JP6931934B2 - 改良シルク繊維を合成するための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年9月17日に出願された米国仮特許出願第61/878,858号の恩典を主張する。上記出願の全教示は、全ての目的について参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、配列表を含有する。2014年9月16日に作成された、該ASCIIコピーは、27321PCT_CRF_SequenceListing.txtという名称であり、サイズは4,189,730バイトである。
本開示は、合成ブロックコポリマータンパク質に関する方法および組成物、それらの分泌のための発現構築物、それらの産生のための組換え微生物、ならびに天然シルクの多くの特性を再現するこれらのタンパク質を含む合成繊維に関する。
クモのシルクポリペプチドは、3つのドメイン:N末端非反復ドメイン(NTD)、リピートドメイン(REP)、およびC末端非反復ドメイン(CTD)に分解することができる大きな(>150kDa、>1000アミノ酸)ポリペプチドである。NTDおよびCTDは、比較的小さく(それぞれ、約150、約100アミノ酸)、十分に研究されており、ポリペプチドへ水安定性、pH感受性、および凝集時の分子整列を与えると考えられている。NTDはまた、強く予想される分泌タグを有し、これは異種発現の間に除去されることが多い。反復領域は、天然ポリペプチドの約90%を構成し、シルク繊維に対してそれぞれ強度および可撓性を与える、結晶領域およびアモルファス領域へ折り畳まれる。
擬似リピートドメインを含むタンパク様ブロックコポリマーであって、繊維へアセンブルすることができ、かつ
該コポリマーのアミノ酸配列の12〜40%のアラニン組成、
該コポリマーのアミノ酸配列の25〜50%のグリシン組成、
該コポリマーのアミノ酸配列の9〜20%のプロリン組成、
該コポリマーのアミノ酸配列の15〜37%のβターン組成、
該コポリマーのアミノ酸配列の18〜55%のGPGアミノ酸モチーフ含有量、および
該コポリマーの全アミノ酸の9〜35%のポリアラニンアミノ酸モチーフ含有量
を含む、タンパク様ブロックコポリマー。
[本発明1002]
75〜350アミノ酸長のN末端非反復ドメインおよび75〜350アミノ酸長のC末端非反復ドメインをさらに含む、本発明1001のコポリマー。
[本発明1003]
擬似リピートドメインが500〜5000アミノ酸長である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1004]
擬似リピートドメインが119〜1575アミノ酸長である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1005]
擬似リピートドメインが900〜950アミノ酸長である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1006]
前記コポリマーの質量が40〜400 kDaである、本発明1001のコポリマー。
[本発明1007]
前記コポリマーの質量が12.2〜132 kDaである、本発明1001のコポリマー。
[本発明1008]
前記コポリマーの質量が70〜100 kDaである、本発明1001のコポリマー。
[本発明1009]
アラニン組成が、前記コポリマーのアミノ酸配列の16〜31%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1010]
アラニン組成が、前記コポリマーのアミノ酸配列の15〜20%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1011]
グリシン組成が、前記コポリマーのアミノ酸配列の29〜43%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1012]
グリシン組成が、前記コポリマーのアミノ酸配列の38〜43%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1013]
プロリン組成が、前記コポリマーのアミノ酸配列の11〜16%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1014]
プロリン組成が、前記コポリマーのアミノ酸配列の13〜15%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1015]
βターン組成が、前記コポリマーのアミノ酸配列の18〜33%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1016]
βターン組成が、前記コポリマーのアミノ酸配列の25〜30%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1017]
GPGアミノ酸モチーフ含有量が、前記コポリマーのアミノ酸配列の22〜47%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1018]
GPGアミノ酸モチーフ含有量が、前記コポリマーのアミノ酸配列の30〜45%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1019]
ポリアラニンアミノ酸モチーフ含有量が、前記コポリマーのアミノ酸配列の12〜29%である、本発明1001のコポリマー。
[本発明1020]
表13aからの配列を含む、本発明1001のコポリマー。
[本発明1021]
SEQ ID NO: 1396を含む、本発明1001のコポリマー。
[本発明1022]
SEQ ID NO: 1398からなる、本発明1001のコポリマー。
[本発明1023]
SEQ ID NO: 1374を含む、本発明1001のコポリマー。
[本発明1024]
SEQ ID NO: 2770からなる、本発明1001のコポリマー。
[本発明1025]
分泌シグナルおよびコード配列をコードする異種核酸分子を含む改変微生物であって、コード配列が本発明1001のコポリマーをコードし、分泌シグナルが微生物からのコポリマーの分泌を可能にする、改変微生物。
[本発明1026]
改変微生物がピキア・パストリス(Pichia pastoris)である、本発明1025の改変微生物。
[本発明1027]
改変微生物がバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)である、本発明1025の改変微生物。
[本発明1028]
培養培地および本発明1025の改変微生物を含む、細胞培養物。
[本発明1029]
a)本発明1028の細胞培養培地を得る工程、および
b)改変微生物に少なくとも2〜20 mgシルク/g DCW/時間の速度でコポリマーを分泌させる条件下で細胞培養培地を維持する工程
を含む、分泌ブロックコポリマーを製造するための方法。
[本発明1030]
コポリマーが少なくとも20 mgシルク/g DCW/時間の速度で分泌される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
本発明1001の分泌コポリマーを含む、細胞培養培地。
[本発明1032]
a)本発明1031の細胞培養培地を得る工程、
b)分泌されたタンパク質を単離する工程、および
c)タンパク質を紡糸液へ処理し、紡糸液から繊維を製造する工程
を含む、繊維を製造するための方法。
[本発明1033]
本発明1001の分泌コポリマーを含む、繊維。
[本発明1034]
24〜172 MPaの降伏応力を有する、本発明1033の繊維。
[本発明1035]
150〜172 MPaの降伏応力を有する、本発明1033の繊維。
[本発明1036]
54〜310 MPaの最大応力を有する、本発明1033の繊維。
[本発明1037]
150〜310 MPaの最大応力を有する、本発明1033の繊維。
[本発明1038]
2〜200 %の破断歪みを有する、本発明1033の繊維。
[本発明1039]
180〜200%の破断歪みを有する、本発明1033の繊維。
[本発明1040]
4.48〜12.7μmの直径を有する、本発明1033の繊維。
[本発明1041]
4〜5μmの直径を有する、本発明1033の繊維。
[本発明1042]
1617〜5820 MPaの初期モジュラスを有する、本発明1033の繊維。
[本発明1043]
5500〜5820 MPaの初期モジュラスを有する、本発明1033の繊維。
[本発明1044]
少なくとも0.5 MJ/m3の靭性値を有する、本発明1033の繊維。
[本発明1045]
少なくとも3.1 MJ/m3の靭性値を有する、本発明1033の繊維。
[本発明1046]
少なくとも59.2 MJ/m3の靭性値を有する、本発明1033の繊維。
[本発明1047]
0.2〜0.6デニールの繊度を有する、本発明1033の繊維。
本発明のこれらおよび他の態様を、ここで、図、明細書、実施例および特許請求の範囲においてさらに説明する。
本明細書において特に定義されない限り、本発明に関して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子および細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにポリペプチドおよび核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法および技術は、当該技術において周知であり、一般的に使用されるものである。
いくつかの態様において、1)シルクポリペプチド配列由来のリピートドメインを混合し組み合わせることによって作製されたブロックコポリマーポリペプチド組成物、およびに2)産業的に拡張可能な微生物からの分泌によって有用な繊維を形成するために十分に大きなサイズ(およそ40 kDa)を有するブロックコポリマーポリペプチドの組換え発現を、本明細書において開示する。本発明者らは、クモシルクポリペプチドのほぼ全ての公開されたアミノ酸配列からの配列を含む、シルクリピートドメイン断片から改変された比較的大きな(およそ40 kDa〜およそ100 kDa)ブロックコポリマーポリペプチドを、拡張可能な改変微生物宿主において産生する能力を本明細書において提供する。いくつかの態様において、シルクポリペプチド配列は、繊維形成が可能な高度に発現され分泌されるポリペプチドを産生するように組み合わせて設計される。
本発明の発現ベクターは、当技術分野において公知の技術を考慮して本明細書の教示に従って作製することができる。配列、例えば、ベクター配列またはトランスジーンをコードする配列は、Integrated DNA Technologies, Coralville, IA、またはDNA 2.0, Menlo Park, CAなどの会社から商業的に得ることができる。キメラシルクポリペプチドの高レベル発現を指示する発現ベクターを本明細書において例示する。
本発明のいくつかの態様において、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換された宿主細胞、およびその子孫を提供する。本発明のいくつかの態様において、これらの細胞は、ベクター上に本発明の核酸配列を保有しており、自由にベクターを複製し得るがその必要はない。本発明の他の態様において、核酸は宿主細胞のゲノムへ組み込まれている。
組換え原核生物または真核生物システムにおける遺伝子発現によって産生されたクモシルク配列に基づく組換えブロックコポリマーポリペプチドは、当技術分野において公知の方法に従って精製され得る。好ましい態様において、市販の発現/分泌システムを使用することができ、それによって、組換えポリペプチドが発現され、その後、宿主細胞から分泌され、周囲の培地から容易に精製される。発現/分泌ベクターが使用されない場合、代替アプローチは、ポリペプチドが発現された原核または真核細胞に由来する細胞溶解物(細胞完全性の破壊後の細胞の残骸)から組換えブロックコポリマーポリペプチドを精製することを伴う。そのような細胞溶解物の作製方法は当業者に公知である。いくつかの態様において、組換えブロックコポリマーポリペプチドは、細胞培養上清から単離される。
いくつかの態様において、当技術分野において公知のプロセスの要素を用いて、本発明のブロックコポリマーポリペプチドの溶液を繊維へ紡糸する。これらのプロセスとしては、例えば、湿式紡糸、乾湿式紡糸、および乾式紡糸が挙げられる。好ましい湿式紡糸態様において、フィラメントが液体凝固浴へオリフィスを通って押し出される。一態様において、フィラメントは、凝固浴と接触する前にエアギャップを通って押し出され得る。乾湿式紡糸法において、紡糸液は、凝固浴に入る前に、不活性非凝固性流体、例えば空気において、細められ引き伸ばされる。適切な凝固流体は、湿式紡糸法において使用されるものと同じである。
シルク配列の獲得
以下の用語を用いてNCBIのヌクレオチドデータベースをサーチし、クモシルクを同定することによって、シルク配列および部分配列を得た:MaSp、TuSp、CySp、MiSp、AcSp、Flag、大瓶状腺、小瓶状腺、鞭状腺、ブドウ状腺、管状腺、円柱状腺、スピドロイン、およびクモフィブロイン。得られたヌクレオチド配列をアミノ酸配列へ翻訳し、次いで精選し(curate)、繰り返される配列を除去した。シルクのタイプに依存して、200〜500アミノ酸長未満であった配列を除去した。上記のサーチからのシルク配列をブロック(例えば、反復配列)および非反復領域へ区分化した。
ヌクレオチド配列へのシルクポリペプチド配列の逆翻訳
実施例1に記載されたR、N、およびCアミノ酸配列をヌクレオチド配列へ逆翻訳した。逆翻訳を行うために、各位置で所望のアミノ酸をコードするコドンのバイアスランダム選択へのピキア(コマガテラ)パストリスコドン使用を用いることによって、10,000個の候補配列を作製した。次いで、選択制限部位(BsaI、BbsI、BtgZI、AscI、SbfI)を各配列から除去し;部位を除去することができなかった場合は、配列を廃棄した。次いで、エントロピー、最長の繰り返されるサブ配列、および繰り返される15量体の数を、各配列についてそれぞれ決定した。
選択されたN、C、またはR配列からのシルクポリペプチドのスクリーニング
実施例1および2からのヌクレオチド配列に、クローニングを可能にするために、合成の過程で、以下の配列を隣接させた:
ここで、「シルク」は実施例2の教示に従って選択されたポリヌクレオチド配列である。
R、N、またはC配列を含有する発現ベクターを、PEG法(Cregg, J.M., DNA-mediated transformation, Methods Mol. Biol., 389, pg. 27-42 (2007))を用いて、ピキア(コマガテラ)パストリス(株RMs71;これは、野生型ゲノム(NRRLY 11430)の断片での形質転換によって野生型へ戻されたHIS4遺伝子における変異、およびヒスチジンを欠いている所定の寒天培地プレートにおける選択を伴う株GS115(NRRL Y15851)である)へ形質転換した。発現ベクターは、ターゲティング領域(HIS4)、ドミナント耐性マーカー(nat−ノウルセオスリシン(nourseothricin)に対する耐性を付与する)、プロモーター(pGAP)、分泌シグナル(α接合因子リーダーおよびプロ配列)、ならびにターミネーター(pAOX1 pAシグナル)からなった。
アセンブリベクターへの挿入のためのN、R、およびC配列の増幅
N、R、およびC配列についてのDNAを発現ベクターからPCR増幅し、AscI/SbfI制限部位を用いてアセンブリベクターへライゲートした。
1.94℃で5分間変性させる
2.94℃で30秒間変性させる
3.55℃で30秒間アニール処理する
4.72℃で30秒間伸長させる
5.29回の付加的なサイクルについて工程2〜4を繰り返す
6.72℃で5分間最終伸長
のうちの1つへライゲートし、これらは、ルーチンな方法を用いて不要な挿入物を放出するために同じ酵素で消化されていた。
アルギオペ・ブルエンニチMaSp2ブロックからのシルクの合成(RM439、「18B」)
実施例2に記載されるアルゴリズムを用いて、アルギオペ・ブルエンニチMaSp2からの6つのリピートブロックのセット(またはブロックコポリマー)を選択し、各々が3つのブロックからなる2つのR配列へ分割した。次いで、2つの3-ブロックR配列を、以下のように短いオリゴヌクレオチドから合成した。
アルギオペ・ブルエンニチMaSp2ブロック配列を、実施例3において用いたものとは異なる方法を用いて作製した。表3中のオリゴRM2919〜RM2942 (SEQ ID NO: 1468〜1491)を、各オリゴを等しい量で有する単一の混合物へ合わせた(合計100μM)。1μl 10x NEB T4 DNAリガーゼバッファー、1μl 100μMプールされたオリゴ、1μl NEB T4ポリヌクレオチドキナーゼ(10,000 U/ml)、および7μl ddH2Oを合わせ、37℃で1時間インキュベートすることによって調製されたリン酸化反応物において、これらのオリゴをリン酸化した。次いで、4μlのリン酸化反応物と16 μlのddH2Oとを混合し、混合物を95℃へ5分間加熱し、次いで混合物を0.1℃/秒の速度で25℃へ冷却することによって、これらのオリゴをアニールした。次いで、4μlのアニール処理オリゴと、5 nmolベクター骨格(AscIおよびSbfIで消化された、RM396 [SEQ ID NO: 1405])、1μl NEB T4 DNAリガーゼ(400,000 U/ml)、1μl 10x NEB T4 DNAリガーゼバッファー、および10 μlへのddH2Oとを合わせることによって、これらのオリゴをベクターへ一緒にライゲートした。ライゲーション溶液を室温で30分間インキュベートした。ライゲーション反応物の全体を、公知の技術に従ってクローン選択、プラスミド単離、および配列検証のために大腸菌へ形質転換した。
表4中のオリゴRM2999〜RM3014 (SEQ ID NO: 1492〜1507)を、各オリゴ100μMの濃度で単一の混合物へ合わせた。1μl 10x NEB T4 DNAリガーゼバッファー、1μl 100μMプールされたオリゴ、1μl NEB T4ポリヌクレオチドキナーゼ(10,000 U/ml)、および7μl ddH2Oを合わせ、37℃で1時間インキュベートすることによって調製されたリン酸化反応物において、これらのオリゴをリン酸化した。次いで、4μlのリン酸化反応物と16 μlのddH2Oとを混合し、混合物を95℃へ5分間加熱し、次いで混合物を0.1℃/秒の速度で25℃へ冷却することによって、これらのオリゴをアニールした。次いで、4 μlのアニール処理オリゴと、5 nmolベクター骨格(AscIおよびSbfIで消化された、RM400 [SEQ ID NO: 1406])、1μl NEB T4 DNAリガーゼ(400,000 U/ml)、1μl 10x NEB T4 DNAリガーゼバッファー、および10μlへのddH2Oとを合わせることによって、これらのオリゴをベクターへ一緒にライゲートした。ライゲーション溶液を室温で30分間インキュベートした。ライゲーション反応物の全体を、公知の技術に従ってクローン選択、プラスミド単離、および配列検証のために大腸菌へ形質転換した。
上述の方法に従って合成されたRM409 (SEQ ID NO: 930)およびRM410 (SEQ ID NO: 931)オリゴヌクレオチド配列を、図6に示されるダイヤグラムに従ってアセンブルし、RM439シルクヌクレオチド配列(例えば「18B」)を作製した。
アセンブリベクターを表5に示す。ベクターについての配列はSEQ ID NO: 1399〜1410の配列を含む。
RM468 (SEQ ID NO: 1401)発現ベクターは、α接合因子配列および3X FLAG配列(SEQ ID NO: 1409)を含有する。18Bシルクポリペプチドコード配列RM439 (SEQ ID NO: 467)を、BtgZI制限酵素およびGibson反応キットによってRM468 (SEQ ID NO: 1401)発現ベクターへトランスファーした。RM439ベクターをBtgZIで消化し、シルク配列を含有するポリヌクレオチド断片をゲル電気泳動によって単離した。不要なダミー挿入物を除外して、発現ベクターRM468を、実施例4に記載された条件を用いて、プライマーRM3329およびRM3330を使用するPCRによって増幅した。得られたPCR産物および単離されたシルク断片を、製造業者の説明書に従ってGibson反応キットを用いて合わせた。Gibson反応キットは市販されており(https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix)、米国特許第5,436,149号およびGibson, D.G. et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nat. Methods, 6:5, pg. 343-345 (2009)に記載されている。
4XリピートR配列のアセンブリおよびアッセイ
十分に発現および分泌されたSEQ ID NO: 1〜1398からの選択されたRドメインを、図12に示されるアセンブリスキームを用いて4xリピートドメインへ連結した。実施例4に説明され図7および8に示されるように、連結を行った。R配列のこのライゲーションからの選択された配列を表6に示す。これらのシルク構築物についての配列は、SEQ ID NO: 1411〜1468の完全長シルク構築物配列を含む。4つのリピート配列、α接合因子、および3X FLAGドメインを含む、得られた産物を、所望のシルク配列を放出するためにAscIおよびSbfIで消化し、そして、不要なダミー挿入物を放出するためにAscIおよびSbfIで消化されていた発現ベクターRM652 (SEQ ID NO: 1400)へライゲートした。大腸菌からのクローン単離後、次いで、ベクターをピキア・パストリスへ形質転換した。形質転換体を、25μg/mlノウルセオスリシンを含有するYPD寒天プレート上に平板培養し、30℃で48時間インキュベートした。各形質転換からの3つのクローンを、96-ウェルスクエアウェルブロック中の400μlのBMGYへ接種し、1000 rpmで撹拌しながら30℃で48時間インキュベートした。細胞を遠心分離によってペレット化し、ウエスタンブロットによるブロックコポリマーポリペプチド含有量の分析のために上清を回収した(図13)。4x同一リピート配列で形質転換された28個の構築物のうち、大部分(18/28)が、ウエスタンブロット上に実質的なシグナルを有する少なくとも1つのクローンを有し、1つのみがシグナルを全く示さなかった。各々2つの別個のリピート配列の2つのリピートから構成された2つの構築物のうち、一方は、強いウエスタンブロットシグナルを示したが、他方は適度なウエスタンシグナルを示した。これは、より小さな十分に発現されるポリヌクレオチドからより大きなブロックコポリマー発現性ポリヌクレオチドをアセンブルすることが、一般に、機能的に発現されるブロックコポリマーポリペプチドをもたらすことを確認する。縞入り(streakiness)、複数のバンド、およびクローン間バリエーションがウエスタン上において明らかである。これらのバリエーションの具体的な原因は特定されていないが、それらは、ポリペプチド分解、翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)、およびゲノム組み込み後のクローン変異を含む、典型的に観察される現象と概ね一致している。修飾および分解されたポリペプチド産物は、意図される使用に応じて、繊維の有用性に悪影響を与えることなく、繊維へ組み入れられ得る。
バチルス・サブチリスからの18Bの発現
大腸菌/B.サブチリスシャトルおよび発現プラスミドを先ず構築する。18Bをコードするポリヌクレオチドを、Gibson反応を用いて、プラスミドpBE-S (Takara Bio Inc.)へトランスファーする。PCR反応においてプライマー
を用いて、プラスミドpBE-S (SEQ ID NO: 1512)を増幅する。反応混合物は、1μlの10μM BES-F、1μlの10μM BES-R、0.5μgのpBE-S DNA(1μl体積)、22μlの脱イオン化H2O、および25μlのPhusion High-Fidelity PCR Master Mix (NEBカタログM0531S)からなる。混合物を以下のプログラムに従ってサーモサイクルする。
1)95℃で5分間変性させる
2)95℃で30秒間変性させる
3)55℃で30秒間アニール処理する
4)72℃で6分間伸長させる
5)29回の付加的なサイクルについて工程2〜4を繰り返す
6)72℃で5分間最終伸長を行う
クラミドモナス・レインハルドチ(Chlamydomonas reinhardtii)からの18Bの発現
切除可能なC.レインハルドチ発現カセットpChlamy (SEQ ID NO: 1514)を有する大腸菌ベクターを、商業的なDNA合成および標準技術を用いて先ず構築する。カセットは、Rasala, B.A., Robust expression and secretion of Xylanase1 in Chlamydomonas reinhardtii by fusion to a selection gene and processing with the FMDV 2A peptide, PLoS One, 7:8 (2012)に詳細に記載されている。18B、3xFLAGタグ、および終止コドンをコードするポリペプチドを、C.レインハルドチのコドン選択(例えば、http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=3055で入手可能)を用いて逆翻訳し、商業的な合成を用いて合成する。合成の過程で、隣接するBbsI部位を含め、18B-3xFLAGポリヌクレオチドの放出を可能にする。5'-ATGTTTTAA-3'を除くプラスミド配列全体を含みかつさらに各末端に18B-3xFLAGコード配列に対する40 bpの相同性を含む線形断片を生じるように設計されたプライマーを用いたpChlamyプラスミドのPCR増幅から得られるポリヌクレオチドを、Gibson反応を用いてBbsIでの消化によって遊離した18B-3xFLAGポリヌクレオチドと連結し、クローン選択、DNA増幅、およびプラスミド単離のために大腸菌へ形質転換する。得られたプラスミドをBsaIで消化し、18B発現カセットを放出させ、これをゲル精製によって単離する。消化された断片を株cc3395へエレクトロポレートし、これを次いで15μg/mlゼオシンで選択する。いくつかのクローンを液体培養で増殖させ、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清をタンパク質発現についてウエスタンブロットによって分析する。
付加的なシルクおよびシルク様配列
「スピドロイン」「カイコガ属(bombyx)」および「ゴケグモ属(latrodectus)」を除外しながら、用語「シルク」についてサーチすることによって、付加的なシルクおよびシルク様配列ならびに部分配列をNCBIの配列データベースから得た。得られたヌクレオチド配列のサブセットをアミノ酸配列へ翻訳し、次いで精選し、繰り返される配列を除去した。短い配列、一般に200〜500アミノ酸長未満、を除去した。さらに、構造エレメントを形成することが公知のポリペプチドを選択するための一次配列を、公共データベースから得た。実施例1に記載された配列に加えて、そのように得られたアミノ酸配列を使用し、相同性によって付加的なシルクおよびシルク様配列をサーチした。得られたシルクおよびシルク様配列を精選し、次いで反復および非反復領域へ区分化した。
ここで、「シルク」は上記の教示に従って選択されたポリヌクレオチド配列である。
アルギオペ・ブルエンニチMaSp2ポリペプチドの円順列変異体
実施例5において特定されたアルギオペ・ブルエンニチMaSp2由来の6つのリピートブロック(ブロックコポリマー)を、およそ90度円順列にし(6つのブロックの末端から最初へ約1.5ブロックを移動させることによる)、次いで、各々、約3つのブロックからなる2つのR配列、RM2398 (SEQ ID NO: 2708)およびRM2399 (SEQ ID NO: 2709)へ分割した。これらの3ブロック配列を続いて使用して、オリジナルの6ブロック配列から約90および約270度回転された6ブロック配列を作製し、既存の3ブロック配列(RM409およびRM410)を使用して、約180度回転された6ブロック配列を作製した。次いで、各6ブロック配列を18ブロック配列へアセンブルした。アセンブリプロセスおよび回転された配列を図15に示す。
を用いるPCRによって、プラスミドRM439 (SEQ ID NO: 467)を増幅した。各反応物は、12.5μL 2x KOD Extreme Buffer、0.25μl KOD Extreme Hot Start Polymerase、0.5μl 10μM Fwdオリゴ、0.5μl 10μM Revオリゴ、5 ngテンプレートDNA (RM439)、0.5μlの10 mM dNTP、および最終体積25μlまで添加されたddH2Oからなった。次いで、各反応物を以下のプログラムに従ってサーモサイクルした:
1.94℃で5分間変性させる
2.94℃で30秒間変性させる
3.55℃で30秒間アニール処理する
4.72℃で60秒間伸長させる
5.29回の付加的なサイクルについて工程2〜4を繰り返す
6.72℃で5分間最終伸長
コピー数およびプロモーター強度の制御によるアルギオペ・ブルエンニチMaSp2ポリヌクレオチドの発現の変化
外因的に導入されたポリヌクレオチドの転写の程度は、産生されるポリペプチドの量に影響を与えることが公知である(例えば、Liu, H., et al., Direct evaluation of the effect of gene dosage on secretion of protein from yeast Pichia pastoris by expressing EGFP, J. Microbiol. Biotechnol., 24:2, pg. 144-151 (2014); およびHohenblum, H., et al., Effects of gene dosage, promoters, and substrates on unfolded protein stress of recombinant Pichia pastoris, Biotechnol. Bioeng., 85:4, pg. 367-375 (2004)を参照のこと)。ピキア(コマガテラ)パストリスにおいて、転写の程度は、宿主ゲノムへ組み込まれるポリヌクレオチドのコピー数を増加させることによって、または転写を駆動するための適切なプロモーターを選択することによって、一般的に制御される(例えば、Hartner, F.S., et al., Promoter library designed for fine-tuned gene expression in Pichia pastoris, Nucleic Acids Res., 36:12 (2008); Zhang, A.L., et al., Recent advances on the GAP promoter derived expression system of Pichia pastoris, Mol. Biol. Rep., 36:6, pg. 1611-1619 (2009); Ruth, C., et al., Variable production windows for porcine trypsinogen employing synthetic inducible promoter variants in Pichia pastoris, Syst. Synth. Biol., 4:3, pg. 181-191 (2010); Stadlmayr, G., et al., Identification and characterisation of novel Pichia pastoris promoters for heterologous protein production, J. Biotechnol., 150:4, pg. 519-529 (2010)を参照のこと)。異種タンパク質発現のために用いられるプロモーターのセットへ比較的最近追加されたのは、pGCW14(Liang, S., Identification and characterization of P GCW14: a novel, strong constitutive promoter of Pichia pastoris, Biotechnol. Lett. 35:11, pg. 1865-1871 (2013))であり、これは、pGAPよりも5〜10倍強いことが報告されている。シルクおよびシルク様ポリペプチドの発現および分泌がコピー数によっても影響され得ることを確認するために、18B(実施例5に記載される)の発現を駆動するpGAPを1、3、または4コピー含有する株、および18Bの発現を駆動するpGCW14を1、2、3、または4コピー含有する株を作製し、試験した。株を表8に記載する。
Rドメインのホモポリマーとの単一のRドメインの発現および分泌の比較
十分に発現および分泌されたSEQ ID NO: 1〜1398からの付加的な選択されたRドメインを、2abアセンブリ(実施例5に記載される)を用いて4〜6xリピートドメインへ連結した。加えて、2abアセンブリを用いて、12B配列を18B配列(実施例5より)と連結し、30B配列が得られた。各シルク配列が、5'末端でα接合ドメインおよび3'末端で3xFLAGドメインに隣接し、pGAPプロモーターによって駆動されるように、得られた産物を発現ベクターへトランスファーした。作製された配列を表10に記載し、配列はSEQ ID NO: 2734〜2748を含む。
シルクを発現および分泌する株の生産性の測定
表11は、実施例10、実施例11、および実施例12に記載されたポリペプチドを発現する株の体積的生産性および比生産性を列挙する。
シルク繊維の機械的特性の測定
実施例5において産生されたブロックコポリマーポリペプチドを、繊維へ紡糸し、様々な機械的特性について試験した。先ず、標準技術を用いて、ギ酸ベースの紡糸溶媒中に精製および乾燥されたブロックコポリマーポリペプチドを溶解することによって、繊維紡糸液を調製した。スピンドープを、時折混合しながら3日間回転シェーカー上において35℃でインキュベートした。3日後、スピンドープを16000 rcfで60分間遠心分離し、紡糸前に少なくとも2時間室温へ平衡化させた。
最適な繊維の製造
MaSp2様シルクのRドメインを表13aおよび13bに列挙されるものから選択し、図12に示されるアセンブリスキームを用いて、Rドメインを、5'末端でα接合因子および3'末端で3X FLAGに隣接した4xリピートドメインへ連結する。実施例4に記載され図7および図8に示されるように、連結を行う。得られたポリヌクレオチド配列および対応のポリペプチド配列を表13aおよび13bに列挙する。
Claims (14)
- 以下を含むタンパク様ブロックコポリマー:
ポリペプチド; ここで、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1249の2〜8回連結されたリピートを含むポリペプチド、またはその円順列変異体。 - SEQ ID NO: 1249の4回連結されたリピートからなる、請求項1記載のタンパク様ブロックコポリマー。
- 前記タンパク様ブロックコポリマーが精製および乾燥された、請求項1記載のタンパク様ブロックコポリマー。
- タンパク様ブロックコポリマーをコードする発現構築物であって、該タンパク様ブロックコポリマーは、SEQ ID NO: 1249の2〜8回連結されたリピートを含むポリペプチド、またはその円順列変異体。
- 前記タンパク様ブロックコポリマーのコード配列と機能的に連結されている分泌シグナルをさらに含む、請求項4記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドがSEQ ID NO: 1249の3回連結されたリピートからなる、請求項4記載の発現構築物。
- 前記タンパク様ブロックコポリマーをコードする配列が、SEQ ID NO: 318の2〜8回連結されたリピートからなる、請求項4記載の発現構築物。
- 前記タンパク様ブロックコポリマーをコードする配列が、SEQ ID NO: 318の4回連結されたリピートからなる、請求項4記載の発現構築物。
- 請求項4記載の発現構築物を含む、宿主細胞。
- 前記細胞が、酵母細胞、真菌細胞、およびグラム陽性細菌からなる群より選択される、請求項9記載の宿主細胞。
- 前記細胞がトリコデルマ属に由来する、請求項10記載の宿主細胞。
- 請求項9記載の宿主細胞を含む細胞培養培地。
- 以下の工程を含む、SEQ ID NO: 1249の2〜8回連結されたリピートを含むポリペプチド、またはその円順列変異体を含むタンパク様ブロックコポリマーを製造するための方法:
発現構築物からタンパク様ブロックコポリマーの発現を促進する条件下で、請求項9の宿主細胞を培養する工程;および
発現したブロックコポリマーを回収する工程。 - 前記回収されたブロックコポリマーが精製および乾燥された、請求項13記載の方法。
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