JP2012055269A - 核酸、核酸によりコードされるタンパク質、核酸が導入された組換え生物、及び組換え生物により作られるタンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の(a)〜(d)のいずれかの核酸。(a)特定の塩基配列を有する核酸。(b)特定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸。(c)前記(a)の核酸と90%以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸。(d)前記(a)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸。
【選択図】なし
Description
(a)配列番号1又は19の塩基配列を有する核酸
(b)配列番号2又は20のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
(c)上記(a)の核酸と90%以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
(d)上記(a)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
(e)配列番号3、5、7、9、11、13、15又は17の塩基配列を有する核酸
(f)配列番号4、6、8、10、12、14、16又は18のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
(g)上記(e)の核酸と90%以上の配列同一性を有する核酸
(h)上記(e)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
(i)配列番号21、23、25、27、29、31、33又は35の塩基配列を有する核酸
(j)配列番号22、24、26、28、30、32、34又は36のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
(k)上記(i)の核酸と90%以上の配列同一性を有する核酸
(l)上記(i)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
(m)配列番号2又は20のアミノ酸配列
(n)上記(m)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(o)以下の(o−1)又は(o−2)のアミノ酸配列を有し、配列番号2のアミノ酸配列と70%以上、好ましくは80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(o−1)配列番号4、6、8、10、12、14、16又は18のアミノ酸配列
(o−2)上記(o−1)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(p)以下の(p−1)又は(p−2)のアミノ酸配列を有し、配列番号20のアミノ酸配列と70%以上、好ましくは80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(p−1)配列番号22、24、26、28、30、32、34又は36のアミノ酸配列
(p−2)上記(p−1)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
[X1−X2−X3−(X4)m−(X5)m−(X6)m−X7−X8]n (1)
(a)配列番号1又は19の塩基配列を有する核酸
(b)配列番号2又は20のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
(c)上記(a)の核酸と90%以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
(d)上記(a)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
(e)配列番号3、5、7、9、11、13、15又は17の塩基配列を有する核酸
(f)配列番号4、6、8、10、12、14、16又は18のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
(g)上記(e)の核酸と90%以上の配列同一性を有する核酸
(h)上記(e)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
(i)配列番号21、23、25、27、29、31、33又は35の塩基配列を有する核酸
(j)配列番号22、24、26、28、30、32、34又は36のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
(k)上記(i)の核酸と90%以上の配列同一性を有する核酸
(l)上記(i)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
(m)配列番号2又は20のアミノ酸配列
(n)上記(m)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(o)以下の(o−1)又は(o−2)のアミノ酸配列を有し、配列番号2のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(o−1)配列番号4、6、8、10、12、14、16又は18のアミノ酸配列
(o−2)上記(o−1)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(p)以下の(p−1)又は(p−2)のアミノ酸配列を有し、配列番号20のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(p−1)配列番号22、24、26、28、30、32、34又は36のアミノ酸配列
(p−2)上記(p−1)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
[X1−X2−X3−(X4)m−(X5)m−(X6)m−X7−X8]n (1)
[(α)(V)(β)]q (2)
・Cheryl Y.Hayashi et al.,Evidence from Flagelliform Silk cDNA for the Structural Basis of Elasticity and Modular Nature of Spider Silks,1998,p.779
・Thomas Scheibel,Spider silks:recombinant synthesis,assembly,spinning,and engineering of synthetic proteins,2004,p.2
・Glareh Askarieh et al.,Self−assembly of spider silk proteins is controlled by a pH−sensitive relay,2010,vol.465,p.1
・J.M.GOSLINE,et al.,THE MECHANICAL DESIGN OF SPIDER SILKS:FROM FIBROIN SEQUENCE TO MECHANICAL FUNCTION,1999,p.3299
Total RNAは、オオジョロウグモ(Nephila pilipes)の大瓶状腺から準備した。生理食塩水(NaCl 0.75%)中でクモの大瓶状腺を解剖し、1mlのTRIZOLを添加し、よく砕いた。懸濁液は200μlのクロロホルムで分離し除去した。水層を別のチューブに移し、同量のイソプロパノールを加えRNAを沈殿させた。沈殿物を75%エタノールでリンスし、−80℃で保存した。その後、7500rpm、4℃にて5分間遠心分離し、8分間真空乾燥したのち、RNase−free waterに溶解した。55℃で10分間RNAを溶解した後、サンプルとして使用した。サンプルをアガロース電気泳動することにより、RNAが抽出できたことを確認した。
G−キャッピング法による大瓶状腺のcDNAライブラリーの合成と構築は、タカラバイオ株式会社に委託した。ライブラリーベクター(pDNR−LIB)は約50μlのTEに溶解した。
高い確率で形質転換を行うため、エレクトロポレーション法を用いた。DNA溶液としては、準備されたcDNAライブラリー溶液を用い、コンピテントセルとしては、Invitrogen社製「Electro MAXTM DH12STM Cells」(Cat.No.18312−017)を用い、キュベットとしては0.1cmサイズのものを用いた。
インサートの配列は、「ABI Prism genetic analyzer 3100」(ライフテクノロジーズジャパン(株)製)とT7primerを使用しシークエンスした。DNAとアミノ酸配列のコンピューター分析は、「Genetyx package」((株)ゼネティック製)と「Sequencher 4.14」(Demo version)(Gene Codes社製)を用いて行った。配列の比較はタンパク質のデータベースに対してExPASy Proteomics server(http;/ www.expasy.org)のSIB BLAST Network Serviceにより相同性分析を行った。
MaSp(major ampullate spidroin)は名前の通り、大瓶状腺で発現するとされている。本発明の遺伝子が大瓶状腺で働いていることを証明するため、cDNA配列の3’末端(アミノ酸配列のC末端)配列を用いてプローブを作成し、クモの四種類糸腺(鞭状腺、管状腺、大瓶状腺、小瓶状腺)から抽出したRNAとノーザンハイブリダイゼーション実験を行った。図3は、ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。図3のレーン1〜4には、順に、鞭状腺、管状腺、大瓶状腺、小瓶状腺から抽出したRNAを流した。この結果より、本発明の遺伝子(核酸)は、オオジョロウグモの大瓶状腺で特異的に発現していることが分かった。また、転写物質の分子量は約3〜4kbであると推測される。
オオジョロウグモの牽引糸と、従来公知のクモの牽引糸の物性を比較するため、それぞれの伸度(弾性率)を測定した。伸度の測定は、測定前日から、20℃、RH65%で24時間放置し、吸湿量をバランス状態にした20mmの各牽引糸をサンプルとして、20℃、RH65%で引張り速度20mm/minの条件のもと、引張試験機「Tensilon UTM−III−100」(Toyo Baldwin社製)を用いた伸度試験により行った。従来公知のクモとしては、日本産ジョロウグモ(Nephila clavata)及びナガコガネグモ(Argiope bruennichi)を用いた。結果を表2に示す。
Claims (14)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかの核酸。
(a)配列番号1又は19の塩基配列を有する核酸
(b)配列番号2又は20のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
(c)前記(a)の核酸と90%以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
(d)前記(a)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸 - 以下の(e)〜(h)のいずれかの核酸を含み、配列番号1の塩基配列を有する核酸と70%以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸。
(e)配列番号3、5、7、9、11、13、15又は17の塩基配列を有する核酸
(f)配列番号4、6、8、10、12、14、16又は18のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
(g)前記(e)の核酸と90%以上の配列同一性を有する核酸
(h)前記(e)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸 - 配列番号1の塩基配列を有する核酸と80%以上の配列同一性を有する、請求項2に記載の核酸。
- 以下の(i)〜(l)のいずれかの核酸を含み、配列番号19の塩基配列を有する核酸と70%以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸。
(i)配列番号21、23、25、27、29、31、33又は35の塩基配列を有する核酸
(j)配列番号22、24、26、28、30、32、34又は36のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
(k)前記(i)の核酸と90%以上の配列同一性を有する核酸
(l)前記(i)の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸 - 配列番号19の塩基配列を有する核酸と80%以上の配列同一性を有する、請求項4に記載の核酸。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸が導入された組換え生物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸が導入された組換えカイコ。
- 請求項7に記載の組換え生物により作られるタンパク質。
- 請求項8に記載の組換えカイコにより作られる絹糸。
- 以下の(m)又は(n)のアミノ酸配列を有する、牽引糸タンパク質。
(m)配列番号2又は20のアミノ酸配列
(n)前記(m)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列 - 以下の(o)又は(p)のアミノ酸配列を有する、牽引糸タンパク質。
(o)以下の(o−1)又は(o−2)のアミノ酸配列を有し、配列番号2のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(o−1)配列番号4、6、8、10、12、14、16又は18のアミノ酸配列
(o−2)前記(o−1)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(p)以下の(p−1)又は(p−2)のアミノ酸配列を有し、配列番号20のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
(p−1)配列番号22、24、26、28、30、32、34又は36のアミノ酸配列
(p−2)前記(p−1)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列 - 前記(o)のアミノ酸配列が、配列番号2のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、前記(p)のアミノ酸配列が、配列番号20のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有する、請求項12に記載の牽引糸タンパク質。
- 以下の一般式(1)で表されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質。
[X1−X2−X3−(X4)m−(X5)m−(X6)m−X7−X8]n (1)
(式中、mはそれぞれ独立に0又は1の整数を示し、nは1〜10の整数を示し、X1は配列番号37〜45のいずれかのアミノ酸配列を示し、X2は配列番号46〜52のいずれかのアミノ酸配列を示し、X3は配列番号53〜59のいずれかのアミノ酸配列を示し、X4は配列番号49のアミノ酸配列を示し、X5は配列番号60又は61のアミノ酸配列を示し、X6は配列番号62〜64のいずれかのアミノ酸配列を示し、X7は配列番号65〜70のいずれかのアミノ酸配列を示し、X8は配列番号71〜81のいずれかのアミノ酸配列を示す。)
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