NO328139B1 - Biotin-bindende proteiner og nukleinsyremolekyler - Google Patents
Biotin-bindende proteiner og nukleinsyremolekyler Download PDFInfo
- Publication number
- NO328139B1 NO328139B1 NO20004195A NO20004195A NO328139B1 NO 328139 B1 NO328139 B1 NO 328139B1 NO 20004195 A NO20004195 A NO 20004195A NO 20004195 A NO20004195 A NO 20004195A NO 328139 B1 NO328139 B1 NO 328139B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- biotin
- domain
- avidin
- protein
- binding
- Prior art date
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 7
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 title description 2
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 title description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 13
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 12
- 102000035013 scavenger receptor class A Human genes 0.000 claims description 9
- 108091005451 scavenger receptor class A Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001159 endocytotic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 4
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 4
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- XWJBVGZSIAZDKJ-FXQIFTODSA-N 2-[3-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]propyl]propanedioic acid Chemical class N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCC(C(=O)O)C(O)=O)SC[C@@H]21 XWJBVGZSIAZDKJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000186983 Streptomyces avidinii Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011603 BDIX rat Methods 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000805729 Homo sapiens V-type proton ATPase 116 kDa subunit a 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000854879 Homo sapiens V-type proton ATPase 116 kDa subunit a 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000854873 Homo sapiens V-type proton ATPase 116 kDa subunit a 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102100025386 Oxidized low-density lipoprotein receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710199789 Oxidized low-density lipoprotein receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical group CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101150090155 R gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 102100020737 V-type proton ATPase 116 kDa subunit a 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100039066 Very low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710177612 Very low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000877 corpus callosum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 1
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Oppfinnelsesområde
Denne oppfinnelse vedrører membran-omspennende proteiner og nukleinsyremolekyler som har biotin-bindende aktivitet.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Biotin (vitamin H) er en lett vannløselig substans som finnes i lave konsentrasjoner i blod og vev. Biotins biologiske rolle er som bærer av aktivert C02 og det muliggjør overføring av C02 til akseptorer uten behov for ytterligere fri energi. Det aktiverte karboksybiotin er vanligvis forbundet med et enzym som fordres for dannelsen av karboksybiotin. For eksempel kan biotin være forbundet med pyruvatkarboksylase som i nærvær av acetyl CoA, katalyserer dannelsen av karboksybiotin og den etterfølgende overføring av den aktiverte karboksylgruppe til pyruvat, for å danne oksaloacetat.
Biotin binder seg også med én av de høyest kjente naturlige affiniteter, til avidin, et 63 kDa glykoprotein fra hønseggehvite, og til streptavidin, et ikke-glykosylert protein fra bakterien Streptomyces avidinii. Bindingen er nesten irreversibel av karakter (Ka 10<15> mol"<1>). Affiniteten mellom avidin og biotin har vist seg meget nyttig innen et stort utvalg bioanalytiske anvendelser. For eksempel har avidin-biotinkomplekset med hell vært benyttet i et stort utvalg deteksjonssystemer, hvor målmolekyler kombineres med biotin gjennom deres karboksyende for å danne biotinylerte molekyler som lett kan påvises eller separeres fra løsning. Biotinylering kan skje uten å endre de biologiske eller fysiokjemiske egenskapene til de ulike molekylene og uten å påvirke bindingskapasiteten av biotinets prostetiske gruppe til avidin.
WO 8705026 beskriver isolering av DNA sekvensen til streptavidin fra Streptomyces avidinii og fusjonering av denne sekvensen til genet som koder for den humane low density lipoprotein (LDL) reseptoren.
WO 9719957 beskriver en metode for målrettet avlevering av toksiner eller nukleinsyrer i celler ved bruk av et fusjonsprotein som består av streptavidin og protein A.
Sammenfatning av oppfinnelsen
Det er nå fastslått at den biotin-bindende aktivitet av avidin og streptavidin kan utnyttes ved produksjon av transmembranproteiner som kan binde biotinylerte molekyler.
Proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte et cytoplasmatisk domene, et membran-omspennende domene og et ekstracellulært domene, hvor det ekstracellulære domenet omfatter biotin-bindende aktivitet. Det ekstracellulære domenet kan omfatte avidinets eller streptavidinets funksjonelle aktivitet.
Ved å benytte proteiner eller nukleinsyremolekyler ifølge denne oppfinnelse, er det mulig å målrette biotinylerte molekyler mot spesifikke seter i vev. Molekyler som er målrettet på denne måte kan opptas av vevene eller cellene ved endocytose, som lar molekylene utøve deres effekt inne i eller på cellen.
Beskrivelse av tegningene
Figur 1 er en skjematisk illustrasjon av et fusjonsprotein ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor A representerer avidin og B representerer det membran-omspennende domenet av en endocytotisk reseptor (og C representerer biotin); Figur 2 er en skjematisk illustrasjon av en kloningsstrategi hvor det benyttes en skyttelvektor; og Figur 3 er en skjematisk illustrasjon av en kloningsstrategi hvor det benyttes en retrovirusvektor.
Beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig protein for å målrette bitinylerte molekyler mot spesifikke seter i vev, kjennetegnet ved at det omfatter et membran-omspennende domene av en endocytotisk reseptor og et ekstracellulært domene, som omfatter biotin-bindende aktivitet.
Det er også beskrevet nukleinsyre-molekyl for å målrette biotinylerte molekyler mot spesifikke seter i vev, kjennetegnet ved at det koder for et protein i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 5.
Proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved bruk av konvensjonell rekombinant DNA-teknologi. Typisk manipuleres en DNA-sekvens som koder for det funksjonelle domenet av et biotin-bindende protein, så som avidin, streptavidin eller et beslektet protein, inn i en genetisk konstruksjon som omfatter en DNA-sekvens som koder for et protein som har membran-omspennende egenskaper. Eksempler på avidin- og streptavidin-relaterte proteiner er AVR-1-AVR-5, AVR-X-AVR-V, Stv1 og Stv2.
De enkelte domenene av fusjonsproteinet kan amplifiseres ved PCR (polymerase chain reaction) eller isoleres fra den opphavelige cDNA ved å benytte restriksjonsenzymoppslutning, isolering og rensing, f.eks. ved å benytte gelelektroforese og påfølgende ligering, f.eks. ved å benytte DNA-ligase. Fusjonsproteinkonstruksjonen kan deretter transfekteres inn i en hvilken som helst egnet vertscelle, dyrkes og isoleres ved å benytte standardteknikker for proteinrensing.
Konstruksjonen kan også benyttes som nakent DNA eller som et plasmid/liposom-, plasmid/polyetylenimin-, plasmid/dendrimer- eller plasmid/peptid-kompleks.
Alternativt kan konstruksjonen innføres i et replikasjonsdefekt virus som kan benyttes til å målrette konstruksjonen mot spesifikke seter in vivo. For eksempel kan konstruksjonen være en retroviral vektor, som omfatter den riktige cDNA for fusjonsproteinet. Et replikasjonsdefekt retrovirus, f.eks. Moloney murint retrovirus, kan deretter benyttes for den stabile transfeksjon av målceller og vev. Andre virus som kan benyttes innbefatter replikasjonsdefekte adenovirus, adeno-assosierte virus, herpesvirus, papillomavirus og sinibisvirus. Ytterligere virus vil være åpenbare for fagmannen.
I tillegg til de funksjonelle domener av avidin, streptavidin eller beslektede proteiner, vil fusjonsproteinet i alminnelighet omfatte de membran-omspennende domenene av endocytotiske reseptorer. Anvendelsen av disse reseptorene muliggjør opptaket av biotinylerte molekyler i en målcelle. Egnede reseptorer som kan benyttes i henhold til denne oppfinnelse omfatter scavenger-reseptor klasse A, low density lipoproteinreseptor, very low density lipoproteinreseptor, transferrin-reseptor og LOX-1-reseptoren. Fusjonsproteinet kan også omfatte en linker mellom reseptroproteinet og avidin-peptidsekvensene. Linkeren kan ha en hvilken som helst lengde, forutsatt at den funksjonelle aktivitet av de forskjellige komponentene av fusjonsproteinet bibeholdes.
I alminnelighet er fusjonen mellom avidin- eller streptavidin-peptidsekvensene og reseptorpeptidsekvensene mellom reseptorproteinets ekstracellulære domene og et hvilket som helst sete utenfor det biotin-bindende sete til avidin eller streptavidin.
Det følgende eksempel illustrerer oppfinnelsen.
Eksempel
En DNA-konstruksjon ble opprettet mellom den bovine scavenger-reseptor klasse A (ScR) (Kodama et al., (1990) Nature, 343:531-535) og avidin (Green (1975) Adv. Prot. Chem. 29:85-133) som koder for et protein som har et ScR-cytoplasmatisk domene, membran-omspennende domene og cc-heliks-domene, ligert til et biotin-bindende domene. Den fullstendige aminosyresekvens av fusjonsproteinet er vist i SEKV. ID. NR:2, hvor aminosyrene 1-53 representerer det cytoplasmatiske domenet; aminosyrene 55-79 representerer transmembrandomenet; aminosyrene 81-111 representerer et spacer-domene og aminosyrene 113-272 representerer a-heliks-domenet. Aminosyrene 273-400 representerer den modne avidin-peptidsekvens avledet fra avidin-cDNA (Gope et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:3595-3606) som mangler et sekresjonssignal.
I korthet ble cDNA for ScR oppnådd fra dyrkede celler som tidligere var transfektert med et plasmid (PLScRNL) inneholdende ScR cDNA med en intern Rous sarkomavirus promoter og /-//ndlll-retriksjonsseter. Den isolerte cDNA ble deretter innskutt i et /-//ndlll-sete i retrovirusvektoren pLSIARNL. Avidin-cDNA ble produsert ved PCR og deretter innskutt i retrovirusvektoren ved et Sty 1 restriksjonssete på ScR cDNA. Den cDNA som utgjør oppfinnelsen er vist som SEKV. ID. NR:1, hvor nukleotidene 1-989 representerer en lang terminal repetisjon fra Mo-MuSV; nukleotidene 1071-2270 representerer den kodende region for fusjonsproteinet; nukleotidene 2376-3101 representerer den utranslaterte region fra bovin scavenger-reseptor I cDNA; nukleotidene 3107-3376 representerer en RSV promoterregion; nukleotidene 3727-4522 representerer et neo R-gen og nukleotidene 4540-5177 representerer en lang terminal repetisjon fra Mo-MuLV.
Fig. 2 og 3 refererer til prosesser benyttet i dette eksempel. Nærmere bestemt viser Fig. 2 hvorledes ScR cDNA med en intern RSV-promoter, ble kuttet fra plasmid pLScRNL med Hind\\\ og klonet inn i et H/ncflll-sete i en skyttelvektor. Fig. 3 viser hvorledes ScR-avidin-RSV cDNA ble klonet inn i et retrovirusvektor pLRNL HindlU-sete.
Ekspresjonen av fusjonsproteinet i celler transfektert med vektoren, kan bekreftes ved northernblotting og immuncytokjemisk farving med et antistoff utviklet mot avidin.
Forsøkene viste at det fulle mRNA-transkript ble translatert inn i 55 kDa monomerer som var i stand til å danne sekundærstrukturer på 110 kDa dimerer tilkoblet ved S-S-bindinger under ikke-reduserende betingelser.Omtrent 110 kDa dimere og 55 kDa monomere peptider ble påvist under bruk av denaturerende betingelser. Resultatene er sammenlignbare med datamaskinberegninger for det monomere fusjonsprotein, 45 kDa. Under ikke-denaturerende betingelser (dvs. bruk av acetylering før westernblotting) var det sterkeste signalet ca. 220 kDa, som ble denaturert til en ca. 110 kDa dimer og en 55 kDa monomer, hvilket tyder på dannelse av tetramerer. Nærværet av proteiner på 220 kDa ble også verifisert ved bruk av kjemiske kryss-linkere, f.eks. NHS-estere. Resultatene viser at avidin forblir løselig og er i stand til å danne tetramerer selv når det er koblet til membran-omspennende domener av endocytotiske reseptorer.
Fusjonsproteinet ble vist å være et funksjonelt protein som var i stand til å binde FITC-biotin når det ble analysert ved konfokal mikroskopi og «atomic force» mikroskopi. Utransduserte celler og celler transfektert med en retrovirusvektor inneholdende LacZ-genet, ble benyttet som kontroller. Det ble ikke påvist uspesifikk binding av biotinprober til LacZ-transduserte kontrollceller ved «atomic force» mikroskopi. Som forventet oppviste de transfekterte cellene spesifikk binding som var gjentatt målbar i ikke-fikserte prøver. De målte bindingskreftene utgjorde multipler av gjennomsnittet 149 ± 19 pN (gjennomsnitt ± sd) som, som også forventet, ligger innenfor området for den tidligere rapporterte biotin/streptavidin-bindingskraft på 160 pN (Florin et al., (1994), Science 264:415-417).
Konstruksjonens funksjonalitet kan også bekreftes in vivo ved å vise bindingen av fluorescens-merkede biotinmolekyler til celler som har fusjonsproteinkonstruksjonen, ved å benytte FACS-analyse.
Den funksjonelle aktivitet av fusjonsproteinet ble analysert in vivo i en malign rottegliom-modell. BT4C villtype gliomceller ble implantert intrakranialt i høyre corpus callosum i en dybde på 2,5 mm i hjernen til innavlede BDIX hunnrotter. Tumorveksten ble hyppig monitert med høyoppløsende MRI (magnetisk resonans-avbildning). 3 uker etter tumorcelle-inokuleringene ble pseudotypede retrovirus som var bærere av cDNA for fusjonsproteinet eller LacZ-genet i titere på henholdsvis 2 x 10<6> cfu/mL og 1,3 x 106 cfu/mL ført inn i tumoren, først i en dybde på 2,5 mm og deretter i en dybde på 1,5 mm, med et intervall på 10 minutter. Genoverføringen ble gjentatt etter to dagers vekst. Dyrene ble avlivet og perfusjons-fiksert med 4% PFA 3 dager etter den siste injeksjonen. Hjernene ble tatt ut og delt ved injeksjonsstedet i to koronale deler, snittet på is og analysert ved immunoreaktivitet mot anti-avidin-antistoff. Resultatene viste at fusjonsproteinet ble uttrykt in vivo i malignt rottegliom. Protein ble påvist i gliomceller og i ring-lignende strukturer, som lignet vaskulære endotelceller i tumor-blodkar.
Claims (6)
1. Protein for å målrette bitinylerte molekyler mot spesifikke seter i vev, karakterisert ved at det omfatter et membran-omspennende domene av en endocytotisk reseptor og et ekstracellulært domene, som omfatter biotin-bindende aktivitet.
2. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at det videre omfatter et cytoplasmatisk domene.
3. Protein ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at det ekstracellulære domenet omfatter en biotin-bindende domene av avidin eller streptavidin.
4. Protein ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at reseptoren er scavenger-reseptor klasse A.
5. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfattter SEKV. ID. NR:2.
6. Nukleinsyremolekyl for å målrette biotinylerte molekyler mot spesifikke seter i vev, karakterisert ved at det koder for et protein i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 5.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9803757.5A GB9803757D0 (en) | 1998-02-23 | 1998-02-23 | Fusion proteins |
| GBGB9813653.4A GB9813653D0 (en) | 1998-06-24 | 1998-06-24 | Fusion proteins |
| PCT/GB1999/000546 WO1999042577A2 (en) | 1998-02-23 | 1999-02-23 | Biotin-binding receptor molecules |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20004195L NO20004195L (no) | 2000-08-22 |
| NO20004195D0 NO20004195D0 (no) | 2000-08-22 |
| NO328139B1 true NO328139B1 (no) | 2009-12-14 |
Family
ID=26313170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20004195A NO328139B1 (no) | 1998-02-23 | 2000-08-22 | Biotin-bindende proteiner og nukleinsyremolekyler |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7208291B2 (no) |
| EP (1) | EP1056850B1 (no) |
| JP (1) | JP2002504328A (no) |
| KR (1) | KR100722578B1 (no) |
| CN (1) | CN1195852C (no) |
| AT (1) | ATE274058T1 (no) |
| AU (1) | AU750444B2 (no) |
| CA (1) | CA2319039A1 (no) |
| DE (1) | DE69919515T2 (no) |
| DK (1) | DK1056850T3 (no) |
| ES (1) | ES2226340T3 (no) |
| HU (1) | HUP0101614A3 (no) |
| NO (1) | NO328139B1 (no) |
| PL (1) | PL195990B1 (no) |
| PT (1) | PT1056850E (no) |
| WO (1) | WO1999042577A2 (no) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040209294A1 (en) * | 2002-09-02 | 2004-10-21 | National Food Research Institute | Method to produce a receptor chip using biotinylated protein |
| US9623117B2 (en) * | 2011-04-04 | 2017-04-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for selective targeting and entry of bacterial toxins to cells |
| SG10201804439PA (en) * | 2013-12-20 | 2018-06-28 | Hutchinson Fred Cancer Res | Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof |
| EP3288570A4 (en) | 2015-04-29 | 2018-11-21 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Modified stem cells and uses thereof |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4839293A (en) * | 1986-02-24 | 1989-06-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA encoding streptavidin, streptavidin produced therefrom, fused polypeptides which include amino acid sequences present in streptavidin and uses thereof |
| US5135736A (en) * | 1988-08-15 | 1992-08-04 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
| CA1340977C (en) * | 1988-11-15 | 2000-04-25 | Monty Krieger | Scavenger receptor protein and antibody thereto |
| US5457035A (en) * | 1993-07-23 | 1995-10-10 | Immunex Corporation | Cytokine which is a ligand for OX40 |
| US5846537A (en) | 1995-06-07 | 1998-12-08 | University Of Rochester | Modified avidin and streptavidin and methods of use thereof |
| US6497881B1 (en) * | 1995-11-30 | 2002-12-24 | New York University | High efficiency tissue specific compound delivery system using streptavidin-protein a fusion protein |
-
1999
- 1999-02-23 PT PT99906341T patent/PT1056850E/pt unknown
- 1999-02-23 CA CA002319039A patent/CA2319039A1/en not_active Abandoned
- 1999-02-23 AU AU26312/99A patent/AU750444B2/en not_active Ceased
- 1999-02-23 JP JP2000532517A patent/JP2002504328A/ja active Pending
- 1999-02-23 DK DK99906341T patent/DK1056850T3/da active
- 1999-02-23 WO PCT/GB1999/000546 patent/WO1999042577A2/en active IP Right Grant
- 1999-02-23 PL PL99343079A patent/PL195990B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-02-23 KR KR1020007009270A patent/KR100722578B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-02-23 EP EP99906341A patent/EP1056850B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-23 AT AT99906341T patent/ATE274058T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-02-23 DE DE69919515T patent/DE69919515T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-23 ES ES99906341T patent/ES2226340T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-23 HU HU0101614A patent/HUP0101614A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1999-02-23 CN CNB998032174A patent/CN1195852C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-08-22 NO NO20004195A patent/NO328139B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-07-11 US US10/618,570 patent/US7208291B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0101614A2 (hu) | 2001-09-28 |
| DE69919515T2 (de) | 2005-04-07 |
| HUP0101614A3 (en) | 2006-04-28 |
| PL195990B1 (pl) | 2007-11-30 |
| JP2002504328A (ja) | 2002-02-12 |
| CN1195852C (zh) | 2005-04-06 |
| KR20010085196A (ko) | 2001-09-07 |
| EP1056850A2 (en) | 2000-12-06 |
| EP1056850B1 (en) | 2004-08-18 |
| CN1291230A (zh) | 2001-04-11 |
| DK1056850T3 (da) | 2004-11-29 |
| AU750444B2 (en) | 2002-07-18 |
| US20040185059A1 (en) | 2004-09-23 |
| PL343079A1 (en) | 2001-07-30 |
| NO20004195L (no) | 2000-08-22 |
| AU2631299A (en) | 1999-09-06 |
| WO1999042577A3 (en) | 1999-10-21 |
| CA2319039A1 (en) | 1999-08-26 |
| ATE274058T1 (de) | 2004-09-15 |
| KR100722578B1 (ko) | 2007-05-28 |
| PT1056850E (pt) | 2004-12-31 |
| DE69919515D1 (de) | 2004-09-23 |
| ES2226340T3 (es) | 2005-03-16 |
| NO20004195D0 (no) | 2000-08-22 |
| WO1999042577A2 (en) | 1999-08-26 |
| US7208291B2 (en) | 2007-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101971021B1 (ko) | 세포 투과성의 향상을 위한 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법, 이를 포함하는 aMTD 서열을 개발하는 방법 | |
| JP4188909B2 (ja) | 細胞質残留性細胞膜透過ペプチド及びこれの用途｛ＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＵｓｅｓｔｈｅｒｅｏｆ｝ | |
| JP2022002530A (ja) | ウイルスベクター効率を改善するための組成物及び方法 | |
| EP1991560B1 (en) | Peptide having cell membrane penetrating activity | |
| JP2009532017A (ja) | ＰＴＤ／ＣＰＰＳへのｄｓＲＮＡ結合ドメイン融合体によるｓｉＲＮＡの導入可能な送達 | |
| CN108165593A (zh) | 胶原蛋白7及相关方法 | |
| US20170145106A1 (en) | Chimeric antigen receptor hCD87-CAR and applications thereof | |
| AU2017375828B2 (en) | Cytoplasmic transduction peptide and intracellular messenger comprising same | |
| CN112218621A (zh) | 包含基于靶向亲和域的膜蛋白的胞外囊泡 | |
| CN114560915A (zh) | 一种改造的高滴度SARS-CoV-2假病毒 | |
| US20090011984A1 (en) | Biotin-binding receptor molecules | |
| NO328139B1 (no) | Biotin-bindende proteiner og nukleinsyremolekyler | |
| CN113293178A (zh) | 基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法 | |
| CN112279921A (zh) | 用于胞内递送分子的复合物 | |
| CN114630909B (zh) | 环状rna、包含环状rna的疫苗及用于检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒 | |
| US7994148B2 (en) | Transmembrane delivery peptide and bio-material comprising the same | |
| CN113880924A (zh) | 一种SARS-CoV-2假病毒 | |
| JP2002504328A5 (no) | ||
| JP2003526323A (ja) | Ｋｄｅｌ受容体インヒビター | |
| Kadkhodazadeh et al. | Fiber manipulation and post-assembly nanobody conjugation for adenoviral vector retargeting through SpyTag-SpyCatcher protein ligation | |
| Widyaningtyas et al. | Design, synthesis, and functional testing of recombinant cell penetrating peptides | |
| RU2464314C2 (ru) | Способ конденсации плазмидной днк для трансфекции эукариотических клеток | |
| BG63548B1 (bg) | Полипептиди, съдържащи протеинови домени на gax, включени в транскрипцията и/или взаимнодействащи сдруги протеини, съответни нуклеинови киселини и тяхното използване | |
| KR20140046996A (ko) | 인간 ｎｌｂｐ 유래의 ｎｐ12 폴리펩티드 또는 ｎｐ21 폴리펩티드를 포함하는 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 | |
| KR20130098839A (ko) | 인간 ｌｐｉｎ３ 단백질 유래의 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |