TW202229321A - 核酸構築體、病毒載體及病毒顆粒 - Google Patents

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泰爾 克拉默
席拉 史佩琪
布列塔尼 尼可 華雷特
美瑜 徐
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Abstract

本發明係關於包含編碼GAT-1之轉殖基因的核酸構築體、病毒載體及病毒顆粒；及此類病毒顆粒用於治療由SLC6A1損傷介導之疾病的用途。

Description

核酸構築體、病毒載體及病毒顆粒
本發明屬於核酸構築體、病毒載體及病毒顆粒領域，其用於治療及/或預防與溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)功能損失相關的疾病，諸如肌痙攣失張力癲癇(MAE)、MAE樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群(Lennox-Gastaut Syndrome)以及自閉症譜系障礙及精神分裂症。
迄今，已有數千個基因與神經發育障礙相關且借助於臨床基因測試，日益增多之症候群係由突變基因而非其臨床特徵來定義的。基因SLC6A1之破壞已鑑別為大範圍之神經發育障礙的顯著原因，包括自閉症譜系障礙(ASD)、智能障礙(ID)及不同類型及嚴重程度之癲癇。SLC6A1編碼GAT-1，其為在中樞神經系統中表現之γ-胺基丁酸(GABA)轉運子家族之成員(Bröer S. and Gether U. 2012. Br J Pharmacol 167: 256-278)。SLC6A1基因首先選殖於1990年(Guastella J.等人, 1990. Science 249: 1303-1306)且屬於一個由20個旁系同源物組成之家族。由此等基因中之13個編碼之蛋白質展現超過80%序列一致性且其中六個能夠以不同程度之受質特異性轉運GABA。
GAT-1在哺乳動物中樞神經系統中廣泛且專一地表現，主要在成人大腦中額葉皮質中表現(Gamazon E.R.等人, 2018. Nat Genet 50: 956-967)。不同於其他GABA轉運子，GAT-1幾乎完全表現於GABA能軸突末端及星形膠質細胞中。在發育中的大腦中，GABA發揮興奮作用，但後來成為中樞神經系統中之主要抑制性神經傳遞素。GABA能抑制之發作對於抗衡神經元興奮至關重要，且當顯著破壞時，其對大腦發育產生負面影響，且導致注意力及認知缺陷以及癲癇。
GAT-1蛋白質由12個跨膜域構成，該等跨膜域聚集在一起以形成單鏈轉運子。GABA轉運子之主要功能為降低胞外空間中之GABA濃度(Scimemi A. 2014. Front Cell Neurosci 8)。此任務藉由將GABA跨細胞膜之易位與鈉及氯化物之電化學梯度之耗散耦合來實現(圖1)。藉由使此等離子與GABA (1 GABA: 2 Na +: 1 Cl -)以固定比率移動跨膜，GAT-1產生化學計量電流(Lester H.A.等人, 1994. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 34: 219-249)。在其餘時，在GABA能神經元之突觸前末端中，鈉及氯離子之驅動力迫使此等離子自胞外空間向細胞質移動，因此在相同方向上攜帶GABA。GABA跨膜之易位相對較快，使得GABA在其釋放之後幾毫秒內自胞外空間移除(Isaacson等人, 1993. Neuron 10: 165-175)。除了調節GABA之轉運外，GAT-1亦表現為離子通道，且產生兩種不以化學計量方式耦合至GABA跨膜之移動的離子電流。第一種為藉由結合至GAT-1之GABA活化的鈉內向電流(Risso等人, 1996. J Physiol 490: 691-702)。第二種為滲漏電流，其甚至在不存在GABA之情況下亦可偵測到，且在活體外由鋰及銫等鹼離子介導(MacAulay等人, 2002. J Physiol (Lond) 544: 447-458)。最後，在不存在GABA之情況下，GAT-1產生鈉依賴性電容電流(Mager等人, 1993. Neuron 10: 177-188)。經由此等電流之協調激活，GAT-1激活可產生局部分流(亦即，膜電阻之改變)或膜去極化。
編碼三種GAT-1同功異型物之人類SLC6A1存在五種主要剪接變異體，該等變異體在外顯子三至五的交替使用中彼此不同。轉錄本ENST00000287766為SLC6A1之最長同功異型物且視為典型的(Hunt等人, 2018. Database (Oxford) 2018
https://academic.oup.com/database/article/doi/10.1093/database/bay119/5255129)。因此，大部分基因變異體映射至其序列中。由於缺乏晶體結構，GAT-1之確切拓樸結構尚不清楚。GAT-1之同源性建模(基於LeuTAa之晶體結構，LeuTAa為一種來自阿氏產水菌(Aquifex aeolicus)的原核同源白胺酸轉運子，與GAT-1具有20-25%的序列同源性)允許鑑別對跨膜域1、3、6、8中之受質及鈉結合所必需之殘基及在輸送過程中構形轉變所必需之其他殘基。(Bröer S.及Gether U. 2012. Br J Pharmacol 167: 256-278)。
然而，如同許多其他神經發育障礙相關基因的情況，SLC6A1內的患者變異體沿著其序列廣泛分佈(Johannesen等人, 2018. Epilepsia 59: 389-402)。在患者中已觀測到兩種類型之變異體：(i)終止所遺傳之兩種SLC6A1基因等位基因中之一者的蛋白質產生的蛋白質截斷變異體及(ii)蛋白質之關鍵區域(諸如GABA結合位點及跨膜域)中之誤義變異體。
因此，SLC6A1病症之預期分子病理機制為功能喪失或單倍體不足。疾病模型由野生型及GAT-1-/-小鼠兩者中之實驗以及對來自具有SLC6A1突變之個體之重組GAT-1蛋白質的研究支持。然而，單倍體不足導致臨床表現之機制尚不清楚。最近，實驗證據顯示，癲癇患者中鑑別之SLC6A1變異體減少活體外GABA轉運(Mattison等人, 2018; Cai et al. 2019. Epilepsia 59: e135-e141)。其他證據表明SLC6A1突變亦可引起蛋白質遷移受損(Cai等人, 2019. Experimental Neurology 320: 112973)。
目前尚無SLC6A1遺傳病症之特異性動物模型。雜合(Het) GAT-1基因剔除小鼠看起來表型正常，儘管GABA再攝取能力大大減弱。先前已開發且部分表徵功能性GAT-1 KO小鼠(Chiu等人, 2005. Neurosci 25: 3234-3245；Cope等人, 2009. Nature Medicine 15: 1392-1398；Jensen等人, 2003. Neurophysiology 90: 2690-2701；Lester等人, 1994. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 34: 219-249)。完整KO動物展現處失神癲癇、持續顫抖、步態異常、力量及活動性降低以及焦慮行為(Chiu等人, 2005. Neurosci 25: 3234-3245; Cope et al. 2009. Nature Medicine 15: 1392-1398)。此等表型與SLC6A1病症之一些臨床表現匹配，該等臨床表現包括失神癲癇、活動性及認知障礙(Johannesen等人, 2018. Epilepsia 59: 389-402)。
丙戊酸本身或與諸如胺己烯酸(vigabatrine)之其他抗癲癇藥組合已展示陽性結果(Johannesen等人, 2018. Epilepsia 59: 389-402)。小分子或伴隨蛋白療法亦視為理論上似乎合理的選擇方案以增強現有GAT-1蛋白質之活性，但迄今為止尚未成功。此等干預均不能解決與GAT-1損傷相關的多種臨床表現背後的全部或甚至一小部分病理特徵。因此，對於改善SLC6A1相關病症之治療方案，仍有明顯的醫療需求未得到滿足。
本發明藉由藉助於基因療法提供野生型SLC6A1基因之健康複本來解決以上鑑定的需要，該野生型SLC6A1基因可在經轉導細胞中經受內源性調節機制且能夠將GAT-1轉運子功能恢復至「正常」範圍。
本發明可概述如下：
實施例1：一種核酸構築體，其包含編碼以下之轉殖基因： i. γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)，其包含SEQ ID NO: 18、19、20；或 ii. 與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或 iii. 天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His; Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile。
實施例2：如實施例1之核酸構築體，其中該轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因，其中該轉殖基因較佳包含： i. SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或 ii. 與SEQ ID NO: 15、26、27、28或29具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性之序列。
實施例3：如實施例1或2中任一項之核酸構築體，其進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14。
實施例4：如前述實施例中任一項之核酸構築體，其中該構築體包含聚腺苷酸化信號序列，較佳為包含SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列。
實施例5：一種病毒載體，其包含如前述實施例中任一項之核酸構築體，其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。
實施例6：如實施例5之病毒載體，其中該5'ITR及/或該3'ITR包含天然腺相關病毒(AAV)之ITR，諸如AAV2。
實施例7：如實施例5或6中任一項之病毒載體，其中該5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或該3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
實施例8：一種病毒顆粒，其包含如實施例1至4中任一項之核酸構築體或如實施例5至7中任一項之病毒載體。
實施例9：如實施例8之病毒顆粒，其中該病毒顆粒至少包含來自AAV之VP1衣殼蛋白，其中該衣殼蛋白較佳包含AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9 (諸如包含SEQ ID NO: 25)、AAV10、AAV-真型(AAVtt，諸如包含SEQ ID NO: 24)或其組合。
實施例10：如實施例9之病毒顆粒，其中該衣殼蛋白來自AAVtt且較佳包含SEQ ID NO: 24或其與SEQ ID NO: 24至少98.5%，較佳99%或99.5%一致。
實施例11：一種病毒載體，其包含包含有編碼以下之轉殖基因的核酸構築體： i.    γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)，其包含SEQ ID NO: 18、19、20；或 ii.   與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或 iii. 天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； 其中該病毒載體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該病毒載體中所包含之核酸構築體包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列；且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。
實施例12。一種病毒載體，其包含包含有轉殖基因之核酸構築體，該轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因，其中該轉殖基因較佳包含： i.   SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，更佳SEQ ID NO: 15； ii.  或與SEQ ID NO: 15、26、27、28或29具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性之序列。 其中該病毒載體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該病毒載體中所包含之核酸構築體包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列，且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。
實施例13。如實施例11或12中任一項之病毒載體，其中該轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 18之γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)。
實施例14。如實施例11至13中任一項之病毒載體，其中該聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 17。
實施例15：一種病毒顆粒，其包含如實施例11至14中任一項之病毒載體。
實施例16：如實施例15之病毒顆粒，其中該病毒顆粒至少包含來自AAV之VP1衣殼蛋白，其中該衣殼蛋白較佳包含AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9 (諸如包含SEQ ID NO: 25)、AAV10、AAV-真型(AAVtt)或其組合。
實施例17：如實施例16之病毒顆粒，其中該衣殼蛋白來自AAV9且較佳包含SEQ ID NO: 25或AAVtt且較佳包含SEQ ID NO: 24或其與SEQ ID NO: 24至少98.5%、較佳99%或99.5%一致。
實施例18：一種質體，其包含如實施例1至4中任一項之核酸構築體或如實施例5至7或11至14中任一項之病毒載體。
實施例19：一種宿主細胞，其用於產生如實施例8至10或15至17中任一項之病毒顆粒。
實施例20：如實施例18之宿主細胞，其中該宿主細胞包含： a.    如實施例1至4中任一項之核酸構築體或如實施例5至7或11至14中任一項之病毒載體； b.    編碼AAV rep及/或cap基因的核酸構築體，較佳質體，不攜有ITR序列；及視情況 c.    包含病毒輔助基因之核酸構築體，例如質體或病毒。
實施例21：一種產生如實施例8至10或15至17中任一項之病毒顆粒的方法，該方法包含以下步驟： a.    在培養基中培養如實施例19或20中任一項之宿主細胞；及 b.    自該宿主細胞培養基及/或在該等宿主細胞內部採集該等病毒顆粒。
實施例22：一種醫藥組合物，其包含如實施例1至4中任一項之核酸構築體或如實施例5至7或11至14中任一項之病毒載體或如實施例8至10或15至17中任一項之病毒顆粒，以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
實施例23：如實施例8至10或15至17中任一項之病毒顆粒，其用於療法中。
實施例24：如實施例8至10或15至17中任一項之病毒顆粒，其用於治療及/或預防以SLC6A1單倍體不足為特徵之疾病，其中該疾病較佳包含伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合。
實施例25：如實施例23或24中任一項之病毒顆粒，其中該用途用於恢復GAT-1功能及/或降低癲癇頻率。
實施例26：如實施例8至10或15至17中任一項之病毒顆粒，其中該疾病與患者中導致病理性GAT-1變異體之至少一種突變相關，其中該等病理性GAT-1變異體包含一個突變或突變組合。
實施例27：如實施例26之病毒顆粒，其中該突變參考SEQ ID NO: 18，包含R44W、R44Q、R50L、D52E、D52V、F53S、S56F、G63S、N66D、G75R、G79R、G79V、F92S、G94E、G105S、Q106R、G112V、Y140C、C173Y、G232V、F270S、R277H、A288V、S295L、G297R、A305T、G307R、V323I、A334P、V342M、A357V、G362R、L366V、A367T、F385L、G393S、S456R、S459R、M487T、V511L、G550R或其組合。
實施例28：一種用於治療及/或預防以SLC6A1單倍體不足為特徵之疾病的方法，其中該疾病較佳包含伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合，該方法包含向有需要之個體投與如實施例8至10或14至16中任一項之病毒顆粒。
實施例29：如實施例28之方法，其中該方法用於恢復GAT-1功能及/或降低癲癇頻率。
實施例30：如實施例28或29中任一項之方法，其中該疾病與患者中導致病理性GAT-1變異體之至少一種突變相關，其中該等病理性GAT-1變異體包含一個突變或突變組合。
實施例31：如實施例30之方法，其中該突變參考SEQ ID NO: 18，包含R44W、R44Q、R50L、D52E、D52V、F53S、S56F、G63S、N66D、G75R、G79R、G79V、F92S、G94E、G105S、Q106R、G112V、Y140C、C173Y、G232V、F270S、R277H、A288V、S295L、G297R、A305T、G307R、V323I、A334P、V342M、A357V、G362R、L366V、A367T、F385L、G393S、S456R、S459R、M487T、V511L、G550R或其組合。
現將參照特定的非限制性態樣及其實施例且參考某些圖式及實例描述本發明。
除非另外指示，否則技術術語係根據其常見含義使用。若向某些術語傳遞特定含義，則將在使用該等術語之上下文中給定術語之定義。
除非另外明確規定，否則當參考單數名詞使用不定冠詞或定冠詞，例如「一(a/an)」或「該(the)」時，此包括該名詞之複數。
如此處所使用，術語「包含(comprising)」不排除其他元素。出於本發明之目，認為術語「由……組成(consist of)」為術語「包含(comprise of)」之一較佳實施例。
如本文所用，術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其類似術語係指獲得所要的藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。因此療法涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病的任何療法，且包括：(a)預防可能易患該疾病、但尚未診斷出患有該疾病之個體(亦即人類)中出現該疾病；(b)抑制該疾病，亦即阻滯其發展；以及(c)緩解該疾病，亦即促使該疾病消退。
本發明提供一種核酸構築體，其包含編碼以下之轉殖基因：包含SEQ ID NO: 18、19、20之γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)，或與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列。
如本文所用，術語「轉殖基因」係指核酸分子(或簡稱及可互換地在本文中使用之核酸)、編碼用作基因療法中之活性成分之基因產物的DNA或cDNA。基因產物可為一或多種肽或蛋白質。
在一個實施例中，轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因。
SLC6A1基因位於SLC6A11基因(編碼另一類型之GABA轉運子)與HRH1基因(編碼組胺受體H1)之間的染色體3之短臂中(GRCh38基因體座標：3:10,992,733-11,039,248 10,992,748-11,039,247)。SLC6A1基因為約46.5千鹼基(Kb)長且包含18個外顯子(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6529)。存在五種產生人類GAT-1之3種剪接同功異型物的主要變異體，該等變異體在外顯子三至五的交替使用中彼此不同。對應於編碼序列部分CDS之轉錄本ENST00000287766為人類SLC6A1之最長同功異型物且視為典型的(Hunt等人, 2018) (圖2)且包含SEQ ID NO: 15。因此，大部分基因變異體映射至此序列中。已知遺傳變異體包含：包含SEQ ID NO: 26之變異體2，包含SEQ ID NO: 27之變異體3，包含SEQ ID NO: 28之變異體4及包含SEQ ID NO: 29之變異體5。
特定言之，根據本發明之核酸構築體包含編碼GAT-1、較佳編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，更佳SEQ ID NO: 15。
如本文所用，術語「GAT-1」係指γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1) (亦稱為GABA轉運子1；MAE；GAT1；GABATR；GABATHG (Uniprot編碼：P30531)。GAT-1蛋白質由12個跨膜域構成，該等跨膜域聚集在一起以形成單鏈轉運子。人類SLC6A1之五個剪接變異體產生GAT-1之三種剪接同功異型物：包含SEQ ID NO: 18(視為典型序列)之同功異型物a，其由分別包含SEQ ID NO: 15及26之剪接變異體1或2編碼；包含SEQ ID NO: 19之同功異型物b，其由包含SEQ ID NO: 27之剪接變異體3編碼；及包含SEQ ID NO: 20之同功異型物c，其由分別包含SEQ ID NO: 28及29之剪接變異體4或5編碼。如本文所用，術語GAT-1係指本文所描述之GAT-1的所有變異體及同功異型物(除非另外規定)。
因此，在一個實施例中，核酸構築體包含編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)之轉殖基因，其包含： i. SEQ ID NO: 18、19、20；或 ii. 與SEQ ID NO: 18或19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或 iii. 天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； 其中該轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因，其較佳包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，更佳SEQ ID NO: 15；或與SEQ ID NO: 15、26、27、28或29具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性的序列。
術語「核酸」及「聚核苷酸」或「核苷酸序列」可互換使用以指由單體核苷酸構成或包含單體核苷酸之任何分子。核酸可為寡核苷酸或聚核苷酸。核苷酸序列可為DNA或RNA。核苷酸序列可經化學修飾或人工修飾。核苷酸序列包括肽核酸(PNA)、𠰌啉(morpholino)及鎖核酸(LNA)以及二醇核酸(GNA)及蘇糖核酸(TNA)。此等序列中之各者與天然存在之DNA或RNA之區別在於分子主鏈之變化。此外，可使用硫代磷酸酯核苷酸。其他去氧核苷酸類似物包括可用於本發明之核苷酸中之甲基膦酸酯、胺基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3'P5'-胺基磷酸酯、以及寡核糖核苷酸硫代磷酸酯及其2'-0-烯丙基類似物及2'-0-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯。
此外，術語「核酸構築體」係指由使用重組DNA技術產生之非天然存在之核酸。尤其，核酸構築體為已經修飾以含有核酸序列區段之核酸分子，該等區段以自然界中不存在之方式合併或併接。
在特定實施例中，該核酸構築體包含編碼核酸序列之全部或片段(至少1000、1100、1500、2000、2500或至少1500個核苷酸)，該編碼核酸序列與GAT-1之天然存在或重組功能變異體之編碼序列具有至少70%、80%、90%、95%、99%或100%一致性。天然存在之GAT-1變異體包括人類、靈長類動物、鼠類或其他哺乳動物已知的GAT-1，通常為包含SEQ ID NO: 18、19或20之人類GAT-1。
如本文中所使用，術語「片段」係指參考序列之連續部分。例如，長度至少為1000個核苷酸之SEQ ID NO: 18或19或20的片段係指50、或100、或200、或500、或1000，且因此對於SEQ ID NO: 18、或19或20之連續核苷酸。
如本文所用之術語「功能變異體」或「天然存在之變異體」係指已相對於參考序列經修飾但保留該參考序列之功能的核酸或胺基酸序列。例如，SLC6A1之功能變異體保留編碼GAT-1之能力。類似地，GAT-1之功能變異體保留參考GAT-1之活性。參考SEQ ID NO: 18，GAT-1之天然產生之變異體展示於表3中且參考SEQ ID NO: 18包含一或多個較佳選自由以下組成之群的突變：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile。
在一較佳實施例中，該核酸構築體包含編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該人類GAT-1包含SEQ ID NO: 18或19或20，例如包含SEQ ID NO: 15之轉殖基因；或由與SEQ ID NO: 15具有至少75%、至少80%或至少90%、至少95%或至少99%一致性之核苷酸序列組成的該轉殖基因之變異體。在一個實施例中，該轉殖基因之變異體包含i)編碼包含SEQ ID NO: 18或19或20之GAT-1的一部分的核苷酸序列；或ii)與SEQ ID NO: 15具有至少75%、至少80%或至少90%、至少95%或至少99%一致性且保持與人類GAT-1基本上相同之GAT-1活性的核苷酸序列；或iii)天然產生之變異體，其參考SEQ ID NO: 18包含一或多個較佳選自由以下組成之群的突變：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile。
如本文所用，術語「序列一致性」或「一致性」係指在兩個聚核苷酸或多肽序列比對之位置中匹配的數目(一致核酸或胺基酸殘基)。序列一致性藉由在對序列進行比對以最大化重疊及一致同時最小化序列間隙的情況下比較該等序列而判定。特定言之，視兩個序列之長度而定，可使用多種數學全域或局域比對演算法中之任一者來判定序列一致性。類似長度之序列較佳使用使用全局比對演算法(例如，Needleman及Wunsch演算法；Needleman及Wunsch, 1970, J Mol Biol.;48(3):443-53)進行比對，其在整個長度上最佳地比對序列，而基本上不同長度的序列較佳使用局域比對演算法(例如，Smith及Waterman演算法(Smith and Waterman, 1981, J Theor Biol. ;91(2):379-80)或Altschul演算法(Altschul SF等人, 1997, Nucleic Acids Res.;25(17):3389-402.；Altschul SF等人, 2005, Bioinformatics.;21(8):1451-6)進行比對。用於判定核酸或胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術中之技能內的各種方式達成，例如使用可在諸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/之網際網路網站上獲得的公開可用的電腦軟體。熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包括用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。出於本文之目的，核酸或胺基酸序列一致性%值係指使用逐對序列比對程式EMBOSS Needle產生的值，該程式EMBOSS Needle使用Needleman-Wunsch演算法來產生兩個序列之最佳全域比對，其中所有搜尋參數均設定成預設值，亦即計分矩陣(Scoring matrix) = BLOSUM62，空位開口(Gap open) = 10，空位延伸(Gap extend) = 0.5，末端空位罰分(End gap penalty) = 假(false)，末端空位開口(End gap open) = 10，且末端空位延伸(End gap extend) = 0.5。
根據本發明之核酸構築體包含轉殖基因及至少適合的核酸元件，其例如在宿主中，諸如在宿主細胞中表現。
例如，該核酸構築體包含編碼GAT-1之轉殖基因及相關宿主中GAT-1之表現所需的一或多個控制序列。一般而言，核酸構築體包含表現GAT-1所需之轉殖基因(諸如編碼GAT-1之轉殖基因)及轉殖基因之前(5'非編碼序列)及之後(3'非編碼序列)的調節序列。
因此，在特定實施例中，該核酸構築體至少包含(i)編碼GAT-1之轉殖基因及ii)可操作地連接於該轉殖基因之啟動子。較佳地，轉殖基因在啟動子的控制下。
如本文所用，術語「啟動子」係指引導其可操作地連接之核酸之轉錄的調節元件。啟動子可調節可操作地連接之核酸的轉錄速率及效率兩者。啟動子亦可以可操作地連接於其它調節元件，該等調節元件增強(「強化子」)或抑制(「抑制子」)核酸的啟動子依賴性轉錄。此等調節元件包括(但不限於)轉錄因子結合位點、抑制子及活化子蛋白結合位點，及熟習此項技術者已知的且直接或間接起作用以調控啟動子之轉錄量的任何其他核苷酸序列，包括例如衰減子、強化子及沉默子。啟動子位於與可操作地連接之基因或編碼序列的轉錄起始位點附近、在相同股上且在DNA序列上游(朝向有義股之5'區)。啟動子可為約100至1000個鹼基對長。啟動子中之位置係相對於特定基因之轉錄起始位點指定(亦即，上游位置為自-1計數返回之負數值，例如，-100為上游100個鹼基對之位置)。
如本文所用，「在5'至3'定向上可操作地連接」或簡單地「可操作地連接」係指兩個或更多個核苷酸序列以功能關係連接，其允許該兩個或更多個序列中之每一者執行其正常功能。通常，術語可操作地連接用以指諸如啟動子之調節元件及編碼所關注蛋白質之轉殖基因的併接。例如，啟動子與轉殖基因之間的可操作連接允許啟動子起作用以驅動轉殖基因在適合表現系統中(諸如在細胞中)的5'表現。
通常，此類啟動子可為組織或細胞類型特異性啟動子，或器官特異性啟動子，或對多個器官具有特異性之啟動子，或全身性或普遍存在的啟動子。
如本文所用，術語「普遍存在的啟動子」更特定言之係指在多種不同細胞或組織中，例如在神經元及星形膠質細胞兩者中具有活性的啟動子。
適用於跨中樞神經系統表現轉殖基因之啟動子之實例包括：雞β肌動蛋白(CBA)啟動子(Miyazaki 1989, Gene 79:269-277)、CAG啟動子(Niwa 1991, Gene 108:193-199)、延伸因子1 α啟動子(EF1α) (Nakai 1998, Blood 91:4600-4607)、人類突觸蛋白1基因啟動子(hSyn) (Kugler S.等人, Gene Ther. 2003. 10(4):337-47)或磷酸甘油酸激酶1啟動子(PGK1) (Hannan 1993, Gene 130:233-239)、甲基CPG結合蛋白2(MECP2)啟動子(Adachi等人, Hum. Mol. Genetics. 2005; 14(23): 3709-3722)、人類神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Twyman, R. M.及E. A. Jones (1997). J Mol Neurosci 8(1): 63-73))、鈣/調鈣蛋白依賴性蛋白質激酶II (CAMKII)啟動子(Nathanson, J. L.等人, (2009). Neuroscience 161(2): 441-450)及人類泛蛋白C (UBC)啟動子(Schorpp, M.等人, (1996). Nucleic Acids Res 24(9): 1787-1788)。
在一個實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 1，或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1。
在一個實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 3。
在一個較佳實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 4。
在一個實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35。
在一個實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 7或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7。
在一個實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 8。
在一個實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 9。
在一個實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 10。
在一個實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13。
在另一較佳實施例中，該啟動子包含SEQ ID NO: 14。
在替代實施例中，核酸構築體至少包含(i)編碼GAT-1之轉殖基因及可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子為以下之至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%： a.    SEQ ID NO: 1或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或較佳地在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14。
用於本發明之核酸構築體中之啟動子可為本文所描述之啟動子的功能變異體或片段。本文所描述之啟動子之功能變異體或片段可在保留對應非變異體或全長啟動子之特徵意義上具有功能性。因此，本文所描述之啟動子之功能變異體或片段保留驅動該功能變異體或片段可操作地連接之轉殖基因轉錄的能力，藉此驅動由該轉殖基因編碼之GAT-1的表現。本文所描述之啟動子之功能變異體或片段可保留針對特定組織類型的特異性。例如，本文所描述之啟動子之功能變異體或片段可對CNS細胞具有特異性，諸如內源hSLC6A1啟動子。本文所描述之啟動子之功能變異體或片段可特異性地驅動神經元及/或星形膠質細胞中GAT-1之表現。
本發明中所用之啟動子可包含「最小序列」，其應理解為具有足夠長度之啟動子的核苷酸序列且其包含充當啟動子(亦即能夠驅動該啟動子可操作地連接之轉殖基因的轉錄)的所需元件，藉此驅動GAT-1之表現。
本發明之核酸構築體中所用的最小啟動子可為例如包含SEQ ID NO: 1之啟動子CAG或包含SEQ ID NO: 5之EF1a啟動子或包含SEQ ID NO: 11之hDLX啟動子。
本發明中所描述之啟動子可包含一或多個內含子。如本文所用，術語「內含子」係指基因內非編碼核苷酸序列。通常，內含子在基因轉錄期間自DNA轉錄成信使RNA (mRNA)，但在基因轉譯之前藉由剪接從mRNA轉錄本中切除。
本發明中所用之啟動子可以包含本文所描述之內含子之功能變異體或片段。本文中所描述之內含子之功能變異體或片段可在保留對應非變異體或全長內含子之特徵意義上具有功能性。因此，本文所描述之內含子之功能變異體或片段為非編碼的。本文所描述之內含子之功能變異體或片段亦可保留自DNA轉錄為mRNA之能力及/或藉由剪接從mRNA切除之能力。
可併入本發明中使用之啟動子中之內含子可來自天然非編碼區或工程改造。
本發明中使用之內含子可為a)嵌合內含子CBA/RbG內含子，其包含或由SEQ ID NO:2或其功能變異體或片段組成，該其功能變異體或片段與SEQ ID NO: 2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致性；b) EF1a內含子，其包含或由SEQ ID NO:6或其功能變異體或片段組成，該其功能變異體或片段與SEQ ID NO: 6具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致性；或c) MECP2內含子，包含或由SEQ ID NO: 34或其功能變異體或片段組成，該其功能變異體或片段與SEQ ID NO: 34具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致性；或d) hDLX內含子，其包含或由SEQ ID NO: 13或其功能變異體或片段組成，該其功能變異體或片段與SEQ ID NO: 13具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致性。
在一些實施例中，本文所描述之啟動子及/或內含子可與非表現外顯子序列組合。非表現外顯子序列不能夠產生轉錄本而可能側接內含子序列以提供剪接位點。
或者，用於本發明之啟動子可為化學誘導性啟動子。如本文所用，化學誘導性啟動子為藉由活體內向該有需要之個體投與化學誘導劑調節的啟動子。適合的化學誘導性啟動子之實例包括(不限於)四環素(Tetracycline)/米諾環素(Minocycline)誘導性啟動子(Chtarto 2003,Neurosci Lett. 352:155-158)或雷帕黴素(rapamycin)誘導型系統(Sanftner 2006, Mol Ther.13:167-174)。
根據本發明之核酸構築體可進一步具有3'非轉譯區，其通常含有聚腺苷酸化信號序列及/或轉錄終止子。
如本文所用，術語「聚腺苷酸化信號序列」(或本文中皆可互換使用的「聚腺苷酸化位點」或「聚(A)信號」)係指在基因之3'非轉譯區域(3' UTR)內的特異性識別序列，其轉錄為前驅體mRNA分子且引導基因轉錄終止。聚腺苷酸化信號序列充當新形成之前驅體mRNA在其3'端之核酸內切酶裂解信號，且用於添加至僅由腺嘌呤鹼基組成之RNA延伸物之此3'端(聚腺苷酸化過程；聚(A)尾)。聚腺苷酸化信號序列對於mRNA之核輸出、轉譯及穩定性為重要的。在本發明之上下文中，聚腺苷酸化信號序列為可在哺乳動物細胞中指引哺乳動物基因及/或病毒基因聚腺苷酸化的識別序列。
聚腺苷酸化信號序列信號通常由以下組成：a)共有序列AAUAAA，其已顯示為3'端裂解及前信使RNA (前mRNA)之聚腺苷酸化以及促進下游轉錄終止所需的；及b) AAUAAA上游及下游之其他元件，其控制AAUAAA作為聚(A)信號之利用效率。哺乳動物基因中此等模體存在相當大的變化性。
在一個實施例中，視情況與上文或下文所描述之各種實施例之一或多個特徵組合，本發明之核酸構築體之聚腺苷酸化信號序列為哺乳動物基因或病毒基因之聚腺苷酸化信號序列。適合之聚腺苷酸化信號尤其包括SV40早期聚腺苷酸化信號、SV40晚期聚腺苷酸化信號、HSV胸苷激酶聚腺苷酸化信號、魚精蛋白基因聚腺苷酸化信號、腺病毒5 EIb聚腺苷酸化信號、生長激素聚腺苷酸化信號、PBGD聚腺苷酸化信號、電腦模擬設計之聚腺苷酸化信號(合成)及其類似物。
在一個特定實施例中，核酸構築體包含編碼以下之轉殖基因：包含SEQ ID NO: 18、19、20之γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)；或與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列，其中該核酸構築體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含：SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或SEQ ID NO: 3；或SEQ ID NO: 4；或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或SEQ ID NO: 7；或SEQ ID NO: 8；或SEQ ID NO: 9；或SEQ ID NO: 10；或SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或SEQ ID NO: 14；其中該核酸構築體進一步包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳包含包含有SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列。較佳地，轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因，其包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，更佳包含SEQ ID NO: 15。
在一個最佳實施例中，核酸構築體包含編碼以下之轉殖基因：包含SEQ ID NO: 18、19、20之γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)；或與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列，其中該核酸構築體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該核酸構築體進一步包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳包含包含有SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列；其中該轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因，其包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，更佳包含SEQ ID NO: 15。
在一個實施例中，提供一種核酸構築體，其包含編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)且保留作為GAT-1之功能性的轉殖基因，其中該核酸構築體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該核酸構築體進一步包含聚腺苷酸化信號序列。
在一個實施例中，提供一種核酸構築體，其包含編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)且保留作為GAT-1之功能性的轉殖基因，其中該核酸構築體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該核酸構築體進一步包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳包含包含有SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列。
在另一實施例中，編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)且保留作為GAT-1之功能性的轉殖基因進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID N之O: 4或SEQ ID NO: 14；其中該核酸構築體進一步包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳包含包含有SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列；且其中該編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)轉殖基因參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳地選自以下之一或多個突變：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；Val578Ile。
核酸構築體亦可包含其他調節元件，諸如強化子序列、內含子、微小RNA靶向序列、促進DNA片段插入載體及/或剪接信號序列內的多連接子序列。
本發明進一步提供一種病毒載體，其包含如本文所描述之核酸構築體。
術語「病毒載體」通常係指如本文所揭示之病毒顆粒之核酸部分，其可封裝於衣殼中以形成病毒顆粒用於遞送至諸如患者之宿主中。
本發明之病毒載體通常至少包含(i)核酸構築體，其包括轉殖基因及適用於其在宿主中表現之核酸元件；及(ii)病毒基因體之全部或一部分，例如病毒基因體之至少反向末端重複序列。
如本文所用，術語「反向末端重複序列(ITR)」係指位於病毒之5'端(5'ITR)的核苷酸序列及位於病毒之3'端(3'ITR)的核苷酸序列，其含有回文序列且可以摺疊以形成在DNA複製起始期間充當引子的T形髮夾結構。其亦為整合至宿主基因體中之病毒基因體所需；用於自宿主基因體補救；以及用於將病毒核酸衣殼化成成熟病毒顆粒。以順式之ITR為載體基因體複製及將其封裝至病毒顆粒中所需。
在一個實施例中，根據本發明之病毒載體包含病毒之5'ITR及3'ITR。
在一個實施例中，病毒載體包含病毒之5'ITR及3'ITR，該病毒獨立地選自由以下組成之群：微小病毒(特定言之，腺相關病毒)、腺病毒、α病毒、反轉錄病毒(特定言之，γ反轉錄病毒及慢病毒)、疱疹病毒及SV40；在一較佳實施例中，病毒為腺相關病毒(AAV)、腺病毒(Ad)或慢病毒。更佳地為AAV。
在一個實施例中，病毒載體包含AAV之5'ITR及3'ITR。
AAV作為一種潛在的人類基因療法載體引起了人們極大關注。病毒之有利特性為其與任何人類疾病缺乏關聯，其能夠感染分裂及非分裂細胞，且可感染來源於不同組織的廣泛細胞株。AAV基因體由含有4681鹼基之線性單股DNA分子構成。(Berns及Bohenzky, 1987, Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307)。基因體包括各端處之反向末端重複序列(ITR)，其以順式充當DNA複製起點且充當病毒之封裝信號。ITR長度為大約145 bp。
本發明之病毒載體中的AAV ITR可具有野生型核苷酸序列或可藉由一或多個核苷酸的插入、缺失或取代而改變，其與已知AAV ITR相比通常具有不超過5、4、3、2或1個核苷酸插入、缺失或取代。AAV載體之反向末端重複序列(ITR)之血清型可選自任何已知人類或非人類AAV血清型。
在特定實施例中，病毒載體可藉由使用任何AAV血清型之ITR來進行。已知AAV ITR包括(但不限於) AAV1、AAV2、AAV3 (包括3A及3B型)、AAV-LK03、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 (AAVrh10)、AAV11、AAV12、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV。亦包括自靈長類動物大腦鑑別之重組血清型，諸如Rec2及Rec3。
或者，本發明之病毒載體可包含合成5'ITR及/或3'ITR。
在一個實施例中，上述核酸構築體包含於該病毒載體中，該病毒載體進一步包含血清型AAV2之AAV的5'ITR及3'ITR。在一個特定實施例中，病毒載體包含血清型AAV2之AAV的5'ITR及3'ITR，較佳SEQ ID NO: 15及/或16，或與SEQ ID NO: 15及/或16具有至少80%或至少90%一致性之序列。
在一個實施例中，病毒載體包含如本文所描述之核酸構築體，其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。
在一個實施例中，5'ITR及/或3'ITR包含天然腺相關病毒(AAV)之ITR，諸如AAV2。
在一個較佳實施例中，5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
在一個特定實施例中，病毒載體包含包含有編碼GAT-1之轉殖基因的核酸構築體，該轉殖基因包含： a)  SEQ ID NO: 18、19、20；或 b) 與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列； 其中核酸構築體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； 其中該核酸構築體進一步包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳包含包含有SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列；且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。
在一個實施例中，5'ITR及/或3'ITR包含天然腺相關病毒(AAV)之ITR，諸如AAV2。
在一個較佳實施例中，5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
因此，在一個較佳實施例中，病毒載體包含包含有編碼GAT-1之轉殖基因的核酸構築體，該轉殖基因包含： a)  SEQ ID NO: 18、19、20；或 b) 與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或 c) 天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； 其中核酸構築體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； 其中該核酸構築體進一步包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳包含包含有SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列；且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR；其中該5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或該3'ITR包含SEQ ID NO: 23。更佳地，轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因，其包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，更佳包含SEQ ID NO: 15。
在一較佳實施例中，本發明提供一種病毒載體，其包含包含有編碼以下之轉殖基因的核酸構築體： i.   γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)，其包含SEQ ID NO: 18、19、20；或 ii.  與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或 iii. 天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； 其中該病毒載體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該病毒載體中所包含之核酸構築體包含聚腺苷酸化信號序列，且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。更佳地，轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 18之γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)。
在一較佳實施例中，本發明提供一種病毒載體，其包含包含有編碼以下之轉殖基因的核酸構築體： i.   γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)，其包含SEQ ID NO: 18、19、20；或 ii.  與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或 iii. 天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； 其中該病毒載體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該病毒載體中所包含之核酸構築體包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列，且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。更佳地，轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 18之γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種病毒載體，其包含包含有轉殖基因之核酸構築體，該轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因，其中該轉殖基因較佳包含： i.   SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，更佳SEQ ID NO: 15； ii.  或與SEQ ID NO: 15、26、27、28或29具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性之序列。 其中該病毒載體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該病毒載體中所包含之核酸構築體包含聚腺苷酸化信號序列，且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。更佳地，轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 18之γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種病毒載體，其包含包含有轉殖基因之核酸構築體，該轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因，其中該轉殖基因較佳包含： i.   SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，更佳SEQ ID NO: 15； ii.  或與SEQ ID NO: 15、26、27、28或29具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性之序列。 其中該病毒載體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該病毒載體中所包含之核酸構築體包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列，且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。更佳地，轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 18之γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)。
轉殖基因編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)且保留作為GAT-1之功能性，其中核酸構築體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID N之O: 4或SEQ ID NO: 14；其中該核酸構築體進一步包含聚腺苷酸化信號序列，較佳包含SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳包含包含有SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列；且其中該編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)轉殖基因參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳地選自以下之一或多個突變：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；Val578Ile。
本發明進一步提供一種病毒顆粒，其包含如本文中所描述之核酸構築體或病毒載體。
如本文所用，術語「病毒顆粒」係關於一種感染性且通常複製缺陷型病毒顆粒，其包含(i)封裝在其中之病毒載體(視情況包含包含有轉殖基因之核酸構築體)及(ii)衣殼。
在較佳實施例中，衣殼由腺相關病毒之衣殼蛋白形成。
腺相關病毒之病毒衣殼的蛋白質包括衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。各種AAV血清型之衣殼蛋白序列之間的差異引起不同細胞表面受體用於進入細胞之用途。與替代性胞內加工路徑組合，此產生各種AAV血清型之不同組織向性。
通常，AAV病毒係就其血清型而言提及。血清型對應於AAV之變異體亞種，其由於衣殼表面抗原之表現譜具有獨特反應性，其可用於將其與其他變異體亞種區分開來。AAV血清型包含AAV1、AAV2、AAV3 (包括A及B)、AAV-LK03、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 (AAVrh10)或AAV11或其組合，亦包括自靈長類動物大腦鑑別之重組血清型，諸如Rec2及Rec3。在本發明之病毒顆粒中，衣殼可衍生自任何AAV血清型及血清型組合(諸如來自AAV之VP1及來自不同血清型之VP2及/或VP3)。
在特定實施例中，用於根據本發明之病毒顆粒的衣殼蛋白之AAV血清型的實例包含AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAV2-逆向或AAVtt。
因此，在一個實施例中，根據本發明之病毒顆粒至少包含來自AAV之VP1衣殼蛋白，其中該衣殼蛋白較佳包含AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9 (諸如包含SEQ ID NO: 25之AAV9.hu14)、AAV10、AAV-真型(AAVtt，諸如包含SEQ ID NO: 24)或其組合。
AAVtt詳細描述於Tordo等人, Brain. 2018; 141(7): 2014-2031及WO 2015/121501，其以全文引用之方式併入本文中。
AAV血清型及變異體之評述可見於Choi等人(Curr Gene Ther. 2005; 5(3); 299-310)及Wu等人(Molecular Therapy. 2006; 14(3), 316-327)中。
在一較佳實施例中，病毒顆粒包含來自AAVtt之衣殼蛋白且較佳包含SEQ ID NO: 24或其與SEQ ID NO: 24至少98.5%，較佳99%或99.5%一致。
在另一較佳實施例中，病毒顆粒包含來自AAV9之衣殼蛋白且較佳包含SEQ ID NO: 25或其與SEQ ID NO: 25至少98.5%，較佳99%或99.5%一致。
用於本發明之AAV基因體或包括ITR序列、rep或cap基因之AAV基因體元件可衍生自AAV全基因體序列之以下寄存編號：腺相關病毒1 NC_002077，AF063497；腺相關病毒2 NC_001401；腺相關病毒3 NC_001729；腺相關病毒3B NC_001863；腺相關5病毒4 NC_001829；腺相關病毒5 Y18065,5AF085716；腺相關病毒6 NC_001862；禽類AAV ATCC VR-865 AY186198、AY629583、NC_004828；禽類AAV株DA-1 NC_006263、AY629583；牛AAV NC_005889、AY388617。
AAV病毒亦可就分枝系或純系而言參考。此係指天然衍生之AAV病毒的系統發育關係，且通常係指可追溯至共同祖先且包括其所有後代之AAV病毒的系統發育群。另外，AAV病毒可就特定分離株，亦即自然界中發現之特定AAV病毒之基因分離株而言來參考。
術語基因分離株描述與其他天然存在之AAV病毒進行有限基因混合之AAV病毒的群體，藉此在基因層面上定義可識別之獨特群體。可用於本發明之AAV分枝系及分離株之實例包括： •   分枝系A：AAV1 NC_002077、AF063497、AAV6 NC_001862、Hu. 48 AY530611、Hu 43 AY530606、Hu 44 AY530607、Hu 46 AY530609； •   分枝系B：Hu. 19 AY530584、Hu. 20 AY530586、Hu 23 AY530589、Hu22 AY530588、Hu24 AY530590、Hu21 AY530587、Hu27 AY530592、Hu28 AY530593、Hu 29 AY530594、Hu63 AYS30624、Hu64 AY530625、Hul3 AY530578、Hu56 AY530618、Hu57 AY530619、Hu49 AY530612、Hu58 25 AY530620、Hu34 AY530598、Hu35 AY530599、AAV2 NC_001401、Hu45 AY530608、Hu47 AY530610、Hu51 AY530613、Hu52 AY530614、Hu T41 AY695378、Hu S17 AY695376、Hu T88 AY695375、Hu T71 AY695374、HuT70 AY695373、Hu T40 AY695372、Hu T32 AY695371、Hu T17 AY695370、Hu LG15 AY695377； •   分枝系C：Hu9 AY530629、HulO AY530576、Hull AY530577、Hu53 AY530615、Hu55 AY530617、Hu54 AY530616、Hu7 AY530628、Hul8 AY530583、Hul5  AY530580、Hul6 AY530581、Hu25 AY530591、Hu60 AY530622、Ch5 AY243021、Hu3 AY530595,Hul AY530575、Hu4 AY530602 Hu2、AY530585、Hu61 AY530623； •   分枝系D：Rh62 AY530573、Rh48 AY530561、Rh54 AY530567、Rh55 AY530568、C5 y2 AY243020、AAV7 AF513851、Rh35 AY243000、Rh37 AY242998、Rh36 AY242999、Cy6 AY243016、Cy4 AY243018、Cy3 AY243019、Cy5 AY243017、Rhl3 AY243013； •   分枝系E：Rh38 AY530558、Hu66 AY530626、Hu42 AY530605、Hu67 AY530627、Hu40 AY530603、Hu41 AY530604、Hu37 AY530600、Rh40 10 AY530559、Rh2 AY243007、Bbl AY243023、Bb2 AY243022、RhlO AY243015、Hul7 AY530582、Hub AY530621、Rh25 AY530557、Pi2 AY530554、Pil AY530553、Pi3 AY530555、Rh57 AY530569、Rh50 AY530563、Rh49 AY530562、Hu39 AY530601、Rh58 AY530570、Rhbl AY530572、Rh52AY530565、Rh53 AY530566、Rh51 AY530564、Rh64 AY530574、Rh43 15 AY530560、AAV8 AF513852、Rh8 AY242997、Rhl AY530556；及 •   分枝系F：Hu 14 (AAV9) AY530579、Hu31 AY530596、Hu32 AY530597；純系分離株AAV5 Y18065、AF085716、AAV 3 NC_001729、AAV 3B NC_001863、AAV4 15 NC_001829、Rh34 AY243001、Rh33 AY243002、Rh32 AY243003。
技術人員可基於其公共常識選擇用於本發明之適當的AAV之血清型、變異體、分枝系、純系或分離株。然而，應理解，本發明亦涵蓋尚未經鑑別或表徵之其他血清型之AAV基因體的用途。
本發明涵蓋在相同載體內來自不同AAV血清型、分枝系、純系或分離株的衣殼蛋白序列的用途。本發明亦涵蓋將一種血清型之基因體封裝至另一血清型之衣殼中，亦即假模式化。嵌合、改組或衣殼改質衍生物可經選擇以提供一或多個所需功能。因此，與包含天然存在之AAV衣殼(諸如AAV2之AAV衣殼)的AAV病毒載體相比，此等衍生物可呈現增加之基因傳遞效率、降低之免疫原性(體液或細胞)、改變之向性範圍及/或改良之特定細胞類型靶向。增加的基因傳遞效率可受細胞表面處改良之受體或共受體結合、改良之內化、改良之細胞內及至細胞核中之遷移、改良之病毒顆粒之脫殼及改良之單股基因體至雙股形式之轉化影響。增加的效率亦可關於改變之向性範圍或特定細胞群體靶向，使得載體劑量不藉由投與至不需要其之組織來稀釋。
嵌合衣殼蛋白包括藉由天然存在之AAV血清型的兩個或更多個衣殼編碼序列之間的重組產生的那些嵌合衣殼蛋白。此可例如藉由標記補救方法執行，其中一種血清型之非感染性衣殼序列經不同血清型之衣殼5序列共轉染，且使用定向選擇來選擇具有所需特性之衣殼序列。不同血清型之衣殼序列可藉由細胞內之同源重組來改變，以產生新穎嵌合衣殼蛋白。
嵌合衣殼蛋白亦包括藉由工程改造衣殼蛋白序列以在兩種或更多種衣殼蛋白之間，例如在不同血清型之兩種或更多種衣殼蛋白之間轉移特定衣殼蛋白域、表面環或特定胺基酸殘基所產生之彼等嵌合衣殼蛋白。改組或嵌合衣殼蛋白亦可藉由DNA改組或藉由易錯PCR產生。可藉由以下方式產生混合型AAV衣殼基因：將相關AAV基因之序列例如編碼多種不同血清型之衣殼蛋白的彼等序列隨機分割且隨後在自引發聚合酶反應中重組該等片段，其亦可在序列同源性區域中引起交叉。可篩選以此方式藉由改組數種血清型之衣殼基因產生之混合型AAV基因文庫以鑑別具有所需功能性之病毒純系。類似地，易錯PCR可用於隨機突變AAV衣殼基因以產生不同變異體文庫，其可隨後根據所需特性選擇。
衣殼基因之序列亦可經遺傳修飾以相對於天然野生型序列引入特定缺失、取代或插入。特定言之，衣殼基因可以藉由將不相關蛋白質或肽之序列插入衣殼編碼序列之開放閱讀框架內，或在衣殼編碼序列之N端及/或C端處進行修飾。不相關蛋白質或肽可有利地為充當特定細胞類型之配位體的蛋白質或肽，藉此賦予改良之與靶細胞的結合或改善病毒顆粒靶向特定細胞群體之特異性。不相關蛋白質亦可為作為生產過程之一部分幫助純化病毒顆粒的蛋白質，亦即抗原決定基或親和標籤。插入位點將通常經選擇以不干擾病毒顆粒之其他功能，例如病毒顆粒之內部化、遷移。熟習此項技術者可基於其公共常識鑑別適用於插入之位點。特定位點揭示於上文提及之Choi等人中。
在一些實施例中，根據本發明之病毒顆粒可藉由將來源於特定AAV血清型之AAV載體/基因體的病毒載體或工程化病毒載體封裝在由對應於相同特定血清型之AAV之天然Cap蛋白質形成的病毒顆粒中來製備。然而，已研發出若干種技術來修飾及改善天然存在之病毒顆粒之結構及功能特性。(Bünning H等人, J Gene Med 2008; 10: 717-733)。因此，在另一實施例中，根據本發明之病毒顆粒包括包含編碼GAT-1之轉殖基因下核酸構築體，側接給定AAV血清型之ITR的病毒載體封裝至以下各者中，例如：a)由衍生自相同或不同AAV血清型之衣殼蛋白(例如AAV2 ITR及AAV9衣殼蛋白；AAV2 ITR及AAVtt衣殼蛋白)構成之病毒顆粒；b)由來自不同AAV血清型之衣殼蛋白或突變體之混合物(例如AAV2 ITR具有由兩種或多種AAV血清型之蛋白形成的衣殼)構成之嵌合體病毒顆粒；c)由已藉由不同AAV血清型之間的結構域交換截短之衣殼蛋白或變異體構成之嵌合病毒顆粒(例如具有AAV3域之AAV2 ITR與AAV5衣殼蛋白)；或d)病毒顆粒，其經工程改造以顯示選擇性結合域，使得能夠與靶細胞特異性受體進行嚴格相互作用。
靶向CNS之基於AAV之基因療法已評述於Pignataro D, Sucunza D, Rico AJ等人, J Neural Transm 2018;125:575-589中。更特定言之，可選擇及/或工程改造AAV顆粒以至少靶向腦及CNS之神經元及微神經膠質細胞。
在特定實施例中，用於根據本發明之AAV病毒顆粒的衣殼蛋白之AAV血清型的實例包含AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9 (諸如包含SEQ ID NO: 25)、AAV10、AAV-真型(AAVtt，諸如包含SEQ ID NO: 24)或其組合。在更佳實施例中，衣殼蛋白之該AAV血清型係選自AAV9或AAVtt血清型。
亦命名為AAV2-真型衣殼之AAVtt衣殼描述於例如WO2015/121501中。在一個實施例中，AAVtt VP1衣殼蛋白包含至少一個相對於野生型AAV VP1衣殼蛋白之胺基酸取代，其位置與AAV2蛋白序列(NCBI參考序列：YP_680426.1)中之以下位置中之一或多者對應：125、151、162、312、457、492、499、533、546、548、585，588及/或593，更特定言之，AAVtt包含相對於野生型AAV2 VP1衣殼蛋白(NCBI參考序列：YP_680426.1)之以下胺基酸取代中之一或多者：V125I、V151A、A162S、T205S、N312S、Q457M、S492A、E499D、F533Y、G546D、E548G、R585S、R588T及/或A593S。在一個特定實施例中，AAVtt在位置457、492、499及533處包含相對於野生型AAV2 VP1衣殼蛋白之四個或更多個突變。
在一特定實施例中，視情況與本文所描述之各種實施例之一或多個特徵組合，病毒顆粒包含如上文所描述之病毒載體，其較佳地包含核酸構築體，該核酸構築體包含編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)之轉殖基因，其包含i) SEQ ID NO: 18、19、20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile；且包含AAV9血清型或AAVtt血清型之衣殼蛋白，較佳AAVtt血清型之衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性的胺基酸序列。
在另一實施例中，病毒顆粒包含包含有核酸構築體之病毒載體，該核酸構築體包含編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)之轉殖基因，其包含i) SEQ ID NO: 18、19、20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個選自由以下組成之群的突變：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；Val578Ile；且包含AAV9血清型或AAVtt血清型之衣殼蛋白，較佳AAVtt血清型之衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性的胺基酸序列。
在另一特定實施例中，視情況與本文所描述之各種實施例之一或多個特徵組合，病毒顆粒包含如上文所描述之病毒載體，其較佳地包含核酸構築體，該核酸構築體包含編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)之轉殖基因，其包含i) SEQ ID NO: 18、19、20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile，且包含AAV9血清型或AAVtt血清型之衣殼蛋白，較佳AAV 9血清型之衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性的胺基酸序列。
在另一實施例中，病毒顆粒包含包含有核酸構築體之病毒載體，該核酸構築體包含編碼γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)之轉殖基因，其包含i) SEQ ID NO: 18、19、20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個選自由以下組成之群的突變：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；Val578Ile；且包含AAV9血清型或AAVtt血清型之衣殼蛋白，較佳AAV 9血清型之衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性的胺基酸序列。
在一個較佳實施例中，病毒顆粒包含核酸構築體，其包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個如表3中所示之突變； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7； f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列，較佳為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成； 其中該病毒顆粒較佳包含AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
在另一較佳實施例中，病毒顆粒包含核酸構築體，其包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含PGK啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
在另一較佳實施例中，病毒顆粒包含核酸構築體，其包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含PGK啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列，較佳為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成； 其中該病毒顆粒較佳包含AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
在另一較佳實施例中，病毒顆粒包含核酸構築體，其包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19、20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個如表3中所示之突變； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7； f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列，較佳為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成； 其中該病毒顆粒較佳包含AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
在另一較佳實施例中，病毒顆粒包含核酸構築體，其包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含PGK啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
在另一較佳實施例中，病毒顆粒包含核酸構築體，其包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含PGK啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列，較佳為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成； 其中該病毒顆粒較佳包含AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
在另一較佳實施例中，病毒顆粒包含核酸構築體，其包含： A)  編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15、26、27、28或29具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性之序列；或 B)   編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； 其中該病毒顆粒包含AAVtt之衣殼蛋白，其較佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列。
在另一較佳實施例中，病毒顆粒包含核酸構築體，其包含： A)  編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15、26、27、28或29具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性之序列；或 B)   編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； 其中該病毒顆粒包含AAV9之衣殼蛋白，其較佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列。
重組AAV病毒顆粒之產生在此項技術中通常已知且已描述於例如US 5,173,414及US5,139,941；WO 92/01070、WO 93/03769、Lebkowski等人, (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996；Vincent等人, (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129；及Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801。
如上文所描述之攜有病毒載體及核酸構築體之病毒顆粒的產生可藉助於習知方法及方案進行，該等方法及方案係考慮針對待產生之病毒顆粒之實際實施例所選擇的結構特徵加以選擇。
簡言之，病毒顆粒可在用待封裝之核酸構築體或病毒載體轉染之宿主細胞中，更特定言之在特定產生病毒之細胞(封裝細胞)中，在輔助載體或病毒或其他DNA構築體存在下產生。
如本文所用之術語「封裝細胞」係指可經本發明之核酸構築體或病毒載體轉染且以反式提供病毒載體之完整複製及封裝所需的所有缺失功能的細胞或細胞株。通常，封裝細胞以組成性或誘導性方式表現該等缺失病毒功能中之一或多者。該等封裝細胞可為黏附或懸浮細胞。
典型地，產生病毒顆粒之方法包含以下步驟： a)    在培養基中培養包含如上文所描述之核酸構築體或病毒載體之封裝細胞；及 b)   自該細胞培養物上清液及/或在該等細胞內部採集該等病毒顆粒。
習知方法可用於產生病毒顆粒，其由以下組成：用攜帶編碼GAT-1之轉殖基因的核酸構築體或表現載體(例如質體)共轉染短暫細胞；編碼rep及cap基因但不攜帶ITR序列之核酸構築體(例如AAV輔助質體)；及提供AAV複製所需之腺病毒功能的第三核酸構築體(例如質體)。AAV複製所需之病毒基因在本文中稱為病毒輔助基因。通常，AAV複製所需之該基因為腺病毒輔助基因，諸如E1A、E1B、E2a、E4或VA RNA。較佳地，腺病毒輔助基因為Ad5或Ad2血清型。
亦可例如藉由用重組桿狀病毒之組合感染昆蟲細胞來進行根據本發明之AAV顆粒的大規模生產(Urabe等人, Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943)。SF9細胞經分別表現待封裝之AAV rep、AAV cap及AAV載體之三種桿狀病毒載體共感染。重組桿狀病毒載體將提供病毒複製及/或封裝所需的病毒輔助基因功能。Smith等人2009 (Molecular Therapy, 第17卷, 第11期, 第1888-1896頁)進一步描述用於昆蟲細胞中AAV顆粒之大規模生產的雙重桿狀病毒表現系統。
適合培養基將為熟習此項技術者已知。構成此類培養基之成分可視待培養細胞之類型而變化。除營養組成以外，容積滲透濃度及pH值視為培養基之重要參數。細胞生長培養基包含熟習此項技術者熟知之多種成分，包括胺基酸、維生素、有機及無機鹽、碳水化合物來源、脂質、微量元素(僅舉幾例，CuS04、FeS04、Fe(N03)3、ZnS04)，各成分以支持活體外培養細胞(亦即細胞存活及生長)之量存在。成分亦可包括不同輔助物質，諸如緩衝物質(如碳酸氫鈉、Hepes、Tris或類似性能緩衝液)、氧化穩定劑、抵消機械應力之穩定劑、蛋白酶抑制劑、動物生長因子、植物水解劑、抗結塊劑、消泡劑。細胞生長培養基之特徵及組成視特定細胞需求而變化。市售細胞生長培養基之實例為：MEM (最小必需培養基)、BME (基礎伊格爾培養基(Basal Medium Eagle)) DMEM (達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's Medium))、Iscoves DMEM (伊斯寇氏改良達爾伯克培養基(Iscove's modification of Dulbecco's Medium))、GMEM、RPMI 1640、Leibovitz L-15、麥考伊培養基199 (McCoy's Medium 199)、Ham(哈姆氏培養基(Ham's Media)) F10及衍生物，Ham F12、DMEM/F12等。
根據本發明使用之病毒載體之建構及產生的進一步指導可見於用於基因療法、方法及方案之病毒載體中。系列：Methods in Molecular Biology, 第737卷. Merten及Al-Rubeai (編); 2011 Humana Press (Springer)；Gene Therapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag；Heilbronn R.及Weger S. Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics. In: Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology 197; M. Schäfer-Korting (編). 2010 Springer-Verlag; 第143-170頁；Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols. R.O. Snyder及P. Moulllier (編). 2011 Humana Press (Springer)；Bünning H.等人, Recent developments in adeno-associated virus technology. J. Gene Med. 2008; 10:717-733；Adenovirus: Methods and Protocols. M. Chillón and A. Bosch (編); 第三版. 2014 Humana Press (Springer)。
本發明亦關於包含如上文所描述之核酸構築體或編碼GAT-1之病毒載體的宿主細胞。更特定言之，根據本發明之宿主細胞為特異性產生病毒之細胞，亦命名為在輔助載體或病毒或其他DNA構築體存在下經如上文所描述之核酸構築體或病毒載體轉染的封裝細胞，且以反式提供病毒顆粒之完整複製及封裝所需的所有缺失功能。該等封裝細胞可為黏附或懸浮細胞。
例如，該等封裝細胞可為真核細胞，諸如哺乳動物細胞，包括猿猴、人類、犬及嚙齒動物細胞。人類細胞之實例為PER.C6細胞(WO01/38362)、MRC-5 (ATCC CCL-171)、WI-38 (ATCC CCL-75)、HEK-293細胞(ATCC CRL-1573)、HeLa細胞(ATCC CCL2)及胚胎恆河猴肺細胞(ATCC CL-160)。非人類靈長類細胞之實例為Vero細胞(ATCC CCL81)、COS-1細胞(ATCC CRL-1650)或COS-7細胞(ATCC CRL-1651)。犬細胞之實例為MDCK細胞(ATCC CCL-34)。嚙齒動物細胞之實例為倉鼠細胞，諸如BHK21-F、HKCC細胞或CHO細胞。
作為哺乳動物來源之替代方案，用於產生病毒顆粒之封裝細胞可衍生自禽類來源，諸如雞、鴨、鵝、鵪鶉或野雞。禽類細胞株之實例包括禽類胚胎幹細胞(WO01/85938及WO03/076601)、永生化鴨視網膜細胞(WO2005/042728)，及禽類胚胎幹細胞源性細胞，包括雞細胞(WO2006/108846)或鴨細胞，諸如EB66細胞株(WO2008/129058及WO2008/142124)。
在另一實施例中，細胞可為任何容許桿狀病毒感染及複製之封裝細胞。在一特定實施例中，該細胞為昆蟲細胞，諸如SF9細胞(ATCC CRL-1711)、Sf21細胞(IPLB-Sf21)、MG1細胞(BTI-TN-MG1)或High Five TM細胞(BTI-TN-5B1-4)。
因此，在一特定實施例中，視情況與上文或下文所描述之各種實施例之一或多個特徵組合，宿主細胞包含： a.    包含編碼如本文所描述之人類GAT-1之轉殖基因的核酸構築體或病毒載體， b.    編碼AAV rep及/或cap基因的核酸構築體，例如質體，不攜有ITR序列；及視情況 c.    包含病毒輔助基因之核酸構築體，例如質體或病毒。
在另一態樣中，本發明係關於經本文中所描述之病毒顆粒轉導的宿主細胞，且如本文中所使用之術語「宿主細胞」係指對所關注之病毒感染敏感且能夠活體外培養的任何細胞株。
在一個其他態樣中，本發明因此提供一種包含核酸構築體之質體，該核酸構築體包含： a)  編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； b)  可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； c)  聚腺苷酸化信號序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在本發明之另一態樣中，提供一種用於產生病毒顆粒之宿主細胞，其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： a)  編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； b)  可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； c)  聚腺苷酸化信號序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在此態樣之一個實施例中，宿主細胞進一步包含： a.    編碼AAV rep及/或cap基因的核酸構築體，較佳質體，不攜有ITR序列；及視情況 b.    包含病毒輔助基因之核酸構築體，例如質體或病毒； 其中該等AAV rep及/或cap基因編碼i) AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或ii) AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列。
在本發明之另一態樣中，提供一種產生病毒顆粒之方法，該方法包含以下步驟： a.    培養包含核酸構築體之宿主細胞；及 b.    自該宿主細胞培養基及/或在該等宿主細胞內部採集該等病毒顆粒； 其中核酸構築體包含： a)  編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； b)  可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； c)  聚腺苷酸化信號序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含本文中所描述之核酸構築體、或病毒載體、或病毒顆粒或宿主細胞，以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意謂經監管機構或公認藥典(諸如歐洲藥典)批准用於動物及/或人類。術語「賦形劑」係指與治療劑一起投與之稀釋劑、佐劑、載劑或媒劑。
任何適合之醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑可用於製備醫藥組合物(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (編) Mack Publishing Company, 1997四月)。醫藥組合物在製造及儲存條件下通常無菌且穩定。醫藥組合物可調配為溶液(例如，鹽水、右旋糖溶液或緩衝溶液或其他醫藥學上可接受之無菌流體)、微乳液、脂質體或適合於容納高產物濃度之其他有序結構(例如，微粒或奈米粒子)。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可以例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。在許多情況下，在組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。
較佳地，該醫藥組合物調配為溶液，更佳調配為視情況選用之緩衝鹽水溶液。補充活性化合物亦可併入本發明之醫藥組合物中。例如，可以在加拿大藥劑師協會之醫藥及專業綱要(CPS)中找到關於共同投與的指南。
在一個實施例中，醫藥組合物為適用於腦實質內、大腦內、靜脈內或鞘內投與之組合物。此等醫藥組合物僅為例示性的且不限制適用於其他腸胃外及非腸胃外投與途徑之醫藥組合物。本文所描述之醫藥組合物可以單一單位劑量或以多劑量形式封裝。
在本發明之一個較佳實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑，其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： a)  編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； b)  可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； c)  聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在另一較佳實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑，其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： a)  編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； b)  可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含PGK啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14； c)  聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在另一較佳實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含病毒顆粒與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之組合，該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在另一較佳實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑，其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： a)  編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； b)  可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含PGK啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14； c)  聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在其他實施例中，醫藥組合物包含與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑組合之如本文所描述之病毒載體或核酸構築體。
本發明之其他態樣提供用於療法中之本文所描述之病毒顆粒、病毒載體或核酸構築體。
在一個態樣中，本發明提供一種病毒顆粒或一種包含該病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、UbC啟動子、PGK啟動子、EF1a啟動子、MECP2啟動子、hNSE啟動子、hSyn啟動子、CamKII啟動子、hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7； f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含以下之衣殼蛋白： 1.    AAVtt，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或 2.    AAV9，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%，更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23；其中病毒顆粒或包含病毒顆粒之醫藥組合物用於療法中。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
較佳地，在療法中之用途係用於治療肌痙攣失張力癲癇症(MAE)、MEA樣及其他癲癇症適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種病毒顆粒或一種包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7； f.     SEQ ID NO: 8；或 g.    SEQ ID NO: 9；或 h.    SEQ ID NO: 10；或 i.     SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.     SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含以下之衣殼蛋白： 1.    AAVtt，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或 2.    AAV9，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%，更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23；其中病毒顆粒或包含病毒顆粒之醫藥組合物用於治療由SLC6A1損傷導致的疾病，該等疾病包含單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症；諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種病毒顆粒或一種包含該病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含PGK啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 4，或內源性人類SLC6A1啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含以下之衣殼蛋白： 1.    AAVtt，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或 2.    AAV9，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%，更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23；其中病毒顆粒或包含該病毒顆粒之醫藥組合物用於治療由SLC6A1損傷導致的疾病，該等疾病包含單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在另一較佳實施例中，本發明提供一種病毒顆粒或一種包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含以下之衣殼蛋白： 1.    AAVtt，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或 2.    AAV9，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%，更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列；其中病毒顆粒或包含該病毒顆粒之醫藥組合物用於治療由SLC6A1損傷導致的疾病，該等疾病包含單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療以下疾病之方法：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合，該方法包含向個體投與治療有效量之病毒顆粒或包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile；及 B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；SEQ ID NO: 8；或 f.     SEQ ID NO: 9；或 g.    SEQ ID NO: 10；或 h.    SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 i.     SEQ ID NO: 14；及 C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在一較佳實施例中，本發明提供一種用於治療以下疾病之方法：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合，該方法包含向個體投與治療有效量之病毒顆粒或包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含PGK啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 4，或內源性人類SLC6A1啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含以下之衣殼蛋白： 1.    AAVtt，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或 2.    AAV9，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%，更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在另一較佳實施例中，本發明提供一種用於治療以下疾病之方法：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合，該方法包含向個體投與治療有效量之病毒顆粒或包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile；及 B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；及 C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含以下之衣殼蛋白： 1.    AAVtt，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或 2.    AAV9，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%，更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
如本文中可互換使用，術語「個體」或「患者」係指哺乳動物。可受益於所揭示之治療或用於療法中之方法的哺乳動物物種包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物，諸如猿；黑猩猩；猴及紅毛猩猩，家養動物，包括狗及貓，以及家畜，諸如馬、牛、豬、綿羊及山羊，或其他哺乳動物物種，包括但不限於小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、倉鼠及其類似物。較佳地，術語「個體」或「患者」係指人類個體或人類患者且甚至更佳地，該人類個體或人類患者為新生兒、嬰兒、兒童或青少年。
「治療有效量」係指一定量之病毒顆粒(包含轉殖基因)，視情況在醫藥調配物內，或包含此類病毒顆粒之醫藥調配物之量，其在向哺乳動物或患者或個體投與時實現所需治療結果，諸如以下治療結果中之一或多者： •   不同癲癇類型(諸如失神、失張力/「跌落發作」、肌陣攣癲癇、全身性癲癇、單純部分癲癇、發熱性癲癇、嬰兒痙攣或其組合)顯著減少； •   顯著達成無癲癇發作； •   發育延遲、語言受損、注意力不足過動症(ADHD)、刻板動作、自閉症及共濟失調特徵顯著減少。
在另一態樣中，本發明提供病毒顆粒或包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物的用途，以製造供治療以下疾病用之藥劑：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合；其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile；及 B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含CAG啟動子、或UbC啟動子、或PGK啟動子、或EF1a啟動子、或MECP2啟動子、或hNSE啟動子、或hSyn啟動子、或CamKII啟動子、或hDLX啟動子或內源性人類SLC6A1啟動子；其中該啟動子較佳包含： a.    SEQ ID NO: 1或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.    SEQ ID NO: 3；或 c.    SEQ ID NO: 4；或 d.    SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.    SEQ ID NO: 7；或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；SEQ ID NO: 8；或 f.     SEQ ID NO: 9；或 g.    SEQ ID NO: 10；或 h.    SEQ ID NO: 11或在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11或較佳在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12在5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 i.     SEQ ID NO: 14；及 C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%，較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在一較佳實施例中，提供有病毒顆粒或包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物的用途，以製造供治療以下疾病用之藥劑：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合；其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；其中該啟動子包含PGK啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 4，或內源性人類SLC6A1啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含以下之衣殼蛋白： 1.    AAVtt，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或 2.    AAV9，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%，更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列，較佳腺相關病毒之5'ITR及3'ITR序列，更佳5'ITR及3'ITR序列；且其中5'ITR及3'ITR序列中之每一者獨立地包含序列SEQ ID NO: 22或23或與SEQ ID NO: 22及/或23具有至少80%或至少90%一致性之序列或由其組成，其中較佳地5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在另一實施例中，提供有病毒顆粒或包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物的用途，以製造供治療以下疾病用之藥劑：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合；其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile；及 B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子；及 C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含以下之衣殼蛋白： 1.    AAVtt，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或 2.    AAV9，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%，更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
以上方法及用途尤其適合於治療以下疾病：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合。
在較佳實施例中，本文所揭示之方法及用途較佳亦用於恢復GAT-1功能，更佳在GABA能突觸處及/或沿軸突或神經纖維網或星形膠質細胞復原GAT-1功能。
在另一較佳實施例中，本文所揭示之方法及用途較佳亦用於降低癲癇頻率或用於恢復GAT-1功能且降低癲癇頻率。
如本文所用，由SLC6A1損傷引起所導致以下的疾病：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症；諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合，亦可藉由已知基因突變來鑑別。
在一個實施例中，由SLC6A1損傷引起之疾病與患者中導致病理性GAT-1變異體之至少一種突變相關，其中該等病理性GAT-1變異體包含一個突變或突變組合。
如本文所用，術語「病理性GAT-1變異體」意謂在患者樣品中發現且經由若干資料收集方法鑑定之GAT-1變異體，包括臨床測試、研究，且其報導為與病理性表型相關，諸如以下中之任一者：伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症；諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合。
在一較佳實施例中，該突變參考SEQ ID NO: 18，包含一或多種選自由以下組成之群之突變：R44W、R44Q、R50L、D52E、D52V、F53S、S56F、G63S、N66D、G75R、G79R、G79V、F92S、G94E、G105S、Q106R、G112V、Y140C、C173Y、G232V、F270S、R277H、A288V、S295L、G297R、A305T、G307R、V323I、A334P、V342M、A357V、G362R、L366V、A367T、F385L、G393S、S456R、S459R、M487T、V511L、G550R或其組合。
此等突變亦說明於下文實例部分中之表2A及表2B中。
因此，在一個實施例中，提供一種病毒顆粒或一種包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列；或iii)天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含i) AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或ii) AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列；其中該病毒顆粒或包含該病毒顆粒之醫藥組合物用於治療由SLC6A1損傷引起之疾病，該疾病包含：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合；其中該由SLC6A1損傷引起之疾病與患者中導致病理性GAT-1變異體之至少一種突變相關，其中該等病理性GAT-1變異體包含一個突變或突變組合，且其中該突變參考SEQ ID NO: 18，較佳包含一或多種選自由以下組成之群的突變：R44W、R44Q、R50L、D52E、D52V、F53S、S56F、G63S、N66D、G75R、G79R、G79V、F92S、G94E、G105S、Q106R、G112V、Y140C、C173Y、G232V、F270S、R277H、A288V、S295L、G297R、A305T、G307R、V323I、A334P、V342M、A357V、G362R、L366V、A367T、F385L、G393S、S456R、S459R、M487T、V511L、G550R或其組合。
在另一實施例中，病毒顆粒或包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，其中該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子為PGK啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 4，或內源性人類SLC6A1啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含i) AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或ii) AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列；其中該病毒顆粒或包含該病毒顆粒之醫藥組合物用於治療由SLC6A1損傷引起之疾病，該疾病包含：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合；其中該由SLC6A1損傷引起之疾病與患者中導致病理性GAT-1變異體之至少一種突變相關，其中該等病理性GAT-1變異體包含一個突變或突變組合，且其中該突變參考SEQ ID NO: 18，較佳包含一或多種選自由以下組成之群的突變：R44W、R44Q、R50L、D52E、D52V、F53S、S56F、G63S、N66D、G75R、G79R、G79V、F92S、G94E、G105S、Q106R、G112V、Y140C、C173Y、G232V、F270S、R277H、A288V、S295L、G297R、A305T、G307R、V323I、A334P、V342M、A357V、G362R、L366V、A367T、F385L、G393S、S456R、S459R、M487T、V511L、G550R或其組合。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療以下疾病之方法：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合，該方法包含向個體投與治療有效量之病毒顆粒或包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15或編碼人類GAT-1之序列，其中人類GAT-1包含i) SEQ ID NO: 18、19或20；或ii)與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留作為GAT-1之功能性的序列； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含i) AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或ii) AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列；其中該由SLC6A1損傷引起之疾病與患者中導致病理性GAT-1變異體之至少一種突變相關，其中該等病理性GAT-1變異體包含一個突變或突變組合，且其中該突變參考SEQ ID NO: 18，較佳包含一或多種選自由以下組成之群的突變：R44W、R44Q、R50L、D52E、D52V、F53S、S56F、G63S、N66D、G75R、G79R、G79V、F92S、G94E、G105S、Q106R、G112V、Y140C、C173Y、G232V、F270S、R277H、A288V、S295L、G297R、A305T、G307R、V323I、A334P、V342M、A357V、G362R、L366V、A367T、F385L、G393S、S456R、S459R、M487T、V511L、G550R或其組合。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療以下疾病之方法：單基因癲癇，諸如伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合，該方法包含向個體投與治療有效量之病毒顆粒或包含病毒顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物，該病毒顆粒包含核酸構築體，該核酸構築體包含： A) 編碼人類GAT-1之轉殖基因；其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15； B) 可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子為PGK啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 4，或內源性人類SLC6A1啟動子，較佳包含SEQ ID NO: 14； C) 聚腺苷酸化信號序列； 其中該病毒顆粒較佳包含i) AAVtt之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列；或ii) AAV9之衣殼蛋白，且更佳包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列； 其中該核酸構築體包含於病毒載體中，該病毒載體進一步包含5'ITR及3'ITR序列；其中該由SLC6A1損傷引起之疾病與患者中導致病理性GAT-1變異體之至少一種突變相關，其中該等病理性GAT-1變異體包含一個突變或突變組合，且其中該突變參考SEQ ID NO: 18，較佳包含一或多種選自由以下組成之群的突變：R44W、R44Q、R50L、D52E、D52V、F53S、S56F、G63S、N66D、G75R、G79R、G79V、F92S、G94E、G105S、Q106R、G112V、Y140C、C173Y、G232V、F270S、R277H、A288V、S295L、G297R、A305T、G307R、V323I、A334P、V342M、A357V、G362R、L366V、A367T、F385L、G393S、S456R、S459R、M487T、V511L、G550R或其組合。
較佳地，聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列，更佳為包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少95%、96%、97%、98%、較佳98.5%、更佳99%或99.5%一致性之序列或由其組成。
本文所描述之治療方法及治療中之用途可與丙戊酸鹽及迄今已知之任何及所有其他潛在抗癲癇藥物(AED)以及基於神經調節之治療(迷走神經刺激、大腦深度刺激)及產酮飲食或類似者組合投與。
包含投與本發明之病毒顆粒或進一步包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑之其組合物的療法之劑量可根據不同參數測定，尤其根據待治療之患者之年齡、體重及病況；投與途徑；及所需方案。醫師將能夠判定任何特定患者之所需投與途徑及劑量。
本發明之核酸構築體、病毒載體、病毒顆粒或醫藥組合物可視情況經由使用目的特異性之投與裝置投與至患者之腦及/或腦脊髓液(CSF)。向腦之遞送可選自大腦內遞送、腦實質內遞送、皮質內遞送、海馬體內遞送、殼核內遞送、小腦內遞送及其組合。CSF之遞送可選自腦池內遞送、鞘內遞送、腦室內(ICV)遞送及其組合。向患者腦及/或腦脊髓液(CSF)之遞送可藉由注射進行。向腦之注射可選自大腦內注射、腦實質內注射、皮質內遞送、海馬體內遞送、殼核內注射、小腦內遞送及其組合。CSF之遞送可選自腦池內注射、鞘內注射、腦室內(ICV)注射及其組合。
本發明之核酸構築體、載體、病毒載體或醫藥組合物之劑量可以單次劑量提供，但可在載體可能尚未靶向正確區域之情況下重複。治療較佳為單次注射，但可考慮重複注射，例如未來數年及/或用不同AAV血清型。
本發明中所包括之序列展示於表1中： 表 1
序列識別符及名稱 序列
SEQ ID NO: 1 CAG 1.6kb 啟動子 CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTATGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
SEQ ID NO: 2 嵌合內含子(CBA + RbG) GGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTTTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG
SEQ ID NO: 3 UbC啟動子 GGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCGTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGCCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTTGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGAC
SEQ ID NO: 4 PGK啟動子 ACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCG
SEQ ID NO: 5 EF1a啟動子加內含子    GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCACTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGTGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGTGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCAGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGCCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCACAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCCAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
SEQ ID NO: 6 EF1a內含子 GTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGTGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGTGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCAGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGCCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCACAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCCAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG
SEQ ID NO: 7 MECP2啟動子 AGCTGAATGGGGTCCGCCTCTTTTCCCTGCCTAAACAGACAGGAACTCCTGCCAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGC
SEQ ID NO: 8 hNSE啟動子    ATGCAGCTGGACCTAGGAGAGAAGCAGGAGAGGAAGATCCAGCACAAAAAATCCGAAGCTAAAAACAGGACACAGAGATGGGGGAAGAAAAGAGGGCAGAGTGAGGCAAAAAGAGACTGAAGAGATGAGGGTGGCCGCCAGGCACTTTAGATAGGGGAGAGGCTTTATTTACCTCTGTTTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAGGTAGTCTTGCTTAGTCTCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTCAGCTCACTGCAACTTCCACCTCCTGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCATGCAACCGCGCCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAAACGGGGTTTCACCACGTTAGCCAGGATGGTCTGGATCTCCTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTCCGCCTTCCAAAGTGCTGGGATTACAGGGGTGAGCCACAGCGCCTGGTCCCTATTTACTTCTGTCTTCTACCTCCAGGAGATCAAAGACGCTGGCCTTCAGACCTGATCAGACTCCCAGGGGCAGCCACCACATGTATGACAGAGAACAGAGGATGCCTGTTTTTGCCCCAAAGCTGGAAATTCATCACAACCTGAGGCCCAGGATCTGCTCTGTGCCGGTCCTCTGGGCAGTGTGGGGTGCAGAATGGGGTGCCTAGGCCTGAGCGTTGCCTGGAGCCTAGGCCGGGGGCCGCCCTCGGGCAGGCGTGGGTGAGAGCCAAGACCGCGTGGGCCGCGGGGTGCTGGTAGGAGTGGTTGGAGAGACTTGCGAAGGCGGCTGGGGTGTTCGGATTTCCAATAAAGAAACAGAGTGATGCTCCTGTGTCTGACCGGGTTTGTGAGACATTGAGGCTGTCTTGGGCTTCACTGGCAGTGTGGGCCTTCGTACCCGGGCTACAGGGGTGCGGCTCTGCCTGTTACTGTCGAGTGGGTCGGGCCGTGGGTATGAGCGCTTGTGTGCGCTGGGGCCAGGTCGTGGGTGCCCCCACCCTTCCCCCATCCTCCTCCCTTCCCCACTCCACCCTCGTCGGTCCCCCACCCGCGCTCGTACGTGCGCCTCCGCCGGCAGCTCCTGACTCATCGGGGGCTCCGGGTCACATGCGCCCGCGCGGCCCTATAGGCGCCTCCTCCGCCCGCCGCCCGGGAGCCGCAGCCGCCGCCGCCACTGCCACTCCCGCTCTCTCAGCGCCGCCGTCGCCACCGCCACCGCCACCGCCACTACCACCGAGATCTGCGATCTAAGTAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCC
SEQ ID NO: 9 hSyn啟動子 AGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG
SEQ ID NO: 10 CamKII啟動子 CATTATGGCCTTAGGTCACTTCATCTCCATGGGGTTCTTCTTCTGATTTTCTAGAAAATGAGATGGGGGTGCAGAGAGCTTCCTCAGTGACCTGCCCAGGGTCACATCAGAAATGTCAGAGCTAGAACTTGAACTCAGATTACTAATCTTAAATTCCATGCCTTGGGGGCATGCAAGTACGATATACAGAAGGAGTGAACTCATTAGGGCAGATGACCAATGAGTTTAGGAAAGAAGAGTCCAGGGCAGGGTACATCTACACCACCCGCCCAGCCCTGGGTGAGTCCAGCCACGTTCACCTCATTATAGTTGCCTCTCTCCAGTCCTACCTTGACGGGAAGCACAAGCAGAAACTGGGACAGGAGCCCCAGGAGACCAAATCTTCATGGTCCCTCTGGGAGGATGGGTGGGGAGAGCTGTGGCAGAGGCCTCAGGAGGGGCCCTGCTGCTCAGTGGTGACAGATAGGGGTGAGAAAGCAGACAGAGTCATTCCGTCAGCATTCTGGGTCTGTTTGGTACTTCTTCTCACGCTAAGGTGGCGGTGTGATATGCACAATGGCTAAAAAGCAGGGAGAGCTGGAAAGAAACAAGGACAGAGACAGAGGCCAAGTCAACCAGACCAATTCCCAGAGGAAGCAAAGAAACCATTACAGAGACTACAAGGGGGAAGGGAAGGAGAGATGAATTAGCTTCCCCTGTAAACCTTAGAACCCAGCTGTTGCCAGGGCAACGGGGCAATACCTGTCTCTTCAGAGGAGATGAAGTTGCCAGGGTAACTACATCCTGTCTTTCTCAAGGACCATCCCAGAATGTGGCACCCACTAGCCGTTACCATAGCAACTGCCTCTTTGCCCCACTTAATCCCATCCCGTCTGTTAAAAGGGCCCTATAGTTGGAGGTGGGGGAGGTAGGAAGAGCGATGATCACTTGTGGACTAAGTTTGTTCGCATCCCCTTCTCCAACCCCCTCAGTACATCACCCTGGGGGAACAGGGTCCACTTGCTCCTGGGCCCACACAGTCCTGCAGTATTGTGTATATAAGGCCAGGGCAAAGAGGAGCAGGTTTTAAAGTGAAAGGCAGGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCGGGGCAACGGGAACAGGGCGTTTCGGAGGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGCTGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGCAGCCACAGTGCCCTGCTCAGAAGCCCCAAGCTCGTCAGTCAAGCCGGTTCTCCGTTTGCACTCAGGAGCACGGGCAGGCGAGTGGCCCCTAGTTCTGGGGGCAGC
SEQ ID NO: 11 hDLX啟動子 TTCAGAATGTTATGCACTCACAGTGGTTTGGCATGCATCTGGTGAATTTTTTTTAACGAAAAATTAGTGTTGGTTTCGATGTATGGTAGCATTCTCCCTAACGTAATTTGAATAATTCAGCAAAGCCCCACTACCAGCTGTACTTCTGCAGCCTCTTCCATTCTTTTCAGCATTATAATTTTGGTTAATTTTCAATTTTAGGTCCTACGTCTCTGCAATTTGTGTATGAATAACAGAATAATTTCCCTCTTTTGTTTCGCCTTTCCTGTTCCTGAATCTAAATAAAGATGGCTTTTTAGTATTAAAAGTGGAAGAAAATTACAGGTAATTATCTTTGACGGTAAAAACGCTGTAATCAGCGGGCTACATGAAAAATTACTCTAATTATGGCTGCATTTAAGAGAATGGAAAAAAACCTTCTTGTGGATAAAAACCTTAAATTGTCCCCAATGTCTGCTTCAAATTGGATGGCACTGCAGCTGGAGGCTTTGTTCAGAATTGATCCTGGGGAGCTACGAACCCAAAGTTTCACAGTAGGAAG
SEQ ID NO: 12 pBGlobin CTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCT
SEQ ID NO: 13 hDLX內含子 GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG
SEQ ID NO: 14 內源性hSLC6A1啟動子 AGAATCCCTCAAACCTCAAGAACTGAGAGAAGGGTGTCTGGGGCTCCTGCCACCATCCCTGTTTCCCTTTTAAGTAATCTGTTTCCCCATCTGTCCATCCATACACACAGCCACTTGTGTCTCCATGACCAACCGCTGGCAGTGGAAGGGTGTCCTTCCCACCCCCACTCTTACACACACTCCCAGCTGGTACCCAGAGCCTGGTCACCCCAGGCCAGGCCTGTGTTTCCAGGTGTAACGGGCAGCAGACGCTGCCCTAGGACTAGAGCAGGGAGGGGGCACGGGCCCACCCCAACCCACAGCGACCCACAGAGGGCGAAAAGAGGACGACCGCAGAGAGAAACGGAAAGGACAGGCCAACGGAAGCAGTACTGCAAGGCTGGAAGGAGAAAAGCCAGGAGGGGAGTGCTTGCTGTGAAAGACAGGGAGACAGAGACCAAGACGGACAGGCAGACAGGCTGGTGACCCAGGATGAGGCCGGAAAGAGCCATCAAAGGAAGGAGAAGGAAGGAGAGAGATTGGAGCGGGACGGCGGGGCAGGCGAGGGAAGGAGGGGGTGGGGAGAGGGAGGGAGGAAGAGAGGGGAGAAAGAGGGAGGAAGAGAGGGGAGAAGGAGGGAGAAGAGAGCGGGAGAATGCGAGAGGAAAGAAGGGAGAGGGGAGGCGTAGAAGGGGAGAGGAGGTGAAGGGAAAAGGAGAGAGCCTGCTGGCGGCGAAGCTGCAAGAGGCAGCTGCGGAGGGAGCGCGCGGCGGGCCTGGGGGAGCGCTGGGCGGGGGCGGGCGGTGCGGGCAGGGCTATACCCGAGCTGGGCGGGCTCCGGGCGCCGCGGGCCCTGCCCTCCCCCTCCATCCCTCCGGACTCGCTCCCCCCTCCTCTCCCTTCCCCGCGACCCTCCGCCCGCCCTCGGAAGACCGAGACAGCGGAGAGGTTGCGGGTGAGCTGCGCTGAGCCCAGGAGCCGAGGAGTCGGGAGCGCAGTAGCGCTGAGCCCGAGCCCGAGCGGCCCCGCGTCCCGAGCGCATCGGAGCGGCCGAGCCGCCCGGATGCAGCGCCTGTCCCGGGCAGCGCAGCCCCGGCCGCAGGATCTCACCCAGGGTGGCAGAAGGAGGCCTTCTGGAGCTGACCCACCCCCGACGACCATCAGGGTGAGGCAACTCCAAGGTCCTACTCTCTTTCTGTGCCTGTTACCCACCCCGTCCTCCTAGGGTGCCCTTGAGCCGCAAAACTGCTGTCCACGTGGACCGGGGGTGACATCGCACGTCCATCTGCCAGGACCCCTGCGTCCAAATTCCGAGAC
SEQ ID NO: 15 人類SLC6A1 NCBI NM_003042.4 (轉錄本變異體1)    ATGGCGACCAACGGCAGCAAGGTGGCCGACGGGCAGATCTCCACCGAGGTCAGCGAGGCCCCTGTGGCCAATGACAAGCCCAAAACCTTGGTGGTCAAGGTGCAGAAGAAGGCGGCAGACCTCCCCGACCGGGACACGTGGAAGGGCCGCTTCGACTTCCTCATGTCCTGTGTGGGCTATGCCATCGGCCTGGGCAACGTCTGGAGGTTCCCCTATCTCTGCGGGAAAAATGGTGGGGGAGCCTTCCTGATCCCCTATTTCCTGACACTCATCTTTGCGGGGGTCCCACTCTTCCTGCTGGAGTGCTCCCTGGGCCAGTACACCTCCATCGGGGGGCTAGGGGTATGGAAGCTGGCTCCTATGTTCAAGGGCGTGGGCCTTGCGGCTGCTGTGCTATCATTCTGGCTGAACATCTACTACATCGTCATCATCTCCTGGGCCATTTACTACCTGTACAACTCCTTCACCACGACACTGCCGTGGAAACAGTGCGACAACCCCTGGAACACAGACCGCTGCTTCTCCAACTACAGCATGGTCAACACTACCAACATGACCAGCGCTGTGGTGGAGTTCTGGGAGCGCAACATGCATCAGATGACGGACGGGCTGGATAAGCCAGGTCAGATCCGCTGGCCACTGGCCATCACGCTGGCCATCGCCTGGATCCTTGTGTATTTCTGTATCTGGAAGGGTGTTGGCTGGACTGGAAAGGTGGTCTACTTTTCAGCCACATACCCCTACATCATGCTGATCATCCTGTTCTTCCGTGGAGTGACGCTGCCCGGGGCCAAGGAGGGCATCCTCTTCTACATCACACCCAACTTCCGCAAGCTGTCTGACTCCGAGGTGTGGCTGGATGCGGCAACCCAGATCTTCTTCTCATACGGGCTGGGCCTGGGGTCCCTGATCGCTCTCGGGAGCTACAACTCTTTCCACAACAATGTCTACAGGGACTCCATCATCGTCTGCTGCATCAATTCGTGCACCAGCATGTTCGCAGGATTCGTCATCTTCTCCATCGTGGGCTTCATGGCCCATGTCACCAAGAGGTCCATTGCTGATGTGGCGGCCTCAGGCCCCGGGCTGGCGTTCCTGGCATACCCAGAGGCGGTGACCCAGCTGCCTATCTCCCCACTCTGGGCCATCCTCTTCTTCTCCATGCTGTTGATGCTGGGCATTGACAGCCAGTTCTGCACTGTGGAGGGCTTCATCACAGCCCTGGTGGATGAGTACCCCAGGCTCCTCCGCAACCGCAGAGAGCTCTTCATTGCTGCTGTCTGCATCATCTCCTACCTGATCGGTCTCTCTAACATCACTCAGGGGGGTATTTATGTCTTCAAACTCTTTGACTACTACTCTGCCAGTGGCATGAGCCTGCTGTTCCTCGTGTTCTTTGAATGTGTCTCTATTTCCTGGTTTTACGGTGTCAACCGATTCTATGACAATATCCAAGAGATGGTTGGATCCAGGCCCTGCATCTGGTGGAAACTCTGCTGGTCTTTCTTCACACCAATCATTGTGGCGGGCGTGTTCATTTTCAGTGCTGTGCAGATGACGCCACTCACCATGGGAAACTATGTTTTCCCCAAGTGGGGCCAGGGTGTGGGCTGGCTGATGGCTCTGTCTTCCATGGTCCTCATCCCCGGGTACATGGCCTACATGTTCCTCACCTTAAAGGGCTCCCTGAAGCAGCGCATCCAAGTCATGGTCCAGCCCAGCGAAGACATCGTTCGCCCAGAGAATGGTCCTGAGCAGCCCCAGGCGGGCAGCTCCACCAGCAAGGAGGCCTACATCTAG
SEQ ID NO: 16 小鼠SLC6A1 ATGGCGACTGACAACAGCAAGGTGGCTGATGGGCAGATCTCTACTGAGGTCAGCGAGGCCCCTGTGGCCAGCGACAAGCCCAAAACCCTGGTAGTCAAGGTGCAGAAGAAGGCCGGGGACCTCCCTGACCGGGACACATGGAAGGGACGCTTCGACTTCCTCATGTCCTGCGTGGGCTATGCCATCGGCCTGGGCAATGTGTGGAGGTTCCCTTACCTCTGTGGGAAAAACGGTGGCGGGGCCTTCCTAATCCCATATTTCCTGACGCTCATCTTTGCGGGTGTTCCTCTCTTCCTTTTGGAGTGCTCCCTAGGCCAGTACACCTCCATTGGGGGCCTGGGCGTATGGAAGCTGGCGCCCATGTTCAAGGGTGTGGGCCTCGCGGCAGCTGTGCTGTCCTTCTGGCTGAACATCTACTACATCGTCATCATCTCCTGGGCCATCTACTACCTGTACAACTCCTTCACCACGACCCTGCCATGGAAACAGTGTGACAACCCGTGGAACACTGACCGCTGCTTCTCCAACTACAGCCTGGTCAATACCACCAACATGACCAGCGCCGTGGTGGAGTTCTGGGAGCGCAACATGCACCAGATGACAGATGGACTGGACAAGCCAGGACAGATCCGCTGGCCTCTGGCCATCACACTGGCCATTGCCTGGGTGCTCGTGTATTTCTGCATCTGGAAGGGTGTTGGTTGGACTGGAAAGGTGGTCTACTTCTCAGCCACGTACCCCTACATCATGCTTATCATCCTGTTCTTCCGTGGAGTGACGCTTCCCGGGGCCAAGGAGGGGATCCTCTTCTACATCACACCCAACTTCCGAAAGCTGTCTGATTCTGAGGTGTGGCTTGACGCCGCCACCCAGATCTTCTTCTCCTACGGGCTGGGCCTGGGGTCCCTGATTGCTCTGGGAAGCTACAACTCTTTCCACAACAATGTGTACAGGGACTCCATCATCGTTTGCTGCATCAACTCCTGCACCAGCATGTTTGCCGGATTCGTCATCTTCTCCATCGTGGGCTTCATGGCTCATGTCACCAAGAGGTCCATAGCTGATGTGGCAGCCTCAGGCCCGGGGCTGGCATTCTTGGCGTACCCTGAGGCTGTGACACAGCTACCCATCTCTCCCCTCTGGGCTATCCTCTTCTTCTCCATGCTGCTGATGCTGGGCATTGACAGCCAGTTCTGTACCGTGGAGGGCTTCATCACTGCCCTGGTGGACGAGTACCCCAGACTTCTCCGCAATCGCCGTGAACTCTTCATTGCTGCCGTGTGCATCGTGTCCTACCTGATTGGCCTGTCTAACATCACCCAGGGTGGCATTTATGTCTTCAAACTGTTTGATTATTACTCTGCCAGCGGCATGAGCTTGCTGTTCCTGGTTTTCTTCGAGTGTGTCTCCATTTCCTGGTTTTATGGTGTCAACCGGTTCTATGACAACATCCAGGAGATGGTTGGCTCCAGGCCCTGCATCTGGTGGAAGCTGTGCTGGTCCTTTTTCACACCCATCATTGTGGCGGGCGTGTTTCTCTTCAGTGCTGTGCAGATGACACCACTCACCATGGGAAGCTATGTTTTCCCCAAGTGGGGCCAGGGCGTGGGCTGGCTCATGGCTCTGTCCTCCATGGTGCTCATCCCCGGGTACATGGCTTACATGTTCCTCACCCTGAAGGGCTCCCTGAAGCAGCGTCTCCAGGTCATGATTCAGCCCAGTGAAGATATTGTGCGCCCTGAGAATGGCCCTGAGCAGCCGCAGGCTGGCAGCTCAGCCAGCAAGGAGGCCTACATCTAG
SEQ ID NO: 17 SV40聚A GATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTT
SEQ ID NO: 18 人類GAT-1同功異型物a MATNGSKVADGQISTEVSEAPVANDKPKTLVVKVQKKAADLPDRDTWKGRFDFLMSCVGYAIGLGNVWRFPYLCGKNGGGAFLIPYFLTLIFAGVPLFLLECSLGQYTSIGGLGVWKLAPMFKGVGLAAAVLSFWLNIYYIVIISWAIYYLYNSFTTTLPWKQCDNPWNTDRCFSNYSMVNTTNMTSAVVEFWERNMHQMTDGLDKPGQIRWPLAITLAIAWILVYFCIWKGVGWTGKVVYFSATYPYIMLIILFFRGVTLPGAKEGILFYITPNFRKLSDSEVWLDAATQIFFSYGLGLGSLIALGSYNSFHNNVYRDSIIVCCINSCTSMFAGFVIFSIVGFMAHVTKRSIADVAASGPGLAFLAYPEAVTQLPISPLWAILFFSMLLMLGIDSQFCTVEGFITALVDEYPRLLRNRRELFIAAVCIISYLIGLSNITQGGIYVFKLFDYYSASGMSLLFLVFFECVSISWFYGVNRFYDNIQEMVGSRPCIWWKLCWSFFTPIIVAGVFIFSAVQMTPLTMGNYVFPKWGQGVGWLMALSSMVLIPGYMAYMFLTLK GSLKQRIQVMVQPSEDIVRPENGPEQPQAGSSTSKEAYI
SEQ ID NO: 19 人類GAT-1同功異型物b MVNTTNMTSAVVEFWERNMHQMTDGLDKPGQIRWPLAITLAIAWILVYFCIWKGVGWTGKVVYFSATYPYIMLIILFFRGVTLPGAKEGILFYITPNFRKLSDSEVWLDAATQIFFSYGLGLGSLIALGSYNSFHNNVYRDSIIVCCINSCTSMFAGFVIFSIVGFMAHVTKRSIADVAASGPGLAFLAYPEAVTQLPISPLWAILFFSMLLMLGIDSQFCTVEGFITALVDEYPRLLRNRRELFIAAVCIISYLIGLSNITQGGIYVFKLFDYYSASGMSLLFLVFFECVSISWFYGVNRFYDNIQEMVGSRPCIWWKLCWSFFTPIIVAGVFIFSAVQMTPLTMGNYVFPKWGQGVGWLMALSSMVLIPGYMAYMFLTLKGSLKQRIQVMVQPSEDIVRPENGPEQPQAGSSTSKEAYI
SEQ ID NO: 20 人類GAT-1同功異型物c MVNTTNMTSAVVEFWERNMHQMTDGLDKPGQIRWPLAITLAIAWILVYFCIWKGVGWTGKVVYFSATYPYIMLIILFFRGVTLPGAKEGILFYITPNFRKLSDSEVWLDAATQIFFSYGLGLGSLIALGSYNSFHNNVYRDSIIVCCINSCTSMFAGFVIFSIVGFMAHVTKRSIADVAASGPGLAFLAYPEAVTQLPISPLWAILFFSMLLMLGIDSQFCTVEGFITALVDEYPRLLRNRRELFIAAVCIISYLIGLSNITQGGIYVFKLFDYYSASGMSLLFLVFFECVSISWFYGVNRFYDNIQEMVGSRPCIWWKLCWSFFTPIIVAGVFIFSAVQMTPLTMGNYVFPKWGQGVGWLMALSSMVLIPGYMAYMFLTLKGSLKQRIQVMVQPSEDIVRPENGPEQPQAGSSTSKEAYI
SEQ ID NO: 21 AAV9.hu14 DNA序列    AGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAATTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGACTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGCCCGGGCTAATTAGGGGGTGTCGCCCTTCGCTGAAGTCCTGTATTAGAGGTCACGTGAGTGTTTTGCGACATTTTGCGACACCATGTGGTCACGCTGGGTATTTAAGCCCGAGTGAGCACGCAGGGTCTCCATTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCGCAGCCGCCATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGACTGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGTGTCAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCACATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCTTGCGACCTGGTCAATGTGGACTTGGATGACTGTGTTTCTGAACAATAAATGACTTAAACCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACAAACCACCAGAGTGCCCAAGCACAGGCGCAGACCGGCTGGGTTCAAAACCAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAATTGCTTGTTAATCAATAAACCGTTTAATTCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCGCGTCAAAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATGCATAATAAATACTGATAACATCTTATAGTTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTGATATCAAAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTGTATATACAAAAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGTTCATCAATCGAAAAAGCAACGTATCTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATATATCAAGCAAAGTGACAGGCGCCCTTAAATATTCTGACAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATAAAAAAACCCGCCGAAGCGGGTTTTTACGTTATTTGCGGATTAACGATTACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCTT
SEQ ID NO: 22 5' ITR AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC
SEQ ID NO: 23 3' ITR GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
SEQ ID NO: 24 AAV真型(AAVtt) MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRILEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPAEPDSSSGTGKSGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMASGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTMSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTAADNNNSDYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKYFPQSGVLIFGKQDSGKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATSDVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
SEQ ID NO: 25 AAV9 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
SEQ ID NO: 26 人類SLC6A1轉錄本變異體2 (同功異型物a)    GCCCTCGGAAGACCGAGACAGCGGAGAGGTTGCGGGTGAGCTGCGCTGAGCCCAGGAGCCGAGGAGTCGGGAGCGCAGTAGCGCTGAGCCCGAGCCCGAGCGGCCCCGCGTCCCGAGCGCATCGGAGCGGCCGAGCCGCCCGGATGCAGCGCCTGTCCCGGGCAGCGCAGCCCCGGCCGCAGGATCTCACCCAGGGTGGCAGAAGGAGGCCTTCTGGAGCTGACCCACCCCCGACGACCATCAGGGTGCCCTTGAGCCGCAAAACTGCTGTCCACGTGGACCGGGGGTGACATCGCACGTCCATCTGCCAGGACCCCTGCGTCCAAATTCCGAGACATGGCGACCAACGG CAGCAAGGTGGCCGACGGGCAGATCTCCACCGAGGTCAGCGAGGCCCCTGTGGCCAATGACAAGCCCAAAACCTTGGTGGTCAAGGTGCAGAAGAAGGCGGCAGACCTCCCCGACCGGGACACGTGGAAGGGCCGCTTCGACTTCCTCATGTCCTGTGTGGGCTATGCCATCGGCCTGGGCAACGTCTGGAGGTTCCCCTATCTCTGCGGGAAAAATGGTGGGGGAGCCTTCCTGATCCCCTATTTCCTGACACTCATCTTTGCGGGGGTCCCACTCTTCCTGCTGGAGTGCTCCCTGGGCCAGTACACCTCCATCGGGGGGCTAGGGGTATGGAAGCTGGCTCCTATGTTCAAGGGCGTGGGCCTTGCGGCTGCTGTGCTATCATTCTGGCTGAACATCTACTACATCGTCATCATCTCCTGGGCCATTTACTACCTGTACAACTCCTTCACCACGACACTGCCGTGGAAACAGTGCGACAACCCCTGGAACACAGACCGCTGCTTCTCCAACTACAGCATGGTCAACACTACCAACATGACCAGCGCTGTGGTGGAGTTCTGGGAGCGCAACATGCATCAGATGACGGACGGGCTGGATAAGCCAGGTCAGATCCGCTGGCCACTGGCCATCACGCTGGCCATCGCCTGGATCCTTGTGTATTTCTGTATCTGGAAGGGTGTTGGCTGGACTGGAAAGGTGGTCTACTTTTCAGCCACATACCCCTACATCATGCTGATCATCCTGTTCTTCCGTGGAGTGACGCTGCCCGGGGCCAAGGAGGGCATCCTCTTCTACATCACACCCAACTTCCGCAAGCTGTCTGACTCCGAGGTGTGGCTGGATGCGGCAACCCAGATCTTCTTCTCATACGGGCTGGGCCTGGGGTCCCTGATCGCTCTCGGGAGCTACAACTCTTTCCACAACAATGTCTACAGGGACTCCATCATCGTCTGCTGCATCAATTCGTGCACCAGCATGTTCGCAGGATTCGTCATCTTCTCCATCGTGGGCTTCATGGCCCATGTCACCAAGAGGTCCATTGCTGATGTGGCGGCCTCAGGCCCCGGGCTGGCGTTCCTGGCATACCCAGAGGCGGTGACCCAGCTGCCTATCTCCCCACTCTGGGCCATCCTCTTCTTCTCCATGCTGTTGATGCTGGGCATTGACAGCCAGTTCTGCACTGTGGAGGGCTTCATCACAGCCCTGGTGGATGAGTACCCCAGGCTCCTCCGCAACCGCAGAGAGCTCTTCATTGCTGCTGTCTGCATCATCTCCTACCTGATCGGTCTCTCTAACATCACTCAGGGGGGTATTTATGTCTTCAAACTCTTTGACTACTACTCTGCCAGTGGCATGAGCCTGCTGTTCCTCGTGTTCTTTGAATGTGTCTCTATTTCCTGGTTTTACGGTGTCAACCGATTCTATGACAATATCCAAGAGATGGTTGGATCCAGGCCCTGCATCTGGTGGAAACTCTGCTGGTCTTTCTTCACACCAATCATTGTGGCGGGCGTGTTCATTTTCAGTGCTGTGCAGATGACGCCACTCACCATGGGAAACTATGTTTTCCCCAAGTGGGGCCAGGGTGTGGGCTGGCTGATGGCTCTGTCTTCCATGGTCCTCATCCCCGGGTACATGGCCTACATGTTCCTCACCTTAAAGGGCTCCCTGAAGCAGCGCATCCAAGTCATGGTCCAGCCCAGCGAAGACATCGTTCGCCCAGAGAATGGTCCTGAGCAGCCCCAGGCGGGCAGCTCCACCAGCAAGGAGGCCTACATCTAGGGTGGGGGCCACTCACCGACCCGACACTCTCACCCCCCGACCTGGCTGAGTGCGACCACCACTTGATGTCTGAGGATACCTTCCATCTCAACCTACCTCGAGTGGCGAGTCCAGACACCATCACCACGCAGAGAGGGGAGGTGGGAGGACAGTTAGACCCCTGGGTGGGCCCTGCCGTGGGCAAGGATACCCGGTGGCTTCTGGCACCTGGCGGGCTGGTGACCTTTTTAATCCAGGCCCCATCAGCATCCCACGATCGGCCTTGGTAACCGCCGCGGTAGATCATTTTTATCCCGCCAGGGAGTGTGATGCAGGAAGACCACATGCGCTCCTGGCTTTTAAACCTGTTCCTGACTGTTCTCTTACTGCCGAAACCCTTGACTGTTATCTCGGACTTTGCAGGAGTTCCTTTCCCTCCGAACGCTGCTCCATGCACAGGAAAAGGGCATTTTGTACAATGGGGACTTCCCGGGAACGCTTGCTCTTAAGTACCAGAAGCCGGCGGAGCTCTGGCTTTCGTGTTTTTGGTTTTCTCCTTCCCAAGGCAGCTGGATTGAAAAAACAAAACAAAACAAAAAAACCCAGGGGCGTCAGTCGATATTCCCAGGGCCGCTTCTCCTGCAGTCTGTGGAGCGTCCTTGTCCCCGCCGCCGGAATGAATGAGCATTCTGCAGCCCGATGTCCCTGTCCCCTCCTCGCCGGGCCATTCTGATTGGACCTGGCCCAGTGCAATCTGTCCAGACAAGCCCTGCTTGCTGGAAAACTGCCACAAGCACAATTGATCTCTTTTTATCGCCATTCCAGGGGCCTCAGGTCCTACTGGGGAAACTTCCTATACCGGAGCTCCAGTTTCTCTTAAGCTGCCCAATTTCACAGAGTACAAAATAGTTGTAGGGGAAATCAAGGTGAAGGATCTGTCCGACAGTCAAGACGGATCCACAGTAATCTTTCGGTCTCCTTAAACTACCACCCTCGCTGCCACCCACCCCAAGCTGCTGCCGCCTCACCTTCCTTGAAATTTCTCAGCGGGAGTCTCCTCACTGCCACTAAAATCCACCCAGCCCACTAACTGAGGAGCTAGTGT TAATCCAGAGAACCCCCCGCAATGTGCTTCCGAGATTCAGACTGCTTCATTGGGAAGTATGATTTGTTCCTTTCTGGAATTGGGCTCCGTGGTGGCGGCGGCACTTCAAGCAAAGACAGTTTCTTGCAAGCTCCAGTAGCTCCGCGTGTCTCATTTGCCAGGAAGATGGGTTCCCACGTAGCAAATCGTACATTGTGCCCTGTAGCTCCTTAGCTAGTTAGCTCACAAGCCGTGTTTTATGACTAATCCTTAATAACTATGGTAAATAACTGTGACTGTGGGGTTTTTAATCTCTTGTCATTCTCATCCAAAAGTGACCAGCATACCAGTTCTTGCAATAAGATATTACCCTCAGAATATTAAGCACATTATTGTAGAGAAAAAAAAATATGTGTACACATATGAACGCACAACATGCACATTCATCCTCACATGTGGCACGTAAGGTCTCATTTGATATTGTGTAGGAAATCTGAAGCCTTTTCCTGAGGTCATCTGTAAAATAGTCTCATTGCCAAGGCATCCCCAGTGCCAGCTGGTGAATCCATGATCAAAATGCATACGTATTGTTAAATGATAAGGTTTAGAATGACAGGAACCCATCACTGTGTCTCATGGTCCCACTTCCCCATCTGTGTGTGAATTCCTTTAGACTAAGGGCAGGAAGACTTCCAGCTTTCTCTTTGTTCTTCAATGTGAAACTGAGACCAAGTCTCTCTAAGACAAATGCAGTGTATTTAATGTTTGTAAGCAATTCTAAGTGAGATGTTTGGCAAGAAATCCCCTAACTGATTTCCATCCAAACCTACCTTATAGAGCACAATATTAAGTGTTGTACAATTACTGTGAGAACTGTGAATATGTGTAACTTTTTTTTAGTATTTGCCCGGGGGGAAAAAGATATTGTATTATCATATATGCTTTTTTGCAATAAGGATTTATTCTCAGAACACCAAGTAAATCTATCTCTATATAAAAAATATATGTAATATATACATATTCAAAGTATATACAGAGCCTGTTTTAAAAAATACAGTATTATTTAGTAAAATTATCTGTTCTATGGACCAAATGTAAAATATTTATAAATGAAGATGCATTTTAAATGTCTATAAATGGTGTCATAACTAGAGCACGGGCGTTATGTAAGTTTCTAAGAATTTAGAGGATAAATAATAAAGGTTCTATGATATACAA
SEQ ID NO: 27 人類SLC6A1轉錄本變異體3 (同功異型物b)    GCCCTCGGAAGACCGAGACAGCGGAGAGGTTGCGGGTGAGCTGCGCTGAGCCCAGGAGCCGAGGAGTCGGGAGCGCAGTAGCGCTGAGCCCGAGCCCGAGCGGCCCCGCGTCCCGAGCGCATCGGAGCGGCCGAGCCGCCCGGATGCAGCGCCTGTCCCGGGCAGCGCAGCCCCGGCCGCAGGATCTCACCCAGGGTGGCAGAAGGAGGCCTTCTGGAGCTGACCCACCCCCGACGACCATCAGGGTGCCCTTGAGCCGCAAAACTGCTGTCCACGTGGACCGGGGGTGACATCGCACGTCCATCTGCCAGGACCCCTGCGTCCAAATTCCGAGACATGGCGACCAACGGCAGCAAGGTGGCCGACGGGCAGATCTCCACCGAGGAGCCTTCCTGATCCCCTATTTCCTGACACTCATCTTTGCGGGGGTCCCACTCTTCCTGCTGGAGTGCTCCCTGGGCCAGTACACCTCCATCGGGGGGCTAGGGGTATGGAAGCTGGCTCCTATGTTCAAGGGCGTGGGCCTTGCGGCTGCTGTGCTATCATTCTGGCTGAACATCTACTACATCGTCATCATCTCCTGGGCCATTTACTACCTGTACAACTCCTTCACCACGACACTGCCGTGGAAACAGTGCGACAACCCCTGGAACACAGACCGCTGCTTCTCCAACTACAGCATGGTCAACACTACCAACATGACCAGCGCTGTGGTGGAGTTCTGGGAGCGCAACATGCATCAGATGACGGACGGGCTGGATAAGCCAGGTCAGATCCGCTGGCCACTGGCCATCACGCTGGCCATCGCCTGGATCCTTGTGTATTTCTGTATCTGGAAGGGTGTTGGCTGGACTGGAAAGGTGGTCTACTTTTCAGCCACATACCCCTACATCATGCTGATCATCCTGTTCTTCCGTGGAGTGACGCTGCCCGGGGCCAAGGAGGGCATCCTCTTCTACATCACACCCAACTTCCGCAAGCTGTCTGACTCCGAGGTGTGGCTGGATGCGGCAACCCAGATCTTCTTCTCATACGGGCTGGGCCTGGGGTCCCTGATCGCTCTCGGGAGCTACAACTCTTTCCACAACAATGTCTACAGGGACTCCATCATCGTCTGCTGCATCAATTCGTGCACCAGCATGTTCGCAGGATTCGTCATCTTCTCCATCGTGGGCTTCATGGCCCATGTCACCAAGAGGTCCATTGCTGATGTGGCGGCCTCAGGCCCCGGGCTGGCGTTCCTGGCATACCCAGAGGCGGTGACCCAGCTGCCTATCTCCCCACTCTGGGCCATCCTCTTCTTCTCCATGCTGTTGATGCTGGGCATTGACAGCCAGTTCTGCACTGTGGAGGGCTTCATCACAGCCCTGGTGGATGAGTACCCCAGGCTCCTCCGCAACCGCAGAGAGCTCTTCATTGCTGCTGTCTGCATCATCTCCTACCTGATCGGTCTCTCTAACATCACTCAGGGGGGTATTTATGTCTTCAAACTCTTTGACTACTACTCTGCCAGTGGCATGAGCCTGCTGTTCCTCGTGTTCTTTGAATGTGTCTCTATTTCCTGGTTTTACGGTGTCAACCGATTCTATGACAATATCCAAGAGATGGTTGGATCCAGGCCCTGCATCTGGTGGAAACTCTGCTGGTCTTTCTTCACACCAATCATTGTGGCGGGCGTGTTCATTTTCAGTGCTGTGCAGATGACGCCACTCACCATGGGAAACTATGTTTTCCCCAAGTGGGGCCAGGGTGTGGGCTGGCTGATGGCTCTGTCTTCCATGGTCCTCATCCCCGGGTACATGGCCTACATGTTCCTCACCTTAAAGGGCTCCCTGAAGCAGCGCATCCAAGTCATGGTCCAGCCCAGCGAAGACATCGTTCGCCCAGAGAATGGTCCTGAGCAGCCCCAGGCGGGCAGCTCCACCAGCAAGGAGGCCTACATCTAGGGTGGGGGCCACTCACCGACCCGACACTCTCACCCCCCGACCTGGCTGAGTGCGACCACCACTTGATGTCTGAGGATACCTTCC ATCTCAACCTACCTCGAGTGGCGAGTCCAGACACCATCACCACGCAGAGAGGGGAGGTGGGAGGACAGTTAGACCCCTGGGTGGGCCCTGCCGTGGGCAAGGATACCCGGTGGCTTCTGGCACCTGGCGGGCTGGTGACCTTTTTAATCCAGGCCCCATCAGCATCCCACGATCGGCCTTGGTAACCGCCGCGGTAGATCATTTTTATCCCGCCAGGGAGTGTGATGCAGGAAGACCACATGCGCTCCTGGCTTTTAAACCTGTTCCTGACTGTTCTCTTACTGCCGAAACCCTTGACTGTTATCTCGGACTTTGCAGGAGTTCCTTTCCCTCCGAACGCTGCTCCATGCACAGGAAAAGGGCATTTTGTACAATGGGGACTTCCCGGGAACGCTTGCTCTTAAGTACCAGAAGCCGGCGGAGCTCTGGCTTTCGTGTTTTTGGTTTTCTCCTTCCCAAGGCAGCTGGATTGAAAAAACAAAACAAAACAAAAAAACCCAGGGGCGTCAGTCGATATTCCCAGGGCCGCTTCTCCTGCAGTCTGTGGAGCGTCCTTGTCCCCGCCGCCGGAATGAATGAGCATTCTGCAGCCCGATGTCCCTGTCCCCTCCTCGCCGGGCCATTCTGATTGGACCTGGCCCAGTGCAATCTGTCCAGACAAGCCCTGCTTGCTGGAAAACTGCCACAAGCACAATTGATCTCTTTTTATCGCCATTCCAGGGGCCTCAGGTCCTACTGGGGAAACTTCCTATACCGGAGCTCCAGTTTCTCTTAAGCTGCCCAATTTCACAGAGTACAAAATAGTTGTAGGGGAAATCAAGGTGAAGGATCTGTCCGACAGTCAAGACGGATCCACAGTAATCTTTCGGTCTCCTTAAACTACCACCCTCGCTGCCACCCACCCCAAGCTGCTGCCGCCTCACCTTCCTTGAAATTTCTCAGCGGGAGTCTCCTCACTGCCACTAAAATCCACCCAGCCCACTAACTGAGGAGCTAGTGTTAATCCAGAGAACCCCCCGCAATGTGCTTCCGAGATTCAGACTGCTTCATTGGGAAGTATGATTTGTTCCTTTCTGGAATTGGGCTCCGTGGTGGCGGCGGCACTTCAAGCAAAGACAGTTTCTTGCAAGCTCCAGTAGCTCCGCGTGTCTCATTTGCCAGGAAGATGGGTTCCCACGTAGCAAATCGTACATTGTGCCCTGTAGCTCCTTAGCTAGTTAGCTCACAAGCCGTGTTTTATGACTAATCCTTAATAACTATGGTAAATAACTGTGACTGTGGGGTTTTTAATCTCTTGTCATTCTCATCCAAAAGTGACCAGCATACCAGTTCTTGCAATAAGATATTACCCTCAGAATATTAAGCACATTATTGTAGAGAAAAAAAAATATGTGTACACATATGAACGCACAACATGCACATTCATCCTCACATGTGGCACGTAAGGTCTCATTTGATATTGTGTAGGAAATCTGAAGCCTTTTCCTGAGGTCATCTGTAAAATAGTCTCATTGCCAAGGCATCCCCAGTGCCAGCTGGTGAATCCATGATCAAAATGCATACGTATTGTTAAATGATAAGGTTTAGAATGACAGGAACCCATCACTGTGTCTCATGGTCCCACTTCCCCATCTGTGTGTGAATTCCTTTAGACTAAGGGCAGGAAGACTTCCAGCTTTC TCTTTGTTCTTCAATGTGAAACTGAGACCAAGTCTCTCTAAGACAAATGCAGTGTATTTAATGTTTGTAAGCAATTCTAAGTGAGATGTTTGGCAAGAAATCCCCTAACTGATTTCCATCCAAACCTACCTTATAGAGCACAATATTAAGTGTTGTACAATTACTGTGAGAACTGTGAATATGTGTAACTTTTTTTTAGTATTTGCCCGGGGGGAAAAAGATATTGTATTATCATATATGCTTTTTTGCAATAAGGATTTATTCTCAGAACACCAAGTAAATCTATCTCTATATAAAAAATATATGTAATATATACATATTCAAAGTATATACAGAGCCTGTTTTAAAAAATACAGTATTATTTAGTAAAATTATCTGTTCTATGGACCAAATGTAAAATATTTATAAATGAAGATGCATTTTAAATGTCTATAAATGGTGTCATAACTAGAGCACGGGCGTTATGTAAGTTTCTAAGAATTTAGAGGATAAATAATAAAGGTTCTATGATATACAA
SEQ ID NO: 28 人類SLC6A1轉錄本變異體4 (同功異型物c)    GCCCTCGGAAGACCGAGACAGCGGAGAGGTTGCGGGTGAGCTGCGCTGAGCCCAGGAGCCGAGGAGTCGGGAGCGCAGTAGCGCTGAGCCCGAGCCCGAGCGGCCCCGCGTCCCGAGCGCATCGGAGCGGCCGAGCCGCCCGGATGCAGCGCCTGTCCCGGGCAGCGCAGCCCCGGCCGCAGGATCTCACCCAGGGTGGCAGAAGGAGGCCTTCTGGAGCTGACCCACCCCCGACGACCATCAGGGTGAGGCAACTCCAAGGTCCTACTCTCTTTCTGTGCCTGTTACCCACCCCGTCCTCCTAGGGTGCCCTTGAGCCGCAAAACTGCTGTCCACGTGGACCGGGGGTG ACATCGCACGTCCATCTGCCAGGACCCCTGCGTCCAAATTCCGAGACATGGCGACCAACGGCAGCAAGGTGGCCGACGGGCAGATCTCCACCGAGGCGTGGGCCTTGCGGCTGCTGTGCTATCATTCTGGCTGAACATCTACTACATCGTCATCATCTCCTGGGCCATTTACTACCTGTACAACTCCTTCACCACGACACTGCCGTGGAAACAGTGCGACAACCCCTGGAACACAGACCGCTGCTTCTCCAACTACAGCATGGTCAACACTACCAACATGACCAGCGCTGTGGTGGAGTTCTGGGAGCGCAACATGCATCAGATGACGGACGGGCTGGATAAGCCAGGTCAGATCCGCTGGCCACTGGCCATCACGCTGGCCATCGCCTGGATCCTTGTGTATTTCTGTATCTGGAAGGGTGTTGGCTGGACTGGAAAGGTGGTCTACTTTTCAGCCACATACCCCTACATCATGCTGATCATCCTGTTCTTCCGTGGAGTGACGCTGCCCGGGGCCAAGGAGGGCATCCTCTTCTACATCACACCCAACTTCCGCAAGCTGTCTGACTCCGAGGTGTGGCTGGATGCGGCAACCCAGATCTTCTTCTCATACGGGCTGGGCCTGGGGTCCCTGATCGCTCTCGGGAGCTACAACTCTTTCCACAACAATGTCTACAGGGACTCCATCATCGTCTGCTGCATCAATTCGTGCACCAGCATGTTCGCAGGATTCGTCATCTTCTCCATCGTGGGCTTCATGGCCCATGTCACCAAGAGGTCCATTGCTGATGTGGCGGCCTCAGGCCCCGGGCTGGCGTTCCTGGCATACCCAGAGGCGGTGACCCAGCTGCCTATCTCCCCACTCTGGGCCATCCTCTTCTTCTCCATGCTGTTGATGCTGGGCATTGACAGCCAGTTCTGCACTGTGGAGGGCTTCATCACAGCCCTGGTGGATGAGTACCCCAGGCTCCTCCGCAACCGCAGAGAGCTCTTCATTGCTGCTGTCTGCATCATCTCCTACCTGATCGGTCTCTCTAACATCACTCAGGGGGGTATTTATGTCTTCAAACTCTTTGACTACTACTCTGCCAGTGGCATGAGCCTGCTGTTCCTCGTGTTCTTTGAATGTGTCTCTATTTCCTGGTTTTACGGTGTCAACCGATTCTATGACAATATCCAAGAGATGGTTGGATCCAGGCCCTGCATCTGGTGGAAACTCTGCTGGTCTTTCTTCACACCAATCATTGTGGCGGGCGTGTT CATTTTCAGTGCTGTGCAGATGACGCCACTCACCATGGGAAACTATGTTTTCCCCAAGTGGGGCCAGGGTGTGGGCTGGCTGATGGCTCTGTCTTCCATGGTCCTCATCCCCGGGTACATGGCCTACATGTTCCTCACCTTAAAGGGCTCCCTGAAGCAGCGCATCCAAGTCATGGTCCAGCCCAGCGAAGACATCGTTCGCCCAGAGAATGGTCCTGAGCAGCCCCAGGCGGGCAGCTCCACCAGCAAGGAGGCCTACATCTAGGGTGGGGGCCACTCACCGACCCGACACTCTCACCCCCCGACCTGGCTGAGTGCGACCACCACTTGATGTCTGAGGATACCTTCCATCTCAACCTACCTCGAGTGGCGAGTCCAGACACCATCACCACGCAGAGAGGGGAGGTGGGAGGACAGTTAGACCCCTGGGTGGGCCCTGCCGTGGGCAAGGATACCCGGTGGCTTCTGGCACCTGGCGGGCTGGTGACCTTTTTAATCCAGGCCCCATCAGCATCCCACGATCGGCCTTGGTAACCGCCGCGGTAGATCATTTTTATCCCGCCAGGGAGTGTGATGCAGGAAGACCACATGCGCTCCTGGCTTTTAAACCTGTTCCTGACTGTTCTCTTACTGCCGAAACCCTTGACTGTTATCTCGGACTTTGCAGGAGTTCCTTTCCCTCCGAACGCTGCTCCATGCACAGGAAAAGGGCATTTTGTACAATGGGGACTTCCCGGGAACGCTTGCTCTTAAGTACCAGAAGCCGGCGGAGCTCTGGCTTTCGTGTTTTTGGTTTTCTCCTTCCCAAGGCAGCTGGATTGAAAAAACAAAACAAAACAAAAAAACCCAGGGGCGTCAGTCGATATTCCCAGGGCCGCTTCTCCTGCAGTCTGTGGAGCGTCCTTGTCCCCGCCGCCGGAATGAATGAGCATTCTGCAGCCCGATGTCCCTGTCCCCTCCTCGCCGGGCCATTCTGATTGGACCTGGCCCAGTGCAATCTGTCCAGACAAGCCCTGCTTGCTGGAAAACTGCCACAAGCACAATTGATCTCTTTTTATCGCCATTCCAGGGGCCTCAGGTCCTACTGGGGAAACTTCCTATACCGGAGCTCCAGTTTCTCTTAAGCTGCCCAATTTCACAGAGTACAAAATAGTTGTAGGGGAAATCAAGGTGAAGGATCTGTCCGACAGTCAAGACGGATCCACAGTAATCTTTCGGTCTCCTTAAACTACCACCCTCGCTGCCACCCACCCCAAGCTGCTGCCGCCTCACCTTCCTTGAAATTTCTCAGCGGGAGTCTCCTCACTGCCACTAAAATCCACCCAGCCCACTAACTGAGGAGCTAGTGTTAATCCAGAGAACCCCCCGCAATGTGCTTCCGAGATTCAGACTGCTTCATTGGGAAGTATGATTTGTTCCTTTCTGGAATTGGGCTCCGTGGTGGCGGCGGCACTTCAAGCAAAGACAGTTTCTTGCAAGCTCCAGTAGCTCCGCGTGTCTCATTTGCCAGGAAGATGGGTTCCCACGTAGCAAATCGTACATTGTGCCCTGTAGCTCCTTAGCTAGTTAGCTCACAAGCCGTGTTTTATGACTAATCCTTAATAACTATGGTAAATAACTGTGACTGTGGGGTTTTTAATCTCTTGTCATTCTCATCCAAAAGTGACCAGCATACCAGTTCTTGCAATAAGATATTACCCTCAGAATATTAAGCACATTATTGTAGAGAAAAAAAAATATGTGTACACATATGAACGCACAACATGCACATTCATCCTCACATGTGGCACGTAAGGTCTCATTTGATATTGTGTAGGAAATCTGAAGCCTTTTCCTGAGGTCATCTGTAAAATAGTCTCATTGCCAAGGCATCCCCAGTGCCAGCTGGTGAATCCATGATCAAAATGCATACGTATTGTTAAATGATAAGGTTTAGAATGACAGGAACCCATCACTGTGTCTCATGGTCCCACTTCCCCATCTGTGTGTGAATTCCTTTAGACTAAGGGCAGGAAGACTTCCAGCTTTCTCTTTGTTCTTCAATGTGAAACTGAGACCAAGTCTCTCTAAGACAAATGCAGTGTATTTAATGTTTGTAAG CAATTCTAAGTGAGATGTTTGGCAAGAAATCCCCTAACTGATTTCCATCCAAACCTACCTTATAGAGCACAATATTAAGTGTTGTACAATTACTGTGAGAACTGTGAATATGTGTAACTTTTTTTTAGTATTTGCCCGGGGGGAAAAAGATATTGTATTATCATATATGCTTTTTTGCAATAAGGATTTATTCTCAGAACACCAAGTAAATCTATCTCTATATAAAAAATATATGTAATATATACATATTCAAAGTATATACAGAGCCTGTTTTAAAAAATACAGTATTATTTAGTAAAATTATCTGTTCTATGGACCAAATGTAAAATATTTATAAATGAAGATGCATTTTAAATGTCTATAAATGGTGTCATAACTAGAGCACGGGCGTTATGTAAGTTTCTAAGAATTTAGAGGATAAATAATAAAGGTTCTATGATATACAA
SEQ ID NO: 29 人類SLC6A1轉錄本變異體5 (同功異型物c)    GCCCTCGGAAGACCGAGACAGCGGAGAGGTTGCGGGTGAGCTGCGCTGAGCCCAGGAGCCGAGGAGTCGGGAGCGCAGTAGCGCTGAGCCCGAGCCCGAGCGGCCCCGCGTCCCGAGCGCATCGGAGCGGCCGAGCCGCCCGGATGCAGCGCCTGTCCCGGGCAGCGCAGCCCCGGCCGCAGGATCTCACCCAGGGTGGCAGAAGGAGGCCTTCTGGAGCTGACCCACCCCCGACGACCATCAGGGTGCCCTTGAGCCGCAAAACTGCTGTCCACGTGGACCGGGGGTGACATCGCACGTCCATCTGCCAGGACCCCTGCGTCCAAATTCCGAGACATGGCGACCAACGG CAGCAAGGTGGCCGACGGGCAGATCTCCACCGAGGCGTGGGCCTTGCGGCTGCTGTGCTATCATTCTGGCTGAACATCTACTACATCGTCATCATCTCCTGGGCCATTTACTACCTGTACAACTCCTTCACCACGACACTGCCGTGGAAACAGTGCGACAACCCCTGGAACACAGACCGCTGCTTCTCCAACTACAGCATGGTCAACACTACCAACATGACCAGCGCTGTGGTGGAGTTCTGGGAGCGCAACATGCATCAGATGACGGACGGGCTGGATAAGCCAGGTCAGATCCGCTGGCCACTGGCCATCACGCTGGCCATCGCCTGGATCCTTGTGTATTTCTGTATCTGGAAGGGTGTTGGCTGGACTGGAAAGGTGGTCTACTTTTCAGCCACATACCCCTACATCATGCTGATCATCCTGTTCTTCCGTGGAGTGACGCTGCCCGGGGCCAAGGAGGGCATCCTCTTCTACATCACACCCAACTTCCGCAAGCTGTCTGACTCCGAGGTGTGGCTGGATGCGGCAACCCAGATCTTCTTCTCATACGGGCTGGGCCTGGGGTCCCTGATCGCTCTCGGGAGCTACAACTCTTTCCACAACAATGTCTACAGGGACTCCATCATCGTCTGCTGCATCAATTCGTGCACCAGCATGTTCGCAGGATTCGTCATCTTCTCCATCGTGGGCTTCATGGCCCATGTCACCAAGAGGTCCATTGCTGATGTGGCGGCCTCAGGCCCCGGGCTGGCGTTCCTGGCATACCCAGAGGCGGTGACCCAGCTGCCTATCTCCCCACTCTGGGCCATCCTCTTCTTCTCCATGCTGTTGATGCTGGGCATTGACAGCCAGTTCTGCACTGTGGAGGGCTTCATCACAGCCCTGGTGGATGAGTACCCCAGGCTCCTCCGCAACCGCAGAGAGCTCTTCATTGCTGCTGTCTGCATCATCTCCTACCTGATCGGTCTCTCTAACATCACTCAGGGGGGTATTTATGTCTTCAAACTCTTTGACTACTACTCTGCCAGTGGCATGAGCCTGCTGTTCCTCGTGTTCTTTGAATGTGTCTCTATTTCCTGGTTTTACGGTGTCAACCGATTCTATGACAATATCCAAGAGATGGTTGGATCCAGGCCCTGCATCTGGTGGAAACTCTGCTGGTCTTTCTTCACACCAATCATTGTGGCGGGCGTGTTCATTTTCAGTGCTGTGCAGATGACGCCACTCACCATGGGAAACTATGTTTTCCCCAAGTGGGGCCAGGGTGTGGGCTGGCTGATGGCTCTGTCTTCCATGGTCCTCATCCCCGGGTACATGGCCTACATGTTCCTCACCTTAAAGGGCTCCCTGAAGCAGCGCATCCAAGTCATGGTCCAGCCCAGCGAAGACATCGTTCGCCCAGAGAATGGTCCTGAGCAGCCCCAGGCGGGCAGCTCCACCAGCAAGGAGGCCTACATCTAGGGTGGGGGCCACTCACCGACCCGACACTCTCACCCCCCGACCTGGCTGAGTGCGACCACCACTTGATGTCTGAGGATACCTTCCATCTCAACCTACCTCGAGTGGCGAGTCCAGACACCATCACCACGCAGAGAGGGGAGGTGGGAGGACAGTTAGACCCCTGGGTGGGCCCTGCCGTGGGCAAGGATACCCGGTGGCTTCTGGCACCTGGCGGGCTGGTGACCTTTTTAATCCAGGCCCCATCAGCATCCCACGATCGGCCTTGGTAACCGCCGCGGTAGATCATTTTTATCCCGCCAGGGAGTGTGATGCAGGAAGACCACATGCGCTCCTGGCTTTTAAACCTGTTCCTGACTGTTCTCTTACTGCCGAAACCCTTGACTGTTATCTCGGACTTTGCAGGAGTTCCTTTCCCTCCGAACGCTGCTCCATGCACAGGAAAAGGGCATTTTGTACAATGGGGACTTCCCGGGAACGCTTGCTCTTAAGTACCAGA AGCCGGCGGAGCTCTGGCTTTCGTGTTTTTGGTTTTCTCCTTCCCAAGGCAGCTGGATTGAAAAAACAAAACAAAACAAAAAAACCCAGGGGCGTCAGTCGATATTCCCAGGGCCGCTTCTCCTGCAGTCTGTGGAGCGTCCTTGTCCCCGCCGCCGGAATGAATGAGCATTCTGCAGCCCGATGTCCCTGTCCCCTCCTCGCCGGGCCATTCTGATTGGACCTGGCCCAGTGCAATCTGTCCAGACAAGCCCTGCTTGCTGGAAAACTGCCACAAGCACAATTGATCTCTTTTTATCGCCATTCCAGGGGCCTCAGGTCCTACTGGGGAAACTTCCTATACCGGAGCTCCAGTTTCTCTTAAGCTGCCCAATTTCACAGAGTACAAAATAGTTGTAGGGGAAATCAAGGTGAAGGATCTGTCCGACAGTCAAGACGGATCCACAGTAATCTTTCGGTCTCCTTAAACTACCACCCTCGCTGCCACCCACCCCAAGCTGCTGCCGCCTCACCTTCCTTGAAATTTCTCAGCGGGAGTCTCCTCACTGCCACTAAAATCCACCCAGCCCACTAACTGAGGAGCTAGTGTTAATCCAGAGAACCCCCCGCAATGTGCTTCCGAGATTCAGACTGCTTCATTGGGAAGTATGATTTGTTCCTTTCTGGAATTGGGCTCCGTGGTGGCGGCGGCACTTCAAGCAAAGACAGTTTCTTGCAAGCTCCAGTAGCTCCGCGTGTCTCATTTGCCAGGAAGATGGGTTCCCACGTAGCAAATCGTACATTGTGCCCTGTAGCTCCTTAGCTAGTTAGCTCACAAGCCGTGTTTTATGACTAATCCTTAATAACTATGGTAAATAACTGTGACTGTGGGGTTTTTAATCTCTTGTCATTCTCATCCAAAAGTGACCAGCATACCAGTTCTTGCAATAAGATATTACCCTCAGAATATTAAGCACATTATTGTAGAGAAAAAAAAATATGTGTACACATATGAACGCACAACATGCACATTCATCCTCACATGTGGCACGTAAGGTCTCATTTGATATTGTGTAGGAAATCTGAAGCCTTTTCCTGAGGTCATCTGTAAAATAGTCTCATTGCCAAGGCATCCCCAGTGCCAGCTGGTGAATCCATGATCAAAATGCATACGTATTGTTAAATGATAAGGTTTAGAATGACAGGAACCCATCACTGTGTCTCATGGTCCCACTTCCCCATCTGTGTGTGAATTCCTTTAGACTAAGGGCAGGAAGACTTCCAGCTTTCTCTTTGTTCTTCAATGTGAAACTGAGACCAAGTCTCTCTAAGACAAATGCAGTGTATTTAATGTTTGTAAGCAATTCTAAGTGAGATGTTTGGCAAGAAATCCCCTAACTGATTTCCATCCAAACCTACCTTATAGAGCACAATATTAAGTGTTGTACAATTACTGTGAGAACTGTGAATATGTGTAACTTTTTTTTAGTATTTGCCCGGGGGGAAAAAGATATTGTATTATCATATATGCTTTTTTGCAATAAGGATTTATTCTCAGAACACCAAGTAAATCTATCTCTATATAAAAAATATATGTAATATATACATATTCAAAGTATATACAGAGCCTGTTTTAAAAAATACAGTATTATTTAGTAAAATTATCTGTTCTATGGACCAAATGTAAAATATTTATAAATGAAGATGCATTTTAAATGTCTATAAATGGTGTCATAACTAGAGCACGGGCGTTATGTAAGTTTCTAAGAATTTAGAGGATAAATAATAAAGGTTCTATGATATACAA
SEQ ID NO: 30 AAV真型DNA序列 TTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGACTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGCCCGGGCTAATTAGGGGGTGTCGCCCTTCGCTGAAGTCCTGTATTAGAGGTCACGTGAGTGTTTTGCGACATTTTGCGACACCATGTGGTCACGCTGGGTATTTAAGCCCGAGTGAGCACGCAGGGTCTCCATTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCGCAGCCGCCATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGATCCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGCCGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGAGCGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTAGCGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAGCTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGATGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACAGCCGCGGATAACAACAACAGTGACTACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTACTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGACTCAGGCAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGCGGCAACACCCAAGCAGCTACCAGCGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAATTGCTTGTTAATCAATAAACCGTTTAATTCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCGCGTCAAAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATGCATAATAAATACTGATAACATCTTATAGTTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTTCTAGAGCGGCCGCAGATCTCAGCTGGATATCAAAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTGTATATACAAAAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGTTCATCAATCGAAAAAGCAACGTATCTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATATATCAAGCAAAGTGACAGGCGCCCTTAAATATTCTGACAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATAAAAAAACCCGCCGAAGCGGGTTTTTACGTTATTTGCGGATTAACGATTACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCTTTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATATTCTTCCTT
SEQ ID NO: 31 小鼠 SLC6A1 NCBI參考NM_178703.4 ATGGCGACTGACAACAGCAAGGTGGCTGATGGGCAGATCTCTACTGAGGTCAGCGAGGCCCCTGTGGCCAGCGACAAGCCCAAAACCCTGGTAGTCAAGGTGCAGAAGAAGGCCGGGGACCTCCCTGACCGGGACACATGGAAGGGACGCTTCGACTTCCTCATGTCCTGCGTGGGCTATGCCATCGGCCTGGGCAATGTGTGGAGGTTCCCTTACCTCTGTGGGAAAAACGGTGGCGGGGCCTTCCTAATCCCATATTTCCTGACGCTCATCTTTGCGGGTGTTCCTCTCTTCCTTTTGGAGTGCTCCCTAGGCCAGTACACCTCCATTGGGGGCCTGGGCGTATGGAAGCTGGCGCCCATGTTCAAGGGTGTGGGCCTCGCGGCAGCTGTGCTGTCCTTCTGGCTGAACATCTACTACATCGTCATCATCTCCTGGGCCATCTACTACCTGTACAACTCCTTCACCACGACCCTGCCATGGAAACAGTGTGACAACCCGTGGAACACTGACCGCTGCTTCTCCAACTACAGCCTGGTCAATACCACCAACATGACCAGCGCCGTGGTGGAGTTCTGGGAGCGCAACATGCACCAGATGACAGATGGACTGGACAAGCCAGGACAGATCCGCTGGCCTCTGGCCATCACACTGGCCATTGCCTGGGTGCTCGTGTATTTCTGCATCTGGAAGGGTGTTGGTTGGACTGGAAAGGTGGTCTACTTCTCAGCCACGTACCCCTACATCATGCTTATCATCCTGTTCTTCCGTGGAGTGACGCTTCCCGGGGCCAAGGAGGGGATCCTCTTCTACATCACACCCAACTTCCGAAAGCTGTCTGATTCTGAGGTGTGGCTTGACGCCGCCACCCAGATCTTCTTCTCCTACGGGCTGGGCCTGGGGTCCCTGATTGCTCTGGGAAGCTACAACTCTTTCCACAACAATGTGTACAGGGACTCCATCATCGTTTGCTGCATCAACTCCTGCACCAGCATGTTTGCCGGATTCGTCATCTTCTCCATCGTGGGCTTCATGGCTCATGTCACCAAGAGGTCCATAGCTGATGTGGCAGCCTCAGGCCCGGGGCTGGCATTCTTGGCGTACCCTGAGGCTGTGACACAGCTACCCATCTCTCCCCTCTGGGCTATCCTCTTCTTCTCCATGCTGCTGATGCTGGGCATTGACAGCCAGTTCTGTACCGTGGAGGGCTTCATCACTGCCCTGGTGGACGAGTACCCCAGACTTCTCCGCAATCGCCGTGAACTCTTCATTGCTGCCGTGTGCATCGTGTCCTACCTGATTGGCCTGTCTAACATCACCCAGGGTGGCATTTATGTCTTCAAACTGTTTGATTATTACTCTGCCAGCGGCATGAGCTTGCTGTTCCTGGTTTTCTTCGAGTGTGTCTCCATTTCCTGGTTTTATGGTGTCAACCGGTTCTATGACAACATCCAGGAGATGGTTGGCTCCAGGCCCTGCATCTGGTGGAAGCTGTGCTGGTCCTTTTTCACACCCATCATTGTGGCGGGCGTGTTTCTCTTCAGTGCTGTGCAGATGACACCACTCACCATGGGAAGCTATGTTTTCCCCAAGTGGGGCCAGGGCGTGGGCTGGCTCATGGCTCTGTCCTCCATGGTGCTCATCCCCGGGTACATGGCTTACATGTTCCTCACCCTGAAGGGCTCCCTGAAGCAGCGTCTCCAGGTCATGATTCAGCCCAGTGAAGATATTGTGCGCCCTGAGAATGGCCCTGAGCAGCCGCAGGCTGGCAGCTCAGCCAGCAAGGAGGCCTACATCTAG
SEQ ID NO: 32 Myc標籤 GAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG
SEQ ID NO: 33 HA標籤 TACCCTTACGATGTACCGGATTACGCA
SEQ ID NO: 34 MECP2內含子 GCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAATTGGCCGCCGCTGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGTGAGTGGGACCGCCAAGGCCGCGGGCGGGGACCCTTGCTGGGGGGCGGGTAGGGGCGGGACGTGGCGCGGGAGGGGCCCGCGGGGTCGGGCGACACGGCTGGCGGTTGGCGTCCCTCCTCTCTACCCTCCCCCTCCCTCTGCCGCCGGTGGTGGCTTTCTCCACTCGTCTCCCGCAATCGCGAGCGACGGTTCTCAGCGCGATCTCCCTGGAGCCACCTTCGATTGACGCCCTCCCGCTGCCCGCCCCATCTGTGCGCATCCTAGGCCCCAGCTGTGCAAGCGCCCTTGTCGTCTGGGCTTCGCCAGTTGGGGCTGCGCGCGCTCCTGCCCTTCTTGGGGCTTTGGGCCTCGGCACTGTCGCGCGCCCGCGGTCCCGGCCTCTCCCTGGATCGCGCTGTCCCCTTCTCCCTCGCGCGCCCCCACTCCCGTTACTTGCTCCCCCCTCACACACACAGACTGGCGCGCGTGCGCAGTCCATCTCCCGTTGGGAGAGTGCGCCACAAGGGCTCCTGAGCTCTTACCCCCATCTCTGGGTTTTGCTCCCTCCTCCTCCTCTCCCATTCCGTGACTTTTTGCCCCCACTGCAAGCGAGTCGGTCCATCAGCTCCATTCCCCACTTGGCAGGAACAAGTTGAGGGTTATTGTCCACCCACAAAAAGGACTAGACATTTTGTTCCTAGGTCCCACAACTCATCATAAAGAGTTGGTTGTAGTTCTCATCAGGAACCGTGGGCAAGGGACTGTGCGTTCCTCAGCACTCGAAGCTCTTCCGTGAGACCTTGCCCGCAGGGTGCTCTGGTTCTTTGGGGTTGCTGTGCTGTGGCTTCGGAATTTGAGCGTCTTCCCACCCTCCCTCCCCTCCCTTCGCCAGCGTTCTGTCTACAAGAAAGAATAGGCAGGTGTCCTTGGATATCGTAGTTGCTAATCGCCTATACACTGTTCTATTACACCTTTCTGCTAAGGATAGGGTTTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGTTCCCCACCCTCCAGTTTGGTTTAGTTTTGGTTTTGGCATTTAGGGTTTTTTGGGGGGGAGTAATATCTTGTGGTAAAGACCCATCTGACCCAAGATACCTTTTTTCTCATACTGGAACCCTAGGCAGCAGTTGCTATTTCCCTGAGTTAGCAATAGTTTTACAGTATTTTGAGGCCTTTTGTCCATAATTCTCACGGAATCCCTCAGGGATCAGATTAGCTGCTGTTGGGATCAGGAAATTGGGTTACACCGCTGAAATCTCTTGCTGGGGCCCTTGTTTTGAATTGGAAAGTCAGGAGGCTGGAACGAAGGCTCACAAGTTAACAGTGCCAGCTGCTCTTCCAGAAGCCCTGGATTCAGTCCCACCAATCCATCGCGGGTCACAACCATCTGTAACTTCAGTCCCAAGGGGTCCGAAGCCCTCTTCTGGCTTTGCCCTATTATTTTATTTATCTTATCTGTTTTTGTCTTGTCATCTGGCAAGCCCAGGGGGCCATTGGGTGCAACTTATAAACTGACTTCTGTATCTTAAGAAGCCAACCATACAGTGCTTACATTCCAGAAAAAAAATCTGCCACTTTAACAGCACTAGAACTAGGGTTTAGAGAAGTATCATAAAGGTCAAATATCTTTGACCAATATCACCAGCAACCTAAAGCTGTTAAGAAATCTTTGGGCCCCAGCTTGACCCAAGGATACAGTATCCTAGGGAAGTTACCAAAATCAGAGATAGTATGCAGCAGCCAGGGGTCTCATGTGTGGCACTCAAGCTCACCTATACTCACTACTGTGCAGACAGCTGTGTTCTCTGTAATACTTACATATTTGTTTAATACTTCAGGGAGGAAAAGTCAGAAGACCAGGATCTCCAGGGCCTCA
SEQ ID NO: 35 EF1a啟動子 GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCACTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG
現將參照附圖中示出的實施例，藉助於實例進一步描述本發明。
實例 實例 1 ： 構築體設計、產生及選殖本研究中使用之質體係藉由重組DNA技術構築。AAV順式主鏈質體係重新(de-novo)合成的且含有兩個AAV反向末端重複序列(ITR)、卡那黴素抗性卡匣、原核複製起點及SV40聚腺苷酸化序列。用方便的選殖限制位點重新合成編碼GAT-1之同功異型物之人類及小鼠SLC6A1 DNA序列(分別包含SEQ ID NO: 15及31(或16))。藉由方便的限制性位點重新合成個別啟動子。從Integrated DNA Technologies™ (Coralville, IA, USA)合成呈寡核苷酸之人類流感血球凝集素(HA)或Myc標籤(分別根據SEQ ID NO: 33及32編碼)且如圖3中所指示插入於胺基或羧基端處。對人類及小鼠SLC6A1基因的四種不同啟動子進行了測試。
實例 2 ： 評估不同啟動子下之 SLC6A1 表現 細胞培養 人源性AD-HEK293 (Agilent Technologies™, Santa Clara, CA, USA)及小鼠源性Neuro-2A (ATCC™, Manassas, VA)細胞株在DMEM+10% FBS+1%青黴素/鏈黴素(均來自Thermo Fisher Scientific™, Waltham, MA, USA)中繼代。如先前描述藉由向生長培養基中補充10 µM視黃酸(MilliporeSigma™, Burlington, MA, USA)以將Neuro-2A細胞分化72小時(Tremblay, R. G.等人, Differentiation of mouse Neuro 2A cells into dopamine neurons. J Neurosci Methods 186, 60-67, doi:10.1016/j.jneumeth.2009.11.004 (2010))。細胞根據製造商的方案使用脂染胺2000 (Thermo Fisher Scientific™, Waltham, MA, USA)進行轉染。亦包括不具有質體之對照組轉染。
免疫螢光法及顯微法 成像實驗係在裝備有20×物鏡及Hamamatsu Orca 4閃光冷卻單色相機(Hamamatsu Photonics KK™, Hamamatsu City, Japan)的Zeiss Axio Observer 7落射螢光顯微鏡(Carl Zeiss AG™, Oberkochen, Germany)上執行。經轉染之AD-HEK293及Neuro-2A細胞用4%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, 19440)固定，且用1:100之初級抗體兔單株抗GAT-1 (Abcam™, Cambridge, MA, USA)或用1:100之兔多株抗GAT-1 (Cell Signalling Technology™, Danvers, MA, USA)進行染色。細胞隨後在成像之前用與Alexa Fluor 488或568結合之1:1,000之山羊抗兔二級抗體進行染色。
如圖4中所示，在普遍存在的EF1a、PGK、UBC及CAG啟動子控制下所有經轉染細胞均顯示小鼠及人類轉殖基因之穩健表現。如所預期，CAG啟動子觀測到最強表現，PGK啟動子則觀測到較低表現。
亦分析經不同神經元特異性啟動子及CAG普遍存在的啟動子驅動之mSLC6A1質體轉染的Neuro-2A轉染細胞。如圖5中所示，所有啟動子均導致小鼠SLC6A1之表現；如所預期，與強及普遍存在的CAG啟動子相比，神經元特異性啟動子較弱。經轉染之AD-HEK293及Neuro-2A之放大圖像顯示，自此等質體表現之SLC6A1如所預期定位至質膜(圖4及5B)。
西方墨點法分析 根據製造商說明書，於含有1X Halt蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物(Thermo Fisher Scientific™, Waltham, MA, USA)之1X細胞裂解緩衝液(Cell Signaling Technology™, Danvers, MA, USA)中採集經轉染AD-HEK 293細胞。將補充有10%還原劑之十二烷基硫酸鋰(LDS)樣品緩衝液(均來自Thermo Fisher Scientific™, Waltham, MA, US)添加至蛋白質裂解物中直至最終濃度為1×。樣品藉由1D SDS-PAGE凝膠電泳解析。對於各樣品，每個泳道裝載30 µg蛋白。使用半乾式轉移設備(Bio-Rad Laboratories™, Hercules CA)將蛋白質轉移至硝化纖維素膜(Li-Cor Biosciences™, Lincoln, NE, USA)。在轉移之後，膜在室溫下在阻斷溶液(Li-Cor Biosciences™, Lincoln, NE, USA)中培育1小時。膜隨後與含有初級抗體之阻斷溶液在4℃下培育隔夜。以下初級抗體用於該分析：1:1,000之兔單株抗體GAT-1 (Abcam™, Cambridge, MA, USA)、1:1,000之兔多株抗GAT-1 (Cell Signalling Technology™, Danvers, MA, USA)、1,1000之兔多株抗c-myc (MilliporeSigma™, Burlington, MA, USA)、1:1,000之兔單株抗HA (Cell Signalling Technology™, Danvers, MA, USA)、1:1,000之小鼠單株抗GAPDH (Thermo Fisher Scientific™, Waltham, MA, US)、1:1,000之兔單株抗GAPDH (Cell Signalling Technology™, Danvers, MA, USA)。膜用PBST溶液洗滌三次，置放於含有IRDye 800CW或680LT山羊抗小鼠或山羊抗雞二級抗體(1:15,000; Li-Cor Biosciences™, Lincoln, NE, USA)之阻斷溶液中，適用於在室溫下在遠紅光譜上偵測1小時。使用Li-Cor Odyssey CLx遠紅成像器(Li-Cor Biosciences™, Lincoln, NE, USA)觀測蛋白質。
SLC6A1為具有12個跨膜域且經糖基化之膜蛋白(Bennett, E. R.及B. I. Kanner. J Biol Chem. 272, 1203-1210, (1997))。在還原條件下SLC6A1單體之分子質量預測為約70 kDa且蛋白質藉由西方墨點法偵測為二聚體及高分子質量聚集體，此可能係由於其膜拓樸及轉譯後修飾。此與文獻中之SLC6A1所偵測到的頻帶模式一致(Bennett, E. R.及B. I. Kanner. J Biol Chem. 272, 1203-1210, (1997))。在一些條件下在約28 kDA之較低分子量下偵測到的額外頻帶可能為SLC6A1之降解產物。使用GAPDH之偵測作為內參照物。此等結果顯示，藉由由CAG啟動子驅動之N端及C端標記之構築體達成穩健表現(圖6)。當使用人類及小鼠樣品(圖C泳道標記為H及M)腦裂解物中之SLC6A1抗體檢測到該蛋白時，亦獲得類似結果。
實例 3 ： 病原性、可能病原性及天然存在之變異體鑑別及分析ClinVar資料庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)係一個可免費存取的關於人類變異及表型之間關係報導的公共檔案，且帶有支持證據，用於使用搜尋術語「SLC6A1」及「病原性」或「可能病原性」以鑑別SLC6A1基因變異體。病原性變異體之清單由發表在科學同行評述文獻中的突變補充，且由PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索使用搜尋術語「SLC6A1及突變」進行手動管理且由作者將其定義為病原性，以鑑別ClinVar中未報導之其他SLC6A1病原性變異體。
隨後鑑定GAT-1蛋白質中由胺基酸變化產生之病原性及可能病原性變異體(表2A)。藉由框移或缺失胺基酸或產生終止密碼子之突變產生之其他病原變異體顯示於表2B中。 表 2A
由胺基酸變化產生之病原性及可能病原性變異體( 參考SEQ ID NO: 18)
R44W G297R
R50L A305T
S56F G307R
G63S V323I
N66D A334P
G75R V342M
G79R A357V
F92S G362R
G94E L366V
G105S F385L
Q106R G393S
Y140C S456R
C173Y S459R
F270S M487T
R277H V511L
A288V G550R
S295L G79V
D52E A367T
D52V G112V
F53S G232V
表 2B
由其他突變產生之病原性及可能病原性變異體
A358fs N66fs
A9fs R419fs
G457fs R50fs
L113fs S175fs
L408fs V446fs
C74* Q534*
Q397* R479*
W135* W235*
W500* W532*
Y246* Q199*
Q291* I268fs
I148fs S437fs
L363fs T170fs
F174del F294del
除胺基酸變化所致之突變之外，可發生其他突變。所鑑別之一種類型的突變為涉及核苷酸之插入或缺失的突變，其中改變之鹼基對之數目不可被三整除，由此引起新胺基酸之產生(框移，如表2B中之fs指示)。若突變破壞正確閱讀框架，則突變之後的整個DNA序列將被不正確地讀取。更特定言之，如表2B中所指示之A358fs意謂參考SEQ ID NO: 18之位置358之丙胺酸由於核苷酸之框移而變化，產生具有不正確胺基酸序列之異常蛋白質產物。
所鑑別之另一類型之突變為移除蛋白質中之一或多個胺基酸殘基之DNA水準的突變。此類型之突變在表2B中指定為缺失(del)。例如，F174del意謂移除參考SEQ ID NO: 18之位置174之苯丙胺酸，且蛋白質將短1個胺基酸且缺失Phe174。
最後，所鑑別之另一類型的突變為引入終止密碼子(由表2B中之星號(*)指示)，其在本文中報導為例如C74*，此意謂蛋白質參考SEQ ID NO: 18在位置74處之半胱胺酸處停止轉譯且蛋白質將自此位置向前截短。
健康群體中天然存在之變異體源於gnomAD (基因體聚集資料庫-https://gnomad.broadinstitute.org/ v2.1.1)，其為一個公開的對照資料集，含有來自使用查詢術語「SLC6A1」的無關個體的60,146個樣品的遺傳資訊。自對照資料集提取之變異體包括誤義，引起胺基酸變化，開始損失變異體(DNA序列中之點突變導致AUG起始密碼子之損失，引起GAT-1之減少或消除)且終止獲得變異體(DNA序列中之點突變，其產生新的終止密碼子，最終引起GAT-1之減少)。產生胺基酸變化之天然存在之變異體報導於表3中。 表 3
天然存在之變異體 ( 參考 SEQ ID NO: 18)
Ala2Thr Asp165Tyr Arg277Ser Ile434Met Arg579His
Gly5Ser Arg172Cys Arg277Cys Ser470Cys Pro580Ser
Asp10Asn Arg172His Arg277Pro Ile471Val Pro587Ala
Gly11Arg Phe174Tyr Ser280Cys Gly476Ser Ala589Val
Ile13Thr Ser178Asn Asn310Ser Arg479Gln Ile599Val
Glu16Lys Asn181Asp Tyr317His Lys497Asn Met1 (開始損失變異體)
Glu19Gly Asn181Lys Ile321Val Phe502Tyr Glu411 (停止獲得變異體)
Pro21Thr Arg195His Ser328Leu Ile506Val   
Lys33Glu Met197Leu Met332Val Ala509Val   
Val34Leu Asp202Glu Val337Ile Thr520Met   
Asp40Asn Lys206Glu His347Arg Gly535Val   
Asp43Glu Arg211Cys Ala354Val Leu547Phe   
Lys76Asn Ile220Val Leu375Met Met552Ile   
Asn77Asp Ile220Asn Ile377Val Met555Val   
Ile84Phe Ala221Thr Ile405Val Thr558Asn   
Phe87Leu Val240Ala Val409Met Arg566His   
Ile91Val Phe242Val Leu415Ile Gln572Arg   
Val142Ile Tyr246Cys Arg417Cys Pro573Thr   
Thr156Asn Arg257Cys Arg417His Pro573Ser   
Thr158Pro Arg257His Arg419Cys Ser574Asn   
Asp165Asn Thr260Met Arg419His Val578Ile   
實例 4 ：病毒顆粒產生 AAV 產生 含有AAV2 Rep序列接著為AAV9.hu14 (以下簡稱AAV9)或AAV-真型(以下簡稱AAVtt)衣殼序列(其胺基酸序列分別為SEQ ID NO: 24及25)的反式質體藉由ATUM™ (Newark, CA, USA)從頭合成。AAV輔助質體pALD-X80購自Aldevron, LLC™ (Fargo, ND, USA)。
藉由三重轉染方法產生非複製AAV載體。在燒瓶中以3.0E+05 - 3.5E+05個細胞/毫升的接種密度使用Expi293表現培養基(Thermo Fisher™, Waltham, MA, USA)每3至4天繼代Expi293細胞(Thermo Fisher™, Waltham, MA, USA)。在實驗開始之前的最後繼代中，細胞在2×1,000 mL搖瓶中以每病毒製劑220 mL之總工作體積以3.5E+05個細胞/毫升繼代。使用Vi-Cell Blu ((Beckman Coulter™, Pasadena, CA, USA)計算活細胞密度。在轉染前一天，以1.5E+06個細胞/毫升接種搖瓶。
如下為各燒瓶創建轉染錯合物：在1.5 mL OptiPRO無血清培養基(Thermo Fisher™, Waltham, MA, USA)中稀釋180 µL聚乙烯亞胺(PEI)，最大濃度為1 mg/mL (Polysciences Inc™, Warrington, PA, USA)，在設定8下渦動四次且在室溫下培育5分鐘。分別地，在1.5 mL OptiPRO無血清培養基中稀釋20 µg順式質體(CAG-hSLC6A1)、30 µg Rep/Cap質體(AAV9或AAV-tt)及40 µg輔助質體(pALD-X80)，在設定8下渦動四次且在室溫下培育5分鐘。接著將此等兩種混合物合併，在設定8下渦旋四次且在室溫下培育15分鐘。隨後將轉染錯合物添加至含有細胞之搖瓶中。在37℃下在以125 rpm之恆定攪拌下將細胞與轉染混合物一起培養。
在96小時之後，燒瓶外加AAV裂解緩衝液至最終濃度為1× (150 mM NaCl、120 mM Tris-HCl [pH = 8.0]、2 mM MgCl2、0.1% Triton X-100)及核酸酶(MilliporeSigma™, Burlington, MA, USA)至最終濃度為50 U/mL。在37℃下在以125 rpm之恆定攪拌下培育此混合物1小時。藉由在23℃下在2,250×g下離心20分鐘使混合物澄清。樣品儲存在-80℃下直至進一步分析。
AAV 效價測定 自-80℃移出各樣品且使其在室溫下解凍15分鐘。一旦將樣品解凍，即將其短暫渦旋且離心一分鐘。在此之後，將10 µL樣品添加至96孔PCR培養盤之個別孔中，與10× DNA酶緩衝液、50 U DNA酶及無DNase水(均來自Promega™, Madison, WI, USA)組合，各孔中的總體積為100 µL。
隨後將盤轉移至Bio-Rad™ (Hercules, CA, USA)熱循環儀且在37℃下加熱30分鐘，隨後冷卻至4℃。隨後如表4中所描述連續稀釋樣品。 表 4
樣品稀釋流程
稀釋步驟 中間稀釋因子 中間樣品 中間體積(µL) 稀釋劑體積(µL) 總體積(µL) 總DF
D0 10 經DNA酶處理之樣品 100 NA 100 10
D1 1.5 D0 100 50 150 1.50E+01
D2 10 D1 10 90 100 1.50E+02
D3 3 D2 10 90 100 1.50E+03
D4 3 D3 10 90 100 1.50E+04
D5 3 D4 10 90 100 1.50E+05
五(5)µL稀釋液D2、D3、D4及D5與20µL ddPCR主混合物混合，該主混合物由Supermix for Probes (No dUTP; Bio-Rad™, Hercules, CA, USA、正向引子GATCCAGACATGATAAGATACATTG、反向引子GCAATAGCATCACAAATTTCAC、探針6-Fam/Zen/3'IB FQ: TGGACAAACCACAACTAGAATGCA及無DNA酶水組成，至最終濃度為1X。各樣品在96孔PCR培養盤中一式兩份地操作。
用箔片覆蓋物熱密封培養盤，使脈衝渦旋，且以1,000×g離心5分鐘。將盤置放於Bio-Rad™QX-200液滴產生器中且根據製造商說明書產生液滴。
在液滴產生之後，使用箔片覆蓋物熱密封培養盤且置放於經程式化以運行表5中所描述之循環的Bio-Rad™熱循環器中。 表 5
PCR擴增設定(所有升溫均設定在2.5℃/秒下)
循環步驟 溫度 持續時間 循環數目
酶活化 95℃ 10分鐘 1
變性 95℃ 30秒 39
退火/延伸 56℃ 1分鐘
酶失活 98℃ 10分鐘 1
保持 4℃ 無限 1
完成後，將培養盤置放於Bio-Rad™ QX200液滴中用於根據製造商說明書讀取液滴。載體基因體之濃度(VG/mL)使用下式進行定量： VG/ML: X = [(aY)(1000/b)]D 其中： X為VG/mL； a為ddPCR反應物體積(25 µl)； Y為每微升複本中之ddPCR讀數； b為ddPCR中之稀釋劑載體之體積(5 µL)； D為施加至測試材料之總稀釋度。
分析驗收準則如下定義： 複本之間的%CV必須為≤15%；若＞15%，則可省略一個離群值。若省略一個離群值且%CV保持＞15%，則需要重複分析。內部稀釋%CV需要≤20%且報導之稀釋度需要至少兩次連續稀釋。若%CV＞20%，則可省略稀釋度，只要所報導之稀釋度為至少兩次連續稀釋。若平均稀釋度仍＞20%，則需要重複分析。各反應孔需要具有≥1,000個可接受的液滴。若＜10,000個液滴，則自分析排除孔。
AAV 衣殼 ELISA 定量病毒顆粒 使用針對AAV9及AAV2設計的AAV滴定ELISA套組(PROGEN™ Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany)，根據製造商說明書確定各構築體之病毒顆粒效價。對於AAV9，將小鼠單株ADK9抗體用於捕獲與偵測步驟。對於AAVTT，A20R單株抗體用於捕獲及偵測步驟兩者。在各步驟之間使用Molecular Devices™ (San Jose, CA, USA) AquaMax 4000微培養盤洗滌器對所提供之1×分析緩衝液(ASSB)進行洗滌。用Molecular Devices™ SpectraMax M5e盤讀取器偵測樣品。自標準曲線內插衣殼效價且報導於表6中。 表 6
構築體 燒瓶編號 衣殼 衣殼效價 (VP/mL) 總病毒顆粒 (VP) 效價 (VG/mL) 總效價 (VG)
CAG-hSLC6A1 1 AAV9 4.43E+11 2.92E+13 7.37E+09 4.86E+11
CAG-hSLC6A1 2 AAV9 5.49E+11 3.62E+13 7.53E+09 4.97E+11
CAG-hSLC6A1 1 AAVtt 2.82E+11 1.86E+13 1.11E+10 7.29E+11
CAG-hSLC6A1 2 AAVtt 1.91E+11 1.26E+13 7.22E+09 4.77E+11
藉由ddPCR獲得之病毒基因體效價及ELISA獲得之衣殼效價指示可成功地產生AAV9及AAVTT病毒顆粒，該等病毒顆粒包含病毒載體，該病毒載體具有包含可操作地連接於人類SLC6A1轉殖基因之CAG啟動子的核酸。
實例 5 ： SLC6A1 之突變形式的活體外 GABA 攝取產生由表現hSLC6A1-WT序列之CAG啟動子或稍後所描述之突變形式(病原性變異體：S295L、A288V、F270S，亦參見實例3)組成的不同工具質體。所有質體經由內部核糖體進入位點(IRES)系統編碼螢光蛋白(tagRFP)，允許表現2種獨立蛋白質(圖7A)。後者允許確認不同條件下類似的轉染水準。
將COS7細胞(猴纖維母細胞樣細胞株)接種在閃爍微量培養盤上且使用脂染胺2000且遵循製造商說明書經上文所描述之工具質體轉染。在轉染後2天，用基於tagRFP報導基因之落射螢光顯微鏡檢查轉染水準。所有轉染條件均類似(資料未示出)。隨後將COS7細胞提交至GABA攝取分析。簡言之，將細胞洗滌且在37℃下用特異性GAT-1抑制劑(CI-966 (Tocris, Cat No 1296)，最終濃度為100 µM/1% DMSO)或單獨用媒劑(1% DMSO)處理10分鐘。細胞隨後在37℃下用氚化與冷GABA ([3H]GABA 10µCi/ml及15µM GABA最終濃度)之混合物處理10分鐘且在使用Microbeta儀器(PerkinElmer)定量放射活性之前，使用1 mM冷GABA停止反應。
如圖7B中所示，相比於野生型SLC6A1，所描述之SLC6A1的病原性變異體在功能性GABA攝取分析中顯示出顯著減少。
實例 6 ： 不同啟動子下的 SLC6A1 介導之 GABA 攝取使用脂染胺3000且按照製造商說明書，用實例1中所描述之構築體轉染SH-SY5Y細胞(人類神經母細胞瘤細胞株)。陽性對照物係由編碼hSLC6A1之質體組成，該質體處於與tagRFP螢光蛋白一起表現之CAG啟動子的控制下，同時作為陰性對照物(且匹配質體缺乏hSLC6A1序列)。轉染後2天，SH-SY5Y細胞經測試用於GABA攝取分析之ICC分析。簡言之，ICC分析如下進行：將細胞用4%多聚甲醛固定且用1:250之初級抗體兔單株抗GAT-1 (Ref: ab177483; Abcam™, Cambridge, MA, USA)染色。細胞隨後在成像之前用與Alexa Fluor 488結合之1:1,000之山羊抗兔二級抗體進行染色。基於螢光細胞之數目估計轉染水準且示於表7中。對於GABA攝取分析，細胞預先接種在閃爍微量培養盤上。轉染後2天，將細胞洗滌且在37℃下用特異性GAT-1抑制劑(CI-966 (Tocris, Cat No 1296)，最終濃度為100 µM/0.8% DMSO)或單獨用媒劑(0.8% DMSO)處理10分鐘。細胞隨後在37℃下用氚化與冷GABA ([3H]GABA 8µCi/ml及15µM GABA最終濃度)之混合物處理10分鐘且在使用Microbeta儀器(PerkinElmer)定量放射活性之前，使用1 mM冷GABA停止反應。
如表7中所示，構築體與基於GAT-1免疫染色之不同pAAV轉染水準相關。另外，所有啟動子引起功能性GAT-1蛋白質之表現，顯示為[3H] GABA之攝取，當細胞用媒劑處理時存在且當細胞用GAT-1抑制劑處理時抑制(圖8)。 表 7
CAG ( 工具 ) CAG EF1a + 內含子 GTVC-CMV CMV PGK UBC Mecp2 Mecp2 + 內含子 hNSE1 CamKII hSyn hDLX 內源性 hSLC6A1 啟動子
+++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ + ++ + + ++ + ++
實例 7 ： LVV 主鏈中之 Prom-hSLC6A1 構築體之活體外篩選將攜有DOX-誘導型NGN2表現之基因編輯iPSC株分化成iPSC衍生之神經元(BIONi010-C-13株)。在此方案中，NGN2轉錄因子係藉由多西環素誘導9天以引發神經元分化。在活體外(DIV) 21天，在所關注之不同啟動子的控制下，用表現hSLC6A1之慢病毒載體的連續稀釋液轉導iPSC衍生之NGN2神經元。在DIV 28下，ICC分析如下進行：將細胞用2%多聚甲醛固定且用1:250之初級抗體兔單株抗GAT-1 (Ref: ab177483; Abcam™, Cambridge, MA, USA)染色。細胞隨後在成像之前用與Alexa Fluor 568結合之1:1000之山羊抗兔二級抗體進行染色。使用經驗參數用InCell分析儀6000儀器進行成像。代表性圖像在圖9中展示為具有經調適用於每一圖像之設定及參數。與iPSCs衍生之NGN2神經元(一種非永生化細胞株的人類細胞系統)中的內源性GAT-1相比，將信號與非轉導細胞進行比較，允許觀測到hSLC6A1在不同啟動子下的轉錄及表現。
實例 8 ： 所選卡匣之活體外及活體內表現選擇四種病毒載體用於進一步研究且各病毒載體之特徵在於不同啟動子。CAG啟動子(CAG)、PGK啟動子(PGK)、hDLX啟動子(hDLX)及天然存在及內源性SLC6A1啟動子(本文中稱為ENDO)用於驅動人類SLC6A1表現。經工程改造以用於SLC6A1蛋白質的構築體待在N端表現為具有HA標籤。由hSyn-eGFP-NLS組成之病毒載體作為對照(在本文中稱為「對照組AAV9」)。將所選病毒載體封裝於AAV9中且進行活體外及活體內測試。根據比利時法律，所有活體內實驗均按照動物實驗倫理委員會發佈的指南進行。該等實驗根據歐洲委員會委員指令(2010/63/EU)進行。進行所有努力以使動物痛苦降至最低。
小鼠原發性皮質神經元細胞由E17小鼠胚胎之皮質組織製備。皮質組織在37℃下使用番木瓜蛋白酶解離30分鐘且在補充有B27補充劑2%、GlutaMAX-I 1 mM及青黴素-鏈黴素50單位/毫升之Neurobasal™培養基中維持培養。每週更換一半培養基。在分裂DIV 7時，神經元細胞用不同AAV9載體以2 MOI (2.5E+6 GC/細胞及5.0E+5 GC/細胞)轉導。用「對照組AAV9」評估轉導水準且水準在兩種MOI條件下均較高(MOI或感染倍率為藥劑(例如病毒)與感染標靶(例如細胞)的比率)。在DIV 13下，固定細胞且針對不同標記物染色。首先，藉由量測與GAT-1染色(1:200; Ref: ab177483; Abcam™, Cambridge, MA, USA)共定位的陽性抗HA染色(1:100; Ref: 2367S, Cell Signaling Technology)來證明SLC6A1轉殖基因的表現。在所有病毒載體中觀測到共定位。其次，利用抗MAP2作為泛神經元標記物(1:5000; Ref: ab5392; Abcam™, Cambridge, MA, USA)、抗GABA (2.5 µg/mL; Ref: A2052; Sigma)進行反染色以鑑別GABA能神經元且用抗GFAP (1:5000; Ref: ab7260; Abcam™, Cambridge, MA, USA)進行反染色以鑑別星形膠質細胞。結果(資料未示出)證實hDLX啟動子驅動主要在GABA能神經元中之表現。相比之下，PGK及ENDO啟動子驅動星形膠質細胞及神經元細胞類型內之表現，其至少在GABA能神經元中驅動表現。與PGK啟動子相比，ENDO啟動子顯示出對GABA能神經元之較好細胞特異性，且亦導致表現模式與未轉導細胞(在對照條件下為野生型，無病毒載體)中觀測到的GAT-1之內源性表現更加一致。經由CAG啟動子的表現引起強表現及對活體外神經元網路發育的MOI依賴性負面影響。
藉由在產後第1天將病毒載體同步注射至C57BL/6J雄性小鼠中之側腦室中，研究封裝於AAV9中之四種所選擇之病毒載體之活體內表現，如表8中所述。 表 8
處理時之年齡 遞送途徑 病毒載體 效價
產後第1天PND1    ICV兩側注射2ul/半球    AAV9-CAG-HA-hSLC6A1 1.32E+13GC/mL
AAV9-PGK-HA-hSLC6A1 1.33E+13GC/mL
AAV9-hDLX-HA-hSLC6A1 1.27E+13GC/mL
AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1 1.23E+13GC/mL
AAV9-hSYN-eGFP-NLS (對照組AAV9) 1.36E+13GC/mL
媒劑PBS (無菌磷酸鹽緩衝鹽水1X)   
將兩組其他小鼠注射有媒劑PBS或「對照組AAV9」來作為對照。
在注射之後5週內，對所有動物組(媒劑PBS、對照組AAV9、AAV9-CAG-HA-hSLC6A1、AAV9-PGK-HA-hSLC6A1、AAV9-hDLX-HA-hSLC6A1及AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1)進行生命評估(臨床跡象、不良影響、體重增加及死亡率)。一週一次監測體重差異以便評定小鼠之整體健康狀況。在最後一次評估之前，注射不同病毒載體的不同組中的體重增加無顯著差異。注射AAV9-CAG-HA-hSLC6A1之小鼠在5週監測過程中顯示存活率降低(20%存活率)。達到人道終點，且在注射後第三週至第四週對小鼠實施安樂死。在5週監測過程中，注射AAV9-PGK-HA-hSLC6A1之小鼠亦顯示出稍微降低之存活率(85%存活率)，但不顯示任何臨床毒性跡象。關於其他組，注射載體PBS、對照組AAV9、AAV9-hDLX-HA-hSLC6A1或AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1的對照組小鼠均未顯示出任何發病跡象。
在注射後5週時，動物根據歐洲委員會委員指導(2010/63/EU)在異氟醚麻醉下用PBS灌注。採集大腦，解剖且提交用於生物化學分析，亦即DNA/RNA自左額葉皮質及海馬體提取，而蛋白質自匹配右額葉皮質提取。簡言之，使用AllPrep微型套組(Qiagen TM, 80204)遵循製造商說明進行DNA/RNA提取，且包括用於RNA提取之DNA酶治療。使用Precellys 24儀器(Bertin Technologies)使組織裂解於RLT Plus緩衝液(補充有β-巰基乙醇)中。量測DNA濃度且針對所有樣品將其調節至20 ng/µl。接著，使用對SV40聚A信號(存在於所有AAV卡匣中)具有特異性之引子/探針將40 ng提供至qPCR。使用ValidPrime®套組(tataabiocenter, A106P25)對小鼠基因體之量進行分析。ValidPrime®經高度優化且對gDNA的非轉錄基因座具有特異性，該基因座存在於每單倍體正常基因體恰好一個複本中。對於SV40p及ValidPrime®兩者，使用標準曲線法來測定絕對複本數。使用套組High Capacity cDNA RT套組+RNA酶抑制劑(Applied Biosystems cat n°4374966)對500 ng RNA進行反轉錄(RT) PCR。隨後，將所獲得cDNA提交至SV40聚A信號qPCR，以及兩個參考基因用於將結果進行標準化。測定相對表現且根據所有組之平均值按比例調整。對於蛋白質提取，使用Precellys 24儀器(Bertin)及冷卻系統在RIPA緩衝液(Pierce, 89900)中裂解組織，該緩衝液包括2x濃縮蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物(Cell Signaling Technology, #5872)。將樣品靜置在冰上30 min，離心且收集上清液作為最終蛋白質提取物。使用BCA蛋白質分析套組(Pierce, 23227)測定蛋白質濃度，且將10 µg蛋白質與Laemli緩衝液及β-巰基乙醇混合且在30℃下培育20分鐘，隨後進行SDS-Page。將凝膠轉移至硝化纖維膜中且接著提交至標準WB程序。簡言之，膜在阻斷溶液(Ref: 927-50000; Li-Cor)中在4℃下培育1小時。初級抗體由兔單株抗GAT-1 (1:2000; Ref: ab177483; Abcam™, Cambridge, MA, USA)、小鼠單株抗HA (1:1000; Ref: 2367S, Cell Signaling Technology)及小鼠單株抗GAPDH (1:10000; Ref: G8795, Sigma)組成。所用二級抗體為IRDye® 680RD驢抗小鼠IgG二級抗體(1:20000; Ref: 926-68072, Li-Cor)及IRDye® 800CW驢抗兔IgG二級抗體(1:20000; Ref: 926-32213, Li-Cor)。
如圖10，圖A中所示，在DNA提取物中偵測到每二倍體小鼠基因體之顯著病毒基因體複本，證明不同病毒載體之間的高效及均勻AAV9轉導。包含PGK啟動子之病毒載體具有略微降低之轉導水準。RNA表現分析揭露轉殖基因在所分析之所有病毒載體中之表現(圖10，圖B)。相對比較允許在SV40pA mRNA表現的病毒載體中對啟動子強度進行總體排序。與具有SLC6A1轉殖基因之病毒載體相比，對照組AAV9構築體產生高水準表達。其中包含PGK及ENDO啟動子之病毒載體(其中後者更表現於海馬體中)顯示高於hDLX啟動子之表現。
蛋白質分析證實DNA及RNA結果，相比於對照組(注射有媒劑PBS之未經轉導的動物或注射有對照組AAV9之經轉導的動物)，包含PGK及ENDO啟動子之病毒載體在組織水準下顯著過度表現GAT-1 (圖11)。啟動子PGK及ENDO引起GAT-1蛋白質表現之類似水準，而hDLX啟動子顯示較低但仍可偵測之表現。
藉由免疫組織化學分析來自注射有AAV9-PGK-HA-hSLC6A1、AAV9-hDLX-HA-hSLC6A1及AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1之其他小鼠的腦樣品。新鮮冷凍切片(12 µm厚；矢狀)由QPS Austria (Austria)之低溫切片機生成，且在-80℃下儲存。所有後續培育步驟均在室溫下進行。使用以下方案對小鼠腦切片進行三免疫螢光標記：切片用NeuN (1:2,000; Abcam, ab177487)、GFAP (1:2,000; SySy, 173006)及生物素結合之HA (1:5,000; Biolegend, 901505)初級抗體一起培育，在潮濕腔室中在含0.3% Triton X-100之PBS中稀釋隔夜。在培育之後，將切片用PBS洗滌3次，接著用抗雞Alexa Fluor 488及抗兔Alexa Fluor 546二級抗體及鏈黴抗生物素蛋白結合之Alexa Fluor 647 (全部在PBS中以1:1,000稀釋；全部來自Thermo Fisher)一起培育1小時。接著，其用DAPI複染以標記細胞核且用PBS洗滌3次。將該等切片最終用Prolong Gold抗螢光衰減封固培養基(Life Technologies)進行封固，且施加蓋玻片。使用具有20x物鏡之AxioScan Z1玻片掃瞄器(Zeiss)獲得染色切片之數位影像。對HA之免疫標記用於研究自不同啟動子過度表現之人類SLC6A1的分佈，該等啟動子包括PGK、人類DLX及SLC6A1內源性啟動子。
在整個腦部中偵測到在3種不同啟動子之作用下經由HA-標籤標記偵測之GAT-1蛋白質表現，主要在紋狀體、海馬體、大腦皮質、下丘腦、蒼白球及隔膜中(圖12，圖C、F及I)。對於PGK啟動子而言，亦在髓質及大腦核中觀測到HA-標籤標記(圖12，圖C)。
根據啟動子，亦在海馬體中觀測到GAT-1表現具有略微不同的模式。對於所有3種啟動子，在構成齒狀回及海馬體以及定向層之分子層之神經元投射中觀測到HA-標籤染色(圖13，圖C、F及I)。另外，hDLX啟動子引起GAT-1在海馬角3 (cornus ammonis 3，CA3)中之表現(圖13)，而PGK及ENDO啟動子引起GAT-1在為GFAP+之星形膠質細胞中之表現(圖13，圖C及I)。
在大腦皮質之神經纖維網中觀測到GAT-1表現(圖14，圖C、F及I)。特定言之，PGK及ENDO啟動子引起亦用GFAP標記之星形膠質細胞中GAT-1之表現。
亦對所選擇組織進行病理性安全性評估。
在研究的活體內階段之後，將腦縱向分裂成兩個半球且將一個半球用於病理性檢查。將半腦以及脊髓、背根神經節、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺及眼睛固定在10%中性緩衝福馬林中，包埋於石蠟中，加工成蠟塊，以大約5 uM厚度切片且用蘇木精及伊紅(H&E)染色。
來自n=28隻小鼠的一系列組織(腦部(7個橫向切片(Bolon等人, Toxicol Pathol 2018年6月;46(4):372-402. doi: 10.1177/0192623318772484)、帶背根神經節之脊髓(6個橫向或縱向切片；頸部、胸部及腰部)、肝臟(2個切片；左側及尾狀葉)、腎臟(2個切片；左側及右側器官)、脾臟(1個切片)、胸腺(1個切片)及眼睛(2個切片；左側及右側器官))藉由光學顯微鏡法進行評估。
未在腦部、脊髓/背根神經節、腎臟或眼睛內鑑別出特定於治療組之發現(此等野生型小鼠中視網膜色素上皮之色素沉著排除脂褐質/顏料含量之評定)。
在腦部中注意到若干變化，其視為屍檢時機械(程序)損傷或由以暗神經元假影為特徵的注射程序之結果，有時伴有結構破壞。
在肝臟內，多種投與對照組AAV9之動物具有最小的彌漫性、肝細胞空泡形成，主要在中間區區域內，其亦在投與病毒載體AAV9-CAG-HA-hSLC6A1、AAV9-PGK-HA-hSLC6A1或AAV9-hDLX-HA-hSLC6A1之個別動物中觀測到。
亦在投與病毒載體AAV9-CAG-HA-hSLC6A1或AAV9-PGK-HA-hSLC6A1之一些動物的肝臟內注意到增加之有絲分裂圖(直至輕微嚴重程度) (且偶爾未記錄於腎中)。
最後，來自注射有病毒載體AAV9-CAG-HA-hSLC6A1及AAV9-PGK-HA-hSLC6A1之治療組之兩隻動物亦呈現最小肝細胞單細胞壞死。
認為其他發現(諸如最小發炎性細胞浸潤、充血及局灶性壞死)處於預期正常背景變化之範圍內且不認為與病毒載體有關。投與AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1之動物的肝臟形態與正常背景範圍一致。
在脾臟內，投與病毒載體AAV9-CAG-HA-hSLC6A1、AAV9-PGK-HA-hSLC6A1或AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1之個別動物具有最低至輕微的髓外造血水準。此認為可能反映此組織內預期造血細胞含量之測試物相關的減少(在對照動物中記錄為適度的)。
實例 9 ： 轉殖基因 SLC6A1 疾病小鼠模型中所選病毒載體之活體內評估為評估所選病毒載體之功效，生成再現人類SLC6A1單倍體不足介導之癲癇的轉殖基因小鼠模型。所用模型為使用C57BL/6J背景之基因嵌入(KI)小鼠模型，該模型帶有在Shanghai Model Organisms中產生之SLC6A1基因(SLC6A1 +/S295L)中的S295L點突變。S295L突變已經活體外功能性驗證，導致GAT-1功能完全喪失。咸信突變發生於已顯示具有攜帶病原性突變之區域中且發現於患有失神癲癇及發育遲緩的患者中(https://slc6a1connect.org/)。根據比利時法律，所有活體內實驗均按照動物實驗倫理委員會發佈的指南進行。該等實驗根據歐洲委員會委員指令(2010/63/EU)進行。進行所有努力以使動物痛苦降至最低。
在產後第1天，用3種病毒載體(AAV9-PGK-HA-hSLC6A1、AAV9-hDLX-HA-hSLC6A1及AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1)中之一者兩側注射至雜合KI (SLC6A1 +/S295L)及野生型同胎仔畜(SLC6A1 +/+)雄性小鼠的側腦室中，如表9中所描述。 表 9
基因型 處理時之年齡 遞送途徑 病毒載體 效價 樣品尺寸 生命評估 癲癇監測
HET (KI) 產後第1天PND1    ICV兩側注射2ul/半球    AAV9-PGK-HA-hSLC6A1 1.33E+13GC/mL 10 注射後7週內的臨床症狀、不良影響、體重增加及死亡 是    活體內無線EEG視頻遙測記錄(注射後6至7週)
AAV9-hDLX-HA-hSLC6A1 1.27E+13GC/mL 11
AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1 1.23E+13GC/mL 15
媒劑 PBS(無菌磷酸鹽緩衝鹽水1X) -- 11
WT 產後第1天PND1    ICV兩側注射2ul/半球    媒劑 PBS(無菌磷酸鹽緩衝鹽水1X) -- 10 否
來自每一基因型之一組額外小鼠注射有媒劑PBS以用作對照組。在注射後3週之療程內一週一次監測臨床徵象且在注射後第3週至第7週每日監測臨床徵象，以便評估小鼠之整體健康狀況。在注射後7週，藉由生物化學分析、組織病理學、免疫組織化學及轉殖基因表現對腦部、血漿及器官收集進行最終評估。
在最後一次評估之前，注射不同病毒載體的不同組中的體重增加無顯著差異。在隨訪期期間(注射後第3至7週)未觀測到死亡率。
注射後六週，進行為期1週的活體內無線EEG (腦電圖)視訊遙測記錄以評估癲癇發生。注射後5週，將SLC6A1 +/S295L小鼠手術植入有皮下遙測發射器及皮質EEG電極。手術在無菌(sterile/aseptic)條件下進行。將麻醉小鼠(氧誘導中之異氟醚：2 l/min時為5%，1.5 l/min時為2.5-1.5%)放置在帶有加熱墊的立體定向框架中，在前額葉皮質的顱骨表面(在前囟(bregma)上)鑽孔作為記錄電極，在小腦的顱骨表面(在頂枕點(lambda)後面)鑽孔作為參考電極。此後，將開源儀器(OSI) A3028S2 ECoG發射器植入背部皮下，連接的電線自皮下一直延伸至顱骨，記錄電極及參考電極通過各孔且定位至腦實質約0.5 mm。各電極用螺桿(塑膠螺釘)固定在適當位置。整個總成用氰基丙烯酸酯及牙齒用水泥保持在原位，形成小圓形頭蓋，且背部用耐綸可吸收縫合材料封閉。術後用藥及疼痛管理包括術前劑量後24小時進行第二次卡洛芬(Carprofen)劑量(10 mg/kg)。手術後，小鼠在溫暖的室內恢復2-3小時。對於活體內無線EEG視訊遙測記錄，將小鼠分組飼養(2-3隻小鼠/籠)。將小鼠籠置於法拉第圍欄中以方便記錄。每天一次對植入小鼠進行監測持續2週。每天對小鼠進行稱重持續4天，其後每週一次稱重。所有記錄均在特意設計之具有溫度及濕度控制的錄音室中進行，以便減少環境干擾且改善發射信號之接收。信號係自植入之發射器傳輸至置放於法拉第圍欄內部之天線。來自一個記錄通道之EEG信號在256 Hz下數位化(帶通濾波器：0.3-80 Hz)。棘波放電(SWD)為失神癲癇之典型特徵，其用內部自動癲癇發作偵測軟體進行分析。SWD偵測演算法係基於事件持續時間分析(＞2 s)、頻帶頻率分析(5-9 Hz)及特定基本諧波頻率之識別。由演算法偵測之各SWD由至少一名經驗豐富的觀察者以盲法進行確認。最初在未注射病毒載體之轉殖基因株SLC6A1 +/S295L中觀測到一段高SWD發生期(自1 pm至6 pm，共5小時)。因此，在此時間段內對不同病毒載體及對照組進行EEG分析。歸因於以下組中EEG信號中出現技術假影，共有4隻動物自分析中排除：AAV9-PGK-HA-hSLC6A1 (10個中之2個)及AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1 (15個中之2個)。亦自AAV9-hDLX-HA-hSLC6A1組中之分析移除額外2隻動物(11個中之2個)；EEG中之一個顯示假影，且另一個未經轉導(在腦組織中未偵測到病毒基因體複本，如下文所提及)。群組之間的差異藉由非參數單向ANOVA (克拉斯卡-瓦立斯檢驗)，隨後進行鄧恩事後分析多重比較檢驗來分析(**p＜0.01)。
如圖15中所說明，與對照組相比，注射有AAV9-PGK-HA-hSLC6A1或AAV9-ENDO-HA-hSLC6A1之SLC6A1 +/S295L小鼠在SWD發生高峰時期連續7天內每天記錄之的SWD平均數目分別顯著減少97%及93%。與對照組相比，注射有AAV9-hDLX-HA-hSLC6A1之SLC6A1 +/S295L小鼠中之SWD數目減少未在此實驗中達到統計顯著性。
此外，對來自注射有不同病毒載體之動物的腦組織進行生物化學分析。遵循與實例8中所描述相同的方法，在注射後7週處死動物。收集尾側皮質且進行DNA/RNA提取，且使用與實例8中所描述之相同的方法，將匹配的半內側額葉皮質用於蛋白質提取。
如圖16A中所示，在DNA提取物中偵測到每二倍體小鼠基因體之顯著病毒基因體複本，證明所用的不同病毒載體之間的高效及均勻AAV9轉導(除AAV9 hDLX組中顯示無病毒轉導之一隻動物之外)。圖16B顯示所有AAV9轉導組中之mRNA表現。對於SLC6A1表現，PGK啟動子與ENDO啟動子之間未觀測到顯著差異。另一方面，與其他組相比，hDLX啟動子顯示出顯著降低之mRNA表現。
蛋白質分析證實，與WT同胎仔畜相比，SLC6A1 +/S295L小鼠(圖中稱為HET)中之GAT-1表現如所預期顯著降低(圖17，圖D、E及F)。如圖17所示，西方墨點法凝膠及圖式展示，與注射有媒劑之SLC6A1 +/S295L小鼠相比，注射AAV9後SLC6A1 +/S295L小鼠(圖中稱為HET)中之GAT-1表現顯著增加。對於所有所用病毒載體，觀測到GAT-1之過度表現。PGK啟動子在野生型(WT)水平上增加了表現，而ENDO啟動子在挽救單倍體不足方面表現出與WT相似的表現水準。hDLX啟動子顯示SLC6A1 +/S295L小鼠之表現顯著增加。類似於在實例8中之WT動物中觀測到的結果，可比較啟動子的強度。如之前所觀測，在SLC6A1 +/S295L小鼠中PGK啟動子顯示出最強蛋白質表現，繼之為ENDO及hDLX啟動子。
圖 1。草圖說明SLC6A1編碼之GAT-1轉運子及其功能。GAT-1為調節胞外GABA之攝取的溶質載體蛋白質。GAT-1化學計算量測術：一個抑制性神經傳遞素GABA之分子與兩個鈉陽離子及一個氯離子一起沿著電化學梯度共同轉運。
圖 2。人類、猴及小鼠GAT-1序列之蛋白質序列比對(人類變異體根據SEQ ID NO: 18)。比對顯示三個物種中之高序列一致性。
圖 3。經設計之構築體的示意性草圖。在圖式中，一般而言「prom」=啟動子且所分析之各種啟動子如底部所示(CAG、EF1a、PGK及UcB)；「INT」意謂內含子且「EX」意謂外顯子，「h」或「m」分別=人類及小鼠，SV40意指聚腺苷酸化序列SV40；「tag」=HA或myc標籤，位於具有CAG啟動子之構築體的N端或C端。
圖 4。AD-HEK293細胞經不同普遍存在的啟動子驅動之hSLC6A1及mSLC6A1質體轉染。放大區段展示GAT-1經轉運至預期細胞定位。
圖 5。A：經不同神經元特異性啟動子驅動之mSLC6A1質體轉染的Neuro-2A細胞。B：放大區展示GAT-1經轉運至預期細胞定位。
圖 6。AD-HEK293細胞中之(A) HA標記之及(B) Myc標記之mSLC6A1及hSLC6A1之西方墨點分析。示出各條件下之兩個技術複本。亦使用抗SLC6A1抗體偵測(C)抗原決定基標記之蛋白質。C=對照組，1=CAG-HA-hSLC6A1，2=CAG-hSLC6A1-Myc，3=CAG-Myc-hSLC6A1，4=CAG-Myc-mSLC6A1，5=CAG-mSLC6A1-Myc，H=人類腦裂解物，M=小鼠腦裂解物。
圖 7。(A)經設計之構築體的示意性草圖。在圖式中，「h」=人類，WT=野生型，p=蛋白質，IRES=內部核糖體進入位點，tagRFP=標記紅色螢光蛋白，SV40=來自猿猴病毒40之聚腺苷酸化序列；(B)經傳染之COS-7細胞中之氚化[ 3H] GABA攝取分析。結果顯示為平均值+SD且標準化為CAG-hSLC6A1-WT-IRES-tagRFP構築體。
圖 8。經轉染之SHSY-5Y細胞中之氚化[ 3H] GABA攝取分析。細胞經含有AAV ITR (pAAV)之質體轉染，其中hSLC6A1表現由不同啟動子驅動。結果顯示為平均值+SD且標準化為CAG-hSLC6A1-WT-IRES-tagRFP構築體。
圖 9。iPSCs衍生之NGN2神經元中之慢病毒轉導。每一條件顯示為一個代表性圖像，僅顯示用於可視化GAT-1的通道。
圖 10。(A)藉由qPCR使用標準化為二倍體小鼠基因體之絕對數目的SV40pA (猿猴病毒40之聚A信號)對病毒基因體複本進行絕對定量。結果示為中位數+四分位數範圍。(B) RNA表現分析。資料顯示為相對表現，其經按比例調整至所有組之平均表現。結果示為幾何平均值+幾何SD。
圖 11。藉由西方墨點法對來自右額葉皮質之樣品進行蛋白質分析。圖A、C及E：西方墨點法表示測試之不同構築體中GAT-1表現(n=5)。來自「對照組AAV9」組及媒劑PBS對照組之小鼠在所有三個圖中相同。圖B、D及F為各別西方墨點法之定量資料，GAPDH用作內參照物且用於各GAT-1頻帶強度之標準化。結果顯示為平均值+SD。將「對照組AAV9」組用以按比例調整組。圖G：表示將3種構築體放置在一起之HA及GAPDH表現(內參照物)之西方墨點法。圖H：圖G中所示之西方墨點法表示兩次且對各樣品資料進行定量，取平均值且在此顯示。結果顯示為平均值+SD。
圖 12。在來自小鼠腦之矢狀切片中針對GFAP (星形膠質細胞)、NeuN (神經元)及HA (人類GAT-1)之三重免疫標記。AF = Alexa Fluor。
圖 13。在來自小鼠海馬體之矢狀切片中針對GFAP (星形膠質細胞)、NeuN (神經元)及HA (人類GAT-1)之三重免疫標記。AF = Alexa Fluor。
圖 14。在來自小鼠大腦皮質之矢狀切片中針對GFAP (星形膠質細胞)、NeuN (神經元)及HA (人類GAT-1)之三重免疫標記。AF = Alexa Fluor。
圖 15。注射有媒劑PBS (n=11)、AAV9-PGK-HA-hSCL6A1 (n=8)、AAV9-ENDO-HA-hSCL6A1 (n=13)及AAV9-hDLX-HA-hSCL6A1 (n=9)之SLC6A1 +/S295L小鼠中之SWD的平均數目。在注射6週之後，在1 pm與6 pm之間的5個小時時間內持續7個連續日分析SWD。群組之間的差異藉由非參數單向ANOVA (克拉斯卡-瓦立斯檢驗(Kruskal-Wallis test))，隨後進行鄧恩事後分析多重比較檢驗(**p＜0.01；***p＜0.001；ns，不顯著)來分析。
圖 16。(A)藉由qPCR使用標準化為二倍體小鼠基因體之絕對數目的SV40pA (猿猴病毒40之聚A信號)對病毒基因體複本進行絕對定量(ValidPRime®)。結果顯示為平均值+SD。群組之間的差異(n=10-15)藉由非參數單向ANOVA (克拉斯卡-瓦立斯檢驗)，隨後進行鄧恩事後分析多重比較檢驗來分析。組之間未觀測到顯著差異。(B)人類SLC6A1之RNA表現分析。資料顯示為相對表現，其經按比例調整至所有組之平均表現。結果示為幾何平均值+幾何SD。群組之間的差異(n=10-15)藉由非參數單向ANOVA (克拉斯卡-瓦立斯檢驗)，隨後進行鄧恩事後分析多重比較檢驗(**p＜0.01；***p＜0.001；ns，不顯著)來分析。
圖 17。藉由西方墨點法對來自半內側額葉皮質之樣品進行蛋白質分析。圖A、B及C：西方墨點法表示來自所研究不同病毒載體、PBS對照組及WT (野生型)組(n=7至10)的GAT-1 (SLC6A1)蛋白質表現。來自WT (野生型)組及HET (SLC6A1 +/S295L小鼠)組之小鼠在所有三個圖中相同。圖D、E及F為各別西方墨點法之定量資料，GAPDH用作內參照物且用於各GAT-1頻帶強度之標準化。結果顯示為平均值+SD。將WT組用以按比例調整組。圖G及H：表示將3種病毒載體放置在一起之HA及GAPDH表現(內參照物)之西方墨點法。圖I：圖G及圖H中表示之西方墨點法之合併定量。GAPDH用作內參照物且用於各GAT-1頻帶強度之標準化。結果顯示為平均值+SD。將PGK組用以按比例調整組用於進行比較啟動子。資料使用單向ANOVA，隨後進行杜凱氏多重比較檢驗(*p＜ 0.01，**p＜0.001，***p＜0.0001)來分析。 

          <![CDATA[<110>  美商元素基因組學公司(ELEMENT GENOMICS INC)，美商UCB生物科學公司(UCB BIOSCIENCES INC)]]>
                 比利時商UCB生物製藥公司(UCB BIOPHARMA SRL)
          <![CDATA[<120>  核酸構築體、病毒載體及病毒顆粒]]>
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          cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt       60
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          catgcgtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac      360
          ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttatgc agcgatgggg gcgggggggg      420
          ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga      480
          ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg      540
          cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cg                         582
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  1011]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  嵌合內含子]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc       60
          cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctccctcc      120
          gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag      180
          ccttaaaggg ctccgggagg gcctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt      240
          gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc      300
          gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg ggccgggggc      360
          ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg      420
          tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctggcaccc      480
          ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgtg cggggcgtgg      540
          cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg      600
          gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggccccggag cgccggcggc      660
          tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag      720
          ggacttcctt tgtcccaaat ctggcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct      780
          ctagcgggcg cgggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct      840
          tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccatctccag cctcggggct gccgcagggg      900
          gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc      960
          ggctttagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca g              1011
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  1210]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  UCB啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcgtcacg gcgagcgctg       60
          ccacgtcaga cgaagggcgc aggagcgtcc tgatccttcc gcccggacgc tcaggacagc      120
          ggcccgctgc tcataagact cggccttaga accccagtat cagcagaagg acattttagg      180
          acgggacttg ggtgactcta gggcactggt tttctttcca gagagcggaa caggcgagga      240
          aaagtagtcc cttctcggcg attctgcgga gggatctccg tggggcggtg aacgccgatg      300
          attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca gctagttccg tcgcagccgg gatttgggtc      360
          gcggttcttg tttgtggatc gctgtgatcg tcacttggtg agtagcgggc tgctgggctg      420
          gccggggctt tcgtggccgc cgggccgctc ggtgggacgg aagcgtgtgg agagaccgcc      480
          aagggctgta gtctgggtcc gcgagcaagg ttgccctgaa ctgggggttg gggggagcgc      540
          agcaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga atggaagacg cttgtgaggc gggctgtgag      600
          gtcgttgaaa caaggtgggg ggcatggtgg gcggcaagaa cccaaggtct tgagcccttc      660
          gctaatgcgg gaaagctctt attcgggtga gatgggctgg gcaccatctg gggaccctga      720
          cgtgaagttt gtcactgact ggagaactcg gtttgtcgtc tgttgcgggg gcggcagtta      780
          tggcggtgcc gttgggcagt gcacccgtac ctttgggagc gcgcgccctc gtcgtgtcgt      840
          gacgtcaccc gttctgttgg cttataatgc agggtggggc cacctgccgg taggtgtgcg      900
          gtaggctttt ctccgtcgca ggacgcaggg ttcgggccta gggtaggctc tcctgaatcg      960
          acaggcgccg gacctctggt gaggggaggg ataagtgagg cgtcagtttc tttggtcggt     1020
          tttatgtacc tatcttctta agtagctgaa gctccggttt tgaactatgc gctcggggtt     1080
          ggcgagtgtg ttttgtgaag ttttttaggc accttttgaa atgtaatcat ttgggtcaat     1140
          atgtaatttt cagtgttaga cttgtaaatt gtccgctaaa ttctggccgt ttttggcttt     1200
          tttgttagac                                                            1210
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  390]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PGK啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct       60
          cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg      120
          gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg      180
          gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg      240
          ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc      300
          cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg      360
          ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg                                       390
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  1179]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EF1a啟動子外加內含子]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg       60
          ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt      120
          gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca      180
          ctagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc      240
          gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt      300
          acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg      360
          gagagttcgt ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgtggcctgg      420
          cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct      480
          ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg      540
          caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat cagcacactg gtatttcggt ttttggggcc      600
          gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga      660
          gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg cccggcctgc tctggtgcct      720
          ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca      780
          gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagcac aaaatggagg      840
          acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg      900
          tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat      960
          tagttctcca gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg     1020
          gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa     1080
          ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca     1140
          gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga                            1179
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  939]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EF1a內含子]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg       60
          ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga      120
          agtgggtggg agagttcgtg gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt      180
          gtggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt      240
          ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt      300
          tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc agcacactgg tatttcggtt      360
          tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg      420
          ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgc ccggcctgct      480
          ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg      540
          tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagcaca      600
          aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg      660
          gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg      720
          cacctcgatt agttctccag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt      780
          tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac      840
          ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag      900
          cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcag                             939
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  229]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MECP2啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc ctaaacagac aggaactcct gccaattgag       60
          ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg      120
          acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga      180
          gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt cccggcatcg gttgcgcgc                  229
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  1317]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  hNSE啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          atgcagctgg acctaggaga gaagcaggag aggaagatcc agcacaaaaa atccgaagct       60
          aaaaacagga cacagagatg ggggaagaaa agagggcaga gtgaggcaaa aagagactga      120
          agagatgagg gtggccgcca ggcactttag ataggggaga ggctttattt acctctgttt      180
          gttttttttt tttttttttt tttttttttt ttgcgaggta gtcttgctta gtctccaggc      240
          tggagtgcag tggcacaatc tcagctcact gcaacttcca cctcctgggt tcaagcaatt      300
          ctcctgcctc agcctcccga gtagctggga ctacaggcgc atgcaaccgc gcctggctaa      360
          tttttgtatt tttagtagaa acggggtttc accacgttag ccaggatggt ctggatctcc      420
          tgacctcgtg atctgcccgc ctccgccttc caaagtgctg ggattacagg ggtgagccac      480
          agcgcctggt ccctatttac ttctgtcttc tacctccagg agatcaaaga cgctggcctt      540
          cagacctgat cagactccca ggggcagcca ccacatgtat gacagagaac agaggatgcc      600
          tgtttttgcc ccaaagctgg aaattcatca caacctgagg cccaggatct gctctgtgcc      660
          ggtcctctgg gcagtgtggg gtgcagaatg gggtgcctag gcctgagcgt tgcctggagc      720
          ctaggccggg ggccgccctc gggcaggcgt gggtgagagc caagaccgcg tgggccgcgg      780
          ggtgctggta ggagtggttg gagagacttg cgaaggcggc tggggtgttc ggatttccaa      840
          taaagaaaca gagtgatgct cctgtgtctg accgggtttg tgagacattg aggctgtctt      900
          gggcttcact ggcagtgtgg gccttcgtac ccgggctaca ggggtgcggc tctgcctgtt      960
          actgtcgagt gggtcgggcc gtgggtatga gcgcttgtgt gcgctggggc caggtcgtgg     1020
          gtgcccccac ccttccccca tcctcctccc ttccccactc caccctcgtc ggtcccccac     1080
          ccgcgctcgt acgtgcgcct ccgccggcag ctcctgactc atcgggggct ccgggtcaca     1140
          tgcgcccgcg cggccctata ggcgcctcct ccgcccgccg cccgggagcc gcagccgccg     1200
          ccgccactgc cactcccgct ctctcagcgc cgccgtcgcc accgccaccg ccaccgccac     1260
          taccaccgag atctgcgatc taagtaagct tggcattccg gtactgttgg taaagcc        1317
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  hSyn啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          agtgcaagtg ggttttagga ccaggatgag gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga       60
          ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga      120
          gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg      180
          gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc      240
          gctgacgtca ctcgccggtc ccccgcaaac tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg      300
          cgccgccgcc ggcccagccg gaccgcacca cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg      360
          cgaccatctg cgctgcggcg ccggcgactc agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg      420
          aggagtcgtg tcgtgcctga gagcgcag                                         448
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  1289]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CamKII啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          cattatggcc ttaggtcact tcatctccat ggggttcttc ttctgatttt ctagaaaatg       60
          agatgggggt gcagagagct tcctcagtga cctgcccagg gtcacatcag aaatgtcaga      120
          gctagaactt gaactcagat tactaatctt aaattccatg ccttgggggc atgcaagtac      180
          gatatacaga aggagtgaac tcattagggc agatgaccaa tgagtttagg aaagaagagt      240
          ccagggcagg gtacatctac accacccgcc cagccctggg tgagtccagc cacgttcacc      300
          tcattatagt tgcctctctc cagtcctacc ttgacgggaa gcacaagcag aaactgggac      360
          aggagcccca ggagaccaaa tcttcatggt ccctctggga ggatgggtgg ggagagctgt      420
          ggcagaggcc tcaggagggg ccctgctgct cagtggtgac agataggggt gagaaagcag      480
          acagagtcat tccgtcagca ttctgggtct gtttggtact tcttctcacg ctaaggtggc      540
          ggtgtgatat gcacaatggc taaaaagcag ggagagctgg aaagaaacaa ggacagagac      600
          agaggccaag tcaaccagac caattcccag aggaagcaaa gaaaccatta cagagactac      660
          aagggggaag ggaaggagag atgaattagc ttcccctgta aaccttagaa cccagctgtt      720
          gccagggcaa cggggcaata cctgtctctt cagaggagat gaagttgcca gggtaactac      780
          atcctgtctt tctcaaggac catcccagaa tgtggcaccc actagccgtt accatagcaa      840
          ctgcctcttt gccccactta atcccatccc gtctgttaaa agggccctat agttggaggt      900
          gggggaggta ggaagagcga tgatcacttg tggactaagt ttgttcgcat ccccttctcc      960
          aaccccctca gtacatcacc ctgggggaac agggtccact tgctcctggg cccacacagt     1020
          cctgcagtat tgtgtatata aggccagggc aaagaggagc aggttttaaa gtgaaaggca     1080
          ggcaggtgtt ggggaggcag ttaccggggc aacgggaaca gggcgtttcg gaggtggttg     1140
          ccatggggac ctggatgctg acgaaggctc gcgaggctgt gagcagccac agtgccctgc     1200
          tcagaagccc caagctcgtc agtcaagccg gttctccgtt tgcactcagg agcacgggca     1260
          ggcgagtggc ccctagttct gggggcagc                                       1289
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  541]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  hDLX啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          ttcagaatgt tatgcactca cagtggtttg gcatgcatct ggtgaatttt ttttaacgaa       60
          aaattagtgt tggtttcgat gtatggtagc attctcccta acgtaatttg aataattcag      120
          caaagcccca ctaccagctg tacttctgca gcctcttcca ttcttttcag cattataatt      180
          ttggttaatt ttcaatttta ggtcctacgt ctctgcaatt tgtgtatgaa taacagaata      240
          atttccctct tttgtttcgc ctttcctgtt cctgaatcta aataaagatg gctttttagt      300
          attaaaagtg gaagaaaatt acaggtaatt atctttgacg gtaaaaacgc tgtaatcagc      360
          gggctacatg aaaaattact ctaattatgg ctgcatttaa gagaatggaa aaaaaccttc      420
          ttgtggataa aaaccttaaa ttgtccccaa tgtctgcttc aaattggatg gcactgcagc      480
          tggaggcttt gttcagaatt gatcctgggg agctacgaac ccaaagtttc acagtaggaa      540
          g                                                                      541
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  49]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  pB球蛋白]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          ctgggcataa aagtcagggc agagccatct attgcttaca tttgcttct                   49
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  133]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  hDLX內含子]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga       60
          cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc      120
          tttctctcca cag                                                         133
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  1296]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  內源性hSLC6A1啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          agaatccctc aaacctcaag aactgagaga agggtgtctg gggctcctgc caccatccct       60
          gtttcccttt taagtaatct gtttccccat ctgtccatcc atacacacag ccacttgtgt      120
          ctccatgacc aaccgctggc agtggaaggg tgtccttccc acccccactc ttacacacac      180
          tcccagctgg tacccagagc ctggtcaccc caggccaggc ctgtgtttcc aggtgtaacg      240
          ggcagcagac gctgccctag gactagagca gggagggggc acgggcccac cccaacccac      300
          agcgacccac agagggcgaa aagaggacga ccgcagagag aaacggaaag gacaggccaa      360
          cggaagcagt actgcaaggc tggaaggaga aaagccagga ggggagtgct tgctgtgaaa      420
          gacagggaga cagagaccaa gacggacagg cagacaggct ggtgacccag gatgaggccg      480
          gaaagagcca tcaaaggaag gagaaggaag gagagagatt ggagcgggac ggcggggcag      540
          gcgagggaag gagggggtgg ggagagggag ggaggaagag aggggagaaa gagggaggaa      600
          gagaggggag aaggagggag aagagagcgg gagaatgcga gaggaaagaa gggagagggg      660
          aggcgtagaa ggggagagga ggtgaaggga aaaggagaga gcctgctggc ggcgaagctg      720
          caagaggcag ctgcggaggg agcgcgcggc gggcctgggg gagcgctggg cgggggcggg      780
          cggtgcgggc agggctatac ccgagctggg cgggctccgg gcgccgcggg ccctgccctc      840
          cccctccatc cctccggact cgctcccccc tcctctccct tccccgcgac cctccgcccg      900
          ccctcggaag accgagacag cggagaggtt gcgggtgagc tgcgctgagc ccaggagccg      960
          aggagtcggg agcgcagtag cgctgagccc gagcccgagc ggccccgcgt cccgagcgca     1020
          tcggagcggc cgagccgccc ggatgcagcg cctgtcccgg gcagcgcagc cccggccgca     1080
          ggatctcacc cagggtggca gaaggaggcc ttctggagct gacccacccc cgacgaccat     1140
          cagggtgagg caactccaag gtcctactct ctttctgtgc ctgttaccca ccccgtcctc     1200
          ctagggtgcc cttgagccgc aaaactgctg tccacgtgga ccgggggtga catcgcacgt     1260
          ccatctgcca ggacccctgc gtccaaattc cgagac                               1296
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  1800]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類SLC6A1]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          atggcgacca acggcagcaa ggtggccgac gggcagatct ccaccgaggt cagcgaggcc       60
          cctgtggcca atgacaagcc caaaaccttg gtggtcaagg tgcagaagaa ggcggcagac      120
          ctccccgacc gggacacgtg gaagggccgc ttcgacttcc tcatgtcctg tgtgggctat      180
          gccatcggcc tgggcaacgt ctggaggttc ccctatctct gcgggaaaaa tggtggggga      240
          gccttcctga tcccctattt cctgacactc atctttgcgg gggtcccact cttcctgctg      300
          gagtgctccc tgggccagta cacctccatc ggggggctag gggtatggaa gctggctcct      360
          atgttcaagg gcgtgggcct tgcggctgct gtgctatcat tctggctgaa catctactac      420
          atcgtcatca tctcctgggc catttactac ctgtacaact ccttcaccac gacactgccg      480
          tggaaacagt gcgacaaccc ctggaacaca gaccgctgct tctccaacta cagcatggtc      540
          aacactacca acatgaccag cgctgtggtg gagttctggg agcgcaacat gcatcagatg      600
          acggacgggc tggataagcc aggtcagatc cgctggccac tggccatcac gctggccatc      660
          gcctggatcc ttgtgtattt ctgtatctgg aagggtgttg gctggactgg aaaggtggtc      720
          tacttttcag ccacataccc ctacatcatg ctgatcatcc tgttcttccg tggagtgacg      780
          ctgcccgggg ccaaggaggg catcctcttc tacatcacac ccaacttccg caagctgtct      840
          gactccgagg tgtggctgga tgcggcaacc cagatcttct tctcatacgg gctgggcctg      900
          gggtccctga tcgctctcgg gagctacaac tctttccaca acaatgtcta cagggactcc      960
          atcatcgtct gctgcatcaa ttcgtgcacc agcatgttcg caggattcgt catcttctcc     1020
          atcgtgggct tcatggccca tgtcaccaag aggtccattg ctgatgtggc ggcctcaggc     1080
          cccgggctgg cgttcctggc atacccagag gcggtgaccc agctgcctat ctccccactc     1140
          tgggccatcc tcttcttctc catgctgttg atgctgggca ttgacagcca gttctgcact     1200
          gtggagggct tcatcacagc cctggtggat gagtacccca ggctcctccg caaccgcaga     1260
          gagctcttca ttgctgctgt ctgcatcatc tcctacctga tcggtctctc taacatcact     1320
          caggggggta tttatgtctt caaactcttt gactactact ctgccagtgg catgagcctg     1380
          ctgttcctcg tgttctttga atgtgtctct atttcctggt tttacggtgt caaccgattc     1440
          tatgacaata tccaagagat ggttggatcc aggccctgca tctggtggaa actctgctgg     1500
          tctttcttca caccaatcat tgtggcgggc gtgttcattt tcagtgctgt gcagatgacg     1560
          ccactcacca tgggaaacta tgttttcccc aagtggggcc agggtgtggg ctggctgatg     1620
          gctctgtctt ccatggtcct catccccggg tacatggcct acatgttcct caccttaaag     1680
          ggctccctga agcagcgcat ccaagtcatg gtccagccca gcgaagacat cgttcgccca     1740
          gagaatggtc ctgagcagcc ccaggcgggc agctccacca gcaaggaggc ctacatctag     1800
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  1800]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  小鼠SLC6A1]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          atggcgactg acaacagcaa ggtggctgat gggcagatct ctactgaggt cagcgaggcc       60
          cctgtggcca gcgacaagcc caaaaccctg gtagtcaagg tgcagaagaa ggccggggac      120
          ctccctgacc gggacacatg gaagggacgc ttcgacttcc tcatgtcctg cgtgggctat      180
          gccatcggcc tgggcaatgt gtggaggttc ccttacctct gtgggaaaaa cggtggcggg      240
          gccttcctaa tcccatattt cctgacgctc atctttgcgg gtgttcctct cttccttttg      300
          gagtgctccc taggccagta cacctccatt gggggcctgg gcgtatggaa gctggcgccc      360
          atgttcaagg gtgtgggcct cgcggcagct gtgctgtcct tctggctgaa catctactac      420
          atcgtcatca tctcctgggc catctactac ctgtacaact ccttcaccac gaccctgcca      480
          tggaaacagt gtgacaaccc gtggaacact gaccgctgct tctccaacta cagcctggtc      540
          aataccacca acatgaccag cgccgtggtg gagttctggg agcgcaacat gcaccagatg      600
          acagatggac tggacaagcc aggacagatc cgctggcctc tggccatcac actggccatt      660
          gcctgggtgc tcgtgtattt ctgcatctgg aagggtgttg gttggactgg aaaggtggtc      720
          tacttctcag ccacgtaccc ctacatcatg cttatcatcc tgttcttccg tggagtgacg      780
          cttcccgggg ccaaggaggg gatcctcttc tacatcacac ccaacttccg aaagctgtct      840
          gattctgagg tgtggcttga cgccgccacc cagatcttct tctcctacgg gctgggcctg      900
          gggtccctga ttgctctggg aagctacaac tctttccaca acaatgtgta cagggactcc      960
          atcatcgttt gctgcatcaa ctcctgcacc agcatgtttg ccggattcgt catcttctcc     1020
          atcgtgggct tcatggctca tgtcaccaag aggtccatag ctgatgtggc agcctcaggc     1080
          ccggggctgg cattcttggc gtaccctgag gctgtgacac agctacccat ctctcccctc     1140
          tgggctatcc tcttcttctc catgctgctg atgctgggca ttgacagcca gttctgtacc     1200
          gtggagggct tcatcactgc cctggtggac gagtacccca gacttctccg caatcgccgt     1260
          gaactcttca ttgctgccgt gtgcatcgtg tcctacctga ttggcctgtc taacatcacc     1320
          cagggtggca tttatgtctt caaactgttt gattattact ctgccagcgg catgagcttg     1380
          ctgttcctgg ttttcttcga gtgtgtctcc atttcctggt tttatggtgt caaccggttc     1440
          tatgacaaca tccaggagat ggttggctcc aggccctgca tctggtggaa gctgtgctgg     1500
          tcctttttca cacccatcat tgtggcgggc gtgtttctct tcagtgctgt gcagatgaca     1560
          ccactcacca tgggaagcta tgttttcccc aagtggggcc agggcgtggg ctggctcatg     1620
          gctctgtcct ccatggtgct catccccggg tacatggctt acatgttcct caccctgaag     1680
          ggctccctga agcagcgtct ccaggtcatg attcagccca gtgaagatat tgtgcgccct     1740
          gagaatggcc ctgagcagcc gcaggctggc agctcagcca gcaaggaggc ctacatctag     1800
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  135]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SV40聚A]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          gatccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga       60
          aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc      120
          tgcaataaac aagtt                                                       135
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  599]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類GAT-1同功異型物a]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Met Ala Thr Asn Gly Ser Lys Val Ala Asp Gly Gln Ile Ser Thr Glu 
          1               5                   10                  15      
          Val Ser Glu Ala Pro Val Ala Asn Asp Lys Pro Lys Thr Leu Val Val 
                      20                  25                  30          
          Lys Val Gln Lys Lys Ala Ala Asp Leu Pro Asp Arg Asp Thr Trp Lys 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Phe Asp Phe Leu Met Ser Cys Val Gly Tyr Ala Ile Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Asn Val Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Gly Lys Asn Gly Gly Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Phe Leu Ile Pro Tyr Phe Leu Thr Leu Ile Phe Ala Gly Val Pro 
                          85                  90                  95      
          Leu Phe Leu Leu Glu Cys Ser Leu Gly Gln Tyr Thr Ser Ile Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Leu Gly Val Trp Lys Leu Ala Pro Met Phe Lys Gly Val Gly Leu Ala 
                  115                 120                 125             
          Ala Ala Val Leu Ser Phe Trp Leu Asn Ile Tyr Tyr Ile Val Ile Ile 
              130                 135                 140                 
          Ser Trp Ala Ile Tyr Tyr Leu Tyr Asn Ser Phe Thr Thr Thr Leu Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Lys Gln Cys Asp Asn Pro Trp Asn Thr Asp Arg Cys Phe Ser Asn 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ser Met Val Asn Thr Thr Asn Met Thr Ser Ala Val Val Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Trp Glu Arg Asn Met His Gln Met Thr Asp Gly Leu Asp Lys Pro Gly 
                  195                 200                 205             
          Gln Ile Arg Trp Pro Leu Ala Ile Thr Leu Ala Ile Ala Trp Ile Leu 
              210                 215                 220                 
          Val Tyr Phe Cys Ile Trp Lys Gly Val Gly Trp Thr Gly Lys Val Val 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Phe Ser Ala Thr Tyr Pro Tyr Ile Met Leu Ile Ile Leu Phe Phe 
                          245                 250                 255     
          Arg Gly Val Thr Leu Pro Gly Ala Lys Glu Gly Ile Leu Phe Tyr Ile 
                      260                 265                 270         
          Thr Pro Asn Phe Arg Lys Leu Ser Asp Ser Glu Val Trp Leu Asp Ala 
                  275                 280                 285             
          Ala Thr Gln Ile Phe Phe Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Gly Ser Leu Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Leu Gly Ser Tyr Asn Ser Phe His Asn Asn Val Tyr Arg Asp Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Ile Val Cys Cys Ile Asn Ser Cys Thr Ser Met Phe Ala Gly Phe 
                          325                 330                 335     
          Val Ile Phe Ser Ile Val Gly Phe Met Ala His Val Thr Lys Arg Ser 
                      340                 345                 350         
          Ile Ala Asp Val Ala Ala Ser Gly Pro Gly Leu Ala Phe Leu Ala Tyr 
                  355                 360                 365             
          Pro Glu Ala Val Thr Gln Leu Pro Ile Ser Pro Leu Trp Ala Ile Leu 
              370                 375                 380                 
          Phe Phe Ser Met Leu Leu Met Leu Gly Ile Asp Ser Gln Phe Cys Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Val Glu Gly Phe Ile Thr Ala Leu Val Asp Glu Tyr Pro Arg Leu Leu 
                          405                 410                 415     
          Arg Asn Arg Arg Glu Leu Phe Ile Ala Ala Val Cys Ile Ile Ser Tyr 
                      420                 425                 430         
          Leu Ile Gly Leu Ser Asn Ile Thr Gln Gly Gly Ile Tyr Val Phe Lys 
                  435                 440                 445             
          Leu Phe Asp Tyr Tyr Ser Ala Ser Gly Met Ser Leu Leu Phe Leu Val 
              450                 455                 460                 
          Phe Phe Glu Cys Val Ser Ile Ser Trp Phe Tyr Gly Val Asn Arg Phe 
          465                 470                 475                 480 
          Tyr Asp Asn Ile Gln Glu Met Val Gly Ser Arg Pro Cys Ile Trp Trp 
                          485                 490                 495     
          Lys Leu Cys Trp Ser Phe Phe Thr Pro Ile Ile Val Ala Gly Val Phe 
                      500                 505                 510         
          Ile Phe Ser Ala Val Gln Met Thr Pro Leu Thr Met Gly Asn Tyr Val 
                  515                 520                 525             
          Phe Pro Lys Trp Gly Gln Gly Val Gly Trp Leu Met Ala Leu Ser Ser 
              530                 535                 540                 
          Met Val Leu Ile Pro Gly Tyr Met Ala Tyr Met Phe Leu Thr Leu Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Gly Ser Leu Lys Gln Arg Ile Gln Val Met Val Gln Pro Ser Glu Asp 
                          565                 570                 575     
          Ile Val Arg Pro Glu Asn Gly Pro Glu Gln Pro Gln Ala Gly Ser Ser 
                      580                 585                 590         
          Thr Ser Lys Glu Ala Tyr Ile 
                  595                 
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  421]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<223>  人類GAT-1同功異型物b]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Met Val Asn Thr Thr Asn Met Thr Ser Ala Val Val Glu Phe Trp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Asn Met His Gln Met Thr Asp Gly Leu Asp Lys Pro Gly Gln Ile 
                      20                  25                  30          
          Arg Trp Pro Leu Ala Ile Thr Leu Ala Ile Ala Trp Ile Leu Val Tyr 
                  35                  40                  45              
          Phe Cys Ile Trp Lys Gly Val Gly Trp Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Ala Thr Tyr Pro Tyr Ile Met Leu Ile Ile Leu Phe Phe Arg Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Val Thr Leu Pro Gly Ala Lys Glu Gly Ile Leu Phe Tyr Ile Thr Pro 
                          85                  90                  95      
          Asn Phe Arg Lys Leu Ser Asp Ser Glu Val Trp Leu Asp Ala Ala Thr 
                      100                 105                 110         
          Gln Ile Phe Phe Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Gly Ser Leu Ile Ala Leu 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Tyr Asn Ser Phe His Asn Asn Val Tyr Arg Asp Ser Ile Ile 
              130                 135                 140                 
          Val Cys Cys Ile Asn Ser Cys Thr Ser Met Phe Ala Gly Phe Val Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Ser Ile Val Gly Phe Met Ala His Val Thr Lys Arg Ser Ile Ala 
                          165                 170                 175     
          Asp Val Ala Ala Ser Gly Pro Gly Leu Ala Phe Leu Ala Tyr Pro Glu 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Thr Gln Leu Pro Ile Ser Pro Leu Trp Ala Ile Leu Phe Phe 
                  195                 200                 205             
          Ser Met Leu Leu Met Leu Gly Ile Asp Ser Gln Phe Cys Thr Val Glu 
              210                 215                 220                 
          Gly Phe Ile Thr Ala Leu Val Asp Glu Tyr Pro Arg Leu Leu Arg Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Arg Glu Leu Phe Ile Ala Ala Val Cys Ile Ile Ser Tyr Leu Ile 
                          245                 250                 255     
          Gly Leu Ser Asn Ile Thr Gln Gly Gly Ile Tyr Val Phe Lys Leu Phe 
                      260                 265                 270         
          Asp Tyr Tyr Ser Ala Ser Gly Met Ser Leu Leu Phe Leu Val Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Glu Cys Val Ser Ile Ser Trp Phe Tyr Gly Val Asn Arg Phe Tyr Asp 
              290                 295                 300                 
          Asn Ile Gln Glu Met Val Gly Ser Arg Pro Cys Ile Trp Trp Lys Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Trp Ser Phe Phe Thr Pro Ile Ile Val Ala Gly Val Phe Ile Phe 
                          325                 330                 335     
          Ser Ala Val Gln Met Thr Pro Leu Thr Met Gly Asn Tyr Val Phe Pro 
                      340                 345                 350         
          Lys Trp Gly Gln Gly Val Gly Trp Leu Met Ala Leu Ser Ser Met Val 
                  355                 360                 365             
          Leu Ile Pro Gly Tyr Met Ala Tyr Met Phe Leu Thr Leu Lys Gly Ser 
              370                 375                 380                 
          Leu Lys Gln Arg Ile Gln Val Met Val Gln Pro Ser Glu Asp Ile Val 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Pro Glu Asn Gly Pro Glu Gln Pro Gln Ala Gly Ser Ser Thr Ser 
                          405                 410                 415     
          Lys Glu Ala Tyr Ile 
                      420     
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  421]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類GAT-1同功異型物c]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Met Val Asn Thr Thr Asn Met Thr Ser Ala Val Val Glu Phe Trp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Asn Met His Gln Met Thr Asp Gly Leu Asp Lys Pro Gly Gln Ile 
                      20                  25                  30          
          Arg Trp Pro Leu Ala Ile Thr Leu Ala Ile Ala Trp Ile Leu Val Tyr 
                  35                  40                  45              
          Phe Cys Ile Trp Lys Gly Val Gly Trp Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Ala Thr Tyr Pro Tyr Ile Met Leu Ile Ile Leu Phe Phe Arg Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Val Thr Leu Pro Gly Ala Lys Glu Gly Ile Leu Phe Tyr Ile Thr Pro 
                          85                  90                  95      
          Asn Phe Arg Lys Leu Ser Asp Ser Glu Val Trp Leu Asp Ala Ala Thr 
                      100                 105                 110         
          Gln Ile Phe Phe Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Gly Ser Leu Ile Ala Leu 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Tyr Asn Ser Phe His Asn Asn Val Tyr Arg Asp Ser Ile Ile 
              130                 135                 140                 
          Val Cys Cys Ile Asn Ser Cys Thr Ser Met Phe Ala Gly Phe Val Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Ser Ile Val Gly Phe Met Ala His Val Thr Lys Arg Ser Ile Ala 
                          165                 170                 175     
          Asp Val Ala Ala Ser Gly Pro Gly Leu Ala Phe Leu Ala Tyr Pro Glu 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Thr Gln Leu Pro Ile Ser Pro Leu Trp Ala Ile Leu Phe Phe 
                  195                 200                 205             
          Ser Met Leu Leu Met Leu Gly Ile Asp Ser Gln Phe Cys Thr Val Glu 
              210                 215                 220                 
          Gly Phe Ile Thr Ala Leu Val Asp Glu Tyr Pro Arg Leu Leu Arg Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Arg Glu Leu Phe Ile Ala Ala Val Cys Ile Ile Ser Tyr Leu Ile 
                          245                 250                 255     
          Gly Leu Ser Asn Ile Thr Gln Gly Gly Ile Tyr Val Phe Lys Leu Phe 
                      260                 265                 270         
          Asp Tyr Tyr Ser Ala Ser Gly Met Ser Leu Leu Phe Leu Val Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Glu Cys Val Ser Ile Ser Trp Phe Tyr Gly Val Asn Arg Phe Tyr Asp 
              290                 295                 300                 
          Asn Ile Gln Glu Met Val Gly Ser Arg Pro Cys Ile Trp Trp Lys Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Trp Ser Phe Phe Thr Pro Ile Ile Val Ala Gly Val Phe Ile Phe 
                          325                 330                 335     
          Ser Ala Val Gln Met Thr Pro Leu Thr Met Gly Asn Tyr Val Phe Pro 
                      340                 345                 350         
          Lys Trp Gly Gln Gly Val Gly Trp Leu Met Ala Leu Ser Ser Met Val 
                  355                 360                 365             
          Leu Ile Pro Gly Tyr Met Ala Tyr Met Phe Leu Thr Leu Lys Gly Ser 
              370                 375                 380                 
          Leu Lys Gln Arg Ile Gln Val Met Val Gln Pro Ser Glu Asp Ile Val 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Pro Glu Asn Gly Pro Glu Gln Pro Gln Ala Gly Ser Ser Thr Ser 
                          405                 410                 415     
          Lys Glu Ala Tyr Ile 
                      420     
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  6922]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  AAV9 hu14]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaatt gcaatttatt catatcagga ttatcaatac       60
          catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata      120
          ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta      180
          ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg      240
          aatccggtga gaatggcaaa agtttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc      300
          cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg      360
          cctgagcgag gcgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgagt      420
          gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt      480
          cttctaatac ctggaacgct gtttttccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat      540
          caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagtggcat aaattccgtc agccagttta      600
          gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca      660
          actctggcgc atcgggcttc ccatacaagc gatagattgt cgcacctgat tgcccgacat      720
          tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc      780
          tcgacgtttc ccgttgaata tggctcatat tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt      840
          atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa      900
          taggggtcag tgttacaacc aattaaccaa ttctgaacat tatcgcgagc ccatttatac      960
          ctgaatatgg ctcataacac cccttgtttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct     1020
          gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggactccc     1080
          catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg     1140
          ggcctttcgc ccgggctaat tagggggtgt cgcccttcgc tgaagtcctg tattagaggt     1200
          cacgtgagtg ttttgcgaca ttttgcgaca ccatgtggtc acgctgggta tttaagcccg     1260
          agtgagcacg cagggtctcc attttgaagc gggaggtttg aacgcgcagc cgccatgccg     1320
          gggttttacg agattgtgat taaggtcccc agcgaccttg acgagcatct gcccggcatt     1380
          tctgacagct ttgtgaactg ggtggccgag aaggaatggg agttgccgcc agattctgac     1440
          atggatctga atctgattga gcaggcaccc ctgaccgtgg ccgagaagct gcagcgcgac     1500
          tttctgacgg aatggcgccg tgtgagtaag gccccggagg cccttttctt tgtgcaattt     1560
          gagaagggag agagctactt ccacatgcac gtgctcgtgg aaaccaccgg ggtgaaatcc     1620
          atggttttgg gacgtttcct gagtcagatt cgcgaaaaac tgattcagag aatttaccgc     1680
          gggatcgagc cgactttgcc aaactggttc gcggtcacaa agaccagaaa tggcgccgga     1740
          ggcgggaaca aggtggtgga tgagtgctac atccccaatt acttgctccc caaaacccag     1800
          cctgagctcc agtgggcgtg gactaatatg gaacagtatt taagcgcctg tttgaatctc     1860
          acggagcgta aacggttggt ggcgcagcat ctgacgcacg tgtcgcagac gcaggagcag     1920
          aacaaagaga atcagaatcc caattctgat gcgccggtga tcagatcaaa aacttcagcc     1980
          aggtacatgg agctggtcgg gtggctcgtg gacaagggga ttacctcgga gaagcagtgg     2040
          atccaggagg accaggcctc atacatctcc ttcaatgcgg cctccaactc gcggtcccaa     2100
          atcaaggctg ccttggacaa tgcgggaaag attatgagcc tgactaaaac cgcccccgac     2160
          tacctggtgg gccagcagcc cgtggaggac atttccagca atcggattta taaaattttg     2220
          gaactaaacg ggtacgatcc ccaatatgcg gcttccgtct ttctgggatg ggccacgaaa     2280
          aagttcggca agaggaacac catctggctg tttgggcctg caactaccgg gaagaccaac     2340
          atcgcggagg ccatagccca cactgtgccc ttctacgggt gcgtaaactg gaccaatgag     2400
          aactttccct tcaacgactg tgtcgacaag atggtgatct ggtgggagga ggggaagatg     2460
          accgccaagg tcgtggagtc ggccaaagcc attctcggag gaagcaaggt gcgcgtggac     2520
          cagaaatgca agtcctcggc ccagatagac ccgactcccg tgatcgtcac ctccaacacc     2580
          aacatgtgcg ccgtgattga cgggaactca acgaccttcg aacaccagca gccgttgcaa     2640
          gaccggatgt tcaaatttga actcacccgc cgtctggatc atgactttgg gaaggtcacc     2700
          aagcaggaag tcaaagactt tttccggtgg gcaaaggatc acgtggttga ggtggagcat     2760
          gaattctacg tcaaaaaggg tggagccaag aaaagacccg cccccagtga cgcagatata     2820
          agtgagccca aacgggtgcg cgagtcagtt gcgcagccat cgacgtcaga cgcggaagct     2880
          tcgatcaact acgcaggaca ggtaccaaaa caaatgttct cgtcacgtgg gcatgaatct     2940
          gatgctgttt ccctgcagac aatgcgagag actgaatcag aattcaaata tctgcttcac     3000
          tcacggtgtc aaagactgtt tagagtgctt tcccgtgtca gaatctcaac ccgtttctgt     3060
          cgtcaaaaag gcgtatcaga aactgtgcta cattcatcac atcatgggaa aggtgccaga     3120
          cgcttgcact gcttgcgacc tggtcaatgt ggacttggat gactgtgttt ctgaacaata     3180
          aatgacttaa accaggtatg gctgccgatg gttatcttcc agattggctc gaggacaacc     3240
          ttagtgaagg aattcgcgag tggtgggctt tgaaacctgg agcccctcaa cccaaggcaa     3300
          atcaacaaca tcaagacaac gctcgaggtc ttgtgcttcc gggttacaaa taccttggac     3360
          ccggcaacgg actcgacaag ggggagccgg tcaacgcagc agacgcggcg gccctcgagc     3420
          acgacaaggc ctacgaccag cagctcaagg ccggagacaa cccgtacctc aagtacaacc     3480
          acgccgacgc cgagttccag gagcggctca aagaagatac gtcttttggg ggcaacctcg     3540
          ggcgagcagt cttccaggcc aaaaagaggc ttcttgaacc tcttggtctg gttgaggaag     3600
          cggctaagac ggctcctgga aagaagaggc ctgtagagca gtctcctcag gaaccggact     3660
          cctccgcggg tattggcaaa tcgggtgcac agcccgctaa aaagagactc aatttcggtc     3720
          agactggcga cacagagtca gtcccagacc ctcaaccaat cggagaacct cccgcagccc     3780
          cctcaggtgt gggatctctt acaatggctt caggtggtgg cgcaccagtg gcagacaata     3840
          acgaaggtgc cgatggagtg ggtagttcct cgggaaattg gcattgcgat tcccaatggc     3900
          tgggggacag agtcatcacc accagcaccc gaacctgggc cctgcccacc tacaacaatc     3960
          acctctacaa gcaaatctcc aacagcacat ctggaggatc ttcaaatgac aacgcctact     4020
          tcggctacag caccccctgg gggtattttg acttcaacag attccactgc cacttctcac     4080
          cacgtgactg gcagcgactc atcaacaaca actggggatt ccggcctaag cgactcaact     4140
          tcaagctctt caacattcag gtcaaagagg ttacggacaa caatggagtc aagaccatcg     4200
          ccaataacct taccagcacg gtccaggtct tcacggactc agactatcag ctcccgtacg     4260
          tgctcgggtc ggctcacgag ggctgcctcc cgccgttccc agcggacgtt ttcatgattc     4320
          ctcagtacgg gtatctgacg cttaatgatg gaagccaggc cgtgggtcgt tcgtcctttt     4380
          actgcctgga atatttcccg tcgcaaatgc taagaacggg taacaacttc cagttcagct     4440
          acgagtttga gaacgtacct ttccatagca gctacgctca cagccaaagc ctggaccgac     4500
          taatgaatcc actcatcgac caatacttgt actatctctc aaagactatt aacggttctg     4560
          gacagaatca acaaacgcta aaattcagtg tggccggacc cagcaacatg gctgtccagg     4620
          gaagaaacta catacctgga cccagctacc gacaacaacg tgtctcaacc actgtgactc     4680
          aaaacaacaa cagcgaattt gcttggcctg gagcttcttc ttgggctctc aatggacgta     4740
          atagcttgat gaatcctgga cctgctatgg ccagccacaa agaaggagag gaccgtttct     4800
          ttcctttgtc tggatcttta atttttggca aacaaggaac tggaagagac aacgtggatg     4860
          cggacaaagt catgataacc aacgaagaag aaattaaaac tactaacccg gtagcaacgg     4920
          agtcctatgg acaagtggcc acaaaccacc agagtgccca agcacaggcg cagaccggct     4980
          gggttcaaaa ccaaggaata cttccgggta tggtttggca ggacagagat gtgtacctgc     5040
          aaggacccat ttgggccaaa attcctcaca cggacggcaa ctttcaccct tctccgctga     5100
          tgggagggtt tggaatgaag cacccgcctc ctcagatcct catcaaaaac acacctgtac     5160
          ctgcggatcc tccaacggcc ttcaacaagg acaagctgaa ctctttcatc acccagtatt     5220
          ctactggcca agtcagcgtg gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaagcgct     5280
          ggaacccgga gatccagtac acttccaact attacaagtc taataatgtt gaatttgctg     5340
          ttaatactga aggtgtatat agtgaacccc gccccattgg caccagatac ctgactcgta     5400
          atctgtaatt gcttgttaat caataaaccg tttaattcgt ttcagttgaa ctttggtctc     5460
          tgcgcgtcaa aagggcgaca caaaatttat tctaaatgca taataaatac tgataacatc     5520
          ttatagtttg tattatattt tgtattatcg ttgacatgta taattttgat atcaaaaact     5580
          gattttccct ttattatttt cgagatttat tttcttaatt ctctttaaca aactagaaat     5640
          attgtatata caaaaaatca taaataatag atgaatagtt taattatagg tgttcatcaa     5700
          tcgaaaaagc aacgtatctt atttaaagtg cgttgctttt ttctcattta taaggttaaa     5760
          taattctcat atatcaagca aagtgacagg cgcccttaaa tattctgaca aatgctcttt     5820
          ccctaaactc cccccataaa aaaacccgcc gaagcgggtt tttacgttat ttgcggatta     5880
          acgattactc gttatcagaa ccgcccaggg ggcccgagct taagactggc cgtcgtttta     5940
          caacacagaa agagtttgta gaaacgcaaa aaggccatcc gtcaggggcc ttctgcttag     6000
          tttgatgcct ggcagttccc tactctcgcc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg     6060
          ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc     6120
          cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag     6180
          gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca     6240
          tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca     6300
          ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg     6360
          atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag     6420
          gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt     6480
          tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca     6540
          cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg     6600
          cggtgctaca gagttcttga agtggtgggc taactacggc tacactagaa gaacagtatt     6660
          tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc     6720
          cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg     6780
          cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg     6840
          gaacgacgcg cgcgtaactc acgttaaggg attttggtca tgagcttgcg ccgtcccgtc     6900
          aagtcagcgt aatgctctgc tt                                              6922
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  128]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  5' ITR]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg       60
          ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc      120
          gagcgcgc                                                               128
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  128]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  3' ITR]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg       60
          tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag      120
          gggttcct                                                               128
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  735]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  AAV真型]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu His Ser Pro Ala Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 
                          165                 170                 175     
          Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 
                      180                 185                 190         
          Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 
                          245                 250                 255     
          Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 
                      260                 265                 270         
          Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 
                  275                 280                 285             
          Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 
                          325                 330                 335     
          Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 
                      340                 345                 350         
          Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 
                  355                 360                 365             
          Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 
              370                 375                 380                 
          Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 
                          405                 410                 415     
          Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 
                      420                 425                 430         
          Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 
                  435                 440                 445             
          Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Met Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 
              450                 455                 460                 
          Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ala Ala Asp Asn Asn 
                          485                 490                 495     
          Asn Ser Asp Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 
                      500                 505                 510         
          Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 
                  515                 520                 525             
          Asp Glu Glu Lys Tyr Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 
              530                 535                 540                 
          Gln Asp Ser Gly Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 
          545                 550                 555                 560 
          Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 
                          565                 570                 575     
          Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Ser Gly Asn Thr Gln Ala Ala Thr 
                      580                 585                 590         
          Ser Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 
                  595                 600                 605             
          Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 
              610                 615                 620                 
          Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 
          625                 630                 635                 640 
          His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 
                          645                 650                 655     
          Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 
                      660                 665                 670         
          Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 
                  675                 680                 685             
          Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 
              690                 695                 700                 
          Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 
          705                 710                 715                 720 
          Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 
                          725                 730                 735 
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  736]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  AAV9]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 
                          165                 170                 175     
          Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 
                      180                 185                 190         
          Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 
                          245                 250                 255     
          Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 
                      260                 265                 270         
          Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 
                  275                 280                 285             
          Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 
              290                 295                 300                 
          Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 
                          325                 330                 335     
          Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 
                      340                 345                 350         
          Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 
                  355                 360                 365             
          Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 
              370                 375                 380                 
          Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 
                          405                 410                 415     
          Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 
                      420                 425                 430         
          Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 
              450                 455                 460                 
          Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 
                      500                 505                 510         
          Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 
                  515                 520                 525             
          Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 
              530                 535                 540                 
          Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 
                          565                 570                 575     
          Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 
                      580                 585                 590         
          Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 
                  595                 600                 605             
          Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 
              610                 615                 620                 
          Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 
          625                 630                 635                 640 
          Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 
                          645                 650                 655     
          Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 
                      660                 665                 670         
          Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 
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          Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 
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          Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 
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          Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 
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          gccctcggaa gaccgagaca gcggagaggt tgcgggtgag ctgcgctgag cccaggagcc       60
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          atcggagcgg ccgagccgcc cggatgcagc gcctgtcccg ggcagcgcag ccccggccgc      180
          aggatctcac ccagggtggc agaaggaggc cttctggagc tgacccaccc ccgacgacca      240
          tcagggtgcc cttgagccgc aaaactgctg tccacgtgga ccgggggtga catcgcacgt      300
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          gccgacgggc agatctccac cgaggtcagc gaggcccctg tggccaatga caagcccaaa      420
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          ggccgcttcg acttcctcat gtcctgtgtg ggctatgcca tcggcctggg caacgtctgg      540
          aggttcccct atctctgcgg gaaaaatggt gggggagcct tcctgatccc ctatttcctg      600
          acactcatct ttgcgggggt cccactcttc ctgctggagt gctccctggg ccagtacacc      660
          tccatcgggg ggctaggggt atggaagctg gctcctatgt tcaagggcgt gggccttgcg      720
          gctgctgtgc tatcattctg gctgaacatc tactacatcg tcatcatctc ctgggccatt      780
          tactacctgt acaactcctt caccacgaca ctgccgtgga aacagtgcga caacccctgg      840
          aacacagacc gctgcttctc caactacagc atggtcaaca ctaccaacat gaccagcgct      900
          gtggtggagt tctgggagcg caacatgcat cagatgacgg acgggctgga taagccaggt      960
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          gtggatgagt accccaggct cctccgcaac cgcagagagc tcttcattgc tgctgtctgc     1620
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          atctcaacct acctcgagtg gcgagtccag acaccatcac cacgcagaga ggggaggtgg     2280
          gaggacagtt agacccctgg gtgggccctg ccgtgggcaa ggatacccgg tggcttctgg     2340
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          gggcctcagg tcctactggg gaaacttcct ataccggagc tccagtttct cttaagctgc     3000
          ccaatttcac agagtacaaa atagttgtag gggaaatcaa ggtgaaggat ctgtccgaca     3060
          gtcaagacgg atccacagta atctttcggt ctccttaaac taccaccctc gctgccaccc     3120
          accccaagct gctgccgcct caccttcctt gaaatttctc agcgggagtc tcctcactgc     3180
          cactaaaatc cacccagccc actaactgag gagctagtgt taatccagag aaccccccgc     3240
          aatgtgcttc cgagattcag actgcttcat tgggaagtat gatttgttcc tttctggaat     3300
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          tgtagctcct tagctagtta gctcacaagc cgtgttttat gactaatcct taataactat     3480
          ggtaaataac tgtgactgtg gggtttttaa tctcttgtca ttctcatcca aaagtgacca     3540
          gcataccagt tcttgcaata agatattacc ctcagaatat taagcacatt attgtagaga     3600
          aaaaaaaata tgtgtacaca tatgaacgca caacatgcac attcatcctc acatgtggca     3660
          cgtaaggtct catttgatat tgtgtaggaa atctgaagcc ttttcctgag gtcatctgta     3720
          aaatagtctc attgccaagg catccccagt gccagctggt gaatccatga tcaaaatgca     3780
          tacgtattgt taaatgataa ggtttagaat gacaggaacc catcactgtg tctcatggtc     3840
          ccacttcccc atctgtgtgt gaattccttt agactaaggg caggaagact tccagctttc     3900
          tctttgttct tcaatgtgaa actgagacca agtctctcta agacaaatgc agtgtattta     3960
          atgtttgtaa gcaattctaa gtgagatgtt tggcaagaaa tcccctaact gatttccatc     4020
          caaacctacc ttatagagca caatattaag tgttgtacaa ttactgtgag aactgtgaat     4080
          atgtgtaact tttttttagt atttgcccgg ggggaaaaag atattgtatt atcatatatg     4140
          cttttttgca ataaggattt attctcagaa caccaagtaa atctatctct atataaaaaa     4200
          tatatgtaat atatacatat tcaaagtata tacagagcct gttttaaaaa atacagtatt     4260
          atttagtaaa attatctgtt ctatggacca aatgtaaaat atttataaat gaagatgcat     4320
          tttaaatgtc tataaatggt gtcataacta gagcacgggc gttatgtaag tttctaagaa     4380
          tttagaggat aaataataaa ggttctatga tatacaa                              4417
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          gccctcggaa gaccgagaca gcggagaggt tgcgggtgag ctgcgctgag cccaggagcc       60
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          tcagggtgcc cttgagccgc aaaactgctg tccacgtgga ccgggggtga catcgcacgt      300
          ccatctgcca ggacccctgc gtccaaattc cgagacatgg cgaccaacgg cagcaaggtg      360
          gccgacgggc agatctccac cgaggagcct tcctgatccc ctatttcctg acactcatct      420
          ttgcgggggt cccactcttc ctgctggagt gctccctggg ccagtacacc tccatcgggg      480
          ggctaggggt atggaagctg gctcctatgt tcaagggcgt gggccttgcg gctgctgtgc      540
          tatcattctg gctgaacatc tactacatcg tcatcatctc ctgggccatt tactacctgt      600
          acaactcctt caccacgaca ctgccgtgga aacagtgcga caacccctgg aacacagacc      660
          gctgcttctc caactacagc atggtcaaca ctaccaacat gaccagcgct gtggtggagt      720
          tctgggagcg caacatgcat cagatgacgg acgggctgga taagccaggt cagatccgct      780
          ggccactggc catcacgctg gccatcgcct ggatccttgt gtatttctgt atctggaagg      840
          gtgttggctg gactggaaag gtggtctact tttcagccac atacccctac atcatgctga      900
          tcatcctgtt cttccgtgga gtgacgctgc ccggggccaa ggagggcatc ctcttctaca      960
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          tgttcgcagg attcgtcatc ttctccatcg tgggcttcat ggcccatgtc accaagaggt     1200
          ccattgctga tgtggcggcc tcaggccccg ggctggcgtt cctggcatac ccagaggcgg     1260
          tgacccagct gcctatctcc ccactctggg ccatcctctt cttctccatg ctgttgatgc     1320
          tgggcattga cagccagttc tgcactgtgg agggcttcat cacagccctg gtggatgagt     1380
          accccaggct cctccgcaac cgcagagagc tcttcattgc tgctgtctgc atcatctcct     1440
          acctgatcgg tctctctaac atcactcagg ggggtattta tgtcttcaaa ctctttgact     1500
          actactctgc cagtggcatg agcctgctgt tcctcgtgtt ctttgaatgt gtctctattt     1560
          cctggtttta cggtgtcaac cgattctatg acaatatcca agagatggtt ggatccaggc     1620
          cctgcatctg gtggaaactc tgctggtctt tcttcacacc aatcattgtg gcgggcgtgt     1680
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          aggatctcac ccagggtggc agaaggaggc cttctggagc tgacccaccc ccgacgacca      240
          tcagggtgag gcaactccaa ggtcctactc tctttctgtg cctgttaccc accccgtcct      300
          cctagggtgc ccttgagccg caaaactgct gtccacgtgg accgggggtg acatcgcacg      360
          tccatctgcc aggacccctg cgtccaaatt ccgagacatg gcgaccaacg gcagcaaggt      420
          ggccgacggg cagatctcca ccgaggcgtg ggccttgcgg ctgctgtgct atcattctgg      480
          ctgaacatct actacatcgt catcatctcc tgggccattt actacctgta caactccttc      540
          accacgacac tgccgtggaa acagtgcgac aacccctgga acacagaccg ctgcttctcc      600
          aactacagca tggtcaacac taccaacatg accagcgctg tggtggagtt ctgggagcgc      660
          aacatgcatc agatgacgga cgggctggat aagccaggtc agatccgctg gccactggcc      720
          atcacgctgg ccatcgcctg gatccttgtg tatttctgta tctggaaggg tgttggctgg      780
          actggaaagg tggtctactt ttcagccaca tacccctaca tcatgctgat catcctgttc      840
          ttccgtggag tgacgctgcc cggggccaag gagggcatcc tcttctacat cacacccaac      900
          ttccgcaagc tgtctgactc cgaggtgtgg ctggatgcgg caacccagat cttcttctca      960
          tacgggctgg gcctggggtc cctgatcgct ctcgggagct acaactcttt ccacaacaat     1020
          gtctacaggg actccatcat cgtctgctgc atcaattcgt gcaccagcat gttcgcagga     1080
          ttcgtcatct tctccatcgt gggcttcatg gcccatgtca ccaagaggtc cattgctgat     1140
          gtggcggcct caggccccgg gctggcgttc ctggcatacc cagaggcggt gacccagctg     1200
          cctatctccc cactctgggc catcctcttc ttctccatgc tgttgatgct gggcattgac     1260
          agccagttct gcactgtgga gggcttcatc acagccctgg tggatgagta ccccaggctc     1320
          ctccgcaacc gcagagagct cttcattgct gctgtctgca tcatctccta cctgatcggt     1380
          ctctctaaca tcactcaggg gggtatttat gtcttcaaac tctttgacta ctactctgcc     1440
          agtggcatga gcctgctgtt cctcgtgttc tttgaatgtg tctctatttc ctggttttac     1500
          ggtgtcaacc gattctatga caatatccaa gagatggttg gatccaggcc ctgcatctgg     1560
          tggaaactct gctggtcttt cttcacacca atcattgtgg cgggcgtgtt cattttcagt     1620
          gctgtgcaga tgacgccact caccatggga aactatgttt tccccaagtg gggccagggt     1680
          gtgggctggc tgatggctct gtcttccatg gtcctcatcc ccgggtacat ggcctacatg     1740
          ttcctcacct taaagggctc cctgaagcag cgcatccaag tcatggtcca gcccagcgaa     1800
          gacatcgttc gcccagagaa tggtcctgag cagccccagg cgggcagctc caccagcaag     1860
          gaggcctaca tctagggtgg gggccactca ccgacccgac actctcaccc cccgacctgg     1920
          ctgagtgcga ccaccacttg atgtctgagg ataccttcca tctcaaccta cctcgagtgg     1980
          cgagtccaga caccatcacc acgcagagag gggaggtggg aggacagtta gacccctggg     2040
          tgggccctgc cgtgggcaag gatacccggt ggcttctggc acctggcggg ctggtgacct     2100
          ttttaatcca ggccccatca gcatcccacg atcggccttg gtaaccgccg cggtagatca     2160
          tttttatccc gccagggagt gtgatgcagg aagaccacat gcgctcctgg cttttaaacc     2220
          tgttcctgac tgttctctta ctgccgaaac ccttgactgt tatctcggac tttgcaggag     2280
          ttcctttccc tccgaacgct gctccatgca caggaaaagg gcattttgta caatggggac     2340
          ttcccgggaa cgcttgctct taagtaccag aagccggcgg agctctggct ttcgtgtttt     2400
          tggttttctc cttcccaagg cagctggatt gaaaaaacaa aacaaaacaa aaaaacccag     2460
          gggcgtcagt cgatattccc agggccgctt ctcctgcagt ctgtggagcg tccttgtccc     2520
          cgccgccgga atgaatgagc attctgcagc ccgatgtccc tgtcccctcc tcgccgggcc     2580
          attctgattg gacctggccc agtgcaatct gtccagacaa gccctgcttg ctggaaaact     2640
          gccacaagca caattgatct ctttttatcg ccattccagg ggcctcaggt cctactgggg     2700
          aaacttccta taccggagct ccagtttctc ttaagctgcc caatttcaca gagtacaaaa     2760
          tagttgtagg ggaaatcaag gtgaaggatc tgtccgacag tcaagacgga tccacagtaa     2820
          tctttcggtc tccttaaact accaccctcg ctgccaccca ccccaagctg ctgccgcctc     2880
          accttccttg aaatttctca gcgggagtct cctcactgcc actaaaatcc acccagccca     2940
          ctaactgagg agctagtgtt aatccagaga accccccgca atgtgcttcc gagattcaga     3000
          ctgcttcatt gggaagtatg atttgttcct ttctggaatt gggctccgtg gtggcggcgg     3060
          cacttcaagc aaagacagtt tcttgcaagc tccagtagct ccgcgtgtct catttgccag     3120
          gaagatgggt tcccacgtag caaatcgtac attgtgccct gtagctcctt agctagttag     3180
          ctcacaagcc gtgttttatg actaatcctt aataactatg gtaaataact gtgactgtgg     3240
          ggtttttaat ctcttgtcat tctcatccaa aagtgaccag cataccagtt cttgcaataa     3300
          gatattaccc tcagaatatt aagcacatta ttgtagagaa aaaaaaatat gtgtacacat     3360
          atgaacgcac aacatgcaca ttcatcctca catgtggcac gtaaggtctc atttgatatt     3420
          gtgtaggaaa tctgaagcct tttcctgagg tcatctgtaa aatagtctca ttgccaaggc     3480
          atccccagtg ccagctggtg aatccatgat caaaatgcat acgtattgtt aaatgataag     3540
          gtttagaatg acaggaaccc atcactgtgt ctcatggtcc cacttcccca tctgtgtgtg     3600
          aattccttta gactaagggc aggaagactt ccagctttct ctttgttctt caatgtgaaa     3660
          ctgagaccaa gtctctctaa gacaaatgca gtgtatttaa tgtttgtaag caattctaag     3720
          tgagatgttt ggcaagaaat cccctaactg atttccatcc aaacctacct tatagagcac     3780
          aatattaagt gttgtacaat tactgtgaga actgtgaata tgtgtaactt ttttttagta     3840
          tttgcccggg gggaaaaaga tattgtatta tcatatatgc ttttttgcaa taaggattta     3900
          ttctcagaac accaagtaaa tctatctcta tataaaaaat atatgtaata tatacatatt     3960
          caaagtatat acagagcctg ttttaaaaaa tacagtatta tttagtaaaa ttatctgttc     4020
          tatggaccaa atgtaaaata tttataaatg aagatgcatt ttaaatgtct ataaatggtg     4080
          tcataactag agcacgggcg ttatgtaagt ttctaagaat ttagaggata aataataaag     4140
          gttctatgat atacaa                                                     4156
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          <![CDATA[<211>  4095]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類SLC6A1轉錄本變異體5 (同功異型物c)]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          gccctcggaa gaccgagaca gcggagaggt tgcgggtgag ctgcgctgag cccaggagcc       60
          gaggagtcgg gagcgcagta gcgctgagcc cgagcccgag cggccccgcg tcccgagcgc      120
          atcggagcgg ccgagccgcc cggatgcagc gcctgtcccg ggcagcgcag ccccggccgc      180
          aggatctcac ccagggtggc agaaggaggc cttctggagc tgacccaccc ccgacgacca      240
          tcagggtgcc cttgagccgc aaaactgctg tccacgtgga ccgggggtga catcgcacgt      300
          ccatctgcca ggacccctgc gtccaaattc cgagacatgg cgaccaacgg cagcaaggtg      360
          gccgacgggc agatctccac cgaggcgtgg gccttgcggc tgctgtgcta tcattctggc      420
          tgaacatcta ctacatcgtc atcatctcct gggccattta ctacctgtac aactccttca      480
          ccacgacact gccgtggaaa cagtgcgaca acccctggaa cacagaccgc tgcttctcca      540
          actacagcat ggtcaacact accaacatga ccagcgctgt ggtggagttc tgggagcgca      600
          acatgcatca gatgacggac gggctggata agccaggtca gatccgctgg ccactggcca      660
          tcacgctggc catcgcctgg atccttgtgt atttctgtat ctggaagggt gttggctgga      720
          ctggaaaggt ggtctacttt tcagccacat acccctacat catgctgatc atcctgttct      780
          tccgtggagt gacgctgccc ggggccaagg agggcatcct cttctacatc acacccaact      840
          tccgcaagct gtctgactcc gaggtgtggc tggatgcggc aacccagatc ttcttctcat      900
          acgggctggg cctggggtcc ctgatcgctc tcgggagcta caactctttc cacaacaatg      960
          tctacaggga ctccatcatc gtctgctgca tcaattcgtg caccagcatg ttcgcaggat     1020
          tcgtcatctt ctccatcgtg ggcttcatgg cccatgtcac caagaggtcc attgctgatg     1080
          tggcggcctc aggccccggg ctggcgttcc tggcataccc agaggcggtg acccagctgc     1140
          ctatctcccc actctgggcc atcctcttct tctccatgct gttgatgctg ggcattgaca     1200
          gccagttctg cactgtggag ggcttcatca cagccctggt ggatgagtac cccaggctcc     1260
          tccgcaaccg cagagagctc ttcattgctg ctgtctgcat catctcctac ctgatcggtc     1320
          tctctaacat cactcagggg ggtatttatg tcttcaaact ctttgactac tactctgcca     1380
          gtggcatgag cctgctgttc ctcgtgttct ttgaatgtgt ctctatttcc tggttttacg     1440
          gtgtcaaccg attctatgac aatatccaag agatggttgg atccaggccc tgcatctggt     1500
          ggaaactctg ctggtctttc ttcacaccaa tcattgtggc gggcgtgttc attttcagtg     1560
          ctgtgcagat gacgccactc accatgggaa actatgtttt ccccaagtgg ggccagggtg     1620
          tgggctggct gatggctctg tcttccatgg tcctcatccc cgggtacatg gcctacatgt     1680
          tcctcacctt aaagggctcc ctgaagcagc gcatccaagt catggtccag cccagcgaag     1740
          acatcgttcg cccagagaat ggtcctgagc agccccaggc gggcagctcc accagcaagg     1800
          aggcctacat ctagggtggg ggccactcac cgacccgaca ctctcacccc ccgacctggc     1860
          tgagtgcgac caccacttga tgtctgagga taccttccat ctcaacctac ctcgagtggc     1920
          gagtccagac accatcacca cgcagagagg ggaggtggga ggacagttag acccctgggt     1980
          gggccctgcc gtgggcaagg atacccggtg gcttctggca cctggcgggc tggtgacctt     2040
          tttaatccag gccccatcag catcccacga tcggccttgg taaccgccgc ggtagatcat     2100
          ttttatcccg ccagggagtg tgatgcagga agaccacatg cgctcctggc ttttaaacct     2160
          gttcctgact gttctcttac tgccgaaacc cttgactgtt atctcggact ttgcaggagt     2220
          tcctttccct ccgaacgctg ctccatgcac aggaaaaggg cattttgtac aatggggact     2280
          tcccgggaac gcttgctctt aagtaccaga agccggcgga gctctggctt tcgtgttttt     2340
          ggttttctcc ttcccaaggc agctggattg aaaaaacaaa acaaaacaaa aaaacccagg     2400
          ggcgtcagtc gatattccca gggccgcttc tcctgcagtc tgtggagcgt ccttgtcccc     2460
          gccgccggaa tgaatgagca ttctgcagcc cgatgtccct gtcccctcct cgccgggcca     2520
          ttctgattgg acctggccca gtgcaatctg tccagacaag ccctgcttgc tggaaaactg     2580
          ccacaagcac aattgatctc tttttatcgc cattccaggg gcctcaggtc ctactgggga     2640
          aacttcctat accggagctc cagtttctct taagctgccc aatttcacag agtacaaaat     2700
          agttgtaggg gaaatcaagg tgaaggatct gtccgacagt caagacggat ccacagtaat     2760
          ctttcggtct ccttaaacta ccaccctcgc tgccacccac cccaagctgc tgccgcctca     2820
          ccttccttga aatttctcag cgggagtctc ctcactgcca ctaaaatcca cccagcccac     2880
          taactgagga gctagtgtta atccagagaa ccccccgcaa tgtgcttccg agattcagac     2940
          tgcttcattg ggaagtatga tttgttcctt tctggaattg ggctccgtgg tggcggcggc     3000
          acttcaagca aagacagttt cttgcaagct ccagtagctc cgcgtgtctc atttgccagg     3060
          aagatgggtt cccacgtagc aaatcgtaca ttgtgccctg tagctcctta gctagttagc     3120
          tcacaagccg tgttttatga ctaatcctta ataactatgg taaataactg tgactgtggg     3180
          gtttttaatc tcttgtcatt ctcatccaaa agtgaccagc ataccagttc ttgcaataag     3240
          atattaccct cagaatatta agcacattat tgtagagaaa aaaaaatatg tgtacacata     3300
          tgaacgcaca acatgcacat tcatcctcac atgtggcacg taaggtctca tttgatattg     3360
          tgtaggaaat ctgaagcctt ttcctgaggt catctgtaaa atagtctcat tgccaaggca     3420
          tccccagtgc cagctggtga atccatgatc aaaatgcata cgtattgtta aatgataagg     3480
          tttagaatga caggaaccca tcactgtgtc tcatggtccc acttccccat ctgtgtgtga     3540
          attcctttag actaagggca ggaagacttc cagctttctc tttgttcttc aatgtgaaac     3600
          tgagaccaag tctctctaag acaaatgcag tgtatttaat gtttgtaagc aattctaagt     3660
          gagatgtttg gcaagaaatc ccctaactga tttccatcca aacctacctt atagagcaca     3720
          atattaagtg ttgtacaatt actgtgagaa ctgtgaatat gtgtaacttt tttttagtat     3780
          ttgcccgggg ggaaaaagat attgtattat catatatgct tttttgcaat aaggatttat     3840
          tctcagaaca ccaagtaaat ctatctctat ataaaaaata tatgtaatat atacatattc     3900
          aaagtatata cagagcctgt tttaaaaaat acagtattat ttagtaaaat tatctgttct     3960
          atggaccaaa tgtaaaatat ttataaatga agatgcattt taaatgtcta taaatggtgt     4020
          cataactaga gcacgggcgt tatgtaagtt tctaagaatt tagaggataa ataataaagg     4080
          ttctatgata tacaa                                                      4095
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          <![CDATA[<223>  AAV真型DNA序列]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa       60
          tgtatttaga aaaataaaca aataggggtc agtgttacaa ccaattaacc aattctgaac      120
          attatcgcga gcccatttat acctgaatat ggctcataac accccttgtt tgcctggcgg      180
          cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc      240
          cgatggtagt gtggggactc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac      300
          gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gcccgggcta attagggggt gtcgcccttc      360
          gctgaagtcc tgtattagag gtcacgtgag tgttttgcga cattttgcga caccatgtgg      420
          tcacgctggg tatttaagcc cgagtgagca cgcagggtct ccattttgaa gcgggaggtt      480
          tgaacgcgca gccgccatgc cggggtttta cgagattgtg attaaggtcc ccagcgacct      540
          tgacgagcat ctgcccggca tttctgacag ctttgtgaac tgggtggccg agaaggaatg      600
          ggagttgccg ccagattctg acatggatct gaatctgatt gagcaggcac ccctgaccgt      660
          ggccgagaag ctgcagcgcg actttctgac ggaatggcgc cgtgtgagta aggccccgga      720
          ggcccttttc tttgtgcaat ttgagaaggg agagagctac ttccacatgc acgtgctcgt      780
          ggaaaccacc ggggtgaaat ccatggtttt gggacgtttc ctgagtcaga ttcgcgaaaa      840
          actgattcag agaatttacc gcgggatcga gccgactttg ccaaactggt tcgcggtcac      900
          aaagaccaga aatggcgccg gaggcgggaa caaggtggtg gatgagtgct acatccccaa      960
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          cctgactaaa accgcccccg actacctggt gggccagcag cccgtggagg acatttccag     1380
          caatcggatt tataaaattt tggaactaaa cgggtacgat ccccaatatg cggcttccgt     1440
          ctttctggga tgggccacga aaaagttcgg caagaggaac accatctggc tgtttgggcc     1500
          tgcaactacc gggaagacca acatcgcgga ggccatagcc cacactgtgc ccttctacgg     1560
          gtgcgtaaac tggaccaatg agaactttcc cttcaacgac tgtgtcgaca agatggtgat     1620
          ctggtgggag gaggggaaga tgaccgccaa ggtcgtggag tcggccaaag ccattctcgg     1680
          aggaagcaag gtgcgcgtgg accagaaatg caagtcctcg gcccagatag acccgactcc     1740
          cgtgatcgtc acctccaaca ccaacatgtg cgccgtgatt gacgggaact caacgacctt     1800
          cgaacaccag cagccgttgc aagaccggat gttcaaattt gaactcaccc gccgtctgga     1860
          tcatgacttt gggaaggtca ccaagcagga agtcaaagac tttttccggt gggcaaagga     1920
          tcacgtggtt gaggtggagc atgaattcta cgtcaaaaag ggtggagcca agaaaagacc     1980
          cgcccccagt gacgcagata taagtgagcc caaacgggtg cgcgagtcag ttgcgcagcc     2040
          atcgacgtca gacgcggaag cttcgatcaa ctacgcagac aggtaccaaa acaaatgttc     2100
          tcgtcacgtg ggcatgaatc tgatgctgtt tccctgcaga caatgcgaga gaatgaatca     2160
          gaattcaaat atctgcttca ctcacggaca gaaagactgt ttagagtgct ttcccgtgtc     2220
          agaatctcaa cccgtttctg tcgtcaaaaa ggcgtatcag aaactgtgct acattcatca     2280
          tatcatggga aaggtgccag acgcttgcac tgcctgcgat ctggtcaatg tggatttgga     2340
          tgactgcatc tttgaacaat aaatgattta aatcaggtat ggctgccgat ggttatcttc     2400
          cagattggct cgaggacact ctctctgaag gaataagaca gtggtggaag ctcaaacctg     2460
          gcccaccacc accaaagccc gcagagcggc ataaggacga cagcaggggt cttgtgcttc     2520
          ctgggtacaa gtacctcgga cccttcaacg gactcgacaa gggagagccg gtcaacgagg     2580
          cagacgccgc ggccctcgag cacgacaaag cctacgaccg gcagctcgac agcggagaca     2640
          acccgtacct caagtacaac cacgccgacg cggagtttca ggagcgcctt aaagaagata     2700
          cgtcttttgg gggcaacctc ggacgagcag tcttccaggc gaaaaagagg atccttgaac     2760
          ctctgggcct ggttgaggaa cctgttaaga cggctccggg aaaaaagagg ccggtagagc     2820
          actctcctgc cgagccagac tcctcctcgg gaaccggaaa gagcggccag cagcctgcaa     2880
          gaaaaagatt gaattttggt cagactggag acgcagactc agtacctgac ccccagcctc     2940
          tcggacagcc accagcagcc ccctctggtc tgggaactaa tacgatggct agcggcagtg     3000
          gcgcaccaat ggcagacaat aacgagggcg ccgacggagt gggtaattcc tcgggaaatt     3060
          ggcattgcga ttccacatgg atgggcgaca gagtcatcac caccagcacc cgaacctggg     3120
          ccctgcccac ctacaacaac cacctctaca aacaaatttc cagccaatca ggagcctcga     3180
          acgacaatca ctactttggc tacagcaccc cttgggggta ttttgacttc aacagattcc     3240
          actgccactt ttcaccacgt gactggcaaa gactcatcaa caacaactgg ggattccgac     3300
          ccaagagact cagcttcaag ctctttaaca ttcaagtcaa agaggtcacg cagaatgacg     3360
          gtacgacgac gattgccaat aaccttacca gcacggttca ggtgtttact gactcggagt     3420
          accagctccc gtacgtcctc ggctcggcgc atcaaggatg cctcccgccg ttcccagcag     3480
          acgtcttcat ggtgccacag tatggatacc tcaccctgaa caacgggagt caggcagtag     3540
          gacgctcttc attttactgc ctggagtact ttccttctca gatgctgcgt accggaaaca     3600
          actttacctt cagctacact tttgaggacg ttcctttcca cagcagctac gctcacagcc     3660
          agagtctgga ccgtctcatg aatcctctca tcgaccagta cctgtattac ttgagcagaa     3720
          caaacactcc aagtggaacc accacgatgt caaggcttca gttttctcag gccggagcga     3780
          gtgacattcg ggaccagtct aggaactggc ttcctggacc ctgttaccgc cagcagcgag     3840
          tatcaaagac agccgcggat aacaacaaca gtgactactc gtggactgga gctaccaagt     3900
          accacctcaa tggcagagac tctctggtga atccgggccc ggccatggca agccacaagg     3960
          acgatgaaga aaagtacttt cctcagagcg gggttctcat ctttgggaag caagactcag     4020
          gcaaaacaaa tgtggacatt gaaaaggtca tgattacaga cgaagaggaa atcaggacaa     4080
          ccaatcccgt ggctacggag cagtatggtt ctgtatctac caacctccag agcggcaaca     4140
          cccaagcagc taccagcgat gtcaacacac aaggcgttct tccaggcatg gtctggcagg     4200
          acagagatgt gtaccttcag gggcccatct gggcaaagat tccacacacg gacggacatt     4260
          ttcacccctc tcccctcatg ggtggattcg gacttaaaca ccctcctcca cagattctca     4320
          tcaagaacac cccggtacct gcgaatcctt cgaccacctt cagtgcggca aagtttgctt     4380
          ccttcatcac acagtactcc acgggacagg tcagcgtgga gatcgagtgg gagctgcaga     4440
          aggaaaacag caaacgctgg aatcccgaaa ttcagtacac ttccaactac aacaagtctg     4500
          ttaatgtgga ctttactgtg gacactaatg gcgtgtattc agagcctcgc cccattggca     4560
          ccagatacct gactcgtaat ctgtaattgc ttgttaatca ataaaccgtt taattcgttt     4620
          cagttgaact ttggtctctg cgcgtcaaaa gggcgacaca aaatttattc taaatgcata     4680
          ataaatactg ataacatctt atagtttgta ttatattttg tattatcgtt gacatgtata     4740
          atttttctag agcggccgca gatctcagct ggatatcaaa aactgatttt ccctttatta     4800
          ttttcgagat ttattttctt aattctcttt aacaaactag aaatattgta tatacaaaaa     4860
          atcataaata atagatgaat agtttaatta taggtgttca tcaatcgaaa aagcaacgta     4920
          tcttatttaa agtgcgttgc ttttttctca tttataaggt taaataattc tcatatatca     4980
          agcaaagtga caggcgccct taaatattct gacaaatgct ctttccctaa actcccccca     5040
          taaaaaaacc cgccgaagcg ggtttttacg ttatttgcgg attaacgatt actcgttatc     5100
          agaaccgccc agggggcccg agcttaagac tggccgtcgt tttacaacac agaaagagtt     5160
          tgtagaaacg caaaaaggcc atccgtcagg ggccttctgc ttagtttgat gcctggcagt     5220
          tccctactct cgccttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg     5280
          cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat     5340
          aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc     5400
          gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc     5460
          tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga     5520
          agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt     5580
          ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg     5640
          taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc     5700
          gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg     5760
          gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc     5820
          ttgaagtggt gggctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg     5880
          ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc     5940
          gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct     6000
          caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga cgcgcgcgta     6060
          actcacgtta agggattttg gtcatgagct tgcgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct     6120
          ctgcttttag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt     6180
          atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca     6240
          gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat     6300
          acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt     6360
          gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag tttatgcatt tctttccaga cttgttcaac     6420
          aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt tattcattcg     6480
          tgattgcgcc tgagcgaggc gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg     6540
          aatcgagtgc aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc     6600
          aggatattct tctaatacct ggaacgctgt ttttccgggg atcgcagtgg tgagtaacca     6660
          tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga agtggcataa attccgtcag     6720
          ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac atcattggca acgctacctt tgccatgttt     6780
          cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc atacaagcga tagattgtcg cacctgattg     6840
          cccgacatta tcgcgagccc atttataccc atataaatca gcatccatgt tggaatttaa     6900
          tcgcggcctc gacgtttccc gttgaatatg gctcatattc ttcctt                    6946
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          <![CDATA[<223>  小鼠SLC6A1]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          atggcgactg acaacagcaa ggtggctgat gggcagatct ctactgaggt cagcgaggcc       60
          cctgtggcca gcgacaagcc caaaaccctg gtagtcaagg tgcagaagaa ggccggggac      120
          ctccctgacc gggacacatg gaagggacgc ttcgacttcc tcatgtcctg cgtgggctat      180
          gccatcggcc tgggcaatgt gtggaggttc ccttacctct gtgggaaaaa cggtggcggg      240
          gccttcctaa tcccatattt cctgacgctc atctttgcgg gtgttcctct cttccttttg      300
          gagtgctccc taggccagta cacctccatt gggggcctgg gcgtatggaa gctggcgccc      360
          atgttcaagg gtgtgggcct cgcggcagct gtgctgtcct tctggctgaa catctactac      420
          atcgtcatca tctcctgggc catctactac ctgtacaact ccttcaccac gaccctgcca      480
          tggaaacagt gtgacaaccc gtggaacact gaccgctgct tctccaacta cagcctggtc      540
          aataccacca acatgaccag cgccgtggtg gagttctggg agcgcaacat gcaccagatg      600
          acagatggac tggacaagcc aggacagatc cgctggcctc tggccatcac actggccatt      660
          gcctgggtgc tcgtgtattt ctgcatctgg aagggtgttg gttggactgg aaaggtggtc      720
          tacttctcag ccacgtaccc ctacatcatg cttatcatcc tgttcttccg tggagtgacg      780
          cttcccgggg ccaaggaggg gatcctcttc tacatcacac ccaacttccg aaagctgtct      840
          gattctgagg tgtggcttga cgccgccacc cagatcttct tctcctacgg gctgggcctg      900
          gggtccctga ttgctctggg aagctacaac tctttccaca acaatgtgta cagggactcc      960
          atcatcgttt gctgcatcaa ctcctgcacc agcatgtttg ccggattcgt catcttctcc     1020
          atcgtgggct tcatggctca tgtcaccaag aggtccatag ctgatgtggc agcctcaggc     1080
          ccggggctgg cattcttggc gtaccctgag gctgtgacac agctacccat ctctcccctc     1140
          tgggctatcc tcttcttctc catgctgctg atgctgggca ttgacagcca gttctgtacc     1200
          gtggagggct tcatcactgc cctggtggac gagtacccca gacttctccg caatcgccgt     1260
          gaactcttca ttgctgccgt gtgcatcgtg tcctacctga ttggcctgtc taacatcacc     1320
          cagggtggca tttatgtctt caaactgttt gattattact ctgccagcgg catgagcttg     1380
          ctgttcctgg ttttcttcga gtgtgtctcc atttcctggt tttatggtgt caaccggttc     1440
          tatgacaaca tccaggagat ggttggctcc aggccctgca tctggtggaa gctgtgctgg     1500
          tcctttttca cacccatcat tgtggcgggc gtgtttctct tcagtgctgt gcagatgaca     1560
          ccactcacca tgggaagcta tgttttcccc aagtggggcc agggcgtggg ctggctcatg     1620
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          gagcagaaac tcatctcaga agaggatctg                                        30
          <![CDATA[<210>  33]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HA標籤]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          tacccttacg atgtaccgga ttacgca                                           27
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MECP2內含子]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          gcgctccctc ctctcggaga gagggctgtg gtaaaacccg tccggaaatt ggccgccgct       60
          gccgccaccg ccgccgccgc cgccgcgccg agcggaggag gaggaggagg cgaggaggag      120
          agactgtgag tgggaccgcc aaggccgcgg gcggggaccc ttgctggggg gcgggtaggg      180
          gcgggacgtg gcgcgggagg ggcccgcggg gtcgggcgac acggctggcg gttggcgtcc      240
          ctcctctcta ccctccccct ccctctgccg ccggtggtgg ctttctccac tcgtctcccg      300
          caatcgcgag cgacggttct cagcgcgatc tccctggagc caccttcgat tgacgccctc      360
          ccgctgcccg ccccatctgt gcgcatccta ggccccagct gtgcaagcgc ccttgtcgtc      420
          tgggcttcgc cagttggggc tgcgcgcgct cctgcccttc ttggggcttt gggcctcggc      480
          actgtcgcgc gcccgcggtc ccggcctctc cctggatcgc gctgtcccct tctccctcgc      540
          gcgcccccac tcccgttact tgctcccccc tcacacacac agactggcgc gcgtgcgcag      600
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          gttttgctcc ctcctcctcc tctcccattc cgtgactttt tgcccccact gcaagcgagt      720
          cggtccatca gctccattcc ccacttggca ggaacaagtt gagggttatt gtccacccac      780
          aaaaaggact agacattttg ttcctaggtc ccacaactca tcataaagag ttggttgtag      840
          ttctcatcag gaaccgtggg caagggactg tgcgttcctc agcactcgaa gctcttccgt      900
          gagaccttgc ccgcagggtg ctctggttct ttggggttgc tgtgctgtgg cttcggaatt      960
          tgagcgtctt cccaccctcc ctcccctccc ttcgccagcg ttctgtctac aagaaagaat     1020
          aggcaggtgt ccttggatat cgtagttgct aatcgcctat acactgttct attacacctt     1080
          tctgctaagg atagggtttt tggttttggt tttggttttg ttccccaccc tccagtttgg     1140
          tttagttttg gttttggcat ttagggtttt ttggggggga gtaatatctt gtggtaaaga     1200
          cccatctgac ccaagatacc ttttttctca tactggaacc ctaggcagca gttgctattt     1260
          ccctgagtta gcaatagttt tacagtattt tgaggccttt tgtccataat tctcacggaa     1320
          tccctcaggg atcagattag ctgctgttgg gatcaggaaa ttgggttaca ccgctgaaat     1380
          ctcttgctgg ggcccttgtt ttgaattgga aagtcaggag gctggaacga aggctcacaa     1440
          gttaacagtg ccagctgctc ttccagaagc cctggattca gtcccaccaa tccatcgcgg     1500
          gtcacaacca tctgtaactt cagtcccaag gggtccgaag ccctcttctg gctttgccct     1560
          attattttat ttatcttatc tgtttttgtc ttgtcatctg gcaagcccag ggggccattg     1620
          ggtgcaactt ataaactgac ttctgtatct taagaagcca accatacagt gcttacattc     1680
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          ggtcaaatat ctttgaccaa tatcaccagc aacctaaagc tgttaagaaa tctttgggcc     1800
          ccagcttgac ccaaggatac agtatcctag ggaagttacc aaaatcagag atagtatgca     1860
          gcagccaggg gtctcatgtg tggcactcaa gctcacctat actcactact gtgcagacag     1920
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EF1a啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg       60
          ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt      120
          gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca      180
          ctagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca g               231
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Claims (31)

  1. 一種核酸構築體，其包含編碼以下之轉殖基因： i.    γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)，其包含SEQ ID NO: 18、19、20；或 ii.   與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留呈GAT-1之功能性的序列；或 iii.  天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile。
  2. 如請求項1之核酸構築體，其中該轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (solute carrier family 6 member 1；SLC6A1)基因，其中該轉殖基因較佳包含： i.   SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，較佳SEQ ID NO: 15 ii.  或與SEQ ID NO: 15、26、27、28或29具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性之序列。
  3. 如請求項1或2中任一項之核酸構築體，其進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含： a.  SEQ ID NO: 1，或較佳地以5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 2之SEQ ID NO: 1；或 b.  SEQ ID NO: 3；或 c.  SEQ ID NO: 4；或 d.  SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 6，或較佳地以5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 6之SEQ ID NO: 35；或 e.  SEQ ID NO: 7；或較佳地以5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 34之SEQ ID NO: 7；或 f.   SEQ ID NO: 8；或 g.  SEQ ID NO: 9；或 h.  SEQ ID NO: 10；或 i.   SEQ ID NO: 11，或以5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，或較佳地以5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 12之SEQ ID NO: 11，其中SEQ ID NO: 12以5'至3'定向上可操作地連接於SEQ ID NO: 13；或 j.   SEQ ID NO: 14。
  4. 如前述請求項中任一項之核酸構築體，其中該構築體包含聚腺苷酸化信號序列，較佳為包含SEQ ID NO: 17之聚腺苷酸化信號序列。
  5. 一種病毒載體，其包含如前述請求項中任一項之核酸構築體，其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(inverted terminal repeat；ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。
  6. 如請求項5之病毒載體，其中該5'ITR及/或該3'ITR包含天然腺相關病毒(adeno-associated virus；AAV)之ITR，諸如AAV2。
  7. 如請求項5或6中任一項之病毒載體，其中該5'ITR包含SEQ ID NO: 22及/或該3'ITR包含SEQ ID NO: 23。
  8. 一種病毒顆粒，其包含如請求項1至4中任一項之核酸構築體或如請求項5至7中任一項之病毒載體。
  9. 如請求項8之病毒顆粒，其中該病毒顆粒至少包含來自AAV之VP1衣殼蛋白，其中該衣殼蛋白較佳包含AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9 (諸如包含SEQ ID NO: 25)、AAV10、AAV-真型(AAVtt)或其組合。
  10. 如請求項9之病毒顆粒，其中該衣殼蛋白來自AAVtt且較佳包含SEQ ID NO: 24或其與SEQ ID NO: 24至少98.5%，較佳99%或99.5%一致。
  11. 一種病毒載體，其包含包含有編碼以下之轉殖基因的核酸構築體： i.   γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)，其包含SEQ ID NO: 18、19、20；或 ii.  與SEQ ID NO: 18、19或20具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性且保留呈GAT-1之功能性的序列；或 iii. 天然存在之變異體，其參考SEQ ID NO: 18，包含一或多個突變，較佳選自由以下組成之群：Ala2Thr；Asp165Tyr；Arg277Ser；Ile434Met；Arg579His；Gly5Ser；Arg172Cys；Arg277Cys；Ser470Cys；Pro580Ser；Asp10Asn；Arg172His；Arg277Pro；Ile471Val；Pro587Ala；Gly11Arg；Phe174Tyr；Ser280Cys；Gly476Ser；Ala589Val；Ile13Thr；Ser178Asn；Asn310Ser；Arg479Gln；Ile599Val；Glu16Lys；Asn181Asp；Tyr317His；Lys497Asn；Glu19Gly；Asn181Lys；Ile321Val；Phe502Tyr；Pro21Thr；Arg195His；Ser328Leu；Ile506Val；Lys33Glu；Met197Leu；Met332Val；Ala509Val；Val34Leu；Asp202Glu；Val337Ile；Thr520Met；Asp40Asn；Lys206Glu；His347Arg；Gly535Val；Met1之缺失；Glu411後之終止密碼子；Asp43Glu；Arg211Cys；Ala354Val；Leu547Phe；Lys76Asn；Ile220Val；Leu375Met；Met552Ile；Asn77Asp；Ile220Asn；Ile377Val；Met555Val；Ile84Phe；Ala221Thr；Ile405Val；Thr558Asn；Phe87Leu；Val240Ala；Val409Met；Arg566His；Ile91Val；Phe242Val；Leu415Ile；Gln572Arg；Val142Ile；Tyr246Cys；Arg417Cys；Pro573Thr；Thr156Asn；Arg257Cys；Arg417His；Pro573Ser；Thr158Pro；Arg257His；Arg419Cys；Ser574Asn；Asp165Asn；Thr260Met；Arg419His；或Val578Ile； 其中該病毒載體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該病毒載體中所包含之核酸構築體包含聚腺苷酸化信號序列；且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。
  12. 一種病毒載體，其包含包含有轉殖基因之核酸構築體，該轉殖基因為溶質載體家族6成員1 (SLC6A1)基因，其中該轉殖基因較佳包含： i.   SEQ ID NO: 15、26、27、28或29，更佳SEQ ID NO: 15 ii.  或與SEQ ID NO: 15、26、27、28或29具有至少95%或96%或97%或98%或99%或99.5%序列一致性之序列， 其中該病毒載體進一步包含可操作地連接於該轉殖基因之啟動子，其中該啟動子較佳包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14；其中該病毒載體中所包含之核酸構築體包含聚腺苷酸化信號序列，且其中該病毒載體進一步包含位於該核酸構築體5'及/或3'側翼處之反向末端重複序列(ITR)，較佳5'ITR及3'ITR。
  13. 如請求項11或12中任一項之病毒載體，其中該轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 18之γ丁酸(GABA)轉運蛋白1 (GAT-1)。
  14. 如請求項11至13中任一項之病毒載體，其中該聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 17。
  15. 一種病毒顆粒，其包含如請求項11至14中任一項之病毒載體。
  16. 如請求項15之病毒顆粒，其中該病毒顆粒至少包含來自AAV之VP1衣殼蛋白，其中該衣殼蛋白較佳包含AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9 (諸如包含SEQ ID NO: 25)、AAV10、AAV-真型(AAVtt)或其組合。
  17. 如請求項16之病毒顆粒，其中該衣殼蛋白來自AAV9且較佳包含SEQ ID NO: 25或AAVtt，且較佳包含SEQ ID NO: 24或其與SEQ ID NO: 24至少98.5%、較佳99%或99.5%一致。
  18. 一種質體，其包含如請求項1至4中任一項之核酸構築體或如請求項5至7或11至14中任一項之病毒載體。
  19. 一種宿主細胞，其用於產生如請求項8至10或15至17中任一項之病毒顆粒。
  20. 如請求項19之宿主細胞，其中該宿主細胞包含： a.  如請求項1至4中任一項之核酸構築體或如請求項5至7或11至14中任一項之病毒載體； b.  編碼AAV rep及/或cap基因的核酸構築體，較佳為質體，不攜有ITR序列；及視情況 c.  包含病毒輔助基因之核酸構築體，例如質體或病毒。
  21. 一種產生如請求項8至10或15至17中任一項之病毒顆粒的方法，該方法包含以下步驟： a.  在培養基中培養如請求項18或19中任一項之宿主細胞；及 b.  自該宿主細胞培養基及/或在該等宿主細胞內部採集該等病毒顆粒。
  22. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至4中任一項之核酸構築體或如請求項5至7或11至14中任一項之病毒載體或如請求項8至10或15至17中任一項之病毒顆粒，以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
  23. 如請求項8至10或15至17中任一項之病毒顆粒，其用於療法中。
  24. 如請求項8至10或15至17中任一項之病毒顆粒，其用於治療及/或預防以SLC6A1單倍體不足為特徵之疾病，其中該疾病較佳包含伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(myoclonic atonic epilepsy；MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群(Lennox Gastaut Syndrome)以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合。
  25. 如請求項23或24中任一項之病毒顆粒，其中其用於恢復GAT-1功能及/或降低癲癇頻率。
  26. 如請求項8至10或15至17中任一項之病毒顆粒，其中該疾病與患者中導致病理性GAT-1變異體之至少一種突變相關，其中該等病理性GAT-1變異體包含一個突變或突變組合。
  27. 如請求項26之病毒顆粒，其中該突變參考SEQ ID NO: 18，包含R44W、R44Q、R50L、D52E、D52V、F53S、S56F、G63S、N66D、G75R、G79R、G79V、F92S、G94E、G105S、Q106R、G112V、Y140C、C173Y、G232V、F270S、R277H、A288V、S295L、G297R、A305T、G307R、V323I、A334P、V342M、A357V、G362R、L366V、A367T、F385L、G393S、S456R、S459R、M487T、V511L、G550R或其組合。
  28. 一種用於治療及/或預防以SLC6A1單倍體不足為特徵之疾病的方法，其中該疾病較佳包含伴有認知、運動行為共病之單基因癲癇；早發發育性及癲癇性腦病；癲癇性腦病；兒童期發作癲癇症候群；肌痙攣失張力癲癇(MAE)；MEA樣及其他癲癇適應症，諸如雷葛氏症候群以及自閉症譜系障礙及精神分裂症或與GABA攝取受損相關之疾病或其組合，伴或不伴自閉症及/或精神分裂症，該方法包含向有需要之個體投與如請求項8至10或15至17中任一項之病毒顆粒。
  29. 如請求項28之方法，其中該方法用於恢復GAT-1功能及/或降低癲癇頻率。
  30. 如請求項28或29中任一項之方法，其中該疾病與患者中導致病理性GAT-1變異體之至少一種突變相關，其中該等病理性GAT-1變異體包含一個突變或突變組合。
  31. 如請求項30之方法，其中該突變參考SEQ ID NO: 18，包含R44W、R44Q、R50L、D52E、D52V、F53S、S56F、G63S、N66D、G75R、G79R、G79V、F92S、G94E、G105S、Q106R、G112V、Y140C、C173Y、G232V、F270S、R277H、A288V、S295L、G297R、A305T、G307R、V323I、A334P、A367T、V342M、A357V、G362R、L366V、F385L、G393S、S456R、S459R、M487T、V511L、G550R或其組合。
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