KR100722578B1 - 비오틴-결합 수용체 분자 - Google Patents

Abstract

단백질이 세포질 도메인, 막-스패닝 도메인 및 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 세포외 도메인이 비오틴-결합 활성을 갖는, 비오틴화된 분자에 결합할 수 있는 신규의 막횡단 단백질.

Description

비오틴-결합 수용체 분자 {BIOTIN-BINDING RECEPTOR MOLECULES}

본 발명은 비오틴-결합 활성을 갖는 막-스패닝 단백질(membrane-spanning proteins)에 관한 것이다.

비오틴(비타민 H)은 혈액 및 조직에서 저농도로 발견되는, 물에 쉽게 용해되는 물질이다. 비오틴의 생물학적 역할은 활성화된 CO₂의 담체로서, 부가적 자유 에너지 없이도 수용체에 CO₂를 전달하게 한다. 활성화된 카르복시비오틴은 보통 카르복시비오틴의 형성에 필요한 효소에 부착된다. 예를 들면, 비오틴은, 아세틸 CoA의 존재 하에, 카르복시비오틴의 형성 및 피루베이트에 활성화된 카르복실기의 연이은 전이를 촉매하여 옥살로아세테이트를 형성하는 피루베이트 카르복실라제에 부착될 수 있다.

비오틴은 또한, 아비딘(달걀 흰자위로부터의 63 kDa 당단백질) 및 스트렙타비딘(스트렙토미세스 아비디니(Streptomyces avidinii) 세균속으로부터의 비당화된 단백질)에 자연적으로 가장 높은 친화성(affinities)을 갖는 것들 중 하나와 결합한다. 결합은 특성(Ka 10¹⁵ mol^-1)에 있어서 거의 비가역적이다. 아비딘과 비오틴 사이의 친화성은 광범위의 생물분석 응용에 매우 유용한 것으로 증명되어 왔다. 예를 들면, 아비딘-비오틴 복합체는, 광범위의 검출계에 성공적으로 사용되어 왔으며, 여기서 표적 분자는 그것의 카르복시 말단을 통해서 비오틴과 결합하여 비오틴화된 분자를 형성하며, 이 비오틴화된 분자는 용액에서 쉽게 검출 또는 분리될 수 있다. 비오틴화는 각종 분자들의 생물학적 및 이화학적 특성들을 변화시키지 않고, 아비딘에 비오틴 보결분자족(prosthetic group)의 결합능에 영향을 주지 않으면서 일어날 수 있다.

본 발명들은 이제 아비딘 및 스트렙타비딘의 비오틴-결합 활성이 비오틴화된 분자들과 결합할 수 있는 막횡단 단백질(transmembrane proteins)의 생산에 이용할 수 있다는 것이 알려지게 하였다.
본 발명의 단백질은 세포질 도메인, 막-스패닝 도메인 및 세포외 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 세포외 도메인은 비오틴 결합 활성을 가질 수 있다. 세포외 도메인은 아비딘 또는 스트렙타비딘의 기능 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 핵산 분자를 사용해서, 조직 중의 특정 부위에 비오틴화된 분자를 표적화하는 것이 가능하다. 이 방법에서 표적화된 분자들은, 분자들이 세포내 또는 세포 표면에서 그들의 효과를 발휘하도록 하는, 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 조직 또는 세포에 흡수될 수 있다.

도 1은 본 발명의 융합 단백질의 도해도이고, 여기서 A는 아비딘을 나타내며, B는 엔도사이토시스 수용체의 막-스패닝 도메인을 나타내고 (및 C는 비오틴을 나타냄);

도 2는 셔틀 벡타를 사용한 클로닝 전략(단계)의 도해도이고,

도 3은 레트로바이러스 벡타를 사용한 클로닝 전략의 도해도이다.

발명의 설명
본 발명의 단백질은 종래의 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 전형적으로, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 관련 단백질 등의 비오틴-결합 단밸질의 기능 도메인을 위한 DNA 서열 코딩(coding)은 막-스패닝 특성을 갖는 단백질의 DNA 서열 코딩을 포함하는 유전적 구조물로 꾀하여 진다(engineered). 아비딘 및 스트렙타비딘-관련 단백질의 예로 AVR-1-AVR-5, AVR-X-AVR-V, Stv1 및 Stv2가 포함된다.

융합 단백질의 개별 도메인은 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭되거나, 제한 효소 소화, 단리 및 정제(예를 들면, 전기영동을 사용하여)시키고, 이어서 결찰(예를 들면, DNA 리가제를 사용하여)을 사용해서 모(parent) cDNA로부터 단리될 수 있다. 그리고 나서, 융합 단백질 구조물은 적당한 숙주 세포로 트랜스펙션, 배양, 및 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.

상기 구조물은 또한 네이키드(naked) DNA 또는 플라스미드/리포솜, 플라스미드/폴리에틸렌이민, 플라스미드/덴드리머 또는 플라스미드/펩티드 복합체로서 사용될 수 있다.

다른 방법으로, 구조물은 생체내의 특정 위치로 구조물을 표적화하기 위해 사용될 수 있는 복제-결핍 바이러스에 도입될 수 있다. 예를 들면, 구조물은 융합 단백질의 적당한 cDNA를 포함하는 레트로바이러스성 벡타일 수 있다. 그리고 나서, 예를 들면, 몰로니(Moloney) 뮤린 레트로바이로스와 같은, 복제-결핍 레트로바이러스가 표적 세포 및 조직의 안정한 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있다. 사용할 수 있는 기타의 바이러스는 복제-결핍 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 포진 바이러스, 유두종 바이러스 및 시니비스(sinibis) 바이러스가 포함된다. 그외의 바이러스들은 당업자들에게 명확하게 될 것이다.

아비딘, 스트렙타비딘 또는 관련 단백질의 기능 도메인 이외에, 융합 단백질은 전형적으로 엔도사이도시스 수용체의 막-스패닝 도메인을 포함할 것이다. 이들 수용체들의 사용은 표적 세포내로 비오틴화된 분자를 섭취할 수 있게 한다. 본 발명에 사용될 수 있는 적합한 수용체는 스캐벤저(scavenger) 수용체 클라스 A, 저밀도의 지질단백질 수용체, 매우 낮은 밀도의 지질단백질 수용체, 트랜스페린 수용체 및 LOX-1 수용체를 포함한다. 융합 단백질은 또한 수용체 단백질과 아비딘 펩티드 서열 사이의 링커(linker)를 포함할 수 있다. 링커는 융합 단백질의 다른 성분들의 기능 활성이 보유되다면 어떠한 길이도 가능하다.

일반적으로, 아비딘 또는 스트렙타비딘 펩티드 서열 및 수용체 펩티드 서열 사이의 융합은 수용체 단백질의 세포외 도메인과 아비딘 또는 스트렙타비딘의 비오틴-결합 부위의 모든(any) 부위 바깥쪽 사이에 있다.

다음의 실시예로 본 발명을 설명한다.

실시예

DNA 구조물을 소 스캐벤저 수용체 클라스 A(ScR) (Kodama et al. (1990) Nature 343: 531~535)와 아비딘(Green (1975) Adv. Prot. Chem. 29: 85~133) 사이에서 생성했고, 이것은 ScR 세포질 도메인, 막-스패닝 도메인 및 α-나선으로 감겨진 도메인을 가지며, 비오틴 결합 도메인에 결찰된 단백질을 코드한다. 융합 단백질의 완전한 아미노산 서열은 SEQ ID No.2에 나타냈으며, 여기서 아미노산 1~53은 세포질 도메인을 나타내고, 아미노산 55~79는 막횡단 도메인을 나타내고, 아미노산 81~111은 스페이서 도메인을 나타내고, 아미노산 113~272은 α-나선형으로 감겨진 도메인을 나타낸다. 아미노산 273~400은 분비 신호가 결여된 아비딘 cDNA(Gope et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 3595~3606)로부터 유도된 성숙 아비딘 펩티드 서열을 나타낸다.

간략하게, ScR의 cDNA는 내부 라우스 육종 바이러스 프로모터(internal Rous Sarcoma Virus Promoter) 및 HindIII 제한 부위를 갖는 ScR cDNA를 함유하는 플라스미드(PLScRNL)로 미리 트랜스펙션된 배양 세포로부터 얻었다. 그 다음, 단리된 cDNA를 레트로바이러스 벡타 pLS1ARNL의 HindIII 부위에 삽입했다. 아비딘 cDNA를 폴리머라제 연쇄반응에 의해 생산하고, 그리고 나서 ScR cDNA 상의 Sty 1 제한 부위에서 레트로바이러스 벡타로 삽입했다. 본 발명을 구체화하는 cDNA는 SEQ ID No.1에 나타냈고, 여기서 뉴클레오티드 1~989는 Mo-MuSV로 부터의 긴 말단 반복을 나타내고; 뉴클레오티드 1071~2270은 융합 단백질의 코딩 영역을 나타내고; 뉴클레오티드 2376~3101은 소 스캐벤저 수용체 I cDNA로부터의 비번역 영역을 나타내고; 뉴클레오티드 3107~3376은 RSV 프로모터 영역을 나타내고; 뉴클레오티드 3727~4522는 신생(neo) R 유전자를 나타내고; 뉴클레오티드 4540~5177은 Mo-MuLV로부터의 긴 말단 반복을 나타낸다.

도 2 및 3은 이 실시예에서 사용한 방법을 언급한다. 더욱 구체적으로, 도 2 는 내부 RSV 프로모터를 갖는 ScR cDNA를 HindIII에 의해 플라스미드 pLScRNL로 부터 절단해서, 셔틀 벡타의 HindIII 위치로 클로닝하는 방법을 나타낸 것이다. 도 3은 ScR-아비딘-RSV cDNA를 레트로바이러스 벡타 pLRNL HindIII 위치로 클로닝하는 방법을 나타낸 것이다.

벡타로 트랜스펙션된 세포 중의 융합 단백질의 발현은 노던 블로팅 및 아비딘에 대한 항체로 면역세포화학적 염색에 의해 확인될 수 있다.

실험한 결과, 완전한 mRNA 전사물은 55 kDa 단량체로 번역되는 것으로 나타났으며, 상기 단량체는 비환원 조건 하에서 S-S 결합에 의해 부착된 110 kDa 이량체의 이차 구조를 형성할 수 있었다. 변성 조건을 사용해서, 대략 110 kDa 이량체 및 55 kDa 단량체 펩티드를 검출했다. 이 결과는 단량체 융합 단백질, 45 kDa의 컴퓨터 계산치에 필적한다. 비변성 조건(즉, 웨스턴 블로팅에 앞서 아세틸화를 사용하여)에서, 가장 강한 신호는 대략 220 kDa이었으며, 이것은 사량체 형성을 암시하는 대략 110 kDa 이량체 및 55 kDa 단량체로 변성되었다. 또한, 220 kDa 단백질의 존재는, 화학적 가교제, 예를 들면, NHS-에스테르를 사용해 증명했다. 결과들은 아비딘이 용해된 채로 남고, 엔도사이토시스 수용체의 막-스패닝 도메인에 부착되었을 때조차 사량체를 형성할 수 있는 것을 나타냈다.

융합 단백질은 동초점(confocal) 현미경 및 원자력(atomic force) 현미경에 의한 분석시, FITC-비오틴과 결합할 수 있는 기능 단백질로 나타났다. 형질도입되지 않은 세포 및 LacZ 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡타로 트랜스펙션된 세포를 대조군으로서 사용했다. LacZ-형질도입된 대조군 세포에 비오틴 프로브의 비-특이적 결합은 원자력 현미경에 의해 검출되지 않았다. 예상한 바와 같이, 트랜스펙션된 세포들은 비고정된 샘플 중에서 반복적으로 측정될 수 있는 특이적 결합을 보였다. 측정된 결합력은 평균 149±19 pN (평균치±평균편차)의 배수였고, 이것은 또한 예상했던대로, 이전에 보고된 비오틴-스트렙다비딘 결합력, 160 pN의 범위내에 있다(Florin et al. (1994), Science 264 : 415~417).

구조물의 기능성은 FACS 분석을 사용하여, 융합 단백질 구조물을 갖는 세포에 형광-표지된 비오틴 분자들의 결합을 보여줌에 의해 생체내에서도 확인될 수 있다.

생체내에서 융합 단백질의 기능 활성은 래트 악성 신경교종 모델 중에서 분석되었다. BT4C 야생-유형 신경교종 세포들을 동계교배한 BDIX 암컷 래트 뇌 중의 2.5 mm의 깊이에서 우측 뇌량 중의 두개골내로 이식했다. 종양의 성장을 고해상(high resolution) MRI(자기공명영상)로 자주 모니터링했다. 종양 세포 접종 3주 후, 각각 2 x 10⁶ cfu/ml 및 1.3 x 10⁶ cofu/ml의 적정량 중의 융합 단백질 또는 LacZ 유전자의 cDNA를 지니는 슈도타입(pseudotype) 레트로바이러스는 처음에는 2.5 mm의 깊이에서, 이어서 1.5 mm의 깊이에서 10분의 간격으로 종양으로 전달되었다. 유전자 전달(transfer)은 성장 2일 후에 반복되었다. 동물들을 희생시키고, 최종 접종후 3일째, 4% PFA로 관류-고정시켰다. 뇌를 제거하고, 접종 부위에서 2개의 관상 조각으로 나누고, 얼음 위에서 절편화하고, 항-아비딘 항체에 대한 면역반응성을 사용해 분석했다. 결과들은 융합 단백질이 생체내의 래트 악성 신경교종 중에서 발현되는 것을 나타냈다. 단백질은 신경교종 및 종양 혈관 중의 혈관 내피 세포를 닮은 고리와 같은 구조 중에서 검출되었다.

<110> EUROGENE LIMITED <120> BIOTIN-BINDING RECEPTOR MOLECULES <130> 20000822 <150> GB9803757.5 <151> 1998-02-23 <150> GB9813653.4 <151> 1998-06-24 <160> 2 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 5177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A DNA construct was created between the bovine scavenger recepto r class A (ScR) and avidin, which codes for a protein having a Sc R cytoplasmic domain, membrane-spanning domain and alpha-helical coiled domain, ligated to a biotin-binding domain. <220> <221> CDS <222> (1071)..(2270) <400> 1 tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60 ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120 tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180 gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240 ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300 tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360 taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc 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Ser 1 5 10 15 Cys Thr Glu Ser Val Lys Phe Asp Ala Arg Ser Val Thr Ala Leu Leu 20 25 30 Pro Pro His Pro Lys Asn Gly Pro Thr Leu Gln Glu Arg Met Lys Ser 35 40 45 Tyr Lys Thr Ala Leu Ile Thr Leu Tyr Leu Ile Val Phe Val Val Leu 50 55 60 Val Pro Ile Ile Gly Ile Val Ala Ala Gln Leu Leu Lys Trp Glu Thr 65 70 75 80 Lys Asn Cys Thr Val Gly Ser Val Asn Ala Asp Ile Ser Pro Ser Pro 85 90 95 Glu Gly Lys Gly Asn Gly Ser Glu Asp Glu Met Arg Phe Arg Glu Ala 100 105 110 Val Met Glu Arg Met Ser Asn Met Glu Ser Arg Ile Gln Tyr Leu Ser 115 120 125 Asp Asn Glu Ala Asn Leu Leu Asp Ala Lys Asn Phe Gln Asn Phe Ser 130 135 140 Ile Thr Thr Asp Gln Arg Phe Asn Asp Val Leu Phe Gln Leu Asn Ser 145 150 155 160 Leu Leu Ser Ser Ile Gln Glu His Glu Asn Ile Ile Gly Asp Ile Ser 165 170 175 Lys Ser Leu Val Gly Leu Asn Thr Thr Val Leu Asp Leu Gln Phe Ser 180 185 190 Ile Glu Thr Leu Asn Gly Arg Val Gln Glu Asn Ala Phe Lys Gln Gln 195 200 205 Glu Glu Met Arg Lys Leu Glu Glu Arg Ile Tyr Asn Ala Ser Ala Glu 210 215 220 Ile Lys Ser Leu Asp Glu Lys Gln Val Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Glu Met Lys Leu Leu Asn Asn Ile Thr Asn Asp Leu Arg Leu Lys 245 250 255 Asp Trp Glu His Ser Gln Thr Leu Lys Asn Ile Thr Leu Leu Gln Gly 260 265 270 Ala Arg Lys Cys Ser Leu Thr Gly Lys Trp Thr Asn Asp Leu Gly Ser 275 280 285 Asn Met Thr Ile Gly Ala Val Asn Ser Arg Gly Glu Phe Thr Gly Thr 290 295 300 Tyr Ile Thr Ala Val Thr Ala Thr Ser Asn Glu Ile Lys Glu Ser Pro 305 310 315 320 Leu His Gly Thr Gln Asn Thr Ile Asn Lys Arg Thr Gln Pro Thr Phe 325 330 335 Gly Phe Thr Val Asn Trp Lys Phe Ser Glu Ser Thr Thr Val Phe Thr 340 345 350 Gly Gln Cys Phe Ile Asp Arg Asn Gly Lys Glu Val Leu Lys Thr Met 355 360 365 Trp Leu Leu Arg Ser Ser Val Asn Asp Ile Gly Asp Asp Trp Lys Ala 370 375 380 Thr Arg Val Gly Ile Asn Ile Phe Thr Arg Leu Arg Thr Gln Lys Glu 385 390 395 400

Claims (25)

1. 엔도사이토시스 수용체(endocytotic receptor)의 막-스패닝 도메인 및 비오틴-결합 활성을 갖는 세포외 도메인을 포함하는 단백질로, 상기 세포외 도메인은 아비딘 또는 스트렙타비딘 기능 활성을 갖는 것인 단백질.
2. 제 1항에 있어서, 추가로 세포질 도메인을 포함하는 단백질.
3. 삭제
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 수용체는 스캐벤저 수용체 클라스 A인 것인 단백질.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단백질이 SEQ ID NO.2에 정의된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
6. 제 1항 또는 제 2항에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
7. 제 6항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡타.
8. 제 1항 또는 제2항에 따른 단백질의 제조방법으로, 세포주를 제 7항에 따른 재조합 발현 벡타로 트랜스펙션 시키고, 트랜스펙션된 세포에서 단백질을 발현시키는 것을 포함하는 제조방법.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 제 4항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 비오틴-결합 도메인을 갖는 아비딘을 포함하는 단백질.
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제

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