WO2005049821A1 - ＲＮＡｉ活性およびｍｉＲＮＡ活性の評価方法 - Google Patents

ＲＮＡｉ活性およびｍｉＲＮＡ活性の評価方法 Download PDF

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target
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rna
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Yuki Naito
Kumiko Tei
Shuhei Zenno
Kaoru Saigo
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Bio-Think Tank Co., Ltd.
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Definitions

  • RNAi is also referred to as “RNA interference”.
  • miRNA is also referred to as microRNA.
  • RNA interference double-stranded RNA (double-stranded RNA; hereinafter referred to as "dsRNA”) consisting of sense RNA and antisense RNA, whose function has been inhibited and homologous to a specific region of the gene, is a transcript of the target gene.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • the phenomenon of interference destruction of the homologous portion of mRNA was first proposed in 1998 by experiments using nematodes (Non-Patent Document 1).
  • the RNAi method which utilizes this phenomenon to inhibit the expression of a desired gene, has attracted attention.
  • transfection of long dsRNA of about 30 base pairs or more into cells induces interferon response, and the cells die by apoptosis, making it difficult to use the RNAi method. .
  • RNA interference can occur between mouse embryos and cultured mammalian cells, and it has been revealed that the mechanism of inducing RNA interference itself exists in mammalian cells. It has now been shown that short double-stranded RNA (short interfering RNA, hereinafter referred to as “siRNA”) of approximately 21-23 base pairs can induce RNA interference in mammalian cell lines without cytotoxicity. It has become possible to use the RNAi method in mammals (Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3).
  • RNA of 20 or more bases which is not translated into protein, is involved in translational suppression or degradation of mRNA.
  • miRNA miRNA
  • Non-patent Document 4 Non-patent Document 5
  • Non-Special Publication 1 Fire, A. et ai., Potent and specinc genetic interference
  • Non-Patent Document 2 Zamore, PD et al, RNAi: double-stranded RNA directs the
  • Non-Patent Document 3 Elbashir, S.M.et al.,: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate
  • Patent Document 4 Gnshok, A. et al., The rde-1 gene, RNA amplification in ds RNAinterference regulate expression of the small temporal RNAs that control
  • Non-Patent Document 5 Rhoades, M.W. et al., Prediction of plant micro RNA targets,
  • RNAi method is a technology expected to have various applications.
  • dsRNA and siRNA homologous to a particular region of a gene show RNA interference effects in most sequences, whereas they were randomly selected in mammals (21). 70-80% of the base siRNAs do not show RNA interference effects.
  • This is a major problem when performing gene function analysis using RNAi in mammals.
  • it may be difficult to evaluate the efficacy of siRNA, because the expression level and stability of mRNA vary depending on the gene.
  • the function of miRNA is still elucidated functionally, and there is a need for a method for easily evaluating the activity of miRNA.
  • an object of the present invention is to provide a method for easily evaluating RNAi activity and miRNA activity.
  • the present inventors have conducted intensive studies, and introduced a molecule to be evaluated and a polynucleotide containing a target sequence into an expression system.
  • a simple method for evaluating whether a molecule has RNAi or miRNA activity with respect to a target sequence has been found. That is, the present invention provides the following methods for evaluating RNAi activity and miRNA activity.
  • RNA containing the target sequence At least a target sequence and an expression control region that regulates the expression of RNA containing the target sequence
  • a target expression molecule which is a polynucleotide comprising a region
  • the target expression molecule supplies an RNA containing the target sequence into an expression system capable of expressing the RNA, and detects whether the RNA containing the target sequence has been cleaved,
  • the target expression molecule comprises a PCR primer-corresponding region having a sequence capable of annealing the PCR primer, upstream and downstream of the target sequence, respectively.
  • RNA containing the target sequence generated by supplying the target expression molecule and the nucleic acid molecule to be evaluated to the expression system by RT-PCR using a pair of primers that anneal to the sequence of the region corresponding to the PCR primer
  • RNAi activity according to (1) above, wherein the nucleic acid molecule to be evaluated is not supplied to the expression system, and whether or not RNA containing the target sequence is cleaved is detected as compared with the case.
  • RNAi activity A sequence for which the mRNA to be transcribed is not cleaved by the nucleic acid molecule to be evaluated, and a control supply molecule containing a control sequence encoding a detectable expression product, the target expression molecule and the nucleic acid molecule to be evaluated.
  • RNA transcribed by the target expression molecule is cleaved by the nucleic acid molecule to be evaluated.
  • the method for evaluating RNAi activity according to any one of (1) to (5) above, wherein the method comprises a control sequence comprising a sequence and encoding a detectable expression product.
  • a target expression molecule which is a polynucleotide comprising:
  • the target expression molecule is supplied into an expression system capable of expressing RNA containing a target sequence, and it is detected whether or not the expression of the reporter is suppressed.
  • the method for evaluating miRNA activity according to any one of (9) to (12) above, wherein the target sequence has a base sequence different from a base sequence of the nucleic acid molecule to be evaluated.
  • the present invention provides a method for easily evaluating RNAi activity or miRNA activity.
  • the method of the present invention particularly facilitates the evaluation of RNAi or miRNA activity targeting any sequence, regardless of the sequence origin or type, such as a sequence derived from an endogenous gene or an artificial sequence. It is excellent in that it can be done. Since the evaluation method of the present invention is simple, a large amount of tests can be performed in a short time. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a target expression molecule.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a target expression molecule; PCR fragment 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of PCR fragment 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the number of PCR cycles and the amount of PCR products.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a target expression molecule into which a puromycin resistance gene (“puro”) has been incorporated as a reporter.
  • puro puromycin resistance gene
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a target expression molecule in which EGFP (“EGFP”) has been incorporated as a reporter.
  • EGFP EGFP
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of a target expression molecule in which a firefly luciferase gene (“F. Luc”) has been incorporated as a reporter.
  • F. Luc firefly luciferase gene
  • FIG. 8 is a view showing the structure of a target expression vector pTREC.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of PCR in the case of! /, Na! / In which the one-sided intron of the primer was designed in the manner described in 2. (2) of Example 1;
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of PCR when primers are designed so as to sandwich a one-force intron in 2. (2) of Example 1.
  • FIG. 11 shows the sequence and structure of siRNA; siVIM-35.
  • FIG. 12 shows the sequence and structure of siRNA; siVIM-812.
  • FIG. 13 shows the sequence and structure of siRNA; siControl.
  • FIG. 14 shows RNAi activities of siVIM-812 and siVIM-35 against the luciferase gene.
  • FIG. 15 is a diagram showing RNAi activities of siControl, siVIM-812, and siVIM-35 against vimentin.
  • FIG. 16 shows the results of antibody staining.
  • the target expression molecule and the nucleic acid molecule to be evaluated are supplied to an expression system capable of expressing RNA, and the RNA expressed by the target expression molecule is converted by the nucleic acid molecule to be evaluated. Detects whether the connection has been disconnected.
  • the target expression molecule is a molecule that expresses RNA having a sequence to be a target of RNAi (hereinafter sometimes referred to as "target sequence").
  • the target expression molecule may be any polynucleotide that can provide RNA of the target sequence to the expression system, and is more preferably a DNA from the viewpoint of stability, operability, etc. More specifically, an expression vector And the like are preferably used. There are already many expression vectors, such as those commercially available. When expression is performed using an expression vector, the expression vector can be appropriately selected depending on, for example, the type of a cultured cell system or the conditions of a cell-free system. In order to insert a target sequence or other predetermined sequences, the target expression molecule preferably has a multicloning site (sometimes abbreviated as “MCS”). As a specific example of the vector, for example, pCI-neo is used.
  • MCS multicloning site
  • the target expression molecule includes at least a target sequence and an expression control region that regulates the expression of RNA containing the target sequence.
  • the target sequence is arbitrary, and the person performing the evaluation can arbitrarily select a sequence from a desired gene or the like.
  • a sequence searched by the following “3. Method for searching for target base sequence for RNA interference” can be selected, and the ability of the searched sequence to actually become the target of RNAi can be tested. It will be confirmed in the system.
  • the target expression molecule has an expression control region for expressing RNA containing the target sequence.
  • the expression control region is composed of, for example, a promoter, an enhancer, a poly A region and the like. A promoter, an enhancer and the like are appropriately selected depending on conditions such as a vector and a host.
  • other sequences that can be incorporated into a vector such as a terminator, may be incorporated into the target expression molecule.
  • the promoter may be any promoter as long as it is appropriate for the cultured cell used for gene expression.
  • the promoter includes the SRa promoter, SV40 promoter, HIV'LTR promoter, CMV (cytomegaloinoles) promoter, HSV-TK promoter, CAG promoter and the like.
  • the nucleic acid molecule to be evaluated is a nucleic acid molecule having a sequence whose RNAi activity is to be evaluated.
  • the nucleic acid molecule is a molecule mainly composed of a nucleic acid, and is mainly composed of RNA, but may be a hybrid molecule or chimeric molecule of RNA and DNA, or a modified molecule thereof.
  • the denatured molecule includes not only a denatured molecule in which a double strand does not form a complete base pair, but also a molecule in which a part of a nucleotide is modified.
  • RNAi activity for example, a siRNA candidate molecule for which the degree of RNAi activity to the above target sequence is to be evaluated, or a nucleic acid molecule expressing a siRNA candidate molecule, a molecule discovered by chance, or an RNAi activity
  • a variety of molecules, such as molecules designed to have the above, can also be candidate molecules.
  • Examples of a method for designing a sequence having a high probability of having RNAi activity include the following "4. Method for designing nucleotide sequence of polynucleotide causing RNA interference". That is, the evaluation method of the present invention was obtained according to the methods described in the following “4. Method for designing base sequence of polynucleotide causing RNA interference” and “5. Method for producing double-stranded polynucleotide”. It is also suitably used as a method for easily confirming the RNAi activity of a molecule having a high probability of having siRNA activity in an experimental system.
  • the nucleic acid molecule to be evaluated is to provide an RNAi candidate molecule to the expression system, and may be in the form of siRNA itself! /, Or a vector that expresses a molecule in the form of siRNA. It may be one.
  • the target expression molecule and the nucleic acid molecule to be evaluated can also be supplied from the target expression molecule to an expression system capable of expressing RNA containing the target sequence.
  • the expression system in which RNA can be expressed may be a cell system or a cell-free system, but it must have at least conditions for mRNA transcription. Therefore, the expression system contains materials for synthesizing RNA molecules, enzymes and the like.
  • the target expression molecule can be expressed in a suitable cultured cell.
  • the method of supplying the target nucleic acid molecule and the evaluation target nucleic acid molecule to the cultured cells can be a general method such as transfection for introducing the molecule into the cell.
  • the cell-free system is, for example, a system obtained by adding a cell extract, ribonucleic acid, RNA polymerase, ATP, or the like to a predetermined buffer or the like outside a cell such as in a test tube.
  • a host cell examples include insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera S19; CHO, COS SHeLa ⁇ C127, Animal cells such as NIH3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells and blood cells; and plant cells.
  • RNA containing the target sequence is transcribed. Then, if the nucleic acid molecule to be evaluated introduced into the expression system also interferes with the sequence to be evaluated, the RNA containing the target sequence is cleaved, and if it does not interfere, it is not cleaved. Therefore, whether or not the nucleic acid molecule to be evaluated has RNAi activity or the degree of RNAi activity can be evaluated by detecting whether or not the mRNA has been cleaved.
  • Methods for detecting whether RNA has been cleaved or not include a method for qualitatively or quantitatively measuring RNA expression, and a method in which a predetermined reporter transcribed together with a target sequence is incorporated into a target expression molecule. And a method of qualitatively or quantitatively measuring the reporter. Specific detection methods and forms suitable for them will be described in detail below.
  • RNAi activity Even if a candidate molecule having RNAi activity is directly administered to a cell or a living body having the endogenous gene and targeting the endogenous gene, the expression level of the endogenous gene may be small, If the stability is low, it is difficult to evaluate the effect of RNAi. In addition, in a cultured cell line with low transfection efficiency, even if it has RNAi activity, the effect of suppressing the endogenous gene by siRNA is hardly visible. In addition, when the expression level of RNA is to be measured by, for example, RT-PCR (reverse transcribed-PCR), protocols such as primer combinations and PCR cycle conditions according to the target endogenous gene are used. Need to be adjusted significantly. That is, for example, if there are 10,000 types of endogenous genes to be targeted, a combination of 10,000 types of primers and extensive examination of PCR cycle conditions will be required.
  • RT-PCR reverse transcribed-PCR
  • the evaluation method of the present invention is a simple method that can measure RNAi activity using a simple experimental system such as a cloning gene expression system.
  • a simple experimental system such as a cloning gene expression system.
  • RNAi activity can be evaluated for a large number of target sequences by a certain protocol except for recombining a desired target sequence.
  • RNAi activity can be appropriately evaluated even for endogenous genes with low expression levels in vivo. .
  • the method of the present invention makes it relatively easy to remove a cell line or a cell-free system. Can be prepared.
  • RNAi is a field that has been studied for various uses, such as knockout technology of genes and its use as medicines, and is a field with the potential to achieve remarkable development in the future.
  • the evaluation method of the present invention is based on RNAi-related technologies. It greatly contributes to development.
  • RNA containing the target sequence has been cleaved by using RT-PCR.
  • cDNA corresponding to the transcribed RNA is amplified by PCR, and the amplified DNA is detected to determine whether or not the RNA has been cleaved.
  • the target expression molecule has a region corresponding to a PCR primer having a sequence capable of annealing a PCR primer at each of upstream and downstream of the target sequence.
  • the primer sequence is not particularly limited, and is appropriately set according to PCR conditions and the like.
  • the intron is inserted between at least one of the regions corresponding to the PCR primers upstream and downstream of the target sequence.
  • To be sandwiched means to be incorporated so as to divide the region corresponding to the PCR primer but not to the end of the region corresponding to the PCR primer.
  • Introns can be found in eukaryotic gene DNA.
  • the intron used in the present invention is not particularly limited as long as it has no amino acid sequence information and is a sequence that is removed in splicing of mRNA.
  • an expression system capable of splicing RNA is used as the expression system.
  • an expression system capable of splicing a eukaryotic expression vector host system which has been confirmed to perform RNA splicing may be used.
  • a cell-free system a system containing at least spliceosomes required for splicing may be constructed. Further, as the cell-free system, a mixed solution containing crushed eukaryotic cells may be used.
  • FIG. 1 shows a design example when an expression vector is used as a target expression molecule.
  • a promoter and enhancer (“proZenh") are incorporated as expression control regions! Downstream of the expression control region, a primer-corresponding region (“PAR (F) 1”: primer annealing region (F) l) for the forward primer with an intron (“intron”) inserted is incorporated.
  • a multi-cloning site (“MCS”) is located downstream of the primer-corresponding region (“PAR (F) 1”) of the forward primer, and a desired target can be obtained using a multi-cloning site (“MCS”).
  • MCS multi-cloning site
  • the sequence is incorporated. Downstream of the target sequence (“target”) is a primer-corresponding region (“PAR (R) 1”: primer annealing region (R) l) corresponding to the reverse primer.
  • FIGS. 2 and 3 show combinations of PCR-based fragments as target expression molecules.
  • the combination of FIG. 2 and FIG. 3 is based on the PCR method and includes an internal standard control (hereinafter, “internal control”; also referred to as “internal control”) for normalizing the detection signal.
  • internal control also referred to as “internal control”
  • FIG. 2 shows PCR fragment 1 (“PCR fragment 1”), which is a target expression molecule containing a target sequence having 23 bases.
  • FIG. 3 shows PCR fragment 2 (“PCR fragment 2”) used as a control when the expression level of the target sequence site is relatively quantified. By using the control, the variation of transfusion efficiency, RNA It is possible to correct errors between sample samples, such as variations in the yield of the sample.
  • PCR fragments 1 and 2 are constructed of double-stranded DNA.
  • PCR fragment 1 has a promoter and Enhansa ( "P RoZenh”), having a primer corresponding region corresponding to the forward primer downstream thereof ( "PAR (F) 1").
  • an intron is sandwiched inside the forward primer corresponding region (“PAR (F) 1"), and PCR fragment 1 itself is designed so as not to function as a type I PCR. T! In the example shown in FIG. 2, the intron may be sandwiched between forces PAR (R) 1 sandwiched between PAR (F) 1. Downstream of the primer-corresponding region (“PAR (F) 1”) corresponding to the forward primer, a target sequence (“target”) is incorporated. Downstream of the target sequence (“target”), a primer-corresponding region (“PAR (R) 1”) corresponding to the reverse primer is incorporated. Further downstream is a poly A signal (“poly A”) sequence.
  • PCR fragment 2 shown in Figure 3 incorporates the neomycin resistance gene ("neo") used as a control for relative quantification.
  • neo neomycin resistance gene
  • PCR fragments 1 and 2 introduce both into an expression system capable of expressing RNA.
  • the embodiment for normalizing the detection signal will be described in detail in “13. Normalization of detection signal by internal control” below.
  • RNA is recovered from the expression system to which the target expression molecule and the nucleic acid molecule to be evaluated are supplied, reverse transcription is performed, and a pair of primers that anneal to the sequence of the region corresponding to the PCR primer is supplied.
  • RT Perform PCR to quantify the polynucleotide containing the target sequence.
  • the expression system may be a cell-free expression system or a cell-based expression system.
  • RT PCR is performed using reverse transcriptase and oligo (dT) primers or random hexamers to generate cDNA. DNA is amplified by PCR using the generated cDNA as type III, and mRNA can be quantified by kinetic evaluation of amplification. Other conditions of RT-PCR, such as temperature and total, may be adjusted appropriately.
  • RT-PCR is also performed for the system that does not supply the nucleic acid molecule to be evaluated. Then, it is detected whether or not the RNA containing the target sequence has been cleaved, as compared with the case where the nucleic acid molecule to be evaluated is not supplied to the expression system.
  • RNAi Have no activity! / ⁇ turned out!
  • the method for detecting RNAi activity using RT-PCR is not particularly limited.
  • the nucleic acid molecule to be evaluated exerts sufficient RNAi activity, it often appears as a delay in amplification of the DNA containing the target sequence.
  • the time-dependent change in the amount of amplified DNA is measured.
  • RNAi activity can be evaluated.
  • Figure 4 shows an example of the evaluation method.
  • FIG. 4 exemplarily shows the time-dependent change in the amount of amplified DNA.
  • the horizontal axis represents the number of PCR cycles, and the vertical axis represents the amount of DNA (PCR product amount).
  • the curve shown in (I) shows the result of the system without supplying the nucleic acid molecule to be evaluated
  • the curve shown in (II) shows the result in the case of supplying a molecule having RNAi activity.
  • DNA amplification appears with a delay as shown in the curve in FIG. 4 (II). This is because the nucleic acid molecule to be evaluated cleaves RNA transcribed from the target expression molecule, resulting in a decrease in the type of RT-PCR. Therefore, the degree of this delay can be an indicator of the degree of RNAi activity.
  • the amount of DNA may increase despite the presence of RNAi activity, depending on the degree of activity, etc., due to the appearance of molecules that can escape RNAi, and if a single type I is formed, it can be easily amplified by PCR. This is because
  • the expression of a reporter-detectable expression product should be incorporated into the target expression molecule at a position where it is transcribed as mRNA integrated with the target sequence, and the expression of the reporter should be detected.
  • the expression system may be a cell-free expression system or a cell expression system.
  • the reporter is not particularly limited as long as its expression can be detected. Examples thereof include various fluorescent proteins, luminescent proteins, synthases, degrading enzymes, and resistance genes. It is. More specifically, as a reporter, for example, EGFP (Enhanced Green
  • Green jellyfish-derived green fluorescent protein gene such as Fluorescent Protein (Enhanced Green Fluorescent Protein), Discoma
  • DsRed red fluorescent protein gene
  • HcRed Heteractis crispa-derived near-infrared fluorescent protein gene
  • Firefly luciferase gene Firefly luciferase gene
  • renifunorenfuef 1 ⁇ fzs Rennla Lucifer as e gene
  • pu- ⁇ romycin resistance gene blasticidin S resistance gene
  • hygromycin resistance gene j8 galactosidase gene
  • chloramphene-coal acetyltransferase gene alkaline phosphatase gene and variants thereof.
  • Many can be used as suitable ones.
  • the reporter is provided at a position transcribed as mRNA integral with the target sequence in the target expression molecule. Therefore, when the mRNA coding for the target sequence is cleaved, translation of the reporter sequence is inhibited, and if the expression product of the reporter is not detected or suppressed, it appears as a phenomena.
  • Detection of a reporter is appropriately selected depending on the type of the reporter. For example, if the reporter is a fluorescent protein or the like, the expression of the reporter can be detected by measuring the fluorescence intensity. If the reporter is a resistance gene, the expression of the reporter can be detected by assessing the resistance of cells into which the resistance gene has been introduced. When a producing enzyme or a degrading enzyme is used as a reporter, expression of the reporter can be detected by quantifying a product produced by a reaction catalyzed by these enzymes. In any case, the measurement can be performed quantitatively or qualitatively. In the case of quantitative measurement, it is preferable that the difference in the amount be reflected as the degree of RNAi activity.
  • FIGS. 5 to 7 show examples of the construction of an expression vector incorporating a reporter as a target expression molecule.
  • Figure 5 shows an expression vector that incorporates a puromycin resistance gene (“puro”) as a reporter. From upstream, it has a promoter and enhancer ("pro / en hj"), Kozak sequence and ATG ("Kozak + ATG”) to facilitate translation, and a multicloning site (“MCS”). Using a multicloning site (“MCS”), the target sequence (“target”) and the puromycin resistance gene (“puro”) Incorporated. Downstream of the puromycin resistance gene is a poly A signal (“poly Aj”), and a neomycin resistance gene (“neo").
  • poly Aj poly A signal
  • neo neomycin resistance gene
  • the expression vector and the nucleic acid molecule to be evaluated shown in Fig. 5 are introduced into a cultured cell line, and it is determined whether or not the cell has resistance to divulgomycin.
  • the nucleic acid molecule to be evaluated does not have RNAi activity
  • the puromycin resistance gene is expressed, and the cells have puromycin resistance, so that they can be grown on a puromycin-containing medium.
  • the nucleic acid molecule to be evaluated has RNAi activity
  • the mRNA encoded by the puromycin resistance gene is not translated because the mRNA is cleaved at the target sequence. Therefore, the host cells do not have puromycin resistance, and the phenomenon that the cells cannot survive or the proliferation is suppressed appears. Based on this difference in growth, the presence or absence of RNAi activity can be determined.
  • the expression vector shown in Figure 5 contains a neomycin resistance gene ("neo").
  • the expression vector shown in FIG. 6 has the EGFP gene incorporated as a reporter. That is, the EGFP gene ("EGFP") is inserted at a position where it is transcribed together with the target sequence. RNAi activity can be detected by detecting the amount of EGFP fluorescence. The measurement of the amount of fluorescence can be performed according to a usual method.
  • a puromycin resistance gene (“puro”) is incorporated as a resistance gene under the control of an expression control region separate from the EGFP gene, allowing selection (enrichment) of transfatated cells with puromycin. is there.
  • the expression vector shown in Fig. 6 contains a region corresponding to the forward primer ("PAR (F) 1") in which an intron (“intron”) is inserted, and a region corresponding to the reverse primer (“PAR (R) 1"). ) Is incorporated. That is, the above-described detection by RT-PCR can also be performed using the expression vector of FIG.
  • the puromycin resistance gene (“puro”) contains PAR (F) 3 and PAR (R) 3 flanked by introns.
  • the RNA of the resistance gene can be quantified and used as an internal control.
  • by selecting cells for puromycin resistance it is possible to increase the proportion of cells into which the expression vector or the like has been introduced. Can do. Other points are the same as those in the example of FIG.
  • the expression vector shown in Fig. 7 incorporates a firefly luciferase gene ("F. LucJ: Firefly Luciferase gene”) as a reporter. That is, it is transcribed together with a target sequence ("target”). The position incorporates the firefly luciferase gene ("F. Luc”). In addition, a renilla luciferase gene (R. LucJ:
  • Renilla Luciferase gene is incorporated.
  • RNAi activity can be determined by measuring luminescence using a luminometer or the like according to the luciferase assay. If the emission of firefly luciferase is detected, it is determined that there is no RNAi activity. When the emission of firefly luciferase is not suppressed or detected, it is determined that the RNAi activity is present. The luminescence of Renilla luciferase can be used as an internal control.
  • luciferase Atsay is a simpler Atsay method than RT-PCR, and can be used as a higher-throughput evaluation method. Other points are the same as FIG. 5 or FIG.
  • RNA yield RNA yield
  • the target expression molecule and the nucleic acid molecule to be evaluated are supplied to the expression system, and the target expression molecule is obtained.
  • Expression of the specified RNA By the way, when there is RNAi activity, the RNA is cleaved, and the presence of RNAi activity is determined as a phenomenon such as suppression of amplification of a predetermined DNA or no detection of an expression product.
  • the target expression molecules etc. were originally supplied to the expression system properly for some reason! Pana! ⁇ ⁇ There are cases!
  • the control supply molecule containing a control sequence encoding a detectable expression product, wherein the RNA to be transcribed is a sequence that is not cleaved by the nucleic acid molecule to be evaluated,
  • the target expression molecule and the nucleic acid molecule to be evaluated are supplied into an expression system to be supplied.
  • the control supply molecule is a polynucleotide containing a control sequence.
  • the control sequence encodes a detectable expression product.
  • Expression products include, for example, RNA, polypeptides, proteins, and the like.
  • the control sequence is such that at least mRNA is not cleaved by the nucleic acid molecule to be evaluated which is also supplied to the expression system. That is, in the embodiment of the introduction confirmation system, the nucleic acid molecule to be evaluated does not receive RNAi and supplies the molecule.
  • the reporter exemplified in the above “12” can be used.
  • the detection of the expression product is appropriately selected depending on the type of the expression product.
  • the sequence that is not cleaved by the nucleic acid molecule to be evaluated may be a sequence confirmed by an experiment.
  • a sequence in which a nucleic acid molecule to be evaluated does not show RNAi activity can be easily detected by the evaluation method of the present invention. Therefore, a sequence that has been confirmed in advance to show no RNAi activity in the evaluation method of the present invention is used. be able to.
  • the fact that the target nucleic acid molecule does not show RNAi activity can be determined by the phenomenon of amplification of DNA by RT-PCR and detection of expression products, so that false positive problems do not occur and discrimination is easy.
  • PCR fragment 2 shown in FIG. 3 is used as a control supply molecule.
  • PCR fragment 2 shown in FIG. 3 is used as a control supply molecule.
  • PCR is performed using a combination of PAR (F) 2 and PAR (R) 2 for the control sequence site! ⁇
  • the error between the samples can be normalized. Then, the comparison can be performed more accurately.
  • RNA yield variations in the transfection efficiency of target expressed molecules and nucleic acid molecules to be evaluated, variations in the number of cells at the time of collection, variations in RNA yield after RNA extraction (RNA yield), PCR templates It is possible to normalize errors between samples such as variations in the amount of cDNA added.
  • PCR fragment 2 has a neomycin resistance gene.
  • PCR primers are designed for PAR (F) 2 and PAR (R) 2 using the sequence in the neomycin resistance gene as it is.
  • control supply molecule may be prepared separately from the target expression molecule and supplied to the expression system.
  • a control sequence may be incorporated into the target expression molecule.
  • a control sequence and an expression control region for expressing the control sequence may be provided in the target expression molecule.
  • the control sequence is the same as the control sequence contained in the control supply molecule.
  • the target expression molecule comprising the PCR fragment shown in FIGS. 2 and 3 has an advantage in that it can be easily prepared by PCR without constructing a vector.
  • target expression molecule examples include the forms shown in Figs. 6 and 7, for example.
  • the puromycin resistance gene (“puro”) is incorporated in the target expression molecule, and the puromycin metabolism gene (“puro”) contains introns (“intron”) and PAR. (F) 3 and PAR (R) 3 are provided and can be used as internal control.
  • an intron is incorporated in PAR (F) 3.
  • the other points in the method of regular dani by internal control are shown in FIG. This is the same as the description of the regular example in the third example.
  • the target expressed molecule contains a renilla luciferase gene ("R. Lucj"), which is an internal control of the firefly luciferase gene.
  • R. Lucj renilla luciferase gene
  • PAR (F) 4 PAR (R) 4 and introns in the Renilla luciferase gene integrated into the target expressed molecule.
  • Luminescence value of Firefly luciferase Z Luminescence of Renilla luciferase By calculating the “degree value”, the relative activity of luciferase can also be determined. More accurate data comparisons are possible based on the normalized values.
  • SiRNAs having RNAi activity, RNAi vectors expressing the siRNAs, and the like can suppress the expression of a predetermined gene, and thus are expected to be used as gene therapy drugs and the like.
  • siRNAs in order to be used as a therapeutic agent, it is required that certain siRNAs act on other genes in the living body and do not cause side effects.
  • RNAi can occur even between similar sequences. Therefore, it is important to evaluate the similarity range in which RNAi occurs from the viewpoint of preventing the above-mentioned side effects.
  • a nucleic acid molecule to be evaluated having a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence of the target sequence is used.
  • a base sequence different from the target sequence is used as an evaluation target.
  • the present invention also provides a method for evaluating miRNA activity.
  • a molecule whose miRNA activity is to be measured is used as the nucleic acid molecule to be evaluated in the above-described method for evaluating RNAi activity. That is, in the method for evaluating miRNA activity of the present invention, at least a target sequence, an expression regulatory region that regulates the expression of RNA containing the target sequence, and a position transcribed as mRNA integral with the target sequence as a reporter.
  • a target expression molecule which is a polynucleotide comprising a sequence encoding a detectable expression product; Supplying the target nucleic acid molecule to be evaluated whether or not the RNA containing the target sequence has miRNA activity to an expression system capable of expressing the target sequence-containing RNA. Then, it is detected whether or not the expression of the reporter is suppressed.
  • miRNA is not translated into protein, and is known as RNA of 20 or more bases! Accordingly, as the nucleic acid molecule to be evaluated, RNA of 20 or more bases that is not translated into a protein, a miRNA precursor having a hairpin structure, or the like is used. In addition, using an expression vector that expresses such RNA, supply it to an expression system that supplies a target sequence expression molecule.
  • miRNA is considered to mainly act as a translation inhibitor
  • the evaluation of miRNA activity involves detecting whether or not expression of a protein encoded by RNA containing a target sequence is suppressed. This is suitable for performing more accurate evaluation. That is, a sequence encoding an expression product that can be detected as a reporter is incorporated into a target expression molecule at a position where the mRNA is transcribed as an integral mRNA with the target sequence.
  • the miRNA activity can be detected in the same manner as in the method for evaluating the RNAi activity described in the section “12 Reporter Method”. If there is miRNA activity, the determination is made in such a form that the reporter is not detected or the expression of the reporter is suppressed.
  • the expression system to which the target expression molecule or the like is supplied may be a cell-free expression system or a cell expression system.
  • an experimental system for detection signal normalization by internal control (see “1-3” above) can be constructed in the same manner as in the method for evaluating RNAi activity.
  • the control sequence consists of a sequence that is not suppressed by the nucleic acid molecule to be evaluated, and encodes a detectable expression product.
  • an experimental system for a side effect confirmation system can be constructed similarly to the method for evaluating RNAi activity.
  • the method for searching for a target nucleotide sequence of the present RNA interference is a method for searching a nucleotide sequence of a target gene for a nucleotide sequence that causes RNA interference.
  • the present searching method a sequence site that follows the rules (a) and (d) below is searched from the base sequence of the target gene for RNA interference.
  • Basic power at 3 'end It is adenine, thymine or peracyl.
  • the number of bases is a number that can cause RNA interference without causing cytotoxicity.
  • the "gene” in the “target gene” refers to a medium that encodes genetic information.
  • a “gene” is composed of a substance that encodes genetic information such as DNA, RNA, or a complex of DNA and RNA. Etc.
  • a “target gene” may be a single coding region, may span multiple coding regions, and may target any polynucleotide whose sequence is known.
  • RNA interference is known as a phenomenon that disrupts mRNA by interference, and the search load can be reduced by selecting a specific coding region.
  • a set of transcription regions may be searched as a target gene.
  • a base sequence that satisfies the above rules (a) to (d) is referred to as a “prescribed sequence”.
  • the nucleotide sequence is a DNA sequence, then if it is a thymine mosquito RNA sequence, peracil corresponds.
  • Rule (c) stipulates that the sequence near the 3 'end contains a rich base selected from the group consisting of adenine, thymine, and peracyl. As one index, it is defined that a base selected from adenine, thymine, and peracida is a rich sequence within a range of 7 bases from the 3 ′ end.
  • “rich sequence” means that a specific base frequently appears !, and when the ratio is schematically shown, the 3 ′ terminal side of the defined sequence It means that one or two or more selected from the group consisting of adenine, thymine and peracilka are contained in a sequence of 5 to 10 bases, preferably 7 bases, at least 40% or more, more preferably 50% or more. More specifically, for example, in the case of a defined sequence of about 19 bases, of the 7 bases on the 3′-terminal side, preferably at least 3 bases or more, more preferably 4 bases or more, particularly preferably Or more than 5 bases One or more selected from the group consisting of adenine, thymine and perillaca.
  • the means for confirming whether or not the rule (c) is satisfied is not particularly limited, and preferably 3 or more bases, more preferably 4 or more bases, and particularly preferably 5 or more bases out of 7 bases. It is only necessary to be able to confirm that it is a For example, a case where one or more kinds selected from the group consisting of ryzanine, thymine and perillaca is defined as being rich when three or more contained in the sequence of 7 bases at the 3 'terminal side is defined as rich. To explain, the first base force at the 3 'end is checked sequentially to see if it is any of the above three bases, and if three appear up to the seventh base, the rule (c ) Can be determined.
  • adenine and thymine or peracyl form a complementary hydrogen bond.
  • three hydrogen bonding sites are formed in the complementary hydrogen bond between guanine and cytosine (G-C hydrogen bond), whereas the complementary hydrogen bond between adenine and thymine or peracyl (A— (TZU ) Hydrogen bond) has two hydrogen bonding sites.
  • the ⁇ - (TZU) hydrogen bond has a weaker bonding force than the GC hydrogen bond.
  • the number of bases in the base sequence to be searched is defined!
  • the number of bases in the base sequence to be searched is the number of bases that can cause RNA interference.
  • an siRNA having an excessively large number of bases causes cytotoxicity depending on conditions such as the type of organism.
  • the upper limit of the number of bases varies depending on the type of organism in which RNA interference is to be caused, it is preferable that the number of bases of a single strand constituting the siRNA be 30 or less, regardless of the kind of deviation. In the case of mammals, the number of bases is preferably 24 or less, more preferably 22 or less.
  • the lower limit is not particularly limited as long as it causes RNA interference, but is preferably 15 or more, more preferably 18 or more, and further preferably 20 or more. It is particularly preferable to search for the number of bases as a single strand constituting siRNA by 21. Yes.
  • the force siRNA described below also has an overhang portion at the 3 'end of the specified sequence. It is preferable that the overhang portion has 2 bases. Therefore, the upper limit of the number of bases of only the defined sequence without including the overhang portion is preferably 28 or less, more preferably 22 or less, and still more preferably 20 or less, and the lower limit is preferably 13 or less. The number is preferably 16 or more, more preferably 18 or more. The most preferred number of bases in the defined sequence is 19.
  • the search for the target nucleotide sequence of RNAi may be performed with a difference between when the overhang portion is included and when it is not included.
  • a base sequence according to the prescribed sequence has an extremely high probability of causing RNA interference. Therefore, this search method can detect a sequence that causes RNA interference with an extremely high probability, and can simplify the design of a polynucleotide that causes RNA interference.
  • the defined sequence can be efficiently detected by using a computer equipped with a program that searches for a portion that complies with the above rules (a) to (c) after determining the number of bases. .
  • the present nucleotide sequence designing method is to design the nucleotide sequence of a polynucleotide (siRNA) that causes RNA interference based on the nucleotide sequence searched by the above search method.
  • siRNA mainly includes hybrid polynucleotides that partially contain DNA.
  • a nucleotide sequence according to the rules (a) to (d) is searched from the nucleotide sequence of the target gene, and a nucleotide sequence homologous to the searched nucleotide sequence is designed.
  • the rules and search methods (a) to (d) are as described for the search method above.
  • the "homologous sequence” refers to the same sequence and a sequence containing mutations such as deletion, substitution, and insertion of the same sequence as long as the function of causing RNA interference is not lost.
  • the allowable mutation is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95%, when the homology (homology) is exemplified. .
  • the system is not particularly limited, but a system suitable for local sequence search, more specifically, BLAST, SSearch, or the like can be suitably used.
  • the searched sequence may be slightly modified, but it is particularly preferable that the designed base sequence has the same number of bases as the searched sequence.
  • the bases of the designed base sequence are preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more. It is preferred to do so.
  • the base sequence having 19 bases it is preferable that 16 bases or more, more preferably 18 bases or more, match the searched base sequence.
  • the base at the 3 'end of the searched base sequence and the base at the 3' end of the designed base sequence are identical. It is preferable that the base at the 5 'end of the searched base sequence is the same as the base at the 5' end of the designed base sequence.
  • an siRNA molecule is provided with an overhang portion.
  • the overhang portion is a portion of the double-stranded siRNA molecule, which is provided at the 3 'end of each strand and protrudes in a single-stranded state.
  • the number of bases in the overhang portion depends on the type of organism and the like, and the number of bases is particularly preferably 2.
  • the base sequence of the overhang portion is basically arbitrary. The same base sequence, TT, UU, or the like as the target gene of the force search source may be suitably used.
  • the preferred number of bases in the overhang portion is 2. Therefore, for example, when designing a single strand that constitutes an siRNA having a base sequence of 19 and an overhang portion of 2 bases, the number of bases of the siRNA including the overhang portion is 21 bases.
  • searching for the sequence of the target gene, and searching for the state of the double strand a sequence having 23 bases may be searched.
  • RNA interference is not necessarily the origin of the target gene. Even if they do not match, it can be applied to related species.
  • an siRNA used for a second species which is a related species of the first species can be designed using the isolated gene as a target gene. Further, for example, by searching for a common sequence from a plurality of types of mammals and searching for and designing the above-mentioned defined sequence from this common sequence, it is possible to design a siRNA that can be widely applied to mammals. This is because a sequence that is common to a plurality of mammals is conserved in other mammals and is considered to have a high probability.
  • RNA interference in relation to the target gene and to prevent the gene from causing RNA interference, whether a sequence identical or similar to the designed sequence is contained in another gene? It is preferable to search.
  • the search for a sequence identical or similar to the designed sequence may be performed using software or the like capable of performing a general homology search. By excluding such identical Z-like sequences, it is possible to design a sequence that specifically causes RNA interference only in the target gene.
  • RNA molecule that causes RNA interference can be easily designed with high probability. Although the synthesis of RNA still requires labor, time, and cost, it is possible to greatly reduce them by the present nucleotide sequence designing method.
  • the method for producing the present double-stranded polynucleotide is a method for producing a double-stranded polynucleotide having a high probability of causing RNA interference.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide is designed according to the above-described nucleotide sequence designing method, and the double-stranded polynucleotide is synthesized according to the sequence design.
  • the preferred form of the sequence design is the same as that described for the base sequence design method.
  • Double-stranded polynucleotides constitute double-stranded polynucleotides that cause RNA interference, and siRNAs are known as such double-stranded polynucleotides.
  • the double-stranded polynucleotide produced by the present double-stranded polynucleotide production method is preferably composed of RNA, but may be a hybrid polynucleotide partially containing DNA. In the present specification, a part containing DNA is also included in the concept of siRNA.
  • siRNA tends to have structurally or functionally asymmetry (asymmetry). It is desirable that the terminal half and the 3'-terminal half of the antisense strand be composed of RNA.
  • the double-stranded polynucleotide has an overhang at the 3 'end of a base sequence in which one of the strands is contained in the base sequence of the target gene, and (a) the base sequence is homologous to the specified sequence whose power also follows the rules of (d).
  • the other strand is formed by providing an overhang portion at the 3 ′ end of a sequence complementary to a base sequence homologous to the above-mentioned defined sequence.
  • the number of bases in each chain is 18 to 24, including the overhang portion, more preferably 20 to 22, and particularly preferably 21. Further, the number of bases in the overhang portion is preferably 2.
  • An siRNA composed of a total of 21 bases, of which the overhang portion is composed of 2 bases is suitable as an siRNA that causes RNA interference with high probability without causing cytotoxicity even in mammals.
  • RNA synthesis may be performed by, for example, chemical synthesis, or may be performed according to a method such as ordinary biotechnology. For example, it can be synthesized by a method such as preparing a DNA chain having a predetermined sequence, using this as a type III, synthesizing single-stranded RNA using a transcriptase, and converting the single-stranded RNA to double-stranded. .
  • the polynucleotide V obtained by the method for producing a double-stranded polynucleotide described above is preferable.
  • the form is the number of bases 13 according to the rules (a) to (d) in the base sequence of the target gene for RNA interference. — Search for 28 sequence sites, and one of the strands has an overhang at the 3 'end of the base sequence contained in the base sequence of the target gene and homologous to the specified sequence according to the rules (a) to (d) above.
  • the other strand is formed by providing an overhang portion at the 3 ′ end of a sequence complementary to the base sequence homologous to the above-mentioned defined sequence, and the number of bases in each strand is 15-30.
  • a double-stranded polynucleotide synthesized as described above is exemplified.
  • the polynucleotide is a polynucleotide having a high probability of causing RNA interference.
  • An expression vector that expresses the siRNA can also be prepared. By placing a vector that expresses a sequence containing the defined sequence under conditions of a cell-free system or a cell system in which expression can be performed, a predetermined siRNA can be supplied using the expression vector.
  • the method, method for designing a base sequence, the method for designing a double-stranded polynucleotide, and the method for preparing a double-stranded polynucleotide can greatly reduce the labor, time, and cost required for various tests and production utilizing RNA interference. is there.
  • the above-mentioned methods for searching for a target base sequence, designing a base sequence, and preparing a double-stranded polynucleotide include RNA analysis, such as gene analysis, drug discovery target search, drug discovery, gene therapy, and study of differences between species.
  • RNA analysis such as gene analysis, drug discovery target search, drug discovery, gene therapy, and study of differences between species.
  • Various tests, research, development, manufacturing, etc. that utilize interference can be greatly simplified and efficiency can be improved.
  • the method for suppressing gene expression comprises a step of searching for a predetermined base sequence, a step of designing and synthesizing a base sequence of siRNA based on the searched base sequence, and a step of synthesizing the obtained siRNA with a target gene. And introducing it into an expression system.
  • the step of searching for a predetermined base sequence follows the above-described method for searching for a target base sequence for RNA interference. Preferred embodiments are also as described above.
  • the step of designing and synthesizing the base sequence of siRNA based on the searched base sequence should be performed according to the above-described method of designing the base sequence of a polynucleotide causing RNA interference and the method of preparing a double-stranded polynucleotide. The same applies to preferred embodiments.
  • the obtained double-stranded polynucleotide is added to a target gene expression system to suppress the expression of the target gene.
  • the target gene expression system is a system in which the target gene is expressed, and more specifically, a system having a reaction system in which at least mRNA of the target gene is formed.
  • the target gene expression system includes both in vitro and in vivo systems.
  • a target gene expression system a cell-free system can be used in addition to a cultured cell, a cultured tissue, a living body, and the like.
  • the target gene whose expression is to be suppressed is not necessarily limited to the species that matches the origin of the searched sequence, but the origin of the search target gene and the suppression target gene are closely related. The more, the more specific and effective the suppression of specific genes.
  • “Introducing the gene into the target gene expression system” means that the target to be introduced is incorporated into the target gene expression reaction system.
  • a double-stranded polynucleotide is transfected into cultured cells having the target gene, and an expression vector having a defined sequence and a base sequence capable of overhanging, which is incorporated into the cells, is prepared.
  • Target remains Examples of such methods include introduction into a cell having a gene.
  • RNA interference a polynucleotide capable of efficiently causing RNA interference can be obtained, so that the gene can be suppressed efficiently and easily.
  • a target mRNA sequence was constructed downstream of the CMV enhancer Z promoter of pCI-neo (GenBank Accession No. U47120, manufactured by Promega) (FIG. 8). That is, the following double-stranded oligomer having a Kozak sequence (“Kozak”), a target 23 base pair sequence (“target”), and a recognition sequence for a restriction enzyme (Nhel, EcoRI, Xhol) for recombination was synthesized.
  • This double-stranded oligomer consists of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and its complementary sequence.
  • the synthesized double-stranded oligomer was inserted into the Nhel and Xbal sites of pCI-neo to construct a target expression vector, pTREC (Fig. 8).
  • the intron used was a ⁇ globin-derived intron site that was originally incorporated into pCI-neo.
  • 0.2-0.3 x 10 6 cells of HeLa cells are seeded per well of a 24-well plate, and one day later, 0.5 g of the pTREC vector was prepared using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manual. Was transfused.
  • mRNA (T) target mRNA
  • C mRNA
  • the real-time monitoring device ABI PRIZM 7000 manufactured by Applied Biosystems was used for the quantitative PCR, and the primer pair T (SEQ ID NOS: 2 and 3 in the Sequence Listing) was used for the quantification of mRNA (T), and the primer was used for the quantification of mRNA (C). Pair C (SEQ ID NOS: 4 and 5) was used, respectively.
  • FIG. 9 and FIG. 10 show the results of PCR.
  • FIGS. 9 and 10 are graphs showing the amount of each PCR product on the vertical axis and the number of PCR cycles on the horizontal axis.
  • the difference in amplification of the resulting PCR product between the cDNA synthesized with reverse transcriptase (+ RT) and the control without reverse transcriptase (-RT) is small.
  • Ivy Figure 9
  • the obtained evaluation sequence fragment is cloned as a new target sequence between the EcoRI and Xhol sites of pTREC using the EchoRI site and Xhol site at both ends, and pTREC-VIM35 and pTREC-VIM812 are cloned. It was constructed.
  • Evaluated sequence VIM-35 (SEQ ID NO: 8, Fig. 11), Evaluated sequence VIM-812 (SEQ ID NO: 9, Fig. 12), and control sequence (siContorol, SEQ ID NO: 10, Fig. 13) respectively
  • the synthesized siRNA fragments were synthesized and annealed. Each sequence of the following siRNA has an overhang at the end.
  • siRNA against the luciferase gene was used as a control.
  • HeLa cells are seeded per well of a 24-well plate, and one day later, 0.5 g of pTREC- according to the manual using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manual.
  • VIM35 or pTREC-VIM812 and siRNAs corresponding to the respective VIM-derived sequences were simultaneously transfected.
  • Control cells were transfected with 0.5 g of pTREC-VIM35 or pTREC-VIM812 and siRNA for luciferase gene (siControl, final concentration ⁇ ) simultaneously.
  • mRNA (T) mRNA containing the VIM-derived sequence to be evaluated
  • C mRNA (C)
  • VIM-812 siRNA significantly reduced the TZC ratio. This is because VIM-812 siRNA cleaved mRNA having the corresponding sequence, indicating that VIM-812 siRNA has an RNAi effect.
  • the T / C ratio was almost the same as the control, indicating that the sequence of VIM-35 had almost no RNAi effect.
  • siRNA against VIM is used using Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen) according to the manual. —35 or siVIM—812) or control siRNA (siControl) 100 nM, and 0.5 g of pEGFP (manufactured by Clontech) as a control for transfection efficiency were simultaneously transfected.
  • pEGFP incorporates EGFP.
  • RNAlOOng oligo (dT) as a primer
  • Superscript Reverse transcription was performed using II RT (manufactured by Invitrogen) to perform a cDNA synthesis reaction.
  • PCR was performed using primers VIM-F3-84 and VIM-R3-274 (SEQ ID NOS: 11 and 12) for vimentin.
  • gagctacgtgactacgtcca (Rooster column number 11)
  • PCR was performed using primers ACTB-F2-481 and ACT B-R2-664 (SEQ ID NOs: 13 and 14) for j8-actin, and the ⁇ -actin After matching the quantitative values, the expression level of vimentin was evaluated.
  • the cells were fixed with 3.7% formaldehyde and blocked by a standard method. Thereafter, a rabbit egret anti-vimentin antibody ( ⁇ -VIM) or a rabbit egret anti-Yes antibody—Yes) was used as an internal control, and reacted at room temperature. Then, the cell surface was washed with PBS (Phosphate Buffered Saline; phosphate buffered saline), and a fluorescence-labeled anti-Egret IgG antibody was added as a secondary antibody, followed by reaction at room temperature. After washing the cell surface with PBS, observation with a fluorescence microscope was performed.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • phosphate buffered saline phosphate buffered saline
  • FIG. 16 shows the result of observation with a fluorescence microscope.
  • the portions displayed in white are the portions where fluorescence appears.
  • the same level of expression was confirmed in all cells.
  • siControl and siVIM-35 fluorescence due to vimentin antibody staining was observed, confirming the presence of endogenous vimentin.
  • siControl and siVIM-35 were introduced. The fluorescence was significantly weaker than the cells. The result is This indicates that the expression of vimentin protein was reduced as a result of interference with endogenous vimentin mRNA, indicating that siVIM-812 also has an RNAi effect on endogenous vimentin mRNA.
  • siVIM-812 also has an RNAi effect on endogenous vimentin mRNA.
  • Example 1 The results obtained with the Atsushi system of the present invention (Example 1) were in good agreement with the results (Example 2) using the respective siRNAs for the endogenous gene, and therefore this Atsushi system was free of any This is considered to be an effective method for evaluating the RNAi activity of siRNA.
  • the present invention can be suitably used for experiments, research, and development of biotechnology, and also for drug development.
  • SEQ ID NO: 1 oligomer containing Nhel, EcoRI, and Xhol restriction sites

Abstract

　本発明は、ＲＮＡｉ活性およびｍｉＲＮＡ活性を簡便に評価できる方法を提供する。 　少なくとも標的配列と前記標的配列を含むＲＮＡの発現を調節する発現調節領域とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、前記標的配列を含むＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性またはｍｉＲＮＡ活性を有するか否か評価の対象とする評価対象核酸分子とを、前記標的発現分子が標的配列を含むＲＮＡを発現可能な発現系内に供給して、ＲＮＡｉ活性またはｍｉＲＮＡ活性を評価する。

Description

明 細 書
RNAi活性および miRNA活性の評価方法
技術分野
[0001] 本発明は、 RNAi活性および miRNA活性の評価方法に関し、より詳しくは、簡便 に RNAi活性および miRNA活性を評価することができる方法に関する。なお、本明 細書にぉ 、て「RNAi」とは RNA干渉（RNA interference)とも!/、う。また、「miRNA」 は、マイクロ RNA (micro RNA)ともいう。
背景技術
[0002] RNA干渉は、機能阻害した 、遺伝子の特定領域と相同なセンス RNAとアンチセ ンス RNAとからなる二本鎖 RNA (double- stranded RNA;以下「dsRNA」という）が標 的遺伝子の転写産物である mRNAの相同部分を干渉破壊するという現象で、 1998 年に線虫を用いた実験により初めて提唱された (非特許文献 1)。この現象を利用し て所望の遺伝子の発現を阻害する RNAi法が注目されている。しかし、哺乳類にお いては、約 30塩基対以上の長い dsRNAを細胞内へ導入すると、インターフェロンレ スポンスが誘導され、細胞がアポトーシスによって死んでしまうため、 RNAi法を用い ることが困難であった。
[0003] 一方、マウス初期胚ゃ哺乳類培養細胞では、 RNA干渉が起こりえることが示され、 RNA干渉の誘導機構そのものは、哺乳類細胞にも存在することが明らかとなってき た。現在では、およそ 21— 23塩基対の短い二本鎖 RNA (short interfering RNA、以 下「siRNA」と ヽぅ）が、哺乳類細胞系でも細胞毒性を示さずに RNA干渉を誘導でき ることが示され、哺乳類においても RNAi法を利用することが可能となってきている（ 非特許文献 2、非特許文献 3)。
[0004] また、最近、タンパク質に翻訳されな 、20数塩基の RNAが翻訳抑制あるいは mR NAの分解に関与していることが示唆されている。このような 20数塩基の RNAは、 mi RNA (マイクロ RNA)と呼ばれて ヽる（非特許文献 4、非特許文献 5)。
[0005] 非特千文献 1： Fire, A. et ai., Potent and specinc genetic interference
bydouble— stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature, 391: 806—811, 1998 非特許文献 2 : Zamore, P.D. et al, RNAi: double- stranded RNA directs the
ATP— dependent cleavage of mRNA at 21 to 23nucleotide intervals. Cell, 101: 25-33, 2000
非特許文献 3 : Elbashir, S. M. et al.,: Duplexes of 21- nucleotide RNAs mediate
RNAinterference in cultured mammalian cells, Nature, 4丄丄： 494—498, 2001
特許文献 4 : Gnshok, A. et al., The rde— 1 gene, RNA amplification in ds RNAinterference regulate expression of the small temporal RNAs that control
C.elegans developmental timing. Cell, 110: 513—520, 2002
非特許文献 5 : Rhoades, M. W. et al., Prediction of plant micro RNA targets,
Cell.l lO: 513-520, 2002
発明の開示
[0006] RNAi法は様々な応用が期待される技術である。し力し、ショウジヨウバエや線虫で は、ある遺伝子の特定領域と相同な dsRNAおよび siRNAは、ほとんどの配列で RN A干渉効果を示すのに対して、哺乳類では無作為に選択した（21塩基の） siRNAの 70— 80%は RNA干渉効果を示さない。これは、哺乳類において RNAi法を用いた 遺伝子機能解析を行う際に大きな問題点となっている。さらに、内在性遺伝子を標的 とした場合、遺伝子によって mRNAの発現量および安定性などが異なるため、 siRN Aの有効性を評価することが困難な場合がある。また、 miRNAについては未だ機能 的に解明されて 、な 、点も多ぐ miRNAの活性にっ 、て簡便に評価する方法が求 められている。
[0007] 上記のような状況の下、本発明は、 RNAi活性および miRNA活性を簡便に評価で きる方法を提供することを課題とする。
[0008] 上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を進めたところ、評価対象とな る分子と、標的となる配列を含むポリヌクレオチドとを発現系に導入し、評価対象とな る分子が標的となる配列に対して RNAi活性または miRNA活性を有するカゝ否かを 評価する簡便な手法を見いだした。すなわち、本発明は、下記 RNAi活性の評価方 法および miRNA活性の評価方法を提供するものである。
[0009] (1) 少なくとも標的配列と前記標的配列を含む RNAの発現を調節する発現調節領 域とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、
前記標的配列を含む RNAに対して RNAi活性を有するか否か評価の対象とする 評価対象核酸分子とを、
前記標的発現分子が標的配列を含む RNAを発現可能な発現系内に供給し、 前記標的配列を含む RNAが切断されたか否かを検出する、
RNAi活性の評価方法。
(2) 前記標的発現分子が、標的配列の上流および下流のそれぞれに、 PCRプライ マーがァニール可能な配列を有する PCRプライマー対応領域を備え、
前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが前記発現系に供給されて生じた 標的配列を含む RNAを、 PCRプライマー対応領域の配列にァニールする 1対のプ ライマーを用いて RT-PCRにより定量し、
前記評価対象核酸分子を前記発現系に供給しな!、場合と比較して、前記標的配 列を含む RNAが切断されたか否かを検出する、上記（1)に記載の RNAi活性の評 価方法。
(3) 標的配列の上流および下流にある PCRプライマー対応領域の少なくとも一方 の領域内部にイントロンが挟み込まれており、かつ、前記発現系が RNAをスプライシ ング可能な発現系である、上記（2)に記載の RNAi活性の評価方法。
(4) 前記標的発現分子が、前記標的配列と一体の mRNAとして転写される位置に 、レポーターとして検出可能な発現産物をコードする配列を含み、
前記レポーターの発現を検出することにより RNAが切断された力否かを検出する、 上記（1)に記載の RNAi活性の評価方法。
(5) 前記発現系が、無細胞発現系または細胞発現系である、上記（1)から (4)のい ずれか一項に記載の RNAi活性の評価方法。
(6) 転写される mRNAが評価対象核酸分子によって切断されない配列力 なり、か つ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列を含むコントロール供給分子を 、前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが供給される発現系内に供給する、 上記（1)から（5)の ヽずれか一項に記載の RNAi活性の評価方法。
(7) 前記標的発現分子に、転写される RNAが評価対象核酸分子によって切断さ れな 、配列からなり、かつ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列が組み 込まれて 、る、上記（1)から (5)の 、ずれか一項に記載の RNAi活性の評価方法。
(8) 前記標的配列が、評価対象核酸分子が有する塩基配列とは異なる塩基配列を 有する、上記（1)から（7)の 、ずれか一項に記載の RNAi活性の評価方法。
(9) 少なくとも、標的配列と、前記標的配列を含む RNAの発現を調節する発現調 節領域と、前記標的配列と一体の mRNAとして転写される位置にレポーターとして 検出可能な発現産物をコードする配列とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子 と、
前記標的配列を含む RNAに対して miRNA活性を有するか否カゝ評価の対象とす る評価対象核酸分子とを、
前記標的発現分子が標的配列を含む RNAを発現可能な発現系内に供給し、 前記レポーターの発現が抑制された力否かを検出する、
miRNA活性の評価方法。
(10) 前記発現系が、無細胞発現系または細胞発現系である、上記（9)に記載の m iRNA活性の評価方法。
(11) 評価対象核酸分子によって発現抑制されない配列からなり、かつ検出可能な 発現産物をコードするコントロール配列を含むコントロール供給分子を、前記標的発 現分子と前記評価対象核酸分子とが供給される発現系内に供給する、上記 (9)また は（10)に記載の miRNA活性の評価方法。
(12) 前記コントロール供給分子が、前記標的発現分子に組み込まれている、上記 (11)に記載の、 miRNA活性の評価方法。
(13) 前記標的配列が、評価対象核酸分子が有する塩基配列とは異なる塩基配列 を有する、上記（9)から（12)の 、ずれか一項に記載の miRNA活性の評価方法。 本発明により、 RNAi活性または miRNA活性を簡便に評価することができる方法 が提供される。本発明の方法は、特に、内在性遺伝子に由来する配列、人工的な配 列など配列の由来、種類などを問わず、任意の配列を標的として RNAi活性または miRNA活性の評価を簡便に行うことができる点で優れて ヽる。本発明の評価方法 は、簡便なものであるため大量の試験を短時間で行うことが可能である。 図面の簡単な説明
[0011] [図 1]は、標的発現分子の一例を示す図である。
[図 2]は、標的発現分子の一例; PCRフラグメント 1を示す図である。
[図 3]は、 PCRフラグメント 2の例を示す図である。
[図 4]は、 PCRサイクル数と PCR産物量との関係を示す図である。
[図 5]は、レポーターとしてピューロマイシン耐性遺伝子（「puro」 )が組み込まれた標 的発現分子の例を示す図である。
[図 6]は、レポーターとして EGFP (「EGFP」 )が組み込まれた標的発現分子の例を示 す図である。
[図 7]は、レポーターとしてフアイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子（「F. Luc」）が組み 込まれた標的発現分子の例を示す図である。
[図 8]は、標的発現ベクター pTRECの構造を示す図である。
[図 9]は、実施例 1の 2. (2)におけるプライマーの一方力イントロンを挟む形でデザィ ンされて!/、な!/、場合の PCRの結果を示す図である。
[図 10]は、実施例 1の 2. (2)におけるプライマーの一方力イントロンを挟む形でデザ インされて!ヽる場合の PCRの結果を示す図である。
[図 11]は、 siRNA； siVIM— 35の配列および構造を示す図である。
[図 12]は、 siRNA； siVIM-812の配列および構造を示す図である。
[図 13]は、 siRNA； siControlの配列および構造を示す図である。
[図 14]は、 siVIM-812および siVIM— 35のルシフェラーゼ遺伝子に対する RNAi活 性を示す図である。
[図 15]は、 siControl、 siVIM— 812および siVIM— 35のビメンチンに対する RNAi活 性を示す図である。
[図 16]は、抗体染色の結果を示す図である。
[0012] 図中の符号の説明は、下記のとおりである。
「proZenh」 プロモーター Zェンノヽンサ一
「intron」 イントロン
「PAR」 プライマー対応領域 「target」 標的配列
「MCS」 マノレチタローニングサイト
「poly A」 ポリ Aシグナル配列
「Kozak」 コザック配列
「Kozak+ATG」 コザック配列および ATG配列
「neo」 ネオマイシン耐性遺伝子
「puro」 ピューロマイシン耐性遺伝子
「F. LucJ フアイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子
「R. LucJ レニラルシフェラーゼ遺伝子
発明を実施するための最良の形態
[0013] 以下、本発明の実施の形態について、最良の形態に言及しつつ、
1. RNAi活性の評価方法、
2. miRNA活性の評価方法、
3. RNA干渉の標的塩基配列検索方法、
4. RNA干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法、
5.二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法、
6.遺伝子の発現抑制方法、
の順に説明する。
[0014] なお、分子生物学的な基本的手法につ!、ては、 BASIC METHODS IN
MOLECULAR BIOLOGY (1986); Sambrookら、 MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL,第 2版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press Coid
Spring Harbor, N.Y. (1989)、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（1992 )、新遺伝子工学ハンドブック改訂第 3版、村松ら編、羊土社 (1999)など、多くの標準 的な実験マニュアルがあり、これらの文献の内容は本明細書に取り込まれるものとす る。また、本明細書において塩基配列は、特に断らない限り、センス鎖、すなわち、 m RNAの配列を基準として示す。
[0015] 1. RNAi活性の評価方法 本発明の RNAi活性の評価方法では、標的発現分子と評価対象核酸分子とを、 R NAを発現させることが可能な発現系に供給して、標的発現分子力 発現した RNA が評価対象核酸分子によって切断されたか否かを検出する。
[0016] 標的発現分子は、 RNAiの標的となる配列（以下「標的配列」という場合がある）を 有する RNAを発現させる分子である。標的発現分子は、標的配列の RNAを発現系 に提供し得るポリヌクレオチドであればよいが、安定性、操作性などの観点カゝら DNA であることが好ましぐより具体的には発現ベクター等が好適なものとして用いられる。 発現ベクターは市販されているものなど既に多数のものがある。発現ベクターによつ て発現させる場合、発現ベクターは、例えば培養細胞系の種類あるいは無細胞系の 条件などに応じて、適宜選択することができる。標的配列を挿入させたり、その他所 定の配列を挿入させたりするために、標的発現分子はマルチクローユングサイト（「M CS」と略称する場合がある）を有するものであることが好ましい。ベクターとしては、具 体的一例としては、例えば pCI— neoなどが用いられる。
[0017] 標的配列を発現系に供給するため、標的発現分子は、少なくとも標的配列およびこ の標的配列を含む RNAの発現を調節する発現調節領域とを含む。標的配列は任意 であり、評価を行う者が所望の遺伝子等から任意に配列を選ぶことができる。一例と して、標的配列は、下記「3. RNA干渉の標的塩基配列検索方法」などによって検索 された配列を選択することができ、検索された配列が実際に RNAiの対象となり得る 力を実験系にて確認することになる。また、標的発現分子は、標的配列を含む RNA を発現させるための発現調節領域を備える。発現調節領域は、例えば、プロモータ 一、ェンハンサー、ポリ A領域などによって構成される。プロモーター、ェンハンサー 等は、ベクターや宿主などの条件に応じて適宜選択される。また、標的発現分子に は、ターミネータ一などベクターに組み込み得る他の配列を組み込んでもよ 、。
[0018] プロモーターは、遺伝子の発現に用いる培養細胞に対応して適切なプロモーター であればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 HIV'LTRプロモーター、 CMV (サイトメ ガロウイノレス）プロモーター、 HSV— TKプロモーター、 CAGプロモーターなどが挙げ られる。 [0019] 評価対象核酸分子は、 RNAi活性を評価しょうとする対象となる配列を有する核酸 分子である。核酸分子は、核酸を構成主体とする分子であり、主に RNAからなるが、 RNAと DNAとのハイブリッド分子およびキメラ分子並びにこれらの変性分子などで あってもよい。ここで、変性分子としては、二本鎖が完全な塩基対を形成していない 変性分子のほか、ヌクレオチドの一部が修飾されたものも含む。より具体的には、例 えば、上記の標的配列に対する RNAi活性の程度を評価しょうとする siRNA候補分 子、または siRNA候補分子を発現する核酸分子であり、偶然発見された分子や、 R NAi活性を有するものと期待して設計された分子など様々なものも候補分子となり得 る。
[0020] RNAi活性を有する蓋然性が高 、配列の設計方法としては、例えば、下記「4. RN A干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法」などが挙げられる。すなわ ち、本発明の評価方法は、下記「4. RNA干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配 列設計方法」および「5.二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法」に記載の方法に従って 得られた siRNA活性を有する蓋然性が高い分子の RNAi活性を実験系で簡便に確 認する手法としても好適に用いられる。
[0021] また、評価対象核酸分子は、発現系に RNAi候補分子を提供するものであり、 siR NAの形態そのものであってもよ!/、し、または siRNAの形態の分子を発現するべクタ 一であってもよい。
[0022] 標的発現分子および評価対象核酸分子は、標的発現分子から標的配列を含む R NAが発現可能な発現系に供給されることもできる。 RNAが発現可能な発現系は、 細胞系であっても無細胞系であってもよいが、少なくとも mRNAの転写が行われる条 件を備えていることを要する。したがって、発現系内には、 RNA分子を合成するため の材料、および酵素等が含まれている。細胞系としては、適当な培養細胞内で標的 発現分子を発現させることができる。培養細胞に標的対象核酸分子および評価対象 核酸分子を供給する方法は、細胞内に分子を導入するトランスフ クシヨンなどの一 般的な方法であることができる。また無細胞系は、例えば、試験管内など細胞外で、 所定の緩衝液などに細胞抽出液、リボ核酸、 RNAポリメラーゼ、 ATPなどをカ卩えた 系である。 [0023] 細胞発現系として宿主細胞を用いる場合、宿主細胞の例としては、例えば、ドロソフ イラ S2 (Drosophila S2)およびスポドプテラ Sf9 (Spodoptera S19)などの昆虫細胞； C HO、 COSゝ HeLaゝ C127、 NIH3T3、 BHK、 HEK293、バウエス（Bowes)黒色腫 細胞および血球系細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。
[0024] 発現系内に取り込まれた標的発現分子からは、標的配列を含む mRNAが転写さ れる。そして、同じく発現系内に導入された評価対象核酸分子が、その評価対象配 列を干渉するものであれば、標的配列を含む RNAは切断され、干渉しないものであ れば切断されない。したがって、 mRNAが切断されたカゝ否かを検出することにより、 評価対象核酸分子が RNAi活性を有するか否か、あるいは RNAi活性の程度を評価 することができる。 RNAが切断された力否かの検出方法としては、 RNAの発現を定 性的または定量的に測定する方法や、標的発現分子に、標的配列と共に転写される 所定のレポーターを^ aみ込んでおき、そのレポーターを定性的または定量的に測定 する方法などが挙げられる。具体的な検出方法、およびそれに適した形態について は下記にて別途詳説する。
[0025] 内在性遺伝子をターゲットとして、その内在性遺伝子を有する細胞または生体に、 直接 RNAi活性を有する候補分子を投与しても、そもそも内在性遺伝子の発現量が 少な 、場合やその遺伝子産物の安定性が低 、場合には、 RNAiの効果にっ 、て評 価するのが困難である。また、トランスフエクシヨン効率の低い培養細胞系では、 RN Ai活性を有していても、 siRNAによる内在性遺伝子の抑制の効果が見えにくい。さ らに、例えば RT— PCR (reverse transcribed- PCR)によって RNAの発現量を測定し ようとする場合には、標的とする内在性遺伝子に応じてプライマーの組み合わせ、 P CRサイクルの条件など、プロトコルを大幅に調整する必要性がある。すなわち、例え ば標的対象の内在性遺伝子が 10, 000種あったとすると、 10, 000種のプライマー の組み合わせ、および PCRサイクルの大幅な条件検討を要することになる。
[0026] これに対して、本発明の評価方法は、クローニングゃ遺伝子発現系などの簡便な 実験系を用いて RNAi活性を測定することができる簡便な方法である。本発明の評 価方法によれば、所望の標的配列を組み換える以外は、一定のプロトコルで多数の 標的配列について RNAi活性を評価することができるという簡便さが提供される。また 、発現べクタ一一宿主系などの確立した実験系をベースとすることができるので、生体 内では発現量の少ない内在性遺伝子であっても、 RNAi活性の評価を適切に行うこ とができる。また、元来の生体内では標的配列を含む発現産物が早期に分解されて しまうような場合でも、本発明の方法によれば、そのような原因を除く細胞系または無 細胞系を比較的容易に調製し得る。さらに、本発明の評価方法は、 siRNAとべクタ 一とを発現系に同時に入れることが可能であり、そのため、トランスフエクシヨンの効率 が低い系であっても、アツセィ可能にすることができる。 RNAiは、遺伝子のノックァゥ ト技術、医薬としての利用など、さまざまな利用が検討されており、今後めざましい発 展を遂げる可能性を秘めた分野であり、本発明の評価方法は、 RNAi関連技術の発 展に大きく寄与するものである。
[0027] 次に、本発明の評価方法の好ましい実施形態の例について、さらに具体的に説明 する。
1-1 PCR方式
標的配列を含む RNAが切断されたか否かを RT— PCRを用いて検出する実施形 態について説明する。この実施形態は、転写された RNAに対応する cDNAを PCR によって増幅するものであり、増幅された DNAを検出して、 RNAが切断されたか否 かを判別する。
[0028] 本 PCR方式の場合、標的発現分子は、標的配列の上流および下流のそれぞれに 、PCRプライマーがァニール可能な配列を有する PCRプライマー対応領域を備える 。プライマーの配列には特に限定はなぐ PCRの条件などに応じて適宜設定される。 より好まし 、形態として、標的配列の上流および下流にある PCRプライマー対応領 域の少なくとも一方の領域内部にイントロンが挟み込まれるようにする。挟み込むとい うのは、 PCRプライマー対応領域の端部に接続されるのではなぐ PCRプライマー対 応領域を分断するように組み込まれることを意味する。 PCRプライマー対応領域にィ ントロンを挟み込ませることにより、発現ベクターを铸型として DNAが増幅してしまうこ とが防止される。その結果、発現ベクター力 転写され且つスプライシングされた RN A、すなわち、イントロンが除去された RNAを基にして PCRが行われるので、より正 確な評価をすることができる。 [0029] イントロンは、真核生物の遺伝子 DNA中に見出すことができる。本発明にお 、て用 いられるイントロンは、アミノ酸配列情報を有さず、 mRNAのスプライシングにおいて 除去される配列であれば特に限定はない。イントロンには多数の例がある力 一部具 体例として例示すると、 |8—グロビン由来のイントロン、 IgG由来のイントロンなどが挙 げられる。
[0030] PCRプライマー対応領域にイントロンが挟み込まれる形態においては、発現系とし ては RNAをスプライシング可能な発現系を用いる。例えば、スプライシング可能な発 現系としては、 RNAのスプライシングが行われることが確認されている真核生物系の 発現べクタ一一宿主系を用いてもよい。また、無細胞系であれば少なくともスプライシ ングに要するスプライセオソームなどを含む系を構築すればよい。また、無細胞系と しては、真核生物の細胞の破砕物を含む混合溶液を用いてもよ ヽ。
[0031] 図 1に標的発現分子として発現ベクターを用いた場合の設計例を示す。発現調節 領域としてプロモーター及びェンハンサー（「proZenh」）が組み込まれて!/、る。発現 調節領域の下流にはイントロン（「intron」）が挟み込まれたフォワードプライマーに対 するプライマー対応領域（「PAR (F) 1」： primer annealing region (F)l)が組み込まれ ている。フォワードプライマーのプライマー対応領域（「PAR(F) 1」）の下流にはマル チクロ一-ングサイト（「MCS」 )があり、マルチクロー-ングサイト（「MCS」 )を使って 、所望の標的配列（「target」）が組み込まれる。さらに標的配列（「target」）の下流 にはリバースプライマーに対応するプライマー対応領域（「PAR(R) 1」： primer annealing region (R)l)が糸且み込まれている。
[0032] 図 2および図 3に、標的発現分子としての PCRベースフラグメントの組み合わせを 示す。図 2および図 3の組み合わせは、 PCR方式であると共に、検出シグナルを正規 化するための内部標準コントロール（以下、「インターナルコントロール」； internal controlとも！/、う)を備える。
[0033] 図 2には、 23塩基力 なる標的配列を含む標的発現分子である PCRフラグメント 1 ( 「PCR fragment 1」）を示す。図 3には、標的配列部位の発現量を相対的に定量 する際にコントロールとして用いる PCRフラグメント 2 (「PCR fragment 2」）が示さ れている。コントロールを用いることにより、トランスフエクシヨン効率のばらつき、 RNA の収率のばらつき等、試料サンプル間の誤差を補正することなどが可能である。 PC Rフラグメント 1および 2は、二本鎖 DNAにより構築されている。 PCRフラグメント 1は プロモーター及びェンハンサー（「ProZenh」 )を有し、その下流にフォワードプライ マーに対応するプライマー対応領域（「PAR(F) 1」）を有する。フォワードプライマー 対応領域（「PAR (F) 1」）の内部には、イントロン（「intron」 )が挟み込まれており、 P CRフラグメント 1そのものが PCRの铸型としては機能しな 、ように設計されて!、る。な お、図 2に示す例では、イントロンは PAR (F) 1に挟み込まれている力 PAR (R) 1に 挟み込んでもよい。フォワードプライマーに対応するプライマー対応領域（「PAR(F) 1」）の下流には、標的配列（「target」 )が組み込まれて 、る。標的配列（「target」 )の 下流にはリバースプライマーに対応するプライマー対応領域（「PAR(R) 1」）が組み 込まれている。さらにその下流にはポリ Aシグナル（「poly A」）配列を備える。図 3に 示す PCRフラグメント 2は、相対定量の際のコントロールとして用いるネオマイシン耐 性遺伝子（「neo」）が組み込まれている。 PCRフラグメント 1および 2を用いる場合、両 者を共に RNAを発現可能な発現系に導入する。なお、検出シグナルを正規化する 実施形態については、下記「1 3 インターナルコントロールによる検出シグナル正 規化」にて別途詳説する。
[0034] 前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが供給された発現系から RNAを回 収して逆転写を行い、 PCRプライマー対応領域の配列にァニールする 1対のプライ マーを供給して RT— PCRを行い、標的配列を含むポリヌクレオチドを定量する。発現 系は、無細胞発現系であっても細胞系発現系であってもよい。 RT— PCRを行うため に、逆転写酵素およびオリゴ (dT)プライマーまたはランダムへキサマーを用いて cD NAが生成される。生成された cDNAを铸型として PCRにより DNAが増幅され、増 幅を速度論的に評価することにより mRNAの定量を行うことが可能である。温度ゃサ イタルなど RT— PCRの他の条件は適宜調整してよい。
[0035] 評価対象核酸分子を供給する系と同様に、評価対象核酸分子を供給しない系に ついても RT - PCRを行う。そして、評価対象核酸分子を前記発現系に供給しない場 合と比較して、前記標的配列を含む RNAが切断されたカゝ否かを検出する。評価対 象核酸分子を供給しない系には、例えばコントロールとして、標的配列に対し RNAi 活性を有しな!/ヽことが判明して！/ヽる分子 (例えば評価対象核酸分子と類似した分子） を供給して比較すると!/、う実施形態も含まれる。
[0036] RT— PCRを用いて RNAi活性を検出する方法は特に限定されな ヽ。例えば、評価 対象核酸分子が RNAi活性を十分に発揮する場合、標的配列を含む DNAの増幅 の遅れとなって現れることが多 、ので、増幅された DNA量の時系列的な変化を測定 して RNAi活性を評価することができる。評価の方法の例を図 4に示す。図 4は、例示 的に、増幅された DNA量の経時的変化を示したものであり、横軸が PCRサイクル数 、縦軸が DNA量 (PCR産物量)を示す。図 4において、（I)に示す曲線は評価対象 核酸分子を供給しない系の結果を示し、 (II)に示す曲線は RNAi活性がある分子を 供給した場合の結果である。図 4 (1)の曲線とは異なって、 RNAi活性を有する分子 が発現系に供給されると、図 4 (II)に示す曲線のように DNAの増幅が遅れて現れる。 評価対象核酸分子が、標的発現分子から転写される RNAを切断し、 RT - PCRの铸 型が減少したためである。したがって、この遅れの程度は RNAi活性の程度を表す 1 つの指標となり得る。 RNAi活性があるにもかかわらず、 DNA量が増えてくる場合が あるのは、活性の程度などにより、 RNAiを免れ得る分子が現れ、 1つの铸型ができ てしまえば PCRによって容易に増幅されてしまうためである。
[0037] また、経時的に DNAの量を測定せずとも、図 4の（I)と（II)のような差が現れやすい 時点（または PCRサイクル数）を予め知っておけば、その時点でのみ DNA量を測定 し、 DNA量の差から RNAi活性を評価することもできる。
[0038] 1-2 レポーター方式
次に、標的配列を含む RNAが切断されたカゝ否かを検出する方法として、レポータ 一を用いる実施形態について説明する。本レポーター方式の場合には、標的発現分 子に、標的配列と一体の mRNAとして転写される位置にレポーターとして検出可能 な発現産物をコードする配列を み込んでおき、レポーターの発現を検出することに より RNAが切断された力否かを検出する。レポーター方式においても、発現系は無 細胞発現系であっても細胞発現系であってもよ 、。
[0039] レポーターは、その発現が検出可能なものであれば特に限定はなぐ例えば、各種 の蛍光タンパク質、発光タンパク質、生成酵素、分解酵素、耐性遺伝子などが挙げら れる。より具体的には、レポーターとして例えば、 EGFP (Enhanced Green
Fluorescent Protein；強化緑色蛍光タンパク質）などのォワンクラゲ由来緑色蛍光タン ノ ク質遺伝子、 Discoma
sp.由来の赤色蛍光タンパク質遺伝子（DsRed)、 Heteractis crispa由来の近赤外蛍 光タンパク質遺伝子 (HcRed)、フアイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子（Firefly luciferase gene)、レニフノレンフエフ1 ~~セ遺 fzs (Rennla Lucifer as e gene)、ピュ ~~ロマ イシン耐性遺伝子、ブラストサイジン S耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、 j8 ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、 アルカリフォスファターゼ遺伝子およびこれらの変異体などの他、多数のものを好適 なものとして用いることができる。レポーターは、標的発現分子内において標的配列 と一体の mRNAとして転写される位置に備えられる。したがって、標的配列をコード する mRNAが切断された場合、レポーターの配列について翻訳が阻害され、レポ一 ターの発現産物が検出されな 、、あるいは抑制されると!/、う現象となって現れる。
[0040] レポーターの検出は、レポーターの種類に応じて適宜選択される。例えば、レポ一 ターが蛍光タンパク質等であれば、その蛍光強度を測定することによりレポーターの 発現を検出することができる。また、レポーターが耐性遺伝子であれば、耐性遺伝子 が導入された細胞の耐性をアツセィすることにより、レポーターの発現を検出すること ができる。生成酵素や分解酵素をレポーターとする場合には、これらの酵素が触媒 する反応によって生じる産物を定量することによりレポーターの発現を検出することが できる。何れの場合であっても定量的あるいは定性的に測定が可能である。また、定 量的な測定の場合は、量の違 、が RNAi活性の程度として反映されるようにすること が好ましい。
[0041] 図 5から図 7に、標的発現分子として、レポーターを組み込んだ発現ベクターの構 築例を示す。図 5は、レポーターとしてピューロマイシン耐性遺伝子（「puro」）を組み 込んだ発現ベクターである。上流から、プロモーターおよびェンハンサー（「pro/en hj )、翻訳を円滑に行わせるための Kozak配列および ATG (「Kozak+ ATG」 )、さ らにはマルチクローユングサイト（「MCS」 )を有し、マルチクロー-ングサイト（「MCS 」）を利用して、標的配列（「target」 )およびピューロマイシン耐性遺伝子（「puro」 )が 組み込まれて 、る。ピューロマイシン耐性遺伝子の下流にはポリ Aシグナル (「poly Aj )が組み込まれて 、る。さらに、ネオマイシン耐性遺伝子（「neo」 )が組み込まれて いる。
[0042] 図 5に示す発現ベクターと評価対象核酸分子とを、培養細胞系に導入し、細胞がピ ユーロマイシン耐性を有するかどうかを判定する。評価対象核酸分子が RNAi活性を 有しない場合には、ピューロマイシン耐性遺伝子が発現し、細胞はピューロマイシン 耐性を有するためピューロマイシン含有培地で生育が可能である。これに対し、評価 対象核酸分子が RNAi活性を有する場合には、標的配列部で mRNAが切断されて しまうためピューロマイシン耐性遺伝子がコードするタンパク質は翻訳されな 、。その ため、宿主細胞はピューロマイシン耐性を有さず、細胞が生存できないかあるいは増 殖が抑制されるという現象が現れる。この生育の差により、 RNAi活性の有無を判別 することができる。図 5に示す発現ベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子（「neo」） が組み込まれている。
[0043] 図 6に示す発現ベクターは、レポーターとして EGFP遺伝子が組み込まれたもので ある。すなわち、標的配列と共に一体として転写される位置に EGFP遺伝子（「EGF P」）が挿入されている。 RNAi活性の検出は、 EGFPの蛍光量を検出することにより 行うことができる。蛍光量の測定は、通常の方法に従って行うことができる。また、 EG FP遺伝子とは別の発現調節領域支配下に耐性遺伝子としてピューロマイシン耐性 遺伝子（「puro」 )が組み込まれており、トランスフエタトされた細胞のピューロマイシン による選択 (濃縮)が可能である。
[0044] 図 6に示す発現ベクターには、イントロン（「intron」）が挟み込まれたフォワードプラ イマ一対応領域（「PAR (F) 1」）、リバースプライマー対応領域（「PAR (R) 1」）が組 み込まれている。すなわち、図 6の発現ベクターを用いて、上記 RT— PCRによる検出 を行うこともできる。ピューロマイシン耐性遺伝子（「puro」）には、イントロンが挟み込 まれた PAR (F) 3および PAR (R) 3が含まれており、ピューロマイシン耐性遺伝子内 のプライマー対応領域を利用してピューロマイシン耐性遺伝子の RNAを定量し、ィ ンターナルコントロールとして用いることができる。また、ピューロマイシン耐性につい て細胞の選択を行うことにより、発現ベクター等が導入された細胞の割合を高めること ができる。他の点は、図 5の例の場合と同様である。
[0045] 図 7に示す発現ベクターは、レポーターとしてフアイヤーフライルシフェラーゼ遺伝 子（「F. LucJ： Firefly Luciferase gene)が組み込まれている。すなわち、標的配列（「 target] )と共に一体として転写される位置にフアイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子（ 「F. Luc」）が組み込まれている。また、これとは別の発現調節領域支配下にレニラル シフェラーゼ遺伝子（「R. LucJ：
Renilla Luciferase gene)が組み込まれている。 RNAi活性は、ルシフェラーゼアツセィ 法によりルミノメーターなどを用いて発光の測定を行うことで判別することができる。フ アイヤーフライルシフェラーゼの発光が検出されれば RNAi活性がないと判別される 。フアイヤーフライルシフェラーゼの発光が抑制あるいは検出されない場合には、 RN Ai活性があると判別される。レニラルシフェラーゼの発光はインターナルコントロール として用いることができる。また、現時点においてであるが、ルシフェラーゼアツセィは RT— PCRよりも簡便なアツセィ法であり、よりハイスループットな評価方法とすることが できる。他の点は図 5または図 6と同様である。
[0046] 1-3 インターナルコントロールによる検出シグナル正規化
本発明の他の好ましい実施形態として、インターナルコントロールを用い、各試験 サンプル間の各種の誤差、具体的には、標的発現分子および評価対象核酸分子の トランスフエクシヨン効率のばらつき、回収時の細胞数のばらつき、 RNA抽出後の RN A収量（RNA収率）のばらつき、 PCRのテンプレートとして加える cDNA量のばらつ きなどを是正することができる実施形態について説明する。
[0047] 本発明の評価方法にお!、ては、細胞発現系であっても、無細胞発現系であっても 、標的発現分子および評価対象核酸分子を発現系に供給し、標的発現分子から所 定の RNAを発現させる。ところで、 RNAi活性がある場合、 RNAが切断されるため、 RNAi活性があることは、所定の DNAの増幅が抑制される、あるいは、発現産物が 検出されないなどの現象として判別される。し力しながら、何らかの理由でもともと標 的発現分子等が発現系に適切に供給されて！ヽな！ヽ場合ある！ヽは発現系が適切に機 能していない場合にも、所定の DNAの増幅抑制、または発現産物の不検出などの 現象が現れる。また、各試料サンプル間で標的発現分子および評価対象核酸分子 のトランスフエクシヨン効率のばらつき、回収時の細胞数のばらつき、 RNA抽出後の RNA収量（RNA収率）のばらつき、 PCRのテンプレートとして加える cDNA量のばら つきなどを生じる可能性もある。そこで、このような問題を是正する手段が設けられる ことがより好ましい。
[0048] 本検出シグナルの正規化を含む実施形態では、転写される RNAが評価対象核酸 分子によって切断されない配列力 なり、かつ検出可能な発現産物をコードするコン トロール配列を含むコントロール供給分子が、前記標的発現分子と前記評価対象核 酸分子とが供給される発現系内に供給される。
[0049] コントロール供給分子は、コントロール配列を含むポリヌクレオチドである。コント口 ール配列は検出可能な発現産物をコードしている。発現産物としては、例えば RNA 、ポリペプチド、タンパク質などが含まれる。また、コントロール配列は、同じく発現系 に供給される評価対象核酸分子によって少なくとも mRNAが切断されないものであ る。すなわち、本導入確認系の実施形態は、評価対象核酸分子によって RNAiを受 けな 、分子を供給するものである。評価対象核酸分子によって mRNAが切断されな いという条件を満たす限り、例えば、上記「1 2」で例示したレポーターを用いることが できる。発現産物の検出は、発現産物の種類に応じて適宜選択される。
[0050] 評価対象核酸分子によって切断されない配列は、実験により確認されたものであつ てもよい。例えば、本発明の評価方法により、評価対象核酸分子が RNAi活性を示さ ない配列も容易に検出することができるため、本発明の評価方法で予め RNAi活性 を示さな ヽことを確認した配列を用いることができる。標的対象核酸分子が RNAi活 性を示さないことは、 RT— PCRによる DNAの増幅、発現産物の検出という現象で把 握できるため、偽陽性の問題は生じず、判別は容易である。
[0051] 具体例としては、例えば図 2および図 3の組み合わせなどによる方式が含まれる。こ の場合、図 3に示す PCRフラグメント 2がコントロール供給分子として用いられる。例 えば、 PAR(F) 1および PAR (R) 1を利用した標的配列に係る PCRとは別に、コント ロール配列部位に係る PAR (F) 2および PAR (R) 2の組み合わせによる PCRを行!ヽ 、標的配列に係る PCRの測定値をコントロール配列部位に係る PCRの測定値で割 つた値を各試料サンプルについて求めることにより、各サンプル間での誤差を正規ィ匕 して、より的確に比較することができる。具体的には、例えば、標的発現分子および 評価対象核酸分子のトランスフエクシヨン効率のばらつき、回収時の細胞数のばらつ き、 RNA抽出後の RNA収量（RNA収率）のばらつき、 PCRのテンプレートとして加 える cDNA量のばらつきなどの各サンプル間の誤差について正規化することができ る。
[0052] PCRフラグメント 2はネオマイシン耐性遺伝子を有している。図 3に示す例では、 PA R (F) 2および PAR (R) 2はネオマイシン耐性遺伝子中の配列をそのまま利用して、 PCRプライマーが設計される。
[0053] 上記のようにコントロール供給分子を標的発現分子とは別個に作製して発現系に 供給しても良いが、他の形態として、コントロール配列を標的発現分子に組み込んで もよい。標的発現分子に組み込むには、コントロール配列およびコントロール配列を 発現させるための発現調節領域を標的発現分子内に備えるようにすればよい。コント ロール配列は、上記コントロール供給分子に含まれるコントロール配列と同様である。
[0054] コントロール配列を標的発現分子に組み込んで発現系に導入する場合、コントロー ル供給分子と共に必ず標的配列部分も発現系内に導入される。したがって、コント口 ール配列を標的発現分子内に組み込むことにより、コントロール供給分子と標的発 現分子につ 、てトランスフエクシヨン効率の差を考慮することを要しな ヽと 、う点でメリ ットがある。他方、標的発現分子にコントロール供給分子を組み込まない場合、一般 にトランスフエクシヨン効率は分子サイズが小さいほど良くなる傾向があるため、標的 発現分子のトランスフエクシヨン効率を良くすることができる。また、図 2および 3に示 す PCRフラグメントからなる標的発現分子は、ベクターをコンストラタシヨンすることなく PCRにより簡便に作製できる点でメリットがある。
[0055] 標的発現分子の具体例としては、例えば、図 6および 7に示す形態などが示される 。図 6に示す例では、標的発現分子中にピューロマイシン耐性遺伝子（「puro」 )が組 み込まれており、このピューロマイシン而性遺伝子（「puro」）中にイントロン（「intron 」）、 PAR(F) 3および PAR (R) 3が設けられており、インターナルコントロールとして 用いることができる。図 6に示す例では、 PAR (F) 3中にイントロンが組み込まれてい る。インターナルコントロールによる正規ィ匕の手法における他の点は、上記図 2および 3の例における正規ィ匕の説明と同様である。
[0056] 図 7に示す例では、標的発現分子にレニラルシフェラーゼ遺伝子（「R. Lucj )が組 み込まれている。レニラルシフェラーゼ遺伝子は、フアイヤーフライルシフェラーゼ遺 伝子のインターナルコントロールである。標的発現分子に組み込まれたレニラルシフ エラーゼ遺伝子中には、 PAR(F) 4、 PAR (R) 4およびイントロンが設けられている。「 フアイヤーフライルシフェラーゼの発光度値 Zレニラルシフェラーゼの発光度値」を算 出することによりルシフェラーゼの相対活性を求めることもできる。正規化された値に 基づき、より正確なデータの比較が可能である。
[0057] 1-4 副作用確認系
RNAi活性を有する siRNA、 siRNAを発現する RNAiベクターなどは所定の遺伝 子の発現を抑制することができるため、遺伝子治療薬等としての用途が考えられる。 しかし、治療薬とするためには、ある特定の siRNA力 生体内の他の遺伝子等にも 作用して、副作用を生じさせないことが求められる。
[0058] ところで、 RNAiを受ける配列と siRNAの配列とは、同じ塩基配列を有する。しかし 、類似した配列どうしの場合でも RNAiが生じることがある。したがって、どのような類 似範囲で RNAiが生じるのかを評価することは上記のような副作用防止の観点から 重要である。
[0059] 本副作用確認系の実施形態は、上記本発明の評価方法にお!、て、評価対象核酸 分子として、標的配列が有する塩基配列とは異なる塩基配列を有するものを用いる。 あえて標的配列とは異なる塩基配列を評価対象として用いることにより、その評価対 象核酸分子が有する RNAi活性の作用範囲を明らかにすることができる。
[0060] 2. miRNA活性の評価方法
また、本発明は、 miRNA活性の評価法も提供する。本発明の miRNA活性の評価 方法は、上記 RNAi活性の評価方法における評価対象核酸分子として、 miRNA活 性を測定しょうとする分子を用いる。すなわち、本発明の miRNA活性の評価方法で は、少なくとも、標的配列と、前記標的配列を含む RNAの発現を調節する発現調節 領域と、前記標的配列と一体の mRNAとして転写される位置にレポーターとして検 出可能な発現産物をコードする配列とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と 、前記標的配列を含む RNAに対して miRNA活性を有するか否かを評価の対象と する評価対象核酸分子とを、前記標的発現分子が標的配列を含む RNAを発現可 能な発現系内に供給し、前記レポーターの発現が抑制された力否かを検出する。
[0061] miRNAは、タンパク質に翻訳されな 、20数塩基の RNAとして知られて!/、る。した がって、評価対象核酸分子としては、タンパク質に翻訳されない 20数塩基の RNAま たはヘアピン構造を有する miRNA前駆体などが用いられる。なお、このような RNA を発現する発現ベクターを用いて、標的配列発現分子を供給する発現系へ供給して ちょい。
[0062] miRNAは主に翻訳抑制として作用するものと考えられているため、 miRNA活性 の評価としては、標的配列を含む RNAがコードするタンパク質の発現が抑制された か否かを検出することが、より正確な評価を行う上で好適である。すなわち、標的配 列と一体の mRNAとして転写される位置にレポーターとして検出可能な発現産物を コードする配列を、標的発現分子中に組み込む。 miRNA活性の検出手法は、上記 RNAi活性の評価方法における「1 2 レポーター方式」の欄に説明した方法と同様 にして行うことができる。 miRNA活性がある場合には、レポーターが検出されない、 またはレポーターの発現が抑制されるという形態で判別される。
[0063] 標的発現分子等が供給される発現系は、無細胞発現系でもあっても、細胞発現系 であってもよい。また、 miRNA活性の評価方法においても、 RNAi活性の評価方法 の場合と同様に、インターナルコントロールによる検出シグナル正規化（上記「1—3」 参照）の実験系を構築することができる。ただし、 miRNA活性の評価の場合には、コ ントロール配列は、評価対象核酸分子によって発現抑制されない配列からなり、かつ 、検出可能な発現産物をコードする。さらに、 RNAi活性の評価方法と同様に、副作 用確認系（上記「1-4」参照)の実験系を構築することもできる。
[0064] 3. RNA干渉の標的塩基配列検索方法
本 RNA干渉の標的塩基配列検索方法 (以下「本検索方法」 、う場合がある）は、 標的とする遺伝子の塩基配列中から、 RNA干渉の起因となる塩基配列を探し出す 方法である。具体的には、本検索方法では、 RNA干渉の標的遺伝子の塩基配列か ら、下記 (a)力も (d)の規則に従う配列部位を検索する。 (a) 3'末端の塩基力 アデニン、チミンまたはゥラシルである。
(b) 5'末端の塩基力 グァニンまたはシトシンである。
(c) 3'末端の 7塩基の配列において、アデニン、チミンおよびゥラシルカ なる群より 選ばれる 1種または 2種以上の塩基がリッチである。
(d)塩基数が、細胞毒性を生じさせずに RNA干渉を生じさせ得る数である。
[0065] 「標的遺伝子」における「遺伝子」とは、遺伝情報をコードする媒体のことを ヽぅ。「遺 伝子」は DNA、 RNA、 DNAおよび RNAの複合体など遺伝情報をコードする物質 により構成されるが、遺伝情報としては、物質そのものではなく塩基配列を電子デー タ化したものをコンピュータ上などで扱うことが可能である。「標的遺伝子」は、 1つの コード領域としてもよいし、複数のコード領域にわたっていてもよいし、また、配列が 判明したすべてのポリヌクレオチドを標的としてもょ 、。特定の機能を有する遺伝子 について検索したい場合には、その特定遺伝子のみを標的とすることにより、当該特 定遺伝子に特異的に RNA干渉を生じさせる塩基配列を効率よく検索することができ る。すなわち、 RNA干渉は mRNAを干渉破壊する現象として知られており、特定の コード領域を選択することにより検索負荷を軽減できる。また、転写領域のひとまとま りを標的遺伝子として検索してもよい。なお、本明細書中では上記 (a)から (d)の規則 を満たす塩基配列のことを「規定配列」という。上記規則においては、塩基配列が D NAの配列であればチミンカ RNAの配列であればゥラシルが対応する。
[0066] 規則（c)は、 3'末端近傍の配列にアデニン、チミン、およびゥラシルからなる群より 選ばれる塩基がリッチに含まれていることを規定しており、具体的に検索を行う際の 一指標として 3'末端部から 7塩基の範囲内において、アデニン、チミン、およびゥラシ ルカも選ばれる塩基がリッチな配列であることを規定している。
[0067] 規則 (c)にお 、て、「リッチな配列」とは特定の塩基が現れる頻度が高!、ことを意味 し、割合を概略的に示すと、規定配列における 3'末端側の 5— 10塩基、好ましくは 7 塩基の配列中にアデニン、チミンおよびゥラシルカもなる群より選ばれる 1種または 2 種以上が、少なくとも 40%以上、より好ましくは 50%以上含まれることを意味する。よ り具体的には、例えば約 19塩基程度の規定配列の場合を例に挙げると、 3'末端側 の 7塩基のうち好ましくは少なくとも 3塩基以上、より好ましくは 4塩基以上、特に好ま しくは 5塩基以上力 アデニン、チミンおよびゥラシルカ なる群より選ばれる 1種また は 2種以上である。
[0068] 規則 (c)に該当するか否かを確認する手段は特に制限されず、 7塩基中の好ましく は 3塩基以上、より好ましくは 4塩基以上、特に好ましくは 5塩基以上がアデニン、チミ ンまたはゥラシルであることを確認できればよい。例えば、了ザニン、チミンおよびゥラ シルカ なる群より選ばれる 1種または 2種以上力 3'末端側の 7塩基の配列中に 3 つ以上含まれることをリッチであると定義した場合を例として説明すると、 3'末端の第 1番目の塩基力 逐次上記 3種の塩基のいずれかであるか否かを照合し、第 7番目 の塩基に至るまでに 3つ現れた場合に、規則（c)に適合すると判断することができる。 例えば、第 3番目までに 3つ現れれば、 3つの塩基を調べれば足りる。すなわち、規 則 (c)について検索する場合、必ずしも 3'末端側の 7塩基についてすべて照合する ことは要しない。逆に第 7番目までに 3つ以上現れなければリッチではなぐ規則（c) を満たさないと判断される。
[0069] 二本鎖ポリヌクレオチドにおいてはアデニンとチミンまたはゥラシルとが相補的に水 素結合することは周知である。また、グァニンとシトシンとの相補的な水素結合 (G— C 水素結合）においては 3つの水素結合部位が形成されるのに対し、アデニンとチミン またはゥラシルとの相補的水素結合 (A— (TZU)水素結合）においては 2つの水素 結合部位があり、一般的にいって、 G— C水素結合に対し、 Α— (TZU)水素結合の ほうが結合力は弱い。
[0070] 規則 (d)にお 、ては、検索する塩基配列の塩基数を規定して!/、る。検索する塩基 配列の塩基数は、 RNA干渉を生じさせ得る塩基数である。また、生物の種類などの 条件により、塩基数があまりに大きすぎる siRNAでは細胞毒性を生じてしまうことが知 られている。塩基数の上限は、 RNA干渉を生じさせようとする生物の種類などにより 異なるが、 siRNAを構成する一本鎖の塩基数は 、ずれの種にせよ 30以下であること が好ましい。また、哺乳動物の場合には、塩基数は、好ましくは 24以下、より好ましく は 22以下である。また、下限は RNA干渉を生じさせる限りにおいて特に制限される ものではないが、好ましくは 15以上、より好ましくは 18以上、さらに好ましくは 20以上 である。 siRNAを構成する一本鎖としての塩基数は、 21で検索することが特に好まし い。
[0071] なお、以下においても説明する力 siRNAには、規定配列の 3'末端にオーバーハ ング部が設けられる。オーバーハング部は塩基数 2であることが好適である。したがつ て、オーバーハング部を含めず、規定配列のみの塩基数の上限としては、好ましくは 28以下、より好ましくは 22以下、さらに好ましくは 20以下であり、下限としては、好ま しくは 13以上、より好ましくは 16以上、さらに好ましくは 18以上である。規定配列の 最も好ましい塩基数は 19である。 RNAiの標的塩基配列の検索は、オーバーハング 部を含める場合および含めな 、場合の 、ずれで検索してもよ ヽ。
[0072] 規定配列に従う塩基配列は、 RNA干渉を生じさせる確率が極めて高い。したがつ て、本検索方法により、 RNA干渉を生じさせる配列を極めて高い確率で検出するこ とが可能であり、 RNA干渉を生じさせるポリヌクレオチドの設計を簡便化することがで きる。
[0073] なお、規定配列は、塩基数を定めた上で上記の（a)から (c)の規則に従う部分を検 索するようなプログラムを搭載するコンピュータを用いて効率的に検出可能である。
[0074] 4. RNA干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法
本塩基配列設計方法は、上記の検索方法により検索された塩基配列に基づいて R NA干渉を生じさせるポリヌクレオチド（siRNA)の塩基配列を設計するものである。 si RNAは主として RNA力 なる力 一部に DNAが含まれている混成ポリヌクレオチド も含まれる。本塩基配列設計方法では、上記 (a)から (d)の規則に従う塩基配列を標 的遺伝子の塩基配列から検索し、検索された塩基配列と相同な塩基配列を設計す る。（a)から (d)の規則および検索の手法については、上記検索方法について説明 したとおりである。
[0075] 「相同な配列」とは、同一の配列および RNA干渉を生じさせるという機能を失わな い範囲で前記同一配列に対し欠失、置換、挿入などの変異を含む配列のことをいう 。標的遺伝子の種類、配列などの条件にもよるが、許容される変異を相同性 (ホモ口 ジー）で例示すると、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%である。許容される変異の程度としての相同性を算出する場合、同一の検索ァ ルゴリズムを用いて算出された数値どうしを比較することが望まし 、。検索アルゴリズ ムは特に限定されないが、局所的な配列の検索に適したもの、より具体的には BLA ST、 SSearchなどを好適に用いることができる。
[0076] 上記のように、検索された配列は若干の改変が許容されるが、設計される塩基配列 の塩基数は、検索された配列と同一とすることが特に好ましい。塩基数を同一とした 場合について改変の許容度を例示すると、設計される塩基配列の塩基が、好ましく は 80%以上、より好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上検索された配列と 一致することが好適である。例えば、塩基数 19の塩基配列を設計する場合であれば 、好ましくは 16塩基以上、より好ましくは 18塩基以上が、検索された塩基配列と一致 することが好ましい。また、検索された塩基配列と相同な配列を設計する場合、検索 された塩基配列の 3'末端の塩基と設計される塩基配列の 3'末端の塩基とは同一で あることが望ましぐまた、検索された塩基配列の 5 '末端の塩基と設計される塩基配 列の 5'末端の塩基とが同一であることが望ましい。
[0077] 通常 siRNA分子には、オーバーハング部が設けられる。オーバーハング部とは、 二本鎖の siRNA分子において、各鎖の 3'末端に設けられた、一本鎖の状態で突出 した部分である。オーバーハング部は、生物の種類などにもよる力 塩基数は 2が特 に好適である。オーバーハング部の塩基配列は、基本的には任意である力 検索元 の標的遺伝子と同一の塩基配列、 TT、あるいは UUなどが好適に用いられる場合が ある。上記のように検索された塩基配列と相同な配列となるように設計された規定配 列の 3'末端に、オーバーハング部を設けることにより、 siRNAを構成するセンス鎖が 設計される。
[0078] また、最初力 規定配列およびオーバーハング部を含めて検索を行 、、設計するこ ともできる。オーバーハング部の好ましい塩基数は 2である。したがって、例えば、塩 基数 19の規定配列および塩基数 2のオーバーハング部力もなる siRNAを構成する 一本鎖の設計をする場合には、オーバーハング部を含めた siRNAの塩基数としては 塩基数 21の配列を標的遺伝子力も検索すればよぐまた二本鎖の状態について検 索する場合には、塩基数 23の配列を検索してもよい。
[0079] 本塩基配列設計方法では、上記のように所望の標的遺伝子から所定の配列を検 索してくるが、 RNA干渉を生じさせようとする対象は、標的遺伝子の由来と必ずしも 一致せずともよぐ類縁種などに適用可能である。例えば、第 1の種力 単離された 遺伝子を標的遺伝子とし、第 1の種の類縁種である第 2の種に用いる siRNAを設計 することもできる。さらに、例えば複数種の哺乳類から共通配列を検索し、この共通配 列から上記規定配列を検索して設計することにより、哺乳類に幅広く適用可能な siR NAの設計が可能である。複数の哺乳類に共通する配列は、他の哺乳類においても 保存されて 、る確率が高 、と考えられるためである。
[0080] 標的遺伝子と関係のな!、遺伝子につ 、てまで RNA干渉を生じさせな 、ようにする ためには、設計した配列と同一または類似の配列が他の遺伝子に含まれていないか 検索することが好ましい。設計した配列と同一または類似の配列の検索は、一般的な ホモロジ一検索を行うことができるソフトウェア等を用いて行えばよい。このような同一 Z類似配列を除外することにより、標的とする遺伝子のみに特異的に RNA干渉を生 じさせる配列を設計することができる。
[0081] 本塩基配列設計方法により、 RNA干渉を生じさせる RNA分子を、高 、確率でしか も容易に設計することができる。 RNAの合成は、未だ労力、時間、費用を要するが、 本塩基配列設計方法によりそれらを大幅に軽減することが可能である。
[0082] 5.二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法
本二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法は、 RNA干渉を生じさせる確率の高 、二本 鎖ポリヌクレオチドを作製する方法である。本二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオ チドの塩基配列が上記塩基配列設計方法に従って設計され、その配列設計に従うよ うに二本鎖ポリヌクレオチドが合成される。配列の設計における好ましい形態は、上 記塩基配列設計方法についての説明と同様である。
[0083] 二本鎖ポリヌクレオチドは RNA干渉を生じさせる二本鎖ポリヌクレオチドを構成する ものであり、このような二本鎖ポリヌクレオチドとして siRNAが知られている。なお、本 二本鎖ポリヌクレオチド作製方法により製造される二本鎖ポリヌクレオチドは RNAに より構成されることが好ましいが、一部に DNAを含む混成ポリヌクレオチドであっても よい。本明細書では一部に DNAを含むものも siRNAの概念に含める。また、本発明 者らの研究によれば、 siRNAは構造的または機能的にアシンメトリー性 (非対称性） を有する傾向が認められ、 RNA干渉を生じさせるという目的からすると、センス鎖の 5 ，末端側の半分、アンチセンス鎖の 3'末端側の半分は RNAで構成されることが望ま しい。
[0084] 二本鎖ポリヌクレオチドは、一方の鎖が標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、 (a) 力も (d)の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の 3'末端にオーバーハング部を設 けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の 3' 末端にオーバーハング部を設けて形成される。各鎖の塩基数はオーバーハング部を 含め 18— 24であり、より好ましくは 20— 22、特に好ましくは 21である。また、オーバ 一ハング部の塩基数は 2であることが好ましい。全体の塩基数が 21、そのうちオーバ 一ハング部が塩基数 2で構成される siRNAは、哺乳類でも細胞毒性を生じさせずに 高確率で RN A干渉を生じさせる siRNAとして好適である。
[0085] RNAの合成は、例えば、化学合成によって行ってもよいし、また、通常のバイオテ クノロジ一等の手法に従って行うこともできる。例えば、所定の配列を有する DNA鎖 を作製し、これを铸型として転写酵素を用いて一本鎖 RNAを合成し、一本鎖 RNAを 二本鎖化するなどの手法により合成することができる。
[0086] 上記本二本鎖ポリヌクレオチド作製方法により得られるポリヌクレオチドとして好まし V、形態としては、 RNA干渉の標的遺伝子の塩基配列中から上記 (a)から (d)の規則 に従う塩基数 13— 28の配列部位を検索し、一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中 に含まれる、上記 (a)から (d)の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の 3'末端に オーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列 と相補的な配列の 3'末端にオーバーハング部を設けて形成され、各鎖の塩基数が 1 5— 30であるように合成された、二本鎖ポリヌクレオチドが例示される。当該ポリヌクレ ォチドは、 RNA干渉を生じさせる確率の高 、ポリヌクレオチドである。
[0087] また、 siRNAを発現するような発現ベクターを調製することもできる。規定配列を含 む配列を発現するベクターを、発現が行われ得る無細胞系または細胞系の条件下 におくことで、発現ベクターを用いて所定の siRNAを供給することができる。
[0088] 従来、 siRNAの設計は、試験者の経験や勘に依存して!/、たため、試行錯誤を繰り 返すことが多力つた。しかし、本二本鎖ポリヌクレオチド作製方法により、 RNA干渉を 生じさせる二本鎖ポリヌクレオチドを高 、確率で製造することが可能である。上記標 的塩基配列検索方法、配列設計方法または二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法によ れば、 RNA干渉を利用した各種の試験や製造等に要する労力、時間、コストを大幅 に削減することが可能である。すなわち、上記標的塩基配列検索方法、塩基配列設 計方法および二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法は、遺伝子解析、創薬ターゲットの 探索、創薬、遺伝子治療、生物種間の差の研究などの RNA干渉を利用する様々な 試験、研究、開発、製造等を大幅に簡便にし、効率の向上を図ることができる。
[0089] 6.遺伝子の発現抑制方法
本遺伝子発現抑制方法は、所定の塩基配列を検索する工程と、検索された塩基配 列に基づ 、て siRNAの塩基配列を設計して合成する工程と、得られた siRNAを標 的遺伝子を含む発現系に導入する工程とを含む。
所定の塩基配列を検索する工程は、上記 RNA干渉の標的塩基配列検索方法に 従う。好ましい態様も上記のとおりである。また、検索された塩基配列に基づいて siR NAの塩基配列を設計して合成する工程は、上記、 RNA干渉を生じさせるポリヌクレ ォチドの塩基配列設計方法、二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法に従って行うことが でき、好ましい形態も同様である。
[0090] 得られた二本鎖ポリヌクレオチドは、標的遺伝子の発現系に添加されて標的遺伝 子の発現を抑制する。標的遺伝子の発現系とは、標的遺伝子が発現している系のこ とであり、より具体的には、少なくとも標的遺伝子の mRNAが形成される反応系を備 える系である。標的遺伝子の発現系としては、 In vitro, In vivoのいずれのものも 含まれる。標的遺伝子の発現系として、培養細胞、培養組織、生体などのほか、無細 胞系を用いることも可能である。発現抑制をしょうとする標的遺伝子 (抑制標的遺伝 子）は必ずしも検索された配列の由来と一致する生物種のものに限らずともよいが、 検索対象遺伝子と抑制対象遺伝子との由来が近縁であればあるほど、特異的かつ 効果的に特定遺伝子の抑制を行うことができる。
[0091] 「標的遺伝子の発現系に導入する」とは、導入対象を標的遺伝子の発現反応系の 中に取り込ませるということである。具体的に例を挙げると、標的遺伝子を有する培養 細胞に二本鎖ポリヌクレオチドをトランスフエタトし、細胞内に取り込ませる、規定配列 およびオーバーハング部力 なる塩基配列を有する発現ベクターを作製し、標的遺 伝子を有する細胞内に導入するなどの手法が挙げられる。
[0092] 本遺伝子抑制方法によれば、効率よく RNA干渉を生じさせるポリヌクレオチドを得 られるため、効率よぐまた簡便に遺伝子を抑制することが可能である。
[0093] 以下、本発明の実施例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、本発明は 下記実施例に限定されるものではな 、。
実施例
[0094] 実施例 1
1.標的発現ベクター pTRECの構築
pCI-neo (GenBank Accession No. U47120,プロメガ社製）の CMVェンハンサー Zプロモーター下流に標的 mRNA配列を構築した（図 8)。すなわち、コザック配列（ 「Kozak」 )、標的となる 23塩基対配列（「target」 )及び組み換えのための制限酵素（ Nhel、 EcoRI、 Xhol)認識配列を有する下記の二本鎖オリゴマーを合成した。この 二本鎖オリゴマーは配列表の配列番号 1に示す配列とその相補的な配列とからなる 。合成した二本鎖オリゴマーを pCI— neoの Nhel、 Xbalサイトに挿入し、標的発現べ クタ一 pTRECを構築した（図 8)。なお、イントロンは、 pCI— neoに当初から組み込ま れている β グロビン由来のイントロン部位を用いた。
5 -gctagccaccatggaattcacgcgtctcgagtctaga-3 (酉 C列备号 1)
[0095] 2.標的 mRNA検出用プライマーの効果
(1)培養細胞へのトランスフエクシヨン
24穴プレートの 1穴あたりに 0. 2—0. 3 X 106cellsの HeLa細胞をまき、 1日後に Lipofectamine 2000 (Invitrogen社製）を用いて、マニュアルにしたがって 0. 5 gの p TRECベクターをトランスフエタトした。
[0096] (2)細胞の回収および mRNAの定量
トランスフエクシヨンの 1日後、細胞を回収し、 TrizoKlnvitrogen社製)を用いて全 RN Aを抽出した。この RNA lOOngを用いて、オリゴ（dT)をプライマーとし、 Superscript II RT(Invitrogen社製)により逆転写して cDNA合成反応を行った。コントロールとして 、逆転写酵素を加えないものを用意した。得られた cDNAの 320分の1量を13じ1^テ ンプレートとし、 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems社製)を用いて、 50 μ 1の反応系で定量 的 PCRを行 、、標的 mRNA (mRNA (T)と称する）および、内部コントロールとして ρ TREC上のネオマイシン耐性遺伝子に由来する mRNA (mRNA (C)と称する）を定 量した。定量的 PCRにはリアルタイムモニタリング装置 ABI PRIZM 7000(Applied Biosystems社製)を用い、 mRNA(T)の定量にはプライマー対 T (配列表配列番号 2 および 3)、 mRNA(C)の定量にはプライマー対 C (配列表配列番号 4および 5)をそ れぞれ使用した。
[0097] プライマー対 T:
aggcactgggcaggtgtc (目 il歹 U番 2)
tgctcgaagcattaaccctcacta (酉己列 号 3)
[0098] プライマー対 C
atcaggatgatctggacgaag ( 歹 U番 4)
ctcttcagcaatatcacgggt ( C列 ¾·号 5)
[0099] 図 9および図 10に、 PCRの結果を示す。図 9および 10は、縦軸にそれぞれの PCR 産物量を、横軸に PCRのサイクル回数をとり、グラフに表したものである。ネオマイシ ン耐性遺伝子の場合、逆転写酵素により cDNAを合成したもの（+RT)と、逆転写酵 素をカ卩えな 、コントロール (-RT)で、得られた PCR産物の増幅の差は小さ力つた（ 図 9)。これは、 cDNAのみならず、細胞内に残っているベクターも PCRの铸型となつ て増幅されたことを示す。他方、標的配列 mRNAでは、逆転写酵素を添加した場合 (+RT)と添加しない場合 (一 RT)とによる差が大き力つた（図 10)。この結果は、ブラ イマ一対 Tのうち一方がイントロンを挟む形でデザインされているため、イントロンが除 去された mRNAに由来する cDNAが効率的に増幅される一方、イントロンを有する 残存ベクターが铸型となりにくくなつて 、ることを示して 、る。
[0100] 3. siRNAによる標的 mRNAの発現抑制
(1)ターゲット発現ベクターへの評価配列のクローニング
ヒトビメンチン (VIM)遺伝子 (Ref Seq ID: NM_003380)コード領域の812—834、 35 —57に相当する配列を評価の対象とした。これらの配列および EcoRI、 Xholの認識 配列を有する下記配列表配列番号 6および 7の合成オリゴヌクレオチド (評価配列フ ラグメント)を作製した。
評価配列 VIM— 35 (VIMの 35—57に相当）
0 -gaattcgcaggatgttcggcggcccgggcctcgag-3 (酉己歹 号。ノ
[0101] 評価配列 VIM— 812 (VIMの 812—834に相当）
5 -gaattcacgtacgtcagcaatatgaaagtctcgag-3 (酉己列番号 7)
[0102] 得られた評価配列フラグメントを、その両端にある EchoRIサイトおよび Xholサイト を利用して、 pTRECの EcoRI、 Xholサイト間に、新たな標的配列としてクローユング し、 pTREC— VIM35、 pTREC— VIM812を構築した。
[0103] (2) siRNAの作製
評価配列 VIM - 35 (配列表の配列番号 8、図 11)、評価配列 VIM - 812 (配列番 号 9、図 12)、およびコントロール配列（siContorol、配列番号 10、図 13)にそれぞ れ相当する siRNAフラグメントを合成し、アニーリングした。下記 siRNAの各配列に お!、ては、 3，末端にオーバーハング部を設けてある。
[0104」 siVIM— 35 5 - aggauguucggcggcccgggc- 3' (目 ti列番号 8)
[0105] siVIM-812 5'- guacgucagcaauaugaaagu- 3' (配列番号 9)
[0106] コントロールとして、ルシフェラーゼ遺伝子に対する siRNAを用いた。
[0107] siControl 5 - cauucuauccgcuggaagaug- 3' (目 c列番号 10)
[0108] (3)培養細胞へのトランスフエクシヨン
24穴プレートの 1穴あたりに 0. 2—0. 3 X 106cellsの HeLa細胞をまき、 1日後に Lipofectamine 2000 (Invitrogen社製）を用いて、マニュアルにしたがって 0. 5 gの p TREC— VIM35または pTREC— VIM812と、それぞれの VIM由来配列に相当する siRNA (siVIM— 35、 siVIM— 812、それぞれ終濃度 ΙΟΟηΜ)を同時にトランスフエ タトした。コントロール細胞には、 0. 5 gの pTREC— VIM35または pTREC— VIM8 12とルシフェラーゼ遺伝子に対する siRNA (siControl、終濃度 ΙΟΟηΜ)とを同時 にトランスフエタトした。
[0109] (4)細胞の回収および mRNAの定量
トランスフエクシヨンの 1日後、細胞を回収し、 Trizol(Invitrogen)を用いて全 RNAを 抽出した。この RNA lOOngを用いて、オリゴ（dT)をプライマーとし、 Superscript II RT (Invitrogen社製）により逆転写して cDN Aを得た。得られた cDNAの 320分の 1 量を PCRテンプレートとし、 SYBR Green PCR
Master Mix(Applied Biosystems社製)を用いて、 50 μ 1の反応系で定量的 PCRを行 い、評価しょうとする VIM由来の配列を含む mRNA (mRNA (T)と称する）および内 部コントロールとして、 pTREC上のネオマイシン而性遺伝子に由来する mRNA(mR NA (C)と称する）を定量した。
[0110] 定量的 PCRにはリアルタイムモニタリング装置 ABI PRIZM 7000(Applied
Biosystems社製)を用い、 mRNA(T)の定量にはプライマー対 T (配列表配列番号 2 および 3)、 mRNA(C)の定量にはプライマー対 C (配列表配列番号 4および 5)をそ れぞれ使用した。得られたそれぞれの mRNAの値の比（TZC)を縦軸（標的 mRNA 相対量 (％) )としてグラフに表した（図 14)。
[0111] コントロール細胞の場合、ルシフェラーゼ遺伝子に対する siRNAは標的 mRNAに 効果を及ぼさないため、 TZC比はほぼ 1になった。 VIM— 812 siRNAでは、 TZC 比が著しく下がった。これは、 VIM— 812 siRNAが、相当する配列を有する mRNA を切断したためであり、 VIM— 812 siRNAが RNAi効果を有することが示された。一 方、 VIM— 35 siRNAの場合、 T/C比はコントロールとほぼ同じ値であったことから 、 VIM— 35の配列には RNAi効果がほとんどないことが示された。
[0112] 施例 2
1. siRNAによる内在性ビメンチンの発現抑制
(1)培養細胞へのトランスフエクシヨン
24穴プレートの 1穴あたりに 0. 2—0. 3 X 106cells の HeLa細胞をまき、 1日後に Lipofectamine 2000 (Invitrogen社製）を用いて、マニュアルにしたがって、 VIMに対 する siRNA (siVIM— 35または siVIM— 812)またはコントロール siRNA (siControl ) 100nM、トランスフエクシヨン効率のコントロールとして 0. 5 gの pEGFP (Clontech 社製）を同時にトランスフエタトした。 pEGFPには EGFPが組み込まれている。
[0113] (2)内在性ビメンチン mRNAの測定
トランスフエクシヨンの 3日後、細胞を回収し、 TrizoKlnvitrogen社製)を用いて全 RN Aを抽出した。この RNAlOOngを用いて、オリゴ（dT)をプライマーとし、 Superscript II RT(Invitrogen社製)により逆転写して cDNA合成反応を行なった。得られた cDNA 産物を铸型として、ビメンチンに対するプライマー VIM— F3— 84、 VIM-R3-274 ( 配列番号 11および 12)を用いて PCRを行った。
[0114] VIM-F3-84 ;
gagctacgtgactacgtcca (酉己列番号 11)
VIM— R3— 274 ; gttcttgaactcggtgttgat (配列番号 12)
[0115] また、コントロールとして、 j8—ァクチンに対するプライマー ACTB— F2— 481、 ACT B-R2-664 (配列番号 13および 14)を用いて PCRを行 、、各サンプル間の β—ァク チンの定量値を合わせたうえで、ビメンチンの発現量を評価した。
[0116] ACTB-F2-481 ; cacactgtgcccatctacga (配列番号 13)
ACTB-R2-664； gccatctcttgctcgaagtc (配列番号 14)
[0117] 結果を図 15に示す。図 15では、 siControl (すなわち、標的とは無関係な配列の si RNA)を入れた場合を 100%として比較し、 VIMに対する siRNAを入れた場合に、 VIMの mRNAがどの程度減少したかを表して!/、る。 siVIM—812は効果的にVIM mRNAを抑制できたのに対して、 siVIM—35を用いた場合はほとんど RNAi効果を 示さなかった。
(3)細胞の抗体染色
トランスフエクシヨンの 3日後、細胞を 3. 7%のホルムアルデヒドにより固定し、定法 によりブロッキングを行った。その後、ゥサギ抗ビメンチン抗体（α— VIM)または内部 コントロールとしてゥサギ抗 Yes抗体 — Yes)をカ卩え、室温で反応させた。その後、 細胞表面を PBS (Phosphate Buffered Saline;リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、二 次抗体として蛍光標識抗ゥサギ IgG抗体を加え、室温で反応させた。細胞表面を PB Sで洗浄の後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
[0118] 蛍光顕微鏡観察の結果を図 16に示す。図 16中、 9つの各枠内において、白く表示 されている部分が蛍光が現れている部分である。 EGFPおよび Yesについては、何 れの細胞でも同程度の発現が確認された。 siControl、 siVIM—35を導入した細胞 では、ビメンチンの抗体染色による蛍光が観察され、内在性ビメンチンの存在が確認 された。一方、 siVIM—812を導入した細胞では、 siControl、 siVIM— 35を導入した 細胞に比べて蛍光が著しく弱力つた。この結果は、
Figure imgf000034_0001
内在性のビメ ンチン mRNAが干渉を受けた結果、ビメンチンの蛋白質の発現量が減少したことを 示すものであり、 siVIM-812は内在性ビメンチン mRNAにも RNAi効果を有するこ とが明らかになった。
本発明のアツセィ系で得られた結果 (実施例 1)は、実際に内在性遺伝子に対して それぞれの siRNAを用いた結果 (実施例 2)とよく一致していたため、このアツセィ系 は任意の siRNAの RNAi活性を評価する方法として有効なものと考えられる。 産業上の利用可能性
[0119] 本発明は、バイオテクノロジーの実験、研究、開発、さらには医薬開発などに好適 に用いることができる。
[0120] この出願は、平成 15年 11月 21日出願の日本特許出願、特願 2003— 392304に 基づくものであり、特願 2003— 392304の明細書および特許請求の範囲に記載され た内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
配列表フリーテキスト
[0121] 配列番号 1； Nhel、 EcoRIおよび Xhol制限サイトを含むオリゴマー
配列番号 2； PCRプライマー T
配列番号 3； PCRプライマー T
配列番号 4； PCRプライマー C
配列番号 5； PCRプライマー C
配列番号 6；標的配列 VIM35
配列番号 7；標的配列 VIM812
配列番号 8 ;評価対象 siRNAゝ siVIM-35
配列番号 9；評価対象 siRNAゝ siVIM-812
配列番号 10 ;コントロール siRNA、 siControl
配列番号 11； PCRプライマー VIM— F3— 84
配列番号 12； PCRプライマー VIM— R3— 274
配列番号 13； PCRプライマー ACTB - F2 - 481
配列番号 14 ; PCRプライマー ACTB— R2—664

Claims

請求の範囲
[1] 少なくとも標的配列と前記標的配列を含む RNAの発現を調節する発現調節領域と を含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、
前記標的配列を含む RNAに対して RNAi活性を有するか否か評価の対象とする 評価対象核酸分子とを、
前記標的発現分子が標的配列を含む RNAを発現可能な発現系内に供給し、 前記標的配列を含む RNAが切断されたか否かを検出する、
RNAi活性の評価方法。
[2] 前記標的発現分子が、標的配列の上流および下流のそれぞれに、 PCRプライマ 一がァニール可能な配列を有する PCRプライマー対応領域を備え、
前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが前記発現系に供給されて生じた 標的配列を含む RNAを、 PCRプライマー対応領域の配列にァニールする 1対のプ ライマーを用いて RT-PCRにより定量し、
前記評価対象核酸分子を前記発現系に供給しな!、場合と比較して、前記標的配 列を含む RNAが切断されたか否かを検出する、請求の範囲 1記載の RNAi活性の 評価方法。
[3] 標的配列の上流および下流にある PCRプライマー対応領域の少なくとも一方の領 域内部にイントロンが挟み込まれており、かつ、前記発現系が RNAをスプライシング 可能な発現系である、請求の範囲 2記載の RNAi活性の評価方法。
[4] 前記標的発現分子が、前記標的配列と一体の mRNAとして転写される位置に、レ ポーターとして検出可能な発現産物をコードする配列を含み、 前記レポーターの発現を検出することにより RNAが切断された力否かを検出する、 請求の範囲 1記載の RNAi活性の評価方法。
[5] 前記発現系が、無細胞発現系または細胞発現系である、請求の範囲 1から 4のい ずれか一項に記載の RNAi活性の評価方法。
[6] 転写される RNAが評価対象核酸分子によって切断されない配列からなり、かつ検 出可能な発現産物をコードするコントロール配列を含むコントロール供給分子を、前 記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが供給される発現系内に供給する、請 求の範囲 1から 5のいずれか一項に記載の RNAi活性の評価方法。
[7] 前記標的発現分子に、転写される RNAが評価対象核酸分子によって切断されな い配列力 なり、かつ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列が組み込ま れている、請求の範囲 1から 5のいずれか一項に記載の RNAi活性の評価方法。
[8] 前記標的配列が、評価対象核酸分子が有する塩基配列とは異なる塩基配列を有 する、請求の範囲 1から 7のいずれか一項に記載の RNAi活性の評価方法。
[9] 少なくとも、標的配列と、前記標的配列を含む RNAの発現を調節する発現調節領 域と、前記標的配列と一体の mRNAとして転写される位置にレポーターとして検出 可能な発現産物をコードする配列とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、 前記標的配列を含む RNAに対して miRNA活性を有するか否カゝ評価の対象とす る評価対象核酸分子とを、
前記標的発現分子が標的配列を含む RNAを発現可能な発現系内に供給し、 前記レポーターの発現が抑制された力否かを検出する、
miRNA活性の評価方法。
[10] 前記発現系が、無細胞発現系または細胞発現系である、請求の範囲 9記載の miR NA活性の評価方法。
[11] 評価対象核酸分子によって発現抑制されない配列力 なり、かつ検出可能な発現 産物をコードするコントロール配列を含むコントロール供給分子を、前記標的発現分 子と前記評価対象核酸分子とが供給される発現系内に供給する、請求の範囲 9また は 10記載の miRNA活性の評価方法。
[12] 前記コントロール供給分子が、前記標的発現分子に組み込まれて!/、る、請求の範 囲 11記載の、 miRNA活性の評価方法。
[13] 前記標的配列が、評価対象核酸分子が有する塩基配列とは異なる塩基配列を有 する、請求の範囲 9から 12のいずれか一項に記載の miRNA活性の評価方法。
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