JPS63245677A - 新規プロモ−タ−領域を有するｄｎａ、それを含有するプラスミド、およびそれらによつて形質転換された大腸菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業Ｅの利用分野） 本発明は遺伝子組換え技術によって目的とするペプチド
を生産させるために有用な、新規なプロモーター領域を
有するＤＮＡ配列、それを含有するプラスミドおよびそ
れらによって形質転換された大腸菌に関する。

（従来＆術） 近年、遺伝子組み換え技術によって目的とするベブチド
を効率よく経済的に生産するために、各種のプロモータ
ーが探索され報告されている。

一方、プロテインＡは黄色ブドウ球菌細胞壁成分の５％
を占めるタンパク質で、ヒト、マウス、ウサギなどの咄
乳類の免疫グログリンＧ（ＩｇＧ）のＦｅ部分と特異的
に結合する。（ただしヒトＩｇＧ３とは結合しない）こ
の性質を利用し、抗体免疫複合体の検出除去、抗体抗頭
の分離精製、１９Ｇサブクラスの分画、ラジオイムアラ
レイ、酵素免疫測定法等の各種標識抗体法、癌、血液疾
患の臨床研究などへ幅広く応用されている。

プロティンＡは、Ｅ、Ｄ、Ａ、［３，Ｃ，Ｘの６つのユ
ニットで構成されており、Ｎ末端から、この順序で結合
している。この６ユニツトは、トリプシン分解で得られ
、各ユニットのうち口、ＤｌＡ、Ｂ、Ｃの５ユニツトは
そのアミノ酸配列に高い類似性がみられる。ここでＥ領
域は、プロティンＡのＮ末端に存在するユニットで、Ｄ
１Ａ％［３，Ｃ領域と類似のアミノ酸配列をしているが
ＩＩＪＧとの結合能力はほとんどもたない領域である。

Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ領域はそれぞれ１９ＧのＦｅ部分との結
合能力を持っている。Ｘ領域はプロティン八分子を黄色
ブドウ球菌の細胞壁に結合させる機能を持っている部分
である。また、’Ｅ、Ｄ、Ａ１Ｂ、Ｃ，Ｘ領域をコード
する構造遺伝子の上流には、Ｓ領域とよばれる分泌に関
与する領域をコードする遺伝子が存在している。

プロティンＡ遺伝子のＤＮＡ１基配列については、１９
８４年にスタフィロコッカス　アウレウス８３２５−４
株（ウーレンら、ジャーナル　オブバイオロジカル　ケ
ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ）　。

２５９．１６９５　（１９８４））由来のものと、スタ
フィロコッカス　アウレウス　コワンエ（ＣｏｖａｎＩ
）株（特開昭５９−１１３８９０号）由来のものが報告
されている。

ウーレンらの文献には、プロティンＡ構造遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列に加えて、その上流にプロモーター領域とシ
グナル配列をコードする２９１ＤＮＡ塩基配列が、そし
て、下流に停止コドンを含め、２１０ＤＮＡ塩基配列が
報告されている。

また、特開昭５９−１１３８９０号では、プロティンＡ
の構造遺伝子とその上流のシグナル配列のＤＮＡ塩基配
列が報告されている。

（発明の目的） 本発明は、ペプチドの生産に有効な、優れたプロモータ
ーの探索を目的とするものである。

（発明の構成） 本発明者らは上記目的を達成するために、スタフィロコ
ッカス　アウレウスの１菌株から、プロティンＡ３！Ｉ
伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、そのヌクレオチド塩基
配列を決定するべく検討した結果、このＤＮＡ断片が、
従来報告され１いるプロティンへ遺伝子のプロモーター
領域とは異った、以下に示すような新規なプロモーター
領域を有することを見い出し、このＤＮＡ断片をプラス
ミドに導入し、さらにそのプラスミドによって大腸菌を
形質転換することによって本発明を完成した。

すなわち本発明は 式■で示されるプロモーター領域の下流にペプチドをコ
ードする遺伝子を有するＤＮＡ配列式■ 八ＡＴＴＡＡＡＣＣＴ　　ＣＡＧＣＡＣ八ＴＴＣへＡＡ
ＡＡＴＴＣＣＡＴ　　ＴＴＴＡＴＴＣＴＴＡ八ＡＡＡＴ
ＡＴＴＴＴ　　ＴＴＡＡＣＴＣＡＴ＾　ＴＧＴＡ＾■八
＾八ＣへＣへＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴ八ＡＡ八ＡＡＴＡ　
　ＴＣＴＡＴＡＴＡＴＴ　　ＴＴ八へＣＴＧＴＴＴ　　
ＴＴＡＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧ　　ＡＴＴ
ＴＴＧＣＧＧＴ　　ＴＴＴＡＡＧＣＣＴＴ　　ＴＴＡＣ
ＴＴＣＣＴＧＡＡＴ八ＡＡＴＣＴＴ　　ＴＧＧＡＣＡＡ
ＡＡＴ　　ＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡ　　ＴＡ八へＴＴＧＴ
八へＡＡＣＴＴＡＣＣ丁Ｔ　　ＴＡＡＡＴＴＴＡＡＴ　
　ＴＡＴＡＡ八■八Ｔへ　へＧＡＴＴＴＴＡＧＴ＾ＴＴ
ＧＣＡＡＴ八ＣＡ　　ＴＡＡＴＴＣＧＴＴＡ　　ＴへＴ
ＴＡＴＧＡＴＧ　　ＡＣＴＴＴＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＣＡＧＧ　　ＧＧＧＴＡＴＴＡＡ丁および 該ＤＮＡ配列を含有するプラスミド および 該プラスミドによって形質転換された大腸菌である。

本発明のＤＮＡ配列の一具体例は、スタフィロコッカス
　アウレウス由来のプロティンＡのプロモーター領域の
下流に、プロティンＡをコードするシグナル配列および
構造遺伝子を右するものである。

本発明のＤＮＡ配列中に含まれる新規なプロモーター領
域は、その塩基配列が定まっているので、全化学合成ま
たは生化学合成によって製造することができる。しかし
、このプロモーター領域はかなり長い塩基配列であるか
ら、プロティンＡ生産能を右するスタフィロコッカス　
アウレウスの染色体ＤＮＡから切り出す方法が簡潔な方
法といえよう。

このプロモーター領域を含むプロティンＡｍ転子の切り
出しおよびＤ　Ｎ　Ａ配列の決定は、以下に示すような
方法で行なうことができる。

ＤＮＡ供与体としてはプロティンＡ生産能を有するスタ
フィロコッカス　アウレウスを用いる。

プロティンＡｍ転子領域を荷うＤＮＡの菌体からの抽出
蹟製は、例えば、リゾスタフィン、界面活性剤、ＥＤＴ
Ａ、プロテアーゼ等を組み合わせ菌体を溶菌した後、斉
藤−三浦の方法（蛋白質核酸　酵素１１，４４６　（１
９６６））に従って行なうことかできる。

ＶＭ製したＤＮＡの断片にはＥｃｏＲＶ、ＴａＱ■など
の市販の制限酵素を用いることができる。

この酵素反応条件は、例えば酵素メーカーのマニュアル
が使用できる。

制限酵素で切断した染色体ＤＮＡ断片は、アガロース電
気泳動後アルカリ変性し、サザーン　トランスファー法
によりメンブランフィルタ−上へ固定する。このメンブ
ランフィルタ−上に固定されたＤＮＡ断片に対し、前述
したウーレンらが報告したプロティンＡ遺伝子のＤＮＡ
塩基配列をもとにして化学合成した３２ＰラベルしたＤ
ＮＡプローブを用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイＶ
−ジョンを行なう。このＤＮＡプローブに用いるＤＮＡ
塩基配列は、プロティンＡ遺伝子の任意の配列を選ぶこ
とができるが、塩基数は１５〜５０が望ましい。

ＤＮＡ−ＤＮＡパイプリダイゼーションによりアガロー
ス電気泳動上のプロティンＡ３）１伝子の位置を確認後
、プロティンＡ遺伝子を含むと思われるＤＮＡサイズの
電気泳動バンドを切り出す。

切り出されたＤＮＡ断片は、制限酵素により切断された
ＥＫ系プラスミドベクター（リラックスド型）の、例え
ばＰＢ　Ｒ３２２に連結づる。切断されたベクターＤＮ
Ａと染色体ＤＮＡ断片の連結方法は、リガーゼを用いる
通常の方法が使用できる。

かくして得られたプロティンＡｍ転子を含むＤＮＡ断片
を挿入したベクターＤＮＡを大腸菌に１２に導入する。

受容菌への導入は通常の形質転換が使用できる。

なお、プロティンＡ遺伝子領域に対応するＤＮＡ塩基配
列は、例えばＭ−１３フアージを用いたダイデオキシ法
などにより決定することができる。

次に、プロティンＡ生産菌からのプロティンＡ遺伝子の
切り出し、そのＤＮＡ配列の決定および解析について、
実施例に基づいて詳細に説明する。

（実施例） （１）プロティンＡ生産菌から染色体のＤＮＡ抽出 スタフィロコッカス　アウレウスＡＴＣＣ１２５９４を
ニュートリエンドブロス（ディフコ社製）１００ｄ中で
３７℃３時間好気培養した対数期後期の菌体を、６−の
２５％シュクロースを含んだ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　
　（ＰＨ７，２）緩衝液に懸濁し、２７０μグのリゾス
タフィン（シグマ社製）を加え、３７℃１時間ゆっくり
振盪した後減菌水９ｄを添加した。次に５％トリトンＸ
−１００３７５μｊ　、２５０ｍＨＥＤＴＡ　　３７５
０μρ、プロナーゼＥ（シグマ社製）　１０ｒｒｒｙ／
ｒｔｔｔ溶液１８９μρ、１０％５ＤＳ９３９μＡを順
次添加し、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。減菌水１
２ｄを加えた１、２４ｔｄのフェノールを加え抽出した
。

このフェノール抽出を２回行い、得られた水層を５回エ
ーテル抽出した。水層に２倍量のエチルアルコールを加
え、粗ＤＮＡ画分を沈澱させた。遠心分離で沈澱を回収
し、７０％エチルアルコールで洗浄後乾燥した。

この乾燥した粗ＤＮＡを４＃ｌｉ２の１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ−１ｍＭ　　　　　ＥＤＴＡ　　　（Ｐ　Ｈ７，
８）　　緩　Ｉｆｆ液に溶解し、１ｒＩＸｇ／ｒｄのリ
ボヌクレアーゼ（シグマ社Ｍ）２００μρを加え、３７
℃３０分間インキュベートした。次に１０Ｐｇ／−のプ
ロナーゼＥを２０ｔｌｆＪ加え、更に３７℃１時間イン
キュベートした。この水溶液に２回フェノール処理を行
なった後６回エーテル処理を行なった。水層に２倍量の
エタノールを加え、ＤＮＡを沈澱させた後、８０％エタ
ノールを用いて洗浄、乾燥し、更に２−の１０ｍＭトリ
ス−）−ＩＣＩ−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ＰＨ７，８）緩
衝液に溶解した。この溶液を同じ緩衝液に対し４℃で透
析し、稈られた溶液を精製染色体ＤＮＡ溶液とした。

（２）制限酵素によるＤＮＡの潤化とＤＮＡ断片のメン
ブランフィルタ−への固定 （１）で得られた染色体ＤＮＡ０．０２μｇ／μＮ　ヲ
ｏ、　１　ｕ　ｎ　ｉ　ｔ／１ｌｆＪの制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ■とＴａｑＩ（共に宝酒造製）で分解した。分解物と
０．８％アガａ−スゲル（ベセスダ　リサーチ　ラボラ
トリーズ製）を用いて電気泳動にかけ、変性溶液（０，
２Ｎ　ＮａＯＨ−０，６ＨＮａＣＩ　）と中和溶液０．
２Ｍ　トリス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）−〇、６ＨＮａ
ＣＩ　）を用いて変性後、メンブランフィルタ−へ、サ
ザーン　トランスファー法（［モレキュラークローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｊコールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　１９
８２　）によりＤＮＡを転写し固定した。　　　゛ （３）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（２）で
メンブランフィルタ−上に固定したＤＮＡに対し、別途
化学合成しさらに３２Ｐで３°末端をラベルしたプロテ
ィンＡのＤＮＡプローブ（塩基配列は八ＡＡＡＴＧＣＴ
ＴＴＣＴＡＴＧＡＡＡＴ　）を用いたＤＮＡ−ＤＮＡハ
イブリダイゼーションを行なった。

すなわち、ＤＮＡを固定したメンブレンフィルターをデ
ンハーツ溶液［Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏ
ｎ　：　０　。

２％牛血清アルブミン（シグマ社［）、０．２％フィコ
ール４００（ファルマシア製）、０．２％ポリビニルピ
ロリドンに−３０（半井化学製）コど６倍濃度の５ｔａ
ｎｄａｒｄ　５ａｌｉｎｅ　Ｃ１ｔｒａｔｅ　　（６Ｘ
　ＳＳＣ；０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、０．９ＭＮ
ａＣＩ）を含む緩衝液中で３８℃３時間前処理した。ま
た、同緩衝液にキャリアーＤＮＡと共にすでに作成した
３２Ｐ−ラベルのプローブＤＮＡを加えた後、この緩衝
液にフィルターを移し、３８℃で１５時間ハイブリダイ
ゼーションを行なった。

その後、フィルターを２ＸＳＳＣを用い°Ｃ２時間ずつ
４回洗浄しオートラジオグラフィーを行なった。その結
果、約２．７Ｋｂ付近にバンドが検出された。

（４）約２．７ＫｂのＤＮＡ断片の単離（１）で得られ
た約７０μ０の染色体ＤＮＡを各々４００ＬニツトのＥ
ｃｏＲＶとｒａＱ　Ｉで切断後、０．８％低融点アガロ
ースゲルを用いて電気泳動により分離した。アガロース
ゲルをエヂジウムブロマイドで染色後、３２０ｎｍのＵ
ＶランプによりＤＮＡバンドを観察し、約２．７Ｋｂの
バンド含むゲルを切り出した。このゲルを融解侵、フェ
ノール抽出、エーテル処理によりカラムクロマトグラフ
ィによりＤＮＡ断片を回収した。次に７４ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて丁ａｑＩ切断部位を平滑末端にした。

（５）ベクター、ＢＲ３２２とＤＮＡ断片との連結 ５ｔｌＱのＰＢＲ３２２をＥＣ０ＲＶで３７℃１時間消
化し、６５℃１０分間の加熱でＥＣ０ＲＶを不活化後、
アルカリホスファターゼ処理した。

次にフェノール抽出、エーテル処理し、ＥｃｏＲ■切断
アルカリホスファターゼ処理ＰＢＲ３２２を回収した。

このＰＢＲ３２２５００ｎｇと、（４）で単離したＤＮ
Ａ断片１００ｎａを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造製）を用いて１４℃１６時間反応させ両ＤＮＡを連結
した。ここで（ｑられた組換えプラスミドをＰＤＣＰ２
４０とした。

このＰＤＣＰ２４０の制限酵素切断地図を第１図に示す
。

（６）形質転換 連結し作成した組換えプラスミドＰＤｃＰ２４０で大腸
菌（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ
）月１８１０１株のコンピテントセルを形質転換し、ア
ンピシリン５０μｇ／ｄを含むし一寒天平板培地［１％
トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（デ
ィフコ社製）、０．５％ＮａＣ＋、１．５％寒天（ディ
フコ社製）］上にまいた。得られたアンピシリン耐性株
を次々各々アンピシリン５０μ（Ｊ／ｄ、テトラサイク
リン１５μＧ／Ｉｄを含むＬ−寒天平板培地上に接種し
、アンピシリン耐性テトラサイクリン感受性を示す株を
組換え型大腸菌として選択した。

（７）コロニーハイブリダイゼーション（６）で得られ
た組換え型株をＬ−寒天平板培地にのせたメンブランフ
ィルタ−上に植菌した。

３７℃で一晩培養後フイルターをはずし、０．５ＮＮａ
ＯＨをしみ込ませたろ紙上にのせ１０分間放置した。水
切り後、１．５８ＮａＣＩを含む０．５Ｍトリス−ＨＣ
ｌ！１衝液ＰＨ７，５をしみ込ませたろ紙上に５分間放
置した。再び水切り後、２ＸＳＳＣをしみ込ませたろ紙
上に５分間放置した。以上の処理をしたメンブランフィ
ルタ−を十分風乾し、６５℃で一晩熱処理した。このよ
うにしてＤＮＡを固定したメンブランフィルタ−を用い
て、（３）で用いた３２Ｐ−ラベルのプロティンＡｍ伝
子のＤＮＡプローブを用いてコロニーハイブリダイゼー
ションを行なった。１６００株の組換え型大腸菌のうち
１株がプロティンＡｆｆｉ信子ポジディプであった。

（８）プロティンＡの生産性の確認 （７）で得られたプロティンＡＩ伝子を含むプラスミド
で形質転換された組換え大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ　ｌ　ｉ　
　ＨＢ１０１／ｐＤＣＰ２４０）を５０μ９７ｔｄｌの
アンピシリンを含むＬ−培地５ｄ中で一晩培養した。遠
心分離で菌体を集め１．！ＭのＴＥＳ！Ｉｌｊ液（１０
１１１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、１　ｍＭＥＤＴＡｏ、
９％ＮａＣ１）ｔ’洗浄した。遠心分離により菌体を集
め、その菌体を、５　！ｌｔｇ／ｒｄのリゾチーム（シ
グマ社製）を含む脱イオン水に再懸濁させ３７℃で１時
間溶菌させた。遠心分離で不ｍ物を除き、上清について
プロティンＡｆｆｉを測定した。

プロティンＡｆｆｉはＥＬＩＳＡ法（ＥｎｚｙｌＩｌｅ
　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５
ａｙ）を用いて測定した。すなわち、マイクロタイター
プレート（ファルコン社製）の凹みにウサギのイムノグ
ロブリンＧ（１■／Ｉ！ＩＩ’）を含むリン酸緩衝液化
生理食塩水（０，８％ＮａＣ１，０，０２％ＫＣＩ、０
．２９％Ｎａ２ＨＰ０　　・１２ＨＯ，０，０２％に２
ＨＰＯ４：；以下、ＰＢＳと略す）３０μｇを満たし、
室温で１時間インキュベートした。その後凹みを３回Ｐ
ＢＳで洗浄し、５％牛血清アルブミンを含む１８３１０
０μｍを凹みに加え室温で１時間放置した。凹みを３回
ＰＢＳで洗浄した後、測定用サンプル５０μｇを加え室
温で１時間放置した。凹みを３回ＰＢＳで洗浄し、プロ
ティンＡ−β−ガラクトシダーゼ複合体（ザイムド　ラ
ボラトリ−製）４０μｆＪ　（０，５６４ｕｎ　ｉ　ｔ
／ｄ）を加え室温で１時間放置した。次に凹みを５回Ｐ
ＢＳで洗浄し、β−ガラクトシダーゼの基質である０Ｎ
ＰＧ（０−ニトロフェニルガラクトシド、１１ｒｔｇ／
ｄ）を５０μｍ加えた。

酵素反応は、１８　ＮａＨＣＯ３１００１（Ｄ添加によ
り停止した。結果、プロティンＡが存在する場所は無色
であるが、ない場合は黄色として観察される。この結果
、Ｌ−培地で培養した組換え大腸菌は３■／！のプロテ
ィンＡを生産していた。

（９）ＤＮＡ塩基配列の決定 （７）で得られたＥ、ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１／ＰＤＣ
Ｐ２４０よりプラスミドＰＤＣＰ２４０を抽出した。こ
のプラスミドを数種の制限酵素で切断し、大きさを電気
泳動により測定したところ、約７．０Ｋｂであった。ベ
クターとして用いたＰＢＲ３２２が約４．３Ｋｂである
ことから、挿入されたプロティンＡＩ伝子を含むＤＮＡ
断片は約２．７Ｋｂであることがわかった。

次にダイデオキシ法（Ｄｉｄｅｏｘｙ法）によりＤＮＡ
塩基配列を決定するために、ＰＤＣＰ２４０を制限酵素
ＥＣ０ＲＶとＴａｑＩで切断し、プロテインＡＷ伝子を
合むＤＮＡ断片を回収した。

次にこのＤＮＡ断片をＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ
を用いて末端修復後、プラスミドベクターＰ　Ｕ　Ｃ１
１８を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造製）で切断したものと
Ｔ４リガーゼを用いて連結し、得られた組換えプラスミ
ドをＰＤＣＰ２４１１とした。この、ＤＣＰ２４１１の
制限酵素切断地図を第２図に示す。

このＰＤＣＰ２４１１をＥ、ｃｏｌｉ　　ＭＶ１３０４
株へ導入した。そしてこの形質転換株のうち、プロティ
ンＡ生産株をＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。

ここで得られた形質転換株を［。

ｃｏｚ　　ＭＶ１３０４／ＰＤＣＰ？１１１とした。こ
のＥ、ｃｏｌｉ　　ＭＶ１３０４ＰＤＣＰ２４１１から
ＰＤＣＰ２４１１を大ｆｌｔ調製し、コノＰＤＣＰ２４
１１よ１ｌｌ）挿入ＤＮＡ部分に約２００塩基対に欠損
のかかった欠損株を作成した（宝酒造ＤＮＡデレーショ
ンギット添付の使用説明力通り）。次にこれら欠損′株
から得たＤＮＡ断片についてダイデオキシ法によりＤＮ
Ａ塩基配列を決定した。その結果得られた全ＤＮＡ塩基
配列を以下に示す。

ＣＧ八ＴＡＧＴ　　ＧＧＣＴＣＣＡ八ＧＴ　　八へＣＧ
ＡＡＧＣＧＡ　　ＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣ
ＣＡＡ　　ＡＧＣＧＧＴＣＧＧＡ　　ＣＡＧＴＧＣＴＣ
ＣＧ　　八ＧＡＡＣＧＧＧＴＧＣＧＣＡＴＡＧ＾八八　
ＴＴＧＣ＾ＴＣＡＡＣＧＣＡＴ八ＴＡへＣＧ　　ＣＴＡ
ＧＣＡＧＣＡＣＧＣＣＡＴＡＧＴＧＡ　　ＣＴＧＧＣＧ
ＡＴＧＣＴＧＴＣＧＧＡＡＴＧ　　ＧＡＣＧＡＴＣＧ八
八−９１１へへ　−９０１−８９１−８８１ＧＴ八八Ａ
ＡＴＴＧ八　ＴＧＡＧＣＧＴＡＡＴ　　ＡＣＴＴ八ＣＡ
へＴＴ　　ＣＡＡＴＡＴＣＴＧＡ八ＧＡＡＣＡＡＣＧ八
　ＧＡＧＡＡＡＡＴＴＧ　　ＣＡＧＡＡＣＧＴＧＴ　　
ＴＡＣＡ丁ＴＧＴＴＴＧＡＴＣ八＾ＡＴＣＡ　　ＴＴＡ
ＡＡＣ八ΔＴＴ　へＴへへＴＣＴＴＧＣＡ　　ＧＡＴＣ
ＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＴ　　ＧＡＴＡＣＣＡ
ＡＡＡ　　ＧＡＴＡＧＴＡＡＡＧ　　ＡＡＴ丁ＴＣＴ八
ＡへＣＴＴＧ八ＴＧＡＴＧ　　ＴＡＴＡＣＡＡＴＧＴ　
　ＡＴＴＴＣＡＡＧ八Ａ　丁ＡＴＴへＴＣＡＡＡＡＡＧ
Ｃ八ＴＣＴ八八　ＣへＴＴＡＡＧＴＴＴ　　ＴＧＴ八Ｇ
へＡＴＴＣＡＣＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＴＡＴＣＡＣ
丁ＴＣＴＣＡＡＡＡＴ　　ＡＡＡＡＡＣＡＴＣＧ　　Ｔ
丁ＣＴＴＣＴＴＡＡΔＧＡＴＴＴ八ＡＴＴ　　ＧＡＡＡ
ＣＡＡＴＣＣＡＣＣ八Ｔへ八八へへ　　ＣＣＣＴＣ八Ａ
ＡＣへＧＴＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＡＴＡＡＴＴ丁　Ａ
ＡＡＡＡＡＧＣＡＡ　　ＧＧＣＴＡＴＣＴ八八−５５１
へへ　　　　　−５４１−５３１−５２１丁へＡＡＡＧ
ＡＡＣＧ　　ＣＴＣ八八へへＧＡＡ　　ＧＡＴＧＡＡＡ
Ｇ八八　ＡＡＡＴへへＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡ八丁　
ＧへＣＧＣＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣ
ＡＡＴＴＡＴＴＡＧＣＴＣ八ΔＧ　　ＴＧ八へＴＣ八へ
へＴ　　ＡＴＴＧＧＣＡＧＡＴ　　へＡＡへＡＴＣＡＴ
ＴＴＡＣＡＴＣ丁ＴＧＴ　　ＴＴＴＴＧＡＡＴ＾八　Ｔ
ＡＴＣＴＣＴＡＴＴ　　ＡＣＧＣＡＡＧＴＧ丁ＧＣＴＧ
Ｔ八ＴＴＣＴ　　ＡＡＡＧＴＧＣＡＣＴ　　ＴＧＴＧＴ
ＴＴＴＣＴ　　ＡＴＴＴＴＴＴ八八Ｔ−３５へへ　　　
　　　−３４１−３３１−３２１＾ＡＡＡＣＣ丁ＣＡＧ
　　ＣへＣＡＴＴＡＴＧＡ　　ＡＣ＾八ＣへＴＴＣ丁　
ＡＴＴＴＴＣＴＡＴＡＴＣＴＣＴＴＡＡＡＡ　　ＣＣＡ
ＴＴＴＣＣＧＡ　　ＡＡＴＴＡＡＡＣＣＴ　　ＣＡＧＣ
ＡＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＣＡ丁　丁ＴＴＡＴＴＣＴ
ＴＡ　　ＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴ　　ＴＴＡＡＣ丁ＣＡＴ
ＡＴＧＴＡＡＴＡＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＡＴＴ　　ＡＴ
ＡＡＡＡＡ八ＴＡ　　ＴへＴ八■へ■へＴへＴＴ＾ＴＣ
ＴＧＴＴＴ　　ＴＴＡＴＴＡ＾丁ＣＧ　　ＧＡＡＴＡＧ
ＣＧＴＧ　　ＡＴＴＴＴＧＣＧＧＴＴＴＴ八八ＧＣＣＴ
Ｔ　　ＴＴＡＣＴＴＣＣＴＧ　　ＡＡＴＡＡ八ＴＣＴへ
　　ＴＧＧＡＣＡＡＡＡＴＴＴＴＴ八ＴＴＴＴＡ　　Ｔ
ＡＡＧＴＴＧＴＡＡ　　ＡＡＣＴＴＡＣＣＴＴ　　ＴＡ
Ａ八ＴへＴ＾ＡＴＴＡＴＡＡＡＴ八ＴＡ　　ＧＡＴＴＴ
ＴＡＧＴＡ　　ＴＴＧＣ八八Ｔへへ＾　■へＡＴＴＣＧ
ＴＴＡ−３１−２１−１１−Ｉ ＴＡＴＴＡＴＧ＾ＴＧ　　ＡＣＴ丁ＴＡＣ八Ａへ　　Ｔ
ＡＣＡＴ＾ＣＡＧＧ　　ＧＧＧＴ＾ＴＴＡＡＴＴＴＧＡ
ＡＡＡＡＧＡ　　ＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡ　　ＴＴＣＡＡ
ＴＴＣＧＴ　　ＡＡＡＣＴＡＧＧＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴ
ＧＣへＴＣＴＧＴＡＡＣ丁　ＴＴＡＧＧＴＡＣＡＴ　　
ＴＡＣＴＴＡＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ　　ＡＣＡ
ＣＣＴＧＣＴＧ　　ＣＡＡ八ＴへＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡ
ＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴ　
　ＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧ　　ＴＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＴ
ＡＡＣＴＴ八八八　ＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡ　　ＣＧＴＡ
ΔＴＧＧＴＴ　　ＴＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＣＴＴＡ八Ａ
ＧＡＴ　　ＧＡｒＣＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＡＡ
　　ＣＧＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＡ　　八
ＡＣＴＴＡＡＴＧＡ　　ＣＴＣＴＣＡＡＧＣＴ　　ＣＣ
ＡＡＡ八ＧＣＴへＡＴＧＣＧＣＡＡＣＡ　　ＡＡＡＴＡ
ＡＧＴＴＣＡＡＣＡΔＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＣＧＣ
３３０，３４０３５０３６０ ＣＴＴＣＴＡＴＧＡ八　ＡＩＣＴＴＧＡＡＣ八　ＴＧＣ
ＣＴ八ＡＣＴへ　　ＡへＡＣＧへＡＧＡＧＣＡＡＣＧＣ
ＡＡＴＧ　　ＧＴＴＴＣ八ＴＴＣへ　ＡＡへＴＣＴＴＡ
ＡＡ　　ＧＡＣＧＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＣＴ
へＡＣＧＴＴＴＴＡ　　ＧＧＴＧＡＡＧＣＴ八　４八Ａ
ＡＡＴＴＡＡＡＣＧＡＡＴＣＴＣＡＡ　　ＧＣＡＣＣＧ
ＡＡＡＧ　　ＣＴＧＡＣＡＡＣ＾八　丁ＴＴＣＡＡＣＡ
ＡへＣ八八Ｃ八八Ｃ八八八　八ＴＧＣＴＴＴＣＴＡ　　
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ＡＣＣＣＡＡＧＴＣＡ八Ａ　　ＧＴＧへＴＡＡＣＣＴ　
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八　へへへへＡＴＧＣＴＴ　　ＴＣＴ八ＴへＡ八ＡへＣ
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ＡＴＧＣＴ丁ＴＣＴＡＴＧ　　ＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡ　
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ＡＣＧＴＡＡ　　ＣＧＧＣｒＴＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣＣ
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ＡＡＡＧＡＡＡＴ丁Ｔ　　ＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＡ
ＡＡＡＧＣＴＡＡＡＣＧΔＴＧＣＴＣＡへＧＣＡＣＣへ
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ＡＡ　　ＡＣＣＴＧＧＣ八八八１６９へへへ　　　　　
１１００　　　　　　１１１０　　　　　　１１２０Ｇ
ＡＡＧＡＣＧＧＣ八　八ＣＡＡＡＣＣＴＧＧ　　ＴＡＡ
ＡＧＡＡＧＡＣＡＡＣ八八へへ八ＡへＣＴＧＧＣＡＡＡ
ＧＡ　　ＡＧ八八ＧＧＣＡＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＴＡ　
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ＴＡＡＡＧＡＡＧ　　＾ＴＧＧＣＡＡＣＡＡ　　ＧＣＣ
ＴＧＧＴＡ八Ａ１２１０　へ　　　　　１２２０　　　
　　　１２３０　　　　　　１２４０Ｇ＾ΔＧＡＴＧＧ
ＣＡ　　ＡＣＡＡＧＣＣＴＧＧ　　ＴＡＡＡＧＡＡＧＡ
ＣＧＧＣＡＡＣＧＧＡＧＴＡＣＡＴＧＴＣＧＴ　　ＴＡ
ＡＡＣＣＴＧＧＴ　　ＧＡＴＡＣＡＧＴＡＡ　　ＡＴＧ
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ＴＧ　　ＣＴＧＡＣＡ八Ａ八Ｔ　へＴへＣＴＧＣＡＧＡ
ＴＡＡＣＡＡＡＴ丁八Ｇ　　ＣＴＧＡＴＡＡＡＡＡ　　
ＣＡＴＧＡＴＣＡＡＡ　　ＣＣＴＧＧ丁ＣＡＡＧＡＡＣ
ＴＴＧＴＴＧＴ　　ＴＧＡＴ八八ＧへへＧ　　ＣＡＡＣ
ＣＡＧＣＡＡ　　ＡＣＣ八ＴへＣＡＧ八１へ１０　　　
　　　１４２０　　　　　　１４３０　　　　　　１４
４０ＴＧＣ丁ＡＡＣＡＡ八　ＧＣｒＣＡＡＧＣＡＴ　　
ＴＡＣＣＡＧ八八八ＣへへへＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣ
ＣＡＴＴＣＡ　　ＴＣＧＧＴＡＣＡ八ＣＴＧＴへＴへＴ
ＧＧＴ　　ＧＧＡＴＴＡＴＣＡＴＴＡＧＣＧＴＴＡＧＧ
　　ＴＧＣＡＧＣＧＴＴＡ　　ＴＴＡＧＣＴＧＧＡＣＧ
丁ＣＧＴＣＧＣＧ＾ＡＣＴＡＴΔＡＡＡＡ　　ＣＡＡ八
Ｃへ八ＴへＣＡＣＡＡＣＧＡＴＡＧ　　へ■決定された
全ＤＮＡ塩基配列は２６２９ｂｐであった。

このうち−１０７７〜−１番目の塩基配列は５゜−ノン
コーディング部分であり、プロモーター領域を含有して
いる部分である。

このプロモーター領域について前述したウーレンらの報
告にあるプロティンＡのプロモーター領域と比較すると
、ウーレンらがヘアピン構造をとると考えている−１３
１〜−１２０番目と−１５１〜−１３８番目のパリンド
ローム配列が、われわれが決定した配列中には存在しな
い。このことかられれわれが決定したプロモーター領域
は新規なプロモーター配列を含んでいるものであるとい
える。

′　１〜１５２４番目の塩基配列は、シグナル配列およ
び構Ｂ　Ｗ信子（コーディング部分）である。

このうち１〜１０８番目はシグナル配列であるＳ領域の
コードする部分、１０９〜２７６番目はＥ領域、２７７
〜４５９番目はＳ領域、４６０〜６３３番目はＡ領域、
６３４〜８０７番目はＳ領域、８０８〜９８１番目はＣ
領域、９８２〜１５２４番目はＸ領域をコードする部分
である。このＸ領域をコードする部分を前述した２つの
報告のそれと比較すると、我々が決定したＸ領域はそれ
らの配列と異なるものであり、新規な配列である。

１５２５〜１５５２番目の塩基配列は３°−ノンコーデ
ィング部分であり、１５２５〜１５２７番目のＴＡＡは
翻訳終止コドンである。

また、決定した全ＤＮＡ塩基配列のプロモーター領域を
含む５°ノンコ一デイング部分のうちの、−１０７７〜
−・３０１番目までを欠落させたＤＮＡ断片について、
実施例（５）〜（８）と同様の操作を行ないプロティン
Ａの生産性を確認したところ、約３１１ｔＦＪ／Ｉｔの
プロティンＡを生産していた。

このことから、プロモーターは、−３００〜−１番目に
含まれているといえる。

なお、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＨＢ　１
０１　／　ｐ　Ｄ　ＣＰ２４０および、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　Ｍ　Ｖ　１３０４／ＰＤＣＰ２
４１１は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の申
請をしたが、受託を拒否された。

（発明の効果） 本発明者らの見い出した新規なプロモーター領域は、目
的のペプチドをコードする遺伝子を発現させるのに有効
である。

すなわら、プロモーター領域のＦ流にペプチドをコード
する遺伝子をつなぎ、適当なベクターに挿入し、適当な
宿主を形質転換することによって該ペプチドを生産する
ことができる。

また、プロティンＡの５ｆｎＩ１１１をコードする遺伝
子をプロモーター領域とペプチドをコードする遺伝子の
間に挿入することにより、目的ペプチドを宿主菌体外に
分泌させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例のプラスミドＰＤＣＰ２４０の
制限酵素切断地図である。 第２図は本発明の実施例のプラスミドＰＤＣＰ２４１１
の制限酵素切断地図である。 図中太線部分はプロティンへのコーディング部分を表わ
す。 特許出願人　エム・ディ・リサーチ株式会社寥上図 否 土 第２−　ロ フ ■ 手　　続　　補　　正　　書　（自発）１、事件の表示 昭和６２年特許願第７８９１１号 ２、発明の名称 新規プロモーター領域を有するＤＮＡ、それを含有する
プラスミド、およびそれらによって形質転換された大腸
菌３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１）明細書第６頁１９行目および第７頁１４行目のｒ
Ｆｅ部分」を「Ｆｃ部分」に補正する。 （２）明細書節７頁２行目の「ラジオイムノアセイノを
「ラジオイムノアッセイ」に補正する。 （３）明細書筒１１頁２０行目の「核酸　酵素１１．」
を「核酸　１：素１１．」に補正する。 （４）明細書筒１２頁６〜７行目および１９行目の「ア
ガロース電気二 （６）明細書第１３頁９行目の「大腸菌に１２」を「大
腸菌に１２株」に補正する。 （７）明細書節１４頁２行目の「生産菌から染色体のＤ
ＮＡ抽」を「生産菌からの染色体ＤＮＡの抽」に補正す
る。 （８）明細書箱１４頁１０〜１１行目および１５行目の
「減菌水」を「滅菌水」に補正する。 （９）明細書筒１５頁４行目の「リボヌクレアーゼ」を
「リボヌクレアーゼＡ」に補正する。 （１０）明細書筒１６頁４行目の「中和溶液０．２Ｍ　
）リス−」を「中和溶液（０，２Ｍ　トリス−」に補正
する。 （１１）明細書筒１７頁１０行目の「オートラジオグラ
フィー」を「オートラジオグラフィー」に補正する。 （１２）明細書第１７頁２０行目の「このゲルを融解後
、」を［このゲルを熱融解後、Ｊに補正する。 （１３）明細書箱１８頁１行目の「フェノール抽出」を
「フェノール抽出」に補正する。 （１４）明ｓｉｔ第１９頁９行目の「次々各々」を「次
に」に補正する。 （１５）明細書第２０頁１８行目のｒＥＤＴＡｏ、９％
ＮａＣＩ）」をｒＥＤＴＡｏ、９％ＮａＣ１（ｐＨ７，
８＞　＞　Ｊに補正する。 （１６）明細書筒２３頁３行目の「末端修復後、」を「
末端修復後、」に補正する。 作成した」を「塩基対ずつ欠損したプラスミドＤＮＡを
有する大腸菌を作成した」に補正する。 （１９）明細書筒２３頁１９行目の「次にこれら欠損株
から」を「次にこれらの大腸菌株から」に補正する。 （２０）明細書筒２８頁２行目のｒｃＡＡｃＡＡｃＡＡ
Ａ　ＡＴＧＣＴＴＴＣＴＡ　Ｊを「Ｇ＾＾ＣＡＡＣＡＡ
Ａ　ＡＴＧＣＴＴＴＣＴＡ　、に補正する。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 I で示されるプロモーター領域の下流にペプ
   チドをコードする遺伝子を有するＤＮＡ配列 式 I 【遺伝子配列があります】
2. （２）プロモーター領域がスタフィロコッカスアウレウ
   ス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）由
   来のプロテインＡのプロモーター領域である特許請求の
   範囲第１項記載のＤＮＡ配列
3. （３）ペプチドがプロテインＡである特許請求の範囲第
   １項記載のＤＮＡ配列
4. （４）プロテインＡのＸ領域をコードする遺伝子が式I
   Iで示される特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列 式II 【遺伝子配列があります】
5. （５）式 I で示されるプロモーター領域の下流にペプ
   チドをコードする遺伝子を有するＤＮＡ配列を含有し、
   このペプチドをコードする遺伝子を宿主中で発現するこ
   とができるプラスミド 式 I 【遺伝子配列があります】
6. （６）式 I で示されるプロモーター領域の下流にペプ
   チドをコードする遺伝子を有するＤＮＡ配列を含有し、
   このペプチドをコードする遺伝子を宿主中で発現するこ
   とができるプラスミドによって形質転換された大腸菌 式 I 【遺伝子配列があります】