CN115851710A

CN115851710A - siRNA分子组合物及其应用

Info

Publication number: CN115851710A
Application number: CN202210921470.6A
Authority: CN
Inventors: 李天浩; 龙笑
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2022-08-02
Filing date: 2022-08-02
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明涉及一种siRNA分子组合物及其应用。该siRNA分子组合物序列为：正义链：5’‑AGCCGTACATTGCTATCGA‑3’，反义链：5’‑TCGATAGCAATGTACGGCT‑3’。该siRNA分子组合物，可以用于制备抑制USP11表达的试剂，以及用于制备治疗瘢痕疙瘩的药物，该siRNA分子组合物以USP11作为瘢痕疙瘩的生物标志物，通过靶向特异抑制瘢痕疙瘩中高表达的USP11，抑制成纤维细胞合成分泌I型胶原细胞外基质和III型胶原细胞外基质，以及控制USP11所调控的下游靶基因，达到控制和治疗瘢痕疙瘩的目标。

Description

siRNA分子组合物及其应用

技术领域

本发明涉及药物用途技术领域，尤其涉及一种siRNA分子组合物及其应用。

背景技术

瘢痕疙瘩是高于皮肤表面，超过伤口边缘，且持续性增生的异常瘢痕，一般不能自行消退。瘢痕疙瘩不仅影响美观，还可能伴有瘙痒、疼痛等症状，长期会对患者的心理和生理均造成较大负面影响。瘢痕疙瘩的发生继发于皮肤损伤，以持续的炎症反应和胶原异常过度沉积为特征，病变范围逐渐扩大，侵犯周围正常皮肤。其发生率从4.5％到16％均有报道，且在有色人种中更高。瘢痕疙瘩的发生可能与生长因子失衡、胶原代谢异常、遗传因素、免疫功能失调、皮脂反应、局部张力异常等许多因素相关，目前还没有假说可以完全解释其成因。瘢痕疙瘩的治疗有手术切除、皮质醇注射、放射治疗、激光、硅凝胶、压力治疗、减张治疗、脂肪移植等许多种，但由于病因不清，无法对因治疗，因此较易复发而导致疗效不佳。

成纤维细胞在瘢痕疙瘩的发生、发展中起重要作用。瘢痕疙瘩中的成纤维细胞在TGF-β等因子的刺激下被过度激活，增殖并分泌胶原。一部分成纤维细胞分化为具有收缩功能的肌成纤维细胞，在瘢痕疙瘩中数量增加。上皮-间质转化也参与了瘢痕疙瘩的形成。TGF-β1和Notch-1介导的信号通路在成纤维细胞的激活中十分重要。多种炎症细胞及细胞因子参与了瘢痕疙瘩的发病，成纤维细胞、免疫细胞等之间的相互作用可能是瘢痕疙瘩发病过程中重要的一环。

泛素化作为一种重要蛋白质翻译后修饰，参与调控细胞周期、细胞凋亡、DNA修复、抗原呈递、受体内吞、细胞内信号转导等生物学过程，对维持细胞稳态具有重要意义。近期研究发现由去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)所介导的去泛素化作为泛素化的逆过程在调节细胞内信号转导同样扮演重要角色，其能切断底物蛋白与泛素分子之间的连接，将泛素分子从泛素化底物蛋白中解离出来，游离的泛素分子重新进入蛋白质调节循环中。基于基因序列和结构域保守性，DUBs可以分为以下六个亚类：泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases，USPs)、泛素羧基末端水解酶(ubiquitin carboxyterminal hydrolases,UCHs)、卵巢肿瘤相关蛋白酶(ovarian tumor-related proteases,OTUs)、MJD结构域蛋白酶(Machado-Joseph disease protein domain proteases，MJDs)、JAMM/MPN域相关金属蛋白酶(JAMM/MPN domain-associated metallopeptidases,JAMMs)以及近期发现的单核细胞趋化蛋白诱导的蛋白质(monocyte chemotactic proteininduced protein，MCPIP)。泛素特异性蛋白酶(USPs)是DUBs家族最大的亚族，包括60多种成员。USPs通过去泛素化作用抑制靶蛋白依赖泛素-蛋白酶体通路的降解或者调节靶蛋白的定位和活性。多项研究报道USPs家族成员可通过去泛素化调节TGF-β/Smad信号通路相关蛋白水平参与纤维化疾病的发生发展。现有研究证据表明USPs在纤维化疾病中存在异常活化，其在调控TGF-β/Smad信号通路转导活性方面发挥关键作用。

泛素特异性蛋白酶11(Ubiquitin-specific protease，USP11)是泛素特异性蛋白酶家族重要成员之一，可以通过去泛素化作用稳定相关功能蛋白的表达(如PTEN、p21等)，从而在生物学过程中发挥重要作用，现已被证实与多种肿瘤的发生发展及预后有关。然而，USP11是否在瘢痕疙瘩中存在异常活化，及其是否可以发挥去泛素化作用调节TGF-β/Smad信号转导进而促进瘢痕疙瘩的发生发展目前尚不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术存在的上述问题，提供一种siRNA分子组合物及其应用。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种siRNA分子组合物，序列为：

正义链：5’-AGCCGTACATTGCTATCGA-3’，如Seq_1所示；

反义链：5’-TCGATAGCAATGTACGGCT-3’，如Seq_2所示；。

第二方面，本发明提供上述siRNA分子组合物在制备USP11抑制剂上的应用。

进一步地，所述USP11抑制剂还包括药学上可接受的载体。

进一步地，所述载体包括：脂质体、稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体中的至少一种。

进一步地，所述USP11抑制剂的制剂类型包括：口服制剂或外用制剂。比如，口服制剂包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等，外用制剂包括粉剂、膏剂、散剂、搽剂、凝胶剂、糊剂、气雾剂、透皮贴片等。

进一步地，所述USP11抑制剂的给药方式为以下之一：静脉注射、吸入给药、肌内注射、皮下注射、直肠给药、舌下给药、口服液体药剂、口服固体药剂、皮肤给药。

第三方面，本发明提供上述siRNA分子组合物或者上述USP11抑制剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体。

进一步地，所述药物的制剂类型包括：口服制剂或外用制剂。比如，口服制剂包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等，外用制剂包括粉剂、膏剂、散剂、搽剂、凝胶剂、糊剂、气雾剂、透皮贴片等。

进一步地，所述药物的给药方式为以下之一：静脉注射、吸入给药、肌内注射、皮下注射、直肠给药、舌下给药、口服液体药剂、口服固体药剂、皮肤给药。

本发明开发了一种siRNA分子组合物，可以用于制备抑制USP11表达的试剂，以及用于制备治疗瘢痕疙瘩的药物，该siRNA分子组合物以USP11作为瘢痕疙瘩的生物标志物，通过靶向特异抑制瘢痕疙瘩中高表达的USP11，抑制成纤维细胞合成分泌I型胶原细胞外基质和III型胶原细胞外基质，以及控制USP11所调控的下游靶基因，达到控制和治疗瘢痕疙瘩的目标。

附图说明

图1为本发明实施例1中瘢痕疙瘩与正常皮肤样本免疫组化结果。

图2为本发明实施例1中瘢痕疙瘩与正常皮肤样本组织总蛋白Western blot结果。

图3为本发明实施例1中使用三条不同siUSP11干扰成纤维细胞后WB结果。

图4为本发明实施例1中当使用siRNA组合物敲降USP11后，瘢痕疙瘩来源成纤维细胞增值能力曲线图。

图5为本发明实施例1中当使用siRNA组合物敲降USP11后，瘢痕疙瘩来源成纤维细胞迁移情况。

图6为本发明实施例1中细胞水平检测结果。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供一种siRNA分子组合物，所述siRNA分子的序列为：

正义链：5’-AGCCGTACATTGCTATCGA-3’，

反义链：5’-TCGATAGCAATGTACGGCT-3’。

上述siRNA分子组合物可以用于制备抑制USP11表达的试剂，以及用于制备治疗瘢痕疙瘩的药物，该siRNA分子组合物以USP11作为瘢痕疙瘩的生物标志物，通过靶向特异抑制瘢痕疙瘩中高表达的USP11，抑制成纤维细胞合成分泌I型胶原细胞外基质和III型胶原细胞外基质，以及控制USP11所调控的下游靶基因，达到控制和治疗瘢痕疙瘩的目标。

当上述siRNA分子组合物制备成USP11抑制剂时，USP11抑制剂还包括药学上可接受的载体。这些载体包括：脂质体、稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体中的至少一种。可以开发成的剂型包括：片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、粉剂、膏剂、散剂、搽剂、凝胶剂、糊剂、气雾剂、透皮贴片，等等，给药方式为以下之一：静脉注射、吸入给药、肌内注射、皮下注射、直肠给药、舌下给药、口服液体药剂、口服固体药剂、皮肤给药。

当上述siRNA分子组合物或者或者上述USP11抑制剂制备成治疗瘢痕疙瘩的药物时，该药物还包括药学上可接受的载体。这些载体包括：脂质体、稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体中的至少一种。可以开发成的剂型包括：片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、粉剂、膏剂、散剂、搽剂、凝胶剂、糊剂、气雾剂、透皮贴片，等等，给药方式为以下之一：静脉注射、吸入给药、肌内注射、皮下注射、直肠给药、舌下给药、口服液体药剂、口服固体药剂、皮肤给药。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例考察了siRNA分子组合物或者上述USP11抑制剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的潜力，具体实验过程如下：

1、人瘢痕来源成纤维细胞的提取和培养：

将来自人瘢痕疙的临床标本用DispaseII(2mg/ml，LifeTechnologies，ThermoFisher)浸泡，4℃过夜，并剥离、去除表皮。无菌环境下切碎组织，用4mg/ml胶原酶浸泡，摇床37℃消化2-4小时，滤网过滤细胞悬液，1500rpm离心5min，去除上清，并用培养基重悬细胞沉淀，接种至DMEM培养基。每2天换液一次。

2、siRNA转染步骤：

(1)siRNA的转染浓度：USP11 siRNA转染浓度是50nM。

(2)使用lipofectamine2000(lipo2000，Invitrogen)转染，转染过程具体如下：

1)转染前一天，接种5×10⁴个/ml人瘢痕来源成纤维细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％。

2)对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA-lipo2000混和液：a.稀释转染试剂lipo2000：使用前，将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基(Opti-MEMI)稀释，轻轻混和，室温孵育5min；b.稀释siRNA：用不含血清的Opti-MEMI稀释siRNA，轻轻混和；c.稀释好的lipo2000经过5min的孵育后，将之与步骤b稀释好的siRNA轻轻混和，室温培养20min以形成siRNA-lipo2000混和液，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。

3)将siRNA-lipo2000混和液加入含有人瘢痕来源成纤维细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和。

4)将培养板置于37℃的CO₂培养箱中培养24～48h。获得的细胞用于后续相关检测。

5)蛋白水平的检测。

3、CCK-8细胞活性检测：

对于体外培养的人瘢痕来源成纤维细胞，采用CCK-8法对细胞的增殖活性进行检测。CCK-8试剂盒购自Dojindo(Tokyo,Japan)，实验步骤按照试剂盒说明书严格进行。

4、细胞迁移能力检测(transwell实验)：

1)接种人瘢痕来源成纤维细胞于6孔板中，siRNA转染48h，达到70～80％的细胞汇合度。

2)无血清培养基对细胞提前进行2h饥饿培养，用胰酶消化(0.25％1×胰酶)进行细胞收集，轻柔吹打，制作单细胞悬液，离心5min1000 rpm。PBS轻轻洗涤，随后以无血清培养基轻柔重悬细胞，调整细胞浓度(1.5×10⁵/ml)。

3)在迁移实验中，transwell小室的上室中加入细胞悬液(100μl，1.5×10⁴个细胞/孔)，每组4个复孔，加入与细胞株相对应的完全培养基(含10％FBS，500μl/孔)于下室中。随后置于孵箱(37℃，5％CO₂)中将transwell板孵育36h。含10％FBS的完全培养基配制方法：从-80℃冰箱中取出分装存放的FBS，于4℃冰箱中放置，解冻24小时。取适量FBS加入DMEM高糖培养基(美国HyClone公司)中，使FBS在培养基中终浓度达10％，将含10％FBS的完全培养基避光放置于低温4℃冰箱中保存。

4)在侵袭实验中，transwell小室的上室加入细胞悬液(200μl，3×10⁴个细胞/孔)，下室中加入与细胞株相对应的完全培养基(含10％FBS，500μl/孔)。随后置于孵箱(37℃，5％CO₂)中将transwell板孵育36h。

5)从孵箱取出transwell小室后，将上层的培养基去除，为去除未转移过去的细胞，通过反复轻旋棉签，擦拭小室膜上表面，用PBS轻柔洗涤3次。

6)向下室加入1ml甲醇溶液，transwell小室放入甲醇溶液中，使膜充分浸没，室温环境下固定细胞20min。

7)取小室进行风干，倒置在室温下，苏木素染液中浸泡(10min，主要染细胞核)，为除去非特异性结合的染料，流水彻底冲洗后晾干，将其在伊红染液中浸泡(5min，染细胞浆)，再次进行流水彻底冲洗，室温风干。

8)玻片及树脂封片，需小心避免产生气泡，于光学显微镜下观察、拍照、计数。

9)采用高倍镜视野计数(分别按上、下、中、左、右共5个区间)，取平均值。重复三次实验。

5、组织切片及HE染色：

人瘢痕疙临床标本取材后常规固定、脱水、石蜡包埋，并制备6μm切片。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水水，就可染色。HE染色：将已入入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。酸水及氨水中分色，各数秒钟。流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。入70％和90％酒精中脱水各10分钟。入酒精伊红染色液染色2-3分钟。脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，树胶封片。拍照。

6、细胞总蛋白提取及定量：

总蛋白提取：(1)吸去人瘢痕来源成纤维细胞培养液，用预冷PBS洗两遍；(2)加入RIPA裂解液(含1％PMSF)适量，在冰上裂解15分钟；(3)用细胞刮刀将细胞刮下，转移进预冷的EP管，4℃12,000rpm离心15分钟；(4)取上清即为总蛋白，分装-80℃保存。定量(BCA法)：(1)将BCA的A液与B液分别以50:1混合后，以每空加200μL至96孔酶标板；(2)加入细胞(或组织)裂解液10μL/孔，RIPA为空白对照，37℃孵育30min；(3)于562nm处测定吸光值，以BCA标准曲线作为校正进行。

7、Western blot：

(1)样品制备：取20μg步骤6获得的蛋白，加入4×Protein SDS PAGE LoadingBuffer，混匀，95℃加热10min，将蛋白变性，并将二硫键打开；

(2)配制分离胶：按表1中体系(10％凝胶)混匀后加入洗净的胶板中间，立即加入异丙醇液封；

(3)配制浓缩胶：待分离胶凝固后，将异丙醇倒掉，按表2中体系混匀后加入胶板中，迅速插入梳子；

(4)电泳：在电泳槽内加入适量电泳缓冲液，将蛋白标记物8μL及变性的蛋白，加入上样孔，80V电泳约30min，至溴酚兰进入分离胶，改为120V电压，电泳约1小时左右；

(5)转膜：小心取下SDS-PAGE凝胶，将PVDF膜(需预先浸泡于甲醇内30秒激活)，定性滤纸以及纤维垫放在电泳槽转膜缓冲液中，以三明治方式(由负极至正极依次是纤维垫、定性滤纸、凝胶、PVDF膜、定性滤纸、纤维垫)夹牢，彻底清除气泡，放入装有转膜缓冲液的转移槽内，放入冰盒，以300mA恒流转膜1.5小时；

(6)封闭：将转有蛋白的PVDF膜取出，浸入新鲜的封闭液(5％BSA)，摇床上室温孵育1小时以封闭非特异性蛋白结合位点；

(7)一抗：将PVDF膜依照所需蛋白的分子量剪开，加入一抗，在摇床上缓慢摇晃，4℃孵育过夜；

(8)洗膜：吸去一抗，用TBST于摇床上洗膜3次，每次10分钟；

(9)二抗：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，摇床上缓慢摇晃，室温下孵育1小时；

(10)洗膜：吸去二抗，用TBST于摇床上洗膜3次，每次10分钟；

(11)显影：将显影液1:1混合后，滴到膜上，打开化学发光成像分析系统(Tanon5200S)，曝光显影，观察蛋白条带；

(12)分析：使用Image J软件分析条带。

表1配置浓缩胶(上胶)

配方	体积(5ml,1块胶)	体积(10ml,2块胶)
			30％聚丙烯酰胺Arc-Bias	0.65ml	1.3ml
4X浓缩胶缓冲液lower buffer	1.25ml	2.5ml
			去离子水ddH2O	3.05ml	6.1ml
过硫酸铵APS(0.1％)	60μl	120μl
			TEMED	6μl	12μl

表2 10％分离胶的配置(下胶)

8、结论

瘢痕疙瘩与正常皮肤样本(来自相同患者的配对正常皮肤组织)免疫组化结果如图1所示，显示USP11在瘢痕疙瘩成纤维细胞胞质当中表达水平相较于正常皮肤成纤维细胞显著上升。

Western blot结果如图2和3所示，图2显示USP11、TβRII、Smad2、Smad3、α-SMA、COL1、COL3在瘢痕疙瘩临床样本组织总蛋白水平相较于正常皮肤组织显著下调。图3显示在si-NC、si-USP11-001、si-USP11-002、si-USP11-003中，si-003敲降USP11效率最好，故选择si-003作为工具序列，si-003即为本发明的siRNA分子组合物，其序列为：

正义链：5’-AGCCGTACATTGCTATCGA-3’，如Seq_1所示；

反义链：5’-TCGATAGCAATGTACGGCT-3’，如Seq_2所示；。

si-USP11-001的正义链：5’-GCCCGTGACTACAACAACT-3’，如Seq_3所示。

si-USP11-002的正义链：5’-GGTCGAAGTGTACCCAGTA-3’，如Seq_4所示。

si-NC为引物设计过程的随机序列。

CCK8结果如图4所示，显示使用si-USP11组合物敲降USP11后，瘢痕疙瘩来源成纤维细胞增值能力相较于si-NC组明显降低。

Transwell结果如图5所示，显示使用si-USP11组合物敲降USP11后，瘢痕疙瘩来源成纤维细胞迁移能力相较于si-NC组明显降低。

Western blot结果如图6所示，显示TβRII、Smad2、Smad3、α-SMA、COL1、COL3在si-USP11处理后的瘢痕疙瘩来源成纤维细胞总蛋白水平相较于si-NC组表达明显下降。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种siRNA分子组合物，其特征在于：其序列为：

正义链：5’-AGCCGTACATTGCTATCGA-3’，

反义链：5’-TCGATAGCAATGTACGGCT-3’。

2.权利要求1所述的一种siRNA分子组合物在制备USP11抑制剂上的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述USP11抑制剂还包括药学上可接受的载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述载体包括：脂质体、稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体中的至少一种。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述USP11抑制剂的制剂类型包括：口服制剂或外用制剂。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述USP11抑制剂的给药方式为以下之一：静脉注射、吸入给药、肌内注射、皮下注射、直肠给药、舌下给药、口服液体药剂、口服固体药剂、皮肤给药。

7.权利要求1所述的一种siRNA分子组合物或者权利要求2所述的USP11抑制剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的载体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述载体包括：脂质体、稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体中的至少一种。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物的制剂类型包括：口服制剂或外用制剂。