LT3133B - Po438, a new calcium-regulated promotor - Google Patents

Po438, a new calcium-regulated promotor Download PDF

Info

Publication number
LT3133B
LT3133B LTIP237A LTIP237A LT3133B LT 3133 B LT3133 B LT 3133B LT IP237 A LTIP237 A LT IP237A LT IP237 A LTIP237 A LT IP237A LT 3133 B LT3133 B LT 3133B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
dna sequence
streptomyces
promoter
sequence
polypeptide
Prior art date
Application number
LTIP237A
Other languages
English (en)
Inventor
Jose Daza Ortega
Jose Antonio Gil
Tomas Vigal Garcia
Juan Francisco Martin
Original Assignee
Serono Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Serono Lab filed Critical Serono Lab
Publication of LTIP237A publication Critical patent/LTIP237A/xx
Publication of LT3133B publication Critical patent/LT3133B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11001—Catechol 1,2-dioxygenase (1.13.11.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11002—Catechol 2,3-dioxygenase (1.13.11.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)

Description

... .1
LT 3133 B Išradimas yra iš biotechnologijos srities. Tiksliau, jis skirtas naujam kalciu reguliuojamam promotoriuį, kuris . naudojamas neląstelinių fermentų arba heterologinių polipeptidų ' gamybps padidinimui, 5 rekombinanto vektoriui, į kurį įeina promotoriaus, operatyviai sujungto su DNR. (dezoksiribonukleinine rūgštimi), užkoduojančia anksčiau paminėtą fermentą arba polipeptidą, DNR seka, šeimininko organizmui, v transformuotam rekombinanto vektoriumi, į kurį įeina 10 šis .promotorius, operatyviai sujungtas su DNR, užkoduojančia minėtą fermentą arba polipeptidą. Šis išradimas toliau skirtas Streptomyces ekspresijos sistemoms ir svetimų DNR sekų išreiškimo iš Streptomyces ir polipeptidų bei proteinų, užkoduotų/, 15 šiomis svetimomis DNR sekomis, išskyrimo į supančią terpę metodams. ' S-treptomyces bakterijos yra gerai 'žinomos įvairių . neląstelinių fermentų, apimančių proteazes, fosfatazes, 20 ksilanazes, · celiuliazes, .· amilazes, . lipazes ir. nukleazes, gamintojos.
Dar daugiau, Streptomyces genties nariai gamina daugybę antibiotikų, pigmentų ir kitų antrinių metabolitų ir 25 turi sudėtingą diferenciacijos struktūrą, · besibaigiančią sporų Susiformavimu. Streptomyces bandinių kultūrose. paprastai yra atitikimas tarp neląstelinių fermentų gamybos, antibiotikų gamybos pradžios, pigmento biosintezės ir sporų susidarymo.. 30 Visi šie procesai , yra slopinami : maitinimo sąlygų, palankiai veikiančių didelius augimo greičius, ir veikiami priešingai, badaujant P, C arba N šaltiniams. Neįtikėtina, kad fermento išskyrimas, antrinių metabolitų susidarymas ir diferenciacija yra visiškai 35 . nepriklausomi, bet . reaguoja į panašius paleidimo mechanizmus. 2
LT 3133 B
Buvo klonuoti keli Streptomyces genai., užkoduojantys neląstelinius fermentus. Jie ' apima agarazę, iš Streptomyces coelicolor,. endoglikozidazę H iš Streptomyces plicatus, ksilanazę iš Streptomyces lividans, alfa-amilazę iš Streptomyces hygroscopicus, celiuliazę · iš Strep.spA2f beta-galaktozidazę iš Strep. lividans ir beta-laktamazes iš Strep. cacaoi,badius ir fradiae.
Tačiau reguliavimo mechanizmai,* kurie kontroliuoja šių genų - ekspresiją, yra iš esmės nežinomi. Be specialių reguliavimo mechanizmų, tokių kaip amilazės ,indukcija dekstrinais ar maltotrioze ir amilazės ar agarazės anglies metabolinis reguliavimas, turbūt, iškyla bendri kelių neląstelinių fermentų skatinimo mechanizmai, kadangi Streptomyces buvo pastebėtas kelių polimerinio substrato degradavusių fermentų susidarymas tuo pačiu met^, sekant maitinimo poslinki, žemyn; Tokie reguliuojantys genai buvo rasti Bacillus subtilis (J. BACTERIOL. 169:324-333,1987), Bacillus natto {J. BACTERIOL 166:20-28,1986) ir Bacillus licheniformis.
Teigiami reguliavimo genai, veikiantys fermentų sintezę ir/arba išskyrimą, gali būti ‘klonuoti, ieškant padidinto neląstelinių fermentų išskyrimo prastuose sekreciniuose kamienuose, tokiuose, kaip S. lividans.
Svetimų DNR sekų išreiškimo iš Streptomyces sistemos buvo aukščiau aprašytos, pavyzdžiui, EP 148,552 ir W0 88/07o79. Tos sistemos naudoja Streptomyces pagamintus neląstelinių fragmentų endogeninius promotorius.
Endogeninių promotorių pakeitimas . svetiipais promotoriais buvo atskleistas W0 90/14426, kur aprašomas naujai izoliuoto geno, saf geno, užkoduojančio naują polipeptidą, vadinamą saf jsolipeptidu, kuris tiesiai arba netiesiai moduliuoja 3
LT 3133 B genų .ekspresiją. neląsteliniams fermentams iš Streptomyces, sąveikaujant su strtiktūrinių genų neįąsteiiniams fermentams kontroline' sritimi, klonavimas ir charakterizavimas.
Buy© prasta, kad saf geno . promotorius yra daug galingesnis - už neląstelinių fermentų natūralų promotorių. Pvz., amilazės genas išskiria daug daugiau amilazės, kai saf promotorius pakeičia natūralų 10 amilazės promotorių. Tuo ; būdu, saf promotorius gąli būti . panaudotas. vietoj proteino natūralaus promotoriaus, kad padidintų bet kurio endogeninio; polipeptido arba proteino ekspresiją. .· 15 Saf geno klonavimui ir charaktėrizavimui plazmidė piJ702 (Katz ir: kt. ;J; GEN.MICROBIOL. 129:2703- 2714,1983) buvo panaudota kaip klonavimo vektorius. Ši plazmidė turi savyje tirozinazės τ fermento, atsakingo už melanino susidarymą .iš trįozino keliuose 20 Streptomyces tipuose, geną. .. Buvo sudarytos · mel lokųso plazmidėje pIJ702 sekos ir nustatyti du atviri skaitymo 7;-7 rėmai (ASR) : pirmas . ARS (ORF-angl.) > atitinkantis mel ; geną, kuris koduoja polipeptidinę tirozinazės grandinę,; ir antras ARS, išdėstytas mel genui prieš srovę, -kuris 25 buvo pavadintas ORF438 (Bernan ir kt. GENE 37:101“ 110,1985) ir kurio vaidmuo dar neaiškus.
Tyrinėjimuose, tiksliai nustatant saf geno vietą, i pIJ702 BglII vietą buvo įterptas fragmentas Šstl^ffenlf 30 (432 nukleotidai-saf genas be:7 prėtobtorlm^)
Stebinantis šių tyrimų aspektas buvo šio fragmento: ekspresijos nebuvimas, kai įterpiama' tiesia ‘orientacija, ir jo. ekspresija, kai į ORF438 įterpiama priešinga kryptimi (prieš laikrodžio rodyklę). Šis 35 atradimas reiškė fragmento su promotoriaus poveikiu buvimą prieš mel geną ir Bglll klonavimo vietoje, esančioje ORF438' viduje, su priešinga orientacija. • > · 4
LT 3133 B
Pagrindinis šio išradimo tikslas yra pateikti naują promotorių, kuris buvo nustatytas DNR fragmente, esančiame pIJ702 plazmidės ORF438 viduje. Promotoriaus poveikis yra teigiamai reguliuojamas kalcio jonų, ir 5 genų ekspresija neląsteliniams fermentams iš Streptomyces, operatyviai sujungtiems su anksčiau minėtu promotoriumi, yra labai padidinama, dalyvaujant CaCl2 tirpalams. 10 .Kitas šio išradimo a'spektas 'yra pateikti klonavimo nešėjus (vektorius), kurie apima aukščiau minėtą promotorių, operatyviai sujungtą su endogeninė arba svetima DNR seka, užkoduojančia polipeptidą arba proteiną, taip pat šeimininko organizmus arba ląsteles, 15 . transformuotas tokių klonuojančių nešėjų, dėl to sukeliančių ekspresiją ir polipeptidų, užkoduotų minėta DN|R. seka, išskyrimą.
Kitas šio išradimo aspektas yra tokio klonavimo nešėjo, 20 nešančio svetimą DNR seką, integracija i, Streptomyces chromosominę DNR.
Dar vienas šio išradimo aspektas yra neląstelinio fermento, reikalingo polipeptido arba proteino 25 paruošimas, . kultivuojant transformuotą šeimininko orepnizmą pagal šį išradimą ir išskiriant produktą .iš šios kultūros skystos terpės.
Naujas . promotorius, turėtas rėme ORF438, rodo 30 promouoriaus poveikį priešinga orientacija ORF438 orientacijai ir toliau yra vadinamas Po438 (Promotorius, . priešingas ORF438). Žinios apie 3° laikrodžio rodyklės krypties promotoriaus pįazmidėje pIJ702 veiksmingumą yra labai svarbios, kad išvengtume klaidingų interpretacijų DNR fragmentų, klonuotų šiame vektoriuje, genų ekspresijos tyrimuose. 35 5
Promotorius Po438 yra . pirmas žinomas kalciu reguliuojamas promotorius, kuris buvo charakterizuotas Streptomyces ir gali būti panaudotas padidinti išrinktų heter©loginių proteinų išskyrimą ' iš Streptomyces,'Z. 5 įterpiant DNR fragmentą, turinti, savyje promotorių Po438, į tinkamą suskaidymo vietą prieš' srovę genui, koduoj ančiam, reikalingą proteiną tinkaaiaame klonavimo r nešėjuje, transformuojantį’ Streptomyces šeimininką su tokiais klonuojančiais nešėjais ir kultivuojantį 10 transformuotas, bakterijas, dalyvaujant Ca2+ tirpalui, kad išskirtų pasirinktą proteiną arba .jo ‘ dalį.
Po438 promotoriaus ' :veiksmingumas buvo nustatytas, 1 panaudo j ant v du promotoriaus-bandinio vektorius. DNR 15 fragmentas, apimantis promotorių’ Po438, buvo subklonuotas ' : dviejose .· skirtingose plazmidėse, ' nešančiose atitinkamai nestimuliuojantį aminoglikozido 'lir.l/'^fpsfobrąnsferazės,'' :;:geną (neo) ir - ne stimuliuojant į kate ch o1o di oks igenazės geną. {XylE) (1 brėž.). Abu 20 genai·. .; daug kiekvieno : fermento, dalyvaujant didėjančioms kalcio jonų koncentracijoms, tuo būdu, Po438 kalciu : reguliuojamą· promotoriaus veiksmingumą. . ' 25 Transkripcijos pradinis taškas Po438 promotoriųje buvo nustatytas t SI nuklėazės kartografiniu eksperimentu, i- kuris nustatė, pradinį ; tašką C 24-, nt. (angį.) nuo\'}]Sstix : Įfeorddoš yį: pridedamus brėžinius: · .
Fig. 1. Plazmidžių pULADSO ir pULAD51f nešančių pIJ702 i lapifflančio Po438· 242 bp Sstl-BglII fragmentą, klonuotą i pfomotoriąus-bandinio vektoriuose pIJ487 (Ward ir. kt. 35 1986) ir pIJ4Q83;. struktūra.
Fig. 2. pĮJ702 242 bp Sstl-BglII frgmento promotoriaus veiksmingumas. Kanamicino gradientas (0-180 ug/ml -angį.) buvo nustatytas kietoje MM (minimalioje terpėje) (Hopwood, 1967) ir buvo štrichuotas (streaked - angį.) su S. lividans, nešančiais plazmidę pULAD50 (A) arba piJ487 (B). .
Fig. 3. pULAD50 srities, nešančios pIJ702 242 bp Sstl-Bgl II fragmentą, scheminis išdėstymas ir. strategija, sekanti SI kartografijai. Diagramoje baras, pažymėtas žvaigždutėmis, vaizduoja pažymėtą fragmentą, o baras su SI vaizduoja gautą apsaugotą fragmentą. Takai A-C-G-T rodo keturias" sekos reakcijas M13mpl8 vienintelei atsajai DNR (dešinė) ir 242 bp Sstl-BglII fragmentui iš piJ702 (kairė). 1 - Apsaugotas fragmentas hibridizacijoje tarp pULAD50 270 nt. HindlII-SstI fragmento ir mRNA iš S. lividans [ pULAD50] . 2 - 270 nt. HindlII-Sstl bandinys. 3 - 242 nt. BglII-SstI bandinys. 4 - Apsaugotas fragmentas hibridizacijoje tarp pIJ702 242 nt. BglII-SstI fragmento ir mRNA .iš S. lividans [ piJ702] .
Rodyklių smaigaliai žymi hibridizacijos juostas, atitinkančias apsaugotiems fragmentams.
Fig. 4 DNR srities mel klasteryje, kuris apima ORF438v nukleotidų seka, pažyminti jos amino rūgšties seką'. Yra parodytos BglII ir SstI apribojimo vietos, kurios ribojasi su DNR fragmentu, klonuotu pIJ487r kad sudarytų pULAD50.
LT 3133 B . oo —» Mel matricos iniciavimas pagal Geistlich ir kt. (1989) ir Leu ir kt, (1989), oo Transkripcijos iniciavimas ,iš Po438 pagal 5 Slnukleazės kartografinius eksperimentus (Fig 3). .·. rbs ribosomasurišanti vieta .
Fig. 5. Ekspresijos iš Ro438· promotoriaus fosfato 10 slopinimas. Neomicino gradientas (0-180 ug/ml) buvo padarytas ant kieto MM+TES (angį.), buferio 825. mM, pH 7,2 (viršutinė plokštelė) ir ant tos, pačios- terpės.,. - . papildytos 20' MM .natrio fosfato buferiu, pH 7,2 (žemutinė plokštelė). Abi plokštelės buvo štrichuotos 15 . su panašiu S. lividans [ pULAD5Q] sporų kiekiu.
Fig. 6. 'Pseudomonas putida nestimuliuojančio XylE geno, patalpinto Po438 promotoriui pasroviui, ’ kalcio, indukciją Str iptomyces bakterijose. S- lividans 20 [ pULAD51] buvo auginamos R2YE skysto j-e terpėje (·) be kalcio ir R2YE terpėje, papildytoje CaC12 iki 60 mM(Δ). S. lividans, transformuotų su piJ4083 (o), katecholo : dioksigenazės aktyvumas (Cat. 02 azė) nebuvo keičiamas, : kai .buvę ' au0«įnama R2YE terpėje su arba be CaCl2. ’ 1 25 '·; _ ,Čia; -aprašomas : darbas buvo atliktas, , naudojant tokias" medžiagas ir metodus.
Bakteriniai kamienai ir plazmidės. Streptomyces 30 kamienai ir plazmidės, naudojami šiame tyrime, : yra išvardinti 1-oje lentelėje.
Terpė ir auginimo sąlygos. Protoplast., Streptomyces kamienų transformacija buvo auginama R2YE, minimalioje 35 terpėje (MM) arba YEME, papildytoje 34% sacharozės ir 5 mM MgCl2 (Hopwood ir kt., Genetic m^nipulation pf Streptomyces. A. LABORATORY MANUAL. The John t Innes 8
LT 3133 B
Foundation., Norwich, U.K., 1985). Skystos Streptomyces kultūros buvo auginamos kolbose su trimis pertvaromis 28°C temperatūroje besisukančiame kratytuve su 220 rmp (angį.) kratymu. 5 S. lividans protoplastų paruošimas ir transformacija buvo tokie, kaip aprašyta (Thompson ir kt., J. BACTERIOL. 151:668-677, 198¾). 10 -DNR izoliacija, manipuliacija ir DNR sekų sudarymas. Plazmidė DNR buvo atskirta, ' naudojant Kieser būdą (Kieser ir kt., PLAZMID 12:19-36,1984). Įsisavinimas ir ligavimas buvo kontroliuojami agarozės helio elektroforeze. Įsisavinimo sąlygos su endonukleazės 15 apribojimu ir ligavimo reakcijos buvo tokios, kokios rekomenduotos gamintojų. DNR fragmentų subklonavimas buvė atliekamas, įsisavinant 1-2 ug DNR plazmidės su atitinkamu apribojančiu fermentu(-ais), ir reakcijos produktai buvo atskiriami helio elektrpforeze žemame 20 agarozės lydymosi taške (LMPA - angį.).
Nukleotidų seka buvo nustatyta Sanger grandinės nutrūkimo;metodu (Sanger ir kt., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 74:5463-5467,1977), naudojant M1 3 klonus (Messing 25 ir kt., NUCL,. ACIDS RES. 9:309-321, 1981).
RNR (ribonukleininės rūgšties) izoliacija ir SI nukleazės kartografija. RNR buvo atskirta pagal Kirby (Kirby ir kt., Biochem J. 104:258-262, 1967) iš 50-ties 30 valandos kultūrų MM terpėje. SI kartografijai DNR
bandiniai buvo galuose pažymėti (Maxam and Gilbert, METHODS ENZYMOL. 65:499-560,’ 1960). RNR (40 ug) . buvo sumaišyta su 105 c.p.m. [ 32p] -gale pažymėtu HDNR fragmentu ir denatūruojama 85°C 15 min. (Favalora ir 35 kt., METHODS ENZYMOL. 65:718-749, 1980). Hibridizacija buvo atliekama 60°C temperatūroje 3 valandas, apdorota su 60 vienetų SI nukleazės ir SI įsisavinimo produktas 9
LT 313 3 B buvo uždėtas ant 7% (w/v turinčio 7¾ šlapalo ir fagu ir pIJ702 242 bp metodu) . angį.) poliakrilamįdo helio, i leistas su M13 mpl8 BglII-SstI fragmentu (sekos
Katecholo dioksigenazės veiksmingumasPlokštelių bandomuose Stresptomycest r ans formanto koloni j os buvo augintos 2 8 C tenperatūro j e 3 dienas , ir plokštelės buvo apipurkštos: 0,5 M kateėholio vandėniniu "tirpalu. S kyšt i ems bandiniams ' Streptomyces kamieną i buvo aug in t i 28°C temperatūroje 50—tyje ml R2YE skystos terpės be CaCl2 arba papildytos CaCl2 (60 mM) . Įvairiu laiku buvo •imami bandiniai ir katecholo dioksigenazės veiksmingumas buvo nust at inė j amas taip, .kaip aprašyt a (Ingram ir ktJ. BACTERIOL 171:6617-6624, * 1989) . Proteino/ koncentracijos buvo nustatinėjamos Bradfordo . metodu, -panaudojant jaučio serumo .... albuminą kaip etaloną (Bradford, AMAL.B10CHEM. 72:248-254, 1976).
Tokie .smulkūs aprašymai iliustruos šį išradimą:
Po438 promotoriaus veiksmingumas · buvo nustatytas aminogl i ko zido f os fo trans f ex az ės geno ir katecholo dioksigenazės geno, · turėtu dviejuose 'skirtinguose promotoriuose-bandiniuose, ekspresija-
Aminoglikozido fosfotransferazės genoekspresija pIJ702 plazmidės 242 bp Bgllir-Sstl; - ifragmentas buvo subklonuotas į pIJ487 (Ward ir kt-, MOL.GEN-GENET. 203:468-478, 1986), kuris nešė nestimuliuojantį aminoglikozido fosfotransferazės geną (neo)» Šio geno: ekspresija palygina ’ Kamicino (km) ir nepmicino a t sparumą Strept omyces livi dans. Taip : buvo sukurtą plazmidė pULABSO : (Fig. 1) . S. lividans, transformuotos su pūLADSO, galėjo augti minimalioje terpėje, 10
LT 3133 B sudarytoje iš daugiau kaip 15 ug/ml Km, kur S. lividans, transformuotos su pIJ487 (promotoriaus-bandinio vektorius be įterpto promotoriaus), neaugo MM su 1.0 ug/ml Km, kaip parodyta fig. 2. Šis rezultatas aiškiai parodo, kad pIJ7Q2 BglII-SstI fragmentas turi promotoriaus veiksmingumą Streptomyces' bakterijose su orientacija iš SstI vietos į BglII vietą.
Katecholo dioksigenazės geno ekspresija. 242 bp BglII-.SstI fragmentas, kaip- aukščiau pateiktame pavyzdyje, buvo - subklonuotas į skirtingą p'romotoriaus-bandini© vektorių, plazmidę pIJ4083, kuri nešė XylE geną iš Pseudomonas putida, . koduodama fermentui katecholo dioksigenazę. Hibridinė plazmidė buvo pavadinta pULAD51 (fig. 1). Streptomyces lividans, transformuotos su pULAD51, buvo auginamos R2YE terpėje,' papildytoje CaC12 iki . 60 Mm. Kiekybinis katecholo dioksigenazės veiksmingumo įvertinimas parodė, Po438- daro įtaką promotoriaus veiksmingumui taip pa"fc, kai įterpiamas genui XylE. prieš srovę (fig. 6) .
Ekspresijos iš Po438 reguliavimas kalcio jonais
Buvo nagrinėjama įvairių kalcio jonų įtaka Po438 promotoriaus veiksmingumui. Kadangi Katamicino atsparumo lygis priklauso nuo druskos kiekio auginimo terpėje (Hopwood ir kt.., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, .U.K., 1985), šleifais tyrinėjimams buvo panaudotas neomicinas(neo) minimalioje terpėje. Visais atvejais MM buvo papildyta TĘS buferiu (25 rrtM, pH 7.2), kad būtų išvengta pH pasikeitimų. Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ katijonai neturi įtakos Po438 stiprumui (atsparumas 170 ug/ml Neo ant MM plokštelių), tuo tarpu, kai keli vienvalenčiai katijonai (Na+, K+, Li+,
Cs+, 10 mM) silpnai sumažina promotoriaus veiksmingumą, ir nebuvo augimo MM, sudarytoje iš daugiau kaip 100 i 11
LT 3133 B ug/ml Neo. Promotoriaus veiksmingumo sumažėjimas buvo pastebėtas taip pat, kai MM buvo papildyta natrio fosfato, buferiu (20 mM, pH 7.2) , kaip) parodyta fig. 5. 5 Kalcio jonai teigiamai reguliuoja Po438 promotoriaus aktyvumą. Ča2+ žymiai padidi-no Neo'. S. lividans transformuotų su plazmide pULAD50, ..atsparumą, ir buvo parodytas griežtas ryšys tarp CaC12 koncentracijos ir Neo atsparumo lygio (2-a lentelė). 10 ' ll;,
Plažmidė pULAD60 yra panašios plazmidės su tuo pačiu neo-genu, sujungtu su skirtingu promotoriumi, - promotoriumi saf, kaip buvo aprašyta WO 90/1.4426, pavyzdys. Tačiau neo stabilumas S. lividans, 15 transformuotų su pULAD60, nebuvo modifikuotas, auginant MM, turinčioje skirtingas CaČ12 koncentracijas (0,10, 20, 30, 40 , mM) , Įteigdamas, . kad nėra nei potransliacinės nėo geno produkto' stimuliacijos, nei neomicino ;kalcir inaktyvacijosJei Ca poveikis nebūtų 20 specifinis, stimuliacinis poveikis būtų ; stebimas su i; visomis struktūromis. Tai rodo, kad Po438 promotoriaus veiksmingumas yra Specifiškai . reguliuojamas kalcio ' jonų. 25 Kalcio indukcija t.p. buvo stebima .S. lividans, transformuotų su plazmide pULAD51, XylE ekspresijoje, . kaip parodyta fig. 6. Katecholio dioksigenazės veiksmingumas (Cat 02 azė) žymiai padidėjo., kai R2YE kultūrinė terpė buvo papildyta CaCl2 iki . 60 mM * 30 koncentracijos. S. lividans, transformuotų su pIJ4038 (promotoriaus-bandinio vektorius - be promotoriaus
Po438), katecholio dioksigenazės veiksmingumas, priešingai, nesikeitė, kai buvo auginama R2YE terpėje su arba be kalcio chlorido.- 35 ' 12 ' Tramskripci jos pirmo taško Po438 mas-tatynu-s .SI nukleazės kartografiniai eksperimentai buvo atlikti, kad nnatatytame transkripcijos pradini tašką ir Po438 5 promotoriaus seką. 270 hp Hindi II-SsrtI .fragmentas., .ėė., atskirtas iš plazmidės pULAD'50, .buvopažymėtas Rindlll 'λ.\ / '5r..- Agale : ir hibridi motas su mKffiL, " atskirto iš · S. lividansp nešančių pūLAD50. Apsaugotas fragmentas pasirodė dydžiu apie 24 nt trtmpesnis irėgu· kontrolinis 10 bandinys (fig. 37» todėl pradinis transkripcijos taškas buvo nustatytas apie C 24 nt nuo SstI vietos (fig. 4). Antras SI nukleazės kartografinis eksperimentas buvo atliktas su pirmine plazmide pIJ702, kuri taip pat apima Po438 DNR ·' sritį. pIJ702 242 bp BgllI-SstI 15 fragmentas buvo 'panaudotas k.aip .bandinys.. Fragmentas buvo pažymėtas BgLTI 5* gale ir .hibridizuotas su mRNA, atskirtais iš S. lividans, transformuotomis su pi J702. : ¾ Fig. 3 rodo, kad apsaugotas fragmentas buvo dar' .24 nt: trumpesnis negu bandinys, pažymėdamas» kad trans-20 kripcijos iniciacija pasirodo pIJlOŽ panašiame nukleotide, kaip ir pULADSO.
Fig. 4 rodo mel geno ORF 438, išdėstyto apie 30 nt prieš ORF 438 pradinį kodoną, promotoriaus^ ^tyvacij os : 25 sritį (Geintlich ir kt., Kolecular Microbiology 3:1061-1069, 1989i beu ir kt., GENE 84r267-277,1589r kaip ir Po438 promotorių, išdėstytą priešinga orientacija ORF 438 orientacijai ir jo tr anskripc i j os pradinį tašką pagal šio darbo SI nukleazės kartografinį eksperimentą.
Hors aminoglikozido fosfotransferazės genas ir i. katecholio dioksigenazės genas buvo apibūdinti pavyzdžiais, reikėtų suprasti, jog tam, kad padidėtų ekspresija, panaudojant promotorių Eo43®, geną? bet 35 kuriam polipeptidui af* proteinui, pagamintas panaudojant Streptgmyces tipus, gali būti modifikuotas,v pašalinant .gimtąjį promotorių ir pakeičiant jį Eo438 13
LT 3133 B promotoriumi.. Panašiai svetima DNR, koduojanti polipeptidą ar proteiną, gali būti įtefpta i, bet kurį tokį endogeninį geną. Tačiau geriausia parinkti tokį endogeninį geną, kuris išskiria proteiną per ląstelės 5 sienelę kultūrinė j.e terpėje, ir tuo atveju svarbu išlaikyti sekrecinę signalo seką. Tuo būdu, svetimą DNR geriausia įterpti tokiu būdu, kad ·. išlaikytume sekrecijos signalus kiek galima daugiau nuo , neiąstelinio fermento geno. Nors šie signalai dominuoja 10 vyraujančio j sekoj, endogeninių genų neląsteliniajns fermentams atžvilgiu akivaizdu, kad terminalinis karboksilo galas yra taip pat svarbus sekrecijai.· Tuo . būdu, būtų geriau sukurti lydymosi, proteiną, įterpiant svetimą DNR seką į; endogeninę DNR, negu pašalinti .·' 15 transkripcinę endogenines DNR dalį, pakeičiant svetima' ' DNR... ·
Taip pat reikėtų suprasti, kad svetima DNR seka gali būti 'bet kuri ne iš Streptomyces išvesta DNR seka, 20 užkoduojanti proteiną arba polipeptidą, ypač eukariotinės arba virusinės prigimties. Tokių eukariotinių arba virusinių DNR sekų pavyzdžiai yra sekos./ užkoduojančios žmogaus arba -gyvulio leukocitų interferonus (INF-alfa), žmogaus insuliną, žmogaus ir 25 gyvulio augimo ir kitus hormonus, tokius kaip kortikotropįno išskyrimo faktorius (KIF), žmogaus serumo albuminas ir įvairūs žmogaus kraujo faktoriai ir plazminogeniniai aktyvatoriai, audiniai ir urokinazė, virusinis hepatito B branduolys ir paviršiaus antigenai _ 30 bei kiti žmogaus ir gyvulio virusiniai polipeptidai ir proteinai. 14
LT 3133 B 1 lentelė. Kamienai ir plazmidės
Pažymėjimas Svarbios charakteristikos Literatūros šaltinis S. lividana JI1326 laukinis tipas JI S. antibioticus ATCC 11891 . laukinis tipas, melanino gamintojas ATCC piJ702 tiostreptono atsparumas ir melaninas* ' Katz ir kt., 1983 pULAD60 pIJ702, nešantis saf promotorių WO90/14426 piJ487 promotoriaus-bandinio vektorius dėl Strepto-myces, nešantis neo geną kaip pranešėją Ward ir kt., 1983 pULAD50 · pIJ487, nešantis 242 bp.Sstl-BglII fragmentą iš pIJ702 Šis darbas piJ4083 promotoriaus-bandinio vektorius dėl Strepto-mycesr nešantis Xy2E geną kaip pranešėją pULAD51 pIJ4083, nešantis 242 bp Sstl-BglII . fragmentą iš pIJ702 Šis darbas JI, mikroorganizmų kolekcija iš John Innes Institute, Colney Lane, Norwich; NR4UH, UK; ATCC, American Type Culture Collection 15
LT 3133 B 2 lentelė. S. lividans [ pULAD50] , augančių MM terpėje, papildytoje CaCl2, neomicino atsparumo lygis C_aCl2 koncentracija (mM) ‘ Neo atsparumas (μg/ml) o · • · ' 180 10 30.0 20 ‘650 30 * . 1100 40 1900 5 Literatūra, cituota brėžiniuose ir 1-je lentelėje GEISTLICH M.. , Irniger S. and Hutter R. : Localization and functional’ analysis of the regulated promoter from the Streptomyces glaucescens mel operon. Molecular 10 Microbiology.· 3 (1989) 1061-1069. HOFWOO.D. D.A. : Genetic analysis and genome structure in Streptomyces poelicolor. Bacterial. Rev. 31 (1967) 373-403.. . ' * 15 ' ' KATZ, E.·, Thompson, C. J. and HopvTood, D.A. : Cloning and expression of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus in Streptomyces lividans. J. Gen. Microbiol. 1^9 (1983) 2703-2714. 20 ·. - LEU, W.-M.,'Wu, S.-Y., Lin, J.-J., Lo, S. Ji, and Vilu
Lee, Y.-H.: Analysis of the promoter region of the melanin locus from Streptomyces antibioticus. Gene 84 (1989) 267-277. ' 2.5 . WARD,, J.M., Jansen, G.R., Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M. J. and Bibb, M.J.: Construction and chąracterization of a series of multi-čopy promoter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the 30 aminoglycoside phpsphotransferase gene from Tn5 as. indicator, Mol. Gen. Genet. 203 (1986) 468-478.

Claims (11)

16 16
LT IŠRADIMO APIBRĖŽTIS 1. Kalciu reguliuo j amas promotorius,· kurio DNR seka. .yra: ·. 5 ' CCGCGGCGCGCGGGGTGTCCACCGGCTCGTAGTGGCTGACGACGCTGATCCACGA GCCGTCGGCGTTGCGCATCACATCGAGTTCGACGCCGTCCACGAACACGGCGTAA CCGCCGCCGTGATGGCCGCCGCCGTGAGCGTGACCGCCGTGACCGeCGCCGTGGT f GGCCCCCGCCGTCGGTGACCGTCCGGCCCTGTATCCGGCGGCCCTTGTAGATCT 10 arba .jos"fragmentai, turintys tą patį poveikį.
2. DNR seka, kuri hibridizuoja su nukleotidų seka pagal ·. \ . 1 punktą ir turi kalciu reguliuojamą promotoriaus 15 veiksmingumą.
3. Kldnuojsntis nešėjas, apimantis DNR seką, užkoduojančią polipeptidą arba proteiną, operatyviai sujungtą su promotoriumi pagal 1 punktą. 20:
4. Klonuojantis nešėjas pagal 3 punktą, b e s i,;;s,..k·./į; r i a n t i s tuo, kad paminėta DNR seka yra endogeninė Streptomyces bakterijoms.
5. Klo juo j antis nešėjas pagal 3 punktą, b e si .s k' r i a n t i s tuo, kad minėta DNR seka apima visą;arba : dalį sekos, užkoduojančios polipeptidą arba proteiną, endogeninį Streptomyces bakterijoms, į kurį susiliejo tame pačiame skaitymo rėme DNR seka, užkoduojanti ne 30 Stretffimyces polipeptidą arba proteiną.
6. Streptomyces šeimininko ląstelė, transformuota: su. klonuojančių nešėju pagal 3 punktą. > _ .
7. Streptomyces šeimininko ląstelė, transf ormuota su klonuojančių nešėju pagal 4 punktą. 17
8. Streptomyceš šeimininko ląstelė, transformuota šu klonuojančiu .nešėju pagal 5 punktą. ♦
9. Svetimos DNR sekos Streptomyceš ekspresijos būdas, 5 b e s i s k i r a, i n t i s tuo, kad apima operatyvų minėtos DNR sekos sujungimą su Streptomyce's ekspresijos kontrolės seka,. į kurią Įeina promotorius pagal 1 punktą.
10 10. Būdas pagal 9 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad minėtą svetimą DNR seką ir Streptomyceš ekspresijos kontrolės seką Įterpia 1 chromosominę Streptomyceš DNR. 15
11. Būdas pagal 9 punktą, bes i s k' i r i antis tuo, kad svetimą DNR seką operatyviai sujungia su 'minėta Streptomyceš. ekspresijos kontrolės seka per DNR seką, užkoduojančia bent dali - proteino arba polipeptido, išskirto iš Streptomyceš signalo sekos, ir 20 kad minėtą DNR seką, užkoduojančią signalo seką, išreikštą kartu su'minėta DNR seka, · kontroliuoja, minėtai Streptomyceš ekspresijos kontrolės seka,; kad būtų išskirtas proteinas arba polipęptidas, .užkoduotas svetima· DNR seka. .
LTIP237A 1991-12-12 1992-12-11 Po438, a new calcium-regulated promotor LT3133B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES9102765 1991-12-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP237A LTIP237A (en) 1994-07-15
LT3133B true LT3133B (en) 1995-01-31

Family

ID=8274462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP237A LT3133B (en) 1991-12-12 1992-12-11 Po438, a new calcium-regulated promotor

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5385841A (lt)
EP (1) EP0546833B1 (lt)
JP (1) JP3340164B2 (lt)
AT (1) ATE154392T1 (lt)
AU (1) AU661073B2 (lt)
CA (1) CA2084351C (lt)
DE (1) DE69220336T2 (lt)
DK (1) DK0546833T3 (lt)
ES (1) ES2103902T3 (lt)
GR (1) GR3024625T3 (lt)
IL (1) IL103975A (lt)
LT (1) LT3133B (lt)
LV (1) LV10728B (lt)
RU (1) RU2112802C1 (lt)
ZA (1) ZA929284B (lt)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA929284B (en) * 1991-12-12 1993-06-02 Serono Lab P0438, an new calcium-regulated promoter.
US6381353B1 (en) 1996-08-30 2002-04-30 Marvin Weiss System for counting colonies of micro-organisms in petri dishes and other culture media

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0148552A1 (en) 1983-06-07 1985-07-17 Biogen, Inc. Streptomyces expression sequence and methods for expressing DNA sequences in streptomyces
WO1988007079A1 (en) 1987-03-09 1988-09-22 Cetus Corporation Expression of heterologous genes in streptomyces species
WO1990014426A2 (en) 1989-05-19 1990-11-29 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Saf polypeptide, gene, promoter and use for expression in streptomyces

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766066A (en) * 1984-09-27 1988-08-23 Eli Lilly And Company Method of using bacteriophage lambda p1 promoter to produce a functional polypeptide in streptomyces
US4745056A (en) * 1984-10-23 1988-05-17 Biotechnica International, Inc. Streptomyces secretion vector
DE3536182A1 (de) * 1985-10-10 1987-04-16 Hoechst Ag Promotor-anordnung fuer streptomyceten-vektoren
US5200327A (en) * 1985-11-06 1993-04-06 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from streptomyces
ZA929284B (en) * 1991-12-12 1993-06-02 Serono Lab P0438, an new calcium-regulated promoter.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0148552A1 (en) 1983-06-07 1985-07-17 Biogen, Inc. Streptomyces expression sequence and methods for expressing DNA sequences in streptomyces
WO1988007079A1 (en) 1987-03-09 1988-09-22 Cetus Corporation Expression of heterologous genes in streptomyces species
WO1990014426A2 (en) 1989-05-19 1990-11-29 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Saf polypeptide, gene, promoter and use for expression in streptomyces

Also Published As

Publication number Publication date
IL103975A0 (en) 1993-05-13
LTIP237A (en) 1994-07-15
JP3340164B2 (ja) 2002-11-05
US5660999A (en) 1997-08-26
GR3024625T3 (es) 1997-12-31
AU661073B2 (en) 1995-07-13
DE69220336D1 (de) 1997-07-17
LV10728A (lv) 1995-06-20
RU2112802C1 (ru) 1998-06-10
ATE154392T1 (de) 1997-06-15
CA2084351C (en) 2007-04-10
DK0546833T3 (da) 1997-09-15
ES2103902T3 (es) 1997-10-01
US5385841A (en) 1995-01-31
ZA929284B (en) 1993-06-02
AU2979192A (en) 1993-06-17
EP0546833A2 (en) 1993-06-16
DE69220336T2 (de) 1997-09-25
CA2084351A1 (en) 1993-06-13
EP0546833A3 (lt) 1994-04-06
IL103975A (en) 1998-08-16
JPH05336972A (ja) 1993-12-21
LV10728B (en) 1995-12-20
EP0546833B1 (en) 1997-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4399158B2 (ja) 乳酸菌における異種遺伝子産物の製造のための改良発酵法
Nodwell et al. An oligopeptide permease responsible for the import of an extracellular signal governing aerial mycelium formation in Streptomyces coelicolor
US7083980B2 (en) Tn5 transposase mutants and the use thereof
Hulett et al. Sequential action of two-component genetic switches regulates the PHO regulon in Bacillus subtilis
van Thor et al. Salt shock-inducible photosystem I cyclic electron transfer in Synechocystis PCC6803 relies on binding of ferredoxin: NADP+ reductase to the thylakoid membranes via its CpcD phycobilisome-linker homologous N-terminal domain
Errington et al. Structure and function of the spoIIIJ gene of Bacillus subtilis: a vegetatively expressed gene that is essential for σG activity at an intermediate stage of sporulation
Steiert et al. A Gene Coding for a Membrane–Bound Hydrolase is Expressed as a Secreted, Soluble Enzyme in Streptomyces Lividans
Donohue et al. Cloning and expression of the Rhodobacter sphaeroides reaction center H gene
KR20000075076A (ko) 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법
WO2021100640A1 (ja) 改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法、及び、タンパク質の製造方法
JPS62181789A (ja) バチルスの制御領域のクロ−ニング及び解析のためのプラスミド
Wang et al. Bacillus subtilis RNase III gene: cloning, function of the gene in Escherichia coli, and construction of Bacillus subtilis strains with altered rnc loci
Solioz et al. Operon of vacuolar-type Na (+)-ATPase of Enterococcus hirae
EP0448180B1 (en) A method of modulating the production of secondary metabolites
EP0429600B1 (en) Saf polypeptide, gene, promoter and use for expression in streptomyces
Nesmeyanova et al. Secretion of the overproduced periplasmic Pho A protein into the medium and accumulation of its precursor in pho A-transformed Escherichia coli strains: involvement of outer membrane vesicles
LT3133B (en) Po438, a new calcium-regulated promotor
US5389526A (en) Plasmid vectors for cellular slime moulds of the genus dictyostelium
Casey et al. Suppression of mutants aberrant in light intensity responses of complementary chromatic adaptation
CA2827774A1 (en) Regulated gene expression systems and constructs thereof
Mongkolsuk et al. Transcription termination signal for the cat-86 indicator gene in a Bacillus subtilis promoter-cloning plasmid
RU2114910C1 (ru) Фрагмент днк, полученный путем молекулярного клонирования из streptomyces griseus атсс 10137, кодирующий saf-полипептид, saf-полипептид, рекомбинантная плазмидная днк, определяющая экспрессию saf-полипептида (варианты), рекомбинантная плазмидная днк pulad3, рекомбинантная плазмидная днк pulad 300, штамм грибов streptomyces lividans, содержащий рекомбинантную плазмидную днк pulad3, и способ экспрессии saf-полипептида
US7718396B2 (en) Inducible high expression system
JPH05284973A (ja) 組換プラスミドおよびこれをベクターとして用いる異種蛋白質の分泌生産方法
RU2221868C2 (ru) Ген l-аспарагиназы erwinia carotovora и штамм escherichia coli вкпм № в-8174 - продуцент l-аспарагиназы erwinia carotovora

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20081211