JP2003526323A - Ｋｄｅｌ受容体インヒビター - Google Patents
Ｋｄｅｌ受容体インヒビターInfo
- Publication number
- JP2003526323A JP2003526323A JP2000562511A JP2000562511A JP2003526323A JP 2003526323 A JP2003526323 A JP 2003526323A JP 2000562511 A JP2000562511 A JP 2000562511A JP 2000562511 A JP2000562511 A JP 2000562511A JP 2003526323 A JP2003526323 A JP 2003526323A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- kdel
- kdel receptor
- receptor inhibitor
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010030685 KDEL receptor Proteins 0.000 title claims abstract description 141
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 110
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 39
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 12
- JBFQOLHAGBKPTP-NZATWWQASA-N (2s)-2-[[(2s)-4-carboxy-2-[[3-carboxy-2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]propanoyl]amino]butanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN JBFQOLHAGBKPTP-NZATWWQASA-N 0.000 claims abstract description 9
- 108010089256 lysyl-aspartyl-glutamyl-leucine Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 claims description 97
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 55
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 46
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 claims description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 35
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 101710176668 Cartilage oligomeric matrix protein Proteins 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 claims description 4
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 claims description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091006082 receptor inhibitors Proteins 0.000 claims description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 10
- 102100027473 Cartilage oligomeric matrix protein Human genes 0.000 claims 5
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 claims 5
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 claims 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 71
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 abstract description 19
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 15
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 abstract description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 104
- 101100065549 Xenopus laevis kdelr3 gene Proteins 0.000 description 50
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 49
- 101100065554 Dictyostelium discoideum kdelr gene Proteins 0.000 description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 28
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 18
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 108010060803 thrombospondin 3 Proteins 0.000 description 12
- 108010060815 thrombospondin 4 Proteins 0.000 description 11
- 101000725512 Rattus norvegicus Cartilage oligomeric matrix protein Proteins 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 9
- 102100029219 Thrombospondin-4 Human genes 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 102000055007 Cartilage Oligomeric Matrix Human genes 0.000 description 7
- 101000899228 Mus musculus Endoplasmic reticulum chaperone BiP Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 7
- 102100029524 Thrombospondin-3 Human genes 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102000005681 phospholamban Human genes 0.000 description 6
- 108010059929 phospholamban Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 6
- 108010027410 Adenovirus E3 Proteins Proteins 0.000 description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000725508 Homo sapiens Cartilage oligomeric matrix protein Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 102000050578 human COMP Human genes 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 101100208244 Mus musculus Thbs3 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101100065553 Caenorhabditis briggsae erd-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100011868 Caenorhabditis elegans erd-2.1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 101100016370 Danio rerio hsp90a.1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100285708 Dictyostelium discoideum hspD gene Proteins 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101100071627 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) swo1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- -1 Terskikh et al. 1997 Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224489 Amoeba Species 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101000725506 Bos taurus Cartilage oligomeric matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OWNRRUFOJXFKCU-UHFFFAOYSA-N Bromadiolone Chemical compound C=1C=C(C=2C=CC(Br)=CC=2)C=CC=1C(O)CC(C=1C(OC2=CC=CC=C2C=1O)=O)C1=CC=CC=C1 OWNRRUFOJXFKCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 206010011416 Croup infectious Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100039371 ER lumen protein-retaining receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039368 ER lumen protein-retaining receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 244000148064 Enicostema verticillatum Species 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 240000001973 Ficus microcarpa Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000812437 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000812465 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000019218 Mannose-6-phosphate receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050006616 Mannose-6-phosphate receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- PPQNQXQZIWHJRB-UHFFFAOYSA-N Methylcholanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC4=CC=C(C)C(CC5)=C4C5=C3C=CC2=C1 PPQNQXQZIWHJRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 229930191564 Monensin Natural products 0.000 description 1
- GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N Monensin A Natural products O1C(CC)(C2C(CC(O2)C2C(CC(C)C(O)(CO)O2)C)C)CCC1C(O1)(C)CCC21CC(O)C(C)C(C(C)C(OC)C(C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101000653007 Mus musculus Thromboxane-A synthase Proteins 0.000 description 1
- 101000608785 Mus musculus Thymidylate synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400001270 Neuronostatin Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100219325 Phaseolus vulgaris BA13 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007946 glucose deprivation Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000005621 mannosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960005358 monensin Drugs 0.000 description 1
- GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N monensin A Chemical compound C([C@@](O1)(C)[C@H]2CC[C@@](O2)(CC)[C@H]2[C@H](C[C@@H](O2)[C@@H]2[C@H](C[C@@H](C)[C@](O)(CO)O2)C)C)C[C@@]21C[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](OC)[C@H](C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 108010080502 preprolactin Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明はKDEL受容体インヒビターおよびその治療上の使用に関する。あるタンパク質は、KDEL配列とその受容体との相互作用を介して、細胞の小胞体に機能的に保持されている。本発明によると、KDEL受容体インヒビターを用いてこの相互作用を阻害すると、そのようなタンパク質の分泌が促進される。本発明の特定の実施形態において、KDEL受容体インヒビターを用いて熱ショックタンパク質の分泌を促進することができ、その結果分泌された熱ショックタンパク質が免疫系にアクセスしやすくなり、熱ショックタンパク質に結合した抗原に対する免疫応答が高められる。
Description
【０００１】１．序論
本発明はKDEL受容体インヒビターおよびその治療上の使用に関する。あるタン
パク質は、そのタンパク質のC末端のKDEL配列とKDEL結合性受容体との相互作用
を介して、細胞の小胞体において機能的に保持されている。本発明によれば、KD
EL受容体インヒビターを用いてこの相互作用を阻害することで、そのようなタン
パク質の分泌が促進される。本発明の特定の実施形態においては、KDEL受容体イ
ンヒビターを用いて熱ショックタンパク質の分泌を促進することができ、その結
果分泌された熱ショックタンパク質が免疫系にアクセスしやすくなり、熱ショッ
クタンパク質に結合した抗原に対する免疫応答が高められる。
パク質は、そのタンパク質のC末端のKDEL配列とKDEL結合性受容体との相互作用
を介して、細胞の小胞体において機能的に保持されている。本発明によれば、KD
EL受容体インヒビターを用いてこの相互作用を阻害することで、そのようなタン
パク質の分泌が促進される。本発明の特定の実施形態においては、KDEL受容体イ
ンヒビターを用いて熱ショックタンパク質の分泌を促進することができ、その結
果分泌された熱ショックタンパク質が免疫系にアクセスしやすくなり、熱ショッ
クタンパク質に結合した抗原に対する免疫応答が高められる。
【０００２】２．発明の背景
生細胞は分子要素の複雑な集合体であり、正しく機能するためには、その構築
物分子同士がつながりをもって組織的に働かなくてはならない。ある構築物要素
は互いに結合して、細胞の活動を区画化する細胞小器官や命令を伝達し運動性を
制御するフィラメントなど分子の高次構造を形成する。その他の構築物要素は可
溶性の形態で存在しており、細胞中あるいは細胞区画内を自由に移動することが
できる。
物分子同士がつながりをもって組織的に働かなくてはならない。ある構築物要素
は互いに結合して、細胞の活動を区画化する細胞小器官や命令を伝達し運動性を
制御するフィラメントなど分子の高次構造を形成する。その他の構築物要素は可
溶性の形態で存在しており、細胞中あるいは細胞区画内を自由に移動することが
できる。
【０００３】
細胞は指定されたタンパク質のサブセットを合成、プロセシングおよび分泌す
る要素も備えている。このいわゆる分泌経路には、分泌されたタンパク質のプロ
セシングに関与する多数の常在可溶性分子だけでなく、小胞体やゴルジ装置など
の膜関連構造体も含まれる。分泌されるタンパク質はゴルジ装置を通過し、そこ
で細胞外への輸送のためにパッケージングされる。それとともに、間断ない膜お
よび小胞体内腔の内容物の小胞輸送によって、可溶性タンパク質が小胞体に適正
に常在している。
る要素も備えている。このいわゆる分泌経路には、分泌されたタンパク質のプロ
セシングに関与する多数の常在可溶性分子だけでなく、小胞体やゴルジ装置など
の膜関連構造体も含まれる。分泌されるタンパク質はゴルジ装置を通過し、そこ
で細胞外への輸送のためにパッケージングされる。それとともに、間断ない膜お
よび小胞体内腔の内容物の小胞輸送によって、可溶性タンパク質が小胞体に適正
に常在している。
【０００４】
これら常在タンパク質の間断ない喪失および再合成の必要性を回避するために
、細胞はゴルジ装置中または近傍に局在している膜結合受容体を利用してそれを
取り戻している(LewisおよびPelham, 1992, Cell 68:353-364)。該受容体は、小
胞体へ逆輸送されるタンパク質のマーカーとなる、特定のC末端アミノ酸配列に
結合する。この配列は通常リジン-アスパラギン酸-グルタミン酸-ロイシン(アミ
ノ酸の3文字表記ではLys-Asp-Glu-Leu、1文字表記ではKDEL、本明細書中では「K
DEL」とする)であることから、該受容体は通常KDEL受容体と呼ばれる(Munroおよ
びPelham, 1987, Cell 48:899-907; Pelham, 1988, EMBO J. 7:913-918)。ヒトK
DEL受容体は7回膜貫通型ドメインタンパク質として特徴付けられており、それは
ゴルジ装置に一時的に存在しているが、KDELを含むリガンドと結合すると小胞体
に移動し、そこで該リガンドは放出される(Townsleyら, 1993, EMBO J. 12:2821
-2829)。
、細胞はゴルジ装置中または近傍に局在している膜結合受容体を利用してそれを
取り戻している(LewisおよびPelham, 1992, Cell 68:353-364)。該受容体は、小
胞体へ逆輸送されるタンパク質のマーカーとなる、特定のC末端アミノ酸配列に
結合する。この配列は通常リジン-アスパラギン酸-グルタミン酸-ロイシン(アミ
ノ酸の3文字表記ではLys-Asp-Glu-Leu、1文字表記ではKDEL、本明細書中では「K
DEL」とする)であることから、該受容体は通常KDEL受容体と呼ばれる(Munroおよ
びPelham, 1987, Cell 48:899-907; Pelham, 1988, EMBO J. 7:913-918)。ヒトK
DEL受容体は7回膜貫通型ドメインタンパク質として特徴付けられており、それは
ゴルジ装置に一時的に存在しているが、KDELを含むリガンドと結合すると小胞体
に移動し、そこで該リガンドは放出される(Townsleyら, 1993, EMBO J. 12:2821
-2829)。
【０００５】
KDEL受容体と相互作用する分子の中に、「熱ショックタンパク質」といわれる
類のタンパク質群があり、それは小胞体で新生ポリペプチドと結合し、それが分
泌される前に、会合プロセスを通してタンパク質をエスコートして分子「シャペ
ロン」として作用する(Frydmanら, 1994, Nature 370:111-117; Hendrickおよび
Hartl, Annu. Rev. Biochem. 62:349-384; Hartl, 1996, Nature 381:571-580)
。熱ショックタンパク質は、温度の急上昇またはグルコース剥奪などのストレス
条件下において細胞で選択的に発現される高保存されたタンパク質群を構築物し
ている。熱ショックタンパク質は、完成した構造をとっていない広範囲にわたる
その他のタンパク質に結合することができ、合成、高次構造形成、会合形成、分
解および転座など、これら結合タンパク質の製造に関与している(Freemanおよび
Morimoto, 1996, EMBO J. 15:2969-2979; LindquistおよびCraig, 1988, Annu.
Rev. Genet. 22:631-677; HendrickおよびHartl, 1993, Annu. Rev. Biochem. 6 2 :349-384)。
類のタンパク質群があり、それは小胞体で新生ポリペプチドと結合し、それが分
泌される前に、会合プロセスを通してタンパク質をエスコートして分子「シャペ
ロン」として作用する(Frydmanら, 1994, Nature 370:111-117; Hendrickおよび
Hartl, Annu. Rev. Biochem. 62:349-384; Hartl, 1996, Nature 381:571-580)
。熱ショックタンパク質は、温度の急上昇またはグルコース剥奪などのストレス
条件下において細胞で選択的に発現される高保存されたタンパク質群を構築物し
ている。熱ショックタンパク質は、完成した構造をとっていない広範囲にわたる
その他のタンパク質に結合することができ、合成、高次構造形成、会合形成、分
解および転座など、これら結合タンパク質の製造に関与している(Freemanおよび
Morimoto, 1996, EMBO J. 15:2969-2979; LindquistおよびCraig, 1988, Annu.
Rev. Genet. 22:631-677; HendrickおよびHartl, 1993, Annu. Rev. Biochem. 6 2 :349-384)。
【０００６】
KDEL受容体についてのリガンド配列を含む２個の熱ショックタンパク質は、gp
96およびBiPである。ショウジョウバエや酵母には見られないが、高等な真核生
物に見られるgp96は、おそらくそれと関連性の深い細胞質熱ショックタンパク質
hsp90をコードする遺伝子の複製によって比較的最近進化したようである(Liおよ
びSrivastava, 1993, EMBO J. 12:3143-3151)。ヒトhsp90とマウスgp96間の同一
性は約48%である（Wiechら, 1992, Nature 358:169-170; Melnickら, 1992, J.
Biol. Chem. 267:21303-21306; Melnickら, 1994, Nature 370:373-375; Schaif
f ら., 1992, J. Exp. Med. 176:657-666; Ramakrishnanら, 1995, DNA and Cel
l Biol. 14:373-384)。BiP（本文献ではgrp78とも呼ばれる）は新たに合成され
る免疫グロブリン鎖と複合体を形成する(Boleら, 1986, J. Cell. Biol. 102:15
58-1566)。
96およびBiPである。ショウジョウバエや酵母には見られないが、高等な真核生
物に見られるgp96は、おそらくそれと関連性の深い細胞質熱ショックタンパク質
hsp90をコードする遺伝子の複製によって比較的最近進化したようである(Liおよ
びSrivastava, 1993, EMBO J. 12:3143-3151)。ヒトhsp90とマウスgp96間の同一
性は約48%である（Wiechら, 1992, Nature 358:169-170; Melnickら, 1992, J.
Biol. Chem. 267:21303-21306; Melnickら, 1994, Nature 370:373-375; Schaif
f ら., 1992, J. Exp. Med. 176:657-666; Ramakrishnanら, 1995, DNA and Cel
l Biol. 14:373-384)。BiP（本文献ではgrp78とも呼ばれる）は新たに合成され
る免疫グロブリン鎖と複合体を形成する(Boleら, 1986, J. Cell. Biol. 102:15
58-1566)。
【０００７】
ある条件下においては、KDELに媒介されるタンパク質再配分の正常な制御を阻
害することが好ましい。本発明によると被験者は、例えば通常は小胞体に保持さ
れているが、放出されると有益な免疫原性効果を有する熱ショックタンパク質の
分泌から利益をうける。
害することが好ましい。本発明によると被験者は、例えば通常は小胞体に保持さ
れているが、放出されると有益な免疫原性効果を有する熱ショックタンパク質の
分泌から利益をうける。
【０００８】
熱ショックタンパク質は様々な状況下で免疫応答に役割を果たすと考えられて
いる。実験動物の腫瘍から調製された熱ショックタンパク質を接種すると、腫瘍
特異的に免疫応答が誘導されることが示された。すなわち、特定の腫瘍から精製
された熱ショックタンパク質gp96は、関連性にかかわらず他の腫瘍ではなく、起
源が同一の腫瘍由来の細胞増殖を阻害する免疫応答を誘導できた(Srivastavaお
よびMaki, 1991, Curr. Topics Microbiol. 167:109-123)。高解像度ゲル電気泳
動により、腫瘍に由来するgp96は分子レベルで不均質であることが示され、この
不均質性の原因が熱ショックタンパク質に付着した、数百に達する細かいペプチ
ド集団であるという証拠が示唆されている(FeldwegおよびSrivastava, 1995, In
t. J. Cancer 63:310-314)。実際、水疱性口内炎ウイルスの抗原性ペプチドが、
ウイルスに感染した細胞のgp96に結合したことが示されている(Nielandら, 1996
, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6135-6139)。このペプチドの集積は、小
胞体でのgp96の局在性に関与しており、ここでgp96はペプチド受容体としておよ
び主要組織適合複合体クラスI分子のペプチドローディング(loading)に対するア
クセサリーとして作用することが示唆されている。(LiおよびSrivastava, 1993,
EMBO J. 12:3143-3151; Sutoおよび Srivastava, 1995, Science 269:1585-1
588)。最近の研究により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ「PDI」（小胞
体の管腔に存在するおよそ60kDaの分子量を有するタンパク質）もペプチド受容
体として機能しうることが示された(Lammertら, 1997, Eur. J. Immunol. 27:16
85-1690)。
いる。実験動物の腫瘍から調製された熱ショックタンパク質を接種すると、腫瘍
特異的に免疫応答が誘導されることが示された。すなわち、特定の腫瘍から精製
された熱ショックタンパク質gp96は、関連性にかかわらず他の腫瘍ではなく、起
源が同一の腫瘍由来の細胞増殖を阻害する免疫応答を誘導できた(Srivastavaお
よびMaki, 1991, Curr. Topics Microbiol. 167:109-123)。高解像度ゲル電気泳
動により、腫瘍に由来するgp96は分子レベルで不均質であることが示され、この
不均質性の原因が熱ショックタンパク質に付着した、数百に達する細かいペプチ
ド集団であるという証拠が示唆されている(FeldwegおよびSrivastava, 1995, In
t. J. Cancer 63:310-314)。実際、水疱性口内炎ウイルスの抗原性ペプチドが、
ウイルスに感染した細胞のgp96に結合したことが示されている(Nielandら, 1996
, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6135-6139)。このペプチドの集積は、小
胞体でのgp96の局在性に関与しており、ここでgp96はペプチド受容体としておよ
び主要組織適合複合体クラスI分子のペプチドローディング(loading)に対するア
クセサリーとして作用することが示唆されている。(LiおよびSrivastava, 1993,
EMBO J. 12:3143-3151; Sutoおよび Srivastava, 1995, Science 269:1585-1
588)。最近の研究により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ「PDI」（小胞
体の管腔に存在するおよそ60kDaの分子量を有するタンパク質）もペプチド受容
体として機能しうることが示された(Lammertら, 1997, Eur. J. Immunol. 27:16
85-1690)。
【０００９】
更に熱ショックタンパク質を、免疫反応を刺激するためのアジュバントとして
使用する方法が提案された（例えばEdgington, 1995, Bio/Technol. 13:1442-14
44; PCT出願国際公開公報番号WO 94/29459 出願人 The Whitehead Institute f
or Biomedical Research 発明者Richard Young、下記文献参照）。最もよく知
られているアジュバントの１つであるフロイント完全アジュバントは、マイコバ
クテリア（結核を引き起こすバクテリウム属）由来の熱ショックタンパク質の混
合物を含む。フロイント完全アジュバントは、非マイコバクテリア抗原に対する
免疫応答を高めるために長年用いられてきた。多数の文献が、とりわけ、結核そ
のものに対する予防接種など、単離されたマイコバクテリア熱ショックタンパク
質の使用を同じ目的で提案している(Lukacsら, 1993, J. Exp. Med. 178:343-34
8; Lowrieら, 1994, Vaccine 12:1537-1540; SilvaおよびLowrie, 1994, Immuno
logy 82:244-248; Lowrieら, 1995, J. Cell. Biochem. Suppl. 0(19b): 220; R
etzlaffら, 1994, Infect. Immun. 62:5689-5693; PCT出願国際公開公報番号WO
94/11513 出願人Medical Research Council 発明者 Colstonら; PCT出願国際
公開公報番号WO 93/1771 出願人 Biocine Sclavo Spa. 発明者 Rappuoliら)。
使用する方法が提案された（例えばEdgington, 1995, Bio/Technol. 13:1442-14
44; PCT出願国際公開公報番号WO 94/29459 出願人 The Whitehead Institute f
or Biomedical Research 発明者Richard Young、下記文献参照）。最もよく知
られているアジュバントの１つであるフロイント完全アジュバントは、マイコバ
クテリア（結核を引き起こすバクテリウム属）由来の熱ショックタンパク質の混
合物を含む。フロイント完全アジュバントは、非マイコバクテリア抗原に対する
免疫応答を高めるために長年用いられてきた。多数の文献が、とりわけ、結核そ
のものに対する予防接種など、単離されたマイコバクテリア熱ショックタンパク
質の使用を同じ目的で提案している(Lukacsら, 1993, J. Exp. Med. 178:343-34
8; Lowrieら, 1994, Vaccine 12:1537-1540; SilvaおよびLowrie, 1994, Immuno
logy 82:244-248; Lowrieら, 1995, J. Cell. Biochem. Suppl. 0(19b): 220; R
etzlaffら, 1994, Infect. Immun. 62:5689-5693; PCT出願国際公開公報番号WO
94/11513 出願人Medical Research Council 発明者 Colstonら; PCT出願国際
公開公報番号WO 93/1771 出願人 Biocine Sclavo Spa. 発明者 Rappuoliら)。
【００１０】
自己熱ショックタンパク質のレベルが増加すると、熱ショックタンパク質の内
因性抗原ペプチドとの結合によって、免疫応答の向上にもつながる(国際出願番
号PCT/US96/13233 Rothmanら)。そのような活性は、従来から用いられてきた異
種熱ショックタンパク質のアジュバント活性とは異なっている。
因性抗原ペプチドとの結合によって、免疫応答の向上にもつながる(国際出願番
号PCT/US96/13233 Rothmanら)。そのような活性は、従来から用いられてきた異
種熱ショックタンパク質のアジュバント活性とは異なっている。
【００１１】
本発明は、抗原性熱ショックタンパク質複合体の分泌を、KDEL受容体に媒介さ
れるその複合体の小胞体への逆輸送を阻害することによって増加させることを目
的とする。同じような方法を用いて、通常はKDEL受容体を介して保持されている
、その他の目的のタンパク質の分泌を増加しうる。
れるその複合体の小胞体への逆輸送を阻害することによって増加させることを目
的とする。同じような方法を用いて、通常はKDEL受容体を介して保持されている
、その他の目的のタンパク質の分泌を増加しうる。
【００１２】３．発明の概要
本発明はKDEL受容体インヒビターおよびその治療上の使用に関する。本発明は
、少なくとも部分的には、そのようなインヒビターが、通常は生産された細胞に
保持される傾向があるタンパク質の分泌を促進する能力に基づく。
、少なくとも部分的には、そのようなインヒビターが、通常は生産された細胞に
保持される傾向があるタンパク質の分泌を促進する能力に基づく。
【００１３】
限定を意図しない実施形態において、本発明は、KDEL受容体に結合する複数の
アミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。そのような抑制性タンパク質は、細
胞に導入されると、本来ならばKDEL受容体との相互作用を介して細胞に機能的に
保持される傾向があるタンパク質の分泌を促進する。分泌されるタンパク質には
、細胞によって天然で生産されるタンパク質および／または該タンパク質をコー
ドする核酸を細胞またはその前駆細胞へ導入した結果発現されるタンパク質が含
まれる。限定を意図しない特定の実施例として、この方法によって内因性または
外来的に導入された熱ショックタンパク質の分泌が促進されうる。更に、KDEL受
容体インヒビタータンパク質は、熱ショックタンパク質と結合しうる抗原性ペプ
チドと共に細胞に導入して、熱ショックタンパク質／抗原性ペプチド複合体の分
泌を促進するのに用いうる。
アミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。そのような抑制性タンパク質は、細
胞に導入されると、本来ならばKDEL受容体との相互作用を介して細胞に機能的に
保持される傾向があるタンパク質の分泌を促進する。分泌されるタンパク質には
、細胞によって天然で生産されるタンパク質および／または該タンパク質をコー
ドする核酸を細胞またはその前駆細胞へ導入した結果発現されるタンパク質が含
まれる。限定を意図しない特定の実施例として、この方法によって内因性または
外来的に導入された熱ショックタンパク質の分泌が促進されうる。更に、KDEL受
容体インヒビタータンパク質は、熱ショックタンパク質と結合しうる抗原性ペプ
チドと共に細胞に導入して、熱ショックタンパク質／抗原性ペプチド複合体の分
泌を促進するのに用いうる。
【００１４】
更なる実施形態において、本発明は、KDEL受容体とそのリガンドとの結合を阻
害するペプトミメティック(peptomimetic)化合物など更なる化合物の同定（例え
ばコンビナトリアルケミストリー技術によって調製されるか又はファージ展示に
より同定されうる）を提供する。そのような化合物は、上述の方法と類似した方
法において、あるタンパク質の分泌を促進するために用いうる。
害するペプトミメティック(peptomimetic)化合物など更なる化合物の同定（例え
ばコンビナトリアルケミストリー技術によって調製されるか又はファージ展示に
より同定されうる）を提供する。そのような化合物は、上述の方法と類似した方
法において、あるタンパク質の分泌を促進するために用いうる。
【００１５】４．図面の説明
(図面の説明については下記参照)５．発明の詳細な説明
限定するためではなく説明を明確にするために、本発明の詳細な説明を以下の
サブセクションに分ける。
サブセクションに分ける。
【００１６】
(i) KDEL受容体インヒビタータンパク質、および
(ii) KDEL受容体インヒビターの使用5.1. KDEL受容体インヒビタータンパク質
本発明は、KDEL受容体（以下「KDELrインヒビタータンパク質」と呼ぶ）に結
合する複数のアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。そのような配列を複数
含有することにより、該タンパク質は、天然のタンパク質（KDEL受容体に結合す
るが結合配列は１つである）と好ましく競合しうる。限定を意図しない好ましい
実施形態において、KDELrインヒビタータンパク質はオリゴマー型であり、複数
のサブユニットタンパク質を含んでおり、各サブユニットタンパク質はC末端にK
DEL受容体に結合する配列を含有している。
合する複数のアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。そのような配列を複数
含有することにより、該タンパク質は、天然のタンパク質（KDEL受容体に結合す
るが結合配列は１つである）と好ましく競合しうる。限定を意図しない好ましい
実施形態において、KDELrインヒビタータンパク質はオリゴマー型であり、複数
のサブユニットタンパク質を含んでおり、各サブユニットタンパク質はC末端にK
DEL受容体に結合する配列を含有している。
【００１７】
本明細書で用いられる「KDEL受容体」とは、タンパク質のC末端KDEL配列に選
択的および特異的に結合し、ゴルジ複合体から小胞体への結合タンパク質の再分
配に関与するタンパク質を意味する。限定を意図しない特定の実施形態において
、KDEL受容体は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevesiae)のER
D2（「ERD2」）およびそのヒト相同体（「hERD2」）によってコードされるタン
パク質、ならびにヒトERD-2に83％の同一性を示すELP-1などの構造的にも機能的
にも相同的なタンパク質を含む(Lewisら,1990, Nature 348:162-162; Semenzaら
, 1990, Cell 61:1349-1357; LewisおよびPelham, 1992, J. Mol. Biol. 226:91
3-916; LewisおよびPelham, 1992, Cell 68:353-364; Hsuら, 1992, Cell 69:62
5-635)。
択的および特異的に結合し、ゴルジ複合体から小胞体への結合タンパク質の再分
配に関与するタンパク質を意味する。限定を意図しない特定の実施形態において
、KDEL受容体は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevesiae)のER
D2（「ERD2」）およびそのヒト相同体（「hERD2」）によってコードされるタン
パク質、ならびにヒトERD-2に83％の同一性を示すELP-1などの構造的にも機能的
にも相同的なタンパク質を含む(Lewisら,1990, Nature 348:162-162; Semenzaら
, 1990, Cell 61:1349-1357; LewisおよびPelham, 1992, J. Mol. Biol. 226:91
3-916; LewisおよびPelham, 1992, Cell 68:353-364; Hsuら, 1992, Cell 69:62
5-635)。
【００１８】
限定を意図しない特定の実施形態において、KDEL受容体に結合するアミノ酸配
列はX-Asp Glu Leu (「XDEL」)であり、ここでXはいずれのアミノ酸でもよいが
好ましくはリジンまたはヒスチジン、最も好ましくはリジンであって、最終C末
端残基がX-Asp-Glu-Leu(KDEL)というようにロイシンになるようにC末端に位置す
る。限定を意図しない本発明の特定の実施形態において、C末端配列はSer-Glu-L
ys-Asp-Glu-Leu(「SEKDEL」)でありうる。KDEL受容体に結合しうるその他のアミ
ノ酸配列は、細胞でのKDEL受容体への結合について、かかる配列がLys-Asp-Glu-
Leu (KDEL)と競合する能力を調べることによって同定する（例えばMunroおよびP
elham, 1987, Cell 48:899-907に記載の実験を参照のこと）か、またはin vitro
で比較しうる条件下で調べることによって同定しうる。
列はX-Asp Glu Leu (「XDEL」)であり、ここでXはいずれのアミノ酸でもよいが
好ましくはリジンまたはヒスチジン、最も好ましくはリジンであって、最終C末
端残基がX-Asp-Glu-Leu(KDEL)というようにロイシンになるようにC末端に位置す
る。限定を意図しない本発明の特定の実施形態において、C末端配列はSer-Glu-L
ys-Asp-Glu-Leu(「SEKDEL」)でありうる。KDEL受容体に結合しうるその他のアミ
ノ酸配列は、細胞でのKDEL受容体への結合について、かかる配列がLys-Asp-Glu-
Leu (KDEL)と競合する能力を調べることによって同定する（例えばMunroおよびP
elham, 1987, Cell 48:899-907に記載の実験を参照のこと）か、またはin vitro
で比較しうる条件下で調べることによって同定しうる。
【００１９】
KDELrインヒビタータンパク質がオリゴマー型である場合、それは複数のサブ
ユニットを含み、それらのサブユニットは構造的に同一でも（すなわち「ホモオ
リゴマー」）異なっても（すなわち「ヘテロオリゴマー」）よい。各サブユニッ
トはKDEL受容体に結合するC末端を含み、サブユニットの残りの部分またはその
１部分は、サブユニット間の結合およびオリゴマー形成を可能にする。サブユニ
ットは互いに共有的にまたは非共有的に結合しうる。サブユニットが共有結合さ
れる場合、限定を意図しない例をいくつか挙げるなら、架橋はジスルフィド結合
、酸化された炭化水素残基または架橋試薬によるものである。
ユニットを含み、それらのサブユニットは構造的に同一でも（すなわち「ホモオ
リゴマー」）異なっても（すなわち「ヘテロオリゴマー」）よい。各サブユニッ
トはKDEL受容体に結合するC末端を含み、サブユニットの残りの部分またはその
１部分は、サブユニット間の結合およびオリゴマー形成を可能にする。サブユニ
ットは互いに共有的にまたは非共有的に結合しうる。サブユニットが共有結合さ
れる場合、限定を意図しない例をいくつか挙げるなら、架橋はジスルフィド結合
、酸化された炭化水素残基または架橋試薬によるものである。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、KDEL受容体に結合するアミノ酸配列
は、オリゴマー型タンパク質またはその１部分のタンパク質サブユニットにC末
端として組み込まれうる。適切なオリゴマーとして知られているのは、免疫グロ
ブリン分子などである。しかしながら、特に好ましくはより小さいオリゴマー型
分子、例えば軟骨オリゴマー型マトリックスタンパク質（「COMP」）（「ペプタ
体(peptabody)」という高結合力の結合タンパク質を生産するのに用いられてお
り、Terskikhら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:1663-1668に記載さ
れている。）のオリゴマー形成ドメインを介して形成された五量体などであるが
、これに限定されない。
端として組み込まれうる。適切なオリゴマーとして知られているのは、免疫グロ
ブリン分子などである。しかしながら、特に好ましくはより小さいオリゴマー型
分子、例えば軟骨オリゴマー型マトリックスタンパク質（「COMP」）（「ペプタ
体(peptabody)」という高結合力の結合タンパク質を生産するのに用いられてお
り、Terskikhら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:1663-1668に記載さ
れている。）のオリゴマー形成ドメインを介して形成された五量体などであるが
、これに限定されない。
【００２１】
このように、限定を意図しない特定の例において、本発明は複数のサブユニッ
ト間の結合を介して形成されたKDELrインヒビタータンパク質を提供する。
ト間の結合を介して形成されたKDELrインヒビタータンパク質を提供する。
【００２２】
ここで各サブユニットはCOMPのオリゴマー形成ドメイン、あるいはトロンボスポ
ンジン３（三量体「TSP3」）、トロンボスポンジン４（三量体「TSP4」）または
ホスホランバン（五量体「PLB」）などの相同的オリゴマー型タンパク質を含ん
でなる。このように、本発明は複数のサブユニットを含むオリゴマー型KDELrイ
ンヒビタータンパク質を提供する。ここで各サブユニットはオリゴマー形成ドメ
インを含み、そのC末端にKDEL受容体に結合する領域（例えばC末端に上記のXDEL
アミノ酸配列を有する領域）を有する。限定を意図しない、本発明の好ましい実
施形態において、KDEL受容体に結合する領域は、アミノ酸配列Lys Asp Glu Leu
を有し、オリゴマー形成ドメインは以下のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸
配列（Malashkevickら, 1996, Science 274:761-765）、あるいはEfimovら, 199
4, FEBS Letts 341:54-58およびEfimovら, 1996, Proteins 24:259に記載の条件
下でオリゴマーを形成するサブフラグメントまたはその相同体を有する。
ンジン３（三量体「TSP3」）、トロンボスポンジン４（三量体「TSP4」）または
ホスホランバン（五量体「PLB」）などの相同的オリゴマー型タンパク質を含ん
でなる。このように、本発明は複数のサブユニットを含むオリゴマー型KDELrイ
ンヒビタータンパク質を提供する。ここで各サブユニットはオリゴマー形成ドメ
インを含み、そのC末端にKDEL受容体に結合する領域（例えばC末端に上記のXDEL
アミノ酸配列を有する領域）を有する。限定を意図しない、本発明の好ましい実
施形態において、KDEL受容体に結合する領域は、アミノ酸配列Lys Asp Glu Leu
を有し、オリゴマー形成ドメインは以下のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸
配列（Malashkevickら, 1996, Science 274:761-765）、あるいはEfimovら, 199
4, FEBS Letts 341:54-58およびEfimovら, 1996, Proteins 24:259に記載の条件
下でオリゴマーを形成するサブフラグメントまたはその相同体を有する。
【００２３】
前記配列は、比較可能な条件下でオリゴマー形成能を失わないという条件で、
欠失、付加、置換などにより改変してもよい。
欠失、付加、置換などにより改変してもよい。
【００２４】
KDELrインヒビタータンパク質は、化学合成または遺伝子工学的技術のいずれ
かを用いた、当業界に既知のいずれの方法によっても調製することができる。従
って本発明は、タンパク質の発現を容易にする適切なエレメントに機能しうる形
で連結していて核酸ベクターに含まれている、本発明のKDELrインヒビタータン
パク質またはそのサブユニットをコードする領域を含む核酸を提供する。適切な
ベクターは、pHSV1などの単純ヘルペスウイルス系ベクター(Gellerら, 1990, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8950-8954)、MFGなどのレトロウイルスベクタ
ー(Jaffeeら, 1993, Cancer Res. 53:2221-2226)、また特にLN, LNSX, LNCX, LX
SNなどのモロニーレトロウイルスベクター(MillerおよびRosman, 1989, Biotech
niques 7:980-989)およびセムリキ森林ウイルス(「SFV」)ベクター、MVAなどの
ワクシニアウイルスベクター(SutterおよびMoss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci
. U.S.A. 89:10847-10851)、pJM17などのアデノウイルスベクター(Aliら, 1994,
Gene Therapy 1:367-384; Berker, 1988, Biotechniques 6:616-624; Wandおよ
びFiner, 1996, Nature Medicine 2:714-716)、AAV/neoなどのアデノ随伴ウイル
スベクター(Mura-Cachoら, 1992, J. Immunother. 11:231-237)、レンチウイル
スベクター(Zuffereyら, 1997, Nature Biotechnology 15:871-875)、pET 11a,
pET3a, pET11d, pET3d, pET22dおよびpET12a (Novagen社)、プラスミドAH5（SV4
0の起点(origin)およびアデノウイルス主要後期プロモーター(adenovirus major
late promoter)を含む）、pRC/CMV (InVitrogen社、Carlsbad, CA)、pCMU II (
Paaboら, 1986, EMBO J. 5: 1921-1927)、pZipNeo SV (Cepkoら, 1984, Cell 37 :1053-1062)、pSRα(DNAX社, Palo Alto, CA)、pBK-CMV (Stratagene社, La Jol
la, CA)、pCDNA3 (InVitrogen社, Carlsbad, CA)およびpCDNA1 (InVitrogen社,
Carlsbad, CA)などである。KDELrインヒビタータンパク質がオリゴマー型である
場合、オリゴマーはin vivoまたはin vitroで形成されうる。In vitroでそのよ
うなオリゴマーを生産する条件は、例えば、酸化グルタチオンおよび還元グルタ
チオンをそれぞれ10 mM、2 mMの濃度で含む室温溶液である(Efimovら, 1994, FE
BS Let. 341:54-58)。
かを用いた、当業界に既知のいずれの方法によっても調製することができる。従
って本発明は、タンパク質の発現を容易にする適切なエレメントに機能しうる形
で連結していて核酸ベクターに含まれている、本発明のKDELrインヒビタータン
パク質またはそのサブユニットをコードする領域を含む核酸を提供する。適切な
ベクターは、pHSV1などの単純ヘルペスウイルス系ベクター(Gellerら, 1990, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8950-8954)、MFGなどのレトロウイルスベクタ
ー(Jaffeeら, 1993, Cancer Res. 53:2221-2226)、また特にLN, LNSX, LNCX, LX
SNなどのモロニーレトロウイルスベクター(MillerおよびRosman, 1989, Biotech
niques 7:980-989)およびセムリキ森林ウイルス(「SFV」)ベクター、MVAなどの
ワクシニアウイルスベクター(SutterおよびMoss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci
. U.S.A. 89:10847-10851)、pJM17などのアデノウイルスベクター(Aliら, 1994,
Gene Therapy 1:367-384; Berker, 1988, Biotechniques 6:616-624; Wandおよ
びFiner, 1996, Nature Medicine 2:714-716)、AAV/neoなどのアデノ随伴ウイル
スベクター(Mura-Cachoら, 1992, J. Immunother. 11:231-237)、レンチウイル
スベクター(Zuffereyら, 1997, Nature Biotechnology 15:871-875)、pET 11a,
pET3a, pET11d, pET3d, pET22dおよびpET12a (Novagen社)、プラスミドAH5（SV4
0の起点(origin)およびアデノウイルス主要後期プロモーター(adenovirus major
late promoter)を含む）、pRC/CMV (InVitrogen社、Carlsbad, CA)、pCMU II (
Paaboら, 1986, EMBO J. 5: 1921-1927)、pZipNeo SV (Cepkoら, 1984, Cell 37 :1053-1062)、pSRα(DNAX社, Palo Alto, CA)、pBK-CMV (Stratagene社, La Jol
la, CA)、pCDNA3 (InVitrogen社, Carlsbad, CA)およびpCDNA1 (InVitrogen社,
Carlsbad, CA)などである。KDELrインヒビタータンパク質がオリゴマー型である
場合、オリゴマーはin vivoまたはin vitroで形成されうる。In vitroでそのよ
うなオリゴマーを生産する条件は、例えば、酸化グルタチオンおよび還元グルタ
チオンをそれぞれ10 mM、2 mMの濃度で含む室温溶液である(Efimovら, 1994, FE
BS Let. 341:54-58)。
【００２５】
上記のKDELrインヒビタータンパク質はいずれも細胞へ導入することができ、
ここで細胞は、KDEL受容体に結合しやすくその為小胞体に逆輸送されるタンパク
質（以下「ERタンパク質」と呼ぶ）を合成しているか、合成したか、または合成
をおこなうものであって、ここにおいてKDEL受容体インヒビタータンパク質はER
タンパク質の分泌を促進することが望ましい。KDELrインヒビタータンパク質は
、KDELrインヒビタータンパク質をコードする遺伝子またはKDELrインヒビタータ
ンパク質を含む微小小胞の導入など、当業界に既知のいずれの方法によっても細
胞へ導入することができる。
ここで細胞は、KDEL受容体に結合しやすくその為小胞体に逆輸送されるタンパク
質（以下「ERタンパク質」と呼ぶ）を合成しているか、合成したか、または合成
をおこなうものであって、ここにおいてKDEL受容体インヒビタータンパク質はER
タンパク質の分泌を促進することが望ましい。KDELrインヒビタータンパク質は
、KDELrインヒビタータンパク質をコードする遺伝子またはKDELrインヒビタータ
ンパク質を含む微小小胞の導入など、当業界に既知のいずれの方法によっても細
胞へ導入することができる。
【００２６】
KDELrインヒビタータンパク質が遺伝子により導入された場合、該KDELrインヒ
ビタータンパク質をコードする核酸は、KDELrインヒビタータンパク質を小胞体
に移行させる該タンパク質に結合したシグナル配列もコードするはずである。使
用されるシグナル配列の例は、図1-5に示したマウスBiPシグナルペプチド、図6-
9に示したアデノウイルスE3/19kdシグナルペプチド(Andersonら, 1991, J. Exp.
Med. 174:489-492)、ヒトプレプロラクチンシグナルペプチドまたはヒトプレプ
ロインスリンシグナルペプチドなどであるが、これらに限定されない。
ビタータンパク質をコードする核酸は、KDELrインヒビタータンパク質を小胞体
に移行させる該タンパク質に結合したシグナル配列もコードするはずである。使
用されるシグナル配列の例は、図1-5に示したマウスBiPシグナルペプチド、図6-
9に示したアデノウイルスE3/19kdシグナルペプチド(Andersonら, 1991, J. Exp.
Med. 174:489-492)、ヒトプレプロラクチンシグナルペプチドまたはヒトプレプ
ロインスリンシグナルペプチドなどであるが、これらに限定されない。
【００２７】
KDELrインヒビターそのものが細胞に導入される場合、それは１つ以上の糖残
基に結合して、例えばインスリン受容体(KruppおよびLane, 1982, J. Biol. Che
m. 257:1372-1377)、マンノース6-リン酸受容体またはアシアログリコプロテイ
ン受容体(Bergら,1982, Exp. Cell Res. 148:319-330)およびWu, 1988, Biochem
. 27:887-892; Plankら, 1992, Bioconjugate Chem. 3:533-539)を介したエンド
ソームへの取込みを促進するか、またはその他の生体分子、例えば葉酸（葉酸受
容体を介する取込み;Wangら, 1995, Proc. Natl. Acad. Sc. U.S.A. 92:3318）
、インスリン（インスリン受容体を介した取込み; Huckettら, 1990, Biochem.
Pharmacol. 40:253）またはトランスフェリン（トランスフェリン受容体を介し
た取込み; Kuhnら, 1984, Cell 37:95-103; McClellandら, 1984, Cell 39:267-
274; Morganら, 1978, Blood 52:1219-1228; KarinおよびMintz, 1981, J. Biol
. Chem. 256:3245-3252; Octaveら, 1983, Trends Biochem. Sci. (「TIBS」) 8 :217-220; Newmanら, 1982, TIBS 7:397-400; Zenkeら, 1990, Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 87:3655）に結合しうる。限定を意図しない特定の例として、図
10はN結合グリコシル化部位を含むKDELインヒビタータンパク質を示す。N-グリ
コシル化の共通部位は、NXTまたはNXSである。図１０に示されたタンパク質に含
まれる配列NSTを、KDELペプチドに関連したグリコシル化のための至適配列とし
て用いる(MisenbockおよびRothman, 1995, J. Cell Biol. 129:309-319; Kimら,
1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:2997-3002も参照のこと)。図１０に
示された分子は、mycタグ配列(Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu;配列
番号３６)も含み、それは例えばモノクローナル抗体9E10を用いて、タンパク質
の局在化についてのマーカーとして用いうる。
基に結合して、例えばインスリン受容体(KruppおよびLane, 1982, J. Biol. Che
m. 257:1372-1377)、マンノース6-リン酸受容体またはアシアログリコプロテイ
ン受容体(Bergら,1982, Exp. Cell Res. 148:319-330)およびWu, 1988, Biochem
. 27:887-892; Plankら, 1992, Bioconjugate Chem. 3:533-539)を介したエンド
ソームへの取込みを促進するか、またはその他の生体分子、例えば葉酸（葉酸受
容体を介する取込み;Wangら, 1995, Proc. Natl. Acad. Sc. U.S.A. 92:3318）
、インスリン（インスリン受容体を介した取込み; Huckettら, 1990, Biochem.
Pharmacol. 40:253）またはトランスフェリン（トランスフェリン受容体を介し
た取込み; Kuhnら, 1984, Cell 37:95-103; McClellandら, 1984, Cell 39:267-
274; Morganら, 1978, Blood 52:1219-1228; KarinおよびMintz, 1981, J. Biol
. Chem. 256:3245-3252; Octaveら, 1983, Trends Biochem. Sci. (「TIBS」) 8 :217-220; Newmanら, 1982, TIBS 7:397-400; Zenkeら, 1990, Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 87:3655）に結合しうる。限定を意図しない特定の例として、図
10はN結合グリコシル化部位を含むKDELインヒビタータンパク質を示す。N-グリ
コシル化の共通部位は、NXTまたはNXSである。図１０に示されたタンパク質に含
まれる配列NSTを、KDELペプチドに関連したグリコシル化のための至適配列とし
て用いる(MisenbockおよびRothman, 1995, J. Cell Biol. 129:309-319; Kimら,
1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:2997-3002も参照のこと)。図１０に
示された分子は、mycタグ配列(Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu;配列
番号３６)も含み、それは例えばモノクローナル抗体9E10を用いて、タンパク質
の局在化についてのマーカーとして用いうる。
【００２８】
KDELrインヒビタータンパク質をコードする核酸を細胞に導入する場合、適切
なベクターであれば、それはいずれのベクターに含まれてもよい。そのようなベ
クターは、限定はされないが、例えばpHSV1などの単純ヘルペスウイルス系ベク
ター(Gellerら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8950-8954)、MFGな
どのレトロウイルスベクター(Jaffeeら, 1993, Cancer Res. 53:2221-2226)、ま
た特にLN, LNSX, LNCXおよびLXSNなどのモロニーレトロウイルスベクター(Mille
rおよびRosman, 1989, Biotechniques 7:980-989)、MVAなどのワクシニアウイル
スベクター(SutterおよびMoss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:1084
7-10851)、pJM17などのアデノウイルスベクター(Aliら, 1994, Gene Therapy 1:
367-384; Berker, 1988, Biotechniques 6:616-624; WandおよびFiner, 1996, N
ature Medicine 2:714-716)、AAV/neoなどのアデノ随伴ウイルスベクター(Mura-
Cachoら, 1992, J. Immunother. 11:231-237)、裸(naked) DNAベクター（国際公
開公報番号 WO 94/21797, Merckら; 国際公開公報番号WO 90/11092, Vicalら;
米国特許第5,589,466号; 米国特許第 5,580,859号）などである。
なベクターであれば、それはいずれのベクターに含まれてもよい。そのようなベ
クターは、限定はされないが、例えばpHSV1などの単純ヘルペスウイルス系ベク
ター(Gellerら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8950-8954)、MFGな
どのレトロウイルスベクター(Jaffeeら, 1993, Cancer Res. 53:2221-2226)、ま
た特にLN, LNSX, LNCXおよびLXSNなどのモロニーレトロウイルスベクター(Mille
rおよびRosman, 1989, Biotechniques 7:980-989)、MVAなどのワクシニアウイル
スベクター(SutterおよびMoss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:1084
7-10851)、pJM17などのアデノウイルスベクター(Aliら, 1994, Gene Therapy 1:
367-384; Berker, 1988, Biotechniques 6:616-624; WandおよびFiner, 1996, N
ature Medicine 2:714-716)、AAV/neoなどのアデノ随伴ウイルスベクター(Mura-
Cachoら, 1992, J. Immunother. 11:231-237)、裸(naked) DNAベクター（国際公
開公報番号 WO 94/21797, Merckら; 国際公開公報番号WO 90/11092, Vicalら;
米国特許第5,589,466号; 米国特許第 5,580,859号）などである。
【００２９】
本発明のKDELrインヒビタータンパク質を更に改変して、例えばその半減期ま
たは活性の向上や、その免疫原性の変更（すなわち、誘発された免疫のサブタイ
プを増減する）をしうる。本発明の特定の実施形態において、KDELrインヒビタ
ータンパク質はポリエチレングリコールなどの第２分子または抗原性ペプチドと
コンジュゲートしうる。後者についての限定を意図しない特定の例として、抗原
性ペプチドは、KDELrインヒビタータンパク質に含まれる１つ以上のN結合グリコ
シル化トリペプチド配列Asn-X-Thrの反復に結合しうる。そのようなKDELrインヒ
ビタータンパク質／抗原性ペプチド複合体の、レクチン耐性細胞株（15Bチャイ
ニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または1021 CHO細胞など）での発現を用いて、
マンノシル化されるかシアル酸付加された、内因性KDELr受容体を飽和するKDELr
インヒビタータンパク質を生産して周辺培地に分泌しうる。分泌／非分泌のこの
タンパク質の形態は、ワクチン製剤に含まれうる。マンノシル化またはシアル酸
付加により、KDELrインヒビタータンパク質はエンドソームへの組込みを介して
取込みやすくなる(Engeringら, 1997, Eur. J. Immunol. 27:2417-2425)。本発
明の更なる実施形態において、KDELrインヒビタータンパク質は、融合ペプチド
またはタンパク質として、その他のタンパク質分子に結合しうる。限定を意図し
ない１つの例として、KDELrインヒビタータンパク質をコードする核酸を、例え
ば図１Aに示したBamHIまたはKpnI制限部位を用いて、他の分子の5’または3’末
端にクローニングしうる。限定を意図しない他の例として、ターゲティング配列
は、KDELrインヒビタータンパク質の、切除されうる配列の下流にあるアミノ末
端領域に取込まれうる。適当なターゲティング配列は、αインテグリン結合モチ
ーフArg-Gly-Asp (RGD)またはCys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys（配列番号
３３、「RGD-4C」と呼ばれる; Arapら, 1998, Science 279:377-380）などであ
る。あるいは、そのようなモチーフはKDELよりも3’部位側に置くことができる
。
たは活性の向上や、その免疫原性の変更（すなわち、誘発された免疫のサブタイ
プを増減する）をしうる。本発明の特定の実施形態において、KDELrインヒビタ
ータンパク質はポリエチレングリコールなどの第２分子または抗原性ペプチドと
コンジュゲートしうる。後者についての限定を意図しない特定の例として、抗原
性ペプチドは、KDELrインヒビタータンパク質に含まれる１つ以上のN結合グリコ
シル化トリペプチド配列Asn-X-Thrの反復に結合しうる。そのようなKDELrインヒ
ビタータンパク質／抗原性ペプチド複合体の、レクチン耐性細胞株（15Bチャイ
ニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または1021 CHO細胞など）での発現を用いて、
マンノシル化されるかシアル酸付加された、内因性KDELr受容体を飽和するKDELr
インヒビタータンパク質を生産して周辺培地に分泌しうる。分泌／非分泌のこの
タンパク質の形態は、ワクチン製剤に含まれうる。マンノシル化またはシアル酸
付加により、KDELrインヒビタータンパク質はエンドソームへの組込みを介して
取込みやすくなる(Engeringら, 1997, Eur. J. Immunol. 27:2417-2425)。本発
明の更なる実施形態において、KDELrインヒビタータンパク質は、融合ペプチド
またはタンパク質として、その他のタンパク質分子に結合しうる。限定を意図し
ない１つの例として、KDELrインヒビタータンパク質をコードする核酸を、例え
ば図１Aに示したBamHIまたはKpnI制限部位を用いて、他の分子の5’または3’末
端にクローニングしうる。限定を意図しない他の例として、ターゲティング配列
は、KDELrインヒビタータンパク質の、切除されうる配列の下流にあるアミノ末
端領域に取込まれうる。適当なターゲティング配列は、αインテグリン結合モチ
ーフArg-Gly-Asp (RGD)またはCys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys（配列番号
３３、「RGD-4C」と呼ばれる; Arapら, 1998, Science 279:377-380）などであ
る。あるいは、そのようなモチーフはKDELよりも3’部位側に置くことができる
。
【００３０】
限定を意図しない本発明の第１の例において、KDELrインヒビタータンパク質
は、単量体単位の五量体を作出することによって形成されうる。ここで、各単量
体はCOMP五量体形成ドメインを含み、該タンパク質はC末端にアミノ酸配列KDEL
を有する。図１Aはそのような単量体単位を１つコードする核酸分子を示す。こ
こで、切断シグナルペプチドはリンカー配列を介してラットCOMPの五量体形成ド
メインに結合し、それはラクダ(キャメル,camel)免疫グロブリンIgG由来のリン
カーを介してC末端KDEL配列に順に結合する。この構築物は、発現ベクター（例
えばpCDNA3であるが、これに限定されない）に取込まれて、正常な発現条件下で
会合し五量体のKDELrインヒビタータンパク質を形成する単量体を生産するのに
用いうる。
は、単量体単位の五量体を作出することによって形成されうる。ここで、各単量
体はCOMP五量体形成ドメインを含み、該タンパク質はC末端にアミノ酸配列KDEL
を有する。図１Aはそのような単量体単位を１つコードする核酸分子を示す。こ
こで、切断シグナルペプチドはリンカー配列を介してラットCOMPの五量体形成ド
メインに結合し、それはラクダ(キャメル,camel)免疫グロブリンIgG由来のリン
カーを介してC末端KDEL配列に順に結合する。この構築物は、発現ベクター（例
えばpCDNA3であるが、これに限定されない）に取込まれて、正常な発現条件下で
会合し五量体のKDELrインヒビタータンパク質を形成する単量体を生産するのに
用いうる。
【００３１】
限定を意図しない本発明の第２の例において、KDELrインヒビタータンパク質
は、単量体単位の三量体を作出することにより形成されうる。ここで、各単量体
はマウストロンボスポンジン３(TSP3)三量体形成ドメインを含み、該タンパク質
はC末端にアミノ酸配列KDELを有する。図３Aおよび４Aは、そのような単量体単
位を１つコードする核酸分子を示す。ここで、シグナルペプチドはリンカー配列
を介してマウスTSP3の三量体形成ドメインに結合し、それはラクダ免疫グロブリ
ンIgG由来のリンカーを介してC末端KDEL配列に順に結合する。この構築物は、発
現ベクター（例えばpCDNA3であるが、これに限定されない）に取込まれて、正常
な発現条件下で会合し三量体のKDELrインヒビタータンパク質を形成する単量体
を生産するのに用いうる。
は、単量体単位の三量体を作出することにより形成されうる。ここで、各単量体
はマウストロンボスポンジン３(TSP3)三量体形成ドメインを含み、該タンパク質
はC末端にアミノ酸配列KDELを有する。図３Aおよび４Aは、そのような単量体単
位を１つコードする核酸分子を示す。ここで、シグナルペプチドはリンカー配列
を介してマウスTSP3の三量体形成ドメインに結合し、それはラクダ免疫グロブリ
ンIgG由来のリンカーを介してC末端KDEL配列に順に結合する。この構築物は、発
現ベクター（例えばpCDNA3であるが、これに限定されない）に取込まれて、正常
な発現条件下で会合し三量体のKDELrインヒビタータンパク質を形成する単量体
を生産するのに用いうる。
【００３２】
限定を意図しない本発明の第３の例において、KDELrインヒビタータンパク質
は、単量体単位の五量体を作出することにより形成されうる。ここで、各単量体
はヒトCOMP五量体形成ドメインを含み、該タンパク質はC末端にアミノ酸配列KDE
Lを有する。図６Aは、そのような単量体単位を１つコードする核酸分子を示す。
ここで、シグナルペプチドはリンカー配列を介してヒトCOMPの五量体形成ドメイ
ンに結合し、それはラクダ免疫グロブリンIgG由来のリンカーを介してC末端KDEL
配列に順に結合する。この構築物は、発現ベクター（例えばpCDNA3であるが、こ
れに限定されない）に取込まれて、正常な発現条件下で会合し五量体のKDELrイ
ンヒビタータンパク質を形成する単量体を生産するのに用いうる。
は、単量体単位の五量体を作出することにより形成されうる。ここで、各単量体
はヒトCOMP五量体形成ドメインを含み、該タンパク質はC末端にアミノ酸配列KDE
Lを有する。図６Aは、そのような単量体単位を１つコードする核酸分子を示す。
ここで、シグナルペプチドはリンカー配列を介してヒトCOMPの五量体形成ドメイ
ンに結合し、それはラクダ免疫グロブリンIgG由来のリンカーを介してC末端KDEL
配列に順に結合する。この構築物は、発現ベクター（例えばpCDNA3であるが、こ
れに限定されない）に取込まれて、正常な発現条件下で会合し五量体のKDELrイ
ンヒビタータンパク質を形成する単量体を生産するのに用いうる。
【００３３】
限定を意図しない本発明の更に関連した例において、KDELrインヒビタータン
パク質は、図７A（ヒトホスホランバンオリゴマー形成ドメインを用いて五量体
を生産する）、図８A（ヒトトロンボスポンジン３オリゴマー形成ドメインを用
いて三量体を生産する）、図９A（ヒトトロンボスポンジン４オリゴマー形成ド
メインを用いて三量体を生産する）および図５A（アフリカツメガエルトロンボ
スポンジン４オリゴマー形成ドメインを用いて三量体を生産する）に示した構築
物を用いて調製しうる。
パク質は、図７A（ヒトホスホランバンオリゴマー形成ドメインを用いて五量体
を生産する）、図８A（ヒトトロンボスポンジン３オリゴマー形成ドメインを用
いて三量体を生産する）、図９A（ヒトトロンボスポンジン４オリゴマー形成ド
メインを用いて三量体を生産する）および図５A（アフリカツメガエルトロンボ
スポンジン４オリゴマー形成ドメインを用いて三量体を生産する）に示した構築
物を用いて調製しうる。
【００３４】5.2. KDEL受容体インヒビターの使用
本発明はKDEL受容体インヒビターの治療上および商業的な使用を多数提供する
。
。
【００３５】
本明細書中で用いられる「KDEL受容体インヒビター」とは、前章で記載したKD
ELrインヒビタータンパク質などであるが、それに限定されない。多数の非タン
パク質因子を含む分子だけでなく、非タンパク質分子も本用語の範囲に含まれる
。そのようなインヒビターは、KDEL受容体が、KDEL受容体に対するリガンド配列
を含むタンパク質を小胞体に戻す能力を阻害するという共通の性質を有する。例
えば、KDEL受容体インヒビターは、KDEL受容体（リガンド配列を複数含む前述の
オリゴマー型タンパク質など）との結合について、リガンド配列と競合するが、
本用語はその他のメカニズムによって作用するインヒビター（例えば、KDEL受容
体がその結合タンパク質を放出する能力を増加させる試薬）も含む。
ELrインヒビタータンパク質などであるが、それに限定されない。多数の非タン
パク質因子を含む分子だけでなく、非タンパク質分子も本用語の範囲に含まれる
。そのようなインヒビターは、KDEL受容体が、KDEL受容体に対するリガンド配列
を含むタンパク質を小胞体に戻す能力を阻害するという共通の性質を有する。例
えば、KDEL受容体インヒビターは、KDEL受容体（リガンド配列を複数含む前述の
オリゴマー型タンパク質など）との結合について、リガンド配列と競合するが、
本用語はその他のメカニズムによって作用するインヒビター（例えば、KDEL受容
体がその結合タンパク質を放出する能力を増加させる試薬）も含む。
【００３６】
KDEL受容体インヒビターを同定するためには、推定上のインヒビター化合物が
、通常はKDEL受容体に結合しやすく、細胞、特に小胞体に保持されているタンパ
ク質の分泌を促進する能力をin vivoで試験しうる。これは、細胞、組織または
細胞培養からの１つまたはそれ以上の該タンパク質の放出率および量を、推定イ
ンヒビターの存在下および不在下、ならびに／または推定インヒビターの様々な
濃度で定量することによって調べることができる。限定を意図しない１つの実施
例として、検出可能な標識タンパク質の分布を、ヒトc-myc遺伝子由来の11個の
アミノ酸配列で標識したタンパク質について行なったように追跡することができ
る(MunroおよびPelham, 1987, Cell 48:899-907)。
、通常はKDEL受容体に結合しやすく、細胞、特に小胞体に保持されているタンパ
ク質の分泌を促進する能力をin vivoで試験しうる。これは、細胞、組織または
細胞培養からの１つまたはそれ以上の該タンパク質の放出率および量を、推定イ
ンヒビターの存在下および不在下、ならびに／または推定インヒビターの様々な
濃度で定量することによって調べることができる。限定を意図しない１つの実施
例として、検出可能な標識タンパク質の分布を、ヒトc-myc遺伝子由来の11個の
アミノ酸配列で標識したタンパク質について行なったように追跡することができ
る(MunroおよびPelham, 1987, Cell 48:899-907)。
【００３７】
もしくは、KDEL受容体インヒビターは、推定上のインヒビターがKDEL受容体に
結合しる能力をin vitroで調べることによって同定しうる。限定を意図しない実
施形態において、そのような推定上のKDELインヒビターが、KDEL受容体との結合
について、既知のKDEL受容体リガンドまたはKDEL受容体インヒビターと競合する
能力を調べうる。限定を意図しない特定の実施例として、推定インヒビターが、
KDEL受容体との結合について、KDELr受容体タンパク質（前章に記載）と競合す
る能力を測定しうる。そのようなin vitroでの試験は、細胞内と同様の条件下で
行なうことが望ましい（例えばWilsonら, 1993, J. Biol. Chem. 268:7465-7468
参照）。KDEL受容体の適切な供与源は、ラット肝臓またはerd2受容体を発現する
COS細胞から調製されたゴルジ膜などである。推定上のインヒビターがin vitro
でKDEL受容体インヒビターとして機能するようであれば、KDEL受容体の機能を阻
害する能力がin vivoでは更に認められるであろう。
結合しる能力をin vitroで調べることによって同定しうる。限定を意図しない実
施形態において、そのような推定上のKDELインヒビターが、KDEL受容体との結合
について、既知のKDEL受容体リガンドまたはKDEL受容体インヒビターと競合する
能力を調べうる。限定を意図しない特定の実施例として、推定インヒビターが、
KDEL受容体との結合について、KDELr受容体タンパク質（前章に記載）と競合す
る能力を測定しうる。そのようなin vitroでの試験は、細胞内と同様の条件下で
行なうことが望ましい（例えばWilsonら, 1993, J. Biol. Chem. 268:7465-7468
参照）。KDEL受容体の適切な供与源は、ラット肝臓またはerd2受容体を発現する
COS細胞から調製されたゴルジ膜などである。推定上のインヒビターがin vitro
でKDEL受容体インヒビターとして機能するようであれば、KDEL受容体の機能を阻
害する能力がin vivoでは更に認められるであろう。
【００３８】
上述のように、KDEL受容体インヒビターは、本来はKDEL受容体の作用によって
細胞に保持される傾向があるタンパク質を、当該タンパク質の分泌が望まれると
きにその分泌を増加させるのに用いられる。タンパク質の分泌増加が有利な状況
とは、 (i)遺伝子工学により、タンパク質（以下「外来タンパク質」とよぶ）をコード
する遺伝子が細胞に導入され、その外来タンパク質の分泌が望ましいものである
場合（例えば、限定を意図しない特定の例として、外来タンパク質が熱ショック
タンパク質である場合）、および (ii)遺伝子工学によって導入されたものではなく、自然にまたは伝染病や悪性腫
瘍などの病気が進行した結果として細胞内に存在するタンパク質（天然の熱ショ
ックタンパク質またはウイルス性タンパク質など）（以下、「内因性タンパク質
」とよぶ）の分泌を増加させることが望ましい場合。
細胞に保持される傾向があるタンパク質を、当該タンパク質の分泌が望まれると
きにその分泌を増加させるのに用いられる。タンパク質の分泌増加が有利な状況
とは、 (i)遺伝子工学により、タンパク質（以下「外来タンパク質」とよぶ）をコード
する遺伝子が細胞に導入され、その外来タンパク質の分泌が望ましいものである
場合（例えば、限定を意図しない特定の例として、外来タンパク質が熱ショック
タンパク質である場合）、および (ii)遺伝子工学によって導入されたものではなく、自然にまたは伝染病や悪性腫
瘍などの病気が進行した結果として細胞内に存在するタンパク質（天然の熱ショ
ックタンパク質またはウイルス性タンパク質など）（以下、「内因性タンパク質
」とよぶ）の分泌を増加させることが望ましい場合。
【００３９】
従って、本発明は外来または内因性タンパク質の細胞による分泌を増加させる
方法を提供する。ここで、タンパク質はKDEL受容体に結合するリガンド配列を含
み、該方法はKDEL受容体インヒビターの不在下での細胞からのタンパク質分泌よ
りも、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる濃度のKDEL受容体インヒビター
に細胞をさらすことを含んでなる。
方法を提供する。ここで、タンパク質はKDEL受容体に結合するリガンド配列を含
み、該方法はKDEL受容体インヒビターの不在下での細胞からのタンパク質分泌よ
りも、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる濃度のKDEL受容体インヒビター
に細胞をさらすことを含んでなる。
【００４０】
限定を意図しない一連の実施形態として、外来タンパク質の分泌が望ましい場
合、外来タンパク質およびKDELrインヒビタータンパク質の両方をコードする核
酸（同一または異なる核酸構築物の一部として）を細胞に導入しうる。本発明の
特定の実施形態によると、２個の異なる構築物（目的のタンパク質をコードする
構築物およびKDELrインヒビタータンパク質をコードする構築物）を導入して、
目的のタンパク質の分泌を、より正確に特定の細胞または組織のサブセットに対
して行なうことができる（すなわち、導入されたタンパク質は、両方の構築物が
存在する場合に選択的に分泌される）。関連する実施形態において、目的のタン
パク質および／またはKDELrインヒビタータンパク質をコードする核酸は、組織
特異的または誘導可能なプロモーター／エンハンサー因子の制御下に置くことが
できる。
合、外来タンパク質およびKDELrインヒビタータンパク質の両方をコードする核
酸（同一または異なる核酸構築物の一部として）を細胞に導入しうる。本発明の
特定の実施形態によると、２個の異なる構築物（目的のタンパク質をコードする
構築物およびKDELrインヒビタータンパク質をコードする構築物）を導入して、
目的のタンパク質の分泌を、より正確に特定の細胞または組織のサブセットに対
して行なうことができる（すなわち、導入されたタンパク質は、両方の構築物が
存在する場合に選択的に分泌される）。関連する実施形態において、目的のタン
パク質および／またはKDELrインヒビタータンパク質をコードする核酸は、組織
特異的または誘導可能なプロモーター／エンハンサー因子の制御下に置くことが
できる。
【００４１】
限定を意図しない実施形態の第２連において、内因性タンパク質の分泌が望ま
しい場合、KDEL受容体インヒビター（例えばKDELrインヒビタータンパク質）を
、KDEL受容体インヒビターそのものを投与するかKDELrインヒビタータンパク質
をコードする核酸を介して、内因性タンパク質の分泌が必要な被験者の細胞に導
入しうる。そのような実施形態の例として、熱ショックタンパク質は抗原ペプチ
ドに結合して、結合ペプチドに対する免疫応答を誘導する複合体を形成すること
が知られている。ある熱ショックタンパク質はKDEL受容体システム(BiPおよびgp
96など)を介して小胞体に選択的に保持される傾向があるので、本発明を用いて
抗原性熱ショックタンパク質複合体の分泌を促進し、それにより標的抗原に対す
る免疫応答を誘導または増加させうる。標的抗原は、肉腫、リンパ腫、白血病、
黒色腫、胸癌、前立腺癌、卵巣癌、頸部癌、子宮癌、結腸癌、肺癌、膠芽細胞腫
および星状細胞腫などの腫瘍形成に関連した抗原、p53などの欠損癌抑制遺伝子
に関連した抗原、ras, src, erbB, fos, ablおよびmycなどの癌遺伝子に関連し
た抗原、バクテリア、ウイルス、原生動物、マイコプラズマ、菌類、酵母、寄生
虫またはプリオンにより引き起こされる感染病に関連した抗原、およびアレルギ
ーまたは自己免疫疾患に関連した抗原など、感染病または癌に関連している。感
染病に関連した抗原の供与源は、例えばヒト乳頭腫（以下参照）、単純ヘルペス
や帯状ヘルペスなどのヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１または２など
のレトロウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、
呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、肺炎マイコプ
ラズマ、サルモネラ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、エンテロコッカス属、クロ
ストリジウム属、エシェリキア属、クレブシエラ属、ビブリオ属またはミコバク
テリウム属などの細菌属、およびアメーバ、マラリア性パラサイトなどの原生動
物、およびクルーズトリパノソーマなどであるが、これらに限定されない。
しい場合、KDEL受容体インヒビター（例えばKDELrインヒビタータンパク質）を
、KDEL受容体インヒビターそのものを投与するかKDELrインヒビタータンパク質
をコードする核酸を介して、内因性タンパク質の分泌が必要な被験者の細胞に導
入しうる。そのような実施形態の例として、熱ショックタンパク質は抗原ペプチ
ドに結合して、結合ペプチドに対する免疫応答を誘導する複合体を形成すること
が知られている。ある熱ショックタンパク質はKDEL受容体システム(BiPおよびgp
96など)を介して小胞体に選択的に保持される傾向があるので、本発明を用いて
抗原性熱ショックタンパク質複合体の分泌を促進し、それにより標的抗原に対す
る免疫応答を誘導または増加させうる。標的抗原は、肉腫、リンパ腫、白血病、
黒色腫、胸癌、前立腺癌、卵巣癌、頸部癌、子宮癌、結腸癌、肺癌、膠芽細胞腫
および星状細胞腫などの腫瘍形成に関連した抗原、p53などの欠損癌抑制遺伝子
に関連した抗原、ras, src, erbB, fos, ablおよびmycなどの癌遺伝子に関連し
た抗原、バクテリア、ウイルス、原生動物、マイコプラズマ、菌類、酵母、寄生
虫またはプリオンにより引き起こされる感染病に関連した抗原、およびアレルギ
ーまたは自己免疫疾患に関連した抗原など、感染病または癌に関連している。感
染病に関連した抗原の供与源は、例えばヒト乳頭腫（以下参照）、単純ヘルペス
や帯状ヘルペスなどのヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１または２など
のレトロウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、
呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、肺炎マイコプ
ラズマ、サルモネラ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、エンテロコッカス属、クロ
ストリジウム属、エシェリキア属、クレブシエラ属、ビブリオ属またはミコバク
テリウム属などの細菌属、およびアメーバ、マラリア性パラサイトなどの原生動
物、およびクルーズトリパノソーマなどであるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明によると、標的抗原として機能するヒト乳頭腫ウイルス抗原性ペプチド
の限定を意図しない特定の例は、 である。
の限定を意図しない特定の例は、 である。
【００４３】
従って、本発明は熱ショックタンパク質／抗原性ペプチド複合体の細胞からの
放出を促進する方法に関する。ここで、熱ショックタンパク質はKDEL受容体に結
合するリガンド配列を含み、該方法はKDEL受容体インヒビターの不在下での細胞
からの複合体の分泌よりも、細胞からの複合体の分泌を増加させる濃度のKDEL受
容体インヒビターに細胞をさらすことを含んでなる。KDEL受容体インヒビターが
タンパク質である場合、それはタンパク質としてもしくはKDELrインヒビタータ
ンパク質をコードする核酸として（限定はされないが、被験者にKDELrインヒビ
タータンパク質をコードする「裸(naked) DNA」を投与することによる手法を含
む「遺伝子ワクチン接種技術」を用いて）投与されうる。
放出を促進する方法に関する。ここで、熱ショックタンパク質はKDEL受容体に結
合するリガンド配列を含み、該方法はKDEL受容体インヒビターの不在下での細胞
からの複合体の分泌よりも、細胞からの複合体の分泌を増加させる濃度のKDEL受
容体インヒビターに細胞をさらすことを含んでなる。KDEL受容体インヒビターが
タンパク質である場合、それはタンパク質としてもしくはKDELrインヒビタータ
ンパク質をコードする核酸として（限定はされないが、被験者にKDELrインヒビ
タータンパク質をコードする「裸(naked) DNA」を投与することによる手法を含
む「遺伝子ワクチン接種技術」を用いて）投与されうる。
【００４４】
関連の実施形態において、本発明は更に、KDEL受容体インヒビターの有効量を
投与することを含んでなる、標的抗原に対する免疫応答を誘導または増加させる
方法を提供する。ここで、標的抗原は熱ショックタンパク質と複合体を形成し、
その熱ショックタンパク質はKDEL受容体に結合するリガンド配列を含む。標的抗
原は内因性抗原でもよいし、コードする核酸またはペプチドの形態で導入しても
よい。同様に、熱ショックタンパク質は内因性熱ショックタンパク質でもよいし
、遺伝子治療技術により導入してもよい。
投与することを含んでなる、標的抗原に対する免疫応答を誘導または増加させる
方法を提供する。ここで、標的抗原は熱ショックタンパク質と複合体を形成し、
その熱ショックタンパク質はKDEL受容体に結合するリガンド配列を含む。標的抗
原は内因性抗原でもよいし、コードする核酸またはペプチドの形態で導入しても
よい。同様に、熱ショックタンパク質は内因性熱ショックタンパク質でもよいし
、遺伝子治療技術により導入してもよい。
【００４５】
限定を意図しない特定の実施形態において、本発明は、KDEL受容体インヒビタ
ーの使用を必要とする被験者の免疫性を高めるのに用いうるKDEL受容体インヒビ
ターの使用を記載する。実施例には遺伝子的疾病素質または発癌物質の曝露によ
り癌を発現する危険性のある被験者か、または易感染性免疫系および／または病
原体の曝露により感染病を発現する危険性のある被験者が含まれる。抗原が同定
されていない状況下では、免疫は内因性抗原に対して誘導されうる。標的抗原が
既知のものである場合、KDEL受容体インヒビターは標的抗原と共に投与され、い
ずれかの標準的経路（例えば皮下、筋内、鼻腔内など）により投与するワクチン
に含まれうる。経口投与されたKDEL受容体インヒビターは特に効果的である。
ーの使用を必要とする被験者の免疫性を高めるのに用いうるKDEL受容体インヒビ
ターの使用を記載する。実施例には遺伝子的疾病素質または発癌物質の曝露によ
り癌を発現する危険性のある被験者か、または易感染性免疫系および／または病
原体の曝露により感染病を発現する危険性のある被験者が含まれる。抗原が同定
されていない状況下では、免疫は内因性抗原に対して誘導されうる。標的抗原が
既知のものである場合、KDEL受容体インヒビターは標的抗原と共に投与され、い
ずれかの標準的経路（例えば皮下、筋内、鼻腔内など）により投与するワクチン
に含まれうる。経口投与されたKDEL受容体インヒビターは特に効果的である。
【００４６】
KDEL受容体インヒビターの全身投与は、通常は小胞体に保持されているタンパ
ク質の広範囲に及ぶ放出を短期に誘導すると思われているため、短い半減期を有
するKDEL受容体インヒビターを、毒作用が最小限にとどまる間隔（限定はされな
いが、例えば1ヶ月で2週間に1度）で投与することが望ましい。あるいは、KDEL
受容体インヒビターは、内因性抗原（例えば、悪性腫瘍または感染組織）を含む
部位、または外来抗原を含む部位（限定はされないが、標的抗原をコードする核
酸が投与された部位）に局部的に投与しうる。
ク質の広範囲に及ぶ放出を短期に誘導すると思われているため、短い半減期を有
するKDEL受容体インヒビターを、毒作用が最小限にとどまる間隔（限定はされな
いが、例えば1ヶ月で2週間に1度）で投与することが望ましい。あるいは、KDEL
受容体インヒビターは、内因性抗原（例えば、悪性腫瘍または感染組織）を含む
部位、または外来抗原を含む部位（限定はされないが、標的抗原をコードする核
酸が投与された部位）に局部的に投与しうる。
【００４７】
本発明は更に、外来KDELrインヒビタータンパク質（動物体内に通常存在して
いる、KDELを有するタンパク質とは異なる）をコードし、プロモーター配列に機
能しうる形で連結された核酸を全細胞または分集団(subpopulation)に導入遺伝
子として有する、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。限定を意図しない
本発明の好ましい実施形態において、該プロモーターは誘導プロモーターである
。そのようなトランスジェニック動物は、内因性または外来的に導入された目的
のタンパク質の分泌を促進する効果を調べるのに用いられうる。
いる、KDELを有するタンパク質とは異なる）をコードし、プロモーター配列に機
能しうる形で連結された核酸を全細胞または分集団(subpopulation)に導入遺伝
子として有する、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。限定を意図しない
本発明の好ましい実施形態において、該プロモーターは誘導プロモーターである
。そのようなトランスジェニック動物は、内因性または外来的に導入された目的
のタンパク質の分泌を促進する効果を調べるのに用いられうる。
【００４８】
KDEL受容体についてのリガンド配列を含むタンパク質を商業的に生産する場合
、本発明のKDEL受容体インヒビターは、該タンパク質の分泌を促進し、その製造
を容易にするのに用いられうる。
、本発明のKDEL受容体インヒビターは、該タンパク質の分泌を促進し、その製造
を容易にするのに用いられうる。
【００４９】
従って、本発明はKDEL受容体インヒビターを含む組成物、またはKDEL受容体を
コードする核酸を、適切な製剤担体の形で提供する。そのような組成物は、標的
抗原または標的抗原をコードする核酸、細胞内で処理されて標的抗原を生じる標
的抗原の前駆体、熱ショックタンパク質をコードする核酸、インターロイキン２
および／またはαインターフェロンなど免疫系の活性を促進するサイトカイン、
および／またはモネンシンなどタンパク質の分泌を促進する試薬を更に含む。 具体的説明の目的においてのみ、限定を意図しない本発明の特定の実施形態を
以下のように実行する。
コードする核酸を、適切な製剤担体の形で提供する。そのような組成物は、標的
抗原または標的抗原をコードする核酸、細胞内で処理されて標的抗原を生じる標
的抗原の前駆体、熱ショックタンパク質をコードする核酸、インターロイキン２
および／またはαインターフェロンなど免疫系の活性を促進するサイトカイン、
および／またはモネンシンなどタンパク質の分泌を促進する試薬を更に含む。 具体的説明の目的においてのみ、限定を意図しない本発明の特定の実施形態を
以下のように実行する。
【００５０】1. リコンビナントrCOMP-KDELrインヒビタータンパク質の発現および精製
図１Aに示す構築物を用いてT7プロモーターの制御下で調製された、pet 11由
来のプラスミドによりコードされたラットCOMP-KDELrインヒビタータンパク質は
、Efimovら, 1994, FEBS Letts. 341:54-58に記載の方法で、E. Coli BL21 (DE3
)細胞において発現しうる。ベクターを含有する細菌をシェーカーフラスコにお
いて37℃でおよそ0.5-0.6のOD600まで培養し、培養物１リットルあたり1.0 mMイ
ソプロピルβ-D-チオガラクトシドを添加してタンパク質合成を誘導しうる。更
におよそ4時間30℃で培養した後、細菌細胞を8000×gで15分間4℃で遠心分離し
て取り出す。次に、細菌ペレットを0.1mg/mlリゾチームを含有する20ml TEバッ
ファー(20mMトリスHCl, pH 8.0, 1mM EDTA)中で再懸濁して、25℃または室温で3
0分間インキュベートする。あるいは、細菌細胞をEmulsiflex C-5 (Avestin社、
オンタリオ、カナダ)などの細胞破砕機を用いて溶解しうる。生じた細胞溶解物
を0.1 mg/ml DNAase Iを用いて15分間25℃（室温）でインキュベートし、23,000
×gで15分間4℃で遠心分離して不溶物を除去する。これらの条件は、続いて行う
遠心分離にも用いうる。30％ w/v硫酸ストレプトマイシン溶液2ミリリットルを
、得られた上清と混合し、その混合物を氷上で15分間インキュベートしうる。得
られた沈殿物を遠心分離によって除去し、硫安を上清におよそ36％の飽和率まで
添加しうる。該溶液を氷上で15分間インキュベートして、硫安／タンパク質の沈
殿物を生成する。次に、硫安／タンパク質の沈殿物を上述の遠心分離によって回
収しうる。遠心分離によって得られたペレットを、2ml TEバッファーに再懸濁し
て、10mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)で平衡化しておいた10mlヒドロキシルアパタ
イトカラム(BioRad社, DNA grade)に加えた。段階的にリン酸濃度を増加させた
プレ−平衡化用のバッファーでカラムを洗浄し、リコンビナントrCOMP-KDELrイ
ンヒビタータンパク質を主に含有していると予測される溶出タンパク質フラクシ
ョンを回収する。同じような方法を用いて、15B CHO細胞または昆虫細胞で発現
するKDELrインヒビタータンパク質を精製しうる。
来のプラスミドによりコードされたラットCOMP-KDELrインヒビタータンパク質は
、Efimovら, 1994, FEBS Letts. 341:54-58に記載の方法で、E. Coli BL21 (DE3
)細胞において発現しうる。ベクターを含有する細菌をシェーカーフラスコにお
いて37℃でおよそ0.5-0.6のOD600まで培養し、培養物１リットルあたり1.0 mMイ
ソプロピルβ-D-チオガラクトシドを添加してタンパク質合成を誘導しうる。更
におよそ4時間30℃で培養した後、細菌細胞を8000×gで15分間4℃で遠心分離し
て取り出す。次に、細菌ペレットを0.1mg/mlリゾチームを含有する20ml TEバッ
ファー(20mMトリスHCl, pH 8.0, 1mM EDTA)中で再懸濁して、25℃または室温で3
0分間インキュベートする。あるいは、細菌細胞をEmulsiflex C-5 (Avestin社、
オンタリオ、カナダ)などの細胞破砕機を用いて溶解しうる。生じた細胞溶解物
を0.1 mg/ml DNAase Iを用いて15分間25℃（室温）でインキュベートし、23,000
×gで15分間4℃で遠心分離して不溶物を除去する。これらの条件は、続いて行う
遠心分離にも用いうる。30％ w/v硫酸ストレプトマイシン溶液2ミリリットルを
、得られた上清と混合し、その混合物を氷上で15分間インキュベートしうる。得
られた沈殿物を遠心分離によって除去し、硫安を上清におよそ36％の飽和率まで
添加しうる。該溶液を氷上で15分間インキュベートして、硫安／タンパク質の沈
殿物を生成する。次に、硫安／タンパク質の沈殿物を上述の遠心分離によって回
収しうる。遠心分離によって得られたペレットを、2ml TEバッファーに再懸濁し
て、10mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)で平衡化しておいた10mlヒドロキシルアパタ
イトカラム(BioRad社, DNA grade)に加えた。段階的にリン酸濃度を増加させた
プレ−平衡化用のバッファーでカラムを洗浄し、リコンビナントrCOMP-KDELrイ
ンヒビタータンパク質を主に含有していると予測される溶出タンパク質フラクシ
ョンを回収する。同じような方法を用いて、15B CHO細胞または昆虫細胞で発現
するKDELrインヒビタータンパク質を精製しうる。
【００５１】
組換えにより発現したタンパク質のオリゴマー形成は、Efimovら, 1994, FEBS
Letts. 341:54-58に記載の方法を用いて、以下のようにして実行しうる。精製
されたKDELrインヒビタータンパク質を、100倍過剰モル濃度のジチオスレイトー
ル（DTT）を用いて30分間37℃でインキュベートすることによって、実質的に（
好ましくは完全に）還元し、50％硫安を用いて沈殿させて上述の通り遠心分離し
うる。得られたペレットを0.2MトリスHCl, pH 8.8, 0.2M NaCl, 1mM EDTA中に再
懸濁して、最終タンパク質濃度を1.5 mg/mLにしうる。タンパク質は、酸化およ
び還元グルタチオンを添加することにより室温で酸化し、最終濃度を14時間にわ
たってそれぞれ10mMおよび2mMにしうる。続いて、酸化タンパク質はHPLCまたは
透析法によりグルタチオンから分離しうる。適正に折りたたまれた五量体は、C4
カラムで逆相クロマトグラフィーによっても精製されうる。
Letts. 341:54-58に記載の方法を用いて、以下のようにして実行しうる。精製
されたKDELrインヒビタータンパク質を、100倍過剰モル濃度のジチオスレイトー
ル（DTT）を用いて30分間37℃でインキュベートすることによって、実質的に（
好ましくは完全に）還元し、50％硫安を用いて沈殿させて上述の通り遠心分離し
うる。得られたペレットを0.2MトリスHCl, pH 8.8, 0.2M NaCl, 1mM EDTA中に再
懸濁して、最終タンパク質濃度を1.5 mg/mLにしうる。タンパク質は、酸化およ
び還元グルタチオンを添加することにより室温で酸化し、最終濃度を14時間にわ
たってそれぞれ10mMおよび2mMにしうる。続いて、酸化タンパク質はHPLCまたは
透析法によりグルタチオンから分離しうる。適正に折りたたまれた五量体は、C4
カラムで逆相クロマトグラフィーによっても精製されうる。
【００５２】
KDELrインヒビタータンパク質はJaenickeおよびRudolph, 1989, Creightonら,
Protein Structure: a practical approach. IRL Press Oxford, pp. 208-209
に記載された方法によってオリゴマー形成しうる。ここで、該タンパク質はまず
0.1M DTT, 6M塩酸グアニジン, 1mM EDTAおよび0.1MトリスHCl, pH 8.3で2時間イ
ンキュベートして還元し、0.01M HClに対して4℃で一晩酸性化して透析し、0.3
mMシスチンおよび3mMシステイン、1mM EDTAおよび0.1MトリスHCL, pH8.3を含有
するオキシドシャフリングシステムにおいておよそ16時間16℃で再びフォールデ
ィングしうる。続いて、タンパク質はHPLCにより精製され、凍結乾燥して4℃で
保存しうる。
Protein Structure: a practical approach. IRL Press Oxford, pp. 208-209
に記載された方法によってオリゴマー形成しうる。ここで、該タンパク質はまず
0.1M DTT, 6M塩酸グアニジン, 1mM EDTAおよび0.1MトリスHCl, pH 8.3で2時間イ
ンキュベートして還元し、0.01M HClに対して4℃で一晩酸性化して透析し、0.3
mMシスチンおよび3mMシステイン、1mM EDTAおよび0.1MトリスHCL, pH8.3を含有
するオキシドシャフリングシステムにおいておよそ16時間16℃で再びフォールデ
ィングしうる。続いて、タンパク質はHPLCにより精製され、凍結乾燥して4℃で
保存しうる。
【００５３】2.KDEL受容体インヒビターがKDEL受容体に結合する能力の試験
本発明のKDEL受容体インヒビターがKDEL受容体に結合する能力を、アルカリ洗
浄されたゴルジ膜を用いてin vitroで試験しうる。そのような膜は屠殺したばか
りのラットの肝臓から、TabasおよびKornfeld, 1979, J. Biol. Chem. 254:1165
5-11663に記載の方法により調製するか、またはerd2受容体をゴルジ膜で発現す
る培養細胞から調製しうる。例えば、取り出された肝臓または培養細胞をダウン
ス（dounce）し、それを用いて1500×gの核を除去した上清を調製し、100,000×
gで回転させて粗膜分画を回収しうる。次に、得られた粗膜を100mM Na2Co3を用
いて4℃で洗浄し、100,000×gで遠心分離してペレット化し、続いて10mM HEPES-
KOH, pH 7.5中に再懸濁してアルカリ洗浄されたゴルジ膜を調製しうる。
浄されたゴルジ膜を用いてin vitroで試験しうる。そのような膜は屠殺したばか
りのラットの肝臓から、TabasおよびKornfeld, 1979, J. Biol. Chem. 254:1165
5-11663に記載の方法により調製するか、またはerd2受容体をゴルジ膜で発現す
る培養細胞から調製しうる。例えば、取り出された肝臓または培養細胞をダウン
ス（dounce）し、それを用いて1500×gの核を除去した上清を調製し、100,000×
gで回転させて粗膜分画を回収しうる。次に、得られた粗膜を100mM Na2Co3を用
いて4℃で洗浄し、100,000×gで遠心分離してペレット化し、続いて10mM HEPES-
KOH, pH 7.5中に再懸濁してアルカリ洗浄されたゴルジ膜を調製しうる。
【００５４】
次に、アルカリで洗浄されたゴルジ膜を用いて、Wilsonら, 1993, J. Biol. C
hem. 268:7465-7468に記載されたように結合アッセイし、推定上のKDEL受容体イ
ンヒビターがerd2 (KDEL) 受容体に結合するかを調べた。推定上のKDEL受容体イ
ンヒビターがerd 2受容体に結合する能力は、該インヒビターが、Tyr-Thr-Ser-G
lu-Lys-Asp-Glu-Leu（配列番号３１）またはLeu-Asn-Tyr-Phe-Asp- Asp-Glu-Leu
（配列番号３２）などの、受容体結合について検出できるように標識されたerd
2受容体に結合するペプチドと競合する能力を測定することによって調べうる。
そのようなペプチドは、例えば、[123I]ヨウ化物の1mCiを用いて、急冷した2.4
mg/mlクロラミンT（BDH Chemicals, Ltd.）の存在下で１分間インキュベートす
ることにより放射性ヨウ化し、該ヨウ化ペプチドはHarlowおよびLane, 1988, An
tibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Har
bor, NY.に記載されたようにSephadex G-10カラム(Pharmacia社)上で分離されう
る。結合アッセイバッファーは20mM NaCl, 250 mg/mlウシ血清アルブミン、50mM
ナトリウムまたはカリウムカコジル酸塩またはクエン酸塩、pH5.0-5.5、MES (2-
[N-morpholino]エタンスルホン酸)または琥珀酸塩およびPIPES(ピペラジン-N, N
’-bis[2-エタンスルホン酸]を同じモル濃度で混合した混合物を含みうる。様々
な濃度の推定上のKDEL受容体インヒビター、膜プロテインの総量（例えば0.5-1.
0μg）、放射線標識されたペプチド（例えば1×105cpmを有する0.1-0.5 ngペプ
チド）および2-4%w/vでアルカリ洗浄されたゴルジ膜を、（例えば25μl）結合ア
ッセイバッファーでおよそ20分間4℃でインキュベートして、microfuge（およそ
15,800×gで）５分間４℃で遠心分離し、ペレットに存在する標識ペプチドの量
を測定しうる。推定上のKDEL受容体インヒビターの濃度上昇に伴って、標識ペプ
チド結合の減少が観察されたことにより、推定上のKDEL受容体インヒビターがer
d 2受容体に結合していることが示される。
hem. 268:7465-7468に記載されたように結合アッセイし、推定上のKDEL受容体イ
ンヒビターがerd2 (KDEL) 受容体に結合するかを調べた。推定上のKDEL受容体イ
ンヒビターがerd 2受容体に結合する能力は、該インヒビターが、Tyr-Thr-Ser-G
lu-Lys-Asp-Glu-Leu（配列番号３１）またはLeu-Asn-Tyr-Phe-Asp- Asp-Glu-Leu
（配列番号３２）などの、受容体結合について検出できるように標識されたerd
2受容体に結合するペプチドと競合する能力を測定することによって調べうる。
そのようなペプチドは、例えば、[123I]ヨウ化物の1mCiを用いて、急冷した2.4
mg/mlクロラミンT（BDH Chemicals, Ltd.）の存在下で１分間インキュベートす
ることにより放射性ヨウ化し、該ヨウ化ペプチドはHarlowおよびLane, 1988, An
tibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Har
bor, NY.に記載されたようにSephadex G-10カラム(Pharmacia社)上で分離されう
る。結合アッセイバッファーは20mM NaCl, 250 mg/mlウシ血清アルブミン、50mM
ナトリウムまたはカリウムカコジル酸塩またはクエン酸塩、pH5.0-5.5、MES (2-
[N-morpholino]エタンスルホン酸)または琥珀酸塩およびPIPES(ピペラジン-N, N
’-bis[2-エタンスルホン酸]を同じモル濃度で混合した混合物を含みうる。様々
な濃度の推定上のKDEL受容体インヒビター、膜プロテインの総量（例えば0.5-1.
0μg）、放射線標識されたペプチド（例えば1×105cpmを有する0.1-0.5 ngペプ
チド）および2-4%w/vでアルカリ洗浄されたゴルジ膜を、（例えば25μl）結合ア
ッセイバッファーでおよそ20分間4℃でインキュベートして、microfuge（およそ
15,800×gで）５分間４℃で遠心分離し、ペレットに存在する標識ペプチドの量
を測定しうる。推定上のKDEL受容体インヒビターの濃度上昇に伴って、標識ペプ
チド結合の減少が観察されたことにより、推定上のKDEL受容体インヒビターがer
d 2受容体に結合していることが示される。
【００５５】3. rCOMP/KDELrインヒビタータンパク質の腫瘍細胞への導入
切断可能なシグナルペプチド（マウス熱ショックタンパク質BiP由来のシグナ
ルペプチドなど）を、ラットCOMP五量体形成ドメインおよびそれに続くラクダIg
Gドメインの５’末端に連結したものをコードする部分的遺伝子構築物の375塩基
対Hind III-Xho I断片（図１A参照）は、（例えばOligos, Etc., Inc., Oregon
などの市販品を用いて）合成しうる。得られたフラグメントを、Hind III-Xho I
制限部位を用いて標準の技術（例えばSambrookら, 1990, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY参照)に
よりpCDNA3などの哺乳類の発現ベクターにクローン化してTOP10F’competent ce
ll（InVitrogen, Incから入手可能）に形質転換した。得られたプラスミドの配
列、rCOMP/pCDNA3は、Sequenase2.0(United States Biochemical社)を用いてジ
デオキシ塩基配列決定法により確認しうる(Sangerら, 1977, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 74:5463-5467)。
ルペプチドなど）を、ラットCOMP五量体形成ドメインおよびそれに続くラクダIg
Gドメインの５’末端に連結したものをコードする部分的遺伝子構築物の375塩基
対Hind III-Xho I断片（図１A参照）は、（例えばOligos, Etc., Inc., Oregon
などの市販品を用いて）合成しうる。得られたフラグメントを、Hind III-Xho I
制限部位を用いて標準の技術（例えばSambrookら, 1990, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY参照)に
よりpCDNA3などの哺乳類の発現ベクターにクローン化してTOP10F’competent ce
ll（InVitrogen, Incから入手可能）に形質転換した。得られたプラスミドの配
列、rCOMP/pCDNA3は、Sequenase2.0(United States Biochemical社)を用いてジ
デオキシ塩基配列決定法により確認しうる(Sangerら, 1977, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 74:5463-5467)。
【００５６】
次に、72塩基対の２本鎖のKDEL含有オリゴヌクレオチドを、Kpn I-Eco R1制限
エンドヌクレアーゼ部位（図１A参照）を用いて、rCOMP-pCDNA3の3’末端でアニ
ールして、rCOMP-KDELrインヒビター/pCDNA3を生成しうる。続いて、この構築物
はジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法により確認しうる。
エンドヌクレアーゼ部位（図１A参照）を用いて、rCOMP-pCDNA3の3’末端でアニ
ールして、rCOMP-KDELrインヒビター/pCDNA3を生成しうる。続いて、この構築物
はジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法により確認しうる。
【００５７】
次に、rCOMP-KDELrインヒビター／pCDNA3の構築物は、例えばCMS-5などの腫瘍
細胞株で発現されうる。CMS-5はメチルコラントレンに誘導されたBALB/c起源の
繊維肉腫で、ウイルス抗原の欠如が示されている(DeLeoら, 1977, J. Exp. Med.
146:720-734)。CMS-5細胞は培養して10%ウシ胎仔血清(FCS)を添加したDMEM培地
(Gibco Life Technologies, Inc.)で増殖しうる。製造元の指示(Gibco-BRL Life
Technologies社)に従い、リポフェクトアミンを用いてトランスフェクションし
うる。簡潔には、cDNA 2μgおよびリポフェクトアミン6μLを100μLの無血清培
地(OPTI-MEM(登録商標) I Reduced Serum medium, Gibco-BRL Life Technologie
s社)で別々に希釈する。次に、これら２種類の溶液を混合して室温でおよそ45分
間インキュベートしてDNA／リポソーム複合体を形成しうる。得られた複合体にO
PTI-MEM(登録商標) 800μLを加えて混合し、洗浄した細胞にかぶせた。およそ６
時間37℃でインキュベートした後、20% FCSを含有する増殖培地１ミリリットル
を添加しうる。トランスフェクションから24時間後、新鮮な培地を細胞に添加し
うる。72時間後、細胞に800μg/mlのgeneticin (Gibco-BRL Life Technologies
社)を細胞に添加することにより、安定性のあるクローンを選択しうる。選択培
地はおよそ３日毎に取り替えうる。安定してトランスフェクトされた細胞のコロ
ニーをスクリーニングして、ウシCOMPに対して生じた抗血清を用いて、rCOMP/KD
ELrインヒビタータンパク質が発現しうる(Hedbomら, 1992, J. Biol. Chem. 264 :6898-6905)。この抗体は非還元および還元的条件下のどちらにおいても、ラッ
トCOMPを染色することが示された(Morgelinら, 1992, J. Biol. Chem. 267:6137
-6141)。
細胞株で発現されうる。CMS-5はメチルコラントレンに誘導されたBALB/c起源の
繊維肉腫で、ウイルス抗原の欠如が示されている(DeLeoら, 1977, J. Exp. Med.
146:720-734)。CMS-5細胞は培養して10%ウシ胎仔血清(FCS)を添加したDMEM培地
(Gibco Life Technologies, Inc.)で増殖しうる。製造元の指示(Gibco-BRL Life
Technologies社)に従い、リポフェクトアミンを用いてトランスフェクションし
うる。簡潔には、cDNA 2μgおよびリポフェクトアミン6μLを100μLの無血清培
地(OPTI-MEM(登録商標) I Reduced Serum medium, Gibco-BRL Life Technologie
s社)で別々に希釈する。次に、これら２種類の溶液を混合して室温でおよそ45分
間インキュベートしてDNA／リポソーム複合体を形成しうる。得られた複合体にO
PTI-MEM(登録商標) 800μLを加えて混合し、洗浄した細胞にかぶせた。およそ６
時間37℃でインキュベートした後、20% FCSを含有する増殖培地１ミリリットル
を添加しうる。トランスフェクションから24時間後、新鮮な培地を細胞に添加し
うる。72時間後、細胞に800μg/mlのgeneticin (Gibco-BRL Life Technologies
社)を細胞に添加することにより、安定性のあるクローンを選択しうる。選択培
地はおよそ３日毎に取り替えうる。安定してトランスフェクトされた細胞のコロ
ニーをスクリーニングして、ウシCOMPに対して生じた抗血清を用いて、rCOMP/KD
ELrインヒビタータンパク質が発現しうる(Hedbomら, 1992, J. Biol. Chem. 264 :6898-6905)。この抗体は非還元および還元的条件下のどちらにおいても、ラッ
トCOMPを染色することが示された(Morgelinら, 1992, J. Biol. Chem. 267:6137
-6141)。
【００５８】
この方法によって生産された、安定的にトランスフェクトされた腫瘍細胞は、
多くの手段に利用されうる。例えば、通常はKDEL受容体によって保持されている
特定のタンパク質の分泌増加が、細胞の腫瘍形成に影響を及ぼすかどうか調べる
ために用いうる。限定を意図しない１つの特定実施例において、それらを用いて
、内因性熱ショックタンパク質の分泌が増加したか、またその増加した内因性タ
ンパク質の分泌が、細胞の腫瘍形成を減少させたかを調べうる（例えば、上述の
安定的にトランスフェクトされたCMS-5細胞はCB6F-1/Jマウスに接種しうる）。
限定を意図しない、他の特定実施例において、安定的にトランスフェクトされた
腫瘍細胞は、外来タンパク質をコードする核酸を用いて更にトランスフェクトす
ることができ、腫瘍細胞による外来タンパク質の分泌の増加が腫瘍形成を減少さ
せたか調べうる。
多くの手段に利用されうる。例えば、通常はKDEL受容体によって保持されている
特定のタンパク質の分泌増加が、細胞の腫瘍形成に影響を及ぼすかどうか調べる
ために用いうる。限定を意図しない１つの特定実施例において、それらを用いて
、内因性熱ショックタンパク質の分泌が増加したか、またその増加した内因性タ
ンパク質の分泌が、細胞の腫瘍形成を減少させたかを調べうる（例えば、上述の
安定的にトランスフェクトされたCMS-5細胞はCB6F-1/Jマウスに接種しうる）。
限定を意図しない、他の特定実施例において、安定的にトランスフェクトされた
腫瘍細胞は、外来タンパク質をコードする核酸を用いて更にトランスフェクトす
ることができ、腫瘍細胞による外来タンパク質の分泌の増加が腫瘍形成を減少さ
せたか調べうる。
【００５９】
さまざまな参考文献を本明細書中で引用したが、それらの要旨はそのまま参考
として本明細書中にとり入れるものとする。
として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
図１(A)は、(i)切断シグナルペプチド（実施例ではマウスBiP由来）、
(ii)ラット軟骨オリゴマー型マトリックスタンパク質(COMP)のオリゴマー形成ド
メイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示された構築物によってコードされたKDEL受容体インヒビタータンパ
ク質のアミノ酸配列（１文字表記）（配列番号１３）であり、切断リーダー／シ
グナルペプチド（下線）およびリンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配
列GDLA（ラットCOMP由来）、ラットCOMP五量体形成ドメイン（上線）およびラク
ダIgGリンカードメイン（下線および上線）がKDELに連結していることを示して
いる。(C-D)は、（A）に示されたラットCOMP-KDEL構築物の核酸配列（配列番号
１４）である。
メイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示された構築物によってコードされたKDEL受容体インヒビタータンパ
ク質のアミノ酸配列（１文字表記）（配列番号１３）であり、切断リーダー／シ
グナルペプチド（下線）およびリンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配
列GDLA（ラットCOMP由来）、ラットCOMP五量体形成ドメイン（上線）およびラク
ダIgGリンカードメイン（下線および上線）がKDELに連結していることを示して
いる。(C-D)は、（A）に示されたラットCOMP-KDEL構築物の核酸配列（配列番号
１４）である。
【図２】
図２(A)は、(i)切断シグナルペプチド（マウスBiP由来）、
(ii)ラット軟骨オリゴマー型マトリックスタンパク質(COMP)のオリゴマー形成ド
メイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示された構築物によってコードされたKDEL受容体インヒビタータンパ
ク質のアミノ酸配列（１文字表記）（配列番号１５）であり、切断リーダー／シ
グナルペプチド（下線）およびリンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配
列GDCC（図１Bに示されたラットCOMPのサブ配列が変化したものであり、ジスル
フィド結合を介して安定性が増加される）、ラットCOMP五量体形成ドメイン（上
線）およびラクダIgGリンカードメイン（下線および上線）がKDELに連結してい
ることを示している。(C-D)は、（A）に示されたラットCOMP-KDEL構築物の核酸
配列（配列番号１６）である。
メイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示された構築物によってコードされたKDEL受容体インヒビタータンパ
ク質のアミノ酸配列（１文字表記）（配列番号１５）であり、切断リーダー／シ
グナルペプチド（下線）およびリンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配
列GDCC（図１Bに示されたラットCOMPのサブ配列が変化したものであり、ジスル
フィド結合を介して安定性が増加される）、ラットCOMP五量体形成ドメイン（上
線）およびラクダIgGリンカードメイン（下線および上線）がKDELに連結してい
ることを示している。(C-D)は、（A）に示されたラットCOMP-KDEL構築物の核酸
配列（配列番号１６）である。
【図３】
図３(A)は、(i)切断シグナルペプチド（マウスBiP由来）、
(ii)マウストロンボスポンジン3三量体形成ドメイン(TSP3)のオリゴマー形成ド
メイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号１７）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC（図１Bに示されたラットCO
MPのサブ配列が変化したものであり、ジスルフィド結合を介して安定性が増加さ
れる）、マウスTSP3三量体形成ドメイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン
（上線および下線）およびKDELを示している。(C-D)は、(A)に示されたマウスTS
P3-KDEL構築物の核酸配列（配列番号１８）であり、翻訳開始部位（○）および
終止部位（□）を示す。
メイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号１７）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC（図１Bに示されたラットCO
MPのサブ配列が変化したものであり、ジスルフィド結合を介して安定性が増加さ
れる）、マウスTSP3三量体形成ドメイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン
（上線および下線）およびKDELを示している。(C-D)は、(A)に示されたマウスTS
P3-KDEL構築物の核酸配列（配列番号１８）であり、翻訳開始部位（○）および
終止部位（□）を示す。
【図４】
図４(A)は、(i)切断シグナルペプチド（マウスBiP由来）、
(ii)マウストロンボスポンジン3三量体形成ドメイン(TSP3)のオリゴマー形成ド
メイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号１９）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC（図１Bに示されたラットCO
MPのサブ配列が変化したものであり、ジスルフィド結合を介して安定性が増加さ
れる）、マウスTSP3三量体形成ドメイン（上線。図３Bと比較すると、5’末端に
さらにサブ配列GEQTを含む）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線）
およびKDELを示している。(C-D)は、(A)に示されたマウスTSP3-KDEL構築物の核
酸配列（配列番号２０）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示
す。
メイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号１９）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC（図１Bに示されたラットCO
MPのサブ配列が変化したものであり、ジスルフィド結合を介して安定性が増加さ
れる）、マウスTSP3三量体形成ドメイン（上線。図３Bと比較すると、5’末端に
さらにサブ配列GEQTを含む）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線）
およびKDELを示している。(C-D)は、(A)に示されたマウスTSP3-KDEL構築物の核
酸配列（配列番号２０）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示
す。
【図５】
図５(A)は、(i)切断シグナルペプチド（マウスBiP由来）、
(ii)アフリカツメガエルトロンボスポンジン4四量体形成ドメイン(TSP4)のオリ
ゴマー形成ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２１）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、アフリカツメガエルTSP4
の三量体形成ドメイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線
）およびKDELを示している。(C-D)は、（A）に示されたアフリカツメガエルTSP4
-KDEL構築物の核酸配列（配列番号２２）であり、翻訳開始部位（○）および終
止部位（□）を示す。
ゴマー形成ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２１）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、アフリカツメガエルTSP4
の三量体形成ドメイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線
）およびKDELを示している。(C-D)は、（A）に示されたアフリカツメガエルTSP4
-KDEL構築物の核酸配列（配列番号２２）であり、翻訳開始部位（○）および終
止部位（□）を示す。
【図６】
図６(A)は、(i)切断シグナルペプチド（実施例ではアデノウイルスE3/19 kDa
タンパク質由来）、 (ii) ヒト軟骨オリゴマー型マトリックスタンパク質（COMP）のオリゴマー形成
ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２３）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、ヒトCOMP五量体形成ドメ
イン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線）およびKDELを示
している。(C-D)は、（A）に示されたヒトCOMP-KDEL構築物の核酸配列（配列番
号２４）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示す。
タンパク質由来）、 (ii) ヒト軟骨オリゴマー型マトリックスタンパク質（COMP）のオリゴマー形成
ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２３）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、ヒトCOMP五量体形成ドメ
イン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線）およびKDELを示
している。(C-D)は、（A）に示されたヒトCOMP-KDEL構築物の核酸配列（配列番
号２４）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示す。
【図７】
図７(A)は、(i)切断シグナルペプチド（アデノウイルスE3/19 kDaタンパク質
由来）、 (ii)ヒトホスホランバン(PLB)のオリゴマー形成ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２５）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、ヒトPLB五量体形成ドメイ
ン（上線。五量体形成に重要な残基に付点した。）、ラクダIgGリンカードメイ
ン（上線および下線）およびKDELを示している。(C-D)は、（A）に示されたヒト
PLB-KDEL構築物の核酸配列（配列番号２６）であり、翻訳開始部位（○）および
終止部位（□）を示す。
由来）、 (ii)ヒトホスホランバン(PLB)のオリゴマー形成ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２５）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、ヒトPLB五量体形成ドメイ
ン（上線。五量体形成に重要な残基に付点した。）、ラクダIgGリンカードメイ
ン（上線および下線）およびKDELを示している。(C-D)は、（A）に示されたヒト
PLB-KDEL構築物の核酸配列（配列番号２６）であり、翻訳開始部位（○）および
終止部位（□）を示す。
【図８】
図８(A)は、(i)切断シグナルペプチド（アデノウイルスE3/19 kDaタンパク質
由来）、 (ii)ヒトトロンボスポンジン３(TSP3)のオリゴマー形成ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２７）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、ヒトTSP3の三量体形成ド
メイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線）およびKDELを
示している。(C-D)は、（A）に示されたヒトTSP3-KDEL構築物の核酸配列（配列
番号２８）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示す。
由来）、 (ii)ヒトトロンボスポンジン３(TSP3)のオリゴマー形成ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２７）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、ヒトTSP3の三量体形成ド
メイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線）およびKDELを
示している。(C-D)は、（A）に示されたヒトTSP3-KDEL構築物の核酸配列（配列
番号２８）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示す。
【図９】
図９(A)は、(i)切断シグナルペプチド（アデノウイルスE3/19 kDaタンパク質
由来）、 (ii)ヒトトロンボスポンジン４(TSP4)のオリゴマー形成ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２９）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、ヒトTSP4の三量体形成ド
メイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線）およびKDELを
示している。(C-D)は、（A）に示されたヒトTSP4-KDEL構築物の核酸配列（配列
番号３０）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示す。
由来）、 (ii)ヒトトロンボスポンジン４(TSP4)のオリゴマー形成ドメイン、 (iii)ラクダIgGリンカードメイン、および (iii)C末端配列KDEL をコードする領域を含んでなるKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする
核酸分子の概略図である。コード配列をいくつかのベクターに組み込むために利
用される、当業界で既知の制限エンドヌクレアーゼの切断部位を示す。ダブルア
スタリスク(**)はシグナルペプチドコード配列に対して3’側に位置するBam HI
部位またはアミノ酸KDELをコードするヌクレオチドより5’末端にあるKpn I部位
を示し、そこに例えばペプチド／標的抗原をコードする核酸を挿入しうる。(B)
は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号２９）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）およびリ
ンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列GDCC、ヒトTSP4の三量体形成ド
メイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および下線）およびKDELを
示している。(C-D)は、（A）に示されたヒトTSP4-KDEL構築物の核酸配列（配列
番号３０）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示す。
【図１０】
図１０(A)は、(i)切断シグナルペプチド（マウスBiP由来）、
(ii)mycタグ、
(iii)N結合グリコシル化配列、
(iv)ラット軟骨オリゴマー形成タンパク質のオリゴマー形成ドメイン、
(iv)ラクダIgGリンカードメイン、および
(v)C末端配列KDEL、
を有するKDELインヒビタータンパク質をコードする核酸分子の概略図である。(B
)は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号３４）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）、mycタ
グ、N結合グリコシル化配列、リンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列
GDCC、ラットCOMPドメイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および
下線）およびKDELを示している。(C-D)は、（A）に示されたKDEL構築物の核酸配
列（配列番号３５）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示す。
)は、(A)に示されたKDEL受容体インヒビタータンパク質のアミノ酸配列（１文字
表記）（配列番号３４）であり、リーダー／シグナルペプチド（下線）、mycタ
グ、N結合グリコシル化配列、リンカー（アミノ酸-GSS-で表される）、サブ配列
GDCC、ラットCOMPドメイン（上線）、ラクダIgGリンカードメイン（上線および
下線）およびKDELを示している。(C-D)は、（A）に示されたKDEL構築物の核酸配
列（配列番号３５）であり、翻訳開始部位（○）および終止部位（□）を示す。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５
37/04 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ
Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ
，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，
ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ
Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ
，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，
ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ
Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ
，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，
ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ
Ｗ
(72)発明者 メイヒュー，マーク
アメリカ合衆国 10591 ニューヨーク州，
タリータウン，ベネディクト アベニュー
414，アパートメント ３イー
(72)発明者 ホエ，ミー，エイチ．
アメリカ合衆国 10021 ニューヨーク州，
ニューヨーク ，イー．66ティーエイチ
ストリート 312，アパートメント ４
シー
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02
EA04 GA11 HA01 HA17
4B063 QA01 QA08 QA18 QR77 QR80
4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 DA03
DA13
4B065 AA90X AA90Y AC14 AC15
BA02 CA24 CA44 CA46
4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13
BA02 BA44 CA53 NA14 ZB092
ZB262
4H045 AA10 AA11 AA20 BA13 BA18
BA19 CA40 EA20 EA50 FA72
FA74
Claims (43)
- 【請求項１】 複数のタンパク質サブユニットを含むオリゴマー型KDEL受容
体インヒビタータンパク質であって、それぞれのサブユニットがオリゴマー形成
ドメインを含み、そのC末端にKDEL受容体に結合する領域を有していることを特
徴とする、オリゴマー型KDEL受容体インヒビタータンパク質。 - 【請求項２】 KDEL受容体に結合する領域がアミノ酸配列Lys-Asp-Glu-Leu
を有することを特徴とする、請求項１記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質
。 - 【請求項３】 オリゴマー形成ドメインが五量体形成ドメインである、請求
項１記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質。 - 【請求項４】 オリゴマー形成ドメインが五量体形成ドメインである、請求
項２記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質。 - 【請求項５】 五量体形成ドメインが軟骨オリゴマー型マトリックスタンパ
ク質に由来することを特徴とする、請求項３記載のKDEL受容体インヒビタータン
パク質。 - 【請求項６】 オリゴマー形成ドメインがトロンボスポンジンタンパク質に
由来することを特徴とする、請求項１記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質
。 - 【請求項７】 五量体形成ドメインがアミノ酸配列 を有することを特徴とする、請求項５記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質
。 - 【請求項８】 五量体形成ドメインがアミノ酸配列 を有することを特徴とする、請求項５記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質
。 - 【請求項９】 オリゴマー形成ドメインがアミノ酸配列 を有することを特徴とする、請求項６記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質
。 - 【請求項１０】 オリゴマー形成ドメインがアミノ酸配列 を有することを特徴とする、請求項６記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質
。 - 【請求項１１】 オリゴマー形成ドメインがアミノ酸配列 を有することを特徴とする、請求項６記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質
。 - 【請求項１２】 オリゴマー形成ドメインがアミノ酸配列 を有することを特徴とする、請求項６記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質
。 - 【請求項１３】 オリゴマー形成ドメインがアミノ酸配列 を有することを特徴とする、請求項１記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質
。 - 【請求項１４】 請求項１記載のKDEL受容体インヒビターをコードする単離
された核酸。 - 【請求項１５】 請求項２記載のKDEL受容体インヒビターをコードする単離
された核酸。 - 【請求項１６】 請求項３記載のKDEL受容体インヒビターをコードする単離
された核酸。 - 【請求項１７】 請求項４記載のKDEL受容体インヒビターをコードする単離
された核酸。 - 【請求項１８】 請求項５記載のKDEL受容体インヒビターをコードする単離
された核酸。 - 【請求項１９】 請求項６記載のKDEL受容体インヒビターをコードする単離
された核酸。 - 【請求項２０】 KDEL受容体に結合するリガンド配列を含むタンパク質の細
胞による分泌を増加させる方法であって、KDEL受容体インヒビターの不在下での
細胞からのタンパク質分泌よりも、細胞からのタンパク質分泌を増加させる濃度
のKDEL受容体インヒビターに細胞をさらすことを含んでなる、方法。 - 【請求項２１】 KDEL受容体インヒビターが、複数のタンパク質サブユニッ
トを含むオリゴマー型KDEL受容体インヒビタータンパク質であり、各サブユニッ
トがオリゴマー形成ドメインを含み、そのC末端にKDEL受容体に結合する領域を
有することを特徴とする、請求項２０記載の方法。 - 【請求項２２】 KDEL受容体に結合するKDELインヒビタータンパク質の領域
が、アミノ酸配列Lys-Asp-Glu-Leuを有することを特徴とする、請求項２１記載
の方法。 - 【請求項２３】 KDELインヒビタータンパク質のオリゴマー形成ドメインが
五量体形成ドメインである、請求項２１記載の方法。 - 【請求項２４】 KDELインヒビタータンパク質のオリゴマー形成ドメインが
五量体形成ドメインである、請求項２２記載の方法。 - 【請求項２５】 五量体形成ドメインが軟骨オリゴマー型マトリックスタン
パク質に由来することを特徴とする、請求項２３記載の方法。 - 【請求項２６】 オリゴマー形成ドメインがトロンボスポンジンタンパク質
に由来することを特徴とする、請求項２１記載の方法。 - 【請求項２７】 五量体形成ドメインが軟骨オリゴマー型マトリックスタン
パク質に由来することを特徴とする、請求項２４記載の方法。 - 【請求項２８】 オリゴマー形成ドメインがトロンボスポンジンタンパク質
に由来することを特徴とする、請求項２２記載の方法。 - 【請求項２９】 KDEL受容体に結合するリガンド配列を含む熱ショックタン
パク質と抗原性ペプチドの複合体の細胞からの放出を促進する方法であって、KD
EL受容体インヒビターの不在下での細胞からの複合体分泌よりも、細胞からの複
合体の分泌を増加させる濃度のKDEL受容体インヒビターに細胞をさらすことを含
んでなる、方法。 - 【請求項３０】 KDEL受容体インヒビターが、複数のタンパク質サブユニッ
トを含むオリゴマー型KDEL受容体インヒビタータンパク質であって、各サブユニ
ットがオリゴマー形成ドメインを含み、そのC末端にKDEL受容体に結合する領域
を有することを特徴とする、請求項２９記載の方法。 - 【請求項３１】 KDEL受容体に結合するKDELインヒビタータンパク質の領域
が、アミノ酸配列Lys-Asp-Glu-Leuを有することを特徴とする、請求項３０記載
の方法。 - 【請求項３２】 KDELインヒビタータンパク質のオリゴマー形成ドメインが
五量体形成ドメインである、請求項３０記載の方法。 - 【請求項３３】 KDELインヒビタータンパク質のオリゴマー形成ドメインが
五量体形成ドメインである、請求項３１記載の方法。 - 【請求項３４】 五量体形成ドメインが軟骨オリゴマー型マトリックスタン
パク質に由来する、請求項３２記載の方法。 - 【請求項３５】 オリゴマー形成ドメインがトロンボスポンジンタンパク質
に由来する、請求項３０記載の方法。 - 【請求項３６】 五量体形成ドメインが軟骨オリゴマー型マトリックスタン
パク質に由来する、請求項３３記載の方法。 - 【請求項３７】 オリゴマー形成ドメインがトロンボスポンジンタンパク質
に由来する、請求項３１記載の方法。 - 【請求項３８】 標的抗原に対する免疫応答を誘導または増加させる方法で
あって、そのような免疫応答の誘導または増加を必要とする被験者にKDEL受容体
インヒビターを有効量投与することを含んでなり、ここで標的抗原は熱ショック
タンパク質と複合体を形成し、その熱ショックタンパク質はKDEL受容体に結合す
るリガンド配列を含むことを特徴とする、方法。 - 【請求項３９】 標的抗原が内因性抗原である、請求項３８記載の方法。
- 【請求項４０】 標的抗原が被験者に導入された抗原である、請求項３８記
載の方法。 - 【請求項４１】 熱ショックタンパク質が内因性熱ショックタンパク質であ
る、請求項３８記載の方法。 - 【請求項４２】 熱ショックタンパク質をコードする核酸を投与することに
よって、熱ショックタンパク質が被験者に導入されたことを特徴とする、請求項
３８記載の方法。 - 【請求項４３】 プロモーター配列に機能しうる形で連結された、請求項１
記載のKDEL受容体インヒビタータンパク質をコードする導入遺伝子を有する、非
ヒトトランスジェニック動物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/124,671 US6160088A (en) | 1998-07-29 | 1998-07-29 | KDEL receptor inhibitors |
| US09/124,671 | 1998-07-29 | ||
| PCT/US1999/017147 WO2000006729A1 (en) | 1998-07-29 | 1999-07-28 | Kdel receptor inhibitors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003526323A true JP2003526323A (ja) | 2003-09-09 |
Family
ID=22416190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000562511A Pending JP2003526323A (ja) | 1998-07-29 | 1999-07-28 | Ｋｄｅｌ受容体インヒビター |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6160088A (ja) |
| EP (1) | EP1100906A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003526323A (ja) |
| AU (1) | AU779912B2 (ja) |
| CA (1) | CA2337692A1 (ja) |
| HU (1) | HUP0103576A3 (ja) |
| IL (1) | IL140988A0 (ja) |
| WO (1) | WO2000006729A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006115770A (ja) * | 2004-10-22 | 2006-05-11 | Chiba Univ | 遺伝子組換えノックイン非ヒト哺乳動物 |
| JP2020508060A (ja) * | 2017-02-22 | 2020-03-19 | エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド | 治療用タンパク質を有するｅｖの負荷の改善 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6773895B2 (en) | 2000-09-01 | 2004-08-10 | Boehringer Ingelheim Pharma Kg | Method for identifying substances which positively influence inflammatory conditions of chronic inflammatory airway diseases |
| GB0021484D0 (en) * | 2000-09-01 | 2000-10-18 | Boehringer Ingelheim Pharma | Method for identifying substances which positively influence inflammatory conditions of chronic inflammatory airway diseases |
| US20050137156A1 (en) * | 2003-08-09 | 2005-06-23 | Johnston Stephen A. | Methods and compositions for generating an immune response |
| GB0404731D0 (en) * | 2004-03-03 | 2004-04-07 | Indp Administrative Inst Nims | Method and products for the selective degradation of proteins |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU724399B2 (en) * | 1995-08-18 | 2000-09-21 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies |
| DE69738670D1 (de) * | 1996-10-28 | 2008-06-19 | Inst Suisse De Rech S Experime | Verfahren zur oligomerisation von peptiden |
| US5824500A (en) * | 1996-11-21 | 1998-10-20 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid encoding novel human KDEL receptor |
-
1998
- 1998-07-29 US US09/124,671 patent/US6160088A/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-07-28 EP EP99938851A patent/EP1100906A1/en not_active Withdrawn
- 1999-07-28 CA CA002337692A patent/CA2337692A1/en not_active Abandoned
- 1999-07-28 JP JP2000562511A patent/JP2003526323A/ja active Pending
- 1999-07-28 AU AU53245/99A patent/AU779912B2/en not_active Ceased
- 1999-07-28 IL IL14098899A patent/IL140988A0/xx unknown
- 1999-07-28 HU HU0103576A patent/HUP0103576A3/hu unknown
- 1999-07-28 WO PCT/US1999/017147 patent/WO2000006729A1/en not_active Application Discontinuation
-
2004
- 2004-03-31 US US10/815,514 patent/US20040204361A1/en not_active Abandoned
- 2004-06-21 US US10/873,594 patent/US20050095667A1/en not_active Abandoned
- 2004-06-25 US US10/877,930 patent/US20040235129A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006115770A (ja) * | 2004-10-22 | 2006-05-11 | Chiba Univ | 遺伝子組換えノックイン非ヒト哺乳動物 |
| JP2020508060A (ja) * | 2017-02-22 | 2020-03-19 | エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド | 治療用タンパク質を有するｅｖの負荷の改善 |
| JP7365902B2 (ja) | 2017-02-22 | 2023-10-20 | エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド | 治療用タンパク質を有するｅｖの負荷の改善 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL140988A0 (en) | 2002-02-10 |
| US20040204361A1 (en) | 2004-10-14 |
| EP1100906A1 (en) | 2001-05-23 |
| AU5324599A (en) | 2000-02-21 |
| HUP0103576A3 (en) | 2003-10-28 |
| CA2337692A1 (en) | 2000-02-10 |
| US20050095667A1 (en) | 2005-05-05 |
| US6160088A (en) | 2000-12-12 |
| US20040235129A1 (en) | 2004-11-25 |
| AU779912B2 (en) | 2005-02-17 |
| HUP0103576A2 (hu) | 2002-01-28 |
| WO2000006729A1 (en) | 2000-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7642044B2 (en) | Trimerising module | |
| JP5148804B2 (ja) | 癌の治療に特に有用な免疫擬装の方法及び薬学的組成物 | |
| US20020198166A1 (en) | Method for treatment of cancer and infectious diseases and compositions useful in same | |
| JP2000515372A (ja) | キメラヘテロ多量体接着体 | |
| Itin et al. | A novel endocytosis signal related to the KKXX ER‐retrieval signal. | |
| JP2004503213A (ja) | １本鎖クラスｉ主要組織適合性複合体、それをコードする構築物およびそれを生成する方法 | |
| US20200095302A1 (en) | Multi-level specific targeting of cancer cells | |
| US6331299B1 (en) | Method for treatment of cancer and infectious disease and compositions useful in same | |
| JP2002523021A (ja) | Ｌｄｃａｍと称される分子 | |
| JP2001510030A (ja) | 志賀毒素のｂフラグメント及び治療向けペプチドを含むキメラポリペプチド | |
| JP2003530360A (ja) | 薬剤送達のためのペプチド複合体 | |
| JP2001512667A (ja) | ヒトオーファンレセプターｎｔｒ−１ | |
| US20020045241A1 (en) | T cells specific for kidney carcinoma | |
| JP2003526323A (ja) | Ｋｄｅｌ受容体インヒビター | |
| JP6717725B2 (ja) | 遺伝子操作した成長因子変異体 | |
| JP2005525128A (ja) | Ｐ５３結合ｔ細胞受容体分子とその使用 | |
| Thomson et al. | A method for expression and purification of soluble, active Hsp47, a collagen-specific molecular chaperone | |
| US6670135B1 (en) | Semaphorin polypeptides | |
| CN112480262B (zh) | 一种融合蛋白及其制备与应用 | |
| WO2011079431A1 (zh) | 具有端粒酶抑制活性的融合蛋白、其制备方法和用途 | |
| US20150030593A1 (en) | Compositions of penetration-enhanced targeting proteins and methods of use | |
| WO2007116925A1 (ja) | コレクチン活性を有するｈＣＬ-Ｋ１ポリペプチド | |
| CA2382506A1 (en) | Novel polypeptides and nucleic acids encoding pro293 which are useful for treating disorders of the pancreas | |
| JP2003169683A (ja) | 新規脱共役蛋白質ｍｔ００２９ | |
| JP2001520884A (ja) | ウイルスがコードするセマフォリンタンパク質受容体ｄｎａおよびポリペプチド |