JPH11512926A - Ａａｖベクター産生のための高効率ヘルパー系 - Google Patents
Ａａｖベクター産生のための高効率ヘルパー系Info
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- JPH11512926A JPH11512926A JP9508599A JP50859997A JPH11512926A JP H11512926 A JPH11512926 A JP H11512926A JP 9508599 A JP9508599 A JP 9508599A JP 50859997 A JP50859997 A JP 50859997A JP H11512926 A JPH11512926 A JP H11512926A
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Abstract
(57)【要約】
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンの産生においてAAVベクターを補足するために必要なAAV機能を発現し得る、アデノ随伴ウイルス（AAV）コード領域を有する、新規な核酸分子が提供される。この分子は、AAV p5プロモーター領域に実質的に相同であるヌクレオチド配列を特徴とし、ここでこのp5プロモーター領域は、野生型AAVゲノム内のAAV repコード領域に対してその天然の位置以外の部位でこの分子中に位置する。AAVヘルパー機能構築物もまた提供され、これは、転写および翻訳されて適切な宿主細胞で相補的AAVヘルパー機能を発現し得、レプリコンで具体的に示される本発明の核酸分子を含む。新規なAAVパッケージング細胞およびAAVプロデューサー細胞が提供され、これらは本発明のAAVヘルパー構築物を含み、そして本発明のAAVヘルパー構築物を使用してrAAVビリオンの産生のレベルを増加する方法もまた提供される。野生型AAVを顕著なレベルで混入して産生せずにrAAVビリオンを産生するための方法もまた提供される。
Description
【発明の詳細な説明】
AAVベクター産生のための高効率ヘルパー系技術分野
本発明は、一般に、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター産生における使用のた
めのヘルパー機能系に関する。より詳細には、本発明は、AAVビリオンの産生に
必要な必須のAAV repおよびcap機能の発現を提供するAAVヘルパー機能構築物に
関する。発明の背景
遺伝子送達は、後天性および遺伝性疾患の処置のために有望な方法である。遺
伝子導入の目的のためのウイルスに基づく系（例えば、現在、この目的のための
最も広く使用されるウイルスベクター系であるレトロウイルス系）が多数記載さ
れてきた。種々のレトロウイルス系の記載については、例えば、米国特許第5,21
9,740号；MillerおよびRosman（1989）BioTechniques 7:980-990；Miller，A.D
．(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpaら(1991)Virology 180:849-852；B
urnsら（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8033-8037；および、Boris-Law
rieおよびTemin（1993）Cur．Opin．Genet．Develop．3:102-109を参照のこと。
アデノ随伴ウイルス(AAV)系もまた、遺伝子送達のために使用されている。AAV
は、Dependovirus属に属するヘルパー依存性DNAパルボウイルスである。AAVは、
増殖性感染を生じるためには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワク
シニアのいずれかの、関連のないヘルパーウイルスとの同時感染を必要とする。
このような同時感染の非存在下では、AAVは、そのゲノムの宿主細胞染色体への
挿入によって潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによる次の感染は、組み込
まれたコピーを救出し、これは次いで感染性のウイルスの子孫を産生するために
複製し得る。AAVは広い宿主範囲を有し、そしてこのような細胞が適切なヘルパ
ーウイルスで首尾良く同時感染される限り、任意の種由来の細胞中で複製し得る
。従って、例えば、ヒトAAVは、イヌアデノウイルスで同時感染したイヌ細胞中
で
複製する。AAVは、ヒトまたは動物の疾患のいずれとも関連しておらず、そして
組込みの際に宿主細胞の生物学的特性を変えないようである。AAVの総説につい
ては、例えば、BernsおよびBohenzky（1987）Advances in Virus Research（Aca
demic Press，Inc.）32:243-307を参照のこと。
AAVゲノムは、4681塩基を含む直鎖状の一本鎖DNA分子から構成される（Berns
およびBohenzky、同上）。ゲノムは、DNA複製起点としておよびウイルスのパッ
ケージングシグナルとして、cisで機能する逆方向末端反復配列（ITR）を各末端
に含む。ITRは約145bpの長さである。ゲノムの内部非反復部分は、それぞれAAV
repおよびcap領域として知られる２つの大きなオープンリーディングフレームを
含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパッケージングに関連するウイル
スタンパク質をコードする。特に、少なくとも４つのウイルスタンパク質のファ
ミリーが、見かけの分子量に従って命名された、AAV rep領域、Rep 78、Rep 68
、Rep 52、およびRep 40から合成される。AAV cap領域は、少なくとも３つの部
分、VP1、VP2、およびVP3をコードする。AAVゲノムの詳細な記載については、例
えば、Muzyczka，N．(1992)Current Topics in Microbiol．and Immunol．158:9
7-129を参照のこと。
組換えAAVビリオンの構築が記載されている。例えば、米国特許第5,173,414号
および同第5,139,941号；国際公開番号WO 92/01070（1992年1月23日公開）およ
びWO 93/03769（1993年3月4日公開）；Lebkowskiら（1988）Molec．Cell．Biol
．8:3988-3996；Vincentら（1990）Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laborator
y Press)；Carter，B.J．(1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539
；Muzyczka，N．(1992)Current Topics in Microblol．and Immunol．158:97-12
9；およびKotin，R.M．(1994)Human Gene Therapy 5:793-801を参照のこと。
組換えAAV（rAAV）ビリオンは、一般に、AAVベクタープラスミドおよびヘルパ
ープラスミドを含む２つの構築物でトランスフェクトされている適切な宿主細胞
で産生され、従って、それによって宿主細胞は、AAV複製およびパッケージング
（AAVヘルパー機能）に必要なAAVタンパク質を発現し得る。次いで、宿主細胞は
、適切なヘルパーウイルスで同時感染されて、必要なウイルスヘルパー機能を提
供する。AAVヘルパー機能は、AAV repおよび／またはcapコード領域を含むがAAV
I
TRを欠くAAVヘルパープラスミドで宿主細胞をトランスフェクトすることによっ
て提供され得る。従って、ヘルパープラスミドは、それ自体を複製もパッケージ
もし得ない。repコード領域を含む多くのベクターが公知であり、ATCC受託番号5
3222、53223、53224、53225、および53226を有する、米国特許第5,139,941号に
記載されるベクターが含まれる。同様に、AAV repのHHV-6ホモログを含むベクタ
ーを得る方法が、Thomsonら（1994）Virology 204:304-311に記載される。capコ
ード領域を含む多数のベクターもまた記載されており、米国特許第5,139,941号
に記載されるベクターが含まれる。異種転写プロモーターに作動可能に連結され
たAAV rep遺伝子を有するベクターでトランスフェクトされたヒト293細胞に由来
するパッケージング細胞株が、1995年5月18日に公開された国際公開番号WO 95/1
3392および1995年5月18日に公開された国際公開番号WO 95/13365に記載されてい
る。
rAAVビリオン産生において、AAVベクタープラスミドは、AAV複製機能およびパ
ッケージング機能を提供するAAV ITRに隣接する目的の機能的に関連のあるヌク
レオチド配列（例えば、選択された遺伝子、アンチセンス核酸分子、リボザイム
など）を含むように操作され得る。AAVヘルパープラスミドおよびヌクレオチド
配列を有するAAVベクタープラスミドの両方とも、一過性のトランスフェクショ
ンによってレシピエント細胞に導入される。次いで、トランスフェクトされた細
胞を、アデノウイルスで感染し、これは、AAV repおよびcap領域の転写および翻
訳を指示するヘルパープラスミドに存在するAAVプロモーターをトランス活性化
する。目的のヌクレオチド配列を有するrAAVビリオンが形成され、そして調製物
から精製され得る。
AAVヘルパー機能をコードするヘルパープラスミドでトランスフェクトされて
いる宿主細胞は、パッケージング細胞を含み、これは、トランスフェクションの
効力によって、選択されたAAVベクタープラスミドから欠失した必要な機能を補
足するためのAAV遺伝子産物を発現し得る。パッケージング細胞系を樹立するた
めの多くの試みが行われてきた。特に、Mendelsonら（1988）Virology 166:154-
165は、rep遺伝子を含むプラスミドでのHeLaまたは293細胞の安定なトランスフ
ェクションを使用して、Repの短い形態の１つの低レベルの発現が可能な細胞株
を報告した。正常AAVプロモーターから発現される組み込みAAV repおよびcap遺
伝子を含む細胞株もまた記載されている。Vincentら（1990）Vaccines 90，Cold
Spring Harbor Laboratory Press，353-359頁。
宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれるか、またはエピソームプラスミドとして
維持されているかのいずれかのAAVベクターを含むパッケージング細胞株系を樹
立するために、他のアプローチが試みられている。次いで、この細胞株をAAV re
p、またはrepおよびcap遺伝子を含む構築物のような、AAV機能を補足するtrans
でトランスフェクトする。例えば、Lebkowskiの来国特許第5,173,414号、および
1995年5月18日に公開された国際公開番号WO 95/13365および1995年5月18日に公
開された国際公開番号WO 95/13392を参照のこと。
しかし、有用性が非常に限定された上記のパッケージング細胞系において、多
くの問題に遭遇している。特に、このような系は、顕著なレベルの組換えAAVビ
リオンを生じ得なかった。どの特定の理論によっても結びつけられないこのよう
な問題は、これらの細胞系において発現されたrep遺伝子産物によるいくつかの
阻害効果の一部によるものであり得る。例えば、Labowら（1987）Mol．Cell．Bi
ol．7:1320-1325およびTratschinら（1986）Mol．Cell．Biol．6:2884-2894を参
照のこと。別の問題は、AAVベクターとヘルパープラスミド配列との間の組換え
事象による、このようなパッケージング細胞系における、混入している野生型AA
V粒子（例えば、複製−コンピテントAAV粒子）を顕著なレベルで産生することで
あった。Senapathyら（1984）J．Biol．Chem．259:4661-4666。
従って、有効なレベルで宿主細胞中で発現され得る改良されたAAVヘルパー機
能構築物を提供することが必要なままである。さらに、組換え野生型AAV粒子を
顕著なレベルでまた混入して産生することなく、組換えAAV粒子の市販品として
有意なレベルを産生し得るAAVパッケージング細胞系を提供することが必要なま
まである。発明の要旨
本発明は、AAV p5プロモーター領域およびAAVコード領域（例えば、AAV repお
よびcapコード領域）に実質的に相同であるヌクレオチド配列を有する新規な核
酸分子を提供する。p5プロモーター領域は、野生型AAVゲノムのAAV repコード領
域に対して核酸分子中の正常位置以外の部位に配置され得る。（野生型(wt)AAV
ゲノムのrepコード領域に対して）正常な上流位置から効果的に移動されたp5プ
ロモーター領域を有する本発明の分子は、いくつかの新規な特徴を示す。第１に
、p5プロモーター領域の再位置づけによって、repコード領域が発現される場合
、少なくとも長い形態のRep産物の産生の減衰が生じ得る。さらに、AAV p19およ
びp40プロモーターからの発現に必要なcis作用機能は、rep52/40およびcapが正
常に発現されるように存在する。また、特定の分子では、rAAV産生中の混入して
いる野生型AAV粒子の望ましくない産生が減少または除去され得る。
本明細書中において、AAVコード領域（例えば、AAV repおよびcapコード領域
）およびAAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を有する核酸分子もま
た提供され、ここで、このヌクレオチド配列は、p5プロモーターが、wt AAVゲノ
ム中のAAV repコード領域に対して、正常な上流位置以外の部位に配置されるよ
うに、この分子中に配置される。
上記の核酸分子は、１つまたは複数の追加のヌクレオチド配列をさらに含み得
る−−ここで、単一の追加のヌクレオチド配列はAAVコード領域およびp5プロモ
ーター領域の5'に配置されるか、または複数の追加のヌクレオチド配列はAAVコ
ード領域およびp5プロモーター領域の隣に配置される。これらの追加のヌクレオ
チド配列は、酵母FLPリコンビナーゼ基質（例えば、Flip Recombination Target
(FRT)部位）に実質的に相同である。5'および3'に隣接するFRT部位を供給（prov
ision）することで、FLPリコンビナーゼ酵素の作用によるベクター構築物からの
核酸分子の切り出しが可能になる。
本発明はまた、AAV RepおよびCapポリペプチドを提供するように発現され得る
AAVヘルパー構築物を提供する。このようなヘルパー構築物は、この構築物に含
まれるAAVコード領域の転写および翻訳を指示し得る適切な制御エレメントに、
本発明の核酸分子を作動可能に連結することによって形成され得る。本明細書中
で提供されるAAVヘルパー構築物は、プラスミドまたは任意の他の適切なベクタ
ーを含み得、そして抗生物質耐性遺伝子などのような選択可能遺伝子マーカーを
含むようにさらに構築され得る。１つの特定の実施態様では、AAVヘルパー構築
物は、プラスミドpGN1909（ACTT受託番号69871）を含む。別の特定の実施態様で
は、AAVヘルパー構築物は、プラスミドpW1901-1またはプラスミドpH8のいずれか
を含む。
本発明は、AAVベクターがその中に存在しそしてパッケージング細胞がウイル
スヘルパー機能を発現し得る場合、AAVプロデューサー細胞になり得るAAVパッケ
ージング細胞をさらに提供する。本発明のAAVパッケージング細胞は、適切な宿
主細胞中に本発明のAAVヘルパー構築物を導入することによって産生される。よ
り詳細には、ヘルパー構築物は、公知の技法を使用して、適切な宿主細胞に一過
性または安定にのいずれかにトランスフェクトされ得る。
本明細書中では、ウイルスヘルパー機能がそこで発現される場合に、rAAVビリ
オンを産生し得るAAVプロデューサー細胞も提供される。本発明のプロデューサ
ー細胞は、適切なAAVベクターでの本発明のAAVパッケージング細胞のトランスフ
ェクションによって形成される。本発明によれば、AAVベクターは、一般に機能
的AAV ITRに隣接する異種ヌクレオチド配列を含む。（次の形質導入のための）
異種ヌクレオチド配列を含むrAAVビリオンの産生は、AAVヘルパー構築物に存在
するAAVヘルパー機能をトランス活性化するために、このプロデューサー細胞に
ウイルスヘルパー機能を導入することによって達成され得る。
本発明は、rAAVビリオンを産生する方法をさらに提供し、これは以下の工程を
包含する：適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程；必須のAAVヘルパー機
能を発現するために、ここで提供されるものから選択されたAAVヘルパー構築物
を上記宿主細胞に導入する工程；この宿主細胞中でウイルスヘルパー機能を発現
する工程；およびrAAVビリオンを産生するために上記の細胞を培養する工程。AA
VベクターおよびAAVヘルパー構築物は、当業者に公知の技法を使用して、連続的
または同時のいずれかで、この宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。ウイル
スヘルパー機能の発現は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニ
アウイルスの群から選択される適切なヘルパーウイルスで宿主細胞を感染させる
ことによって提供され得る。ウイルスヘルパー機能は、AAV repおよびcap領域の
転写および翻訳を指示するAAVヘルパー構築物に存在するAAVプロモーターをトラ
ンス活性化する。従って、選択された異種ヌクレオチド配列を有するrAAVビリオ
ンが形成され、そして公知の方法を使用して調製物から精製され得る。
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書の開示によって当業者には容
易に想到する。図面の簡単な説明
図１は、pGN1909プラスミド構築物の構築を示す。
図２は、プラスミドpGN1909の表示である。
図３は、本発明のAAVヘルパー構築物の構築に有用である、76bp FRT部位(配列
番号３)および59bp「最小」FRT部位(配列番号２)のヌクレオチド配列を示す。
図４は、野生型AAV血清型２ゲノムの塩基対145〜494(配列番号４)からなるポ
リヌクレオチド配列を示す。発明の詳細な説明
本発明の実施は、他に指示がなければ、当該分野の技術範囲内のウイルス学、
微生物学、分子生物学、および組換えDNA技法の従来の方法を使用する。このよ
うな技法は、文献に十分に説明される。例えば、Sambrookら Molecular Cloning
: A Laboratory Manual(最新版)；DNA Cloning: A Practical Approach，第Iお
よびII巻（D．Glover編）；Oligonucleotide Synthesis(N．Gait編，最新版)；N
ucleic Acid Hybridization(B．HamesおよびS．Higgins編，最新版)；Transcrip
tion and Translation(B．HamesおよびS．Higgins編，最新版)；CRC Handbook o
f Parvoviruses，第IおよびII巻(P．Tijessen編)；Fundamental Virology，第2
版，第IおよびII巻（B.N．FieldsおよびD.M．Knipe編）を参照のこと。
本明細書中で引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、上記または
下記のいずれであれ、その全体が参考として本明細書に援用される。
本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」
、および「the」は、内容が明確に他を指示しない限り、複数の表示を含む。Ａ．定義
本発明を記載する際に、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義
されることが意図される。
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」は、宿主細胞に外来DNAを確実に挿入す
るための方法または系をいう。このような方法は、組み込まれていない移入され
たDNAの一過性発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外
複製および発現、または宿主細胞のゲノムDNAへの移入された遺伝物質の組込み
を生じ得る。遺伝子移入は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置への独特のアプ
ローチを提供する。多くの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入について開発され
ている。例えば、米国特許第5,399,346号を参照のこと。
「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色
体、ウイルス、ビリオンなどのような、任意の遺伝エレメントを意味し、これは
適切な制御エレメントと結合した場合に複製可能であり、そして細胞間で遺伝子
配列を移入し得る。従って、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒク
ル、ならびにウイルスベクターを包含する。
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または「AAV ITR」とは、AAVゲノ
ムの各末端で見出される当該分野で認識されるパリンドローム領域を意味し、こ
れは、DNAの複製起点としておよびウイルスのパッケージングシグナルとして、c
isで一緒に機能する。AAV ITRは、AAV repコード領域とともに、哺乳動物細胞か
らの効率的な切り出しおよび救出、ならびに２つの隣接するITR間にはさまれた
ヌクレオチド配列の哺乳動物細胞ゲノムへの組込みを提供する。
AAV ITR領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、AAV-2配列については
Kotin，R.M．(1994)Human Gene Therapy 5:793-801；Berns，K.I．「パルボウイ
ルス科およびその複製」Fundamental Virology，第2版，(B.N．FieldsおよびD.M
．Knipe編)を参照のこと。本明細書で使用される場合、「AAV ITR」は、示され
た野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入
、欠失、または置換によって改変され得る。さらに、AAV ITRは、AAV-1、AAV-2
、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むが限定されない、いくつかのAAV血清
型のいずれかに由来し得る。さらに、AAVベクターにおいて、選択されたヌクレ
オチド配列に隣接する5'および3' ITRは、これらが意図するように、すなわち、
宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列の切り出しおよび救出を可能にす
るよ
うに、およびrep遺伝子が細胞中に（同じまたは異なるベクターのいずれかに）
存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組込みを可能にするよう
に機能する限り、必ずしも同一である必要がないかまたは同じAAV血清型もしく
は単離株に由来する必要はない。
「AAVベクター」とは、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含
むが限定されないアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。AA
Vベクターは、全体または一部で欠失した１つ以上のAAV野生型遺伝子、好ましく
はrepおよび／またはcap遺伝子を有し得るが、機能的な隣接するITR配列を保持
し得る。機能的ITR配列は、AAVビリオンの救出、複製、およびパッケージングに
必要である。従って、AAVベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングにc
isで必要とされる少なくともこれらの配列（例えば、機能的ITR）を含むように
、本明細書中で定義される。ITRは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく
、そして、配列が機能的救出、複製、およびパッケージングを提供する限り、例
えばヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変更され得る。
AAVベクターは、機能的AAV ITRとともに両末端（5'および3'）に隣接した１つ
以上の異種ヌクレオチド配列を含むように、当該分野で公知の組換え技法を使用
して構築され得る。本発明の実施において、AAVベクターは、少なくとの１つのA
AV ITRならびに異種ヌクレオチド配列の上流に位置する適切なプロモーター配列
および異種配列の下流に位置する少なくとも１つのAAV ITRを含み得る。5'およ
び3' のITRは、これらが意図されるように機能する限り、必ずしも同一である必
要がないかまたは同じAAV単離株に由来する必要はない。
AAVベクターに含まれる選択された異種ヌクレオチド配列は、欠陥があるか、
もしくは、レシピエント細胞ゲノムから欠落しているタンパク質をコードするか
、または所望の生物学的または治療的な効果（例えば、抗ウイルス機能）を有す
る非天然タンパク質をコードする任意の所望の遺伝子を含み得るか、あるいはこ
の配列は、アンチセンス機能またはリボザイム機能を有する分子に対応し得る。
適切な遺伝子は、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性疾患、および感染性疾患（AI
DS、ガン、神経性疾患、心血管系疾患、高コレステロール血症(hypercholestemi
a)のような異常を含む）；種々の血液の異常（種々の貧血、地中海貧血、および
血友
病を含む）；遺伝的欠損（例えば、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデア
ミナーゼ（ADA）欠損症、気腫など）の処置に使用される遺伝子を包含する。ガ
ンおよびウイルス性疾患に対するアンチセンス治療に有用である多くのアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド（例えば、mRNAの翻訳開始部位（AUGコドン）の周囲の
配列に相補的な短いオリゴヌクレオチド）は当該分野で記載されている。例えば
、Hanら（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:4313-4317；Uhlmannら（1990
）Chem．Rev．90:543-584；Heleneら（1990）Biochim．Biophys．Acta．1049:99
-125；Agarwalら（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:7079-7083；およびHe
ikkilaら（1987）Nature 328:445-449を参照のこと。適切なリボザイムの議論に
ついては、例えば、Cechら（1992）J．Biol．Chem．267:17479-17482およびGold
bergらに対する米国特許第5,225,347号を参照のこと。
AAVベクターはまた、制御配列（例えば、プロモーターおよびポリアデニル化
部位）、ならびに選択マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列、お
よび転写の誘導を可能にする他の制御エレメントを含み得る。このような制御エ
レメントは、以下にさらに十分に記載される。このようなAAVベクターは、当該
分野で周知の技法を使用して構築され得る。例えば、米国特許第5,173,414号；
国際公開番号WO 92/01070（1992年1月23日公開）およびWO 93/03769（1993年3月
4日公開）；Lebkowskiら（1988）Molec．Cell．Biol．8:3988-3996；Vincentら(
1990)Vaccines 90（Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter，B.J．(19
92)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka，N．(1992)Curren
t Topics in Microbiol．and Immunol．158:97-129；Kotin，R.M．(1994)Human
Gene Therapy 5:793-801；ShellingおよびSmith（1994）Gene Therapy 1:165-16
9；およびZhouら（1994）J．Exp．Med．179:1867-1875を参照のこと。
「AAVヘルパー機能」とは、次には増殖性AAV複製にtransで機能し得るAAV遺伝
子産物を提供するように発現され得る、AAV由来コード配列をいう。従って、AAV
ヘルパー機能は、主なAAVオープンリーディングフレーム（ORF）（repおよびcap
）の１つまたは両方を含む。Rep発現産物は、AAVのDNA複製起点の認識、結合、
およびニッキング；DNAヘリカーゼ活性；ならびにAAV（または他の異種）プロモ
ーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。Cap発
現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。AAVヘルパー機能は、本明細
書中では、AAVベクターから欠落している、transでの相補的AAV機能に使用され
る。
用語「ウイルスヘルパー機能」とは、AAVのライフサイクルの種々の局面の間
に必要な因子の供給（provision）をいう。AAVは、増殖性AAV感染を生じるため
には、関連のないヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイル
ス、またはワクシニアウイルス）からのこのようなヘルパー機能を必要とする。
特に、アデノウイルスが、AAVプロモーター発現、AAVメッセンジャーRNA安定性
、およびAAV翻訳に必要とされる因子を供給することが証明されている。例えば
、Muzyczka，N．(1992)Curr．Topics．Microbiol．and Immun．158:97-129を参
照のこと。このような機能の非存在下で、AAVは、宿主細胞染色体へのそのゲノ
ムの挿入によって潜伏状態を樹立する。ウイルスヘルパー機能の産生は、組み込
まれたコピーを救出し、このコピーは次いで複製して感染性ウイルス子孫を産生
し得る。ウイルスヘルパー機能は、適切なヘルパーウイルスでの細胞の感染によ
って提供され得る。
用語「AAVヘルパー構築物」とは、一般的に、AAVベクターから欠失したAAV機
能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいい、目的のヌクレオチド配列
の送達のための形質導入ベクターを産生するために使用される。AAVヘルパー構
築物は、通常、溶菌性AAV複製に必要である、欠落しているAAV機能を相補するた
めにAAV repおよび／またはcap遺伝子の一過性発現を提供するために使用される
；しかし、ヘルパー構築物は、AAV ITRを欠き、そしてそれ自体を複製もパッケ
ージもし得ない。AAVヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾ
ン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。多くのAAVヘルパ
ー構築物が記載されている（例えば、RepおよびCap発現産物の両方をコードする
通常使用されるプラスミドpAAV/AdおよびpIM29+45）。例えば、Samulskiら（198
9）J．Virol．63:3822-3828；およびMcCartyら（1991）J．Virol．65:2936-2945
を参照のこと。Repおよび／またはCap発現産物をコードする多くの他のベクター
が記載されている。例えば、米国特許第5,139,941号を参照のこと。
「組換えウイルス」とは、例えば、粒子への異種核酸構築物の付加または挿入
によって、遺伝的に改変されているウイルスを意味する。
「AAVビリオン」とは、例えば、野生型（wt）AAVウイルス粒子（AAVカプシド
タンパク質コートと結合した直線状の一本鎖AAV核酸ゲノムを含む）、または以
下に記載のような組換えAAVウイルス粒子のような、完全なウイルス粒子を意味
する。これに関して、例えば、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖のいずれ
かの相補的なセンス鎖の一本鎖AAV核酸分子は、任意の１つのAAVビリオンにパッ
ケージされ得、そして両鎖は等しく感染性である。
「組換えAAVビリオン」または「rAAVビリオン」は、本明細書中では、両側にA
AV ITRが隣接している、目的の異種ヌクレオチド配列をカプシド化しているAAV
タンパク質外皮から構成される感染性の複製欠損性ウイルスとして定義される。
用語「プロモーター領域」は、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域をいうた
めの通常の意味で本明細書中において使用され、ここで、この調節配列は、RNA
ポリメラーゼを結合し得、そして下流（3'方向）のコード配列の転写を開始し得
る遺伝子に由来する。プロモーター領域内のあるコンセンサス配列は、RNAポリ
メラーゼの結合に特に重要であると思われ、そして一般的にCATボックスおよびT
ATAボックスと呼ばれる。プロモーター領域は、遺伝子コード領域の始まりから
約40ヌクレオチド〜約５ヌクレオチド上流に広がり、CATボックスおよびTATAボ
ックスは、ヌクレオチド配列の短い範囲としてプロモーター領域内に位置する。
TATAボックスは、転写因子の結合部位を含むが、RNAポリメラーゼ酵素の結合部
位を含まない。
「AAV p5プロモーター領域」は、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7
などを含むが限定されないAAV血清型から単離されたp5プロモーター領域に対し
て同一性を有するプロモーター配列、ならびに（以下に定義されるように）それ
と実質的に相同であり、そして機能的に等価であるプロモーター配列の両方を包
含する。AAV p5プロモーターは、長い形態のRepの発現を指示し、そして記載お
よび特徴づけられている。例えば、Lusbyら（1982）J．Virol．41:518-526;Laug
hlinら（1979）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76:5567-5571；Greenら（1980a）J
．Virol．36:79-92；Greenら（1980b）Cell 1:231-242を参照のこと。本発明を
定義する目的のために、wt AAVゲノムでは、 AAV p5プロモーター領域は、repコ
ー
ド配列の転写開始部位の5'末端で結合し、そしてrep転写開始部位がp5 TATAボッ
クスから約25bp下流（3'方向）である場合には、「その天然の位置に」あり、そ
のためrep ATGはp5 TATAボックスから約60bp下流（3'方向）である。wt AAV p5
プロモーターは、上流（5'方向）に広がり、バックグランドより上の検出可能な
レベルで長い形態のRepの転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレ
メントを含む。
AAV p5プロモーターが、記載されている特定の核酸分子においてrepコード配
列に対してその天然の位置から移動している場合、AAV p5プロモーター領域は「
その天然の位置以外」に位置する。例えば、AAV p5プロモーターTATAボックスが
同じ分子においてrep転写開始部位の25bp上流（5'方向）でないように、AAV p5
プロモーター領域が核酸分子に位置する場合、AAV p5プロモーター領域は「その
天然の位置以外に位置する」。
「AAV repコード領域」とは、ウイルスゲノムを複製するためにひとまとめに
して必要とされるウイルスの複製タンパク質をコードする、当該分野で認識され
る、AAVゲノムの領域、またはその機能的ホモログ（例えばAAV-2 DNA複製を媒介
することも知られているヒトヘルペスウイルス６（HHV-6）rep遺伝子（Thomson
ら（1994）Virology 204:304-311））を意味する。従って、repコード領域は、A
AV Rep 78、Rep 68、Rep 52、およびRep 40をコードする遺伝子、またはその機
能的ホモログを少なくとも包含する。本明細書中で使用される場合、repコード
領域は、AAV p5プロモーター領域を含まない。AAV repコード領域のさらなる記
載については、例えば、Muzyczka，N．(1992)Current Topics in Microbiol．an
d Immunol．158:97-129；およびKotin，R.M．(1994)Human Gene Therapy 5:793-
801を参照のこと。repコード領域は、上記のAAV血清型のような任意の血清型に
由来し得る。この領域は野生型遺伝子のすべてを含む必要はないが、AAVベクタ
ーとともに宿主細胞に存在する場合に、rep遺伝子の存在が十分な複製機能を提
供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され
得る。
用語「短い形態のRep」とは、AAV repコード領域のRep 52およびRep 40の遺伝
子産物をいい、その機能的ホモログを含む。短い形態のRepは、記載および特徴
づけられているAAV p19プロモーターの指示下で発現される。例えば、Lusbyら、
Laughlinら、Greenら(1980a)、およびGreenら(1980b)、上記を参照のこと。
用語「長い形態のRep」とは、AAV repコード領域のRep 78およびRep 68の遺伝
子産物をいい、その機能的ホモログを含む。長い形態のRepは、普通は、記載お
よび特徴づけられているAAV p5プロモーターの指示下で発現される。Lusbyら、L
aughlinら、Greenら(1980a)、およびGreenら(1980b)、上記を参照のこと。
「AAV capコード領域」とは、ウイルスゲノムをパッケージングするためにひ
とまとめにして必要とされる、ウイルスのコートタンパク質をコードする、AAV
ゲノムの当該分野で認識される領域を意味する。従って、capコード領域は、コ
ートタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードする遺伝子を少なくとも包含する
。capコード領域のさらなる記載については、例えば、Muzyczka，N．(1992)Curr
ent Topics in Microbiol．and Immunol．158:97-129；およびKotin，R.M．（19
94）Human Gene Therapy 5:793-801を参照のこと。本明細書中で使用される場合
、AAV capコード領域は、上記のように、任意のAAV血清型に由来し得る。この領
域は野生型cap遺伝子のすべてを含む必要はないが、AAVベクターとともに宿主細
胞中に存在する場合に遺伝子が十分なパッケージング機能を提供する限り、例え
ば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。
「AAVコード領域」とは、AAV repおよびcapコード領域に対応する２つの主なA
AVオープンリーディングフレームを含む核酸分子（例えば、野生型AAVゲノムの
塩基対310〜4,440に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む核酸分子）を意味す
る。例えば、Srivastavaら（1983）J．Virol．45:555-564；Hermonatら（1984）
J．Virol．51:329-339；およびTratschinら（1984）J．Virol．51:611-619を参
照のこと。従って、本発明の目的のためには、「AAVコード領域」は、AAV p5プ
ロモーター領域に対応する配列を含まず、そしてAAV ITRを含まない。
「フリップ組換え標的（Flip Recombination Target）部位」（FRT）とは、部
位特異的酵母フリップリコンビナーゼ系において基質として作用するヌクレオチ
ド配列をいう。FRT組換え領域は、2-μm環（Saccharomyces cerevisiae中に通常
存在するプラスミド）の599-bp長逆方向反復配列内の約65塩基対（bp）のセグメ
ントにマップされている。組換えを担う酵素（FLP）は2-μm環によってコードさ
れ、そしてヒト細胞において高レベルで発現されている。FLPは、分子の逆方向
反復配列内の組換えを触媒して分子内逆位を引き起こす。FLPはまた、2-μm環反
復配列を含むプラスミド間の効率的な組換えを、非常に高い効率および特異性で
促進し得る。例えば、Jayaram（1985）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:5875-58
79；およびO'Gorman（1991）Science 251:1351-1355を参照のこと。「最小FRT部
位」（例えば、最小FLP基質）は、当該分野で記載されており、そして本明細書
中では、65-bp FRT領域内に位置する13-bpの二回対称＋8-bpのコアとして定義さ
れる。Jayaramら，上記。FRT部位およびFLP発現プラスミドは両方とも、Stratag
ene(San，Diego，CA)から市販されている。
「トランスフェクション」とは、細胞による外来DNAの取り込みをいい、そし
て外因性DNAが細胞膜の内側に導入されている場合に、細胞は「トランスフェク
ト」されている。このように、外因性DNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNA
に組み込まれる（共有結合する）ようになってもならなくてもよい。多くのトラ
ンスフェクション技法が当該分野で公知である。例えば、Grahamら（1973）Viro
logy，52:456、Sambrookら（1989）Molecular Cloning，a Iaboratory manual，
Cold Spring Harbor Laboratories，New York、Davisら（1986）Basic Methods
in Molecular Biology，Elsevier、およびChuら（1981）Gene 13:197を参照のこ
と。これらの技法のいずれかを使用して、適切な宿主細胞内に１つ以上の外因性
DNA部分（例えば、AAVヘルパー構築物、AAVベクタープラスミド、および他のベ
クター構築物）を導入し得る。一般的に、外因性DNAは、細胞の転写機構および
複製機構に曝されるために、レシピエント細胞の原形質膜を横断しなければなら
ない。得られる細胞は、外因性核酸分子で一過性にトランスフェクトされ得るか
、または安定にトランスフェクトされ得る−−ここで、核酸分子は、宿主細胞ゲ
ノムに共有結合されるか、または子孫細胞に伝えられ得る（例えば、十分な割合
で染色体外複製が可能である）エピソーム性ユニットとして維持および複製され
得る。このようなトランスフェクション方法は当該分野で記載されており、これ
らは、リン酸カルシウム共沈殿（Grahamら（1973）Virol．52:456-467）、培養
した細胞中への直接マイクロインジェクション（Capecchi，M.R．(1980)Cell 22
:479-488）、エレクトロポレーション（Shigekawaら（1988）BioTechniques 6:7
4
2-751）、リポソーム媒介遺伝子移入（Manninoら(1988)BioTechniques 6:682-69
0）、脂質媒介トランスフェクション（Felgnerら（1987）Proc．Natl．Acad．Sc
i．USA 84:7413-7417）、および高速度マイクロプロジェクタイルを使用する核
酸送達（Kleinら（1987）Nature 327:70-73）を包含する。
「一過性トランスフェクション」とは、トランスフェクトされた細胞のゲノム
内に外因性DNAが組み込まれない場合、例えば、エピソームDNAがmRNAに転写され
そしてタンパク質に翻訳される場合をいう。
核酸構築物が細胞膜の内側に導入され、そしてAAVコード領域が娘細胞によっ
て受け継がれ得る場合、細胞は、AAVコード領域を含む核酸構築物で「安定にト
ランスフェクト」されている。
用語「宿主細胞」とは、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動
物細胞を示し、AAVヘルパー構築物、AAVベクタープラスミド、または他の移入DN
Aのレシピエントとして使用され得、または使用されており、そしてトランスフ
ェクトされている元の細胞の子孫を含む。従って、本明細書中で使用される場合
、「宿主細胞」とは、一般的に、上記のような方法を使用して外因性DNA配列で
トランスフェクトされている細胞をいう。単一の親細胞の子孫が、自然変異、偶
発的変異、または意図的変異によって、元の親と形態においてまたはゲノムDNA
相補物もしくは全DNA相補物において必ずしも完全に同一でないかもしれないこ
とが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「細胞株」とは、インビトロで連続的または
延長した増殖および分裂が可能である細胞の集団をいう。しばしば、細胞株は、
単一の始原細胞に由来するクローン集団である。自然変化または誘導された変化
が、このようなクローン集団の保存または移入の間に核型に生じ得ることは、当
該分野でさらに知られている。従って、言及される細胞株に由来する細胞は、先
祖細胞または先祖培養物と正確に同一でないかもしれず、そして言及される細胞
株はこのような変異体を含む。
「パッケージング細胞」とは、異種ヌクレオチド配列での安定的または一過性
のトランスフェクションによって、AAVヘルパー構築物を含む核酸分子を有する
宿主細胞をいい、ここで、この構築物は、増殖性AAV複製がtransで提供され得る
AAVヘルパー機能の一過性発現を提供し得る。AAVヘルパー機能の発現は、構成的
または例えば、ヘルパー機能が誘導性プロモーターの制御下である場合、誘導性
のいずれかであり得る。
「プロデューサー細胞」とは、AAVヘルパー機能での細胞のトランスフェクシ
ョンの前に、その次に、または同時にのいずれかで、AAVベクターで安定にまた
は一過性にトランスフェクトされているパッケージング細胞をいう。このように
、プロデューサー細胞は、cisで複製およびパッケージングのために提供されるA
AV配列（例えば、機能的ITR配列）、ならびにAAVベクターから欠落しているヘル
パー機能をコードしそしてtransで複製およびパッケージングのために提供され
るAAV配列を含む。従って、必須のウイルスヘルパー機能の存在下、プロデュー
サー細胞は、次の遺伝子送達のための感染性ウイルス粒子に、トランスフェクト
したウイルスDNA（例えば、目的の組換えヌクレオチド配列を含むAAVウイルスベ
クター）をパッケージングするために必要であるAAVポリペプチドをコードし得
る。
上で定義されるように、ウイルスヘルパー機能は、アデノウイルス、ヘルペス
ウイルス、またはワクシニアウイルスのような１つ以上のヘルパーウイルス部分
と一緒のその感染または重感染によって、プロデューサー細胞に導入され得る。
用語「異種」は、コード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、
通常ともに連結されていない、および／または通常特定の細胞と結合していない
配列を示す。従って、核酸構築物の「異種」領域は、天然では他の分子に関して
見出されない別の核酸分子の内の、またはこれに結合した核酸のセグメントであ
る。例えば、構築物の異種領域は、天然ではコード配列に関して見出されない配
列に隣接したコード配列を含み得た。異種コード配列の別の例は、コード配列自
体が天然で見出されない場合の構築物である（例えば、本来の遺伝子とは異なる
コドンを有する合成配列）。同様に、細胞内に通常は存在しない構築物で形質転
換した宿主細胞は、本発明の目的のために異種であると考えられる。対立遺伝子
変異または天然に存在する変異事象は、本明細書で使用される場合、異種DNAを
生じない。
「コード配列」または特定のポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調
節配列の制御下におかれる場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転
写され（DNAの場合）そして翻訳される（mRNAの場合）核酸配列である。コード
配列の境界は、5'（アミノ）末端での開始コドンおよび3'（カルボキシ）末端で
の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物または真核生物
のmRNAからのcDNA、原核生物または真核生物のDNAからのゲノムDNA配列、および
さらに合成DNA配列を包含し得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、
通常コード配列の3'側に位置する。
用語DNA「制御配列」とは、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転
写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「IRES」
）、エンハンサーなどを集合的にいい、これはレシピエント細胞においてコード
配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。選択された遺伝子が適切な
レシピエント細胞において複製、転写、および翻訳され得る限り、これらの制御
配列のすべてが必ずしも存在する必要はない。
「作動可能に連結された」とは、エレメントの配置をいい、ここでこのように
記載された成分はそれらの通常の機能を実行するように配置される。従って、コ
ード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現をもたらし得る
。制御配列は、その発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接する
必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロ
モーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、
依然として、コード配列に「作動可能に連結された」と考えられ得る。
ヌクレオチド配列についていう場合、「単離された」とは、指示された分子が
、同じタイプの他の生物学的巨大分子の実質的な不在下で存在することを意味す
る。従って、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」は、対象
のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう
；しかし、この分子は、組成物の基本的特徴に有害な影響を与えないいくつかの
追加の塩基または部分を含み得る。
本出願の全体を通して特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対位置を
記載する目的で、例えば、特定のヌクレオチド配列が別の配列に関して「上流」
、「下流」、「3'」、または「5'」に配置されると記載される場合、これは、当
該分野において慣習的にそのようにいわれる、DNA分子の「センス」鎖または「
コ
ード」鎖における配列の位置であると理解される。
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド間、または２つのポリペプチド部分
間の同一性のパーセントをいう。１つの部分の配列と別の部分の配列との間の対
応は、当該分野で公知の技法によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情
報を整列させること、および容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用す
ることによる、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定さ
れ得る。あるいは、相同性は、相同領域間に安定な二重鎖を形成する条件下での
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の１または複数の一本鎖特
異的ヌクレアーゼでの消化、および消化したフラグメントのサイズ決定によって
決定され得る。上記の方法を使用して決定したときに、少なくとも約80％、好ま
しくは少なくとも約90％、および最も好ましくは少なくとも約95％のヌクレオチ
ドまたはアミノ酸が、規定の長さの分子にわたってマッチする場合、２つのDNA
または２つのポリペプチド配列は互いに「実質的に相同」である。
所定のポリペプチドの「機能的ホモログ」または「機能的等価物」は、本来の
ポリペプチド配列に由来する分子、ならびに、所望の結果を達成するように参照
分子と同様の様式で機能する、組換えにより産生されたか、または化学的に合成
されたポリペプチドを包含する。従って、AAV Rep 52またはRep 40の機能的ホモ
ログは、これらのポリペプチドの誘導体およびアナログを包含する（これらには
、複製活性が残存する限り、その内部またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端
で生じる、任意の単一または複数のアミノ酸の付加、置換、および／または欠失
が含まれる）。
所定のAAVプロモーター領域の「機能的ホモログ」または「機能的等価物」は
、AAV血清型に由来するプロモーター、ならびに、所望の結果を達成するように
参照プロモーター領域と同様の様式で機能する、組換えにより産生されたかまた
は化学的に合成されたポリヌクレオチドを包含する。従って、AAV p5プロモータ
ー領域の機能的ホモログは、このような制御配列の誘導体およびアナログを包含
する（これらには、プロモーターホモログがバックグランドより上に検出可能な
レベルで長い形態のRepの転写を開始するために十分な最小数の塩基またはエレ
メントを保持する限り、プロモーター領域内で生じる任意の単一または複数のヌ
ク
レオチド塩基の付加、置換、および／または欠失が含まれる）。Ｂ．一般的方法
本発明の主な目的は、続いて遺伝子移入方法に使用され得る組換えAAV（rAAV
）ビリオンの産生に有用な改良されたAAVヘルパー系を提供することである。特
に、本発明の目的は、市販で有用なレベルの組換えAAVビリオンの増強された産
生を提供するために適切なパッケージング細胞に導入され得るAAVヘルパー構築
物を開発することである。
１つの特定の実施態様では、AAV repおよびcapコード領域ならびにAAV p5プロ
モーター領域を有する核酸分子が提供され、このプロモーター領域は、野生型（
wt）AAVゲノム中のAAV repコード領域に対してその正常な位置以外の部位で本発
明の分子に置かれる。repおよびcapコード領域は、２つの隣接する主要なオープ
ンリーディングフレームとして分子中に配置され得、wt AAVゲノム中のそのコー
ド領域の正常配置のような5'から3'方向での所定の順にそれぞれ配置され得る。
例えば、BernsおよびBohenzky（1987）Advances in Virus Research（Academic
Press，Inc.）32:243-307；Tratschinら（1984）J．Virol．51:611-619；および
Srivastavaら（1983）J．Virol．45:555-564を参照のこと。
あるいは、repおよびcapコード領域は、ヌクレオチドに介在することによって
分離される２つの隣接しない領域として核酸分子中に配置され得、そしてrepコ
ード領域がrep52/40の発現を指示し得る少なくとも１つのプロモーター（例えば
、AAV p19プロモーター領域に実質的に相同なヌクレオチド配列）を含む限り、
任意の順で配置され得、そしてcapコード領域は、Cap発現産物の発現を指示し得
る少なくとも１つのプロモーターを含む（例えば、AAV p40プロモーター領域に
実質的に相同なヌクレオチド配列）。
本発明の分子は、AAV repおよびcapコード領域に対応するヌクレオチド配列（
Srivastavaら、前出）をAAV p5プロモーター領域に実質的に相同であるかまたは
wt AAVゲノムのbp 145〜309に対応するヌクレオチド配列（図４、(配列番号４)
）と連結することによって構築され得る−−ここでp5プロモーター領域は、rep
コード領域に対してその正常な位置以外の任意の位置で分子中に配置される。
１つの特定の分子では、AAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド配列は、wt
AAVゲノムのbp 145〜494に実質的に相同である（図４、(配列番号４)）。他の
分子では、AAV p5プロモーター領域に相同であるヌクレオチド配列は、repおよ
びcapコード領域の両方の下流に配置され、capコード領域の3'末端に実質的に隣
接する。3'末端に実質的に隣接することは、本発明のヌクレオチド配列が、cap
コード領域の3'末端の約０〜500ヌクレオチド以内、より好ましくは約０〜200ヌ
クレオチド以内、および最も好ましくは約０〜50ヌクレオチド以内であることを
意味する。
さらに他の実施態様では、AAV p5プロモーター領域は、repおよびcapコード領
域の両方の下流に配置され、そして最小の長さ（1）を有する介在ヌクレオチド
配列（X）によってそれから分離され、これによって、得られるAAV rep-cap-X-p
5フラグメントは、このフラグメントとAAVベクター（ITRの獲得を生じる）との
間の組換え事象（組換えAAVビリオン産生中の）が、大きすぎてAAVビリオンとし
てパッケージしない組換えた分子を得るようにサイズ分類される。約5100bpフラ
グメントが、このような粒子にパッケージされ得る遺伝物質の上限を示すことが
一般的に認識される（例えば、Lebkowskiへの米国特許第5,173,414号を参照のこ
と。このように、野生型AAV粒子が混入する可能性のある産生は減少または除去
される。１つの特定の分子では、介在ヌクレオチド配列（X）は少なくとも500塩
基対を含む。
上記の核酸分子は、単離され、そしてAAVヘルパー構築物を提供するためのプ
ラスミドまたはウイルス粒子のような適切なベクターにクローニングされ得、こ
こで、ベクターは、AAVコード配列の複製および発現に適切な制御エレメントを
さらに含み得、そして細胞間の核酸の移入を容易にし得る。
本発明のさらなる実施態様では、上記核酸分子は、酵母FLPリコンビナーゼ基
質に実質的に相同な１つ以上のヌクレオチド配列を含み得る（例えば、Flip Rec
ombination Target(FRT)部位）。Jayaram（1985）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82
:5875-5879；およびO'Gorman（1991）Science 251:1351-1355。従って、上記
の核酸分子は、FRT部位（または少なくとも最小のFRT部位）に相同な第２のヌク
レオチド配列を含み得、ここで第２のヌクレオチド配列は、FRT部位がAAVコード
領域およびAAV p5プロモーター領域の上流に位置するように分子中に配置される
。好ましい実施態様では、5'〜3'方向に、FRT部位（Jayaram、およびO'Gorman、
前出）、AAV repコード領域、AAV capコード領域、およびAAV p5プロモーター領
域を含む分子が提供される。なおさらなる実施態様では、AAVp5プロモーター領
域を含むヌクレオチド配列がwt AAVゲノムのbp 145〜494に実質的に相同である
分子が提供される（図４、(配列番号４)）。この第１のヌクレオチド配列はまた
、FRT部位を含む挿入されたポリヌクレオチドを有する。より特定すると、ポリ
ヌクレオチド挿入物（FRT部位を含む）は、第１の配列のbp 310と311との間に配
置されており、そのため、挿入されたFRT部位は、AAVp5プロモーター領域（bp 1
45〜310の範囲にわたる）の3'末端にすぐ隣に位置する。次いで、得られた構築
物は、上記のように、repコード領域に対してその正常位置以外の任意の位置にA
AV p5プロモーター領域を置くように核酸分子中に配置される。上記の分子のす
べては、当該分野で公知の組換え技法を使用して構築され得る。
関連の実施態様では、上記の核酸分子は、FRT部位に相同な多数のポリヌクレ
オチドを含むように構築される。より特定すると、２つのFRT部位は、AAVコード
領域およびAAV p5プロモーター領域に隣接する、5'および3'に隣接する領域を提
供するように分子中に配置され得る。このように、核酸分子は、FRT部位に隣接
するカセット（AAV repコード領域、AAV capコード領域、およびAAV p5プロモー
ター領域を有する）を含む。好ましい実施態様では、核酸分子は、5'〜3'方向に
所定の順で、FRT部位、AAV rep、AAV cap、AAV p5プロモーター領域、およびFRT
部位を含むように配置される。上記の分子は、集められ、単離され、そして公知
の技法を使用する適切なベクター中にクローニングされ得る。FRT-rep-cap-p5-F
RTカセットは、所望ならば、酵母FLPリコンビナーゼ酵素の作用によって、容易
にベクターに挿入されかまたはベクターから切り出され得る。
なおさらなる関連する実施態様では、AAV repおよびcapコード領域、AAV p5プ
ロモーター領域を含むヌクレオチド配列、および複数のFRT部位を有する分子が
提供される。この特定の分子では、AAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド
配列は、wt AAVゲノムのbp 145〜494に実質的に相同である（図４、(配列番号４
)）。この第１のヌクレオチド配列内に、FRT部位を含むポリヌクレオチドが挿
入されている。より特定すると、ポリヌクレオチド挿入物（FRT部位を含む）は
、挿入されたFRT部位がAAV p5プロモーター領域（bp 145〜310の範囲にわたる）
の3'末端にすぐ隣りに位置するように、第１の配列のbp 310と311との間に配置
されている。次いで、核酸分子は、5'から3'方向に所定の順で、FRT部位、AAV r
ep、AAV cap、およびAAV p5プロモーター領域を含みそしてAAV p5プロモーター
領域の3'のすぐ隣に位置するFRT部位を有するヌクレオチド配列を含むように配
置される。
さらに、上記核酸分子を含むベクターは、適切な宿主に容易に導入され、そし
てそこで発現して機能しているrepおよび／またはcapコード領域を欠くAAVベク
ターにおいてなくなったAAV機能を補足する。AAVベクター中のrepおよびcap領域
は、遺伝物質の欠失、リーディングフレームエラーを引き起こす遺伝物質の挿入
、ならびにこれらの遺伝子によって供給される複製およびカプシド化機能を分裂
させる点変異によって、弱められ得る。AAVベクター系は、適切な宿主（例えば
、アデノウイルス感染した細胞）にベクターをトランスフェクトすること、およ
び複製しているベクターゲノムの存在について、例えば48時間後に、細胞抽出物
をアッセイすることによって、機能しているrepコード領域についてスクリーニ
ングされ得る。repコード領域が機能的であるならば、複製しているDNAは、当該
分野で公知の技法を使用してサザンブロット分析によって明らかにされ得る。AA
Vベクター系は、当該分野で公知のウエスタンブロット技法を使用してAAV粒子産
生についてアッセイすることによって、機能しているcapコード領域についてス
クリーニングされ得る（Samulskiら（1989）J．Virol．63:3822-3828）。
本発明の核酸分子は、従来の組換え技法を使用して構築され得る。これに関し
て、AAV repおよびcapコード領域を置き換えたAAV p5プロモーター領域とともに
含む核酸分子は、AAV repコード領域に対して適切な部位に本発明のプロモータ
ー領域を含む制限フラグメントを連結することにより、AAV p5プロモーター領域
を含むヌクレオチド配列を、AAVコード領域（repおよびcapコード領域を含む）
を有する構築物に挿入することによって、容易に構築され得る。次いで、新しく
形成された核酸分子は、所望であれば、制限酵素を使用して構築物から切り出さ
れ得る。従って、本発明のこれらおよび他の分子は、当該分野で周知の技法を使
用して本明細書で提供され得る。例えば、米国特許第5,173,414号および第5,139
,941号；国際公開番号WO 92/01070（1992年1月23日公開）およびWO 93/03769（1
993年3月4日公開）；Lebkowskiら（1988）Molc．Cell．Biol．8:3988-3996；Vin
centら（1990）Vaccines 90（Coled Spring Harbor Laboratory Press）；Carte
r，B.J．(1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka，N．(
1992)Current Topics in Microbiol．and Immunol．158:97-129；Kotin，R.M．(
1994)Human Gene Therapy 5:793-801；ShellingおよびSmith（1994）Gene Thera
py 1:165-169；およびZhouら（1994）J．Exp．Med．179:1867-1875を参照のこと
。
より特定すると、repおよびcap遺伝子を含む選択されたAAVコード領域、およ
びAAV p5プロモーター領域を含むもののような選択されたヌクレオチド配列は、
ウイルスゲノムからまたは同じものを含むAAVベクターから切り出され得、そし
てSambrookら、前出に記載されるような標準的連結技法を使用して、p5プロモー
タ領域がrepおよび／またはcapコード領域の3'であるように連結され得る。これ
らの分子は、その5'、または5'および3'末端に配置された隣接するFRT配列を有
するようにさらに構築され得る。連結は、20 mM Tris-Cl(pH 7.5)、10mM MgCl2
、10 mM DTT、33 μg/ml BSA、10 mM-50 mM NaCl、および、０℃にて40 μM ATP
、0.01-0.02（Weiss）ユニット T4 DNA リガーゼ（「付着末端」連結）または14
℃にて1 mM ATP、0.3-0.6（weiss）ユニット T4 DNA リガーゼ（「平滑末端」連
結）のいずれかで完了され得る。分子間「付着末端」連結は、通常、30〜100μg
/mlの全DNA濃度（５〜100 nMの全末端濃度）で実行される。
あるいは、本発明の核酸分子は、固相直接オリゴヌクレオチド合成化学と当該
分野で従来の酵素的連結方法との組み合わせを使用して、合成によって誘導され
得る。制限酵素部位のような特徴を有する合成配列が構築され得、そしてApplie
d Biosystems Inc．(Foster City，CA)から入手可能なデバイスのような市販の
利用可能なオリゴヌクレオチド合成デバイスで、ホスホルアミダイト法を使用し
て調製され得る。例えば、Beaucageら（1981）Tetrahedron Lett．22:1859-1862
を参照のこと。AAV repおよびcapコード配列、AAV p5、p19およびp40プロモータ
ー領域、ならびにFRT部位のヌクレオチド配列は公知であり、そして既に記載さ
れている。（AAV配列については、例えば、Srivastavaら（1983）J．Virol．45:
555-564；Kotin，R.M．(1994)Human Gene Therapy 5:793-801；Berns，K.I．「パ
ルボウイルス科およびその複製」Fundamental Virology，第2版，(B.N．Fields a
nd D.M．Knipe編)を参照のこと；および、FRT配列については、例えば、Jayaram
ら（1985）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:5875-5879およびO'Gorman（1991）S
cience 251:1351-1355を参照のこと）。哺乳動物細胞における合成分子の発現に
好ましいコドンもまた合成され得る。次いで、完全な核酸分子が、上記の方法に
よって調製された重複オリゴヌクレオチドから組み立てられる。例えば、Edge，
Nature（1981）292:756；Nambairら、Scince（1984）223:1299；Jayら J．Biol
．Chem．(1984)259:6311を参照のこと。
本発明のさらなる目的は、本発明の核酸分子を含むレプリコンを一般的に含む
AAVヘルパー構築物を提供することである。従って、この構築物はAAVヘルパー機
能をコードし得る。本明細書では、レプリコンは、DNA合成中に複製の１単位と
して作用する任意の長さのDNAとして定義される。１つの実施態様では、AAVヘル
パー構築物は、宿主ゲノムの独立した自己複製ができるエピソームの形態で提供
され、そしてこれは宿主染色体への組込みをさらに可能にし得る。１つの特定の
好ましい実施態様では、構築物はプラスミドである。種々の他の実施態様では、
AAVヘルパー機能（例えば、repおよびcapコード領域）は、その転写および翻訳
を指示する制御配列に作動可能に連結される。
本発明の１つの特定の局面では、AAVヘルパー構築物は、宿主細胞で安定な維
持ができる染色体外レプリコン（例えば、エピソームまたはプラスミド）として
維持され得る発現カセットを提供するように組み立てられる。構築物は、複製し
ている宿主で実質的に安定に維持されることを可能にする適切な複製系を有する
。
AAVヘルパー構築物は、上記のように、wt AAVゲノム中のrepコード領域に対し
てその正常位置以外の部位にあるように本発明の構築物に配置されるAAV p5プロ
モーター領域を有するAAV repおよびcapコード領域、制御配列、および任意の増
幅配列を含み、これはまた、選択マーカーを含み得る。適切なマーカーには、核
酸構築物でトランスフェクトされている細胞が適切な選択培地中で増殖される場
合、抗生物質耐性もしくは感受性を与え、または色を与え、または抗原特徴を変
化させる遺伝子が含まれる。本発明の実施に有用な特定の選択マーカー遺伝子は
、
G418（Sigma，St．Louis，MOから入手可能）に耐性を与えることによって哺乳動
物細胞での選択を可能にするハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシド
ホスホトランスフェラーゼ（APH）をコードする）を含む。他の適切なマーカー
は当業者に公知である。
本発明のなおさらなる目的は、AAVベクターが細胞に存在し、そしてパッケー
ジング細胞がウイルスヘルパー機能を発現し得る場合、rAAVビリオンを産生し得
るAAVパッケージング細胞を提供することである。１つの特定の実施態様では、A
AVパッケージング細胞は、（ウイルスヘルパー機能の規定では）ヘルパーウイル
スによる感染を受け得る哺乳動物細胞に由来し得る。これに関して、細胞に適合
するヘルパーウイルスが存在する限り、ほとんどの全ての哺乳動物細胞はAAVを
受けそしてAAVビリオンを産生し得る。従って、rAAVビリオンを産生するために
使用されるパッケージング細胞は、入手可能性、増殖特徴などのような便宜上大
きく指示された選択の問題である。適切なパッケージング細胞には、特に、ヒト
および非ヒト霊長類種、齧歯類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、およびイヌ
などの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、便宜のために、ヒ
ト293、HeLa、KB、およびJW-2細胞のようなヒト細胞株が好ましい。これらの細
胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から容易に入手可能で
ある（例えば、ヒト293細胞は、受託番号ATCC CRL1573で入手可能である）。
１つの特定の実施態様では、AAVパッケージング細胞は、AAVヘルパー機能を発
現し得るAAVヘルパー構築物で細胞をトランスフェクトすることによって、適切
な宿主細胞（例えば、ヒト293細胞）から形成される。本発明のAAVヘルパー構築
物は、AAV repおよびcapコード領域およびAAV p5プロモーター領域を含むヌクレ
オチド配列を有する核酸分子を含み、ここでヌクレオチド配列は、上記のような
wt AAVゲノムにおけるrepコード領域に対してその正常な位置以外の部位にp5プ
ロモーターを置くように分子中に配置される。ヘルパー構築物は、関連するAAV
ベクターにおいて欠けているAAV機能を補足するために宿主細胞で有効に転写お
よび翻訳され得る。
他の特定の実施態様では、AAVパッケージング細胞は、AAV RepおよびCapポリ
ペプチドを発現し得るAAVヘルパー構築物でのトランスフェクションによって適
切な宿主細胞（例えば、ヒト293細胞）から形成される。トランスフェクトしたA
AVヘルパー構築物は、AAVコード領域を有する核酸分子およびAAV p5プロモータ
ー領域を含むヌクレオチド配列を含み、このAAVコード領域およびこのAAV p5プ
ロモーター領域はそれぞれ分子中の5'から3'へ配置されそして介在ヌクレオチド
配列によって互いに分離される。本発明の構築物は、関連するAAVベクターにお
いて欠けているAAV機能を補足するために宿主細胞で有効に転写および翻訳され
得る。さらに、介在ヌクレオチド配列は、得られるAAV rep-cap...p5フラグメン
トをrAAVビリオン産生中の組換え事象においてAAVビリオン粒子としてパッケー
ジされないほど大きくする十分な長さを有するように選択され得る。このように
、パッケージング細胞系において混入するwt AAV粒子の顕著なレベルの産生が避
けられる。関連の実施態様では、AAVヘルパー構築物はプラスミドを含む。
本発明のそれぞれのAAVヘルパー構築物は、エピソームエレメントとしてパッ
ケージング細胞に安定に維持され得るか、またはパッケージング細胞ゲノムに組
み込まれ得、そのため無限に維持され得るパッケージング細胞株を生成する。あ
るいは、AAVヘルパー構築物は、適切なウイルスヘルパー機能の導入の直前、ま
たはその次に、または同時にのいずれかで、パッケージング細胞にトランスフェ
クトされ得る。
本発明の目的はまた、ウイルスヘルパー機能がそこで発現される場合にrAAVビ
リオンを産生し得るAAVプロデューサー細胞を提供することである。１つの特定
の実施態様では、プロデューサー細胞は、機能的AAV ITR間にはさまれる異種ヌ
クレオチド配列を有するAAVベクター（例えば、プラスミド）で上記のAAVパッケ
ージング細胞の１つを一過性または安定にのいずれかでトランスフェクトするこ
とによって形成される。
本発明のなおさらなる目的は、rAAVビリオンの産生のための方法を提供するこ
とであり、ここで、この方法は、一般的に、以下の工程を包含する：(1)機能的A
AV ITR間にはさまれる形質導入される異種ヌクレオチド配列を有するAAVベクタ
ーを宿主細胞に導入する工程；(2)上記のように組み立てられたAAVヘルパー構築
物をこの宿主細胞に導入する工程(ここで、この構築物はAAVベクターを欠いてい
るAAVヘルパー機能を発現し得る)；(3)この宿主細胞でウイルスヘルパー機能を
発現する工程；および(4)この細胞を培養してrAAVビリオンを産生する工程。
１つの実施態様では、 rAAVビリオンを産生する方法が提供され、ここで上記
のように構築されたAAVパッケージング細胞は、AAV ITR間にはさまれる目的の異
種ヌクレオチド配列を含むAAVベクターでトランスフェクトされる。AAVパッケー
ジング細胞は、（上記のようなプロデューサー細胞を提供するために）本発明の
AAVベクターで一過性または安定にのいずれかでトランスフェクトされ得る。
１つの好ましい実施態様では、上記の方法に使用されるAAVパッケージング細
胞は、AAV RepおよびCapポリペプチドを提供するように発現され得るAAVヘルパ
ー構築物で適切な宿主細胞をトランスフェクトすることによって産生される。本
発明のAAVヘルパー構築物は、AAV repおよびcapコード領域ならびにAAV p5プロ
モーター領域を含むヌクレオチド配列を有する核酸分子を含み、ここでこの分子
のエレメントは、上記のようなwt AAVゲノムにおけるrepコード領域に対してそ
の正常な位置以外の部位にp5プロモーターを置くように配置される。AAVヘルパ
ー構築物は、当業者に公知の方法を使用して、適切なAAVベクターで宿主細胞に
同時トランスフェクトされ得る。さらなる関連の実施態様では、AAVヘルパー構
築物は、上記のように１つ以上の隣接するFRT部位を含み得る。
他の好ましい実施態様では、AAVパッケージング細胞は、rAAVベクター産生中
の顕著なレベルの野生型AAVの産生を減少または除去するように設計されたAAVヘ
ルパー構築物で適切な細胞をトランスフェクトすることによって産生される。ヘ
ルパー構築物には、AAV repおよびcapコード領域、介在ヌクレオチド配列、およ
びAAV p5プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を有する核酸分子が含まれる
。この分子のエレメントは、AAV p5領域が、repおよびcapコード領域の両方から
の下流に位置し、そして介在ヌクレオチド配列(X)によってそれから分離される
ように配置される。ヌクレオチド配列(X)は、得られるAAV rep-cap-X-p5フラグ
メントが、このフラグメントとAAVベクターとの間の（ITRの獲得を生じる）組換
え事象（組換えAAVビリオン産生の間の）がAAVビリオンとしてパッケージするに
は大きすぎる組換えた分子を生じることを確実にするのに有効な、最小の長さを
有するように選択される。このように、wt AAV粒子産生の可能性が減少または除
去される。
本発明の実施において、rAAVビリオンの増強された力価は、上記のパッケージ
ング細胞を用いる方法を使用して得られ得る。いずれの特定の理論によっても結
びつけられることなく、このような細胞での増強されたビリオン産生は、一部は
、これらの細胞でのRep毒性の減弱によると考えられる。これに関して、repコー
ド領域に対してその正常位置以外の部位でのp5プロモーター領域の置換は、rep
コード領域が発現される場合、Rep 78およびRep 68の両方の産生（p5プロモータ
ーから正常に転写された長い形態のRep発現産物）を減弱するために作用し得る
。いくつかの長い形態のRep産物が本発明のAAVヘルパー構築物から発現されると
いう事実を考慮すると、再度位置づけしたAAV p5プロモーター領域は、その新し
い位置によってエフェクター機能に作用する。
上記の方法のそれぞれにおいて、ウイルスヘルパー機能は、当業者に公知であ
る方法を使用して宿主細胞で発現され得る。特に、ウイルスヘルパー機能は、関
連のないヘルパーウイルスでの宿主細胞の感染によって提供される。本発明の系
において使用されるヘルパーウイルスには、アデノウイルス；１型および２型単
純ヘルペスウイルスのようなヘルペスウイルス；およびワクシニアウイルスが含
まれる。非ウイルスヘルパーも、任意の公知の薬剤のいずれかを使用して、細胞
同調化のように本発明において使用される。例えば、Bullerら（1981）J．Virol
．40:241-247；McPhersonら（1985）Virology 147:217-222；Schlehoferら（198
6）Virology 152:110-117を参照のこと。宿主細胞の感染の結果として、ウイル
スヘルパー機能は、AAV RepおよびCapタンパク質を産生するためにAAVヘルパー
構築物をトランス活性化するように発現され得る。このように、Repタンパク質
は、組換えAAVベクターから（またはAAVベクターが組み込まれている場合には宿
主細胞ゲノムから）組換えDNA（異種ヌクレオチド配列を含む）を切り出すため
に作用する。Repタンパク質はまた、AAVゲノムを２倍にするために作用する。発
現したCapタンパク質はカプシド中に組み立てられ、そして組換えAAVゲノムはカ
プシド中にパッケージされる。従って、溶菌AAV複製が起こり、そして異種ヌク
レオチド配列は生存力のある形質導入ベクター中にパッケージされる。
宿主細胞でのウイルスヘルパー機能の発現およびAAV複製の後、rAAVビリオン
は、CsCl勾配のような種々の従来の精製方法を使用して宿主細胞から精製され得
る。さらに、感染がウイルスヘルパー機能を発現するために用いられるならば、
任意の残りのヘルパーウイルスは、公知の方法を使用して不活性化され得る。例
えば、AAVは非常に熱安定でありそしてアデノウイルスは熱不安定なので、アデ
ノウイルスは、例えば、20分以上、約60℃の温度まで加熱することによって不活
性化され得る。
目的の異種ヌクレオチド配列を含む得られるrAAVビリオンは、次いで、遺伝子
治療適用に、トランスジェニック動物の生産に、ワクチン接種、リボザイムおよ
びアンチセンス治療に、ならびにインビトロでの遺伝子送達におけるような、種
々の細胞タイプへの遺伝子送達のために使用され得る。Ｃ．実験
以下は、本発明を実行するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、
例示の目的でのみ提供され、そして本発明の範囲をいかなるようにも限定するこ
とを意図しない。
使用された数字（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にする努力が行
われたが、いくらかの実験誤差および偏差は、もちろん許容されるべきである。
実施例１
pAAVlacZ プラスミドの構築
lacZ遺伝子（pAAV-lacZ）を有するAAVベクターを以下のように構築した。XbaI
部位間の、pSub201のAAVコード領域（Samulskiら（1987）J．Virol．61:3096-31
01）を、EcoRIリンカーで置換して、プラスミドpAS203を得た。pCMVβ（CLONETE
CH）のEcoRIからHindIIIフラグメントを平滑末端にし、そしてpAS203のKlenow処
理したEcoRI部位にクローニングしてpAAVlacZを得た。
実施例２
pGN1909 ヘルパープラスミドの構築
AAVヘルパー構築物pGN1909は、AAV RepおよびCapポリペプチド産物を発現し得
、これは、AAV repおよびcapコード領域、ならびに２つのFRT部位間にはさまれ
る
下流のAAV p5プロモーターを含む、約4.8 Kbヌクレオチド長を含む。pGN1909プ
ラスミドを以下のように構築し得る。図１を参照すると、BgIII部位を、以前に
記載されたpAAV/Ad構築物（Samulskiら（1989）J．Virol．63:3822-3828）にお
けるrep78/68 ATGの12塩基5'側に導入して、pAAV/Ad-Bglというプラスミドを得
る。次いで、50 bpの最小FRT部位（Jayaram（1985）Proc．Natl．Acad．Sci．US
A 82:5875-5879；およびO'Gorman（1991）Science 251:1351-1355）をpAAV/Ad-B
glのBgIII部位に挿入し、そして得られるp5プロモーターのないFRT-rep-capフラ
グメントをpBSII k/s-（Stratagene，San Diego，CA）のポリリンカーにクロー
ニングしてpFRTRepCapというプラスミドを得る。
別々の工程において、以前に記載されたpIM29+45プラスミド（McCartyら（199
1）J．Virol．65:2936-2945）のSpeIおよびPstI部位によって定義されるフラグ
メントは、AAV p5プロモーターおよびrep遺伝子の5'末端の部分を含み、これをS
peIおよびPstI部位間のpBSII k/s-のポリリンカーにサブクローニングする。次
いで、FRT部位を、rep78/68 ATGの12 bp5'側に導入し、pGN1901というプラスミ
ドを得る。pGN1901のSpeI-PstIフラグメントを、pFRTRepCapプラスミドのXbaI部
位に挿入して、pGN1909プラスミド構築物を得る。pGN1909プラスミドのマップを
図２に示す。
同様の構築物を以下のように構築し得る。以下の５つのヌクレオチドフラグメ
ントを、5'から3'方向に所定の順で配置し、そしてNotIとPstI部位との間のpBSI
I k/s-のポリリンカーに連結する：(1)図３(配列番号２)に示す59 bp「最小」FR
T部位（JayaramおよびO'Gorman、前出）を含む第１のヌクレオチドフラグメント
；(2)AAV repおよびcapコード領域（wt AAVゲノムのbp 310〜4484に対応する、S
rivaStavaら（1983）J．Virol．45:555-564）を含む第２のヌクレオチドフラグ
メント；(3)wt AAVゲノムのbp 145〜310に対応するAAV p5プロモーター領域を含
む第３のヌクレオチドフラグメント（図４に示す、(配列番号４)）；(4)図３(配
列番号３)に示す76 bp FRT部位（JayaramおよびO'Gorman、前出）を含む第４の
ヌクレオチドフラグメント；および(5)wt AAVゲノムのbp 310〜494に対応するre
pコード領域の5'末端の184 bpセグメントを含む第５のヌクレオチドフラグメン
ト（図４に示す、(配列番号４)）。
５つのヌクレオチド配列を一緒に連結して、これらの２つの部分の連結を促進
するためにフラグメント２と３との間にはさまれる合成接合部を有する、単一の
連続した核酸分子を形成する。合成接合部のヌクレオチド配列は以下のとおりで
ある：5'-CTCTAGTGGATCT-3'［配列番号１］。このような接合部は、当該分野で
公知の任意の適切なリンカー部分であり得、そして本発明では単に、本発明のAA
Vヘルパー構築物の組み立てを促進するために使用される。
実施例３
pW1909 ヘルパープラスミドの構築
AAVヘルパープラスミドpW1909は、組換えAAVビリオン産生に必須のAAV Repお
よびCapポリペプチドを提供し得、これは、一般的に、1909 AAVヘルパー配列（
その下流に配置されたAAV p5プロモーターを有するAAV repおよびcapコード領域
）を含む。pW1909プラスミドを、pW1909adhLacZプラスミド（以下に記載）から
構築し、このプラスミドをSse8387で切断すること、6506 bpのSse8387I-Sse8387
1フラグメントを単離すること、および分子内連結によってフラグメントを再環
化することによって構築した。
pW1909adhLacZプラスミドを以下のように構築した。プラスミドpUC119（GeneB
ank Reference Name: U07649，GeneBank Accession Number: U07649）を、AflII
IおよびBspHIで部分的に消化し、klenow酵素で平滑末端に改変し、次いで細菌起
点およびamp遺伝子のみ（ポリリンカーおよびF1起点を除去した）を含む環状173
2 bpプラスミドを形成するように連結した。平滑化して連結したAflIIIおよびBs
pHI接合部は独特のNspI部位を形成する。1732 bpプラスミドをNspIで切断し、T4
ポリメラーゼで平滑末端改変し、そしてpUC119ポリリンカーから得られた20 bp
HinDIII-HinCIIフラグメント（klenow酵素で平滑末端改変した）を、プラスミド
の平滑化NspI部位に連結した。平滑化ポリリンカーからのHinDIII部位を再生し
、次いで、細菌の複製起点に隣接して配置する。次いで、得られるプラスミドを
、独特のPstI/Sse8387I部位で切断し、そしてSse8387I-PvuII-Sse8387Iオリゴヌ
クレオチド（5'-GGCAGCTGCCTGCA-3'［配列番号５］）を連結した。残りの独特の
BspHI部位を切断し、klenow酵素で平滑末端改変し、そしてAscIリンカー（5'-GA
AG
GCGCGCCTTC-3'［配列番号６］）を含むオリゴヌクレオチドをそこに連結し、Bsp
HI部位を除去した。得られるプラスミドをpWeeと呼んだ。
CMVlacZ発現カセットを、多数の工程を使用してpWeeの独特のPvuII部位に挿入
し、そのためCMVプロモーターをpWeeの細菌amp遺伝子の近位に配置した。CMVlac
Zカセットは、AAV ITRによって5'側および3'側に隣接したヌクレオチド配列を含
む。ヌクレオチド配列は以下のエレメントを有する：CMVプロモーター；hGHの第
１イントロン；adhlacZフラグメント；およびSV40初期ポリアデニル化部位。
プラスミドpsub201（Samulskiら（1987）J．Virol．61:3096-3101）をXbaIで
切断し、平滑末端改変し、そしてNotIリンカー（5'-TTGCGGCCGCAA-3'）［配列番
号７］を末端に連結して、細菌の複製起点およびamp遺伝子を含むベクターフラ
グメントを提供した。ここで、ベクターフラグメントはNotI部位が両側に隣接す
る。NotIでの切断後、第１のCMV発現カセットを、psub201ベクターフラグメント
にクローニングして、psub201CMVを作製した。このプラスミドからITRが結合し
た発現カセットを、PvuIIで切断することによって単離し、そしてプラスミドをP
vuIIで切断した後のpWeeに連結し、pWCMVを作製した。次いで、pWCMVをBssHIIで
（部分的に）切断し、そしてadhlacZ遺伝子を含む3246 bpフラグメント（プラス
ミドpCMV-βから得たSmaI-DraIヌクレオチドフラグメント、3246 bpフラグメン
トを提供するために末端に連結したAscIリンカー（5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'）［配
列番号６］を有する）を、pWCMVのBssHII部位に連結してpWadhlacZ構築物を得た
。
プラスミドpW1909adhlacZを、pGN1909からのエレメントとpWadhlacZ構築物と
を組み合わせることによって得た。特に、AAV repおよびcapコード領域を含む47
23 bp SpeI-EcoRVフラグメントを、プラスミドpGN1909から得た。4723 bpフラグ
メントを平滑末端改変し、そしてAscIリンカーを平滑末端に連結した。次いで、
得られたフラグメントをpWadhlacZの独特のAscI部位に連結し、そしてAAVコード
配列をこの構築物中の細菌の複製起点の近位に配置するように配向した。
実施例４
組換えAAVビリオンの産生
ヒト293細胞（Grahamら（1967）J．Gen．Virol．36:59-72、受託番号CRL1573
でATCCから入手可能である）を、10％ウシ胎児血清（FCS）、１％ pen/strep、
および１％グルタミン（Sigma，St．Louis，MO）を補充した滅菌DME/F12培養培
地（HEPES緩衝液を含まない）中で、５％CO2で37℃にて増殖させた。一旦細胞が
健康でありそして分割していると、これらをトリプシン処理し、そして10cmの細
胞培養プレート当たり１×106〜５×106細胞で播種する。細胞が最初にプレート
の表面に付着する場合、50〜75％の単層コンフルエンシーに達する。各プレート
の培地の容量は10 mLである。細胞のいずれの凝集の回避および細胞の均等な分
布は、組織培養プレートのすべての領域にわたる均等な細胞密度を達成するため
に必須である（これは高いrAAV粒子収量のために重要である）。次いで、細胞を
５％CO2中で37℃にて増殖させて、トランスフェクションの24〜48時間前の期間
にわたって90％コンフルエンシーに達する。
トランスフェクションの１〜４時間前に、組織培養プレート中の培地を10％FC
S、１％ pen/strep、および１％グルタミンを含む新鮮なDME/F12培養培地で置き
換える。それぞれ10μgのpAAVlacZベクターおよびpGN1909ヘルパー構築物（また
は他の適切なヘルパー構築物）を１mLの滅菌300 mM CaCl2に添加し、次いで１mL
の滅菌２×HBS溶液（280 mM NaCl、50 mM HEPES緩衝液、1.5 mM Na2HPO4を混合
して10 M NaOHでpH 7.1に調節することによって形成した）に添加し、そして穏
やかに倒置することによってすぐに混合する。次いで、得られた混合物を、90％
コンフルエントの293細胞（10 mLの上記の培養培地中）の10cmプレートにすぐに
ピペットで入れ、そして撹拌して(swirl)均質な溶液を生成する。
プレートを５％CO2インキュベーターに移し、そして妨げることなく６〜８時
間、37℃にて培養する。トランスフェクション後、培地をプレートから除去し、
そして単層の細胞を滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で１回洗浄する。
アデノウイルス作動ストックを、アデノウイルス（血清型２）のマスタースト
ックをDME/F12＋10％FCS、１％ pen/strep、１％グルタミン、および25 mM滅菌H
EPES緩衝液（pH 7.4）中で106pfu/mLの濃度に希釈することによって調製する。
得られたアデノウイルス作動ストックの10 mLを各10cmプレートに添加し、そし
て細胞を約72時間インキュベートする。すべての細胞が細胞変性効果（CPE）を
示し、そして約30％の細胞が浮遊している場合、細胞を穏やかにピペットで取る
ことによって細胞を採集して、プレート表面から細胞を脱離させる。細胞懸濁液
を集め、そして300×gにて２分間遠心分離する。上清を吸引除去し、そして細胞
を１mLの滅菌Tris緩衝化生理食塩水（TBS、100 mL Tris HCL、150mM NaClを混合
することによって調製し、そしてpH 8.0に調節した）で再懸濁する。得られた物
質を−80℃で凍結し得るか、または凍結／融解溶解物を作成して直ちに使用し得
る。
凍結／融解溶解物を、ドライアイス／エタノール浴（細胞が完全に凍結するま
で）と37℃水浴（完全に融解するまで）との間を交替することによって、TBS:細
胞懸濁液を３回凍結および融解することにより調製する。組織の破片を、10,000
×gにて10分間の遠心分離によって除去する。上清を集めて、滅菌凍結バイアル
に移す。アデノウイルスを、56℃にて１時間水浴に浸すことにより凍結／融解溶
解物をインキュベートすることによって、熱不活性化する。熱不活性化中に形成
するあらゆる沈殿を、試料を10,000×gにて10分間遠心分離することによって除
去する。次いで、組換えAAVビリオンを含む上清を採集する。ビリオンを−70℃
にて凍結保存し得る。
形質導入ベクター力価を、上記で調製したrAAVビリオンの希釈系列で293細胞
を感染することによって決定し得る。24時間後、細胞を固定し、そしてX-Galで
染色する（Sanesら（1986）EMBO 5:3133-3142）。力価を、青色細胞の数を定量
することによって計算する。
実施例５
AAV ヘルパープラスミド効率の比較
pGN1909構築物によって提供されるヘルパー機能の効率を、上記のpAAV/Adおよ
びpIM29+45AAVヘルパープラスミド（Samulskiら、およびMcCartyら、前出）に対
して比較した。rAAVlacZビリオンを、pAAVlacZ（実施例１に上記のように調製し
た）および以下の３つのヘルパープラスミドのうちの１つでのヒト293細胞の同
時トランスフェクションによって調製した：pGN1909、pAAV/Ad、およびpIM29+45
。３つの調製物からの組換え調製物の力価を決定した（実施例４に上記のように
）。結果を表１に示す。
上記の結果で見られ得るように、AAVヘルパー構築物としてpGN1909構築物を使
用して産生した組換え調製物の力価は、２つの上記のヘルパープラスミドのいず
れかを使用する調製物よりも５〜10倍大きい。
実施例６
延長した1909 AAVヘルパー配列の調製
組換えAAVビリオン産生中、望ましくない組換え事象がAAVベクターと複製コン
ピテントAAV野生型ウイルスの産生を生じるAAVヘルパーDNAとの間で生じ得る（
ここで、AAVヘルパーフラグメントはAAV ITRを獲得している）。野生型AAVウイ
ルス生成を減少または除去するために、介在ヌクレオチド配列(X)を、AAV capコ
ード領域とAAV p5プロモーターを含むヌクレオチド配列との間のpW1909ヘルパー
構築物中に挿入した。介在配列(X)を、野生型組換え体が大きすぎてAAVビリオン
としてカプシド化されない長さ(l)を有するように選択した。
特に、４つのヘルパープラスミドのセットは、ポリアデニル化部位（構築物中
のAAV capコード領域の3'側）とAAV p5プロモーター配列との間のAAVヘルパー配
列に４つの段階的により長い介在ヌクレオチド配列（X1〜X4）を挿入することに
よって、pW1909から得られた。pW1909プラスミドを、5060位でEcl136IIにて部分
的に消化した。X1ヌクレオチド配列（phi X174,2から得られる603 bpフラグメン
ト）を、pW1909のEcl136II部位に連結してpW1909-0.6を得た。603 bp X1フラグ
メントの付加で、pW1909-0.6構築物は5349 bp AAVヘルパー配列を含む。X2ヌク
レオチド配列（phi X174,3から得られる1078 bpフラグメント）を、pW1909のEcl
136II部位に連結してpW1909-1を得た。1078 bp X2フラグメントの付加で、pW190
9-1構築物は5824 bp AAVヘルパー配列を含む。X3ヌクレオチド配列（ファージλ
から得られる2027 bpフラグメント）を、pW1909のEcI136II部位に連結してpW190
9-2を得た。2027 bp X3フラグメントの付加で、pW1909-2構築物は6773 bp AAVヘ
ルパー配列を含む。X4ヌクレオチド配列（ファージλから得られる4361 bpフラ
グメント）を、pW1909のEcl136II部位に連結してpW1909-4を得た。4361 bp X4フ
ラグメントの付加で、pW1909-4構築物は9107 bp AAVヘルパー配列を含む。
pW1909-0.6、pW1909-1，pW1909-2、またはpW1909-4の延長したAAVヘルパー配
列のいずれかに対する２つの最小（145 bp）AAV ITR配列の付加により、それぞ
れ5639 bp、5824 bp、6773 bp、および9107 bpのAAV配列長になる。このように
、AAVヘルパー構築物のいずれかから生成した野生型組換え体のサイズは、約510
0bpのAAVパッケージング限界を越える。
pW1909-0.6、pW1909-1、pWl909-2、およびpW1909-4構築物を、rAAVビリオン産
生における増強したAAVヘルパー活性を提供するそれらの能力について評価した
。pW1909ヘルパー構築物およびpAAV/Adヘルパープラスミドをコントロールとし
て使用した。
AAVヘルパー活性を以下のように評価した。rAAVlacZビリオンを、pAAVlacZ（
実施例１で上記のように調製した）および以下のヘルパープラスミドのうちの１
つとヒト293細胞（10cmディッシュ当たり５×106細胞）との同時トランスフェク
ションによって調製した：pAAV/AdまたはpW1909（コントロールとして）；pW190
9-0.6；pWl909-1；pW1909-2；またはpW1909-4。ウイルスヘルパー機能（通常ア
デノウイルス感染によって提供される）がプラスミドの形態で提供されることを
除いて、rAAVビリオン産生を、実施例４に上記のように行った。より詳細には、
293細胞培養物を、以下のベクターのそれぞれ５μgで同時トランスフェクトした
：pAAVlacZベクター；選択されたAAVヘルパープラスミド；および、アデノウイ
ルスヘルパー機能を供給した選択されたアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域
（E2a、E4、およびVA RNA）を含む第３のプラスミド。細胞を約72時間インキュ
ベートした。次いで、凍結／融解溶解物の調製および調製物からのrAAVLacZ力価
の決定を、実施例４に記載のように行った。結果を表２に示す。
示され得るように、pW1909ヘルパー構築物を使用して産生した組換え調製物の
力価は、既に記載した「従来の」ヘルパープラスミドpAAV/Adを使用して得られ
た調製物よりも４倍大きい。延長したAAVヘルパー配列を有する1909構築物（pW1
909-0.6、pW1909-1、pW1909-2、およびpW1909-4）は、種々の量のビリオンを提
供し、ここで、pW1909-1は、pW1909の実質的に60％の効果であるヘルパー活性を
示した。
実施例７
pW1909 ヘルパープラスミドの改変型の調製
pW1909ヘルパープラスミドの２つの改変型、pH4およびpH8を以下のように提供
した。最初に、AAVヘルパープラスミド、pUC4391を、AAV血清型２ゲノムの塩基
対146〜4530を含むヌクレオチド配列（Srivastavaら（1983）J．Virol．45:555-
564）をpUC119のSmaI部位に挿入することによって組み立てた。プラスミドを、S
maI部位が、２つの145塩基対ITR配列以外はAAV血清型２ゲノム配列のすべてを含
む4391 bpヌクレオチドフラグメントに隣接するように配置した。特に、pSM620
から得られた4567 bp SmaIフラグメント（Samulskiら（1982）Proc．Natl．Acad
．Sci．USA 79:2077-2081）を、pUC119（GeneBank Reference Name: U07649，Ge
neBank Accession Number: U07649）のSmaI部位にサブクローニングして、pUC45
67を得た。次いで、M13に基づく変異誘発を使用して、全てのAAV ITR配列を除去
し、そしてそれによってpUC4391を得た。以下の変異原性オリゴヌクレオチドを
、
M13変異誘発において使用した：5'-AGCTCGGTACCCGGGCGGAGGGGTGGAGTCG-3'[配列
番号９]；および5'-TAATCATTAACTACAGCCCGGGGATCCTCTA-3'[配列番号１０]。
pBSII k/s-（Stratagene，San Diego）のポリリンカーを、BssHIIで切断する
ことによって除去し、そして以下の合成ポリリンカーで置き換えた：5'-GCGCGCC
GATATCGTTAACGCCCGGGCGTTTAAACAGCGCTGGCGCGC-3'［配列番号８］。合成ポリリン
カーは、以下の制限部位を含む：BssHII；EcoRV;HpaI；SrfI；PmeI；Eco47III；
およびBssHII。得られる構築物を「bluntscript」と称した。
pUC4391からの4399 bp SmaIフラグメントを、AAVヘルパー配列のrepコード領
域の5'末端が合成ポリリンカーのHpaI部位に近位であるように、bluntscriptのS
rfI部位にクローニングした。得られるプラスミドをpH1と称した。pH1のAAV p5
プロモーター領域およびAAV rep 5'非翻訳配列を、pW1909ヘルパープラスミドか
ら得たプロモーターのない5'非翻訳配列と置き換えた。特に、pW1909からの323b
p BssHII(平滑化)-SrfIフラグメントを、pH1から得た7163 bp SrfI-SmaI(部分的
)フラグメントにクローニングして、pH2を得た。pH2構築物を使用して、２つのA
AVヘルパープラスミド、pH4およびpH8を得た。これらは、AAVヘルパー配列の3'
末端に配置されたAAV p5プロモーター領域の２つの異なる型を含む。
特に、pW1909からの727 bp BgII-PstI(平滑化)フラグメントをpH2のEco47III
部位にクローニングすることによって、pH4ヘルパープラスミドを構築した。pW1
909からの727bp配列は、AAV p5プロモーター領域、FRT部位、およびN-末端repコ
ード配列の一部を含む。3' AAV p5プロモーター領域からの転写の方向は、AAV p
19およびAAV p40プロモーター領域の転写の方向と同じである。
AAV p5プロモーター領域を含む172 bp核酸フラグメントをpH2のEco47III部位
に挿入することによって、pH8ヘルパープラスミドを構築した。従って、pH8ヘル
パープラスミドは、FRT組換え部位、または3' AAV p5プロモーター領域に関連す
るさらなるAAVヌクレオチド配列を有さない。さらに、3' AAV p5プロモーター領
域は、AAV p19およびAAV p40プロモーター領域と同じ方向で転写する。
rAAVlacZビリオン産生の産生においてpH4およびpH8ヘルパープラスミドによっ
て提供されるヘルパー機能の効率を、pW1909プラスミドに対して比較した。ウイ
ルスヘルパー機能（通常アデノウイルス感染によって提供される）がプラスミド
の形態で提供される以外は、rAAVビリオン産生を実施例４で上記のように行った
。より詳細には、293細胞培養物を、以下のベクターのそれぞれ５μgで同時トラ
ンスフェクトした：pAAVlacZベクター；選択されたAAVヘルパープラスミド；お
よび、アデノウイルスヘルパー機能を供給した選択されたアデノウイルス遺伝子
または遺伝子領域（E2a、E4、およびVA RNA）を含む第３のプラスミド。細胞を
約72時間インキュベートした。次いで、凍結／融解溶解物の調製および調製物か
らのrAAVLacZ力価の決定を、実施例４に記載のように行った。結果を表３に示す
。
示され得るように、pH4およびpH8の両方とも、pW1909ヘルパープラスミドとほ
とんど同じ活性を有し、これは、3' FRT部位および3' AAV rep配列の欠失がpW19
09由来のpH8ヘルパープラスミドの機能に悪い影響を与えなかったことを示す。
本発明の実施において有用な株の寄託
以下の株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、ブダペスト条約の規定に従って
、アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Parklawn Drive，Rockvill
e，Marylandで行った。指定された受託番号を、成功した生存性試験後に割り当
てられ、そして必要な費用を払った。この培養物へのアクセスは、米国特許施行
規則1.14および米国特許法112条に基づいて権利を与えられる特許庁長官によっ
て決定されたものへの特許出願の係属中、利用可能である。公衆へのこの培養物
の利用可能性のすべての制限は、出願に基づく特許の譲渡によって改変可能に除
去されない。さらに、指定された寄託物は、寄託日から30年の期間、または寄託
物の最終請求後５年間；あるいは米国特許の存続期間の、どの長い期間も維持さ
れる。培養物が生存不可能になり、または不注意で破壊され、あるいはプラスミ
ド含有
培養物が生存不可能になり、または不注意で破壊され、あるいはプラスミド含有
株の場合は、そのプラスミドがなくなるならば、同じ分類の記載の生存培養物と
置き換えられる。
これらの寄託物は、当業者への便宜上のみで提供され、そして寄託が必要とさ
れる承認ではない。これらのプラスミドの核酸配列、ならびにそれによってコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の記載と何らかの矛盾がある
場合はコントロールしている。ライセンスは、寄託物質を製造、使用、または販
売するために必要であり得、そしてこのようなライセンスはこれによって譲渡さ
れない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．AAVヘルパー機能をコードする核酸分子であって、該分子が、 AAV repコード領域およびAAV capコード領域であって、該AAV repおよびcapコ ード領域が、その発現を指示する制御配列に作動可能に連結されている、コード 領域；および AAV p5プロモーター領域を含む第１のヌクレオチド配列であって、該第１のヌ クレオチド配列は、該p5プロモーター領域が、野生型AAVゲノム中のrepコード領 域に対してその天然の位置以外の部位に位置するように、該分子中に配置される 、ヌクレオチド配列； を含む、核酸分子。 ２．請求項１に記載の核酸分子であって、ここで、前記第１のヌクレオチド配 列が、図４(配列番号４)に塩基１〜164として示される、野生型AAV血清型２ゲノ ムの塩基対145〜309と実質的に相同である、核酸分子。 ３．請求項１に記載の核酸分子であって、ここで、前記第１のヌクレオチド配 列が、図４(配列番号４)に塩基１〜349として示される、野生型AAV血清型２ゲノ ムの塩基対145〜494と実質的に相同である、核酸分子。 ４．Flip Recombination Target(FRT)部位と相同である第２のヌクレオチド配 列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。 ５．5'および3'に隣接するヌクレオチド配列をさらに含む請求項１に記載の核 酸分子であって、ここで、それぞれの該隣接する配列が、FRT部位に実質的に相 同であり、そしてさらに、前記AAV repコード領域、前記AAV capコード領域、お よび前記AAV p5プロモータ領域を含む前記ヌクレオチド配列が、該隣接するヌク レオチド配列間にはさまれる、核酸分子。 ６．介在ヌクレオチド配列をさらに含む請求項１に記載の核酸分子であって、 ここで、該分子が5'から3'方向に所定の順で、AAV repコード領域、AAV capコー ド領域、該介在ヌクレオチド配列、およびAAV p5プロモーター領域を含むヌクレ オチド配列を含む、核酸分子。 ７．請求項６に記載の核酸分子であって、ここで、前記介在ヌクレオチド配列 が、組換えAAVビリオン産生中に該核酸分子のAAV ITRとの組換えによって産生さ れる分子のAAVビリオンへのパッケージングを妨げるために十分な長さを有する 、核酸分子。 ８．前記介在ヌクレオチド配列が少なくとも500塩基対を含む、請求項７に記 載の核酸分子。 ９．請求項１に記載の核酸分子を含むAAVヘルパー構築物。 １０．前記構築物がプラスミドを含む、請求項９に記載のAAVヘルパー構築物 。 １１．前記構築物がプラスミドpGN1909（ATCC受託番号69871）を含む、請求項 １０に記載のAAVヘルパー構築物。 １２．請求項４に記載の核酸分子を含むAAVヘルパー構築物。 １３．前記構築物がプラスミドを含む、請求項１２に記載のAAVヘルパー構築 物。 １４．前記構築物がプラスミドpH8を含む、請求項１３に記載のAAVヘルパー構 築物。 １５．請求項７に記載の核酸分子を含む、AAVヘルパー構築物。 １６．前記構築物がプラスミドを含む、請求項１５に記載のAAVヘルパー構築 物。 １７．前記構築物がプラスミドpW1909-1を含む、請求項１６に記載のAAVヘル パー構築物。 １８．選択可能な遺伝子マーカーをさらに含む、請求項９に記載の構築物。 １９．前記選択可能な遺伝子マーカーが抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項１ ８に記載の構築物。 ２０．請求項９に記載のAAVヘルパー構築物で適切な宿主細胞をトランスフェ クトすることによって調製される、AAVパッケージング細胞。 ２１．請求項１２に記載のAAVヘルパー構築物で適切な宿主細胞をトランスフ ェクトすることによって調製される、AAVパッケージング細胞。 ２２．請求項１５に記載のAAVヘルパー構築物で適切な宿主細胞をトランスフ ェクトすることによって調製される、AAVパッケージング細胞。 ２３．ウイルスヘルパー機能が発現されるときに組み換えAAVビリオンを産生 し得るAAVプロデューサー細胞であって、該プロデューサー細胞が、AAVベクター でトランスフェクトされている請求項２０に記載のパッケージング細胞を含む、 AAVプロデューサー細胞。 ２４．ウイルスヘルパー機能が発現されるときに、野生型AAVを顕著なレベル で混入して産生せずに組み換えAAVビリオンを産生し得るAAVプロデューサー細胞 であって、該プロデューサー細胞が、AAVベクターでトランスフェクトされてい る請求項２１に記載のパッケージング細胞を含む、AAVプロデューサー細胞。 ２５．ウイルスヘルパー機能が発現されるときに、野生型AAVを顕著なレベル で混入して産生せずに組み換えAAVビリオンを産生し得るAAVプロデューサー細胞 であって、該プロデューサー細胞が、AAVベクターでトランスフェクトされてい る請求項２２に記載のパッケージング細胞を含む、AAVプロデューサー細胞。 ２６．組換えAAVビリオンを産生する方法であって、以下の工程： (ａ)AAVベクターを宿主細胞に導入する工程； (ｂ)請求項９に記載のAAVヘルパー構築物が必須のAAV RepおよびCapポリペプ チドを提供するように、該AAVヘルパー構築物を該宿主細胞に導入する工程; (ｃ)該宿主細胞でウイルスヘルパー機能を発現させる工程；および (ｄ)組換えAAVビリオンを産生するために該細胞を培養する工程 を包含する、方法。 ２７．前記ウイルスヘルパー機能の発現が、アデノウイルス、ヘルペスウイル ス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択されるウイルスで前記宿主細 胞を感染することによって提供される、請求項２６に記載の方法。 ２８．組換えAAVビリオンを産生する方法であって、以下の工程： (ａ)AAVベクターを宿主細胞に導入する工程； (ｂ)請求項１２に記載のAAVヘルパー構築物が必須のAAV RepおよびCapポリペ プチドを提供するように、該AAVヘルパー構築物を該宿主細胞に導入する工程； (ｃ)該宿主細胞でウイルスヘルパー機能を発現させる工程；および (ｄ)組換えAAVビリオンを産生するために該細胞を培養する工程 を包含する、方法。 ２９．前記ウイルスヘルパー機能の発現が、アデノウイルス、ヘルペスウイル ス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択されるウイルスで前記宿主細 胞を感染することによって提供される、請求項２８に記載の方法。 ３０．野生型AAVを顕著なレベルで混入して産生せずに組換えAAVビリオンを産 生する方法であって、 (ａ)AAVベクターを宿主細胞に導入する工程； (ｂ)請求項１５に記載のAAVヘルパー構築物が必須のAAV RepおよびCapポリペ プチドを提供するように、該AAVヘルパー構築物を該宿主細胞に導入する工程； (ｃ)該宿主細胞でウイルスヘルパー機能を発現させる工程；および (ｄ)組換えAAVビリオンを産生するために該細胞を培養する工程 を包含する、方法。 ３１．前記ウイルスヘルパー機能の発現が、アデノウイルス、ヘルペスウイル ス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択されるウイルスで前記宿主細 胞を感染することによって提供される、請求項３０に記載の方法。
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