ES2773305T3 - Composición para la prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica que utiliza dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de prevención o el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, conteniendo la composición, como principio activo, dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o un polinucleótido que codifique las isoformas, en la que las dos o más isoformas del HGF incluyen el HGF de longitud completa (flHGF), que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y la variante de eliminación del HGF (dHGF), que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición para la prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica que utiliza dos o más isotermas del factor de crecimiento de hepatocitos
Campo técnico
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Coreana N.°: 10-2013-0126216 presentada en la Oficina de Propiedad Intelectual Coreana el 22 de octubre de 2013 y la Solicitud de Patente Coreana N.°: 10-2014 0143377 presentada en la Oficina de Propiedad Intelectual Coreana el 22 de octubre de 2014.
La presente invención se refiere a una composición, que contiene, como principio activo, dos o más isotermas del factor de crecimiento de hepatocitos o un polinucleótido que codifique las isoformas, para la prevención o el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica.
Técnica antecedente
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA), que es una enfermedad de la neurona motora, fue presentada por primera vez en 1869 por el médico francés Jean-Martin Chartcot. La ELA fue conocida por la población desde que Lou Gehrig, un famoso jugador de baloncesto de los Estados Unidos sufrió esta enfermedad en 1939, y desde este momento, la ELA se denominó enfermedad de Lou Gehrig.
El pronóstico de la ELA se basa en las características clínicas, los ensayos de diagnóstico con electricidad, y la exclusión de otros estados de salud asociados con los síntomas. El ensayo genético molecular, que se puede utilizar en los ensayos clínicos asociados con algunos genes implicados en la ELA tiene un papel importante en la determinación del genotipo y terapia genética.
La ELA puede heredarse de una manera autosómica dominante, autosómica recesiva, o unida a X. La terapia genética y evaluación del riesgo depende del diagnóstico preciso de genes particulares.
Se conoce el Riluzol como un fármaco utilizado para retrasar el progreso de la ELA. Se sabe que el riluzol puede disminuir la velocidad de progreso de la ELA inhibiendo el exceso de ácido glutámico que se considera una de las causas de la destrucción de la neurona motora. Sin embargo, los efectos clínicos del Riluzol no alivian los síntomas de la ELA, y los resultados del mismo tampoco son obvios en la extensión de la supervivencia libre de traqueotomía de los pacientes de ELA a los que no se les practica la traqueotomía. Como se ha descrito anteriormente, se ha publicado que los efectos clínicos genuinos del Riluzol, que son útiles para los pacientes con ELA, están muy restringidos y opacos (Stewart y col, 2001). No obstante, no existe un agente preventivo o terapéutico que sea eficaz para la ELA, excluyendo el Riluzol, que tenga una eficacia clínica aunque sea ambigua, y por lo tanto, es necesario el desarrollo de fármacos que presenten efectos de prevención o tratamiento de la ELA.
Por otra parte, se conocen vectores de expresión como sistema de suministro genético para la terapia genética en la técnica convencional. Las descripciones detalladas del vector pCK que se utiliza en un ejemplo de la presente invención se desvelan en el documento PCT/KR1999/000855. Además, el documento PCT/k R2003/000548 desvela una composición que contiene un vector recombinante pCK-HGFX7 que se utiliza en la presente invención, para el tratamiento o prevención de enfermedades isquémicas o trastornos hepáticos.
Los documentos WO 02/22162 A1 y US 2003/0176347 A1 desvelan el uso del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y/o sus genes como remedio en el tratamiento de la ELA.
Los documentos WO 2013/037521 y WO 2013/037520 desvelan un factor de crecimiento de hepatocitos modificado (HGF)-1K1-polipéptido y su uso en el tratamiento de varias enfermedades.
A lo largo de toda la memoria descriptiva, se hace referencia a muchos papeles y documentos de patente y su cita está representada.
Descripción detallada de la invención
Problema técnico
Los presentes inventores han investigado y se han esforzado en desarrollar fármacos que sean capaces de la prevención o el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Como resultado, los presentes inventores establecieron que la ELA se puede tratar utilizando una composición de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, conteniendo dicha composición, como principio activo, dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o un polinucleótido que codifique las isoformas, y así han completado la presente invención.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica.
También se desvela un procedimiento para la prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica.
Otros fines y ventajas de la presente divulgación serán más obvios con la siguiente descripción detallada de la invención, reivindicaciones, y dibujos.
Solución técnica
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, conteniendo la composición, como principio activo, dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o un polinucleótido que codifique las isoformas, de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
Los presentes inventores han investigado y se han esforzado en desarrollar fármacos que sean capaces de la prevención o el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica. Como resultado, los presentes inventores establecieron que la ELA podría tratarse utilizando una composición que contenga, como principio activo, dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o un polinucleótido que codifique las isoformas, de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
La estrategia terapéutica de la presente invención puede clasificarse sobre todo en dos tipos: terapia proteica y terapia genética. De acuerdo con la estrategia con el agente terapéutico proteico de la presente invención, se utilizan dos proteínas isoméricas del HGF. Por otra parte, de acuerdo con la estrategia con el agente terapéutico genético de la presente invención, se utiliza al menos una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más tipos de isómeros del HGF. Se puede proporcionar una secuencia de polinucleótido que codifique dos o más isoformas de1HGF mediante un polinucleótido o polinucleótidos diferentes. Preferentemente, la secuencia de polinucleótido que codifica las dos o más isoformas de HGF se proporciona mediante un polinucleótido.
De aquí en adelante, la presente invención se describirá en detalle.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "isoforma HGF (o isoforma de HGF)" se refiere a un HGF polipeptídico que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del HGF de origen natural en un animal, incluyendo todas las variantes alélicas. Por ejemplo, la isoforma del HGF significa que incluye todas las formas normales o de tipo silvestre de1HGF y distintas variantes de1HGF (por ejemplo, variantes por corte y empalme y variantes de eliminación).
En una realización de la presente invención, las dos o más isoformas de HGF incluyen e1HGF de longitud completa (flHGF) y variante de eliminación del HGF (dHGF). El uso de una composición que contenga tanto la variante de1HGF de longitud completa como la variante del HGF de eliminación pueden prevenir o tratar la ELA muy eficazmente.
Como se utiliza en el presente documento, el término "flHGF" se refiere a una secuencia de aminoácidos 1-728 del HGF proteico de un animal, preferentemente un mamífero, y más preferentemente un ser humano.
Como se utiliza en el presente documento, el término "dHGF" se refiere a una variante de eliminación de1HGF proteico producido por un corte y empalme alternativo del gen del HGF de un animal, preferentemente un mamífero, y más preferentemente se refiere a un HGF humano que consiste en 723 aminoácidos, con una eliminación de cinco aminoácidos (F, L, P, S, y S) en el primer dominio kringle de la cadena alfa de la secuencia de1HGF de longitud completa.
De acuerdo con la presente invención, el HGF de longitud completa de la presente invención incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y la variante de eliminación del HGF de la presente invención incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En una realización de la presente invención, las isoformas del HGF de la presente invención son codificadas por secuencias de nucleótidos diferentes o por una única secuencia de polinucleótido. En el presente documento, la composición farmacéutica de la presente invención incluye dos o más polinucleótidos cuando los diferentes tipos de isoformas del HGF son codificados por polinucleótidos diferentes, e incluye al menos un polinucleótido que incluye el único polinucleótido cuando los diferentes tipos de isoformas del HGF son codificados por la única secuencia de polinucleótido. El polinucleótido de la presente invención puede estar unido operativamente al menos a una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor o un amplificador) que regula la expresión de las isoformas de1HGF.
Cuando los dos o más tipos de isoformas del HGF están codificadas por polinucleótidos diferentes, se puede construir un casete de expresión de dos maneras. De acuerdo con una primera manera, el casete de expresión se construye uniendo una secuencia reguladora de la expresión a una secuencia codificante (CDS) de cada isoforma. De acuerdo con una segunda manera, el casete de expresión se construye utilizando un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y péptidos 2A, tal como "secuencia reguladora de la expresión - primera CDS de isómero - IRES - segunda CDS de isómero - secuencia de terminación de la transcripción". El IRES permite que se inicie la traducción genética en la secuencia IRES, expresando de esta manera dos o más genes de interés en la misma construcción.
Cuando se codifican dos o más tipos de isoformas del HGF por un único polinucleótido, el polinucleótido que codifica los dos tipos de isoformas está unido operativamente a una única secuencia reguladora de la expresión.
En la presente invención, las isotermas del HGF puede codificarse por un gen de HGF híbrido que exprese simultáneamente dos o más tipos diferentes de isotermas del HGF, por ejemplo el flHGF y el dHGF.
De acuerdo con una realización preferible de la presente invención, el gen de HGF híbrido incluye los exones 1 a 18 del ADNc que se corresponde con el HGF humano y el intrón 4 del gen del HGF humano o un fragmento del mismo, que se inserta entre el exón 4 y el exón 5 del ADNc.
De acuerdo con una realización más preferible de la presente invención, el gen híbrido de1HGF incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10.
El gen híbrido de HGF que incluye el intrón 4 tiene 7113 pb de longitud e incluye las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. El gen híbrido de HGF puede incluir selectivamente un fragmento del intrón 4 entre el exón 4 y el exón 5 del ADNc del HGF.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la secuencia insertada adicionalmente entre el exón 4 y el exón 5 incluye: el intrón 4 del gen HGF humano, los nucleótidos 392-2247, nucleótidos 392-727, nucleótidos 2229-5471, nucleótidos 5117-5471, nucleótidos 3167-5471, nucleótidos 4167-5471, o una combinación de los mismos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.
Más preferentemente, la secuencia insertada adicionalmente entre el exón 4 y el exón 5 de la secuencia de nucleótidos terapéutica que se utiliza en la presente invención es (i) los nucleótidos 392-2247 y los nucleótidos 2229-5471 de SEQ ID NO: 3; (ii) los nucleótidos 392-2247 y los nucleótidos 5117-5471 de SEQ ID NO: 3; (iii) los nucleótidos 392-2247 y los nucleótidos 3167-5471 de SEQ ID NO: 3; (iv) los nucleótidos 392-2247 y los nucleótidos 4167-5471 de SEQ iD NO: 3; (v) los nucleótidos 392-727 y los nucleótidos 2229-5471 de SEQ ID No : 3; (vi) los nucleótidos 392-727 y los nucleótidos 5117-5471 de SEQ ID No : 3; (vii) los nucleótidos 392-727 y los nucleótidos 3167-5471 de SEQ ID n O: 3; (viii) los nucleótidos 392-727 y los nucleótidos 4167-5471 de SEQ ID NO: 3.
La secuencia de nucleótidos terapéutica de la presente invención de acuerdo con la secuencia insertada adicionalmente entre el exón 4 y el exón 5 se resume de la siguiente manera: (i) (exón 1 a exón 4)-(nucleótidos 392 2247 - nucleótidos 2297-5471 de SEQ ID NO: 3) (exón 5 a exón 18); (ii) (exón 1 a exón 4)-(nucleótidos 392-2247 -nucleótidos 5117-5471 de SEQ ID NO: 3)-(exón 5 a exón 18); (iii) (exón 1 a exón 4)-(nucleótidos 392-2247 - nucleótidos 392-5471 de SEQ ID NO: 3)-(exón 5 a exón 18); (iv) (exón 1 a exón 4)-(nucleótidos 392-2247 - nucleótidos 4167-5471 de SEQ ID NO: 3)-(exón 5 a exón 18); (v) (exón 1 a exón 4)-(nucleótidos 392-727 - nucleótidos 2229-5471 de SEQ ID NO: 3)-(exón 5 a exón 18); (vi) (exón 1 a exón 4)-(nucleótidos 392-727 - nucleótidos 5117-5471 de SEQ ID NO: 3)-(exón 5 a exón 18); (vii) (exón 1 a exón 4)-(nucleótidos 392-727 - nucleótidos 3167-5471 de SEQ ID NO: 3)-(exón 5 a exón 18); (viii) (exón 1 a exón 4)-(nucleótidos 392-727 - nucleótidos 4167-5471 de SEQ ID NO: 3)-(exón 5 a exón 18).
En el presente documento, el gen híbrido de HGF que incluye el fragmento de intrón 4 se denomina "HGF-X", y el HGF-X incluye el HGF-X2, HGF-X3, HGF-X4, HGF-X5, HGF-X6, HGF-X7, y HGF-X8, que tienen las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 a 10. En la presente invención se utiliza preferentemente e1HGF-X7. La "isoterma del HGF", "HGF-X", y "HGF-X7" de la presente invención se ha publicado en el documento PCT/KR2003/000548.
Las secuencias de aminoácidos o nucleótidos de las isoformas del HGF que se pueden utilizar en la presente invención, se considera que incluyen secuencias de aminoácidos o nucleótidos que tienen una identidad sustancial con las secuencias de las isoformas del HGF humano de tipo silvestre. La expresión "identidad sustancial" significa que, cuando la secuencia de aminoácidos o nucleótidos de la isoforma del HGF humano de tipo silvestre y otra secuencia de nucleótidos se alinean para que se correspondan entre ellas tanto como sea posible y las secuencias alineadas se analizan utilizando un algoritmo que se utiliza normalmente en la técnica, la secuencia de aminoácidos o nucleótidos de la isoforma del HGF humano de tipo silvestre muestra al menos un 80 % de identidad, preferentemente al menos un 90 % de identidad, y más preferentemente al menos un 95 % de identidad. Los procedimientos para la comparación de secuencias se conocen bien en la técnica. Se desvelan distintos procedimientos y algoritmos para el alineamiento en Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); Needleman y Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson y Lipman, Methods in Mol. Biol. 24:307-31 (1988); Higgins y Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet y col., Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang y col., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992); y Pearson y col., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994). La herramienta de búsqueda del alineamiento local básico del Nc BI (BLAST) (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)) está disponible a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y, en internet, se puede utilizar en conexión con programas de análisis de secuencia, tales como blastp, blasm, blastx, tbastn y tblastx. Se puede acceder a BLSAT a través de http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/BLAST/. El procedim iento de identidad de secuencia que utiliza dicho programa puede confirmarse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
Como se utiliza en el presente documento, el término "prevención" se refiere a todas las acciones para suprimir la esclerosis lateral amiotrófica o retrasar el progreso de la esclerosis lateral amiotrófica mediante la administración de la composición de la presente invención.
El término "tratamiento" que se utiliza en el presente documento se refiere a (a) la supresión del progreso de la esclerosis lateral amiotrófica, (b) el alivio de la esclerosis lateral amiotrófica, o (c) la eliminación de la esclerosis lateral
amiotrófica.
La composición de la presente invención puede prevenir o tratar la esclerosis lateral amiotrófica mediante el brote y crecimiento de neuritas así como el crecimiento y anti-apoptosis de neuronas motoras.
La composición de la presente invención se puede aplicar in vivo mediante distintos procedimientos de suministro que se conocen de manera convencional en el campo de la terapia genética.
En una realización de la presente invención, el polinucleótido de la presente invención es un ADN desnudo o está contenido en un sistema de suministro genético. Ejemplos del sistema de suministro genético incluyen un plásmido un vector, y un vector vírico.
(i) Plásmido (vector)
Un plásmido (vector) se puede utilizar como un sistema de suministro que suministra el polinucleótido de la presente invención. El polinucleótido incluido en el vector se encuentra preferentemente en un casete de expresión apropiado. Preferentemente, el polinucleótido está unido operativamente a un promotor en el casete de expresión.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "unido operativamente" se refiere a una unión funcional entre una secuencia reguladora de la expresión del ácido nucleico (por ejemplo, un promotor, una secuencia de señal, o una matriz en el sitio de unión de un factor de regulación de la transcripción) y otra secuencia de ácido nucleico, y mediante la unión, la secuencia reguladora regula la transcripción y/o la traducción de otra secuencia de ácido nucleico.
En la presente invención, la unión del promotor a la secuencia de polinucleótido es la que pueda regular la transcripción de la secuencia de nucleótidos mediante la operación en células animales, preferentemente células de mamífero, y más preferentemente células humanas, e incluye, por ejemplo, promotores derivados de virus de mamífero y promotores derivados de genomas celulares de mamífero. Ejemplos de los mismos pueden incluir el promotor de citomegalovirus (CMV), promotor tardío de adenovirus, promotor 7.5K de virus vaccinia, promotor SV40, promotor tk de HSV, promotor de RSV, promotor alfa EF1, promotor de metalotioneína, promotor de beta actina, promotor genético de IL-2 humana, promotor del gen del IFN humano, promotor del gen de la IL-4 humana, promotor del gen de linfotoxina humana, y promotor genético de GM-CSF humano, pero no se limita a estos. Más preferentemente, el promotor que se utiliza en la presente invención es un promotor derivado del gen inmediatamente temprano (IE) del CMV humano (hCMV), o un promotor EF1 alfa, y más preferentemente, una región 5' no traducida (UTR) que incluye el promotor/amplificadory la secuencia completa del exón 1 inmediatamente hacia el codón de inicio ATG del exón 2 del gen IE del hCMV.
El casete de expresión que se utiliza en la presente invención puede incluir una secuencia de poliadenilación, por ejemplo, un terminador de la hormona de crecimiento bovina (Gimmi, E. R., y col., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), secuencia de poliadenilación derivada del SV40 (Schek, N, y col., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., y col., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), p-globina poliA (Gil, A., y col, Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK poliA (Cole, C. N. yT. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) o poli A del virus del polioma (Batt, D. B y G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995)), pero no se limita a estos.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, se puede utilizar un vector pCK, pCP, pVAX1, o pCY como sistema de suministro del polinucleótido, y más preferentemente, se puede utilizar el vector pCK. El vector pCK se desvela con detalle en el documento WO 2000/040737.
(ii) Retrovirus
Los retrovirus pueden introducir un gen del mismo en el genoma de un huésped para suministrar un montón de materiales genéticos exóticos, y tiene un amplio espectro de células que puede infectar, así que la mayoría de los retrovirus se utilizan como vector de suministro genético.
Con el fin de construir el vector retrovírico, la secuencia de polinucleótido de la presente invención se inserta en el genoma retrovírico pero no la secuencia retrovírica, produciendo de esta manera virus deficientes en replicación. Para la producción de viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol, y env pero no tienen secuencias de repeticiones terminales largas (LTR) ni secuencia ^ (Mann y col., Cell, 33:153-159 (1983)). Cuando el plásmido recombinante que contiene la secuencia de polinucleótido de la presente invención, la secuencia LTR y la secuencia ^ se introduce en la línea celular, la secuencia ^ permite la producción de transcripciones ARN del plásmido recombinante, y estas transcripciones se empaquetan con virus, que se descargan en el medio (Nicolas y Rubinstein "Retroviral vectors," en: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez y Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). Los medios que contienen los retrovirus recombinantes se recolectan y concentran y entonces se utilizan como sistema de suministro genético.
Se ha publicado el suministro genético que utiliza vectores retrovíricos de segunda generación. Kasahara y col., fabricaron una variante del virus de leucemia murina de moloney, y produjo una proteína quimérica que tenía nuevas características de unión insertando la secuencia de eritropoyetina (EPO) en el sitio de envoltura de la misma (Science, 266:1373-1376 (1994)). La secuencia de polinucleótido de la presente invención también se puede introducir en el
retrovirus de acuerdo con la estrategia de construcción del vector retrovírico de segunda generación.
(iii) Adenovirus
El adenovirus se ha empleado habitualmente como un vector de suministro genético debido al genoma de tamaño medio, facilidad de modificación, título alto, amplio intervalo de células diana, y alta infectividad. Ambos extremos del genoma contienen repeticiones terminales invertidas (ITR) de 100-200 pb, que son elementos cis necesarios para la replicación y empaquetamiento de ADN. La región E1 (E1A, y E1B) dl genoma codifica proteínas responsables para la regulación de la transcripción del genoma vírico y la transcripción de los genes de la célula huésped. La región E2 (E2A, y E2B) codifica las proteínas implicadas en la replicación del ADN vírico.
Entre los vectores desarrollados hasta ahora, se utilizan habitualmente los adenovirus deficientes en replicación que tienen eliminada la región E1. Por otra parte, la región E3 eliminada en los vectores adenovíricos normales puede proporcionar un sitio de inserción para genes exóticos (Thimmappaya, B. y col., Cell, 31:543-551 (1982); y Riordan, J. R. y col., Science, 245:1066-1073 (1989)). Por lo tanto, la secuencia de polinucleótido de la presente invención se inserta preferentemente en la región E1 eliminada (región E1A y/o región E1B) o la región E3 eliminada. Además, la secuencia de polinucleótido también se puede insertar en la región E4 eliminada. En el presente documento, el término "eliminación" que se utiliza con referencia a secuencias del genoma vírico engloba la eliminación completa de la secuencia correspondiente así como la eliminación parcial de la misma. Además, el adenovirus puede empaquetar aproximadamente un 105% del genoma de tipo silvestre, proporcionando la capacidad de aproximadamente 2 kb adicionales de ADN (Ghosh-Choudhury y col., EMBO J., 6:1733-1739 (1987)). Por lo tanto, las secuencias exóticas anteriores que se insertan en el adenovirus se pueden acoplar con el genoma adenovírico.
El adenovirus puede ser de cualquiera de los 42 serotipos diferentes y los subgrupos A-F. De estos, el adenovirus tipo 5 que pertenece al subgrupo C es el material de partida más preferible para la obtención del vector adenovírico de la presente invención. La información bioquímica y genética sobre los adenovirus tipo 5 es bien conocida. Los genes exóticos suministrados mediante el adenovirus se replican de la misma manera que en el episoma, y por lo tanto tiene baja genotoxicidad para las células huésped. Por lo tanto, se determina que la terapia genética que utiliza el sistema de suministro genético adenovírico es segura.
(iv) vector AAV
Los virus adenoasociados (AAV) son capaces de infectar células que no se dividen y tienen la capacidad de infectar distintos tipos de células y por lo tanto son adecuados como sistema de suministro genético de la presente invención. Las descripciones detalladas para el uso y preparación del vector AAV se desvelan en las Pat. de EE. UU. N.° 5.139.941 y 4.797.368.
Los resultados de la investigación de los AAV como sistema de suministro genético se desvelan en LaFace y col, Virology, 162:483486 (1988), Zhou y col., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993), WELAh y col, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994), y Flotte y col., Gene Therapy, 2:29-37 (1995). Recientemente, el vector AAV se ha aprobado para ensayos con seres humanos en Fase I para el tratamiento de la fibrosis quística.
Normalmente, el virus AAV se fabrica co-transfectando un plásmido que contiene una secuencia genética diana flanqueada por dos repeticiones terminales del AAV (McLaughlin y col., J. Virol., 62:1963-1973 (1988); y Samulski y col., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)) y un plásmido de expresión que contienen una secuencia codificante del AAV de tipo silvestre sin repeticiones terminales (McCarty y col., J. Virol., 65:2936-2945 (1991)).
(v) Otros vectores víricos
Se pueden utilizar otros vectores víricos para el suministro de la secuencia de polinucleótido de la presente invención en el cuerpo biológico. También se pueden utilizar vectores derivados de virus, tales como los virus vaccinia (Puhlmann M. y col., Human Gene Therapy 10:649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," en: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez y Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal y Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) y Coupar y col., Gene, 68:1-10 (1988)), lentivirus (Wang G. y col., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62 (1999)), o herpes simplex virus (Chamber R., y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415 (1995)) como sistema de suministro capaz de suministrar el polinucleótido en las células.
(vi) Liposomas
Los liposomas se forman espontáneamente por los fosfolípidos suspendidos en un medio acuoso. El suministro de moléculas de ADN exótico mediado por liposomas ha sido muy satisfactorio como se describe en Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982) y Nicolau y col., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987). Los liposomas que atrapan la secuencia de polinucleótido de la presente invención suministran la secuencia de polinucleótido en las células interactuando con las células mediante mecanismos tales como la endocitosis, adsorción en las superficies celulares y fusión con las membranas plasmáticas celulares.
En los casos en los que la secuencia de polinucleótido de la presente invención se introduce en una molécula de ADN recombinante desnuda o un plásmido (vector), la secuencia de polinucleótido se puede introducir en las células mediante microinyección (Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980); y Harland & Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), precipitación en fosfato cálcico (Graham, F.L. y col., Virology, 52:456 (1973); y Chen & Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), electroporación (Neumann, E. y col., EMBO J., 1:841 (1982); y Tur-Kaspa y col., Mol. Cell Biol., 6:716-718 (1986)), transfección mediada por liposomas (Wong, T.K. y col., Gene, 10:87 (1980); Nicolau & Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982); y Nicolau y col., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), DEAE-dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)) y bombardeo genético (Yang y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)).
Cuando la secuencia de polinucleótido de la presente invención se construye basándose en el vector vírico, la secuencia de polinucleótido puede suministrarse en las células mediante distintos procedimientos de infección vírica conocidos en la técnica. La infección de las células huésped utilizando vectores víricos se describen en los documentos citados que se mencionan anteriormente.
En una realización preferida de la presente invención, el sistema de suministro genético de la presente invención es un vector.
En una realización de la presente invención, el vector de la presente invención es un plásmido y más preferentemente se puede utilizar el vector pCK. Un ejemplo del vector recombinante que incluye un único polinucleótido que expresa dos o más isómeros del HGF que utiliza un vector pCK puede ser pCK-HGFX7, cuyo contenido se describe con detalle en los documentos PCT/KR1999/000855 y PCT/KR2003/000548, como se ha descrito anteriormente.
La composición de la presente invención puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable contenido en la composición de la presente invención se utiliza convencionalmente para la formulación, y los ejemplos del mismo pueden incluir, pero no se limitan a, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato cálcico, alginato, gelatina, silicato cálcico, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metil celulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato magnésico, y aceite mineral. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener adicionalmente un lubricante, un agente humectante, un agente edulcorante, un agente saborizante, un emulsionante, un agente de suspensión, un conservante, y similares, además del ingrediente anterior. Los vehículos y los agentes farmacéuticamente aceptables adecuados se describen con detalle en Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).
Preferentemente, la composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar por vía parenteral, y por ejemplo, se puede emplear la administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intraespinal, administración intratecal, administración intraventricular, administración parenquimática, administración intracraneal, administración intramuscular, o administración local. Más preferentemente, la composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar por vía intramuscular, espinal, intratecal, intraventricular, parequimática, o intracraneal.
La composición farmacéutica de la presente invención se puede formular y administrar como una inyección. La dosis apropiada de la composición farmacéutica de la presente invención varía dependiendo de factores tales como el procedimiento de formulación, la manera de administración, la edad del paciente, el peso corporal, género, y gravedad de la enfermedad, momento de la administración, vía de administración, velocidad de excreción y sensibilidad de la respuesta, y el experto habituado puede juzgar y prescribir fácilmente la dosis eficaz para el tratamiento o prevención deseados.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, las isoformas de1HGF de la presente invención se administran a una dosis de 1 |jg a 2.500 mg para cada uno, y el polinucleótido que codifica las isoformas se administra a una dosis de 1 jg a 2.500 mg. Cuando las isoformas del HGF o el polinucleótido que codifica las isoformas se administra de manera repetida una vez o más, la dosis puede ser igual o diferente en cada administración.
La composición farmacéutica de la presente invención se formula utilizando un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptables, de acuerdo con el procedimiento que sea llevado a cabo fácilmente por un experto habituado en la técnica a la que pertenece la presente invención, y se puede preparar la composición farmacéutica en una forma de dosificación unitaria o se puede insertar en un envase multidosis. Aquí, la forma de dosificación puede ser una solución en un medio oleoso o acuoso, una suspensión, una emulsión, un extracto, un polvo, gránulos, un comprimido, una cápsula, y puede contener adicionalmente un dispersante o un estabilizante.
También se desvela un procedimiento para la prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, incluyendo el procedimiento la administración a un mamífero de una composición que contenga como principio activo, dos o más isómeros del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o un polinucleótido que codifique los isómeros.
En una realización de la presente invención, las dos o más isoformas de HGF de la presente invención incluyen el HGF de longitud completa (flHGF) y variante de eliminación del HGF (dHGF).
De acuerdo con la presente invención, el HGF de longitud completa de la presente invención incluye la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y la variante de eliminación del HGF de la presente invención incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Como el procedimiento de prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica incluye la etapa de administración de la composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, que es un aspecto de la presente invención, las descripciones que se solapan entre ellas se han omitido para evitar una complicación excesiva de la memoria descriptiva debido a descripciones repetitivas del mismo.
Efectos ventajosos
Las características y ventajas de la presente invención se resumen de la siguiente manera:
(a) La presente invención proporciona: una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento para la prevención o el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica.
(b) También se desvela, pero no forma parte de la presente invención, un procedimiento para la prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica.
(c) La composición de la presente invención se puede utilizar para prevenir o tratar la esclerosis lateral amiotrófica mediante el brote y crecimiento de células neurales embrionarias así como el crecimiento y anti-apoptosis de las neuronas motoras.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 representa un efecto del pCK-HGFX7 sobre el brote de neuritas en células ENC de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 2 representa un efecto del pCK-HGFX7 sobre el crecimiento de las células ENC de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 3 representa un efecto del pCK-HGFX7 sobre el crecimiento de las células NSC-34 de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 4 representa un efecto del pCK-HGFX7 sobre la apoptosis de las células NSC-34 de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 5 representa un efecto del pCK-HGFX7 sobre la supervivencia de las células NSC-34 en condiciones de cultivo oxidativo de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 6 representa un efecto del pCK-HGFX7 sobre la apoptosis de las células NSC-34 en condiciones de cultivo oxidativo de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 7 representa un efecto del pCK-HGFX7 sobre el crecimiento de las células a las que se suministró hSOD1 con la mutación G93A de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 8 representa un efecto del pCK-HGFX7 sobre la fuerza de sujeción de los ratones ELA de acuerdo con una realización de la presente invención.
Modo para llevar a cabo la invención
De aquí en adelante, la presente invención se describirá en detalle con referencia a ejemplos. Estos ejemplos son solamente para ilustrar la presente invención más específicamente, y será evidente para los expertos en la técnica que el ámbito de la presente invención no está limitado por estos ejemplos, sino por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1: Verificación del efecto de pCK-HGFX7 sobre la maduración de las células neuronales embrionarias (ENC)
Solo se tomó una parte de la corteza cerebral del embrión de ratón para convertirla en células únicas, y luego se añadieron 10 pM de Ara-C 10 al medio de cultivo para cultivar solo las células neuronales. Con el fin de verificar el efecto de pCK-HGFX7 sobre la maduración de las ENC, se sembraron 2 x 104 células, y al día siguiente, se trataron las células con 1,25 ng/ml de la proteína obtenida de las células 293F (Life Technologies, USA) transfectadas con pCK-HGFX7, verificando de esta manera el grado de brote de neuritas que se muestra en la maduración celular. El grado de brote de neuritas se confirmó mediante inmunocitohistoquímcia sobre la expresión de TUJ-1 que es una tubulina proteica que se expresa específicamente en las células neuronales.
Los resultados confirmaron que, como se muestra en la FIG. 1, la longitud de la neurita aumentaba significativamente en el grupo de tratamiento con pCK-HGFX7 más que en el grupo de tratamiento pCK de control.
Ejemplo 2: Verificación el efecto de pCK-HGFX7 sobre el crecimiento celular después de la maduración de las ENC
Se verificó el efecto de pCK-HGFX7 sobre el crecimiento celular después de la maduración de las ENC. Para este fin, se sembraron 5 x 104 ENC, seguido por un periodo de maduración de 6 días. Después de los 6 días, se trataron las células con 1,25 ng/ml de la proteína obtenida de células 293F transfectadas con el pCK-HGFX7, verificando de esta manera el efecto del pCK-HGFX7 sobre el crecimiento celular. Después de 3 días del tratamiento con el pCK-HGFX7,
se llevó a cabo un ensayo MTT para medir el crecimiento celular.
Los resultados confirmaron que, como se muestra en la FIG. 2, la longitud de la neurita aumentaba significativamente aproximadamente un 40 % en el grupo de tratamiento con pCK-HGFX7 más que en el grupo de tratamiento pCK de control.
Ejemplo 3: Verificación del efecto del pCK-HGFX7 sobre el crecimiento celular y la apoptosis en las células neuronales motoras del ratón (NSC-34)
3-1. Línea celular y cultivo celular
Las células NSC-34 (Cellution Biosystem, Vancouver, CA) que se utilizan en el presente ensayo son células neuronales motoras derivadas del ratón. Las células NSC-34 se corresponden con una línea celular en la que las células neuronales motoras derivadas del nervio espinal del embrión de ratón se mezclan con células de neuroblastoma, y se utilizan ampliamente en estudios asociados con el nervio motor. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un material antibiótico (Gibco BRL, USA) en condiciones de 37 °C y un 5 % CO2. El medio, reactivo y suero para el cultivo celular se adquirieron en Gibco y Sigma Aldrich.
3-2. Producción y cuantificación del HGF proteico expresado en el sobrenadante
Se utilizó una transfección de ADN para producir el HGF proteico expresado en el sobrenadante. La transfección se llevó a cabo utilizando un sistema de transfección FuGene HD (Promega, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se sembraron las células 293T a 1 x 106 células, y al día siguiente se transfectaron las células con 3 |jg de ADN pCK, pCK-HGF728 (pCK-cHGF en el documento PCT/KR03/000548), pCK-HGF723 (pCK-dHGF en el documento PCT/KR03/000548), y pCK-HGFX7. Después del cultivo durante 48 h, se recolectaron los respectivos sobrenadantes y luego se filtraron a través de un filtro de 0,22 jm . El nivel de expresión de1HGF proteico contenido en cada sobrenadante se midió utilizando el inmunoensayo de HGF humano. Cada sobrenadante se diluyó de nuevo a 1 jg/m l para su uso en los ensayos. El HGF proteico recombinante humano utilizado en el inmunoensayo de HGF humano se adquirió en R&D (R&D Systems, Inc., MSP, USA) para su uso.
3-3. Efecto del pCK-HGFX7 humano sobre el crecimiento celular en células NSC-34
Con el fin de verificar el efecto del pCK-HGFX7 sobre el crecimiento de células neuronales motoras, las células NSC-34 se trataron con pCK-HGFX7 y luego se evaluó el grado de proliferación celular. Las células se cultivaron en medio de cultivo suplementado con un 1o % de suero bovino fetal, y luego, para su uso en los ensayos, el cultivo se suspendió utilizando medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) suplementado con un 1 % de suero bovino fetal. Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos de manera que estaban contenidas 3 x 104 de las células en 2 ml de un medio que contenía un 1 % de suero. Después de 2 h de la siembra, se añadieron los sobrenadantes respectivos obtenidos de las células 293T transfectadas con pCK-HGF728, pCK-HGF723, y pCK-HGFX7 a una placa de 6 pocillos a 100 ul por pocillo de manera que la concentración del HGF proteico era de 50 ng/ml. El sobrenadante obtenido mediante transfección de las células 293T con el vector pCK se utilizó como control. Después de 48 h de cultivo, el medio de la placa de 6 pocillos se intercambió. Después, se añadieron 2 ml de un medio que contenía un 1 % de suero bovino en cada pocillo, se añadió cada uno de los sobrenadantes obtenidos de las células 293T transfectadas con pCK-HGF728, pCK-HGF723, y pCK-HGFX7 de manera que la concentración de1HGF proteico era de 50 ng/ml, seguido por un cultivo de 48 h. El sobrenadante obtenido mediante transfección de las células 293T con el vector pCK se utilizó como control. Las células cultivadas se recolectaron y contaron. El vector pCK se utilizó como control.
Como resultado del cultivo durante 5 días después de la siembra celular, cuando los grupos tratados con los respectivos sobrenadantes obtenidos de las células 293T transfectadas con pCK, pCK-HGF728, pCK-HGF723, y pCK-HGFX7 se compararon con el grupo de tratamiento con pCK, la proliferación se indujo aproximadamente un 20 % en el grupo de tratamiento con pCK-HGF728 o pCK-HGF723 y el crecimiento celular aumentó aproximadamente un 48 % en el grupo de tratamiento con pCK-HGFX7. Mediante estos resultados, se pudo verificar que el pCK-HGFX7 puede aumentar significativamente el crecimiento celular de las células neuronales motoras en comparación con el pCK-HGF728 o pCK-HGF723.
3-4. Efecto del pCK-HGFX7 sobre la apoptosis en las células NSC-34
Las células NSC-34 se suspendieron a 3 x 104 en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con un 1 % de suero bovino fetal, y entonces se sembró en una placa de 6 pocillos. Después de la siembra de las células se estabilizaron durante 2 h y luego se añadió cada uno de los sobrenadantes obtenidos de las células 293T transfectadas con pCK-HGF728, pCK-HGF723, y pCK-HGFX7 de manera que la concentración de1HGF proteico era de 50 ng/ml. El sobrenadante obtenido mediante transfección de las células 293T con el vector pCK se utilizó como control. Las células se cultivaron durante 5 días mientras el medio y cada uno de los sobrenadantes se intercambiaba a intervalos de 2-3 días.
Se extrajo el ARN de las células, que se cultivaron durante 5 días, utilizando el reactivo Trizol (Life Technologies,
USA), y se utilizó el ARN extraído para sintetizar un ADNc utilizando el kit First Strand cDNA (Roche, USA). Se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real utilizando el ADNc sintetizado como matriz y como cebadores los nucleótidos de SEQ ID NO: 11 y 12 para el gen Bax o los nucleótidos de SEQ ID NO: 13 y l4 para el gen Bcl-12. Se llevó a cabo la PCR en tiempo real mezclando 1 |jl de la matriz de ADNc, 1 |jl de cada cebador a 10 pmol/jl, 12,5 de mezcla maestra de PCR SYBR Green (Life Technologies, USA), y 9,5 j l de agua destilada terciaria esterilizada para preparar un total de 25 j l de una mezcla líquida y luego se lleva a cabo la reacción en condiciones de 2 min a 50 °C y 10 min a 95 °C, y luego 40 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C. Aquí, con el fin de corregir cada valor de reacción, se llevó a cabo una PCR en tiempo real utilizando, como cebadores, los nucleótidos de SEQ ID NO: 15 y 16 para GAPDH como un gen constitutivo. Como resultados del ensayo, la expresión del gen Bax asociado con la apoptosis se redujo en cada uno de los sobrenadantes con HGF de los grupos de tratamiento más que en el grupo de tratamiento con pCK, y especialmente, aumentó la expresión de Bcl-2 asociada con anti-apoptosis en 1,3 veces en el grupo de tratamiento con pCK-HGFX7 más que en el grupo de tratamiento con pCK (véase la FIG.
4a). Mediante este ensayo, se confirmó que, en el medio que contenía un 1 % de suero bovino fetal, el pCK-HGFX7 inhibía la apoptosis aproximadamente un 40 %, en comparación con el grupo de tratamiento con pCK como control (véase la f Ig .4b).
Ejemplo 4: Verificación del efecto de pCK-HGFX7 sobre la supervivencia de las células NSC-34 en condiciones de cultivo de estrés oxidativo
4-1. Selección de la concentración de la solución de peróxido de hidrógeno que induce la apoptosis de las células NSC-34 por estrés oxidativo
Antes de la verificación del efecto del pCK-HGFX7 sobre la apoptosis de las células NSC-34 inducida por una solución de peróxido de hidrógeno, se seleccionaron la concentración de siembra celular que es adecuada para validar la apoptosis de células NSC-34, y la concentración de solución de peróxido de hidrógeno para la inducción de apoptosis.
Las células cultivadas en un medio de cultivo suplementado con un 10 % de suero bovino fetal se recolectaron, y entonces se suspendieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con un 1 % de suero bovino fetal, seguido por el recuento celular. Las células ya contadas se sembraron en una placa de 96 pocillos con una concentración celular de 1 x 104, y luego se tratan al día siguiente con soluciones de peróxido de hidrógeno de 10, 20, 30, 50 y 100 jM . Se añadió la solución salina tampón fosfato a un pocillo que no se trató con la solución de peróxido de hidrógeno, y el pocillo se utilizó como control. Después de 24 h, se midió el grado de apoptosis utilizando el procedimiento de ensayo XTT (Roche, USA). Se verificó que los grupos de ensayo tratados con diferentes concentraciones de la solución de peróxido inducían un 0, 10, 30, 70 y 85% de apoptosis en comparación con el control. Basándose en estos resultados, la concentración adecuada de solución de peróxido de hidrógeno para la inducción de apoptosis de las células NSC-34 se seleccionó en 30 jM .
Adicionalmente, con el fin de llevar a cabo el ensayo de apoptosis en una placa de 6 pocillos, las células se sembraron en la placa de 6 pocillos de manera que las células estaban contenidas a 1,5 x 105, 3 x 105, y 1 x 106 en 2 ml de medio que contenía un 1 % de suero bovino fetal. Al día siguiente, las células NSC-34 se trataron con la solución de peróxido de hidrógeno de 30 jM , y se llevó a cabo el recuento celular los días 1, 4 y 7. Como resultado de la confirmación del recuento celular del día 7, las células del pocillo en el que se sembraron las células a 1,5 x 105 estaban todas muertas, y por lo tanto no se pudieron seleccionar para el ensayo, y no se indujo apoptosis en el pocillo en el que se sembraron las células a 1 x 106. Basándose en estos resultados del ensayo, el recuento celular, y la concentración de la solución de peróxido de oxígeno se seleccionaron para el ensayo de apoptosis en 3 x 105 y 30 jM , respectivamente.
4-2. Verificación del efecto de pCK-HGFX7 sobre la supervivencia de las células NSC-34 en condiciones de cultivo de estrés oxidativo
Las células NSC-34 se cultivaron en medio de cultivo suplementado con un 10 % de suero bovino fetal, y, para su uso en los ensayos de inhibición de la apoptosis, el cultivo se suspendió utilizando medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con un 1 % de suero bovino fetal. Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos de manera que estaban contenidas 3 x 105 de las células en 2 ml de un medio que contenía un 1 % de suero. Al día siguiente, se trataron los pocillos respectivos con la solución de peróxido de hidrógeno 30 jM seleccionada en el ensayo anterior, y luego se trataron con los sobrenadantes respectivos obtenidos de las células 293T transfectadas con pCK-HGF728, pCK-HGF723, y pCK-HGFX7 de manera que la concentración del HGF proteico era de 50 ng/ml. Se utilizó como control un medio de cultivo obtenido mediante la transfección de las células con el vector pCK se utilizó como control. Mientras las células se cultivaban durante 7 días, se observó el grado de apoptosis. Después de 7 días desde la siembra celular, las células se recolectaron y se contaron. Como resultado del recuento celular, se verificó que, solo aproximadamente un 60-70 % de las células sobrevivían en comparación con las células sembradas originalmente en los grupos de ensayo tratados con pCK, pCK-HGF728, y pCK-HGF723, mientras que las células NSC-34 tratadas con pCK-HGFX7 presentaba aproximadamente un 92 % de supervivencia, indicando una inhibición de apoptosis excelente en comparación con los grupos tratados con los otros materiales de ensayo. Estos resultados confirmaron que el HGFX7 proteico inhibía eficazmente la apoptosis de la neurona motora inducida por estrés oxidativo debido a la solución de peróxido de hidrógeno (véase la FIG. 5).
4-3. Verificación del efecto de pCK-HGFX7 sobre la apoptosis de las células NSC-34 en condiciones de cultivo de
estrés oxidativo
Las células NSC-34 se suspendieron a 3 x 105 en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con un 1 % de suero bovino fetal, y entonces se sembró en una placa de 6 pocillos. Al día siguiente, se trataron los pocilios respectivos con la solución de peróxido de hidrógeno 30 |jM seleccionada en el ensayo anterior, y luego se trataron con los sobrenadantes respectivos obtenidos de las células 293T que se habían transfectado con pCK-HGF728, pCK-HGF723, y pCK-HGFX7 de manera que la concentración del HGF proteico era de 50 ng/ml, seguido por el cultivo durante 7 días. El sobrenadante obtenido mediante transfección de células con el vector pCK se utilizó como control.
Se extrajo el ARN de las células, que se cultivaron durante 7 días, utilizando el reactivo Trizol, y se utilizó el ARN extraído para sintetizar un ADNc utilizando el kit First Strand cDNA. Se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real utilizando el ADNc sintetizado como matriz y como cebadores los nucleótidos de SEQ ID NO: 11 y 12 para el gen Bax o los nucleótidos de SEQ ID NO: 13 y 14 para el gen Bcl-12. Se llevó a cabo la PCR en tiempo real mezclando 1 j l de la matriz de ADNc, 1 j l de cada cebador a 10 pmol/jl, 12,5 de mezcla maestra de PCR SYBR Green (Life Technologies, USA), y 9,5 j l de agua destilada terciaria esterilizada para preparar un total de 25 j l de una mezcla líquida y luego se lleva a cabo la reacción en condiciones de 2 min a 50 °C y 10 min a 95 °C, y luego 40 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C. Aquí, con el fin de corregir cada valor de reacción, se llevó a cabo una PCR en tiempo real utilizando, como cebadores, los nucleótidos de SEQ ID NO: 15 y 16 para GAPDH como un gen constitutivo. Los resultados del ensayo confirmaron que la expresión del gen Bax asociado con inducción de apoptosis estaba disminuida y la expresión de Bcl-2 asociado con anti-apoptosis estaba aumentada en cada uno de los grupos de tratamiento con sobrenadante de HGF más que con el grupo de tratamiento con el pCK. Especialmente, se redujo la expresión del gen Bax aproximadamente un 70 % (véase la FIG. 6a), y la relación Bax/Bcl-2 disminuyó aproximadamente un 75 %, indicando un efecto apoptótico excelente (véase la FIG. 6b), en el grupo de tratamiento con pCK-HGFX7 más que el grupo de tratamiento con pCK.
Ejemplo 5: Verificación el efecto de pCK-HGFX7 sobre el crecimiento celular en células a las que se suministró hSODI mutante G93A
El ensayo in vitro que utiliza la forma mutante G93A de la superóxido dismutasa 1 (SOD1), que es una de las causas de ELA, ha sido desarrollado por muchos investigadores. Especialmente se ha publicado que el suministro de la forma mutante G93A de la hSOD1 en las células NSC-34, que se ha utilizado ampliamente en la investigación de la neurona motora, puede inducir apoptosis (Cheema y col., 2005). Por lo tanto, en el presente ensayo, se fabricaron un pCK-hSOD1 de tipo silvestre y pCK-hSOD-G93A insertando el gen de la SOD1 de tipo silvestre humana (tipo silvestre; WT) (NM_000454) y el gen de la SOD1 humana, en la que el resto de aminoácido 93° se sustituyó de glicina a alanina, en el sitio de BamHI del vector pCK, respectivamente. Se llevó a cabo el siguiente ensayo para investigar el efecto de pCK-HGFX7 en las células NSC-34 en las que se había suministrado hSOD1-G93A utilizando el plásmido preparado.
Las células NSC-34 se sembraron en una placa de 96 pocillos de manera que las células se suspendieron a 1 x 104 en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con un 10 % de suero bovino fetal. Al día siguiente, las células se transfectaron con pCK, pCK-hSOD1 de tipo silvestre (WT), y el mutante pCK-hSOD1-G93A (G93A) utilizando el reactivo lipofectamina LTX (Life Technologies, USA). Inmediatamente antes de la transfección, las células transfectadas con G93A se trataron con los sobrenadantes obtenidos de las células 293T que se transfectaron con pCK-HGF728 y pCK-HGFX7 de manera que la concentración del HGF proteico era de 50 ng/ml. El sobrenadante obtenido mediante transfección de células con el vector pCK se utilizó como control.
Después del cultivo durante 3 días, el crecimiento celular se confirmó mediante el tratamiento con el reactivo XTT. Los resultados confirmaron que las células a las que se suministró la hSOD1 de tipo silvestre y las células a las que se suministró el vector pCK presentaban un crecimiento celular similar. Sin embargo, las células a las que se suministró la hSOD1 mutante en G93A presentaban aproximadamente un 85,8 % de crecimiento celular, en comparación con las células a las que se suministró pCK, que presentaban un deterioro en el crecimiento celular en comparación con las células a las que se suministró la hSOD1 de tipo silvestre. Sin embargo, el grupo de tratamiento con pCK-HGFX7 presenta aproximadamente un 92,9 % de crecimiento celular, indicando el efecto de inhibición del deterioro del crecimiento celular, que está causado por el suministro de la hSOD1 mutante en G93A (véase la FIG. 7).
[Secuencias genéticas]
SEQ ID NO: 11: GGC AGA CAG TGA CCA TCT TT
SEQ ID NO: 12: AGT GGA CCT GAG GTT TAT TG
SEQ ID NO: 13: CCA TCA ATC AAA GCC AAG CA
SEQ ID NO: 14: AGC CTT CAC GCA AGT TCA GG
SEQ ID NO: 15: CCA TCA CTG CCA CTC AGA C
SEQ ID NO: 16: TCA TAC TTG GCA GGT TTC TCC
Ejemplo 6: Verificación de pCK-HGFX7 sobe la fuerza de agarre en ratones Tg con SOD1-G93A mutante humana (de aquí en adelante, ratón ELA)
Se ha descubierto que la mutación de la superóxido dismutasa 1 (SOD1) es una de las causas de ELA, se desarrolló el modelo de ratón ELA utilizando este gen, y actualmente, los investigadores de la ELA en todo el mundo han llevado
Claims (11)
1. Una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de prevención o el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, conteniendo la composición, como principio activo, dos o más isotermas del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o un polinucleótido que codifique las isoformas, en la que las dos o más isoformas de1HGF incluyen el HGF de longitud completa (flHGF), que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y la variante de eliminación del HGF (dHGF), que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que las dos o más isoformas de1HGF son codificadas por secuencias de nucleótidos diferentes.
3. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que las dos o más isoformas de1HGF son codificadas por una única secuencia de nucleótidos.
4. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que el polinucleótido es un ADN desnudo, o está contenido en un sistema de suministro genético.
5. La composición para el uso de la reivindicación 4, en la que el sistema de suministro genético es un vector.
6. La composición para el uso de la reivindicación 5, en la que el vector es un plásmido.
7. La composición para el uso de la reivindicación 6, en la que el vector es el pCK.
8. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que el polinucleótido incluye una secuencia correspondiente del exón 1 al exón 18 de un gen del HGF humano, y el intrón 4 de un gen de1HGF humano o su fragmento como una secuencia insertada adicionalmente entre el exón 4 y el exón 5.
9. La composición para el uso de la reivindicación 8, en la que el polinucleótido incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10.
10. La composición para el uso de la reivindicación 9, en la que el polinucleótido incluye una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9.
11. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que el polinucleótido se administra a una dosis de 1 |jg a 2.500 mg.
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