CN112585170A

CN112585170A - 纳米原纤纤维素水凝胶

Info

Publication number: CN112585170A
Application number: CN201980034947.5A
Authority: CN
Inventors: M·诺珀宁; L·帕索嫩; T·萨托马; O·埃迪欧; J·贺林
Original assignee: UPM Kymmene Oy
Current assignee: UPM Kymmene Oy
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CA3101067A1; CN112585170B; EP3572434A1; US20210214510A1; FI20206321A1; FI129962B; EP3572434B1; JP2021524519A; WO2019224314A1

Abstract

公开了一种纳米原纤纤维素水凝胶。该纳米原纤纤维素水凝胶可包含叠氮改性的纳米原纤纤维素，其具有由式‑O‑(CH₂)_n‑S(O)_m‑L₁‑N₃表示的取代基，其中n在1至10的范围内；m为0或1；L₁是连接基；其中所述取代基连接到叠氮改性的纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳上，从而形成与所述碳相连的醚键。

Description

纳米原纤纤维素水凝胶

技术领域

本公开涉及纳米原纤纤维素水凝胶。

背景

纳米原纤纤维素水凝胶用于3D细胞培养，因为水凝胶提供了三维基质，细胞可以在其中生长并且可以相互作用。纳米原纤纤维素水凝胶是相对定义的细胞培养基材，因此，除了纳米原纤纤维素本身以外，通常不包含生长因子或其他旨在影响细胞生长，分化或粘附的组分。

纳米原纤纤维素水凝胶通常以水凝胶分散体的形式提供，其粘度和其他流变性质适合于细胞培养。

发明内容

公开了一种纳米原纤纤维素水凝胶。纳米原纤纤维素水凝胶可包含叠氮改性的纳米原纤纤维素。叠氮改性的纳米原纤纤维素可以具有由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-N₃表示的取代基，其中n在1至10的范围内；m为0或1；L₁是连接基。取代基可以连接至叠氮改性的纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳，从而形成与该碳连接的醚键。

附图简要说明

所附附图提供了对说明书的实施方式的进一步理解并构成说明书的一部分，其例示了各种实施方式。在附图中：

图1：生成叠氮改性的和配体改性的纳米原纤纤维素的示意图；

图2：叠氮改性的

的MALDI-TOF质谱；

图3：经过改性的

在高压灭菌后仍可发挥功能；

图4：烯丙基化的

的¹H-NMR谱；

图5A-5D：培养9天后，不同3D水凝胶中的iPS细胞；

图6：不同3D水凝胶中iPS细胞的细胞计数；

图7：不同3D水凝胶中的细胞活力；

图8：细胞增殖测定；

图9A和9B：在改性的

中生长的球状体的抗Tra-1-60染色；

图10A和10B：在

中生长的球状体中的抗SSEA-4染色；

图11A-11C：在

中生长的“大”球状体中的Alexa488-鬼笔环肽染色；

图12A-12C：在聚糖

中生长的球状体中的Alexa488-鬼笔环肽染色；

图13A-13C：在未改性的

中生长的球状体中的Alexa488-鬼笔环肽染色；

图14A-14C：在未改性的

中生长的球状体中的Alexa488-鬼笔环肽染色；和

图15：通过应力扫描测量，未改性样品(实线)和改性样品(虚线)的0.5％纳米纤维素分散体的粘弹性质。

发明详述

公开了包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶。叠氮改性的纳米原纤纤维素具有共价键合于其上的叠氮基(-N₃)基团。

现已发现，可以使用包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶将配体共价连接(即偶联)到水凝胶的纳米原纤纤维素上。例如，可以将诸如生长因子或其他生物分子的配体连接至水凝胶。合适的配体可以包括例如，蛋白质，肽，聚糖或纳米原纤纤维素(交联的纳米原纤纤维素)。这样的配体可以改善或支持与水凝胶接触生长的细胞和/或组织的生长，分化和/或附着。纳米原纤纤维素水凝胶可适用于细胞和/或组织的培养，例如多能干(PS)细胞，例如诱导的多能干细胞(iPS细胞)的培养。

可以以允许连接一个或多个选择的配体和/或一个或多个选择的量的配体的形式提供纳米原纤纤维素水凝胶。最终用户可以在使用水凝胶之前不久完成连接。

纳米原纤纤维素水凝胶的流变性质和/或胶凝性质不一定受到改性的显著影响。根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的叠氮改性似乎没有引起纳米原纤纤维素的明显的不希望的交联，这种交联可能不利地影响流变学或胶凝性能。

制备叠氮改性的纳米原纤纤维素水凝胶和将配体连接至其的反应可以在水溶液中进行，因此水凝胶的性质可能不会受到制备水凝胶时所用反应条件的显著影响。反应不需要例如苛性溶剂。此外，所使用的化学物质不会将潜在的有毒成分引入水凝胶。因此，反应后纯化水凝胶的过程可能相对较简单，甚至可以省去。

纳米原纤纤维素的改性不会明显干扰纳米原纤纤维素水凝胶的酶促降解，例如使用一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶进行的酶促降解。例如与配体和纳米原纤纤维素水凝胶的简单混合相比，配体还可以相对均匀地分布在水凝胶内，使配体在溶液中而不与纳米原纤纤维素共价结合。

可以由植物来源的纤维素原料制备纳米原纤纤维素。该原料可以基于含纤维素的任何植物材料。原料也可以源自某些细菌发酵过程。在一个实施方式中，植物材料是木材。木材可以来自软木树如云杉、松树、冷杉、落叶松、花旗松或铁杉，或来自硬木树如桦树、白杨、杨树、桤木、桉树、橡树、山毛榉或刺槐，或者来自软木和硬木的混合物。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素从木浆获得。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素从硬木浆获得。在一个实例中，硬木是桦木。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素从软木浆获得。

纳米原纤纤维素可以由植物材料制备。在一个例子中，原纤是从非薄壁(non-parenchymal)植物材料获得的。在这种情况下，原纤可以从次生细胞壁获得。这种纤维素原纤的一种丰富来源是木纤维。植物来源(例如木材)的纤维素浆料的最小纤维素实体包括纤维素分子、初级原纤和微原纤。微原纤单元是物理条件下聚结导致的初级原纤的束，而物理条件下聚结的原理是表面自由能降低。

纳米原纤纤维素是通过对来自木材的纤维原料进行均质化制得，所述纤维原料可以是化学浆料。纤维素纤维可以崩解产生直径在纳米范围内的原纤，该直径可以最高达200nm，或最高达50nm，例如在1-200nm或1-100nm的范围内，并且能够提供原纤在水中的分散体。原纤的尺寸可以减小到大部分原纤的直径在2-20nm的范围内。来源于次生细胞壁的原纤可以基本为晶体，其结晶度至少为55％。这种原纤可以具有与源自初生细胞壁的原纤不同的性质；例如源自次生细胞壁的原纤的脱水可能更具挑战性。

如本说明书的上下文中，术语“纳米原纤纤维素”可以指从基于纤维素的纤维原料分离的纤维素原纤或原纤束。这些原纤的特征在于具有高纵横比(长度/直径)：它们的长度可以超过1μm，而直径通常保持小于200nm。最小的原纤具有所谓的初级原纤的规格，它们的直径通常为2至12nm。原纤的尺度和尺寸分布可以取决于精制方法和效率。纳米原纤纤维素可表征为基于纤维素的材料，其中颗粒(原纤或原纤束)的中值长度不超过50μm，例如在1至50μm的范围内，并且颗粒直径小于1μm，例如在2至500nm的范围内。在天然纳米原纤纤维素的情况中，在一个实施方式中原纤的平均直径在5至100nm的范围内，例如在10至50nm的范围内。在纳米原纤纤维素中可能存在完整的未原纤化的微原纤单元。如本说明书的上下文中，术语“纳米原纤纤维素”不旨在包括非原纤的棒形的纤维素钠米晶体或须晶。

目前关于纳米原纤纤维素的命名并不统一，在文献中使用的术语可能不一致。例如，以下术语已经用作纳米原纤纤维素的同义词：纤维素纳米纤维(CNF)、纳米原纤纤维素、纳米原纤化的纤维素(NFC)、纳米纤维素、纳米级原纤化的纤维素、微原纤纤维素、纤维素微原纤、微原纤化的纤维素(MFC)和原纤纤维素。

纳米原纤纤维素的特征在于具有大的比表面积和强的形成氢键的能力。在水分散体中，纳米原纤纤维素一般呈现为浅色或混浊的凝胶状材料。根据纤维原料，纳米原纤纤维素也可含有少量的其它木质组分，如半纤维素或木质素。其量取决于植物来源。

不同级别的纳米原纤纤维素可基于三个主要特性分类：(i)尺寸分布、长度和直径；(ii)化学组成；和(iii)流变性质。为了完全描述级别，可以平行使用这些性质。不同级别的实例可以包括天然(或未改性的)NFC、氧化NFC(高粘度)、氧化NFC(低粘度)、羧甲基化NFC和阳离子化NFC。在这些主要级别中，还可以存在亚级别，例如：极佳原纤化相比于中度原纤化、高度取代相比于低度取代、低粘度相比于高粘度，等等。原纤化技术和化学预改性可能对原纤尺寸分布有影响。通常，非离子级别可能具有更宽的原纤直径(例如10-100nm，或10-50nm)，而化学改性级别可能更细(例如2-20nm)。对于改性级别，原纤尺寸的分布可能也更窄。某些改性，尤其是TEMPO氧化，可以产生更短的原纤。

根据原料来源，例如硬木(HW)相比于软木(SW)浆料，最终纳米原纤纤维素产品中可能存在不同的多糖组成。通常，从漂白的桦木浆料制备非离子级别，其可能产生高二甲苯含量(25重量％)。从HW或SW浆料制备改性级别。在这些改性级别中，半纤维素也可以与纤维素域一起被改性。改性可以不是均匀的，即，一些部分相比其他部分可以被改性到更高的程度。因此，不可能进行详细的化学分析——改性产物通常是不同多糖结构的复杂混合物。

在水性环境中，纤维素纳米纤维的分散体可以形成粘弹性水凝胶网络。例如，该凝胶可由分散和水合的缠结原纤在相对低浓度(例如0.05至0.2％(w/w))下形成。NFC水凝胶的粘弹性可用例如动态振动流变学测量来表征。纳米原纤纤维素水凝胶可以表现出特有的流变性质。例如，它们是剪切稀化或假塑性材料，这意味着其粘度取决于使材料变形的速度(或力)。当在旋转流变仪中测量粘度时，观察到以下剪切稀化特性：随着剪切速率增加而粘度降低。水凝胶显示出塑性行为，这意味着在材料开始容易地流动之前需要一定的剪切应力(力)。该临界剪切应力经常被称作屈服应力。屈服应力可由用应力控制流变仪测定的稳态流动曲线确定。当将所述粘度相对于施加的剪切应力作图时，可看到在超过临界剪切应力后粘度急剧下降。零剪切粘度和屈服应力可以是描述材料悬浮能力的最重要的流变参数。这两种参数可以非常清楚地区分不同的级别，从而能对级别进行分类。

原纤或原纤束的尺寸可以取决于原料和崩解方法。可采用任何合适的设备，如精制机、研磨机、分散器、均质机、磨碎机(colloider)、摩擦研磨机、销棒粉碎机(pin mill)、转子-转子解胶机、超声波破碎器、流化器(如微流化器、大流化器(macrofluidizer)或流化器型均质机)来对纤维素原料进行机械崩解。可以在存在足够的水的条件下进行崩解处理，以防止纤维之间形成键。

在一个实例中，通过使用具有至少一个转子、桨叶或类似移动机械构件的分散器进行崩解，所述分散器例如是转子-转子解胶机(rotor-rotor dispergator)。转子-转子解胶机的一个实例是Atrex设备。

适于崩解的设备的另一实例是销棒粉碎机，例如多重外周销棒粉碎机。在US6202946 B1中描述了这种设备的一个例子。

在一个实施方式中，通过使用均质机进行崩解。

在本说明书的上下文中，术语"原纤化"一般指通过向颗粒施加的功来机械崩解纤维材料，由此纤维素原纤从纤维或纤维片段中脱离。该功可基于各种作用，例如研磨、压碎或剪切、或它们的组合，或者能够减小颗粒尺寸的其他相应的作用。精制工作所消耗的能量通常以能量/(处理的原料量)表示，单位例如是kWh/kg，MWh/吨，或者与这些单位成比例的单位。表述“崩解”或“崩解处理”可与“原纤化”互换使用。经历原纤化的纤维材料分散体可以是纤维材料和水(或水溶液)的混合物，在本文中也被称为“浆料(pulp)”。纤维材料分散体一般可指与水混合的整个纤维、从中分离的部分(片段)、原纤束或原纤，并且一般地，水性纤维材料分散体是这类物质的混合物，其中组分之间的比例取决于加工程度或处理阶段，例如取决于同一批次纤维材料在处理过程中的进行处理的次数或“经历”次数。

崩解的纤维状纤维素原料可以是改性的或未改性的纤维原料。改性的纤维原料是指纤维受改性处理影响的原料，从而纤维素纳米原纤更易于从纤维上脱离。可以对液体中悬浮物形式(例如浆料)存在的纤维状纤维素原料进行改性。

对纤维的改性处理可以是化学性或物理性的。在化学改性中，纤维素分子的化学结构通过化学反应(纤维素的“衍生化”)改变，例如使得纤维素分子的长度不受影响但官能团添加至聚合物的β-D-吡喃葡萄糖单元。纤维素的化学改性以某一转化度发生，该转化度取决于反应物的剂量和反应条件，通常化学改性不完全，这样纤维素将作为原纤保持固体形式并且不溶于水。在物理改性中，阴离子型、阳离子型或非离子型物质或其任意组合可以物理性地吸附在纤维素表面上。改性处理也可以是酶促的。特别地，在改性之后纤维中的纤维素可以是带离子电荷的，这是因为纤维素的离子电荷可以减弱纤维的内部键，之后可以有助于崩解至纳米原纤纤维素。可以通过对纤维素进行化学或物理改性来获得离子电荷。与起始原料相比，改性后的纤维可以具有更高的阴离子或阳离子电荷。最普遍使用的用于制备阴离子电荷的化学改性方法可以包括氧化(其中羟基被氧化为醛和羧基)、磺化以及羧甲基化。进而，可以通过使阳离子基团(例如季铵基团)连接至纤维素来进行阳离子化，从而以化学方式产生阳离子电荷。

换言之，叠氮改性的纳米原纤纤维素可包含进一步的改性，例如化学改性。化学或物理改性的纳米原纤纤维素可以用作制备叠氮改性的纳米原纤纤维素的原料。或者，叠氮改性的纳米原纤纤维素可以先制备，然后进一步化学或物理改性，例如通过将含叠氮基的化合物与烯基化的纳米原纤纤维素偶联，然后对叠氮改性的纳米原纤纤维素进行化学或物理改性来实现。

纳米原纤纤维素水凝胶也可以是叠氮改性的纳米原纤纤维素和一种或多种其他纳米原纤纤维素类型或级别的混合物。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素包含化学改性的纳米原纤纤维素，例如阴离子改性的纳米原纤纤维素或阳离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是阴离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是阳离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是氧化的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是磺化的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是羧甲基化的纳米原纤纤维素。

纤维素可以被氧化。在纤维素的氧化中，纤维素的伯羟基可以被杂环硝酰基化合物(例如2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-氧基自由基，通常称为“TEMPO”)催化氧化。纤维素β-D-吡喃葡萄糖单元的至少一些伯羟基(C6-羟基)可以被选择性地氧化为羧基。还可以由伯羟基形成一些醛基。纤维素可以被氧化至氧化的纤维素中羧酸含量为0.6-1.4毫摩尔COOH/克浆料，或0.8-1.2毫摩尔COOH/克浆料，例如1.0-1.2毫摩尔COOH/克浆料的水平，该含量由电导滴定确定。当以这种方式得到的氧化纤维素的纤维在水中崩解时，它们可以提供个体化纤维素原纤的稳定透明分散体，该个体化纤维素原纤的宽度可以例如为3-5nm。

纳米原纤纤维素还可以通过平均直径(或宽度)来表征、或平均直径与粘度一起来表征，所述粘度例如是布氏粘度或零剪切粘度。在一个实施方式中，所述纳米原纤纤维素具有在1-100nm范围内的原纤的数均直径。在一个实施方式中，所述纳米原纤纤维素具有在1-50nm范围内的原纤的数均直径。在一个实施方式中，所述纳米原纤纤维素具有在2-15nm范围内的原纤的数均直径，例如TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。可用多种技术，例如使用显微镜确定原纤的直径。可通过对场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、透射电子显微镜(TEM)(例如低温透射电子显微镜(cryo-TEM))或原子力显微镜(AFM)获得的图像进行图像分析来测定原纤厚度和宽度分布。通常，AFM和TEM可以很好地适用于具有窄原纤直径分布的纳米原纤纤维素级别。

可以使用流变仪测量纳米原纤纤维素的粘度。在一个实例中，在22℃，用装配有窄间隙叶片几何结构(叶片的直径为28mm，且长度为42mm)的应力控制旋转流变仪(AR-G2，英国TA仪器公司(TA Instruments,UK))，在直径为30mm的圆筒形样品杯中对纳米原纤纤维素分散体的流变粘度进行测量。在将样品装载到流变仪之后，使它们静止5分钟，之后开始测量。用逐渐增加的剪切应力(其与施加的扭矩成比例)来测量稳态粘度，并测量剪切速率(其与角速度成比例)。在达到恒定剪切速率之后或者在2分钟的最大时间之后，记录某一剪切应力下的报道粘度(＝剪切应力/剪切速率)。当超过1000s^-1的剪切速率时，停止测量。该方法可用于确定零剪切粘度。

在一个实例中，纳米原纤纤维素当分散在水中时提供在1000–100000Pa·s范围内、例如在5000-50000Pa·s范围内的零剪切粘度(在小剪切应力下恒定粘度的“平台”)，和在1–50Pa范围内、例如在3–15Pa范围内的屈服应力(开始剪切稀化时的剪切应力)，这些测量结果是通过旋转流变仪在稠度为0.5重量％(w/w)的条件下在水性介质中确定的。

当以0.5重量％的浓度分散在水中时，该纳米原纤纤维素可以具有0.3–50Pa的储存模量。例如，当以0.5重量％的浓度分散在水中时，储存模量可以在1-20Pa的范围内，或在2-10Pa的范围内。

浊度是通常为肉眼不可见的个体颗粒(所有的悬浮或溶解固体)导致的流体的混浊或模糊。有几种测量浊度的实用方式，最直接的是测量光穿过水样柱时的衰减(即，强度的降低)。可以替代使用的杰克逊蜡烛法(单位：杰克逊浊度单位或JTU)本质上是反过来测量完全遮蔽穿过水柱所见的蜡烛火焰所需的水柱长度。

可以采用光学浊度测量仪器来定量测定浊度。存在一些市售用于定量测量浊度的浊度计。在本发明中，采用基于比浊法的方法。来自校准比浊计的浊度单位称作比浊法浊度单位(NTU)。用标准校准样品对测量设备(浊度计)进行校准和控制，然后对经稀释的NFC样品的浊度进行测量。在一种浊度测量方法中，可以将纳米原纤纤维素样品在水中稀释至低于所述纳米原纤纤维素的凝胶点的浓度，可以测量稀释样品的浊度。测得纳米原纤纤维素样品的浊度的所述浓度可以为0.1％。具有50ml测量容器的HACH P2100浊度计可用于浊度测量。确定纳米原纤纤维素样品的干物质，可以将0.5g样品(以干物质计算)装载到测量容器中，其可以用自来水填充至500g，并通过振荡剧烈混合约30秒。立即将水性混合物分入5个测量容器中，将它们插入浊度计中。可以对每个容器进行3次测量。可以从所获得的结果计算平均值和标准偏差，最终结果可以以NTU单位给出。

表征纳米原纤纤维素的一种方式是既限定粘度又限定浊度。低浊度可以与原纤的小尺寸(例如小直径)相关，因为小原纤对光的散射很差。一般而言，随着原纤化程度增加，粘度增加并且同时浊度降低。然而，这可能发生在某个点之前。当继续进行原纤化时，原纤可能最终开始破裂并且不能再形成牢固的网络。因此，在此点之后，浊度和粘度都可能开始下降。

在一个实例中，阴离子纳米原纤纤维素的浊度低于90NTU，例如3-90NTU，诸如5-60NTU，例如8-40NTU，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测得。在一个实例中，天然纳米原纤的浊度甚至可以高于200NTU，例如10-220NTU，诸如20-200NTU，例如50–200NTU，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测得。为了表征纳米原纤纤维素，这些范围可以与纳米原纤纤维素的粘度范围组合。

用于制备方法的原料可以是直接由上述一些纤维原料的崩解得到的纳米原纤纤维素或可以直接由上述一些纤维原料的崩解得到的纳米原纤纤维素，它们由于崩解条件以较低浓度均匀地分布在水中。原料可以是浓度为0.2-10％的水性凝胶。

术语“叠氮改性的纳米原纤纤维素”可以理解为是指化学改性的纳米原纤纤维素，使得其具有共价键合于其上的叠氮基(-N₃)基团。

纳米原纤纤维素水凝胶的叠氮改性的纳米原纤纤维素包含葡糖基单元，其中的一个或多个葡糖基单元可以被取代。在纳米原纤纤维素水凝胶中，叠氮改性的纳米原纤纤维素可以具有由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-N₃表示的取代基，其中n在1至10的范围内；m为0或1；L₁是连接基。取代基可以连接至叠氮改性的纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳。该取代基由此与所述碳形成醚键。

在一个实施方式中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方式中，n在1至2的范围内，或在1至3的范围内，或在1至4的范围内，或在1至5的范围内，或在1至6的范围内，或在1至7的范围内，或在1至8的范围内。在一个实施方式中，n在3到10的范围内。

根据本领域的惯例，纳米原纤纤维素的每个葡糖基单元包含6个碳原子，这些碳原子的编号为1-6。在未改性的纳米原纤纤维素中，碳2、3和6具有与之连接的羟基。这些碳中的每一个可具有与之连接的单个羟基。因此，取代基可以代替羟基连接至这些碳中的任何一个。换句话说，取代基可以被认为是替代了连接在碳上的羟基。

术语“一个或多个葡糖基单元的碳”可以理解为是指一个或多个葡糖基单元的一个或多个碳。换句话说，单个葡糖基单元的一个或多个碳可以具有与之连接的根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的取代基。作为附加或替代，根据本说明书中描述的取代基的一个或多个实施方式，多个葡糖基单元中的一个或多个碳可以被取代。如本领域技术人员所熟知，纳米原纤纤维素的纤维素原纤或衍生自纤维素原料的原纤束可以包含纤维素分子，所述纤维素分子包含数百或数千个葡糖基(通常为β1,4-D-吡喃葡萄糖基)单元的链。因此，纤维素链的各个葡糖基单元可以独立于纤维素链的其他葡糖基单元被取代。

在本文中，术语“取代基”可以理解为是指由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-N₃表示的部分，其中n在1至10的范围内；m为0或1；且L₁是连接基。取代基可以替代原本应当连接在葡糖基单元的碳上的羟基而连接在碳(即一个或多个碳)上。因此，叠氮改性的纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳(即一个或多个碳)上的羟基可以被所述取代基代替。本文所定义的由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-N₃表示的取代基共价(直接)结合至碳；因此，通过取代基的氧原子在碳和取代基之间形成醚键。

除了一个或多个葡糖基单元之外，纳米原纤纤维素的其他糖单元也具有与之连接的根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的取代基。例如，根据原料，纳米原纤纤维素也可含有其它木质组分，如半纤维素和/或木质素。叠氮改性的纳米原纤纤维素的半纤维素也可以被取代。因此，叠氮改性的纳米原纤纤维素的半纤维素也可以具有根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的取代基，该取代基以与叠氮改性的纳米原纤纤维素类似的方式连接至半纤维素的一个或多个糖单元的碳上。半纤维素的一个或多个糖单元可以是木糖基单元，葡糖醛酸木糖基(glucuronoxylosyl)单元，阿拉伯糖木糖基(arabinoxylosyl)单元，葡糖甘露糖基(glucomannosyl)单元，木糖葡糖基(xyloglucosyl)单元和/或其任何组合或聚合物。

还可以理解，在叠氮改性的纳米原纤纤维素中，取代基可以由根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的取代基的混合物表示。换句话说，至少在一些实施方式中，叠氮改性的纳米原纤纤维素的单个取代基或叠氮改性的纳米原纤纤维素的纤维素的单链的单个取代基可以独立地选自本说明书所述的取代基的一个或多个实施方式。可以有意地将两个或更多个不同的取代基引入叠氮改性的纳米原纤纤维素，和/或可以例如通过叠氮改性的纳米原纤纤维素的制备过程中发生的不同化学反应而将它们引入。因此，叠氮改性的纳米原纤纤维素的所有取代基不一定由相同的式表示。

此外，例如，叠氮改性的纳米原纤纤维素还可以具有由式-O-(CH₂)_nCH＝CH₂表示的烯基(或烯丙基)取代基，其中n在1至8的范围内，所述烯基(或烯丙基)取代基连接到叠氮改性的纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳上，从而形成连接到该碳的醚键。尽管这样的实施方式通常是不期望的，但是当烯基取代基没有进一步反应时，它可能作为副产物出现。

在一些实施方式中，亚砜结构(基团-S(O)-，即-S(＝O)-)可存在于取代基中，即m可为1。在其他实施方式中，不存在亚砜结构，即m为0。还可以理解，在叠氮改性的纳米原纤纤维素中，取代基可以表示混合物。因此，在叠氮改性的纳米原纤纤维素的某些取代基中或在叠氮改性的纳米原纤纤维素的纤维素的单链中，m可以为0，在其他情况下，m可以为1。虽然不受理论限制，亚砜结构的存在可能取决于例如制备叠氮改性的纳米原纤纤维素所用的试剂和/或条件。例如，在UV催化(活化)的反应中，不一定形成亚砜结构，而在化学催化(活化)的反应中，亚砜结构可以在叠氮改性的纳米原纤纤维素中存在的大部分取代基中形成。

在一个实施方式中，L₁表示-CH₂-CH₂(R₁)-NH-L₂-，其中R₁不存在或者是-COOH，L₂是连接基。

换句话说，在纳米原纤纤维素水凝胶中，叠氮改性的纳米原纤纤维素可以具有由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-CH₂-CH₂(R₁)-NH-L₂-N₃表示的取代基，其中n，m，R₁和L₂如本说明书中所定义，其中取代基连接至叠氮改性的纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳。该取代基因此可以与形成与碳连接的醚键。

在一个示例性实施方式中，叠氮改性的纳米原纤纤维素可以由下式表示：

在该式和以下包含R¹和R²的其他式中，R¹和R²表示相邻的葡糖基单元或通过糖基单元的碳1和碳4的糖苷键连接在一起的纳米原纤纤维素分子的链。

换句话说，在该实施方式中，叠氮改性的纳米原纤纤维素的与β1,4-D-葡萄糖单元的碳6连接的取代基由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-N₃表示，其中n为3；m为1；L₁表示-CH₂-CH₂(R₁)-NH-L₂-，其中R₁是-COOH，L₂表示C(O)-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-，其中o是4。在式的另一些实施方式中，m可以为0；R₁可以不存在；和/或o可以为0、1或更大。如图所示，取代基通过取代基的氧原子形成与碳6连接的醚键。

在本说明书的上下文中，包括L₁和/或L₂在内的“连接基”可以包括一个或多个连接基团或部分和/或一个或多个间隔基团。连接基原则上可以是能够结合到根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的叠氮改性的纳米原纤纤维素中的任何连接基团。多种不同的连接基是本领域已知的，并且可以商购获得。其还可以包括一个或多个通过两个官能团之间的反应形成的基团。本领域技术人员将意识到可以利用各种不同的化学物质，因此可以使各种不同的官能团反应以形成L₁和/或L₂所包含的基团或部分，例如巯基，氨基，烯基，炔基，叠氮基，醛，羧基，马来酰亚胺基，琥珀酰亚胺基和/或羟氨基。技术人员能够选择官能团，使得它们可以在某些条件下反应。

连接基可以是亲水的。亲水性连接基可以具有其可以相对很好地溶于水溶液的效用。例如，连接基可以是肽连接基，例如长度为2至5个氨基酸的肽连接基。连接基的长度没有特别限制，可以例如根据配体的尺寸进行选择。可以选择连接基及其长度，以减少空间位阻，优化叠氮改性或配体改性的纳米原纤纤维素在水溶液中的溶解度和/或优化纳米原纤纤维素水凝胶的各种性质。

包括L₁和/或L₂在内的连接基可以包含以下基团或部分中的任何一种或者是例如以下基团或部分中的任何一种：

(a)其他聚亚烷基二醇或其衍生物，包括聚丙二醇均聚物以及乙二醇与丙二醇的共聚物；

(b)肽或其衍生物，包括式-(AA)_n-的肽或其衍生物，其中AA是任何氨基酸，n是1至约100之间的整数；

(c)寡糖或多元醇；

(d)淀粉，糊精，葡聚糖或葡聚糖衍生物，包括硫酸葡聚糖，交联糊精和羧甲基糊精；

(e)肝素或肝素片段；

(f)聚乙烯醇或聚乙烯基乙醚；

(g)聚乙烯吡咯烷酮；

(h)α,β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺；

(i)聚氧乙基化多元醇；或

(j)烷烃，取代的烷烃，烯烃，取代的烯烃，炔烃，取代的炔烃或其衍生物。

合适的连接基或连接基部分的例子是例如WO2004100997中描述的间隔部分，例如其中描述的聚(乙二醇)部分。

在一个实施方式中，L₂表示C(O)-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-，其中o为0或更大。在一个实施方式中，o可以是1或更大。在一个实施方式中，o可以在0至100或1至100的范围内，或在0至20或1至20的范围内。o可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这种类型的连接基可以相对地具有生物相容性，亲水性和柔性。o，即L₂中的(CH₂-CH₂-O)单元的数目，可以根据例如配体的尺寸进行选择。

可以在没有叠氮改性(取代基)的情况下直接与伯或仲羟基连接的纳米原纤纤维素的葡糖基单元中的任何一个碳原子都可以进行改性，使得取代基代替伯或仲羟基连接到碳上。纳米原纤纤维素的一个或多个β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元的碳2、3和6中的一个或多个可以如本说明书中所述进行改性。换句话说，纳米原纤纤维素的一个或多个β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元的碳2，3和6中的一个或多个可具有与之连接的根据在本说明书中描述的一个或多个实施方式的取代基。

也可以将改性选择性地引导至碳6(C6)，即纤维素中D-吡喃葡萄糖基残基的伯羟基。换句话说，一个或多个葡糖基单元中的至少一个或多个可以是β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元，并且取代基所连接的多个β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元中的一个的碳可以是碳6。

叠氮改性的纳米原纤纤维素的取代度(DS)可以为至少约0.0001，至少约0.001，至少约0.01或至少约0.05，或至少约0.1，至少约0.2，至少约0.3，至少约0.4，至少约0.5，至少约0.6，至少约0.7，至少约0.8，至少约0.9或约1。在一个实施方式中，DS为约0.09。在一个实施方式中，DS为约0.06。在此上下文中，DS可具体指被根据本说明书中一个或多个实施方式的取代基取代的DS。术语“取代度”可以理解为是指叠氮改性或配体改性的纳米原纤纤维素的每个葡糖基单元所连接的取代基的数目或平均数目。为了计算每克干燥的纳米原纤纤维素的可用叠氮基的摩尔量，纳米原纤纤维素的结构单元可以理解为具有约162.1克/摩尔的质量，其对应于葡萄糖残基的质量，换句话说，脱水葡萄糖的质量。因此，可以将1摩尔的纳米原纤纤维素理解为具有约162.1g的质量，并且可以将1g的纳米原纤纤维素理解为具有约6.17毫摩尔的摩尔量。因此，0.01的取代度可对应于每162.1g干燥的纳米原纤纤维素10毫摩尔的叠氮基，或0.06毫摩尔/克。

DS可以使得叠氮基的含量或数量超过要与叠氮改性的纳米原纤纤维素连接的配体的含量或数量。

还公开了一种试剂盒，该试剂盒包含根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的纳米原纤纤维素水凝胶。该试剂盒还可以包括使用说明。

还公开了固体支持物，其包含或含有根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的纳米原纤纤维素水凝胶。固体支持物可以是例如多孔板，器皿，生物反应器，支架或3-D微流体细胞培养芯片(芯片上的器官)。固体支持物可适于培养细胞和/或组织。固体支持物可具有用于接受或容纳纳米原纤纤维素水凝胶(叠氮改性的和/或配体改性的)的凹部。

还公开了用于制备具有环状或非环状炔基的配体的试剂盒，该试剂盒包含可与配体偶联的具有环状炔基的连接基化合物。

试剂盒可进一步包含纳米原纤纤维素水凝胶，该纳米原纤纤维素水凝胶包含根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的叠氮改性的纳米原纤纤维素。

试剂盒可进一步包含根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的固体支持物。

试剂盒或固体支持物可进一步包含例如反应缓冲剂和/或其他试剂。例如，试剂盒可包含干燥形式的可与配体偶联且具有环状炔基的连接基化合物，因此，试剂盒可包含用于重建干燥连接基化合物的水溶液。试剂盒或固体支持物可进一步包含细胞培养基。

试剂盒可以进一步包含配体，尽管不是必须的。配体可以单独获得。

试剂盒可以进一步包含具有环状或非环状炔基的配体。作为替代或者补充，试剂盒可进一步包含可与配体偶联的连接基化合物，该连接基化合物可具有环状或非环状炔基。可与配体偶联的连接基化合物可以是本说明书中描述的任何合适的连接基化合物。使用说明可以包括制备根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的包含配体改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶的说明。

在本说明书的上下文中，术语“配体”可以理解为是指可以与生物分子形成复合物以用于生物学目的的分子。配体可以是生物分子，例如。肽，蛋白质(例如糖蛋白)，聚糖或其任何混合物或组合。所述配体可以与细胞分子形成复合物，所述细胞例如是可以适合与纳米原纤纤维素水凝胶接触培养的细胞。配体可以与细胞表面上的分子形成复合物。配体可以促进细胞对纳米原纤纤维素水凝胶的附着/粘附和/或细胞的生长，例如生长因子，粘附分子或能够与粘附分子结合的配体。配体的大小没有特别限制。术语“配体”或“一个配体”也可以包括一个或多个配体，配体的混合物。

配体可以是或包含例如细胞外基质(ECM)组分，凝集素，S型凝集素，C型凝集素，P型凝集素，I型凝集素，半乳糖凝集素，半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素配体，脂质，糖脂，糖苷，半乳糖苷，蛋白聚糖，寡糖，多糖，糖胺聚糖，肝素，硫酸乙酰肝素，软骨素，硫酸软骨素，硫酸角质素，透明质酸，转化生长因子β1(TGF-β1)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，白血病抑制因子(LIF)，整合素(例如αV，β1，β5，α5或α6整合素)，α6β1整合素，α3β1整合素，α1β1或α2β1整合素，整合素配体，塔林(talin)，纽蛋白(vinculin)，金林(kindling)，钙粘着蛋白，上皮(E)钙粘着蛋白，神经(N)钙粘着蛋白，血管内皮(VE)钙粘着蛋白，钙粘着蛋白配体，选择素，选择素配体，层粘连蛋白，层粘连蛋白-511，层粘连蛋白-111，层粘连蛋白-332，层粘连蛋白-521，层粘连蛋白配体，巢蛋白(nidogen)，纤连蛋白，纤连蛋白I型结构域，纤连蛋白II型结构域，纤连蛋白II型结构域，RGD肽，RGD粘附肽(例如GRGDSPC，SEQ ID No:1)，玻连蛋白，玻连蛋白寡肽KGGPQVTRGDVFTMP(SEQ ID No:2)，胶原蛋白，I型胶原蛋白，IV型胶原蛋白，或其结构域，片段或修饰。

术语“具有环状(或非环状)炔基的配体”可以理解为是指本说明书中描述的任何配体，环状(或非环状)炔基直接或通过一个或多个连接基或间隔共价键合到该配体上。

环状或非环状炔基可以与叠氮改性的纳米原纤纤维素的叠氮基反应。非环状炔基可能需要催化剂来有效地反应，例如铜(I)催化剂。环状炔基可以在不存在外源金属(例如铜)催化剂的情况下，在生物正交反应即环加成反应中与叠氮基反应。因此，对于环状炔基，不需要外源金属催化剂，因此在反应中不必包含潜在的细胞毒性金属离子作为催化剂。

环状炔基可以是DBCO(二苄基环辛炔)，OCT(环辛炔)，MOFO(单氟化环辛炔)，ALO(无芳基辛炔)，DIFO(二氟环辛炔)，DIFO2(二氟环辛炔)，DIFO3(二氟环辛炔)，DIMAC(二甲氧基氮杂环辛炔)，DIBO(二苯并环辛炔)，DIBAC(二苯并氮杂环辛炔)，BARAC(双芳基氮杂环辛炔酮)，BCN(双环壬炔)，桑德海默尔(Sondheimer)二炔，TMDIBO(2,3,6,7-四甲氧基-DIBO)，S-DIBO(磺酰化DIBO)，COMBO(羧甲基单苯并环辛炔)，PYRROC(吡咯并环辛炔)或其改性物或类似物。

环状炔基可选自下组：DBCO，OCT，MOFO，ALO，DIFO，DIFO2，DIFO3，DIMAC，DIBO，DIBAC，BARAC，BCN，Sondheimer二炔，TMDIBO，S-DIBO，COMBO，PYRROC和其改性物或类似物。

上述环状炔基的结构示于下表1中。本领域技术人员将理解，本文所述的任何环状炔基可通过环状炔基的合适原子或基团(例如DBCO的N原子或DIBO的O原子)结合至配体和/或连接基。

表1.环状炔基的结构。

这些环状炔烃的各种改性物和类似物也可以考虑或开发。

可与配体偶联的连接基化合物可包含一个或多个连接基团或部分。其还可以包括一个或多个通过两个官能团之间的反应形成的基团。本领域技术人员将认识到，在制备化合物时可以使用各种不同的化学物质，因此可以使各种不同的官能团反应来形成可与配体偶联的连接基化合物所包含的基团。此外，可与配体偶联的连接基化合物可包含一个或多个可与配体偶联的官能团；所述官能团可以根据例如配体进行选择。例如，可与配体偶联的连接基化合物可包含巯基、氨基、烯基、炔基、叠氮基、醛、羧基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、羟氨基中的至少一种。可与配体偶联的连接基化合物可包含N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)或N-羟基磺基琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)酯。例如，可与配体偶联的连接基化合物可包含或者可以是NHS-磺基-DBCO(二苯并环辛炔-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺基酯)或NHS-DBCO(二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺基酯)，其中NHS和DBCO可任选地通过连接基或间隔基团连接。在本说明书中，“琥珀酰亚胺基”可以指N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)或N-羟基磺基琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)。这样的化合物可以与配体的伯氨基反应。也可以考虑各种其他的氨基反应性官能团，例如酰亚胺酯(imidoester)。

公开了制备纳米原纤纤维素水凝胶的方法，该纳米原纤纤维素水凝胶包含根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的叠氮改性的纳米原纤纤维素。该方法可以包括：

用烯基化剂对纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元进行烯基化，以获得烯基化的纳米原纤纤维素，和

将含叠氮基的化合物与烯基化的纳米原纤纤维素偶联，从而获得包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶。

该方法可以包括在烯基化之前提供包含纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶。

烯基化剂可以具有由式X-(CH₂)_nCH＝CH₂表示的结构，其中n在1至8的范围内，并且X是Br、Cl或I。

在一个实施方式中，n是1、2、3、4、5、6、7或8。在一个实施方式中，n在1至2的范围内，或在1至3的范围内，或在1至4的范围内，或在1至5的范围内，或在1至6的范围内，或在1至7的范围内。

在一个实施方式中，烯基化剂是烯丙基溴。当使用烯丙基溴作为烯基化剂时，烯基化(即烯丙基化)的纳米原纤纤维素可由下式表示：

也可以将烯基化选择性地引导至碳6(C6)的羟基，即纤维素中D-吡喃葡萄糖基残基的伯羟基。换句话说，一个或多个葡糖基单元中的至少一个或多个可以是β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元，并且一个或多个β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元中的一个的碳上的被烯基化的羟基可以是碳6上的羟基。

可以在一个或多个步骤中将含叠氮基的化合物与烯基化的纳米原纤纤维素偶联。

该方法可以包括使含硫醇基的化合物与烯基化的纳米原纤纤维素反应，其中所述含硫醇基的化合物还具有叠氮基，从而获得包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶。换句话说，含叠氮基的化合物可以是还具有叠氮基的含硫醇基的化合物。

该方法可以包括使含硫醇基的化合物与烯基化的纳米原纤纤维素反应，其中所述含硫醇基的化合物还具有氨基，从而获得氨基改性的纳米原纤纤维素，以及使具有能够与氨基反应的官能团的化合物与氨基改性的纳米原纤纤维素反应，其中具有官能团的化合物还具有叠氮基，从而获得包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶。

含硫醇基的化合物可以是半胱氨酸，半胱胺，或者它们的组合或混合物。当使用烯丙基溴作为烯基化剂并将半胱氨酸用作含硫醇基的化合物时，氨基改性的纳米原纤纤维素可由下式表示：

该含硫醇基的化合物可以在自由基引发剂的存在下与烯基化的纳米原纤纤维素反应。自由基引发剂能够催化烯基化的纳米原纤纤维素的烯基与硫醇基(巯基)之间的反应。在本说明书的上下文中，“自由基引发剂”可以理解为是指能够在温和条件下产生自由基物质并促进自由基反应的试剂。术语“自由基引发剂”也可以指UV(紫外)光。紫外光照射能够产生自由基，例如在合适的光引发剂存在下产生自由基。合适的自由基引发剂可包括但不限于无机过氧化物，例如过硫酸铵或过硫酸钾，有机过氧化物和紫外光。

当使用烯丙基溴作为烯基化剂，将半胱氨酸用作含硫醇基的化合物，并且将NHS-PEG4-叠氮化物(N-羟基琥珀酰亚胺酯-PEG-叠氮化物连接基，在PEG部分中具有4-(CH₂-CH₂-O)-单元)用作具有能够与氨基反应的官能团的化合物时，叠氮改性的纳米原纤纤维素可以由下式表示：

换句话说，在该实施方式中，取代基代替，即替代叠氮改性的纳米原纤纤维素的β1,4-D-葡萄糖单元的碳6的碳上的羟基。取代基由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-N₃表示，其中n为3；m为1；L₁表示-CH₂-CH₂(R₁)-NH-L₂-，其中R₁是-COOH，并且L₂表示C(O)-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-，其中o是4。在该式的另一些实施方式中，m可以为0；R₁可以不存在；和/或o可以为0、1或更大。

该方法，包括其所有步骤，可以在水溶液中进行。合适的水溶液可以是例如缓冲水溶液，其pH值可以约为6至8。

可以通过以下方式进行该方法：将待改性的纳米原纤纤维素水凝胶稀释至所需的稠度。随后，可将包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的可获得的纳米原纤纤维素水凝胶浓缩至所需的稠度以进一步使用。可以浓缩水凝胶，例如通过离心或过滤来进行。如果需要，可以通过在水中或水溶液中稀释纳米原纤纤维素水凝胶然后浓缩来对其进行洗涤。

含叠氮基的化合物可以与烯基化的纳米原纤纤维素直接反应，从而获得包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶。在这样的实施方式中，含叠氮基的化合物还可以具有硫醇基。也可以考虑获得叠氮改性的纳米原纤纤维素的其他方式或途径。

公开了一种包含配体改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶，其中所述配体改性的纳米原纤纤维素具有一个或多个与其共价结合的配体。一个或多个配体可以包括蛋白质、肽、聚糖或纳米原纤纤维素分子中的至少一种。

配体改性的纳米原纤纤维素可以具有一个或多个通过叠氮基和环状炔基之间的反应形成的基团而与之共价结合的配体。该基团可以是三唑基，例如1,2,3-三唑基。形成的三唑基的确切结构可取决于环状炔基的结构。因此，1,2,3-三唑基可以是通过点击偶联(click conjugation)形成的包含三唑部分的基团。点击偶联应理解为是指叠氮化物与炔烃之间产生共价产物-1,5-二取代的1,2,3-三唑的反应，例如铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(CuAAC)。点击偶联还可以指无铜点击化学，例如叠氮化物和环状炔基(例如二苯并环辛基(DBCO))之间的反应。因此，“1,2,3-三唑基”还可以指通过叠氮化物与环状炔基(例如DBCO)之间的反应形成的基团，其中该基团包含1,2,3-三唑部分。

环状炔基可以是本说明书中描述的任何环状炔基。环状炔基可以是：DBCO，OCT，MOFO，ALO，DIFO，DIFO2，DIFO3，DIMAC，DIBO，DIBAC，BARAC，BCN，Sondheimer二炔，TMDIBO，S-DIBO，COMBO，PYRROC或其改性物或类似物。

配体改性的纳米原纤纤维素可具有由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-D表示的取代基，其中n在1至10的范围内；m为0或1；L₁是连接基；D表示与连接基共价结合的配体；其中取代基连接到配体改性的纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳上。因此，取代基形成与碳相连的醚键。在一个实施方式中，D表示配体和通过根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的纳米原纤纤维素水凝胶的纳米原纤纤维素的叠氮基与配体的环状或非环状炔基之间的反应形成的三唑基。

一个或多个葡糖基单元中的至少一个或多个可以是β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元，并且连接有取代基的多个β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元中的一个的碳可以是碳6。

在一些实施方式中，碳可以是碳6。换句话说，一个或多个葡糖基单元中的至少一个或多个可以是β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元，并且取代基所连接的多个β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元中的一个的碳可以是碳6。碳6的取代基可能不会明显干扰纳米原纤纤维素水凝胶的酶促降解。

在一个实施方式中，配体改性的纳米原纤纤维素具有由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-D表示的取代基，其中n在1至10的范围内；m为0或1；L₁不存在或者是连接基；D表示配体；其中取代基连接到配体改性的纳米原纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳上。该实施方式可以例如通过使具有硫醇基的配体(例如具有硫醇基的肽或蛋白质配体)直接与烯基化的纳米原纤纤维素反应来制备。在一些实施方式中，碳可以是碳6。

在一个实施方式中，L₂表示C(O)-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-，其中o为0或更大。在一个实施方式中，o可以是1或更大。在一个实施方式中，o可以在0至100或1至100的范围内，或在0至20或1至20的范围内。

叠氮改性的纳米原纤纤维素的取代度(DS)可以为至少约0.0001，至少约0.001，至少约0.01或至少约0.05，或至少约0.1，至少约0.2，至少约0.3，至少约0.4，至少约0.5，至少约0.6，至少约0.7，至少约0.8，至少约0.9或约1。在一个实施方式中，DS为约0.09。在一个实施方式中，DS为约0.06。在此上下文中，DS可具体指被根据本说明书中一个或多个实施方式的包含配体(或一个或多个配体)的取代基取代的DS。

在一个实施方式中，一个或多个配体包括蛋白质、肽或聚糖中的至少一种。

一个或多个配体可包含纳米原纤纤维素分子。换句话说，第二纳米原纤纤维素分子可以与配体改性的纳米原纤纤维素或配体改性的纳米原纤纤维素分子共价结合。因此，配体改性的纳米原纤纤维素可以是交联的。这种交联的配体改性的纳米原纤纤维素可以更稳定和/或具有期望的性质，例如粘度或刚度。交联的纳米原纤纤维素可以例如适用于活性药物成分的控制释放或适用于3D打印。

选自蛋白质、肽、聚糖、纳米原纤纤维素分子或其任何混合物或组合的两个或更多个配体可以与配体改性的纳米原纤纤维素共价结合。此外，其他配体可以另外与配体改性的纳米原纤纤维素共价结合。可以考虑各种类型的配体，例如本说明书中描述的任何配体。

公开了制备纳米原纤纤维素水凝胶的方法，该纳米原纤纤维素水凝胶包含根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的配体改性的纳米原纤纤维素。该方法可以包括使根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶与具有环状或非环状炔基的配体接触。

该方法可以包括提供包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶，然后使其与具有环状或非环状炔基的配体接触。

这样的配体可以具有环状或非环状炔基，例如被制备为具有环状或非环状炔基的合成配体。在配体尚未具有环状或非环状炔基的情况下，可以将其与配体共价连接，即偶联。这可以称为激活配体。因此，该方法可以包括将具有环状或非环状炔基的连接基化合物与配体偶联，从而获得具有环状炔基的配体，并使叠氮改性的纳米原纤纤维素水凝胶与具有环状或非环状炔基的配体接触。一个或多个连接基化合物可与配体偶联，使得环状或非环状炔基经由一个或多个连接基或连接基团共价结合至配体。

一个或多个具有环状或非环状炔基的配体，例如配体的混合物，可与包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶接触。

可以将待制备的纳米原纤纤维素水凝胶稀释至所需的稠度以进行该方法。随后，可将包含配体改性的纳米原纤纤维素的可获得的纳米原纤纤维素水凝胶浓缩至所需的稠度以进一步使用。可以浓缩水凝胶，例如通过离心或过滤来进行。如果需要，可以通过在水中或水溶液中稀释纳米原纤纤维素水凝胶然后浓缩来对其进行洗涤。

叠氮基的数量或含量或者DS相对于配体的量可以过量，或者使得可以将不同数目或数量的配体连接至叠氮改性的纳米原纤纤维素。这可以允许例如制备一系列浓度的配体，即包含具有不同数目或数量的配体的配体改性的纳米原纤纤维素的NFC水凝胶。

公开了根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的叠氮改性或配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶或根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的固体支持物用于细胞、组织、类器官或器官的维持、运输、分离、培养、繁殖、传代、分化或移植的用途。

公开了根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的叠氮改性或配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶用于3D打印的用途。

公开了根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的叠氮改性或配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶或根据本说明书中所述的一个或多个实施方式的固体支持物用于改善细胞、组织、类器官或器官的粘附、维持、运输、分离、培养、繁殖、传代、分化或移植的用途。

公开了一种用于细胞、组织、类器官或器官的维持、运输、分离、培养、繁殖、传代、分化或移植的方法。该方法可以包括使细胞、组织、类器官或器官与根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的叠氮改性或配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶或根据本说明书中描述的一个或多个实施方式的固体支持物接触。

在用于维持、运输、分离、培养、繁殖、传代、分化或移植细胞或组织的用途或方法的情况下，细胞可以是本说明书中描述的任何细胞，例如多能干细胞，例如iPS细胞。按照细胞或组织在其中维持、运输、分离、培养、繁殖、传代、分化或移植的生长培养基的体积计，配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶中配体的量至少约为0.001μg/ml。生长培养基可以包括配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶和任选的第二培养基，例如含有营养物的培养基。合适的第二培养基可包括例如用于细胞和/或组织培养的各种液体培养基。例如，配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶中配体的量可以为至少约0.01μg/ml或至少约0.1μg/ml。在配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶中配体的量可以最高达约500μg/ml，或最高达约1mg/ml，或最高达约10mg/ml。例如，按生长培养基的体积计，配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶中配体的合适量可以为1–500μg/ml，或5–100μg/ml。

在用途或方法的一个实施方式中，叠氮改性或配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶或固体支持物用作3D培养基质。

在用途或方法的一个实施方式中，叠氮改性或配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶或固体支持物用于器官或类器官的生长。例如，作为3D微流体细胞培养芯片的固体支持物可用于器官或类器官的生长。

例如，通过支持肠道球状体的存活、扩增和上皮分化为HIO，从人多能干细胞(hPSC)球状体体外生成人肠道类器官(HIO)可能需要在3D培养基质中存在RGD粘附肽(GRGDSPC,SEQ ID No.1)。

椎间盘(IVD)髓核(NP)区域中细胞与层粘连蛋白的相互作用可以促进细胞粘附和生物合成。将层粘连蛋白111型(LM111)结合到3D细胞培养基质中可能对促进NP细胞存活和表型有益。

肝细胞生态位的两个关键元素是层粘连蛋白521和层粘连蛋白111。在层粘连蛋白521和层粘连蛋白111的存在下，人胚胎干细胞(hESC)的组织，功能和向肝细胞的分化可得到明显改善。

实施例

下面详细参考各种实施方式，这些实施方式的例子在附图中示出。

下文详细揭示了一些实施方式，使得本领域技术人员基于这些说明能够使用这些实施方式。没有对实施方式的所有步骤或特征进行详细讨论，因为许多步骤或特征对于本领域技术人员来说基于本说明书是显而易见的。

实施例1–包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶的生成

在以下实施例中，术语“GrowDex”或

是指纳米原纤纤维素水凝胶。在这些实施例中使用的GrowDex是天然纳米原纤纤维素水凝胶。

图1示意性地示出了叠氮改性和配体改性的纳米原纤纤维素的生成。

方案1.

改性反应

方案1中显示了第一产物叠氮改性的GrowDex的合成路线。通过使0.75％(w/v)

水凝胶与0.62％(v/v)的烯丙基溴在0.25M氢氧化钠中于60℃反应3小时来进行烯丙基化。通过用乙酸中和来停止反应，用去离子水洗涤，在3000rcf下离心1分钟，除去上清液。重复洗涤5次。接下来，将0.75％(w/v)L-半胱氨酸添加到20mM过硫酸铵溶液中的1％(w/v)

水凝胶中。在50℃下3小时后，通过如上所述用去离子水洗涤5次来终止反应。最后，将0.75％(w/v)NHS-PEG4-叠氮化物试剂添加到在pH 9.3的30mM Na₂CO₃缓冲溶液中的1％(w/v)

水凝胶中。在室温下3小时后，通过如上所述用去离子水洗涤5次来停止反应。通过在3000rcf下离心较长的时间并去除上清液，可以将浓度提高到1.5％。

高压灭菌

将叠氮改性的材料高压灭菌为约1.5％溶液，外观没有任何可见变化。

表征

在方案1的每个反应步骤后，将等分试样的水凝胶用纤维素酶(UPM生物化学公司(UPM Biochemicals))消化，并通过MALDI-TOF质谱进行分析，鉴定出预期的反应产物：6-O-烯丙基，硫醇-烯和叠氮基-PEG4-酰胺化纤维二糖和纤维三糖(图2)。图2显示了叠氮改性的

的MALDI-TOF质谱。纤维素酶消化后，分析反应产物。观察到预期的改性的二糖和三糖反应产物。

为了验证叠氮官能团在高压灭菌后仍然存在，通过荧光标记物的偶联验证了它们的反应性(图3)。图3显示了经过改性的

在高压灭菌后仍可以发挥作用。使炔基官能化的荧光标记物(DBCO-Alexa)与经过高压灭菌的叠氮改性的

反应，然后将游离的未反应标记物洗掉。离心过程中，标记物与基质一起沉淀，表明其已共价偶联。

纤维素酶消化后，通过1H-NMR谱对烯丙基化的产物进行表征，以实现烯丙基的定量(图4)。图4显示了烯丙基化的

的1H-NMR谱。显示了在1M NaOH中的反应中产生的纤维素酶消化的烯丙基化

未显示关于0.25M NaOH溶液(最终优化的反应条件)的数据。积分的定量显示样品中葡萄糖单元和烯丙基之间是11:1的关系。图4中的参考数字1、2、3、4、5和6表示特定的氢原子和它们所对应的NMR谱中的峰。

实施例2–包含蛋白质改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶的生成

方案2.蛋白质和聚糖改性的

的合成路线。任何含有可及胺基的水溶性分子都可以用NHS-DBCO试剂活化，并通过点击化学(无铜叠氮化物-炔烃环加成反应)与叠氮改性的

偶联。该反应基本上是定量的。

方案2中显示了配体改性的产品(蛋白质和聚糖改性的

)的合成路线。本方案中的蛋白质配体是来自植物刺桐(Erythrina cristagalli，ECA)的凝集素，该凝集素与多能干细胞(PSC)表面结合，并促进其与生长表面的粘附以及在标准2D细胞培养中的有效培养(Mikkola等人，2013，Stem Cells Dev.22:707-16)。将ECA(西格玛(Sigma))溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并通过向ECA蛋白单体中添加4:1(摩尔:摩尔)NHS-DBCO试剂来进行炔改性，然后在室温下反应2小时。通过分光光度分析验证DBCO与ECA的共价偶联，显示通过过滤除去游离标记物后DBCO产生的309nm处的吸光度信号(数据未显示)。将DBCO-ECA产物进行无菌过滤，并将100μg/ml与0.5％叠氮改性的

混合。在室温下反应2小时后，将ECA改性的

洗涤并通过如上所述的离心转移至iPS培养基。通过ECA改性的

的纤维素酶消化然后分离蛋白质并进行MALDI-TOF质谱分析来验证ECA与纤维素基质的共价偶联。观察到具有预期额外质量的ECA蛋白，其对应于纤维素片段-连接基加成物(数据未显示)。

实施例3–包含聚糖改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶的生成

本实施例中的聚糖配体是作为PSC表面糖复合物成分的四糖LNT(乳-N-四糖)和LNnT(乳-N-新四糖)，其与ECA相似，可促进干细胞对生长表面的粘附和2D细胞培养(Mikkola等人，未发表的观察结果)。DBCO-LNT和DBCO-LNnT偶联物在格莱科斯芬兰公司(Glykos Finland Oy)合成，用反相HPLC纯化，并通过MALDI-TOF质谱和1H-NMR光谱进行表征(数据未显示)。将DBCO-聚糖产物进行无菌过滤，与上述0.5％叠氮改性的

混合。

实施例4–在包含改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶中的细胞培养

细胞培养

将iPS细胞接种在0.5％水凝胶中，使其在补充了10μM ROCK抑制剂(Y-27632二盐酸盐，卡巴开公司(Calbiochem))的Nutristem培养基(Stemgent)中的密度为1.0x10⁵细胞/100μl水凝胶。将带有细胞的水凝胶等分到96孔板中，并在顶部添加补充了10μM ROCK抑制剂的100μl Nutristem培养基。将细胞培养7-14天，每天更新培养基。

细胞计数测定

将细胞在

和改性的

水凝胶中培养8天，然后在+37℃下用600μg纤维素酶/mg纤维素将水凝胶降解过夜。从96孔板收集细胞到试管中，并用PBS洗涤一次。通过在+37℃下用0.5mM EDTA(英杰公司(Invitrogen))处理2分钟而将球状体解离，用移液器研磨5-10次。用培养基洗涤细胞一次并计数。分析了每种水凝胶条件下的三个细胞样品。

用PrestoBlue细胞活力试剂进行的细胞增殖测定

在时间点0(将细胞接种到水凝胶中后立即)和时间点7(培养7天后)，用基于刃天青的

试剂对一式三份样品测量细胞活力。将

试剂(生命技术公司(Life Technologies))以1:100的稀释度直接添加到细胞培养板中并混合。将细胞在+37℃下孵育3.5小时，并在570nm和600nm处测量吸光度。根据制造商的说明计算结果。简而言之，从A570中减去A600，并且将仅培养基+水凝胶的对照孔取平均值。从所有样品孔中减去对照平均值，然后计算一式三份样品的平均值。

用[2-¹⁴C]胸苷进行的细胞增殖测定

通过测量[2-¹⁴C]胸苷掺入细胞DNA和RNA中来分析细胞增殖。将iPS细胞在3D水凝胶中培养5天，然后在1.0μCi/mL[2-¹⁴C]胸苷(帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))的存在下培养细胞6、24和48小时。然后将细胞用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，以除去游离的[2-¹⁴C]胸苷。为了使细胞增溶，将可溶物添加到样品中并在+60℃下孵育过夜。在计数之前，将闪烁液添加到样品中，并使用液体闪烁计数器(Wallac)测量掺入的[2-¹⁴C]胸苷的量。

免疫荧光染色

将iPS细胞在含有Nutristem培养基的

和改性

水凝胶中培养10天。除去水凝胶顶部的培养基(100μl)，并通过添加100μl 8％的多聚甲醛来固定细胞，并在室温(RT)下孵育90分钟。然后将细胞洗涤两次；将PBS添加到水凝胶的顶部，孵育5分钟，并以200xg离心1分钟。用在PBS中的0.1％Triton X-100在+4℃进行细胞透化过夜(鬼笔环肽样品)或在室温下进行细胞透化2小时(TRA-1-60和SSEA-4样品)。

将细胞用浓度为20μg/ml的抗TRA-1-60(R&D系统公司(R&D Systems))和浓度为15μg/ml的抗SSEA-4(阿柏堪穆公司(Abcam))在+4℃下染色过夜，并像之前一样用PBS洗涤两次。添加二抗(DyLight488抗小鼠IgM或AlexaFluor488抗小鼠IgG)至终浓度2μg/ml，并在室温下孵育60分钟。与二抗同时添加DAPI核染色剂(英杰公司(Invitrogen))至终浓度为2.5μg/ml。

在室温下，将细胞用Alexa Fluor 488鬼笔环肽(生命技术公司)以1:400稀释度染色60分钟。与鬼笔环肽同时添加DAPI核染色剂(英杰公司)至终浓度为2.5μg/ml。如前所述，将细胞用PBS洗涤两次，最后转移至黑色96孔板进行共焦成像，再移至显微镜载玻片进行荧光显微镜成像。

在共焦显微镜下，用配备旋转盘共焦，20x/0.4LD Plan-Neofluar Ph2 Corr WD＝7.9M27物镜，紫光(固态405nm/100mW)和蓝光(固态488nm/50mW)激光器的3I Marianas(3I智能成像创新(3I Intelligent Imaging Innovations))荧光显微镜和Zeiss AxioObserver Z1倒置显微镜对球状体进行照相。

或者，使用配备有ProgRes C5 CCD相机(JENOPTIK)和10倍或20倍物镜(N-ACHROPLAN 10x/0.25Ph1，Plan-Neofluar 20x/0.50Ph2)的Zeiss Axio Scope A1观察球状体并拍照。

生长特征

在

和改性的

水凝胶中培养9天后，iPS细胞已经形成了小球状体(图5)。图5显示了培养9天后不同3D水凝胶中的iPS细胞。A)

B)

C)

和D)LNnT-

样品之间的球状体尺寸没有显著差异。用三种不同的方法测量了3D水凝胶培养中的细胞增殖。首先，通过在培养8天，水凝胶降解和球状体解离后对细胞计数来进行粗细胞数测定。比较细胞数时，未观察到

和改性的

水凝胶之间的差异(图6)。图6显示了不同3D水凝胶中iPS细胞的细胞计数。8天后3D水凝胶培养中的细胞总数，取一式三份样品的平均值。

计数是总细胞数，也包括死亡细胞(未确定细胞活力)。

细胞活力和增殖也通过

细胞活力测定来确定。将细胞接种到水凝胶中后直接测定活力，培养7天后再测定一次。当比较第0天和第7天的结果时，在培养过程中活力降低(图7)。图7证明了在不同的3D水凝胶中的iPS细胞在时间点0(第0天)和7(第7天)的细胞活力。观察到

和改性的

水凝胶之间的活力没有差异。[2-¹⁴C]胸苷掺入细胞核酸用于比较iPS细胞在

和改性的

水凝胶中的增殖速率。培养5天后，将细胞与[2-¹⁴C]胸苷孵育6、24和48小时，然后用闪烁计数器测量细胞核酸中的放射性。与

相比，在改性的

水凝胶样品中生长的iPS细胞在任何时间点都没有掺入更高数量的[2-¹⁴C]胸苷(图8)，这与其他增殖测定的结果相容。图8显示了细胞增殖测定的结果。用[¹⁴C]胸苷掺入来测定iPS细胞增殖。改性的

水凝胶中的细胞增殖不高于原始的

在每个时间点n＝2。

干细胞特征-抗TRA-1-60染色

一些小的球状体显示出整体Tra-1-60染色，但大多数染色局限于球状体中的细胞子集(图9)。图9显示了在改性的

中生长的球状体的抗-Tra-1-60染色。A)在

中生长的上部球状体中看到分散的Tra-1-60阳性细胞(绿色)，而在下部球状体中则看不到或看到非常低水平的Tra-1-60阳性细胞(球状体直径约为100μm)。B)球状体的共焦图像显示出许多Tra-1-60阳性细胞(

球状体长度约70μm)。蓝色DAPI染色显示核。原始放大20倍。

通过对随机球状体(放大10倍)及其Tra-1-60染色进行计数，约59％，52％，64％和64％的未改性的

ECA-，LNT-和LNnT-改性的凝胶分别显示出Tra-1-60染色(随机选择20-30个球状体)。通常，最大的球状体未显示Tra-1-60阳性细胞，可能表明已开始分化。

干细胞特征-抗SSEA-4染色

通常，SSEA-4染色主要局限于小球状体，通常染色会出现在所有或几乎所有球状体细胞中(图10)。图10显示了在

中生长的球状体中的抗SSEA-4染色。A)下部球状体显示许多SSEA-4阳性细胞，而在上部球状体中则没有或只有极低水平的SSEA-4阳性细胞。B)细胞核被染成蓝色(DAPI)。原始放大20倍，球状体直径约为80和50μm。

在一些球状体中，细胞子集显示出SSEA-4染色。通过对随机球状体(放大10倍)及其SSEA-4染色进行计数，约30％，45％，70％和50％的未处理的

ECA-，LNT-和LNnT-改性的凝胶分别显示出SSEA-4染色(随机选择20-30个球状体)。通常，抗SSEA-4染色的强度比抗Tra-1-60染色的强度弱。

一般特征

鬼笔环肽-Alexa488染色用于描述总体细胞形态(鬼笔环肽与肌动蛋白结合)。在未改性或改性的

中培养的球状体之间未检测到总体变化。大多数球状体的大小都在中小型，但所有凝胶中也包括“大”尺寸的球状体，并且它们的数量大致相同(当在96孔中计数时，在未改性的ECA-，LNT-和

中分别为20、9、16和10个大球体)。

图11-14显示了球状体的Alexa488-鬼笔环肽染色。图11显示了共焦图像中

中生长的“大”球状体中的Alexa488-鬼笔环肽染色。A)球状体的合成图像，绿色显示A488鬼笔环肽，蓝色显示核。B)绿色通道显示A488-鬼笔环肽染色。C)蓝色通道显示DAPI染色。球体的长度约为220μm(原始放大20倍)。图12显示了共焦图像中聚糖

中生长的球状体中的Alexa488-鬼笔环肽染色。A)球状体的合成图像，绿色显示A488鬼笔环肽，蓝色显示核。B)绿色通道显示A488-鬼笔环肽染色。C)蓝色通道显示DAPI染色。在球状体外可以看到单个DAPI阳性片段，但这些片段未显示A488-鬼笔环肽染色。球状体直径约为70μm(原始放大20倍)。图13显示在未改性的

中生长的球状体中的Alexa488-鬼笔环肽染色。A)球状体的合成图像，绿色显示A488鬼笔环肽，蓝色显示核。B)绿色通道显示A488-鬼笔环肽染色。C)蓝色通道显示DAPI染色。在球状体外可以看到单个DAPI阳性片段或片段簇，但这些片段或片段簇未显示A488-鬼笔环肽染色。原始放大20倍。图14显示在未改性的

中生长的球状体中的Alexa488-鬼笔环肽染色。A)球状体的合成图像，绿色显示A488鬼笔环肽，蓝色显示核。B)绿色通道显示A488-鬼笔环肽染色。C)蓝色通道显示DAPI染色。在球状体中可以看到DAPI阳性片段簇。原始放大20倍。

在所有凝胶中都出现了许多单个细胞，这些细胞表现出Tra-1-60，SSEA-4或鬼笔环肽染色。但是，大多数DAPI染色的结构最有可能是死亡或经历凋亡的细胞的碎裂核(如DAPI阳性染色而不是A488鬼笔环肽染色所证明的)。

一些球状体还含有碎裂核(无周围鬼笔环肽染色)，这是由于正常的细胞过程或针对球状体非最佳的生长条件(凋亡)导致的。在所有凝胶的球状体中都可以看到碎裂核，并且没有做出任何努力来量化球状体或外部球状体中碎裂核的比例。单个细胞也在细胞测定中计数。

实施例4–纳米原纤纤维素水凝胶的流变学测量

准备了三个样品进行粘度分析：

1. 0.5％

在水中，2ml

2. 0.5％叠氮改性的

在水中，2ml

3. 0.5％ECA改性的

在水中，2ml

通过间苯二酚比色测定法分析每个样品中的

浓度，该比色测定法与葡萄糖单体浓度相关。与0.5％(w/v)

制备品相比，将所有样品稀释至0.5％(w/v)浓度。

为了验证改性的成功性，采用配备有20mm板几何结构的应力控制旋转流变仪(ARG2,英国TA设备公司(TA instruments,UK))对纳米原纤纤维素水凝胶形式的样品进行流变测量。未改性和改性的纳米原纤纤维素水凝胶的应力扫描测量以0.5重量％进行，以验证凝胶强度不会由于改性而改变。在0.01–100Pa的剪切应力范围内，在0.1Hz频率和22℃下测量应力扫描。

图15示出了通过应力扫描测量，未改性样品(实线)和改性样品(虚线)的0.5％纳米纤维素分散体的粘弹性质。给出了G′(储能模量，Δ)和G″(损耗模量，□)的应力依赖性。

样品1.和2.(

和叠氮改性的

)具有相同的粘度水平，表明叠氮改性对粘度没有影响。样品3.(ECA改性的

)具有较低的粘度，但呈凝胶形式。

实施例5–用于制备配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶的试剂盒

配体偶联试剂盒的内容物：

-DBCO：0.5mg DBCO-磺基-NHS酯，干燥至管底部

-PBS：1ml无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)

-Amicon：10kDa MWCO离心过滤器

-纳米原纤纤维素-叠氮化物：2.5ml叠氮改性的纳米原纤纤维素基质，在水中1.5％无菌凝胶

试剂盒的使用说明：

1.将计算量的蛋白质/配体溶解在缓冲液中。

2.将计算量的DBCO溶液添加到配体溶液中并混合。

3.在室温下孵育。

4.通过重复离心和添加缓冲液，将DBCO-配体溶液转移到离心过滤管中，以去除过量的未反应DBCO。

5.将DBCO-配体试剂添加到纳米原纤纤维素-叠氮化物基质中，并充分混合以使配体均匀地分布在基质中。

6.在室温下孵育。

7.将配体改性的纳米原纤纤维素-叠氮化物基质更改为合适的培养基。

对本领域技术人员显而易见的是，随着科技的发展，基本理念可以以各种方式实施。因此，实施方式不限于上文所述实施例；相反，它们可以在权利要求的范围内变化。

上文所述的实施方式相互间可以任意组合使用。几个实施方式可组合在一起形成又一实施方式。本文公开的方法、产品、系统或用途可包含至少一个上文所述的实施方式。应当理解，上述益处和优点可以涉及一个实施方式，或者可以涉及多个实施方式。实施方式不限于解决任何或所有所述问题的那些实施方式或具有任何或所有所述益处和优点的那些实施方式。将进一步理解，“一个”项目的表述是指一个或多个所述项目。术语“包括”在本说明书中用于表示包括其后的特征或动作，而不排除一个或多个其他特征或动作的存在。

序列表

<110> 芬欧汇川集团

格里克斯芬兰有限公司(Glykos Finland Oy)

<120> 纳米原纤纤维素水凝胶

<130> P-EP108376M

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RGD粘附肽

<400> 1

Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys

1 5

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自玻连蛋白的寡肽

<400> 2

Lys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro

1 5 10 15

Claims

1.一种纳米原纤纤维素水凝胶，其包含叠氮改性的纳米原纤纤维素，所述叠氮改性的纳米原纤纤维素具有由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-N₃表示的取代基，其中n在1至10的范围内；m为0或1；L₁是连接基；其中取代基连接到叠氮改性的纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳上，从而形成与所述碳相连的醚键。

2.如权利要求1所述的纳米原纤纤维素水凝胶，其中，L₁表示-CH₂-CH₂(R₁)-NH-L₂-，其中R₁不存在或者是-COOH，L₂是连接基。

3.如权利要求2所述的纳米原纤纤维素水凝胶，其中，L₂表示C(O)-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-，其中o为0或更大。

4.如权利要求1-3中任一项所述的纳米原纤纤维素水凝胶，其中，一个或多个葡糖基单元中的至少一个或多个是β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元，并且取代基所连接的多个β1,4-D-吡喃葡萄糖基单元中的一个的碳是碳6。

5.如权利要求1-4中任一项所述的纳米原纤纤维素水凝胶，其中，所述叠氮改性的纳米原纤纤维素的取代度为至少约0.0001，或至少约0.01。

6.一种试剂盒或固体支持物，其包含如权利要求1-5中任一项所述的纳米原纤纤维素水凝胶和任选的反应缓冲液和/或使用说明。

7.如权利要求6所述的试剂盒或固体支持物，其中，所述试剂盒或固体支持物还包含具有环状或非环状炔基的配体，或能够与配体偶联的具有环状或非环状炔基的连接基化合物。

8.一种用于制备具有环状或非环状炔基的配体的试剂盒，所述试剂盒包含能够与配体偶联的具有环状或非环状炔基的连接基化合物和任选的反应缓冲液和/或使用说明。

9.一种制备如权利要求1-5中任一项所述的纳米原纤纤维素水凝胶的方法，其中所述方法包括：

用烯基化剂对纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的羟基进行烯基化，以获得烯基化的纳米原纤纤维素，和

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述烯基化剂具有由式X-(CH₂)_nCH＝CH₂表示的结构，其中n在1至8的范围内，并且X是Br、Cl或I。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中，所述方法包括使含硫醇基的化合物与烯基化的纳米原纤纤维素反应，其中所述含硫醇基的化合物还具有叠氮基，从而获得包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶；或

其中所述方法包括使含硫醇基的化合物与烯基化的纳米原纤纤维素反应，其中所述含硫醇基的化合物还具有氨基，从而获得氨基改性的纳米原纤纤维素，以及使具有能够与氨基反应的官能团的化合物与氨基改性的纳米原纤纤维素反应，其中具有官能团的化合物还具有叠氮基，从而获得包含叠氮改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述含硫醇基的化合物是半胱氨酸，半胱胺，或者它们的组合或混合物。

13.一种包含配体改性的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶，其中所述配体改性的纳米原纤纤维素具有一个或多个与其共价结合的配体，所述一个或多个配体包含蛋白质、肽、聚糖或纳米原纤纤维素分子中的至少一种；其中所述配体改性的纳米原纤纤维素具有由式-O-(CH₂)_n-S(O)_m-L₁-D表示的取代基，其中n在1至10的范围内；m为0或1；L₁不存在或是连接基；D表示与连接基共价结合的配体，以及任选的通过如权利要求1至5中任一项所述的纳米原纤纤维素水凝胶的叠氮改性的纳米原纤纤维素的叠氮基与配体的环状或非环状炔基之间的反应形成的三唑基；其中所述取代基连接到配体改性的纳米原纤纤维素的一个或多个葡糖基单元的碳上，从而形成与所述碳相连的醚键。

14.如权利要求13所述的纳米原纤纤维素水凝胶，其中，D表示与连接基共价结合的配体和通过如权利要求1至5中任一项所述的纳米原纤纤维素水凝胶的纳米原纤纤维素的叠氮基与配体的环状或非环状炔基之间的反应形成的三唑基，使得配体通过三唑基与连接基共价结合。

15.如权利要求13所述的纳米原纤纤维素水凝胶，其中，L₁表示-CH₂-CH₂(R₁)-NH-L₂-，其中R₁不存在或者是-COOH，L₂是连接基。

16.一种制备如权利要求13-15中任一项所述的纳米原纤纤维素水凝胶的方法，所述方法包括使如权利要求1-5中任一项所述的纳米原纤纤维素水凝胶与具有环状或非环状炔基的配体接触。

17.如权利要求16所述的方法，其中，所述方法包括将具有环状或非环状炔基的连接基化合物与所述配体偶联，从而获得具有所述环状或非环状炔基的配体。

18.如权利要求7或8所述的试剂盒或固体支持物，如权利要求13-15中任一项所述的纳米原纤纤维素水凝胶，或如权利要求16或17所述的方法，其中，所述环状炔基是DBCO，OCT，MOFO，DIFO，DIFO2，DIFO3，DIMAC，DIBO，BARAC，BCN，桑德海默尔二炔，TMDIBO，S-DIBO，COMBO，PYRROC，或它们的改性物或类似物。

19.如权利要求1-5中任一项所述的叠氮改性的纳米原纤纤维素水凝胶或如权利要求13-15中任一项所述的配体改性的纳米原纤纤维素水凝胶在细胞或组织的维持、运输、分离、培养、繁殖、传代、分化或移植中的用途。