CN102399778A - 一组下调Mortalin/HSPA9/Grp75表达的siRNA分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组能有效下调Mortalin/HSPA9/Grp75表达的siRNA分子，所述的siRNA分子的靶点位于Mortalin/HSPA9/Grp75mRNA的编码区。所述的siRNA分子能够有效下调Mortalin/HSPA9/Grp75的表达。通过该siRNA分子下调Mortalin/HSPA9/Grp75表达后，耐药卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性增加，侵袭性降低。该siRNA分子可以逆转卵巢癌的耐药，降低卵巢癌细胞的侵袭性，提高卵巢癌的治疗效果。本发明还提供了含有上述siRNA分子的载体、应用以及其与化疗药物的组合物。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一组siRNA分子，具体的说，是关于一组能有效下调Mortalin/HSPA9/Grp75表达的siRNA分子及其在抑制卵巢癌细胞增殖方面的应用。
背景技术
卵巢癌（Ovarian Carcinoma）是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤，治疗原则主要是以手术为主，辅以化疗的综合治疗。以铂类为主的联合化疗提高了卵巢癌患者的总体反应率、临床缓解率和中位生存率。然而随之而来的肿瘤细胞原发或获得性多药耐药（Multidrug Resistance，MDR）现象成为临床治疗的障碍，是大多数卵巢癌患者化疗失败、预后不良的主要原因之一。多药耐药问题不仅仅是卵巢癌，也是所有肿瘤临床化学药物治疗的一大瓶颈，不仅导致化疗药物治疗的最终失败，而且耐药肿瘤细胞往往侵袭转移能力增强，缩短患者的生存期。因而寻找可行的、能对其进行干预的靶分子，逆转肿瘤耐药和阻止侵袭转移的产生，以达到不断提高疗效的目的，无疑具有重要理论意义和临床实际应用价值。
已有的研究发现，某些分子伴侣，特别是应激蛋白和热休克蛋白（Hsp27、Hsp90和Hsp70等）在许多肿瘤中呈上调表达，通过调控肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移等，参与了肿瘤的发生、发展和耐药。由于分子伴侣异常表达与肿瘤耐药的直接相关性，抑制分子伴侣将为逆转肿瘤耐药开创新的思路。
分子伴侣（molecular chaperone）是一类与其他蛋白的不稳定构象相结合并使之稳定的蛋白质，通过控制结合和释放来帮助被结合多肽在细胞内进行折叠、组装、转运或降解等。分子伴侣由一些进化上非常保守的蛋白质家族组成，广泛分布于各种生物体内。
Mortalin/HSPA9/Grp75基因是Hsp70分子伴侣家族成员之一，首先在小鼠的成纤维细胞中被克隆出来。最初的研究发现其前体带有一段线粒体蛋白的信号肽，被认为是一类线粒体蛋白，因而早期的研究主要围绕在其对线粒体蛋白转运过程中所发挥的作用，以及它在线粒体内的分子伴侣功能展开。随后的研究发现Mortalin/HSPA9/Grp75广泛分布于多个细胞器和胞浆，具有多个结合配体（DJ-1、ILR-1a、VDAC、HSP60等），与细胞增殖和应激反应的调控有关。迄今为止，针对于Mortalin/HSPA9/Grp75的研究发现其生物学功能主要包括分子伴侣功能、抗凋亡的细胞保护功能和稳定细胞骨架等。
已有的研究发现在许多肿瘤组织（如结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、肝细胞癌）和几乎所有的肿瘤起源的体外细胞系Mortalin/HSPA9/Grp75均呈上调表达。而且过表达MortalinHSPA9/Grp75可以增加乳腺癌细胞的恶性程度，从而提出Mortalin/HSPA9/Grp75有可能成为肿瘤治疗的一个候选基因。与肿瘤相关性的研究还发现，Mortalin/HSPA9/Grp75具有两个特点：①Mortalin/HSPA9/Grp75 的mRNA和蛋白表达水平在永生化和肿瘤细胞中表达水平增加；②Mortalin/HSPA9/Grp75在正常细胞和肿瘤细胞中的分布不同：正常细胞中Mortalin/HSPA9/Grp75分布于整个细胞质（pancytoplasmic）；在肿瘤细胞中主要分布于核周（perinuclear）。详细机制有待于进一步探讨。
抑癌基因P53（凋亡调节关键因子之一）的突变或缺失在多种肿瘤的形成和发展过程中起到了重要的作用，包括卵巢癌。而且与其他妇科恶性肿瘤如宫颈癌、子宫内膜癌相比，P53基因在卵巢癌中的突变频率最高。P53基因与卵巢癌的耐药也密切相关。顺铂能够通过诱导肿瘤细胞经p53依赖的途径发生凋亡从而抑制肿瘤生长，p53的调控失衡将导致凋亡信号转导失常，出现对顺铂的耐药。
Kaul SC等的研究发现Mortalin/HSPA9/Grp75可以通过其N-terminal 氨基酸残基253-282与p53直接结合；J Zuo等的研究则发现Mortalin/HSPA9/Grp75可以抑制p53的线粒体易位和核转位，从而抑制其抗凋亡转录活性。进一步的研究还发现，当p53-Mortalin/HSPA9/Grp75复合物的相互作用被过表达截短的p53打断后，p53活化后入核，从而引起人骨肉瘤和乳腺癌细胞的生长迟滞。提示Mortalin/HSPA9/Grp75对p53活性的抑制可能在肿瘤的发生与耐药过程中起到了一定的作用。
由于细胞凋亡的调节在肿瘤发生、发展以及化疗耐药过程中发挥了重要的作用；且多种分子伴侣（Hsp27，Hsp70和Hsp90等）在肿瘤发生和耐药过程中的作用与其抗凋亡的特性有关。基于分子伴侣进化上的保守性，推测Mortalin/HSPA9/Grp75的上调表达在肿瘤发生和耐药中所发挥的作用，可能与其抗凋亡的细胞保护作用有关。Mortalin/HSPA9/Grp75可能通过其分子伴侣功能和p53结合，抑制p53凋亡诱导功能的发挥；抑或通过对PI3K/Akt、Raf/Mek/Eek等通路的激活发挥其凋亡抑制功能。而下调Mortalin/HSPA9/Grp75将导致细胞增殖能力的丧失、衰老和细胞死亡。
研究发现经Northern Blot检测的卵巢癌标本中约30% Mortalin/HSPA9/Grp75表达量明显增高。且Mortalin/HSPA9/Grp75在人耐药卵巢癌细胞株A2780/cis中的mRNA和蛋白表达水平均明显高于人卵巢癌细胞株A2780。提示Mortalin/HSPA9/Grp75上调表达可能与卵巢癌耐药具有一定的相关性。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。由于这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post–transcriptional gene silencing，PTGS)，它是生物体抵御病毒感染及防止重复序列和突变引起基因组不稳定性的细胞保护机制。
当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中RNaseIII核酶家族的Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即小干扰RNA（siRNA）。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与胞内的一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC具有核酸酶的功能，能与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，在结合部位切割mRNA，切割位点是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。
RNAi技术目前主要应用于基因功能的研究，病毒感染性疾病以及肿瘤的基因治疗。在肿瘤的治疗中，通过使用针对某些抗凋亡分子如survivin或与耐药相关分子如MDR1的siRNA或shRNA，可以特异性杀伤肿瘤细胞或提高肿瘤细胞对药物的敏感性。
尽管前期的研究表明Mortalin/HSPA9/Grp75上调表达可能与卵巢癌细胞对化疗药物不敏感有关，但是目前尚未有关于其小干扰RNA序列用于增加耐药卵巢癌细胞对药物的敏感性方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一组能有效下调Mortalin/HSPA9/Grp75表达的siRNA分子，通过RNAi技术下调Mortalin/ HSPA9/Grp75表达后，耐药卵巢癌细胞是否对药物的敏感性增加，为逆转卵巢癌耐药以及卵巢癌分子靶向治疗提供依据。
已有的研究表明Mortalin/HSPA9/Grp75上调表达可能与肿瘤细胞对化疗药物不敏感有关。而通过干扰Mortalin/HSPA9/Grp75的表达逆转卵巢癌耐药的研究尚未见报道。因此，我们设计了一系列干扰序列，用于筛选具有明显干扰活性并且能够逆转卵巢癌耐药的序列。首先，必须把表达干扰序列的载体转染到人耐药的卵巢癌细胞A2780/cis中，然后才能判断每一条干扰序列的干扰活性。真核细胞的转染可以通过多种方法获得，例如磷酸钙沉淀、脂质体转染、电穿孔以及病毒方法。其中脂质体转染效率较高，且通过抗性药物G418的筛选可以获得稳定的单克隆细胞株，为此我们比较后选择了脂质体转染的方法，并通过无限稀释法挑取了单克隆。免疫印记检测结果显示设计的三条干扰序列均有明显的干扰活性。
本发明提供了一组下调Mortalin/HSPA9/Grp75表达的siRNA分子，所述的siRNA分子靶点位于Mortalin/HSPA9/Grp75 mRNA的编码区。
Mortalin/HSPA9/Grp75基因是Hsp70分子伴侣家族成员之一，首先在小鼠的成纤维细胞中被克隆出来。针对于Mortalin/HSPA9/Grp75的研究发现其生物学功能主要包括分子伴侣功能、抗凋亡的细胞保护功能和稳定细胞骨架等。其序列可参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
所述的siRNA分子靶点选择位点的序列如SEQ ID NO 11-13中任意一条序列所示。所述的siRNA分子靶点选择位点可以为第129-147 bp的碱基序列: GCGGGATTATGCATCAGAA（SEQ ID NO 11）、第463-481 bp的碱基序列: GAGGCTCATGGGAAATTGT（SEQ ID NO 12）或者第685-703 bp的碱基序列: GCCTATGGTCTAGACAAAT（SEQ ID NO 13）。
例如，所述的siRNA分子的序列如SEQ ID NO 5-10中任意一条序列所示。其中，SEQ ID NO 5与SEQ ID NO 6为一对，称为Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA1；SEQ ID NO7与SEQ ID NO 8为一对，称为Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2；SEQ ID NO 9与SEQ ID NO 10为一对，称为Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA3。
本发明还提供了含有上述的siRNA分子的载体。可以采用市售的常规载体，较好的采用减毒或者改造的病毒载体，例如，商品化的慢病毒载体等。
上述的siRNA分子可以应用于增强卵巢癌细胞对药物的敏感性。MTT检测表明，用上述的siRNA分子下调Mortalin/ HSPA9/Grp75的表达后，耐药卵巢癌细胞A2780/cis对化疗药物顺铂的敏感性明显增加。
相应的，本发明提供了一种增加卵巢癌细胞对药物敏感性的方法，即在对卵巢癌细胞加药之前、同时或者之后，加入上述siRNA分子或者其载体。所述“之前”包括在加药之前若干小时至几天，例如1小时到48小时、72小时甚至96小时。所述“之后”包括在加药之后若干小时至几天，例如1小时到48小时、72小时甚至96小时。还包括对卵巢癌细胞加入上述siRNA分子，待其在上述卵巢癌细胞中稳定存在后再加药。
上述siRNA分子可以用于降低卵巢癌细胞侵袭性。体外侵袭实验检测结果显示，用上述的siRNA分子下调Mortalin/ HSPA9/Grp75的表达后，耐药卵巢癌细胞A2780/cis的侵袭性降低。
克隆形成实验检测结果则表明，用上述的siRNA分子下调Mortalin/ HSPA9/Grp75的表达后，卵巢癌细胞的克隆形成能力降低。
本发明的siRNA分子和化疗药物可以组成药物组合物，应用于抑制卵巢癌细胞增殖。相应的，本发明提供了一种抑制卵巢癌细胞增殖的方法，即在卵巢癌细胞培养物中加入该药物组合物。
所述的化疗药物可以是各种目前常用的化疗药物，包括影响DNA结构与功能的、干扰转录和阻止RNA合成的以及抑制蛋白质合成与功能的抗肿瘤药物。例如，在本发明的一个实施中采用的化疗药物是顺铂。
本发明优点在于：通过使用本发明的siRNA分子，可以有效下调耐药卵巢癌细胞中Mortalin/HSPA9/Grp75基因表达。Mortalin/ HSPA9/Grp75表达下调后，耐药卵巢癌细胞侵袭性降低，对化疗药物顺铂的敏感性增加。一系列的实验进一步证实了Mortalin/HSPA9/Grp75表达与卵巢癌细胞耐药相关，下调Mortalin/HSPA9/Grp75可以逆转卵巢癌细胞耐药，Mortalin/HSPA9/Grp75可作为淋巴瘤治疗的新靶点，通过RNA干扰进行分子靶向治疗。同时也说明我们设计的三条序列干扰效果明显。使用本发明可以克服卵巢癌对顺铂的耐药，提高卵巢癌的治疗效果和预后，使用方便且易被患者接受。
附图说明
图1：人耐药卵巢癌细胞株A2780/cis中Mortalin/HSPA9/Grp75的mRNA表达水平明显高于人卵巢癌细胞株A2780的复制曲线部分（amplication curves）。其中，横坐标是循环数，纵坐标是荧光值（fluorescence）。
图2：人耐药卵巢癌细胞株A2780/cis中Mortalin/HSPA9/Grp75的mRNA表达水平明显高于人卵巢癌细胞株A2780的熔解曲线部分（melting curves）。其中，横坐标是温度，纵坐标是荧光值（fluorescence）。与图1结合，A2780/cis与A2780中Mortalin/HSPA9/Grp75的mRNA表达水平的相对差异：2（—△△Ct）=20.11。
图3：人耐药卵巢癌细胞株A2780/cis中Mortalin/HSPA9/Grp75的蛋白表达水平明显高于人卵巢癌细胞株A2780。
图4：Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA1 测序图谱表明载体构建成功。
图5：Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2 测序图谱表明载体构建成功。
图6：Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA3 测序图谱表明载体构建成功。
图7：免疫印迹结果鉴定Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA的干扰活性，显示挑取的三个克隆均有明显干扰活性，其中Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2的干扰活性最强。
图8：MTT结果显示在人耐药卵巢癌细胞A2780/cis中，Mortalin/HSPA9/Grp75下调后肿瘤细胞对顺铂敏感性增加。
图9：细胞侵袭实验结果。显示在人耐药卵巢癌细胞A2780/cis中，Mortalin/HSPA9/Grp75下调表达后肿瘤细胞侵袭性降低。
图10：图9相应的细胞显微镜下图。
图11：克隆形成实验检测结果，显示在人耐药卵巢癌细胞A2780/cis中，Mortalin/HSPA9/Grp75下调表达后肿瘤细胞克隆形成能力明显降低。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。p＜0.05认为具有统计学差异。所有数据采用SpssV13.0软件分析。
（一）细胞株及细胞培养
人耐药卵巢癌细胞株A2780/cis，人卵巢癌细胞株A2780均购自ECACC公司。所有细胞均采用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在5%CO2-95%空气，饱和湿度以及37°C的条件下培养。
（二）试剂
RNA抽提试剂Trizol购自上海华舜生物工程有限公司，RNA逆转录试剂盒购自Fermentas公司，pSlencer 4.1- H1 neo Vector购自Ambion公司，高保真DNA聚合酶购自TAKARA公司，抗-GAPDH，抗- Mortalin/HSPA9/Grp75，抗-Hsp70，抗-Hsp72单克隆抗体购自Abcam公司, 质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Sybr Green购自TOYOBO公司，MTT粉剂购自Amresco公司。
（三）RNA的抽提及逆转录PCR
收集对数生长期细胞，0.01M PBS洗涤2次，加入1ml Trizol冰上裂解细胞20 min。加入200ul氯仿，漩涡振荡器混匀（1 min），静止10 min，4℃离心（12000 g，15 min）。待液体分为三层，取上层水相至1.5mlEP管内，加入200ul异丙醇，振荡混匀，室温静止10 min，离心12000 g，10 min，弃上清。加入1ml 75%的乙醇，振荡混匀1 min，离心12000 g，10 min，弃上清，超净台内风干，根据RNA沉淀的量加入DEPC水溶解。
根据Fermentas公司K1622逆转录试剂盒说明书将提取的RNA逆转录为cDNA。取1ul olig(dT)、模版RNA 11ul，冰上混匀，70℃ 5 min，立即置冰上1 min。轻微离心后加入下列试剂：5×反应buffer 4ul、RNA酶抑制剂1ul、10Mm dNTP混合物 2ul，轻轻混匀。37℃ 5 min后加入逆转录酶1ul，42℃ 1h，70℃ 10min 终止反应，获得cDNA进行real-time PCR。
real-time PCR反应设计的引物：
18S rRNA（内参照） 5'-ATCCCTGAAAAGTTCCAGCA-3'（SEQ ID NO 1）
5'-CCCTCTTGGTGAGGTCAATG-3'（SEQ ID NO 2）
Mortalin/HSPA9/Grp75 5’-ATGGCACTTCAGAGGGTA-3’ （SEQ ID NO 3）
5’-GCACGGGTCAACTTCATA-3’ （SEQ ID NO 4）
real-time PCR 反应体系如下：
| SYBR Green Supermix | 12.5μl | ||
| cDNA | 1μl | ||
| 引物1 | 0.5μl | ||
| 引物2 | 0.5μl | ||
| 灭菌d3H2O | 10.5μl |
总体积 25μl 混匀后轻微离心
热循环参数：
| 预变性 | 94℃ | 5min |
| 变性 | 94℃ | 30s |
| 复性 | 55℃ | 30s |
| 延伸 | 72℃ | 40s 循环40次 |
PCR结束后，通过其特定软件设计解链曲线模板，从65°C开始至90°C获得PCR产物的解链曲线。通过比较Ct值法进行结果分析，即根据设定的阈值获得Ct值，根据下列公式计算：相对的目的基因表达=2-△△Ct，其中△△Ct=（CtsAmple-Ctcontrol）treatment—(CtsAmple—Ctcontrol)normal。同时根据PCR扩增产物的解链曲线判定是否为靶片段的特异性扩增。
（四）免疫印迹
取对数生长期细胞，移去培养基，用0.25%胰酶消化，0.01M PBS吹打细胞，收集至10ml EP管，离心，PBS洗涤细胞两次。根据细胞量加入适量SDS蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂cocktail。SDS-PAGE电泳后，采用半干转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶（TBS/0.1% Tween 20溶解）封闭2小时，之后与一抗在室温下孵育2小时或在4℃孵育过夜，用TBS/0.1% Tween 20洗三遍，每次5min。再室温孵育二抗2小时, TBS/0.1% Tween 20洗三遍，每次5min。用ECL化学发光检测试剂盒检测。
（五）构建Mortalin/HSPA9/Grp75-siRNA-pSilencer小干扰RNA载体
1．siRNA序列设计
siRNA序列按照Promega公司siRNA Target Designer软件进行设计，小干扰RNA序列长19bp，插入片段总长63bp，形成发夹状结构，包括5’酶切位点、干扰序列、发夹结构、干扰序列反向互补序列、保护碱基序列及3’酶切位点。我们同时设计正义链和反义链两条互补的DNA序列，并在5’端加上BamH1限制性酶切位点，3’端加上Hind III酶切位点，siRNA序列由上海生工生物有限公司合成，具体序列如下：
| SiRNA1S | gatcc GCGGGATTATGCATCAGAA tctcttgaa TTCTGATGCATAATCCCGC TTTTTGGAAA a（SEQ ID NO 5） |
| SiRNA1A | agctt TTTCCAAAAA GCGGGATTATGCATCAGAA ttcaagaga TTCTGATGCATAATCCCGC g（SEQ ID NO 6） |
| SiRNA2S | gatcc GAGGCTCATGGGAAATTGT tctcttgaa ACAATTTCCCATGAGCCTC TTTTTGGAAA a（SEQ ID NO 7） |
| SiRNA2A | agctt TTTCCAAAAA GAGGCTCATGGGAAATTGT ttcaagaga ACAATTTCCCATGAGCCTC g（SEQ ID NO8） |
| SiRNA3S | gatcc GCCTATGGTCTAGACAAAT tctcttgaa ATTTGTCTAGACCATAGGC TTTTTGGAAA a（SEQ ID NO 9） |
| SiRNA3A | agctt TTTCCAAAAA GCCTATGGTCTAGACAAAT ttcaagaga ATTTGTCTAGACCATAGGC g（SEQ ID NO 10） |
2．互补DNA序列的复性
合成好的两条互补DNA序列分别加水稀释到100μM浓度，然后各取1μl正义链和1μl反义链混合，加水补足25μl体系，具体如下：
3．复性的DNA片段插入pSilencer 3.1- H1 neo 载体
pSilencer 3.1- H1 neo载体用Bam H1和Hind III双酶切，体系如下：
然后双酶切产物进行琼脂糖电泳，紫外灯下切取载体片段，纯化后与复性的DNA片段连接，连接体系如下：
16℃水浴过夜，连接产物4℃保存备用。
4．感受态细菌的制备
将配好的LB固体培养基高压灭菌后，铺板。无菌铂丝直接蘸取冻存的大肠杆菌Top10株，在LB平板上划线接种，37℃培养16h。从LB平板上挑取一个单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中， 37℃振荡培养12小时左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：100的比例接种于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养90min以上使呈云絮状，估计OD 600=0.3-0.4之间。将菌液转移至一个无菌，用冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置1小时，同时预冷0.1M CaCl2。4℃ 3000g离心10min，弃上清并用枪头尽量吸干净。20ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬沉淀，冰上放置1小时后， 4℃，3000g离心10min。弃去上清，加入2ml冰预冷的0.1M CaCl2，轻轻悬浮细胞，冰上放置2小时，即为感受态细胞，可用于转化。
5．细菌转化
100μl感受态细胞，加入Grp75/PCDNA3质粒1μl，轻轻摇匀，冰上放置45min。轻轻混匀后42℃水浴中热激90s，热激后迅速置于冰上冷却5min。加500μl LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡（100-150rpm）培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp）。将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使其终浓度为50μg/ml，摇匀后铺板。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上。正面向上放置2-3小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37℃培养16-24小时至生长出菌落。挑取单个菌落，接种至5ml含Amp（50μg/ml）的LB液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜
6．质粒小量抽提
按照天根生化科技（北京）有限公司质粒小抽试剂盒操作。简言之，5ml过夜培养菌液12000rpm离心后，弃上清，加入250μL P1充分混匀，再加入250μL P2上下颠倒混匀6-8次。加入350μL P3上下颠倒混匀6-8次，12000rpm离心10分钟后，上清加入过滤柱离心，再用600μL漂洗液PW洗两遍，加入30μL 三蒸水，12000rpm离心2分钟后获得质粒。
获得的质粒，送上海美季生物技术有限公司直接测序。
实施例一 Mortalin/HSPA9/Grp75-siRNA干扰活性的鉴定
1. Mortalin/HSPA9/Grp75-siRNA-pSilencer载体的构建
Mortalin/HSPA9/Grp75小干扰RNA载体pSilencer 3.1- H1 neo全长4.3kb，干扰序列插入以后，在人H1启动子下，在真核细胞内可以表达一个短发夹状小干扰RNA，进而发挥干扰功能。每一干扰序列同时挑3个克隆，由于插入片段长度较小，只有63bp，因此我们通过直接测序的方法判断是否有插入片段及插入片段是否正确，测序结果显示，9个克隆均包含插入片段，且9个克隆序列经Blast比对后都完全正确。用于进行下一步干扰活性的鉴定。
2．Mortalin/HSPA9/Grp75-siRNA转染A2780/cis细胞
A2780／cis细胞接种在六孔板中，待细胞密度达到80%时转染。转染时分4组：正常对照组（A2780/cis）、pSilenser载体对照组（A2780/cis NC）、SiRNA实验组（Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA1；Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2；Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA3 ）。按照invitrogen lipofectamin2000转染试剂说明书进行转染，质粒转染6h后，换成含10%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48h后，换成含G418（终浓度为1mg/ml）和10%FBS的DMEM培养液，继续培养并适时换液，直至空白对照组细胞（未转染细胞）全部死亡。随后，用无限稀释法获得多个单克隆细胞并以500mg/ml的G418维持筛选。
3．免疫印迹
提取A2780、A2780/cis、A2780/cis NC、Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA1、Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2、Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA3细胞的蛋白，方法同前。
4. Mortalin/HSPA9/Grp75-siRNA干扰活性的鉴定
Mortalin/HSPA9/Grp75小干扰RNA的干扰活性通过免疫印记实验进行鉴定，把表达小干扰RNA的Mortalin/HSPA9/Grp75-siRNA-pSilencer载体转染入人耐药卵巢癌细胞A2780/cis细胞中。免疫印迹结果显示，pSilencer对照组（Mortalin/HSPA9/Grp75/NC）Mortalin/HSPA9/Grp75表达水平与A2780/cis一致。而Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA1和Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA3组条带明显减弱，而Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2几乎看不到条带，提示3条干扰序列都能有效的干扰Mortalin/HSPA9/Grp75的表达，并且以Mortalin/HSPA9/Grp75-siRNA2干扰序列的干扰活性最好。而与Mortalin/HSPA9/Grp75同一家族的Hsp70和Hsp72蛋白表达量无明显改变。
实施例二 MTT Mortalin/HSPA9/Grp75下调表达后耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性
检测顺铂对 A2780/s、A2780/cis、Mortalin/HSPA9/Grp75 SiRNA的增殖抑制作用。取对数生长期细胞以5×10 4个/ml密度，每孔200μl接种于96孔板中。24h后弃上清，分别向实验组加入含不同药物浓度的培养液200μl，浓度梯度为5、10、20μmol/L。每组同一浓度药物均设 5个复孔，37℃、5% CO2 条件下培养24h。后每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，于培养箱继续培养4h。4h后弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，振荡10min后，用酶标仪于波长492nm处测定光吸收值(OD值)，分别计算不同顺铂浓度对A2780/s、A2780/cis、Mortalin/HSPA9/Grp75 SiRNA生长的抑制率。细胞存活率(％)=（实验组OD值/对照组OD值）×100。
MTT检测结果显示在顺铂（DDP）5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l作用24后，Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA2组和Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA1组细胞存活率均低于A2780/cis组，均有显著性差异（p<0.05）。结果提示下调表达Mortalin/HSPA9/Grp75后，人耐药卵巢癌细胞A2780/cis对顺铂的敏感性明显增加。
实施例三 侵袭性实验检测Mortalin/HSPA9/Grp75表达下调后耐药卵巢癌细胞侵袭性的改变
检测A2780/s、A2780／cis、Mortalin/HSPA9/Grp75 SiRNA细胞侵袭力的差异。在24孔transwell室聚碳酸酯膜(膜孔径8um)上涂1mg／ml的matrigel 40μl，37℃孵育5h，使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。之后吸出上室残余液体，加70μl不含血清的DMEM水化基底膜， 37℃孵育30 min。取对数生长期的A2780/s、A2780／cis、Mortalin/HSPA9/Grp75 SiRNA细胞，以不加血清的DMEM培养液调整细胞数为l×105个/ml。取200μl细胞悬液接种transwell上室内，下室加入10％FBS的DMEM培养液600μl，37℃ 5℅CO2培养箱中培养24h。24h后弃去孔中培养液，PBS洗2遍，甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min，d2H2O2洗3遍，将滤膜上层细胞用棉签轻轻抹去，400倍光镜下选择膜上下左右中5个不同视野的穿膜细胞数，求平均值。
体外侵袭实验结果显示，Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA组侵袭率明显低于A2780/cis组和Mortalin/HSPA9/Grp75 NC组，有显著性差异（p<0.05）。且Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA组侵袭率略低于A2780组。
实施例四 克隆形成实验检测Mortalin/HSPA9/Grp75表达下调对耐药卵巢癌细胞克隆形成能力的影响
取对数生长期的A2780/s、A2780／cis、Mortalin/HSPA9/Grp75 SiRNA细胞制备细胞悬液。以300个/皿的细胞浓度接种于含10ml培养液的10cm培养皿中，然后以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。将平皿在37℃、5%CO2的培养箱中，静止培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去培养液。PBS洗涤2次，甲醇固定15min。吉姆萨染液染色20min，流水洗去染液，空气干燥，拍照。
克隆形成实验检测结果显示Mortalin/HSPA9/Grp75 siRNA组细胞的克隆形成率最低，明显低于A278/cis组和A2780组。表明，Mortalin/HSPA9/Grp75表达下调能降低卵巢癌细胞的克隆形成能力，说明本发明的SiRNA能够抑制卵巢癌细胞增殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一组下调Mortalin/HSPA9/Grp75表达的siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子靶点位于Mortalin/HSPA9/Grp75 mRNA的编码区。
2.根据权利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子靶点选择位点的序列如SEQ ID NO 11-13中任意一条序列所示。
3.根据权利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子的序列如SEQ ID NO 5-10中任意一条序列所示。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的siRNA分子。
5.一种增加卵巢癌细胞对药物敏感性的方法，其特征在于，在对卵巢癌细胞加药之前、同时或者之后，加入权利要求1所述的siRNA分子或者含有权利要求1所述的siRNA分子的载体。
6.权利要求1所述的siRNA分子的应用，其特征在于，将其应用于增强卵巢癌细胞对药物的敏感性或者降低卵巢癌细胞的侵袭率。
7.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物由权利要求1所述的siRNA分子和化疗药物组成。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的化疗药物是顺铂。
9.权利要求7所述的药物组合物的应用，其特征在于，将该药物组合物应用于抑制卵巢癌细胞增殖。
10.一种抑制卵巢癌细胞增殖的方法，其特征在于，在卵巢癌细胞培养物中加入权利要求7所述的药物组合物。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101052717A (zh) * | 2004-05-11 | 2007-10-10 | α基因株式会社 | 诱发rna干扰的多核苷酸以及使用该多核苷酸的基因表达抑制方法 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101052717A (zh) * | 2004-05-11 | 2007-10-10 | α基因株式会社 | 诱发rna干扰的多核苷酸以及使用该多核苷酸的基因表达抑制方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ANDERS WITTRUP，ET AL: "Magnetic nanoparticle-based isolation of endocytic vesicles reveals a role of the heat shock protein GRP75 in macromolecular delivery", 《PNAS》 * |
| MIKKEL ROHDE，ET AL: "Members of the heat-shock protein 70 family promote cancer cell growth by distinct mechanisms", 《GENES DEV.》 * |
| 王淼舟 等: "热休克蛋白的生物功效及与肿瘤热疗的研究进展", 《实用医学杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107254470A (zh) * | 2017-06-26 | 2017-10-17 | 浙江大学 | 特异性抑制PADI2基因表达的siRNA及其重组载体和应用 |
| CN107254470B (zh) * | 2017-06-26 | 2019-11-26 | 浙江大学 | 特异性抑制PADI2基因表达的siRNA及其重组载体和应用 |
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