JP2001512674A - 組換えａａｖの生産効率を増強する方法 - Google Patents

組換えａａｖの生産効率を増強する方法

Info

Publication number
JP2001512674A
JP2001512674A JP2000506318A JP2000506318A JP2001512674A JP 2001512674 A JP2001512674 A JP 2001512674A JP 2000506318 A JP2000506318 A JP 2000506318A JP 2000506318 A JP2000506318 A JP 2000506318A JP 2001512674 A JP2001512674 A JP 2001512674A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rep
aav
recombinant
protein
cap
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000506318A
Other languages
English (en)
Inventor
シンダー，リチャード
Original Assignee
セル ジェネシス，インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by セル ジェネシス，インコーポレーテッド filed Critical セル ジェネシス，インコーポレーテッド
Publication of JP2001512674A publication Critical patent/JP2001512674A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、AAV REPおよびCAPタンパク質の発現を制御することにより高力価の組換えAAV（rAAV）株の生産を増強するための方法および組成物に関する。本発明の方法および組成物は、AAV REP 78/68タンパク質の低レベル発現がAAVウイルスキャプシドタンパク質の産生およびパッケージング効率を増大させ、その結果高力価の組換えウイルス株の産生をもたらすという観察に基づいている。本発明は、AAV REPおよびCAPタンパク質の発現を指令する組換えAAVベクター、ならびに高力価のrAAVベクターを産生する能力がある新規で安定な細胞系を作製するためのこれらのベクターの使用を包含する。本発明は、AAV REP 78/68、REP 40/52およびCAP遺伝子の発現を転写レベルおよび転写後レベルで制御するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 １．緒言 本発明は、AAV REPおよびCAPタンパク質の発現を制御することによって組換え
AAV(rAAV)の高力価株の生産を増加させるための方法および組成物に関する。本 発明の方法と組成物は、AAV REP 78/68タンパク質の発現が低レベルであること がAAVウイルスキャプシドタンパク質の産生を増加させ、パッケージング効率を 高め、それによって高力価の組換えウイルス株の生産がもたらされた、という知
見に基づいたものである。本発明は、AAV REPおよびCAPタンパク質の発現を指令
する組換えAAVベクター、および高力価のrAAVベクターを作ることのできる新規 の安定な細胞系を作るための前記ベクターの使用をも包含する。本発明は、AAV
REP 78/68、REP 40/52、およびCAP遺伝子の発現を転写レベル、および翻訳後レ ベルで制御するための方法を提供する。本発明の方法と組成物は高力価のrAAV株
を生産するために用いることができ、そのrAAV株は、先天性および後天性の疾患
を含むヒトの疾病の管理と治療のために遺伝情報を適切な宿主細胞中に移入する
ことを目的とする遺伝子治療に用いることができる。
【０００２】 ２．発明の背景 2.1. 遺伝子治療 遺伝子治療とは、一般的には機能的に活性を有する治療用遺伝子を標的細胞中
へ送達するようにデザインされた技法を意味するものと理解されている。そのよ
うな治療用遺伝子は、遺伝的な欠損を補うタンパク質、サイトカイン、細胞表面
膜タンパク質、もしくは細胞の増殖および/または分化を調節する機能を有する タンパク質をコードするものである。そのようなタンパク質は、例えば、シグナ
ル伝達経路もしくは転写経路を調節することにより細胞内で機能することができ
る。また別に、そのタンパク質は細胞によって分泌され、細胞外に効力を及ぼす
ことができる。
【０００３】 体細胞遺伝子治療の初期の努力は組織への遺伝子の間接的な導入法に依存し、
それは例えば生物体から標的細胞を取り出し、組換え遺伝子を持つベクターでト
ランスフェクトもしくは感染させ、生物体内に再移植するというものである。こ
のようなタイプの技法は一般的にはin vitro治療法と呼ばれている。
【０００４】 これに対して、in vivoへの直接的な遺伝子導入は、リポソーム内に捕捉させ たDNAの製剤(Ledleyら, 1987)；ウイルスのエンベロープ受容体タンパク質を含 有するプロテオリポソーム(Nicolauら, 1983)；リン酸カルシウム共沈DNA(Benve
nsistyとReshef, 1986)；およびポリリシン-糖タンパク質キャリアー化合物に結
合させたDNA(WuとWu, 1988)を用いることによって最近可能となった。
【０００５】 さらに、複製能を欠損させた組換えウイルスベクターがin vitroおよびin viv
oの双方での細胞の感染に用いられた。遺伝子治療用として最も広範囲に研究さ れたウイルスベクターはおそらくレトロウイルスベクターであろう。レトロウイ
ルスベクターの使用に伴う最大の欠点は、多くのウイルスベクターが分裂期でな
い細胞には感染しないこと、挿入突然変異誘発に伴う問題、ヘルパーウイルス産
生の可能性などである。最近、対象の遺伝子を細胞へと送達するために用いるこ
とができる、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに基づくベクターなどの
その他のタイプの組換えウイルスベクターの使用が注目されるようになった。
【０００６】 とりわけ、組換えアデノ随伴ウイルスは遺伝子治療の分野で興味深い特徴を多
数有している。このベクターは、欠陥のある、非病原性のヒトパルボウイルスを
もとに作られており、それは分裂期および非分裂期のどちらの細胞にも顕著な向
性を示すことなく感染することができる。さらに、そのウイルスゲノムは宿主の
ゲノム中に安定的に組み込まれ、長期間の遺伝子導入を容易にする。
【０００７】 2.2. AAV ウイルスベクター AAVゲノムは、Rep(複製)およびCap(キャプシド)タンパク質をコードするため の大きなオープンリーディングフレームを有する4680ヌクレオチドの直鎖状の一
本鎖DNA分子からなっている。AAVコード領域に隣接して2つの145ヌクレオチドの
逆方向末端反復配列(ITR)があり、これらは折りたたまれてヘアピン構造を作る パリンドローム配列を有し、このヘアピン構造がDNA複製の開始の際にプライマ ーとして機能する。さらに、ITR配列は、ウイルスの組み込み、宿主ゲノムから のレスキュー、およびウイルス核酸の成熟ビリオンへの包膜に必要である(Muzyc
zka, N., 1992, Current Topics in Microbiology & Immunology, 158, 97-129)
。
【０００８】 AAVは宿主細胞への感染に際してヘルパーウイルスの存在如何で2つの経路を取
るものと考えられている。ヘルパーウイルスの存在下では、AAVはウイルスゲノ ムが転写、複製、キャプシド包膜されて新たに形成されたウイルス粒子となる溶
菌サイクルに入っていく。ヘルパーウイルス機能がない状態では、AAV末端と宿 主細胞配列との組換えによって宿主細胞ゲノムの特定領域中へプロウイルスの形
でAAVゲノムが組み込まれる(Cheung, Aら, 1980, J. Virol., 33:739-748; Bern
s, K.I.ら, 1982, Virus Persistence, Mahey, B.W.J.ら編(Cambridge Univ. Pr
ess, 英国ケンブリッジ), pp.249-265)。
【０００９】 無傷のAAVゲノムを含むプラスミドが宿主細胞中にトランスフェクトされると 、組換えAAVベクターが宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、そのベクターは宿主 細胞が後にヘルパーウイルスの感染を受けるまではプロウイルスの形でとどまる
、という発見により、AAVを遺伝情報導入用の運搬体として用いることが容易と なった。ヘルパーウイルスが宿主細胞に感染すると、AAVはプラスミドベクター からレスキューされ、溶菌サイクルに入り、成熟したウイルス粒子の産生をもた
らす。
【００１０】 rAAV粒子の産生は、DNAの複製、パッケージング、および組み込みに必要な唯 一のAAVシス配列である逆方向末端反復配列(ITR)によって挟まれたトランスジー
ンを含有するベクターを利用する。rAAV粒子を産生するには、通常、AAV(Rep)お
よびキャプシド(Cap)遺伝子産物が異なる鋳型（一般にはヘルパープラスミド） からトランスで提供される。
【００１１】 ビリオンの発現に必要とされる3種類のウイルスコートタンパク質VP1、VP2、 およびVP3は、p40プロモーターの位置から開始されるmRNAから誘導されるが、一
方4種のオーバーラップしている非構造性Repタンパク質はAAV DNAの複製に不可 欠である。Rep78と68はスプライされていないおよびスプライスされた、p5プロ モーターの位置を開始点とする転写産物から発現されるが、一方Rep52とRep40は
p19プロモーターの位置を開始点とする転写産物から同様にして産生される。Rep
52/40はAAVの一本鎖DNA形成(Chejanovskyら, 1989, Virology 173:120-128)およ
び遺伝子制御に関係すると考えられているが、Rep78/68はAAVのDNA複製に不可欠
な酵素機能の全てをディスプレイしていると思われる(ITR結合、DNAヘリカーゼ 、およびDNA部位特異的ニッキング活性)、(Muzyczka, N., 1991, Seminars in V
irology 2:281-290)。このような機能に加え、Rep78/68はAAVプロモーターをポ ジティブ、ネガティブの双方に制御しており(Labowら, 1986, Journal of Virol
ogy 60:215-258; Pereiraら, 1997, J. Virol., 印刷中; Tratschinら, 1986, M
ol. Cell Biol. 6:2884-2894)、多数の異種プロモーターを抑制する(Antoniら,
1991, Journal of Virology 65:396-404; Heilbronnら, 1990 Journal of Virol
ogy 64:3012-3018; Hermonat, P.L., 1994, Cancer Letters 81:129-36; Horer ら, 1995, Journal of Virology 69:5485-5496; Labowら, 1987, Molecular & C
ellular Biology 7:1320-1325)。
【００１２】 Rep遺伝子の発現が、ヘルパーウイルスが不在な場合に起こる潜伏期を含めてA
AVのライフサイクルの全てのステップにおいて最重要なものと考えられる(Berns
, K.I., 1990, Virology 第2版, vol.2; Berns, K.I., 1996, B.N. Fieldsら編;
Samulskiら, 1989, Journal of Virology 63:3822-3828)。最近、Rep78/68がAA
Vの宿主細胞のゲノムへの組み込みにも関連していることが示されている(Giraud
ら, 1994, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America; Kotinら, 1990, Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 87:221-2215; Samulskiら, 1991,
EMBO Journal 10:3941-3950; Weitzmanら, 1994, Proceedings of the Nationa
l Academy of Sciences of the United States of America 91:5808-5812)。rep
および宿主のYY1タンパク質によるウイルス遺伝子発現の抑制は潜伏期の確立と 維持に必要であると考えられる(Labowら, 1986, Journal of Virology 60:251-2
58; Laughlinら, 1982, Journal of Virology 41:868-876; Perieraら, 1997, J
. virol. 印刷中; Shiら, 1991, Cell 67:377-388)。そのような抑制はおそらく
Rep遺伝子産物による宿主細胞に対する証明された細胞静止効果を避けるために 必要なのであろう(Yangら, 1994, Journal of Virology 68:4847-4856)。溶菌性
の感染の際に、AAVプロモーター、特にp5は、アデノウイルスE1Aタンパク質およ
びYY1によってトランス活性化される(Lewisら, 1995, J. Virol. 69:1628-1636;
Shiら, 1991, Cell 67:377-388)。p5産物は次いでp19およびp40プロモーターを
正に制御し、その結果Rep52/40およびウイルスキャプシドタンパク質が豊富に産
生される(Pereiraら, 1997, J. Virol. 71:1079-1088)。p5プロモーターをSV40 初期プロモーターで置き換えてAAV rep遺伝子の制御を回避しようとの試みが初 期に行われたが失敗に終わった(Labowら, 1988, Journal of Virology 62:1705-
1712)。構成型のRep78/68の発現の代わりに、異種のプロモーターが予期に相違 して内在性p5プロモーターと同じ様な活性を示した；Adの不在の状態では抑制さ
れ、Adの存在下では活性化された(Labowら, 1988, Journal of Virology 62:175
0-1712)。これらの研究は、異種プロモーターを制御するための機作としてのrep
抑制を示唆する最初のものであったが、これらの知見はまた、AAV p5産物がAAV の産生においておそらく律速因子であろうということを暗示している(Labowら,
1988, Journal of Virology 62:1705-1712)。この分野でさらに行われた研究は 、Rep78/68の過剰発現がrAAVベクターの収量を増加させうることを示唆している
(Flotteら, 1995, Gene Therapy 2:29-37)。
【００１３】 rAAVを効率的な送達システムとして用いることの本質的な特徴はウイルスの組
換え株を生産する能力である。rAAV力価は複数ラウンドの精製および濃縮後には
野生型(wt)のレベルに近づきうるとはいえ、全体的な総収量は依然として野生型
AAVの収量よりずっと低い。従って高力価rAAVウイルス株産生能を増加させる方 法により、遺伝子治療においてrAAV送達システムの使用が容易になる。
【００１４】 ３．発明の概要 本発明は、組換えAAVの高力価株の産生に用いることのできる新規な組換えAAV
ベクターおよびrAAVパッケージング細胞系を提供する。本発明は、AAV REP 78/6
8タンパク質の発現の減少がウイルスキャプシドタンパク質の合成の増加および ウイルスDNAの複製をもたらし、その結果高力価の組換えウイルス株の産生がも たらされる、という知見に基づいている。そのような組換えAAV株は、遺伝子治 療において先天性疾患および癌やAIDSなどの後天性疾患を含むヒトの疾病の管理
および治療のために遺伝情報を適切な宿主細胞中へ導入する目的で用いることが
できる。
【００１５】 本発明は、宿主細胞内でのREP 78/68の発現レベルおよび/またはAAV REP 78/6
8タンパク質の活性を制御することによる組換えAAVの高力価株の産生法を包含す
る。本発明は遺伝子工学的手法で生物学的機能を有するウイルスREP 78/68タン パク質の発現が低レベルとなるように作られた組換えヘルパープラスミドなどの
組成物を包含する。そのようなヘルパープラスミドにおいては、REP 78/68タン パク質の発現が転写レベル、翻訳レベルおよび/または翻訳後レベルで制御され うる。本発明はさらに遺伝子工学的技法で高レベルのAAV REP 40/52およびCAP遺
伝子を発現するようにした組換えヘルパープラスミドに関する。さらに、遺伝子
工学的技法でAAV REPおよびCAP遺伝子の各々を発現する別個のプラスミドを含む
宿主細胞を作ることができる。
【００１６】 ５．発明の詳細な説明 本発明は、AAV REP 78/68、REP 40/52およびCAPタンパク質の発現の調節によ って、組換えAAV（rAAV）の高力価株の生産を増加する方法に関わる。組換えウ イルス株を作製するために、対象の遺伝子およびシス要求性AAV末端反復配列を 含有する組換えベクターを、ヘルパーウイルス機能を提供しかつAAV REPおよびC
APタンパク質をトランスで供給する能力のある宿主細胞にトランスフェクトする
。本発明の方法は、AAV REP 78/68のトランスでの低レベル発現が、AAVウイルス
のキャプシドタンパク質の生産およびrAAVベクターのパッケージング効率を増加
し、高力価組換えウイルス株の生産をもたらすという観察に基く。
【００１７】 特に、以下の節で記載した本発明は、REP 78/68、REP 40/52およびCAPタンパ ク質発現のレベルを制御する方法を包含する。本発明は、AAVウイルスREP 78/68
タンパク質の低レベルおよびREP 40/52およびCAPタンパク質の高レベルを発現す
るように遺伝子操作した組換えヘルパープラスミドに関する。例えば、様々なAA
Vタンパク質の発現は、物理的に分離されかつ別個のプラスミドの使用によって 転写レベルで制御されており、該プラスミドはしっかりと制御されたプロモータ
ー系を含有する。例えば、天然のAAV p19およびp40プロモーターを、サイトメガ
ロウイルス即時型（CMV IE）プロモーターのような強力な異種プロモーターで置
き換えることができる。強力な異種プロモーターの使用は、p19およびp40プロモ
ーターに対するAAV REP 78/68タンパク質の調節作用を軽減させる。
【００１８】 あるいはまた、様々なプラスミド構築物の比率は、その天然のAAVプロモータ ー（p5）の転写制御下にあるREP 78/68遺伝子に対して、より多いコピー数の、 天然のプロモーター（p19およびp40）の転写制御下にあるREP 40/52およびCAP遺
伝子を宿主細胞系に導入するような方法で、操作することができる。
【００１９】 さらに他の実施形態では、プラスミド構築物の比率は、その天然のAAVプロモ ーター（p5）の下にあるREP 78/68に対して、より多い、異種プロモーター（例 えばCMV IE）の下にあるREP 40/52およびCAP遺伝子を導入して細胞系を作製する
ような方法で、操作することができる。このような例では、REP 78/68タンパク 質の発現は、天然のプロモーター（p5）と翻訳開始コドン（ATG）から、異種プ ロモーターから、非天然の翻訳開始コドン（ACG）から、またはそれらの任意の 組合わせから行われる。
【００２０】 AAV発現ベクターを組換えAAV株の生産に一過性で使うことができる。あるいは
、該組換えプラスミドを使って安定なパッケージング細胞系を作製することがで
きる。安定なプロデューサー細胞系を作製するために、当業者に周知のトランス
フェクション手法により、AAV遺伝子を発現する組換えベクターを、ネオマイシ ン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neor）を発現するプラスミドと共に宿主
細胞に同時トランスフェクトし、続いて、G418耐性に対して選択することができ
る。
【００２１】 高力価の組換えウイルス株を生産することに加えて、AAV REPおよびCAP遺伝子
の発現を指令する３つの異なるプラスミドベクターをもつ細胞系の生産は、汚染
性の野生型AAVを生産する確率を低下させるであろう。感染性の野生型AAVゲノム
を作製するには、感染性野生型ゲノムを作製するための多重組換え事象を必要と
するであろう。
【００２２】 5.1． AAV REPタンパク質の組換え発現 本発明は、ウイルスREPおよびCAPタンパク質の低レベル発現をトランスで提供
するように遺伝子操作した組換えヘルパープラスミドを包含する。本発明によれ
ば、AAV REP 78/68、REP 40/52およびCAP（VP1、VP2およびVP3遺伝子）タンパク
質をコードするオープンリーディングフレームを遺伝子操作して、REPタンパク 質の高度に制御された発現のための発現ベクターとする。AAV REPおよびCAPタン
パク質を発現させるために、REPおよびCAPタンパク質をコードするヌクレオチド
配列または機能性等価物を、適当な発現ベクター、すなわち挿入したREPおよびC
APコード配列の高度に制御された転写と翻訳に必要なエレメントを含有するベク
ター中に挿入する。
【００２３】 当業者には周知の方法を使って、REPおよびCAPの高度に制御された発現のため
の適当な転写／翻訳制御シグナルに機能しうる形で結合されたAAV REPおよびCAP
タンパク質コード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これら
の方法は、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo組換え／遺伝子組
換えを含む。例えば、Maniatisら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.およびAusubelら, 1989, Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Int
erscience, N.Y.に記載の技術およびベクターを参照すること。
【００２４】 AAV REPおよびCAP遺伝子の配列は、Srivastava, A.ら, 1983. J. Virol. 45:5
55-564; Muzyczka, N., 1992, Curr. Top. Micro Immunol. 158:97-129およびRu
ffing, M.ら, 1992, J. Virol. 66:6922-6930, 1992により報じられている。AAV
REPおよびCAP遺伝子の供給源は、哺乳類ウイルス血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、
AAV-4、およびAAV-5、ならびにウシAAVおよびトリAAVを含みうる。本発明が意図
するのは、それらに開示されたREPおよびCAP DNA配列に加えて、(1)Srivatava,
A.,ら,前掲；Muzyczka, N.,前掲およびRuffing, M.,ら,前掲に示されているREP
78/68、REP 40/52およびCAPと同じアミノ酸配列をコードするDNA配列；(2)それ らに開示されているコード配列の相補体と、高度にストリンジェントな条件下で
、例えば0.1 x SSC/0.1% SDS中、68℃で洗浄（Ausubel F.M.ら編, 1989, Curren
t Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, I
nc., and John Wiley & sons, Inc., New York, p.2.10.3）してハイブリダイズ
し、かつ機能的に同等の遺伝子産物をコードするDNA配列；および／または3）そ
れらに開示された該コード配列の相補体と、それほどストリンジェントでない条
件下で、例えば中程度のストリンジェント条件下で、例えば0.2 x SSC/0.1% SDS
中、42℃で洗浄して（Ausubelら, 1989,前掲）ハイブリダイズし、かつ機能的に
同等の遺伝子産物もコードするDNA配列である。
【００２５】 本発明では、天然のAAV REPおよびCAPタンパク質の（断片を含む）誘導体およ
び類似体をコードする核酸も、その誘導体と類似体がAAV DNA複製およびDNAのウ
イルス粒子への包膜に必要な機能をあたえる能力を持つ限り、使うことができる
。特に、REPおよびCAP誘導体は、置換、付加、または欠失によりREPおよびCAP配
列を変更することによって作ることができ、変更された表現型を有しうる機能的
に活性のある分子を与える。さらに、ヌクレオチドコード配列の縮重により、実
質的に同じかまたは機能的に同等のAAV REPおよびCAPアミノ酸配列をコードする
他のDNA配列を、本発明の方法の実施に使うこともできる。該遺伝子産物は、サ イレントな変化をもたらして生物活性のある産物を生産する、配列内のアミノ酸
残基の欠失、付加または置換を含んでもよい。このようなアミノ酸置換は、関わ
る残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性
に基いて行われる。例えば、負電荷をもつアミノ酸は、アスパラギン酸およびグ
ルタミン酸を含み；正電荷をもつアミノ酸はリシンおよびアルギニンを含み；同
じ親水性価を有する無電荷の極性ヘッド基または非極性ヘッド基を有するアミノ
酸は次のものを含む：ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、
アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン
。
【００２６】 様々な宿主発現ベクター系を用いて、AAV REPおよびCAPタンパク質を発現する
ことができる。本発明の目的に使うことができる発現系は、限定されるものでな
いが、哺乳類細胞のゲノム（例えばメタロチオネインプロモーター）からまたは
哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイル
ス7.5Kプロモーター）から誘導された調節エレメントを含有する組換え発現構築
物を宿す哺乳類細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3、A549）を含む。調 節エレメントは、限定されるものでないが、誘導および非誘導プロモーター、エ
ンハンサー、オペレーター、および発現を駆動し調節することが当業者に知られ
ている他のエレメントを含む。細胞系内のREPおよびCAPタンパク質を発現するプ
ロモーターは、宿主細胞内で高度に制御されているプロモーターから引き出され
る。それらは、限定されるものでないが、CMVプロモーター、SV40プロモーター 、ヘルペスTKプロモーター、および組換えDNA技術で周知の他のプロモーターを 含む。誘導遺伝子制御は、限定されるものでないが、メタロチオネインプロモー
ター（MT）および熱ショックプロモーターを含む単純誘導プロモーター系を使っ
て、またはグルココルチコイド刺激に反応するマウス乳癌ウイルスプロモーター
（MMTV）を使って達成される。あるいは、よりフレキシブルであるがより複雑な
誘導調節系を「バイナリー」(binary)遺伝子手法によって実施することができる
。これらのバイナリー調節系は、トランス活性化遺伝子産物を用いて対象とする
第２遺伝子の発現を調節する。さらに、リプレッサーに基くバイナリー系を使っ
て遺伝子発現を調節することができる（Brownら, 1987, Cell 48:555-566; Figg
eら, 1988, Cell 49:603-612）。例えば、tetR系は、細菌リプレッサーtetRおよ
び対象の遺伝子のプロモーター領域へのtetRオペレーター配列の挿入を利用する
。このような系における遺伝子発現の誘導は、リプレッサー分子に結合し不活性
化して遺伝子発現の活性化をもたらすインデューサー（inducer）分子の応用に 関わる。 REPおよびCAPコード領域を、所定の細胞系において活性化できる発現ベクター
中のどのような数のプロモーターにも連結させることができる。さらに、このカ
セット（REPまたはCAP遺伝子とプロモーター）を、ベクターを受入れる細胞が確
認できるように、選択マーカーを含有するベクターに担持させる。選択マーカー
とそれに伴う選択薬剤は、限定されるものでないが、アミノグリコシドホスホト
ランスフェラーゼ／G418、ハイグロマイシン-Bホスホトランスフェラーゼ／ハイ
グロマイシン-B、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ／メトトレキセートのような
増幅可能選択マーカーを含む群、ならびにその他当業者に周知のものから引き出
すことができる。
【００２７】 本発明の他の実施形態は、AAV REPおよびCAPタンパク質を発現する原核生物、
昆虫、植物、および酵母発現系の使用を含む。REPおよびCAPタンパク質を発現す
るために、REPおよびCAPタンパク質をコードするヌクレオチド配列、または第5.
1節、前掲、に記載した機能性等価物を、適当な発現ベクター、すなわち挿入さ れたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入
する。当業者に周知の方法を使って、適当な転写／翻訳制御シグナルに機能しう
る形で連結されたREPおよびCAPタンパク質コード配列を含有する発現ベクターを
構築することができる。これらの方法は、in vitro組換えDNA技術、合成技術、 およびin vivo組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatisら, 1989, Molec
ular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.お
よびAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ
ishing Associates & Wiley Interscience, N.Y.）に記載の技術およびベクター
を参照すること。
【００２８】 挿入したタンパク質コード配列の十分な翻訳には、特定の開始シグナルも必要
である。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。これらの 外因性翻訳制御シグナルおよび開始配列は、天然および合成両方の様々な起源で
あってよい。例えば、大腸菌（E.coli)発現ベクターは、適当に位置したリボソ ーム結合部位および開始ATGのような翻訳制御配列を含むであろう。
【００２９】 REP 78/68タンパク質の発現は、しっかりと制御された、低レベルの、または 誘導しうるREP 78/68遺伝子の発現をもたらすプロモーター系の使用を介して、 転写レベルで調節することができる。このようなプロモーターを、遺伝子操作に
よって、低レベルのREP 78/68タンパク質を発現するように設計した組換えヘル パープラスミドに組込むことができる。さらに３重らせん分子を用いてREP 78/6
8遺伝子発現のレベルを低下させることができる。このような３重らせん分子を 、REP 78/68遺伝子のプロモーター領域とハイブリダイズさせ、それによりREP遺
伝子転写を抑制するように設計することができる。
【００３０】 さらに、本発明は、REP 78/68 mRNAの翻訳を調節するよう遺伝子操作した組換
えヘルパープラスミドを包含する。例えば、REP遺伝子のコード領域を、遺伝子 操作によって、その開始METコドンをより低い効率で翻訳される開始コドンで置 き換えることができる。例えば、REP 78/68の開始コドンにATGからACGへの変異 を有する組換えプラスミドを構築することができる。
【００３１】 ウイルスのREP 78/68タンパク質をコードする遺伝子も、翻訳リプレッサータ ンパク質が結合する特定の5'ヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作する
ことができる（Melefors, 1993, Bioassays 15:85-90）。このようなリプレッサ
ータンパク質のREP 78/68 mRNA分子の5'末端への結合は、REP 78/68 mRNA翻訳の
抑制をもたらすであろう。このような系を使い、REPタンパク質のレベルを、翻 訳リプレッサータンパク質のレベルまたは活性を調節することにより制御するこ
とができるであろう。このような配列は、限定されるものでないが、鉄応答エレ
メントのような配列を含む。
【００３２】 あるいは、REP 78/68 mRNA翻訳のレベルを、REP mRNAの安定性を変えることに
より制御することができる。例えば、REP 78/68 mRNAの半減期は、3'非翻訳領域
（UTR）のAおよびUヌクレオチドが多い遺伝子操作ヌクレオチド配列により有意 に低下する。さらに、3'UTRに特定のエンドヌクレアーゼの認識部位を含有するR
EP 78/68 mRNAを、組換えDNA技術を使って作製することができる。
【００３３】 さらに、REP 78/68 mRNAの翻訳を、特定のmRNA再コードシグナルのREP遺伝子 へのクローニングによって制御することができる。このようなREP 78/68 mRNA分
子の再コードシグナルは、成長するREP 78/68ポリペプチド鎖を、時折、リボソ ーム上の１つのヌクレオチドだけ逆方向にスリップさせ、mRNAを間違った読み枠
で読ませて、末端切断されたREPタンパク質を生産する。本発明の１つの実施形 態では、ヌクレオチドUUUUUUAからなる再コードシグナル配列を、AAV REPをコー
ドする組換えヘルパープラスミドに含ませて、所望の低レベルのAAC REPタンパ ク質を生産する。
【００３４】 宿主細胞で発現されるREP 78/68タンパク質のレベルは、アンチセンスおよび リボザイム分子の使用によってさらに低下させることができる。アンチセンス手
法は、相補的なREP RNAと結合してREP RNAの翻訳を抑制するオリゴヌクレオチド
の設計に関わる。リボザイム分子は、１つ以上のREP RNAに相補的な配列を含む ように設計され、特異的かつ効率的にREP RNA配列の内部切断を触媒するように 機能する。
【００３５】 最後に、REP 78/68タンパク質の活性を翻訳後レベルで制御することもできる 。例えば、活性の低いおよび／またはタンパク質安定性の低いREP 78/68タンパ ク質の変異型を作製することができる。REP 78/68タンパク質の活性は温度感受 性REP変異体を使用して制御することができる。あるいは、安定性のより低いREP
タンパク質、すなわち半減期のより短いREPタンパク質またはタンパク質分解切 断感受性のより高いREPタンパク質を、REPタンパク質の活性を低下させる手段と
して用いることができる。
【００３６】 5.2. AAV REPおよびCAPタンパク質を発現するように遺伝子操作した細胞系 低レベルのAAV REP 78/58タンパク質ならびに高レベルのREP 40/52およびCAP
タンパク質を自発的に発現するように、細胞系を遺伝子操作することができる。
AAV REPおよびCAP産生性細胞系を遺伝子工学的技法で作製するために、AAV REP およびCAPオープンリーディングフレームを挿入した組換えヘルパープラスミド ベクターで、細胞をトランスフェクトすることができる。上記の第5.1節に記載 した方法を使用して、組換えベクターを構築するためには、標準的組換えDNA技 術を使用することができる（Ausubel,F.ら編、Current Protocols in Molecular
Biology,Wiley & Sons, New York,1994）。トランスフェクションは当分野のど
の標準的技法によっても達成することができる。あるいはまた、宿主細胞ゲノム
中にDNAを組み込むことができるウイルスベクターを使用して、細胞系を樹立す ることができる。これらのベクターの例として、レトロウイルスまたはAAVに由 来するものが含まれる。
【００３７】 組み込みのために選択することができる細胞系として、限定するわけではない
が、HeLa、COS、NTH 3T3、A549および当業者に周知のその他のものが含まれる。
選択された細胞系中で活性化することができる、どのような数の異種プロモータ
ーにREPおよびCAPをコードする領域を連結してもよい。その上、この挿入カセッ
ト（REPおよびCAP遺伝子ならびにプロモーター）を選択マーカーをコードする遺
伝子に連結してもよい。この場合、マーカーを連結させたREPおよび／またはCAP
コード領域を組み込むと、このマーカーによってもたらされる特定の表現型が安
定的にトランスフェクトされた細胞に付与される。これによって、REPおよび／ またはCAP遺伝子がうまく組み込まれた細胞を選択することができるようになる 。あるいは、選択マーカーを別のプラスミドに担持させてトランスフェクトして
もよい。
【００３８】 細胞系内でAAV REPおよびCAPタンパク質を発現させるためのプロモーターを、
その宿主細胞内で機能的に活性なものから選び出すことができる。当分野で周知
のこうしたプロモーターとして、宿主細胞内で高度に制御された結果、ウイルス
REP 78/68タンパク質の低レベル発現またはREP 40/52およびCAPタンパク質の高
レベル発現をもたらすものが含まれる。本発明の実施において、誘導性プロモー
ターを使用することもできる。これらとして、限定するわけではないが、メタロ
チオネインプロモーター（MT）、マウスの乳癌ウイルスプロモーター（MMTV）、
および当業者に知られたその他のものが含まれる。
【００３９】 選択マーカーおよびそれらに付随する選択薬剤として、限定するわけではない
が、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ／G418、ハイグロマイシン-Bホ
スホトランスフェラーゼ／ハイグロマイシン-B、およびジヒドロ葉酸レダクター
ゼ／メトトレキセートなどの増幅性選択マーカー、ならびに当業者に知られてい
るその他のものが含まれる。
【００４０】 REPおよびCAP遺伝子の発現の検出は、ノーザン分析、イムノブロッティング、
および免疫沈降を含む標準的技法によって実施することができる。こうした技法
を利用して、低レベルのREPタンパク質を発現する細胞を同定することができる
。
【００４１】 5.3. 組換えウイルス株の生産 本発明は、AAV REPおよびCAPタンパク質の発現を制御することによる高力価の
rAAV株の効率的生産法に関する。本発明の方法には、ヘルパーウイルス、AAV CA
PおよびREPタンパク質をコードする組換えDNA、および対象とするDNA配列とこれ
に必要とされるシス作用性AAV末端反復構造を含む組換え核酸を保有する真核細 胞を培養することが含まれる。
【００４２】 本発明の第１の目的は、低レベルのREP 78/68タンパク質と高レベルのREP 40/
52およびCAPをトランスで発現させるための方法を提供することである。本発明 の方法は、REP 78/68タンパク質の発現または活性の低下の結果として高力価のr
AAV株が産生されるという観察に基づいている。
【００４３】 組換えウイルス株を作製するためには、ヘルパーウイルス機能を提供し、かつ
AAV REPおよびCAPタンパク質をトランスで供給することができる宿主細胞系中に
、AAV ITRに隣接して対象のDNA配列を含有する組換え核酸をトランスフェクトま
たは感染させるのがよい。このREPおよびCAPタンパク質は、線状の組換え核酸を
複製して、成熟ウイルス粒子中に包膜するために必要とされる。
【００４４】 REPおよびCAPタンパク質は、それぞれのタンパク質をコードしうる組換えプラ
スミドで宿主細胞系をトランスフェクトすることによって、トランスで供給する
ことができる。DNAトランスフェクションは当業者に周知の方法を使用して実施 することができる。これらとして、リポフェクション(lipofection)、エレクト ロポレーションまたはリン酸カルシウム沈降によるDNAトランスフェクションが 含まれる（Ausubelら、1989：Current Protocols for Molecular Biology, Gree
n Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York）。R
EPおよびCAPタンパク質の一過性または安定的発現のいずれかを目的として、プ ラスミドを宿主細胞系中にトランスフェクトする。
【００４５】 ウイルスREPおよびCAPタンパク質の発現の外に、宿主細胞系はヘルパーウイル
ス機能を提供することができなければならない。アデノウイルスおよび単純ヘル
ペスウイルスの両者はともに、シス要求性のAAV末端反復配列を含有するDNA断片
の複製および包膜のためのヘルパーウイルスとして作用することができる。これ
ら２つのウイルスのいずれか、またはAAVのためのヘルパーウイルスとして作用 することができる任意のウイルスによる感染を受け入れるどんな宿主でも本発明
の実施のために使用することができる。感染多重度（MOI）および感染の持続時 間は使用するウイルスおよび利用する細胞系のタイプに依存し、こうした技法は
当業者にとって周知である。
【００４６】 5.4. 組換えAAVウイルス株の使用 癌およびAIDSなどの先天性および後天性疾患を含むヒトの疾病を管理および正
常化するための、遺伝情報を適切な宿主細胞中に導入する目的での遺伝子治療用
に、rAAVウイルス株を使用することができる。このrAAVを患者に治療上有効な用
量で投与することができる。治療上有効な用量とは、疾病の症状の軽減をもたら
すのに十分な化合物の量を意味する。
【００４７】 rAAVの毒性および治療効力は、例えばLDS50（集団の50％の致死量）およびED5 0 （集団の50％に治療効果がある用量）の決定のための、細胞培養物または実験 動物における医薬の標準的な手法によって決定することができる。毒性と治療効
力の用量比が治療指数であり、比率LD50/ED50で表現することができる。大きな 治療指数を示す用量が好ましい。毒性側の効果を表示する用量を使用するときは
、治療しない細胞に対する損傷を最少にし、そして副作用を低下させるため、rA
AVが治療部位をターゲットとするような送達システムを設計するように注意すべ
きである。
【００４８】 ヒトにおいて使用するためのある範囲の投与量を製剤化するために、細胞培養
アッセイおよび動物試験から得られたデータを使用することができる。これらの
rAAVの投与量は好ましくはほとんどまたは全く毒性を伴わないED50を含む循環濃
度の範囲内とする。投与量は、使用する投与剤型および利用する投与経路に応じ
て、この範囲内で変更することができる。本発明で使用するどの化合物について
も、治療上有効な用量は最初に細胞培養アッセイから評価することができる。細
胞培養で決定されたIC50（すなわち、最大の半分の感染量または最大の半分の阻
害量を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量を動
物モデル用に製剤化することができる。こうした情報を使用して、ヒトにおいて
有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高
性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００４９】 本発明にしたがって使用するためのrAAVを含む医薬組成物を、１種以上の生理
学的に許容される担体または賦形剤を使用し、通常の方法で製剤化することがで
きる。例えば、rAAVをPBS（リン酸緩衝生理食塩水）などの担体中に懸濁させる ことができる。
【００５０】 rAAVならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物を、（口または鼻の
いずれかを経由する）吸入または吹入による投与、あるいは経口、舌下、非経口
または直腸投与用に製剤化することができる。
【００５１】 吸入による投与のためには、本発明にしたがって使用するためのrAAVを、好適
な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジク
ロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の好適な気体、を併用する
加圧パックまたはネブライザーからのエアゾルスプレーでの提供形態で都合よく
送達される。加圧エアゾルの場合、投与量単位は一定量を送達するバルブを設け
ることによって決定することができる。吸入器または吹入器で使用するため、治
療用化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との混合粉末を含
有する、例えばゼラチンのカプセルまたはカートリッジを製剤化することができ
る。
【００５２】 経口投与のためには、医薬組成物を、結合剤（例えばあらかじめゲル化したト
ウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチル
セルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微小結晶セルロースもしくはリン
酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクもしく
はシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンもしくはナトリウムデンプング
リコレート）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に
許容される賦形剤とともに普通の方法によって調製した錠剤またはカプセル剤の
形状にすることができる。錠剤は当分野で周知の方法によってコーティングして
もよい。経口投与のための液状製剤は例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形態
とするか、または使用前に水もしくはその他の好適なビヒクルにより調製される
乾燥製品として適用してもよい。こうした液状製剤は、懸濁剤（例えばソルビト
ールシロップ、セルロース誘導体もしくは水素化食用油脂）；乳化剤（例えばレ
シチンもしくはアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油状エステ
ル、エチルアルコールもしくは分別植物油）；および保存剤（例えばメチルもし
くはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的 に許容さ
れる添加剤とともに通常の方法によって調製することができる。製剤には適宜バ
ッファー塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有させてよい。
【００５３】 経口投与用製剤は、活性化合物の制御された放出を与えるように好適に製剤化
することができる。舌下投与のためには、組成物を通常の方法で製剤化した錠剤
またはトローチの形態とすることができる。 注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に、rAAVを製剤
化することができる。注射用製剤は例えばアンプルに入れた単位投与剤とするか
、保存剤を添加した多数回用量容器に入れて提供することができる。組成物を油
性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態とすることが
でき、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの添加剤を含ませてもよい。あ
るいは、使用前に好適なビヒクル、例えば無菌で発熱物質を含まない水により調
製するために、活性成分を凍結乾燥粉末形態としてもよい。
【００５４】 前記の製剤の外に、rAAVをデポー剤として製剤化することもできる。こうした
長期作用性製剤を埋め込み（例えば皮下または筋内）によるか、または筋内注射
によって投与することができる。これらの例をあげると、治療用化合物を好適な
ポリマー性もしくは疎水性物質とともに（例えば許容される油中のエマルジョン
として）、またはイオン交換樹脂とともに製剤化するか、あるいは溶解度が低い
誘導体、例えば低溶解性塩として製剤化することができる。
【００５５】 所望ならば、活性成分を含有する１単位以上の投与剤型を含むパックまたはデ
ィスペンサー器具に入れて組成物を提供することができる。パックは金属または
プラスチックフォイル、プラスチックパックなど、としてもよい。パックまたは
ディスペンサー器具に投与のための説明書を添付してもよい。
【００５６】 ６．実施例： AAV REPおよびCAP遺伝子の組換えウイルスベクター発現 以下の分節では、低レベルのAAV REP 78/68タンパク質ならびに高 レベルのAA
V REP 40/52およびCAPタンパク質を発現するように遺伝子工学的技法で作製され
た組換えAAVベクターについて記載する。
【００５７】 6.1. AAVヘルパープラスミドの構築 プラスミドpACG-Rep（図３）を構築するため、プラスミドpACG-2（図２）を制
限酵素 XbaIおよび XhoIで消化し、そしてRep遺伝子断片（ヌクレオチド115-216
3）を単離する。オリゴヌクレオチドアダプターの１つをこの断片の XhoI末端に
連結して、rep遺伝子中の欠失したヌクレオチドに代替させる（5'TCAGAGAGAGTGT
CC3'にアニールした5'TCGAGGACACTCTCTCTGA3'）。次にこのRep遺伝子断片をEcoR
IおよびNotI制限酵素で消化したプラスミド pCMBβ（図８；Clontech,＃6177-1 ）中に、rep遺伝子の3'末端をプラスミド pCMBβのSV40ポリアデニル化部位に近
接させて挿入する。
【００５８】 プラスミドpCMV-52/40＋Cap（図４）を構築するため、プラスミドpACG-2（図
２）を制限酵素 BcIIおよび XbaIで消化し、そしてRep＋Cap遺伝子断片（ヌクレ
オチド894-4420）を単離する。次にこのRep＋Cap遺伝子断片をBamHI制限酵素で
消化したプラスミド pCMVβ（図８）中に挿入する。プラスミドpCMV-52/40（図
５）を構築するため、プラスミドpACG-2（図２）を制限酵素 BcIIおよび XhoIで
消化し、そしてRep遺伝子断片（ヌクレオチド894-2163）を単離する。オリゴヌ
クレオチドアダプターの１つをこの断片の XhoI末端に連結して、rep遺伝子中の
欠失したヌクレオチドに代替させる（5'CAGAGAGAGAGTGTCC3'にアニールした5'TC
GAGGACACTCTCTCTGA3'）。次にこのRep遺伝子断片をXhoIおよびNotI制限酵素で消
化したプラスミド pCMBβ（図８；Clontech,＃6177-1）中に、rep遺伝子の5'末 端 をプラスミド pCMBβのCMVプロモーターに近接させて挿入する。プラスミドp
CMV-Cap（図６）を構築するため、プラスミドpACG-2（図２）を制限酵素 HindII
Iおよび XbaIで消化し、そしてCap遺伝子断片（ヌクレオチド1812-4420）を単離
する。次にこのCap遺伝子断片をBamHI制限酵素で消化したプラスミド pCMBβ（C
lontech,＃6177-1）中に、Cap遺伝子の5'末端をプラスミド pCMVβのCMVプロモ ーターに近接させて挿入する。
【００５９】 本発明の範囲は記載した特定の実施形態に限定されるものではなく、これらは
本発明の個々の態様を単に説明することを意図しており、機能的に等価な方法お
よび成分は本発明の範囲内である。実際に、当業者にとって、本明細書に示し、
記載したものの外に、前記の説明および添付する図面から、本発明の各種の改変
が明らかになるであろう。こうした改変は特許請求の範囲に含まれるものと想定
する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 AAVゲノムのマップ。
【図２】 pACG-2のマップ。プラスミドACG-2は内在性p5プロモーターを含有し、REP 78/
68の翻訳開始コドンの位置にATCからACGへの変異を有する。
【図３】 プラスミドpACG-REPのマップ。プラスミドpACG-REPはp5プロモーターの制御下
にあるAAV REP遺伝子を含有し、翻訳開始コドンの位置にATCからACGへの変異を 有する。
【図４】 プラスミドpCMV-52/40+Capのマップ。プラスミドpCMV-52/40 CAPはCMVプロモ ーターの制御下にあるAAV REP 40/52およびCAPを含有する。
【図５】 プラスミドpCMV-52/40のマップ。プラスミドpCMV-52/40はCMVプロモーターの 制御下にあるAAV REP 40/52を含有する。
【図６】 プラスミドpCMV-Capのマップ。プラスミドpCMV-CAPはCMVプロモーターの制御 下にあるAAV CAP遺伝子を含有する。
【図７】 組換えAAVベクタープラスミドのマップ。プラスミドは2つのAAV ITR配列の間 にトランスジーンカセットインサートを含有する。
【図８】 pCMVBのマップ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，Ｈ Ｕ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組換えアデノ随伴ウイルス株を生産する方法であって、 a) アデノ随伴ウイルスの複製が可能な細胞を、 i) 低下したレベルのアデノ随伴 REP 78/68タンパク質を発現するよう に遺伝子操作した組換えベクター、 ii) 上昇したレベルのアデノ随伴 REP 40/52およびCAPタンパク質を発現
    するように遺伝子操作した組換えベクター、および iii) 外来DNA配列を含有し、かつ感染性AAVビリオン中に組み込むことが 可能な組換えアデノ随伴ウイルスベクター、 で同時トランスフェクトし、 b) 産生されたビリオンを回収する、 ことを含んでなる上記方法。
  2. 【請求項２】 REP 78/68遺伝子の転写を調節することによってREP 78/68タ
    ンパク質のレベルを低下させる、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 REP 78/68遺伝子の翻訳を調節することによってREP 78/68タ
    ンパク質のレベルを低下させる、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 REP 40/52およびCAP遺伝子の転写が異種プロモーターの制御
    下にある、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 異種プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターであ
    る、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 組換えアデノ随伴ウイルス株を生産するための宿主細胞であ
    って、 i) 野生型よりも低いレベルのアデノ随伴 REP 78/68タンパク質を発現 する組換えDNAベクター、および ii) アデノ随伴 REP 40/52およびCAPタンパク質を発現する組換えDNAベ クター１種、 を含有する上記細胞。
  7. 【請求項７】 REP 78/68タンパク質のレベルが転写レベルで調節される、
    請求項５記載の宿主細胞。
  8. 【請求項８】 REP 78/68タンパク質のレベルが翻訳レベルで調節される、
    請求項５記載の宿主細胞。
  9. 【請求項９】 REP 40/52およびCAP遺伝子の転写が非アデノ随伴ウイルスプ
    ロモーターの制御下にある、請求項５記載の宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 REP 40/52およびCAP遺伝子の転写がサイトメガロウイルス
    プロモーターの制御下にある、請求項８記載の宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 宿主細胞が一過性にトランスフェクトされる、請求項６記
    載の宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 宿主細胞が安定的にトランスフェクトされる、請求項６記
    載の宿主細胞。
JP2000506318A 1997-08-08 1998-08-07 組換えａａｖの生産効率を増強する方法 Pending JP2001512674A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/908,578 1997-08-08
US08/908,578 US6037177A (en) 1997-08-08 1997-08-08 Method for increasing the efficiency of recombinant AAV production
PCT/US1998/016510 WO1999007833A1 (en) 1997-08-08 1998-08-07 Method for increasing the efficiency of recombinant aav production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001512674A true JP2001512674A (ja) 2001-08-28

Family

ID=25425996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000506318A Pending JP2001512674A (ja) 1997-08-08 1998-08-07 組換えａａｖの生産効率を増強する方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US6037177A (ja)
EP (1) EP1005534B1 (ja)
JP (1) JP2001512674A (ja)
AT (1) ATE397655T1 (ja)
AU (1) AU732145B2 (ja)
CA (1) CA2300084A1 (ja)
DE (1) DE69839584D1 (ja)
WO (1) WO1999007833A1 (ja)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5436146A (en) * 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
AU728220B2 (en) * 1997-04-14 2001-01-04 Cell Genesys, Inc. Methods for increasing the efficiency of recombinant AAV product
CA2303768C (en) 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
US7078387B1 (en) 1998-12-28 2006-07-18 Arch Development Corp. Efficient and stable in vivo gene transfer to cardiomyocytes using recombinant adeno-associated virus vectors
AU782966B2 (en) 1999-06-08 2005-09-15 University Of Iowa Research Foundation, The Compounds and methods to enhance RAAV transduction
AU7739000A (en) 1999-10-01 2001-05-10 University Of Florida Temperature-sensitive regulation of viral vector production
US7115391B1 (en) * 1999-10-01 2006-10-03 Genovo, Inc. Production of recombinant AAV using adenovirus comprising AAV rep/cap genes
US6844192B2 (en) 2001-06-29 2005-01-18 Wake Forest University Adenovirus E4 protein variants for virus production
US7647184B2 (en) 2001-08-27 2010-01-12 Hanall Pharmaceuticals, Co. Ltd High throughput directed evolution by rational mutagenesis
US20030129203A1 (en) * 2001-08-27 2003-07-10 Nautilus Biotech S.A. Mutant recombinant adeno-associated viruses
US20030225260A1 (en) * 2002-04-30 2003-12-04 Snyder Richard O. Production of recombinant AAV virions
AU2004227915A1 (en) * 2003-03-31 2004-10-21 John F. Engelhardt Pharmico-gene theraphy of epithelial sodium channel associated disoders
US20040197312A1 (en) 2003-04-02 2004-10-07 Marina Moskalenko Cytokine-expressing cellular vaccine combinations
US20070231298A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-04 Cell Genesys, Inc. Cytokine-expressing cancer immunotherapy combinations
US20090017062A1 (en) * 2006-04-28 2009-01-15 Iowa Research Foundation Iowa Centers For Enterpri Methods and compounds to alter virus infection
WO2009014708A2 (en) * 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
US8425897B2 (en) * 2007-08-30 2013-04-23 Immutep S.A. Compositions containing LAG-3 and cells that secrete GM-CSF and methods of use
US8840881B2 (en) 2008-08-28 2014-09-23 Aduro Gvax Inc. Methods and compositions for treating prostate cancer or inducing a humoral immune response against prostate cancer
US20160272687A1 (en) * 2013-11-08 2016-09-22 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Adeno-associated virus "x" oncogene
GB201322626D0 (en) 2013-12-19 2014-02-05 Immutep S A Combined preparations for the treatment of cancer
GB201500374D0 (en) 2015-01-09 2015-02-25 Immutep S A Combined preparations for the treatment of cancer
WO2017139381A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 University Of Iowa Research Foundation Methods to produce chimeric adeno-associated virus/bocavirus parvovirus
MA43735A (fr) 2016-03-07 2018-11-28 Univ Iowa Res Found Expression médiée par aav utilisant un promoteur et un activateur synthétiques
CN110785495A (zh) * 2017-04-18 2020-02-11 葛兰素史克知识产权开发有限公司 腺相关病毒载体的生产方法
GB201800903D0 (en) * 2018-01-19 2018-03-07 Oxford Genetics Ltd Vectors

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) * 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5436146A (en) * 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5478745A (en) * 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
DE19625188A1 (de) * 1996-06-24 1998-01-08 Medigene Gmbh System zur Herstellung von AAV-Vektoren
AU728220B2 (en) * 1997-04-14 2001-01-04 Cell Genesys, Inc. Methods for increasing the efficiency of recombinant AAV product

Also Published As

Publication number Publication date
DE69839584D1 (de) 2008-07-17
EP1005534A4 (en) 2002-08-28
EP1005534A1 (en) 2000-06-07
US6037177A (en) 2000-03-14
AU732145B2 (en) 2001-04-12
WO1999007833A1 (en) 1999-02-18
AU8825498A (en) 1999-03-01
EP1005534B1 (en) 2008-06-04
CA2300084A1 (en) 1999-02-18
ATE397655T1 (de) 2008-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1005534B1 (en) Method for increasing the efficiency of recombinant aav production
US7229823B2 (en) Methods for increasing the efficiency of recombinant AAV product
US9567607B2 (en) Adeno-associated virus serotype I nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
CA2349838C (en) Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US7070998B2 (en) Adeno-associated virus materials and methods
Tal Adeno-associated virus-based vectors in gene therapy
JP2001500497A (ja) 組換えアデノ随伴ウイルスに指図される遺伝子治療の方法
JPH10504185A (ja) アデノ随伴ウイルス物質および方法
US7091029B2 (en) High titer recombinant AAV production
JP2001520051A (ja) 組換えａａｖベクターの産生のための増幅可能アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）パッケージングカセット
Xiao et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer
EP1845163A2 (en) Adeno-associated virus serotype l nucleic acid sequences, vetors and host cells containing same
EP4112731A1 (en) System for high-level raav production

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050804

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080630

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080918

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080926

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081029

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081106

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090304