids dispersed in the aqueous phase. Examples of successfully delivering foreign DNA molecules into liposomes into cells include Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982) and Nicolau et al. , Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987). Liposomes containing the polynucleotide sequence of the present invention interact with cells through mechanisms such as endocytosis, adsorption to the cell surface, or fusion with plasma cell membranes to transport the polynucleotide sequences into cells.
- the polynucleotide sequence of the present invention when mounted on naked recombinant DNA molecules or plasmids (vectors), the microinjection method (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980); and Harland and Weintraub, J. Cell Biol. 101: 1094-1099 (1985)), calcium phosphate precipitation (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973); and Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745 -2752 (1987)), electroporation (Neumann, E. et al. ⁇ EMB0 J., 1: 841 (1982); and Tur-Kaspa et al., Mol.
- the polynucleotide sequence of the present invention When the polynucleotide sequence of the present invention is constructed based on a viral vector, the polynucleotide sequence may be transported into cells according to various viral infection methods known in the art. Infection of host cells with viral vectors is described in the above cited references.
- the gene carrier of the invention is a vector.
- the vector of the present invention is a plasmid, most preferably a pCK vector can be used.
- a recombinant vector comprising a single polynucleotide expressing two or more isoforms of HGF using a pCK vector is PCK-HGFX7, as detailed above in PCT / KR99 / 000855 and PCT / KR03 / 000548. It is described.
- composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
- Pharmaceutically acceptable carriers included in the compositions of the present invention are those commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi Manny, Starch, Acacia Rubber, Calcium Phosphate, Alginate, Gelatin, Calcium Silicate, Microcrystalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidone, Cellulose, Water, Syrup, Methyl Cellulose, Methylhydroxybenzoate, Propylhydride Oxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
- a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbibuprofate, a sorbi cal Sciences (19th ed., 1995).
- the pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral administration, such as intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, spinal cord administration, intrathecal administration, intraventricular administration, intracranial administration, intracranial administration, intramuscular Administration may be by administration or by topical administration. Most preferably, intramuscular, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intraventricular and intracranial administration can be administered.
- compositions of the invention can be formulated and administered by injection. Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age of patient, weight, sex, degree of disease symptom, time of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity. In general, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment.
- the variants of the HGF of the invention are administered at a dosage of 1 to 2500 mg each, and the polynucleotides encoding the variants are administered at a dosage of 1 to 2500 mg each. Dosages may be the same or different each time when administration of the variants of the HGF or the polynucleotides encoding it is repeated more than once.
- compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated using pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
- the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion of oil or aqueous medium, or may be in the form of axes, powders, granules, tablets or capsules, dispersants Or stabilizers may additionally be included.
- the present invention provides a muscle comprising administering to a mammal a composition comprising, as an active ingredient, two or more variants of Hepatocyte Growth Factor (HGF) or a polynucleotide encoding the variants.
- HGF Hepatocyte Growth Factor
- a method for preventing or treating Amyotrophic Lateral Sclerosis is provided.
- two or more isoforms of the HGF of the invention include full length HGF (flHGF) and the missing variant HGFCdeleted variant HGF; dHGF).
- the full length HGF of the invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
- the deleted variant HGF of the invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
- the method for preventing or treating Amyotrophic lateral sclerosis is a method comprising the step of administering a pharmaceutical composition for preventing or treating Amyotrophic lateral sclerosis, which is an aspect of the present invention. It is omitted to avoid excessive complexity.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Amyotrophic Lateral Sclerosis.
- the present invention provides a method for preventing or treating Amyotrophic Lateral Sclerosis.
- composition or method of the present invention can prevent or treat atrophic lateral sclerosis through suppression of neural pole germination, growth and motor neuron growth and death in embryonic neurons.
- 1 is a neuropolar germination of ENC cells according to an embodiment of the present invention Indicates the effect of pCK-HGFX7.
- Figure 2 shows the effect of pCK-HGFX7 on the growth of ENC cells according to an embodiment of the present invention.
- Figure 3 shows the effect of pCK-HGFX7 on cell growth in NSC-34 cells according to an embodiment of the present invention.
- Figure 4 shows the effect of pCK-HGFX7 on cell death in NSC-34 cells according to an embodiment of the present invention.
- Figure 5 shows the effect of pCK-HGFX7 on the survival of NSC-34 cells in oxidative stress culture conditions according to an embodiment of the present invention.
- Figure 7 shows the effect of pCK-HGFX7 on cell growth in cells delivered with hSODl of the G93A mutant form according to an embodiment of the present invention.
- Figure 8 shows the effect of pCK-HGFX7 on the grip of the mouse in ALS mice according to an embodiment of the present invention.
- NSC 34 cells used in this experiment (Cel hit i on Biosystem, Vancouver,
- CA mouse derived motor neurons.
- NSC-34 cells are a cell line in which motor neurons and neuroblastoma cells derived from spinal nerves of an embryonic mouse are mixed and widely used for research on motor neurons. The cells were cultured at 37 ° C., 5% C0 2 , Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma) containing 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, USA) and antibiotics (Gibco BRL, USA). Incubated in-house. Cell culture media, reagents and serum were purchased from Gibco and Sigma aldr i ch.
- DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
- DNA transfection was used to produce supernatants expressing HGF proteins.
- Transfection uses the FuGene HD Transfection System (Promega, USA). Was used and performed according to the manufacturer's protocol. After seeding 293T cells with 1 ⁇ 10 6 cells, the following day pCK, pCK-HGF728 (pCK-cHGF from PCT / KR03 / 000548), pCK-HGF723 (pCK-dHGF from rcT / KR03 / 000548) and pCK-HGFX7 DNA 3 yg were each transfected. After incubation for 48 hours, each supernatant was harvested and filtered using a 0.22 ⁇ filter.
- HGF protein contained in each supernatant was measured using human HGF immunoassay. Each supernatant was again diluted to 1 yg / mL and used for the experiment.
- Recombinant human HGF protein used in human HGF immunoassay was purchased from R & D (R & D syst em, Inc., USA).
- NSC-34 cells were treated with pCK-HGFX7 and then evaluated for cell proliferation.
- Cells were cultured in culture medium containing 10% fetal bovine serum and then suspended using Dulbecco's Modified Eagle Medium containing fetal bovine serum for use in experiments.
- the cells were suspended in 6-well plates by suspending 3 ⁇ 10 4 cells and cells in 2 mL of a medium containing 1% serum.
- each supernatant obtained from 293T cells transfected with pCK-HGF728, pCK-HGF723, and pCK-HGFX7 was added to each well in a 6 well plate at a concentration of 50 ng / mL.
- the supernatant obtained by transfecting 293T cells with pCK vector was used as a control. After 48 hours of incubation, the medium of the 6-well plate was replaced.
- each supernatant obtained from 293T cells transfected with pCK-HGF728, pC -HGF723, pCK_HGFX7 was prepared with a concentration of HGF protein of 50 ng / After adding to n was incubated for 48 hours.
- the supernatant obtained by transfecting 293T cells with pCK vector was used as a control. Cultured cells were collected to count the cells. pCK vector was used as a control.
- the cells were cultured for 5 days, and compared to the experimental group treated with the pCK vector in the experimental group treated with the supernatant obtained from 293T cells transfected with pCK, pCK-HGF728, pCK-HGF723, and pCK-HGFX7.
- the experimental group treated with pCK-HGF728 or pCK-HGF723 induced about 20% cell proliferation
- an increase of about 48% was observed.
- NSC-34 cells were seeded in 6 well plates suspended in 3 ⁇ 10 4 with Dulbecco's Modified Eagle Medium containing 1% fetal bovine serum. After stabilizing cells for 2 hours after cell seeding, each supernatant obtained from 293T cells transfected with pCK-HGF728, pCK-HGF723, and pCK-HGFX7 was added at a concentration of 50 ng / mL of HGF protein. The supernatant obtained by transfecting 293T cells with pCK vector was used as a control. Cells were incubated for 5 days by replacing the medium and each supernatant at 2-3 days intervals.
- a quantitative polymerase chain reaction was carried out using nucleotides of sequence list 11th and 12th sequence for Bax gene and sequence 13th sequence and 14th sequence for Bcl-2 gene as primers.
- time PCR was performed. Real time PCR was performed by mixing 1 uL of template cDNA, 1 iiL of 10 pmole / uL primer, 12.5 yL of SYBR green PCR master mix (Life technologies, USA), and 9.5 tiL of sterile tertiary distilled water to make a total of 25 mixtures.
- NSC-34 cells were cultured in culture medium containing 10% fetal bovine serum and then suspended using Dulbecco's Modified Eagle Medium containing 1% fetal bovine serum for use in inhibition of apoptosis. 2 niL of medium containing 1% of serum was suspended to include 3 ⁇ 10 5 cells and seeded in 6 well plates.
- each supernatant obtained from 293T cells transfected with pCK-HGF728, pC -HGF723, and pCK-HGFX7 was treated with 30 ⁇ hydrogen peroxide solution selected in the previous experiment, and the concentration of HGF protein was 50 ng / mL. It was treated again.
- As an experimental control a culture medium obtained after transfection of the pCK vector was used. The cell death was observed while culturing the cells for 7 days. Seven days after cell seeding, cells were collected and counted.
- NSC-34 cells were seeded in 6 well plates suspended in 3 ⁇ 10 5 with Dulbecco's Modified Eagle Medium containing 1% fetal bovine serum. The next day, 30 ⁇ hydrogen peroxide solution was treated in each well, and each supernatant obtained from 293T cells transfected with pCK-HGF728, P CK-HGF723, and pCK-HGFX7 was treated so that the concentration of HGF protein was 50 ng / mL. Incubated daily. The supernatant obtained after transfection of the pCK vector was used as an experimental control.
- a quantitative polymerase chain reaction was carried out using nucleotides of sequence list 11th and 12th sequence for Bax gene and sequence 13th sequence and 14th sequence for Bcl-2 gene as primers.
- time PCR was performed. Real time PCR was performed on the template cDNA 1 uL, 10 pmole / uL.
- Primer 1 y L, SYBR green PCR master mix (Li technologies, USA) 12.5 ii L, sterile tertiary distilled water 9.5 were mixed to make a total of 25 mixtures, 50 ° C 2 minutes, 95 ° C 10 minutes.
- pCK-hSODl-wild type and pCK-hS0Dl_G93A were constructed.
- the following experiment was performed.
- NSG-34 cells were suspended in 96 well plates with 1 ⁇ 10 4 Dulbecco's Modified Eagle Medium containing 10% Fetal Bovine Serum and seeded in 96-well plates, the next day pCK, pCK—hSODl ⁇ wild type (WT) , P CK-hS0Dl-G93A mutant (G93A) was transfected using lipofectamine LTX reagent (Li fe technologies, USA) It was. Immediately before transfection, G93A transfected cells were treated with each supernatant obtained from 293T cells transfected with pCK-HGF728 and pCK-HGFX7 so that the concentration of HGF protein was 50 ng / mL. The supernatant obtained after transfection of the pCK vector was used as an experimental control.
- the cell growth was confirmed by treatment with XTT reagent.
- the wild-type hSODl-delivered cells showed similar cell growth with the pCK vector-delivered cells.
- the G93A mutant hSODl-transferred cells showed about 85.8% cell growth compared to the pCK-transmitted cells, which showed lower cell growth than the wild-type hSODl-delivered cells.
- the experimental group treated with PCK-HGFX7 showed about 92.9% of cell growth, showing an effect of inhibiting the decrease of cell growth by delivery of the G93A mutant hSODl (see FIG. 7).
- mice The 10-week-old ALS mice were divided into 4 mice per group, and were divided into Tg-pCK, Tg-pCK—HGF728 (pCK-cHGF from PCT / KR03 / 00548) and Tg-pCK-HGFX7 administration groups, respectively.
- Non-Tg individuals were selected as 6 negative controls (non-Tg).
- the mice of the three experimental groups, except the negative control group were administered intramuscularly.
- the left and right brachial triceps, the forearm muscle, the thigh muscles, the calf muscles were respectively administered, and the dose was administered 50 ⁇ at a concentration of 2 yg / ⁇ .
- the mesh grip test is a method of investigating the grip by placing the mouse over a steel grid with regular grids, flipping it over, and then time the mouse to hang on the steel grid. This is one of the most representative methods for assessing the muscle capacity of mice (Craw l ey JN, 2008).
- mice hanged upside down for an average time of about 9 minutes
- pG-treated mice hanged upside down for 30 seconds on average.
- Individuals who received the pCK-HGF728 plasmid showed a slightly higher mean time than the pCK group, with an average of 49 seconds.
- mice that received pCK-HGFX7 hung upside down longer than mice that received either pCK or pCK-HGF728, and the average time was 3 minutes (see FIG. 8). This shows that pCK-HGFX7 markedly improved the function of the muscles that are ascribed to the grip of ALS mice compared to pCK and pCK-HGF728.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Neurology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 HGF(Hepatocyte Growth Factor)의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 사용함으로써 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
Description
【명세서】
【발명의 명칭】
간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물
【기술분야】
본 특허출원은 2013 년 10 월 22 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2013-0126216 호 및 2014 년 10 월 22 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0143377 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
근위축성 측삭 경화증 (Amyot rophi c Lateral Sc l eros i s : ALS)은 운동 신경원에 발생하는 질환으로 1869년 프랑스의 의사 장마르틴 샤콧 (Jean- Mart in Chartcot )에 의해 최초로 보고되었다. 이후 1939년 미국의 유명한 야구 선수인 루게릭 (Lou Gehr ig)이 이 질환을 앓게 되면서 일반 사람들에게 알려졌으며， 이때부터 루게릭병 (Lou Gehr ig^ di sease)이라고도 불리게 되었다.
ALS의 예후는 임상적 특징， 전기 진단 테스트 및 증상과 관련된 다른 건강상태의 배제를 기반으로 한다. ALS와 관련된 몇몇의 유전자와 관련된 임상 실험에서 사용할 수 있는 분자 유전자 검사는, 유전적 유형 진단 및 유전상담에서 중요한 역할을 한다.
ALS는 상염색체 우성， 상 염색체 열성, 또는 X-연관 방법에 의해서 유전될 수 있다. 유전 상담 및 위험 평가는 특정 유전자 진단의 정확한 진단에 달려있다.
ALS 병의 진행을 지연시키는 약제로는 리루졸 (Ri luzol e)이 알려져
있다. 리루졸은 운동 신경세포를 파괴하는 원인의 하나로 여겨지는 과도한 글루타민산을 억제시킴으로써 ALS의 진행 속도를 늦출 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 리루졸의 임상적 효과는 ALS의 증상을 개선시키지는 못하며 ALS 환자가 기관절개술을 받지 않고 생존하는 기간 ( tracheostomy- free surviva l )을 늘리는데 있어서도 그 결과가 명확하지 않다. 이와 같이 ALS 환자에게 도움이 되는 리루졸의 진정한 임상적인 효과는 매우 제한적이고 모호한 것으로 보고된바 있다 (St ewart et a l , 2001 ) . 그럼에도 불구하고 이 같이 임상적 유용성이 모호한 리루졸 이외에 ALS에 대한 효과적인 예방 또는 치료제가 없는 실정이어서， ALS에 예방 또는 치료 효과를 나타내는 약물의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서의 발현백터들이 종래 공지되어 있다. 본 발명의 일실시예에서 사용된 pCK 백터에 대하여
PCT/KR99/000855에 자세히 기재되어 있다. 또한， PCT/KR03/000548에는 본 발명에서 사용된 pCK-HGFX7 재조합 백터를 포함하는 허혈성 질환 또는 간질환 치료 또는 예방용 조성물에 관하여 기재하고 있다. PCT/KR99/000855 및 PCT/KR03/000548의 모든 내용은 본 명세서에 참조로서 통합된다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】
본 발명자들은 근위축성 측삭 경화증을 예방 또는 치료할 수 있는 약물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 둘 이상의 간세포 성장인자 (Hepat ocyt e Growth Factor ; HGF) 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 ALS를 치료할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 근위축성 측삭 경화증 (Amyot rophi c
Lateral Scl eros i s) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophi c Lateral Sc leros i s)의 예방 또는 치료방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
[과쎄 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 HGF(Hepatocyte Growth
Factor )의 둘 이상의 . 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophi c Lateral Sc leros i s) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 근위축성 측삭 경화증을 예방 또는 치료할 수 있는 약물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 둘 이상의 간세포 성장인자 (Hepatocyte Growth Factor ; HGF) 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 ALS를 치료할 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 치료 전략은 크게 단백질 치료 및 유전자 치료 두 가지로 분류될 수 있다. 본 발명의 단백질 치료제 전략에 따르면， HGF의 두 종류 이상의 이형체 단백질을 이용한다. 한편, 본 발명의 유전자 치료제 전략에 따르면， HGF의 두 종류 이상의 이형체를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 이용한다. 두 종류 이상의 HGF 이형체-암호화 뉴클레오타이드 서열은 하나의 폴리뉴클레오타이드로 제공되거나 별도의 폴리뉴클레오타이드로 제공될 수 있다. 바람직하게는， HGF의 두 종류 이상의 HGF 이형체-암호화 뉴클레오타이드 서열은 하나의 폴리뉴클레오타이드로 제공된다. 이하, 본 발명에 대하여 상세히 기재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "HGF 이형체 ( i soform) 1 '는 모든 대립
유전자 변형체들 (var i ant s)을 포함하는， 동물에서 자연적으로 생성되는 (natural ly occurr ing) HGF 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HGF 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어， HGF 이형체는 HGF의 정상형 (normal form) 또는 야생형 (wi ld type) , 그리고 HGF의 다양한 변이체 (예컨대, 스플라이싱 변이체 및 결손 변이체)를 모두 포괄하는 의미를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서， 본 발명의 HGF의 둘 이상의 이형체들은 전장 HGF( ful l length HGF ; f lHGF)와 결손된 변이형 HGF(del eted var i ant HGF ; dHGF)를 포함한다. 전장 HGF 및 결손된 변이형 HGF를 모두 포함하는 조성물을 이용하는 경우， ALS를 더욱 효과적으로 예방 -또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " f lHGF"는 동물， 바람직하게는 포유동물， 보다 바람직하게는 인간 HGF의 아미노산 1-728 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "dHGF"는 동물, 바람직하게는 포유동물에서 HGF 유전자의 선택적 스풀라이싱에 의해 생성되는 HGF 단백질의 결손된 변형체， 보다 바람직하게는 전장 HGF 서열로부터 알파 사슬의 첫 번째 크링글 도메인에서 5 개의 아미노산 (F , L , P, S 및 S)이 결손된 723 개의 아미노산으로 이루어지는 인간 HGF 를 지칭한다 .
본 발명의 일 구체예에 있어서， 본 발명의 전장 HGF는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 포함하고， 본 발명의 결손된 변이형 HGF는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서， 본 발명의 HGF의 이형체들은 별도의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나， 또는 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화된다. 본 발명인 약학적 조성물은， HGF의 서로 다른 종류의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들이 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에는 상기 단일의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 HGF 이형체들의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열 (예컨대， 프로모터 또는 인핸서)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
HGF의 두 종류 이상의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우， 두 가지 방식으로 발현 카세트를 구축할 수 있다. 첫 번째 방식에 따르면, 이형체 각각에 대한 CDS( cod i ng sequence )에 발현 조절 서열을 연결하여 발현 카세트를 구축한다. 두 번째 방식에 따르면， "발현조절서열-제 1 이형체 CDS-IRES-제 2 이형체 CDS-전사종결 서열' '과 같은 방식으로 IRESG nt erna l r i bosoma l ent ry s i t e ) 또는 2k 펩타이드를 이용하여 발현 카세트를 구축한다. IRES 는 유전자의 번역이 IRES 서열에서 시작되도록 함으로써 2 개 이상의 관심 유전자가 동일한 구조물에서 발¾되도록 한다.
HGF의 두 종류 이상의 이형체들이 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우， 상기 두 종류 이상의 이형체들을 모두 암호화하고 있는 폴리뉴클레오타이드는 단일의 발현조절서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명에 있어서, HGF의 이형체들은 둘 이상의 서로 다른 종류의 이형체들, 예컨대 f lHGF 및 dHGF를 동시에 발현하는 하이브리드 (hybr i d ) HGF 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 하이브리드 HGF 유전자는 인간 HGF 의 엑손 1 내지 18 에 해당하는 cDNA , 및 상기 cDNA 의 액손 4 와 5 사이에 삽입된 인간 HGF 유전자의 인트론 4 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면， 상기 하이브리드 HGF 유전자는 서열목록 제 3 서열 내지 제 10 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 인트론 4 를 포함하는 하이브리드 HGF 유전자는 7113bp 길이이며， 서열목록 제 3 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다ᅳ 상기 하이브리드 HGF 유전자는 선택적으로 HGF cDNA 의 액손 4 와 5 사이에 인트론 4 의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 엑손 4 및 5 사이에 추가적으로 삽입되는 서열은 인간 HGF 유전자의 인트론 4， 서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 2247 번째까지의 뉴클레오타이드, 392 번째부터 727 번째까지의 뉴클레오타이드 2229 번째부터 5471 번째까지와 뉴클레오타이드, 5117 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드, 3167 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드， 4167 번째부터 5471 번째까지의
뉴클레오타이드 또는 이의 조합이다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 치료학적 뉴클레오타이드 서열의 액손 4 및 5 사이에 추가적으로 삽입되는 서열은 (i) 서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 2247 번째까지의 뉴클레오타이드와 2229 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드, (ii) 서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 2247 번째까지의 뉴클레오타이드와 5117 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드， (iii) 서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 2247 번째까지의 뉴클레오타이드와 3167 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드， (iv) 서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 2247 번째까지의 뉴클레오타이드와 4167 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드， (v) 서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 727 번째까지의 뉴클레오타이드와 2229 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드， (vi) 서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 727 번째까지의 뉴클레오타이드와 5117 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드， (vii) 서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 727 번째까지의 뉴클레오타이드와 3167 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드， 또는 (viii) 서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 727 번째까지의 뉴클레오타이드와 4167 번째부터 54기번째까지의 뉴클레오타이드이다.
상기 액손 4 및 5 사이에 추가적으로 삽입되는 서열에 따라 본 발명의 치료학적 뉴클레오타이드 서열을 정리하면 다음과 같다: (i) (액손 1 내지 엑손 4)- (서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 2247 번째까지의 뉴클레오타이드 -2229 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드) - (엑손 5 내지 액손 18); (ii) (엑손 1 내지 액손 4)- (서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 2247 번째까지의 뉴클레오타이드 -5117 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드) - (액손 5 내지 엑손 18); (iii) (액손 1 내지 엑손 4)- (서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 2247 번째까지의 뉴클레오타이드 -3167 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드) - (엑손 5 내지 엑손 18); (iv) (액손 1 내지 액손 4)- (서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 2247 번째까지의 뉴클레오타이드 -4167 번째부터 5471 번째까지와 뉴클레오타이드) - (액손 5 내지 액손 18); (V) (액손 1 내지 엑손 4)- (서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 727 번째까지의 뉴클레오타이드 -2229 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드) - (액손 5 내지 엑손 18); (vi)
(엑손 l 내지 엑손 4)- (서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 727 번째까지의 뉴클레오타이드 -5117 번째부터 5471 번째 까지의 뉴클레오타이드) - (엑손 5 내지 엑손 18); (vii) (액손 1 내지 액손 4)- (서열목록 제 3 서열의 392 번째 부터 727 번째까지의 뉴클레오타이드 -3167 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드) - (액손 5 내지 엑손 18); 및 (viii) (액손 1 내지 액손 4)- (서열목록 제 3 서열의 392 번째부터 727 번째까지의 뉴클레오타이드 -4167 번째부터 5471 번째까지의 뉴클레오타이드) - (엑손 5 내지 엑손 18).
본 명세서에서， 상기 인트론 4 의 단편을 포함하는 하이브리드 HGF 유전자는 "HGF-X" 로 명명되고， 상기 HGF— X에는 서열목록 제 4 서열 내지 제 10 서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 HGF-X2, HGF-X3, HGF-X4, HGF-X5 HGF-X6, HGF-X7 및 HGF— X8이 포함된다. 본 발명에 있어서 바람직하게는 HGF-X7이 이용된다. 본 발명에 있어서의 "HGF 이형체" ， "HGF-X" , 및 " HGF-X7" 등에 관하여서는 종래 PCT/KR03/000548에 보고한 바 있으며， 상기 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다. 본 발명에서 이용 가능한 HGF 이형체들의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 인간 HGF 이형체의 서열과 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 실질적인 동일성은， 야생형 인간 HGF 이형체의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고， 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에， 최소 80%의 상동성， 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성 , 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Ap l. Math. 2:482 (1981)； Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443 (1970)； Pearson and Li man, Methods in Mol . Biol . 24： 307-31 (1988)； Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988)； Higgins and Sharp, CAB I OS 5： 151-3 (1989)； Corpet et al. , Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988)； Huang et al . , Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992) 및 Pearson et al. , Meth. Mol . Biol. 24:307-31 (1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
(Altschul et al . , J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며， 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx 와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT 는 http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi .nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html 에서 확인할 수 있다ᅳ 본 명세서에서 사용되는 용어 "예방" 은 본 발명의 조성물의 투여로 근위축성 측삭 경화증을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료" 는 (a) 근위축성 측삭 경화증의 발전의 억제; (b) 근위축성 측삭 경화증의 경감; 또는 (c) 근위축성 측삭 경화증의 제거를 의미한다.
본 발명의 조성물은 신경세포에서의 신경극 발아 및 성장， 그리고 운동신경세포의 성장 및 사멸억제를 통하여 근위축성 측삭 경화증을 예방 또는 치료할 수 있도록 한다.
본 발명의 조성물은 유전자 치료 분야에서 통상적으로 공지된 다양한 운반 방법을 통하여 생체 내에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서， 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 DNACnaked DNA) 이거나 또는 유전자 운반체에 포함되어 있다. 유전자 운반체의 예는 플라스미드， 백터 및 바이러스 백터를 포함한다.
(i) 풀라스미드 (백터)
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 운반체로서 플라스미드 (백터)가 이용될 수 있다. 백터에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 발현 카세트 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 카세트에서 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된 "은 핵산 발현조절 서열 (예 : 프로모터 , 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이 )과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며， 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및 /또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서， 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는， 동물세포， 바람직하게는 포유동물 세포 , 보다 바람직하게는 인간 세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서， 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며， 예컨대, CMV (cyt omega lo virus) 프로모터， 아데노바이러스 후기 프로모터， 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터， SV40 프로모터， HSV 의 tk 프로모터， RSV 프로모터 , EF1 알파 프로모터， 메탈로티오닌 프로모터, 베타 -액틴 프로모터， 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터， 인간 림포특신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더 바람직하게는， 본 발명에서 이용되는 프로모터는 인간 CMV (hCMV)의 IE (immediately early) 유전자로부터 유래된 프로모터 또는 EF1 알파 프로모터이며， 가장 바람직하게는 hCMV IE 유전자의 프로모터 /인핸서 및 엑손 1 전체서열부터 엑손 2 의 ATG 개시코돈 직전까지를 포함하는 5'-UTR (untranslated region)이다.
본 발명에서 이용되는 발현 카세트는 폴리아네닐화 서열을 포함할 수 있으며， 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터 (Gimmi, E. R. , et al., Nucleic Acids Res. 17:6983—6998 (1989))， SV40 유래 폴리 아데닐화 서열 (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992))， HIV— 1 polyAC lasens, B. I. F. , et al . , Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), β—글로빈 polyA(Gil, A. , et al , Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104—2113 (1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 폴리뉴클레오타이드의 운반체로서 pCK, pCP, pVAXl 또는 pCY 백터를 이용할 수 있으며， 보다 바람직하게는 pCK 백터를 이용할 수 있다. 상기 pCK 백터는 W0 2000/040737에 상세히 개시되어 있으며， 상기 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
(ii) 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고， 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며， 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 백터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 백터를 구축하기 위하여， 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다 . 비리온을 생산하기 위하여， gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al. , Cell , 33：153-159 (1983)). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, LTR 및 ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면， Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며， 이 전사체는 바이러스로 패키징되고， 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors , " In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses , Rodriguez and Denhardt (eds . ) , Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2 세대 레트로바이러스 백터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara 등 (Science, 266:1373-1376 (1994))은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고， 여기에서 EP0 (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열도 이와 같은 2 세대 레트로바이러스 백터의 구축 전략에 따라 레트로바이러스에 탑재될 수 있다.
(iii) 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기， 조작의 편의성， 높은 타이터， 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 백터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200bp 의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며， 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스- 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주세포 유전자의
전사를 조절하는 단백질을 암호화한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 암호화한다.
현재 개발된 아데노바이러스 백터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편 , E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 백터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thi麵 appaya, B. et al., Cell, 31： 543-551 (1982)； 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073 (1989)). 따라서， 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및 /또는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 또한， 상기 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실 " 은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라， 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. 또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105% 까지 패킹할 수 있기 때문에， 약 2 kb 를 추가적으로 패키징 할 수 있다 (Ghosh— Choudhury et al. , EMBO J., 6:1733-1739 (1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42 개의 상이한 혈청형 및 A-F 의 서브그룹올 갖는다. 이 중에서， 서브그룹 C 에 속하는 아데노바이러스 타입 5 가 본 발명의 아데노바이러스 백터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5 에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며， 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서， 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 안전할 것으로 판단된다.
(iv) AAV 백터
아데노 -관련 바이러스 (MV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고， 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. MV 백터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 AAV 에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486 (1988)， Zhou et al . , Exp. Hematol. (NY), 21:928- 933 (1993)， Walsh et al, J. Clin. Invest . , 94:1440-1448 (1994) 및 Flotte et al. , Gene Therapy, 2:29-37 (1995)에 개시되어 있다. 최근에， MV 백터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I 을 실시하고 있다.
전형적으로， MV 바이러스는 두 개의 MV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988)； 및 Samulski et al., J. Virol. , 63:3822-3828 (1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 V. 코딩 서열을 포함하는 발현 #라스미드 (McCarty et al . , J. Virol. , 65:2936-2945 (1991))를 동시 형질전환 시켜 제조된다.
(ν) 다른 바이러스 백터
다른 바이러스 백터들도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 생체 내로 운반하는 데 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al . , Human Gene Therapy 10:649—657 (1999)； Ridgeway , "Mammal i an expression vectors , " In: Vectors： A survey of molecular cloning vectors and their uses . Rodriguez and Denhardt , eds . Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988)； Baichwal and Sugden , "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred ■genes," In: Kucher 1 apat i R, ed. Gene transfer . New York: Plenum Press , 117-148 (1986) 및 Coupar et al . , Gene, 68： 1-10 (1988))， 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest . 104(11) :R55-62 (1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber . , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415 (1995)) 로부터 유래된 백터들도 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
(vi) 리포좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982) 및 Nicolau et al . , Methods
Enzymol., 149:157-176 (1987)에 개시되어 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포 내로 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
본 발명에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 네이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드 (백터)에 탑재된 경우에는， 미세 주입법 (Capecchi, M.R.， Cell, 22:479 (1980)； 및 Harland 와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al. , Virology, 52:456 (1973)； 및 Chen 과 Okayama, Mol . Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al .ᅳ EMB0 J., 1:841 (1982)； 및 Tur-Kaspa et al. , Mol. Cell Biol. , 6 :716-718 (1986)), 리포좀 -매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al. , Gene, 10： 87 (1980)； Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982)； 및 Nicolau et al . , Methods Enzymol . , 149:157—176 (1987))， DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)) 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , 87:9568-9572 (1990)) 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 이입시킬 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 바이러스 백터에 기초하여 제작된 경우에는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 운반할 수 있다. 바이러스 백터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서， 본 발명의 유전자 운반체는 백터이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서， 본 발명의 백터는 플라스미드이고， 가장 바람직하게는 pCK 백터를 이용할 수 있다. pCK 백터를 이용한 HGF의 둘 이상의 이형체를 발현하는 단일 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 백터의 예는 PCK-HGFX7을 들 수 있으며， 이는 앞서 밝힌바와 같이 PCT/KR99/000855 및 PCT/KR03/000548에 자세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 덱스트로스, 수크로스, 솔비를ᅳ
만니를， 전분, 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴 , 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀를로스， 물, 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트 , 프로필히드록시벤조에이트， 활석 , 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington ' s Pharmaceut i cal Sciences ( 19th ed . , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고 예컨대 정맥내 투여， 복강내 투여, 피하 투여， 피내투여， 척수내 투여， 척수강내 투여， 뇌실내 투여， 뇌실질내 투여, 두개강내 투여， 근육내 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 가장 바람직하게는 근육내， 척수내, 척수강내， 뇌실내， 뇌실질내， 두개강내 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 주사로 제제화되어 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식, 환자의 연령， 체중， 성， 질병 증상의 정도， 투여 시간， 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하며， 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 HGF의 이형체들은 각각 1 내지 2500 mg의 투여량으로 투여되며， 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 각각 1 내지 2500 mg의 투여량으로 투여된다. 상기 HGF 의 이형체들 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 투여가 일회를 초과하여 반복될 때 투여량은 매회 동일하거나 다를 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질증의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제, 분말제， 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며， 분산제
또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다 . 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HGF(Hepatocyte Growth Factor)의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosis)의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 HGF의 둘 이상의 이형체들은 전장 HGF(full length HGF; flHGF) 및 결손된 변이형 HGFCdeleted variant HGF; dHGF)를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서， 본 발명의 전장 HGF는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 포함하고, 본 발명의 결손된 변이형 HGF는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명인 근위축성 측삭 경화증의 예방 또는 치료방법의 경우, 본 발명의 일 양태인 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로， 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosis)의 예방 또는 치료방법올 제공한다.
(c) 본 발명의 조성물 또는 방법을 이용하면 배아 신경세포에서의 신경극 발아, 성장 및 운동신경세포의 성장 및 사멸억제를 통하여 근위축성 측삭 경화증을 예방 또는 치료할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 ENC 세포의 신경극 발아에
는 pCK-HGFX7의 영향을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ENC 세포의 성장에 미치는 pCK- HGFX7의 영향을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 NSC-34 세포에서 pCK-HGFX7이 세 포 성장에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 NSC-34 세포에서 pCK-HGFX7이 세 포 사멸에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 산화적 스트레스 배양 조건에서 NSC-34 세포의 생존에 미치는 pCK-HGFX7의 효과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화적 스트레스 배양 조건에서
NSC-34 세포의 세포사멸에 미치는 pCK-HGFX7의 효과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 G93A 돌연변이 형태의 hSODl를 전달한 세포에서 pCK-HGFX7이 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 ALS 마우스에서 pCK-HGFX7이 마 우스의 악력에 미치는 영향을 나타낸다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 실시예 1 : 배아신경세포 (Embryonic neuronal cel l , ENC)의 성숙 (maturat ion)에서 pCK-HGFX7가 미치는 효능 확인
마우스의 배아 (embryo)로부터 대뇌피질 부분만을 취하여 단일 세포화 한 후 Ara-C 10 μ Μ을 배양 배지에 넣어 신경 세포만 배양하였다. ENC의 성숙에서 PCK-HGFX7이 미치는 영향을 확인하기 위해 2 X 104개의 세포를 파종하고 다음날 세포에 pCK— HGFX7을 트랜스펙션한 293F 세포 (L i fe technologi es , USA)에서 얻은 단백질 1.25 ng/mL을 처리하여 세포의
성숙에서 보이는 신경극 발아 (neur i te outgrowth) 정도를 확인하였다. 세포의 신경극 발아의 정도는 신경 세포 특이적으로 발현하는 튜불린 (tubul in) 단백질인 TUJ-1의 발현을 면역세포화학 ( i麵 unocytochemi stry)을 통해 확인하였다.
그 결과， 도 1에 도시된 바와 같이， pCK-HGFX7 처리군이 대조군인 pCK 처리군에 비해 유의하게 신경돌기의 길이를 증가시킴을 확인하였다. 실시예 2 : ENC의 maturat ion후 pCK-HGFX7이 세포 성장에 미치는 영향 확인
ENC의 성숙 후 pCK-HGFX7이 세포 성장에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 5 X 104개의 ENC를 파종하고 6일간 성숙 과정을 진행하였다. 6일 후 pCK-HGFX7을 트랜스펙션 한 293F 세포에서 얻은 단백질 1.25 ng/mL을 처리하여 pCK-HGFX7이 세포의 성장에 미치는 영향을 확인하였다. pCK- HGFX7을 처리한 3일 후 MTT 어세이를 수행하여 세포 성장을 측정하였다. 그 결과 도 2에 도시된 바와 같이 , pCK-HGFX7 처리군에서 대조군인 pCK 처리군에 비해 약 40%정도 세포 성장이 증가함을 확인하였다. 실시예 3: 마우스 운동 신경세포 (NSC-34)에서 pCK-HGFX7이 세포 성장 및 세포 사멸에 미치는 영향 확인
3-1. 세포주 및 세포 배양
본 실험에 사용된 NSC— 34 세포 (Cel hit i on Bi osystem , Vancouver ,
CA)는 마우스 유래 운동신경 세포이다. NSC-34 세포는 배아기 마우스의 척추 신경에서 유래한 운동 신경 세포와 신경모세포종 세포가 흔합된 세포주로 운동 신경과 관련한 연구에 널리 사용되는 세포주이다. 상기 세포는 37°C , 5% C02 조건에서 배양하였으며， 10% 소태아혈청 (Gibco BRL , USA) 및 항생물질 (Gibco BRL , USA)이 포함된 둘베코스 모디파이드 이글 미디엄 (DMEM , Sigma) 내에서 배양하였다. 세포배양 매질 , 시약 및 혈청은 Gibco와 Sigma aldr i ch사에서 구입하였다.
3-2. HGF 단백질을 발현하는 상등액 생산 및 정량
HGF 단백질을 발현하는 상등액을 생산하기 위해 DNA 트랜스펙션법을 이용하였다. 트랜스펙션은 FuGene HD 트랜스펙션 시스템 (Promega , USA)을
이용하였고 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 293T 세포를 1 X 106개로 파종 한 후, 다음 날 pCK , pCK-HGF728(PCT/KR03/000548의 pCK-cHGF) , pCK- HGF723(rcT/KR03/000548의 pCK-dHGF) 및 pCK-HGFX7 DNA 3 y g을 각각 트랜스펙션 하였다. 48시간 배양 후， 각각의 상등액을 모두 수확하여 0.22 μ ηι 필터를 이용하여 여과하였다. 인간 HGF 면역분석법을 이용하여 각 상등액에 포함된 HGF 단백질의 발현량을 측정하였다. 각 상등액을 다시 1 y g/mL로 희석하여 실험에 사용하였다. 인간 HGF 면역분석법에 사용된 재조합 인간 HGF 단백질은 R&D사 (R&D syst em , Inc . , USA)의 제품을 구입하여 사용하였다,
3-3. NSC-34 세포에서 pCK-HGFX7이 세포 성장에 미치는 영향
PCK-HGF 7이 운동 신경 세포의 성장에 미치는 효과를 확인하기 위하여， NSC-34 세포에 pCK-HGFX7을 처리한 뒤 세포의 증식 정도를 평가하였다. 세포는 10% 소태아 혈청을 포함하는 배양배지에서 배양한 뒤 실험에 사용하기 위해 \ 소태아 혈청을 포함하는 둘베코스 모디파이드 이글 미디엄을 이용하여 현탁하였다. 1%의 혈청을 포함하는 배지 2 mL에 3 X 104개와 세포가 포함되도록 현탁하여 6 웰 플레이트에 파종하였다. 파종 2시간 후 pCK-HGF728 , pCK-HGF723 , pCK-HGFX7을 트랜스펙션 한 293T 세포에서 얻은 각 상등액을 HGF 단백질의 농도가 50 ng/mL이 되도록 6 웰 플레이트에 웰 당 lOOuL씩 각각 첨가하였다. pCK 백터를 293T 세포에 트랜스펙션하여 얻은 상등액을 대조군으로 사용하였다. 48시간 배양 후 6웰 플레이트의 배지를 교체하여 주었다. 각각의 웰에 1%의 소태아혈청을 포함하는 배지 2 mL을 첨가한 후, pCK-HGF728 , pC -HGF723 , pCK_HGFX7을 트랜스펙션 한 293T 세포에서 얻은 각 상등액을 HGF 단백질의 농도가 50 ng/n 이 되도록 첨가하여 준 뒤 48시간 배양하였다. pCK 백터를 293T 세포에 트랜스펙션하여 얻은 상등액을 대조군으로 사용하였다. 배양한 세포를 수집하여 세포를 계수하였다. pCK 백터를 대조군으로 사용하였다. 세포를 파종 한 뒤 5일 동안 배양한 결과, pCK , pCK-HGF728 , pCK- HGF723 , pCK-HGFX7을 트랜스펙션 한 293T 세포에서 얻은 각 상등액을 처리한 실험군에서 pCK백터를 처리한 실험군과 비교하였을 때 pCK-HGF728 혹은 pCK-HGF723을 처리한 실험군은 약 20%정도 세포 증식을 유도하였으며,
PCK-HGFX7을 처리한 군은 약 48% 정도 세포성장 증가가 관찰되었다. 이 결과를 통해 pCK-HGFX7은 운동 신경 세포의 세포 성장을 PCK-HGP728 혹은 PCK-HGF723에 비해 현저하게 증가시킴을 확인할 수 있었다 (참조: 도 3). 3-4. NSC-34 세포에서 pCK-HGFX7이 세포 사멸에 미치는 영향
NSC-34 세포를 1% 소태아 혈청을 포함하는 둘베코스 모디파이드 이글 미디엄으로 3X104개로 현탁하여 6 웰 플레이트에 파종하였다. 세포 파종 후 2시간 동안 세포를 안정화 시킨 후 pCK-HGF728, pCK-HGF723, pCK-HGFX7을 트랜스펙션 한 293T 세포에서 얻은 각 상등액을 HGF 단백질의 농도가 50 ng/mL의 농도로 첨가하였다. pCK 백터를 293T 세포에 트랜스펙션하여 얻은 상등액을 대조군으로 사용하였다. 세포는 2-3일 간격으로 배지와 상기의 각 상등액을 교체하여 5일간 배양하였다.
5일간 배양한 세포로부터 트리졸 시약 (Life technologies, USA)를 이용하여 RNA를 추출하고， 추출한 RNA는 First Strand cDNA Kit (Roche, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 Bax 유전자에 대한 서열목록 제 11 서열과 제 12 서열 또는 Bcl-2 유전자에 대한 서열목록 제 13 서열과 제 14 서열의 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 실시간 정량 중합효소연쇄반웅 (real time PCR)을 수행하였다. Real time PCR은 주형 cDNA 1 uL, 10 pmole/uL 프라이머 각 1 iiL, SYBR green PCR master mix(Life technologies, USA) 12.5 yL, 멸균 삼차증류수 9.5 tiL를 흔합하여 총 25 의 흔합액을 만든 후, 50°C 2분, 951 10분 간 반웅한 후 95°C 15초， 60°C 1분 조건으로 40회 반복하여 반응하였다. 이때， 각 반응 값을 보정하기 위하여 하우스키핑 유전자로서 GAPDH에 대한 서열목록 제 15 서열과 제 16 서열의 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 동일하게 real time PCR을 수행하였다. 시험 결과， pCK 처리군에 비해 각 HGF 상등액을 처리한 그룹에서 아픕토시스 유도와 관련된 유전자인 Bax의 유전자 발현이 감소하였으며， 특히 pCK-HGFX7 처리군에서는 안티- 아픕토시스와 관련된 Bcl-2의 발현이 pCK 처리군에 비해 1.3배 증가하였다 (참조: 도 4a). 이 실험을 통해 pCK-HGFX7이 1% 소태아 혈청을 포함하는 배지 조건에서 대조군인 pCK 처리군에 비해 약 40%정도 세포 사멸을 억제함을 확인하였다 (참조: 도 4b).
실시예 4. 산화적 스트레스 배양 조건에서 NSC-34 세포의 생존에 미치는 PCK-HGFX7의 효과 확인
4-1. 산화적 스트레스에 의한 NSC-34 세포의 세포사멸을 유도하는 과산화수소수의 농도 선정
과산화수소수에 의해 유도되는 NSC— 34 세포의 세포 사멸에 pCK- HGFX7이 미치는 영향을 확인하기에 앞서, NSC-34 세포의 사멸을 확인하기에 적절한 세포의 파종 농도 및 세포사멸을 유도하는 과산화수소수의 농도를 선정하였다,
10% 소태아 혈청을 포함하는 배양 배지를 이용해 배양한 세포를 수집하여 1% 소태아혈청을 포함하는 둘베코스 모디파이드 이글 미디엄으로 현탁하여 세포를 계수하였다ᅳ 계수한 세포는 96 웰 플레이트에 1X104개의 세포 농도로 파종한 뒤 다음날 10， 20, 30, 50， 100 μΜ의 과산화수소수를 처리하였다. 과산화수소수를 처리하지 않은 웰은 인산완층용액을 넣어 주고 대조군으로 사용하였다. 24시간 후 ΧΤΤ 실험법 (Roche, USA)을 이용하여 세포 사멸 정도를 측정하였다. 대조군에 비해 과산화수소수를 농도별로 처리한 실험군에서 0, 10, 30, 70， 85%의 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 NSC-34 세포의 세포사멸을 유도하는 과산화수소수의 적절한 농도를 30 μΜ로 선정하였다.
또한, 6 웰 플레이트에서 세포사멸 실험을 수행하기 위해 1% 소태아 혈청을 포함하는 배지 2 mL에 1.5X 105, 3X105, 1X106개의 세포가 함유되도록 하여 6 웰 플레이트에 파종하였다. 다음 날 NSC-34 세포에 과산화수소수 30 uM을 처리 한 뒤 1， 4， 7일째에 세포 수를 확인하였다ᅳ 7일째에 세포수를 확인한 결과, 1.5X105개의 세포를 파종한 웰의 세포는 모두 사멸하여 실험에 선정할 수 없었으며， 1X106개의 세포를 파종한 웰은 세포 사멸이 유도되지 않았다. 이러한 실험 결과를 토대로 세포사멸을 유도하는 실험에 사용할 세포수와 과산화수소수의 농도를 3X105개와 30 μΜ로 선정하였다. 4-2. 산화적 스트레스 배양 조건에서 NSC-34 세포의 생존에 미치는 pCK- HGFX7의 효과 확인
NSC-34 세포는 10% 소태아 혈청을 포함하는 배양배지에서 배양한 뒤 세포사멸 억제실험에 사용하기 위해 1% 소태아 혈청을 포함하는 둘베코스 모디파이드 이글 미디엄을 이용하여 현탁하였다. 1 %의 혈청을 포함하는 배지 2 niL에 3X105개의 세포가 포함되도록 현탁하여 6 웰 플레이트에 파종하였다. 다음날 이전 실험에서 선정된 과산화수소수 30 μΜ을 각 웰에 처리한 뒤 pCK-HGF728, pC -HGF723, pCK-HGFX7을 트랜스펙션 한 293T 세포에서 얻은 각 상등액을 HGF 단백질의 농도가 50 ng/mL이 되도톡 처리하였다. 실험 대조군으로 pCK 백터를 트랜스펙션 후 얻은 배양 배지를 이용하였다. 7일 동안 세포를 배양하면서 세포사멸 정도를 관찰하였다. 세포 파종 7일 후 세포를 수집하여 세포를 계수하였다. 세포 계수 결과, pCK, pCK-HGF728, pCK-HGF723을 처리한 실험군의 세포는 처음 파종한 세포수에 비해 약 60-70%의 세포만 생존하였으나, pCK-HGFX7 처리한 NSC- 34 세포는 약 92%정도의 생존을 보여 다른 실험물질 처리군에 비해 세포 사멸이 억제되는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 HGFX7 단백질이 과산화수소수에 의한 산화적 스트레스로 유도되는 운동 신경의 세포사멸을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다 (참조: 도 5).
4-3. 산화적 스트레스 배양 조건에서 NSC-34 세포의 세포사멸에 미치는 PCK-HGFX7의 효과 확인
NSC-34 세포를 1% 소태아 혈청을 포함하는 둘베코스 모디파이드 이글 미디엄으로 3X105개로 현탁하여 6 웰 플레이트에 파종하였다. 다음날 30 μΜ 과산화수소수를 각 웰에 처리한 뒤 pCK-HGF728, PCK-HGF723, pCK- HGFX7을 트랜스펙션 한 293T 세포에서 얻은 각 상등액을 HGF 단백질의 농도가 50 ng/mL이 되도록 처리하여 7일간 배양하였다. 실험 대조군으로 pCK 백터를 트랜스펙션 후 얻은 상등액을 이용하였다.
7일간 배양한 세포로부터 트리졸 시약을 이용하여 RNA를 추출하고， 추출한 RNA는 First Strand cDNA Kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 Bax 유전자에 대한 서열목록 제 11 서열과 제 12 서열 또는 Bcl-2 유전자에 대한 서열목록 제 13 서열과 제 14 서열의 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 실시간 정량 중합효소연쇄반웅 (real time PCR)을 수행하였다. Real time PCR은 주형 cDNA 1 uL, 10 pmole/uL
프라이머 각 1 y L, SYBR green PCR master mix(Li fe technologies , USA) 12.5 ii L, 멸균 삼차증류수 9.5 를 흔합하여 총 25 의 흔합액을 만든 후， 50 °C 2분， 95 °C 10분 간 반웅한 후 95 °C 15초， 60°C 1분 조건으로 40회 반복하여 반응하였다. 이때， 각 반웅 값을 보정하기 위하여 하우스키핑 유전자로서 GAPDH에 대한 서열목록 제 15 서열과 게 16 서열의 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 동일하게 real t ime PCR을 수행하였다. 시험 결과， pCK 처리군에 비해 각 HGF 상등액을 처리한 그룹에서 아픕토시스 유도와 관련된 유전자인 Bax의 유전자 발현은 감소하고， 안티- 아픕토시스와 관련된 Bcl-2의 발현은 증가함을 확인하였다. 특히 pCK-HGFX7 처리군의 경우， pCK 처리군에 비해 약 70%정도 Bax 유전자의 발현을 감소시키는 결과를 나타내었으며 (참조: 도 6a) , Bax/Bcl-2의 비율 (rat io)을 약 75%정도 감소시켜 세포 사멸 억제 효과가 뛰어난 것으로 확인되었다 (참조: 도 6b) . 실시예 5. G93A 돌연변이 (mutant) 형태의 hSODl를 전달한 세포에서 pCK- HGFX7이 세포 성장에 미치는 영향 확인
ALS의 원인 중 하나로 알려진 SODKSuperoxide di smutase 1)의 G93A 돌연변이 형을 이용한 in vi tro 시험법이 많은 연구자들을 통해 개발되었다. 특히 운동 신경 세포의 연구에서 널리 사용하는 NSC-34 세포에 hSODl의 G93A 돌연변이 형을 전달하였을 때 세포의 사멸을 유도할 수 있다는 보고가 알려져 있다 (Cheema et al . ,2005) . 따라서 본 시험에서는 human S0D1 야생형 유전자 (wi ldtype ; WT) (NM— 000454)와 human S0D1 유전자의 93번째 아미노산 서열을 글리신에서 알라닌으로 변경한 유전자를 각각 pCK 백터의 BamHI 부위 (si te)에 삽입하여 pCK-hSODl-야생형과 pCK-hS0Dl_G93A를 제작하였다. 제작한 플라스미드들을 이용하여 hS0Dl-G93A를 전달한 NSC- 34세포에서 pCK-HGFX7의 효능을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.
NSG-34 세포를 10% 소태아 혈청을 포함하는 둘베코스 모디파이드 이글 미디엄으로 1 X 104개로 현탁하여 96 웰 플레이트에 파종한 후 다음 날 pCK, pCK—hSODlᅳ야생형 (wi ldtype ; WT)， PCK-hS0Dl-G93A 돌연변이 (G93A)를 리포펙타민 LTX 시약 (Li fe technologies , USA)을 이용하여 트렌스펙션
하였다. 트렌스펙션 직전에 G93A 트렌스펙션 세포들은 pCK-HGF728 , pCK- HGFX7을 트랜스펙션 한 293T 세포에서 얻은 각 상등액을 HGF 단백질의 농도가 50 ng/mL이 되도록 처리하였다. 실험 대조군으로 pCK 백터를 트랜스펙션 후 얻은 상등액을 이용하였다.
3일간 배양한 후 XTT 시약을 처리하여 세포 성장을 확인하였다. 그 결과, 야생형 hSODl을 전달한 세포는 pCK 백터를 전달한 세포와 세포 성장이 유사하게 나타나는 것을 확인하였다. 그러나 G93A 돌연변이 형태의 hSODl올 전달한 세포는 pCK를 전달한 세포에 비해 약 85.8%의 세포 성장을 나타내어， 야생형 hSODl을 전달한 세포에 비해 세포 성장이 저하됨올 보였다. 하지만 PCK-HGFX7을 처리한 실험군은 약 92.9%의 세포 성장을 나타내어 G93A 돌연변이 형태의 hSODl의 전달에 의한 세포 성장의 저하를 억제하는 효과를 나타냈다 (참조: 도 7) .
[유전자 서열]
제 11 서열 ： GGC AGA CAG TGA CCA TCT TT
제 12 서열 ： AGT GGA CCT GAG GTT TAT TG
제 13 서열 ： CCA TCA ATC AAA GCC AAG CA
제 14 서열 ： AGC CTT CAC GCA AGT TCA GG
제 15 서열 ： CCA TCA CTG CCA CTC AGA AGA C
제 16 서열 ： TCA TAC TTG GCA GGT TTC TCC 실시예 6. 인간 돌연변이 S0D1 G93A Tg 마우스 (이하 ALS 마우스)의 악력 (grip strength)에 pCK-HGFX7이 미치는 효능 평가
ALS의 원인 중의 하나로 SODKSuperoxide di smut ase 1)의 돌연변이가 밝혀짐에 따라 이 유전자를 이용한 ALS 마우스 모델이 개발되었고， 현재 전세계의 ALS 연구자들이 이 동물모델을 이용하여 다양한 연구를 수행하고 있다 (Weydt P et a l . , 2003) . 이 중에서 널리 쓰이는 B65JL- Tg(S0Dl*G93A) lGur/J (002726)를 선정하여 실험에 사용하였다. ALS 마우스의 제작은 우정 BSC(Korea)에 의뢰하였으며, genotyping 과정을 거쳐 돌연변이 형태의 S0D1 유전자를 발현하는지 확인한 후 본 실험에 사용하였다.
10주령의 ALS 마우스는 군 당 4마리씩으로 나눠 각각 Tg-pCK ， Tg- pCK— HGF728(PCT/KR03/00548의 pCK-cHGF) , Tg-pCK-HGFX7 투여군으로 분리하였다. Tg가 아닌 개체는 6마리를 골라내어 음성 대조군으로 설정하였다 (이하 non-Tg) . 2주 후 음성 대조군을 제외한 상기 3가지 실험군의 마우스에 해당 플라스미드를 근육주사로 투여하였다. 이때 투여는 좌우의 상완 삼두근， 전경골근, 대퇴직근， 장딴지근에 각각 투여하였고， 용량은 2 y g/ μ ΐ의 농도로 50 μ ΐ씩 투여하였다. 투여 2주 후 ( 14주령)에 행동실험을 통해 각 마우스의 악력을 조사하였다. 행동실험의 경우 mesh 악력 테스트를 진행하였다. Mesh 악력 테스트는 마우스를 일정한 간격의 격자무늬가 있는 철제 망에 을려놓고 이를 뒤집은 후에 마우스가 철제 망에 매달려 버티는 시간을 재어 악력을 조사하는 방법이다. 이 방법은 마우스의 근육 능력을 평가할 수 있는 가장 대표적인 방법 중 하나이다 (Craw l ey JN , 2008) .
실험 결과 non-Tg 마우스의 경우 평균 9분 가량의 시간 동안 뒤집힌 채로 버티는 데 반해 Tg의 개체들 중 pCK를 투여 받은 마우스의 경우 평균 30초 정도 뒤집은 채로 매달려 있었다. pCK-HGF728 플라스미드를 투여 받은 개체의 경우에는 pCK 투여군보다 소폭 상승한 평균 시간을 보였는데 그 시간은 평균 49초였다. 이에 반해 pCK-HGFX7을 투여 받은 마우스의 경우 pCK나 pCK-HGF728을 투여 받은 마우스에 비해 더 오랫동안 뒤집은 채로 매달려 있었고, 그 평균 시간은 3분이었다 (참조: 도 8 ) . 이는 pCK-HGFX7가 pCK 및 pCK-HGF728에 비해 ALS 마우스의 악력으로 위시되는 근육의 기능을 현저하게 향상시켰음을 보여준다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라세 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims
【청구항 1】
HGF(Hepatocyte Growth Factor)의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 전장 HGF(full length HGF; flHGF) 및 결손된 변이형 HGFCdeleted variant HGF; dHGF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3】
제 2 항에 있어서, 상기 전장 HGF는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 포함하고 상기 결손된 변이형 HGF는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 별도의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5】 ■
제 1 항에 있어서， 상기 HGF의 둘 이.상의 이형체들은 단일의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 6】
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 DNMnaked DNA) 이거나 또는 유전자 운반체에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물 .
【청구항 7】
제 6 항에 있어서， 상기 유전자 운반체는 백터인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8】
제 7 항에 있어서， 상기 백터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9】
제 8 항에 있어서， 상기 플라스미드는 pCK인 것을 특징으 ¾ 하는 조성물.
【청구항 10】
HGF(Hepatocyte Growth Factor)의 둘 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물올 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 근위축성 측삭
경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosi s)의 예방 또는 치료방법 .
【청구항 11】
제 10 항에 있어서， 상기 HGF의 둘 이상의 이형체들은 전장 HGF ful l length HGF; f lHGF) 및 결손된 변이형 HGF(deleted var i ant HGF ; dHGF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 12]
제 11 항에 있어서， 상기 전장 HGF는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 포함하고， 상기 결손된 변이형 HGF는 서열목록 제 2 서열의
아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201480058075.3A CN105682676B (zh) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | 利用肝细胞生长因子的两种以上的异构体的肌萎缩性侧索硬化症预防或治疗用组合物 |
| JP2016546724A JP6240337B2 (ja) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | 肝細胞増殖因子の２つ以上のアイソフォームを利用した筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療用組成物 |
| RU2016119116A RU2639582C2 (ru) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов |
| ES14856385T ES2773305T3 (es) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Composición para la prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica que utiliza dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos |
| CA2926607A CA2926607C (en) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Composition for preventing or treating amyotrophic lateral sclerosis using two or more isoforms of hepatocyte growth factor |
| SG11201602452SA SG11201602452SA (en) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Composition for preventing or treating amyotrophic lateral sclerosis using two or more isoforms of hepatocyte growth factor |
| MX2016005006A MX2016005006A (es) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Composicion para prevenir a tratar la esclerosis lateral amiotrofica usando dos o mas isoformas del factor de crecimiento de hepatocito. |
| BR112016008267A BR112016008267A2 (pt) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Composição para prevenir ou tratar esclerose lateral amiotrófica usando duas ou mais isoformas de fator de crescimento de hepatócito |
| US15/030,999 US10639351B2 (en) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Method for treating amyotrophic lateral sclerosis with a polynucleotide encoding two or more isoforms of hepatocyte growth factor |
| AU2014337870A AU2014337870B2 (en) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Composition for preventing or treating amyotrophic lateral sclerosis using two or more isoforms of hepatocyte growth factor |
| EP14856385.1A EP3061457B1 (en) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Composition for preventing or treating amyotrophic lateral sclerosis using two or more isoforms of hepatocyte growth factor |
| HK16107864.0A HK1219873A1 (zh) | 2013-10-22 | 2016-07-06 | 利用肝細胞生長因子的兩種以上的異構體的肌萎縮性側索硬化症預防或治療用組合物 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130126216 | 2013-10-22 | ||
| KR10-2013-0126216 | 2013-10-22 | ||
| KR10-2014-0143377 | 2014-10-22 | ||
| KR1020140143377A KR101779775B1 (ko) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2015060650A2 true WO2015060650A2 (ko) | 2015-04-30 |
| WO2015060650A3 WO2015060650A3 (ko) | 2015-06-11 |
Family
ID=52993719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2014/009971 WO2015060650A2 (ko) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2015060650A2 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
| WO2000040737A1 (en) | 1998-12-31 | 2000-07-13 | Viromed Limited | High efficiency mammalian gene expression vectors that contain exogenous promoter and entire 5' untranslated region in the upstream from start codon for inherent gene as transcription regulatory site |
-
2014
- 2014-10-22 WO PCT/KR2014/009971 patent/WO2015060650A2/ko active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
| WO2000040737A1 (en) | 1998-12-31 | 2000-07-13 | Viromed Limited | High efficiency mammalian gene expression vectors that contain exogenous promoter and entire 5' untranslated region in the upstream from start codon for inherent gene as transcription regulatory site |
Non-Patent Citations (47)
| Title |
|---|
| "Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed.", 1995, . |
| ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 10 |
| BATT, D. B; G. G. CARMICHAEL, MOL. CELL. BIOL, vol. 15, 1995, pages 4783 - 4790 |
| CAPECCHI, M.R., CELL, vol. 22, 1980, pages 479 |
| CHAMBER R. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI USA, vol. 92, 1995, pages 1411 - 1415 |
| CHEN; OKAYAMA, MOL. CELL. BIOL, vol. 7, 1987, pages 2745 - 2752 |
| COLE, C. N.; T. P. STACY, MOL. CELL. BIOL., vol. 5, 1985, pages 2104 - 2113 |
| CORPET ET AL., NUC. ACIDS RES, vol. 16, 1988, pages 10881 - 90 |
| COUPAR ET AL., GENE, vol. 68, 1988, pages 1 - 10 |
| FLOTTE ET AL., GENE THERAPY, vol. 2, 1995, pages 29 - 37 |
| GHOSH-CHOUDHURY ET AL., EMBO J., vol. 6, 1987, pages 1733 - 1739 |
| GIL, A. ET AL., CELL, vol. 49, 1987, pages 399 - 406 |
| GIMMI, E. R. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 17, 1989, pages 6983 - 6998 |
| GOPAL, MOL. CELL, vol. 5, 1985, pages 1188 - 1190 |
| GRAHAM, F.L. ET AL., VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456 |
| HARLAND; WEINTRAUB, J. CELL BIOL., vol. 101, 1985, pages 1094 - 1099 |
| HIGGINS; SHARP, CABIOS, vol. 5, 1989, pages 151 - 3 |
| HIGGINS; SHARP, GENE, vol. 73, 1988, pages 237 - 44 |
| HUANG ET AL., COMP. APPL. BIOSCI, vol. 8, 1992, pages 155 - 65 |
| KLASENS, B. I. F. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 26, 1998, pages 1870 - 1876 |
| KUCHERLAPATI R: "Gene transfer", 1986, PLENUM PRESS, article BAICHWAL; SUGDEN: "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes", pages: 117 - 148 |
| LAFACE ET AL., VIOLOGY, vol. 162, 1988, pages 483486 |
| MANN ET AL., CELL, vol. 33, 1983, pages 153 - 159 |
| MCCARTY ET AL., J. VIROL., vol. 65, 1991, pages 2936 - 2945 |
| MCLAUGHLIN ET AL., J. VIROL., vol. 62, 1988, pages 1963 - 1973 |
| NEEDLEMAN; WUNSCH, J. MOL. BIO., vol. 48, 1970, pages 443 |
| NEUMANN, E. ET AL., EMBO J., vol. 1, 1982, pages 841 |
| NICOLAU ET AL., METHODS ENZYMOL., vol. 149, 1987, pages 157 - 176 |
| NICOLAU; SENE, BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 721, 1982, pages 185 - 190 |
| PEARSON ET AL., METH. MOL. BIOL, vol. 24, 1994, pages 307 - 31 |
| PEARSON; LIPMAN, METHODS IN MOL. BIOL, vol. 24, 1988, pages 307 - 31 |
| PUHLMANN M. ET AL., HUMAN GENE THERAPY, vol. 10, 1999, pages 649 - 657 |
| RIORDAN, J. R. ET AL., SCIENCE, vol. 245, 1989, pages 1066 - 1073 |
| RODRIGUEZ AND DENHARDT: "Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses", 1988, BUTTERWORTH, article NICOLAS; RUBINSTEIN: "Retroviral vectors", pages: 494 - 513 |
| RODRIGUEZ AND DENHARDT: "Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses.", 1988, BUTTERWORTH, article RIDGEWAY: "Mammalian expression vectors", pages: 467 - 492 |
| SAMULSKI ET AL., J. VIROL., vol. 63, 1989, pages 3822 - 3828 |
| SCHEK, N ET AL., MOL. CELL BIOL, vol. 12, 1992, pages 5386 - 5393 |
| SCIENCE, vol. 266, 1994, pages 1373 - 1376 |
| See also references of EP3061457A4 |
| SMITH; WATERMAN, ADV. APPL. MATH, vol. 2, 1981, pages 482 |
| THIMMAPPAYA, B. ET AL., CELL, vol. 31, 1982, pages 543 - 551 |
| TUR-KASPA ET AL., MOL. CELL BIOL., vol. 6, 1986, pages 716 - 718 |
| WALSH ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 94, 1994, pages 1440 - 1448 |
| WANG G. ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 104, no. 11, 1999, pages R55 - 62 |
| WONG, T.K. ET AL., GENE, vol. 10, 1980, pages 87 |
| YANG ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 87, 1990, pages 9568 - 9572 |
| ZHOU ET AL., EXP. HEMATOL. (NY, vol. 21, 1993, pages 928 - 933 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015060650A3 (ko) | 2015-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2024020346A (ja) | 筋疾患の治療のための改変ａａｖカプシドポリペプチド | |
| Gilbert et al. | Prolonged dystrophin expression and functional correction of mdx mouse muscle following gene transfer with a helper-dependent (gutted) adenovirus-encoding murine dystrophin | |
| KR101860452B1 (ko) | 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 | |
| Ponnazhagan et al. | Suppression of human alpha-globin gene expression mediated by the recombinant adeno-associated virus 2-based antisense vectors. | |
| KR20210131370A (ko) | Grn-연관 성인-발병 신경퇴화의 치료를 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 | |
| BR112020007765A2 (pt) | composições de vírus adeno-associados para restaurar a função do gene hbb e métodos de uso das mesmas | |
| WO2008101216A2 (en) | Gamma satellite insulator sequences and their use in preventing gene silencing | |
| WO2013065913A1 (ko) | Ｈｇｆ 이형체를 이용한 당뇨병성 신경병증의 유전자 치료 | |
| CA3090226A1 (en) | Adeno-associated virus compositions for restoring pah gene function and methods of use thereof | |
| WO2015060650A2 (ko) | 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 | |
| JP2019070001A (ja) | 肝細胞増殖因子及びストローマ細胞由来因子１αを用いた末梢動脈疾患の予防または治療用組成物 | |
| Takeda et al. | Gene therapy for muscular dystrophies: current status and future prospects | |
| JP7244547B2 (ja) | Ｆ８遺伝子機能を回復させるためのアデノ随伴ウイルス組成物及びその使用の方法 | |
| EP3924376A1 (en) | Optimized lentiviral vector compromising minimal enhancer elements for stem cell gene therapy of hemoglobinopathies | |
| WO1999036559A1 (en) | Viral vectors expressing self-polymerizing neuronal intermediate filaments and their use | |
| Lim et al. | Gene therapy approaches to ataxias | |
| TW202229321A (zh) | 核酸構築體、病毒載體及病毒顆粒 | |
| WO2023173125A2 (en) | VECTORS COMBINING ANTI-SICKLING BETA-AS3-GLOBIN WITH ANTI BCEL11A shRNAMIR TO TREAT BETA-HEMOGLOBINOPATHIES | |
| KR20240027748A (ko) | Rbm20 돌연변이의 게놈 편집 | |
| KR20230038503A (ko) | 샤르코-마리-투스 질환의 치료에 유용한 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 14856385 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A2 |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2926607 Country of ref document: CA Ref document number: 2016546724 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: MX/A/2016/005006 Country of ref document: MX |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 15030999 Country of ref document: US |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| REG | Reference to national code |
Ref country code: BR Ref legal event code: B01A Ref document number: 112016008267 Country of ref document: BR |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2014337870 Country of ref document: AU Date of ref document: 20141022 Kind code of ref document: A |
|
| REEP | Request for entry into the european phase |
Ref document number: 2014856385 Country of ref document: EP |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2014856385 Country of ref document: EP |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2016119116 Country of ref document: RU Kind code of ref document: A |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 112016008267 Country of ref document: BR Kind code of ref document: A2 Effective date: 20160414 |