ES2226340T3 - Moleculas del receptor de union de biotina. - Google Patents

Moleculas del receptor de union de biotina.

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ES2226340T3 ES99906341T ES99906341T ES2226340T3 ES 2226340 T3 ES2226340 T3 ES 2226340T3 ES 99906341 T ES99906341 T ES 99906341T ES 99906341 T ES99906341 T ES 99906341T ES 2226340 T3 ES2226340 T3 ES 2226340T3
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Markku Kulomaa
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Varpu Marjomaki
Kari Airenne
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Abstract

Proteína que comprende un dominio transmembranoso de un receptor de endocitosis y un dominio extracelular con actividad de unión a la biotina, destinada para uso terapéutico.

Description

Moléculas del receptor de unión a la biotina.
Área de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de membrana con actividad de unión a la biotina.
Antecedentes de la invención
La biotina (vitamina H) es una sustancia fácilmente soluble en agua que se encuentra en concentraciones bajas en la sangre y en los tejidos. El papel biológico de la biotina es el de transportador de CO_{2} activado, lo que permite la transferencia de CO_{2} a los aceptores sin necesidad de energía libre adicional. La carboxibiotina activada suele estar unida a una enzima que es necesaria para la formación de carboxibiotina. Por ejemplo, la biotina puede estar unida a piruvato carboxilasa que, en presencia de acetil CoA, cataliza la formación de carboxibiotina y la subsiguiente transferencia del grupo carboxilo activado al piruvato, para formar oxalacetato.
La biotina también se une, con una de las más altas afinidades conocidas, a la avidina, una glucoproteína de 63 kDa de la clara del huevo de gallina, y a la estreptavidina, una proteína no glucosilada procedente de la bacteria Streptomyces avidinii. La unión es de carácter casi irreversible (Ka 10^{15} mol^{-1}). La afinidad entre la avidina y la biotina ha demostrado ser de gran utilidad en una amplia variedad de aplicaciones bioanalíticas. Por ejemplo, el complejo avidina-biotina ha sido utilizado con éxito en una gran variedad de sistemas de detección en los que las moléculas diana se combinan con la biotina mediante su grupo carboxilo terminal, formándose moléculas biotiniladas que pueden ser fácilmente detectadas o separadas de la solución. La biotinilización puede producirse sin cambios de las propiedades biológicas o fisicoquímicas de las distintas moléculas y sin que se afecte la capacidad de unión del grupo prostético de la biotina a la avidina.
El documento WO-A-87/05026 da a conocer el aislamiento de una secuencia de ADN que codifica la estreptavidina y una fusión del gen de la estreptavidina y de un gen que codifica el receptor humano de LDL. El gen fusionado expresa una proteína constituida por estreptavidina en la región N-terminal de la proteína de fusión y el receptor de LDL fusionado en la región C-terminal de la proteína de fusión. El gen fusionado puede ser insertado en un vector de expresión y utilizarse para transformar una célula huésped. La presencia de la proteína de fusión estreptavidina-receptor de LDL en la superficie de una célula puede determinarse por la adición de células sanguíneas acopladas a albúmina sérica bovina biotinilada.
Kulomaa et al, FASEB J. 9(6):A1395 (1995) publican la construcción de diversos vectores de proteína de fusión de avidina, incluyendo una proteína de fusión que consta de avidina fusionada al receptor de progesterona B de pollo, que ha sido expresado en Escherichia coli.
Marjomaki et al, "Molecular Biology of the Cell" (Dic 1996), Vol. 7, supp. 5, pág. 2631, pub. Am. Chem. Soc. Cell Bio., muestran el uso del virus del bosque Semliki como sistema de expresión con el fin de obtener la expresión transitoria de una proteína quimérica con el dominio transmembrana y parte del dominio citoplásmico del receptor independiente de cationes de la manosa-6-fosfato fusionado a una avidina recombinante en células BHK.
Sumario de la invención
Según el primer aspecto de la presente invención, una proteína comprende un dominio transmembrana de un receptor de endocitosis y un dominio extracelular con actividad de unión a la biotina, para uso terapéutico.
Según un segundo aspecto de la invención, un ácido nucleico para uso terapéutico codifica una proteína, como se ha definido anteriormente.
Según un aspecto adicional de la presente invención, una nueva proteína comprende un dominio transmembrana de un receptor barredor de clase A y un dominio extracelular con actividad de unión a la biotina.
La proteína de la presente invención puede comprender un dominio citoplásmico, un dominio transmembrana y un dominio extracelular y el dominio extracelular contiene la actividad funcional avidina o estreptavidina.
Usando las proteínas o ácidos nucleicos de esta invención es posible dirigir moléculas biotiniladas a sitios específicos de los tejidos. Las moléculas marcadas de esta forma pueden ser captadas por los tejidos o por las células mediante endocitosis, lo que permite que ejerzan sus efectos dentro o en la superficie de las células.
Descripción de las figuras
La figura 1 es una ilustración esquemática de una proteína de fusión de la presente invención en la que A representa a la avidina y B representa el dominio transmembrana de un receptor de endocitosis (y C representa a la biotina).
La figura 2 es una ilustración esquemática de una estrategia de clonación usando un vector lanzadera.
La figura 3 es una ilustración esquemática de una estrategia de clonación usando un retrovirus vector.
Descripción de la invención
Las proteínas de la presente invención pueden ser producidas usando la tecnología convencional del ADN recombinante. Típicamente, se construye una secuencia de ADN codificadora del dominio funcional de una proteína que se une a la biotina, como la avidina, estreptavidina o proteína relacionada, en una construcción genética que contiene una secuencia de ADN codificadora de una proteína con propiedades transmembrana. Ejemplos de proteínas relacionadas con avidina y estreptavidina son la AVR-1-AVR-5, AVR-X-AVR-V, Stv1 y Stv2.
Los dominios individuales de la proteína de fusión pueden ser amplificados por la reacción en cadena de la polimerasa o aislados del ADNc parental mediante digestión, usando enzimas de restricción, aislamiento y purificación, por ejemplo, usando electroforesis en gel y ligamiento ulterior, por ejemplo, con ADN ligasa. La construcción proteica puede entonces ser transfectada a la célula huésped, cultivada y aislada usando las técnicas estándar de purificación de proteínas.
La construcción también puede usarse como ADN "desnudo" o como un complejo plásmido/liposoma, plásmido/polietilenimina, plásmido/ dendrímero o plásmido/péptido.
Alternativamente, la construcción puede ser introducida en un virus de replicación deficiente que puede ser utilizado para dirigir la construcción a sitios específicos in vivo. Por ejemplo, la construcción puede ser un retrovirus vector con el ADNc apropiado para la proteína de fusión. Un virus de replicación deficiente, por ejemplo, el retrovirus murino de Moloney, puede usarse entonces para la transfección estable de dianas celulares y titulares. Otros virus que pueden ser utilizados son los adenovirus, virus asociados a adenovirus, virus herpes, virus del papiloma y virus Sindbis de replicación deficiente. Hay otros virus adicionales, evidentes para los expertos en la materia.
Además de los dominios funcionales de la avidina, estreptavidina o proteínas relacionadas, la proteína de fusión comprenderá típicamente el dominio transmembrana de receptores de endocitosis. El uso de estos receptores posibilita la captación de moléculas biotiniladas por las células diana. Los receptores apropiados que pueden usarse en esta invención comprenden los receptores barredores de clase A, los receptores de lipoproteínas de baja densidad, de lipoproteínas de muy baja densidad, de transferrina y el receptor LOX-1. La proteína de fusión también puede comprender un ligamiento entre las secuencias peptídicas de la proteína receptor y la avidina. El ligamiento puede ser de cualquier longitud siempre que conserve la actividad de los diferentes componentes de la proteína de fusión.
En general, la fusión entre las secuencias peptídicas de la avidina o estreptavidina y las secuencias peptídicas del receptor se produce entre el dominio extracelular de la proteína receptor y cualquier sitio fuera de del sitio de unión para la biotina de la avidina o estreptavidina.
El ejemplo siguiente ilustra la invención.
Ejemplo
Se creó una construcción de ADN entre el receptor barredor bovino de clase A (ScR) (Kodama et al. (1990), Nature 343:531-535) y avidina (Green (1975). Adv. Prot. Chem. 29:85-133) que codifica una proteína con un dominio ScR citoplásmico, un dominio transmembrana y un dominio en hélice \alpha ligado a un dominio de unión a la biotina. En SEC ID nº 2 se muestra la secuencia completa de aminoácidos de la proteína de fusión en la que los aminoácidos 1-53 representan el dominio citoplásmico, los aminoácidos 55-79 representan el dominio transmembrana, los aminoácidos 81-111 representan un dominio espaciador y los aminoácidos 113-272 representan el dominio plegado en hélice \alpha. Los aminoácidos 273-400 representan la secuencia peptídica madura de la avidina derivada del ADNc de avidina (Gope et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:3595-3606) carente de señal de secreción.
Brevemente, el ADNc del ScR se obtuvo de células en cultivo previamente transfectadas con un plásmido (PLScRNL) que contenía el ADNc del ScR con un promotor interno virus del sarcoma de Rous y sitios de restricción HindIII. El ADNc aislado se insertó posteriormente en un sitio HindIII del vector retroviral pLS1ARNL. El ADNc de la avidina fue producido por la reacción en cadena de la polimerasa y posteriormente se insertó en el vector retroviral en el sitio de restricción Sty 1 del ADNc de ScR. El ADNc de la invención se muestra como SEC ID nº 1 en el que los nucleótidos 1-989 representan una repetición terminal larga de Mo-MuSV, los nucleótidos 1071-2270 representan la región codificadora de la proteína de fusión, los nucleótidos 2376-3101 representan una región no traducida del ADNc del receptor barredor bovino I, los nucleótidos 3107-3376 representan una región promotora RSV, los nucleótidos 3727-4522 representan un gen neo R y los nucleótidos 4540-5177 representan una repetición terminal larga de Mo-MuLV.
Las figuras 2 y 3 se refieren al procedimiento usado en este ejemplo. Más específicamente, la Fig. 2 muestra cómo el ADNc de ScR con un promotor interno virus RSV fue cortado del plásmido pLScRNL por la HindIII y clonado en un sitio HindIII en un vector versátil. La Fig. 3 muestra cómo se clonó el ADNc de ScR-avidina-RSV en un sitio HindIII en un retrovirus vector.
La expresión de la proteína de fusión en las células transfectadas con el vector puede confirmarse mediante transferencia Northern y tinción inmunocitoquímica con un anticuerpo anti avidina.
Los experimentos han revelado que el transcrito ARNm completo fue traducido en monómeros de 55 kDa, capaces de formar estructuras secundarias de dímeros de 110 kDa unidos por enlaces S-S en condiciones no reductoras. Usando condiciones de desnaturalización se detectaron péptidos diméricos de 110 kDa y péptidos monoméricos de 55 kDa, aproximadamente. El resultado es comparable al del cálculo computarizado de la proteína de fusión monomérica, 45 kDa. En condiciones de no desnaturalización (es decir, usando acetilación antes de la transferencia Western) la señal más intensa fue aproximadamente de 220 kDa, que fue desnaturalizada a un dímero de 110 kDa y un monómero de 55 kDa, aproximadamente, lo que sugiere la formación de tetrámeros. La presencia de la proteína de 220 kDa se comprobó también usando agentes de enlaces cruzados, por ejemplo, ésteres NHS. Los resultados muestran que la avidina permanece soluble y puede formar tetrámeros incluso cuando está unida a los dominios transmembrana de los receptores de endocitosis.
Analizando con microscopía confocal y microscopía de fuerza atómica, se demostró que la proteína de fusión es una proteína funcional capaz de unirse a biotina-FITC. Como controles se usaron células no transducidas y células transfectadas con un retrovirus vector que contenía el gen LacZ. No se detectó mediante microscopía de fuerza atómica ninguna unión inespecífica de las sondas de biotina a las células control transducidas con LacZ. Como era de esperar, las células transfectadas mostraron unión específica repetidamente mensurable en las muestras sin fijar. Las fuerzas de unión medidas eran múltiplos del promedio 149\pm19 pN (media \pm sd), lo que estaba también, como era de esperar, dentro del rango de la fuerza de unión de 160 pN previamente referida de la biotina-estreptavidina (Florin et al. (1994), Science 264: 415-417).
El funcionamiento de la construcción también puede ser confirmado in vivo mediante la demostración de la unión de moléculas de biotina marcadas con fluorescencia a células que contienen la construcción de la proteína de fusión, usando análisis de FACS.
La actividad funcional in vivo de la proteína de fusión se analizó en un modelo de glioma maligno de rata. Las células del glioma BT4C de tipo salvaje se implantaron intracranealmente en el cuerpo calloso derecho, a una profundidad de 2,5 mm en el cerebro de ratas hembras BDIX, endogámicas. El crecimiento de los tumores se monitorizó frecuentemente mediante IRM (imagen por resonancia magnética). Tres semanas después de las inoculaciones de las células tumorales se transfirieron al tumor pseudotipos de retrovirus portadores del ADNc de la proteína de fusión o del gen LacZ con títulos de 2 x 10^{6} ufc/ml y 1,3 x 10^{6} ufc/ml, respectivamente, primero a una profundidad de 2,5 mm y posteriormente a una profundidad de 1,5 mm, con un intervalo de 10 minutos. La transferencia genética se repitió tras dos días de crecimiento. Los animales fueron sacrificados y fijados por perfusión con PFA al 4% 3 días después de la última inyección. Se extrajeron los cerebros y se cortaron en dos piezas coronales al nivel del sitio de la inyección, se realizaron cortes por congelación y se analizó la inmunorreactividad frente a anticuerpos antibiotina. Los resultados mostraron que la proteína de fusión se expresaba in vivo en el glioma maligno de la rata. La proteína se detectó en las células del glioma y en estructuras redondeadas tipo células endoteliales vasculares en los vasos sanguíneos tumorales.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Eurogene Limited
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Marquis House, 67/68 Jermyn street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL: SW1Y 6NY
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MOLÉCULAS DEL RECEPTOR DE UNIÓN A BIOTINA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA ACCESIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquette
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
"SOFTWARE": Patente en publicación #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5177 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
PRESENTACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1071..2270
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1
1
2
3
4
5
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 400 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteínas
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
8
9

Claims (10)

1. Proteína que comprende un dominio transmembranoso de un receptor de endocitosis y un dominio extracelular con actividad de unión a la biotina, destinada para uso terapéutico.
2. Proteína según la reivindicación 1, que comprende además un dominio citoplásmico.
3. Proteína según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el dominio extracelular comprende un dominio de unión de avidina o estreptavidina a biotina.
4. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el receptor es un receptor barredor de la clase A.
5. Proteína según la reivindicación 1, que comprende la SEC ID nº 2.
6. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, destinada para uso terapéutico.
7. Proteína que comprende un dominio transmembrana del receptor barredor de la clase A y un dominio extracelular con actividad de unión a la biotina.
8. Proteína que comprende la SEC ID nº 2.
9. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína según las reivindicaciones 7 u 8.
10. Vector de expresión recombinante que contiene una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9.
ES99906341T 1998-02-23 1999-02-23 Moleculas del receptor de union de biotina. Expired - Lifetime ES2226340T3 (es)

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