JPS6231920B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の分野］ 本発明は相補的なポリヌクレオチドセグメント
の特異的分子結合、すなわち普通ハイブリダイゼ
ーシヨンとして知られているものに関する発明で
あり、とくに特定のポリヌクレオチド配列を測定
するための核酸ハイブリダイゼーシヨン法および
試薬系に適用されるものである。核酸ハイブリダ
イゼーシヨン法の原理は、ポリヌクレオチド塩基
配列の測定および単離の手段として組換え遺伝子
の分野の研究者によつて開発されたものである。
２本鎖の形態の核酸を変性することによつて得ら
れるDNAやRNAなどの１本鎖の核酸は、適当な
条件下で相補的な１本鎖核酸とハイブリダイズ
（再結合）する。かかる相補的な核酸プローブ
を、検出が容易な化学物質で標識することによ
り、１本鎖の被検核酸を含む試験媒体中のポリヌ
クレオチド塩基配列の存在を検出することが可能
になつた。 ハイブリダイゼーシヨン技術は、組換えDNA
の分野だけでなく、他の様々な分野、とりわけ人
間医学および獣医学、農業、食品科学の分野にお
ける分析上重要なポリヌクレオチドの検出に応用
することができる。就中この技術は、細菌やビー
ルスなどの病原体の検出、同定や、細菌の抗生物
質耐性のスクリーニング、鎌状赤血球貧血や地中
海貧血などの遺伝性疾患の診断の補助、あるいは
ガン化した細胞の発見に利用することができる。
ハイブリダイゼーシヨン法の概観ならびに現在お
よび将来におけるその意義に関する考察が「バイ
オテクノロジー（Biotechnology）」（1983年８
月）の471〜478ページに掲載されている。 ［発明の背景］ 以下の情報は、本発明に関連があると出願人が
考える事項を開示するために提供するものであ
る。ただし、以下の事項のいずれかが本発明に先
行する技術であると認めるわけでは必ずしもな
く、またそのように解釈すべきでもない。 ウエツトマー（Wetmur）（1974年）は、溶液
中のDNAのハイブリダイゼーシヨン速度が10％
デキストラン硫酸によつて約10倍高められること
を見出している（「バイオポリマーズ
（Biopolymers）」14：2517〜2524）。非イオン性
重合体のデキストランによるハイブリダイゼーシ
ヨン促進効果ははるかに小さく、またハイブリダ
イゼーシヨン速度の対数とポリマー溶液の粘度の
間には線形の関係が存在した。ウオール
（Wahl）ら（1970年）は、共有結合によつて１本
鎖DNAをジアゾベンジルオキシメチルセルロー
スに固定し、溶液中における放射性同位元素で標
識したDNAのハイブリダイゼーシヨン速度を10
％デキストラン硫酸によつて100倍も高めたと報
告している（「プロシーデイング・ナシヨナル・
アカデミー・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.
）」76：3683〜3687）。米国特許第4302204号に
は、デキストラン硫酸や他の荷電多糖類を用い
て、ポリヌクレオチドの一方を共有結合で固相に
固定したハイブリダイゼーシヨン反応の速度を上
げる方法が示されている。非常に少量のDNA配
列の検出が必要な場合は、10％デキストラン硫酸
がしばしばハイブリダイゼーシヨンに使用されて
いる。 ハイブリダイゼーシヨン反応は長時間のインキ
ユベーシヨンを必要とする傾向があり、ハイブリ
ダイゼーシヨン法を実施する多くの場合において
インキユベーシヨンを短縮する手段が有用であり
うるが、ハイブリダイゼーシヨン速度の増進にデ
キストラン硫酸を使用することには欠点がある。
すなわち、このポリマーは比較的高価であり、大
量に、サザン法の場合のように面積の広い支持体
をハイブリダイゼーシヨン溶液でおおう必要があ
る場合はとくに大量に用いられる。また10％デキ
ストラン硫酸は、上記のウオール（Wahl）らや
ラニキ（Raniki）ら（「微生物学・免疫学の最新
の話題（Current Topics in Microbiology and
Immunology）」104：307〜318、1983年）が報告
しているように、ニトロセルロースやセルロース
の支持体への標識化（ラベル化）したDNAプロ
ーブの非特異的な吸着を増大させる。 レンツ（Renz）とクルツ（Kurz）（1984年）
は、ペルオキシダーゼでラベルした核酸を用いた
ハイブリダイゼーシヨンでは、デキストラン硫酸
よりポリエチレングリコールの方がすぐれている
ことを見出している（「ニユークレイツク・アシ
ズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）」12：
3435〜3444）。しかしながら、ポリアクリル酸塩
については、DNAのハイブリダイゼーシヨン速
度に影響を与えないと報告されている［スビラナ
（Subirana）とドテイ（Doty）、「バイオポリマー
ズ（Biopolymers）」４：171〜187）。 ［発明の要約］ アクリル酸塩のアニオン重合体が水性媒体にお
ける相補的なポリヌクレオチドセグメントのハイ
ブリダイゼーシヨン速度を上げることが判つた。
そしてこの新しい速度増進化合物は、従来最も普
通に用いられてきた化合物であるデキストラン硫
酸に優る利点を有しており、微生物による分解に
耐え、かつハイブリダイゼーシヨン速度を上げる
能力に関してはデキストラン硫酸と同等である。 この反応促進効果は、溶液試験および被検核酸
を固定化しラベルしたプローブを使用する固相検
定をはじめとするハイブリダイゼーシヨン法にお
いてとりわけ有用である。通常用いられるニトロ
セルロース支持体へのプローブの非特異的な吸着
は、デキストラン硫酸存在下よりポリアクリル酸
塩やポリメタクリル酸塩存在下の方がかなり少な
い。ポリアクリル酸塩がとくに有利であるのは、
低濃度で効果があるためと、デキストラン硫酸に
比べて相当安価であるためである。 ［好ましい実施態様の説明］ ポリアクリル酸塩およびポリメタクリル酸塩
は、in situで形成されうるか、あるいはこれら
のポリマーをナトリウム、カリウム、アンモニウ
ムなどの塩の形で加えることによつて形成されう
るアニオン型でハイブリダイゼーシヨン水性媒体
に存在することになる。塩の選択に当たつては、
ハイブリダイゼーシヨン媒体の他の構成要素に対
する特定の対カチオンの影響を考慮する。たとえ
ば、沈殿を防ぐために硫酸ドデシルを界面活性剤
として用いる場合はカリウム塩を選択しないこと
が多い。ハイブリダイゼーシヨン媒体は水性であ
り、ポリアクリル酸塩またはポリメタクリル酸塩
の値に、緩衝剤や有機溶媒、界面活性剤、非特異
的核酸、およびフイコール（Ficoll）［フアーマ
シア・フアイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine
Chemicals）（ニユージヤージー州ピスカタウエ
イ）から市販の庶糖とエピクロロヒドリンの共重
合体］やポリビニルピロリドンなどのポリマーを
含むことができる。ハイブリダイゼーシヨン媒体
中のポリアクリル酸塩およびポリメタクリル酸塩
の濃度（容量に対する重量百分率（ｗ／ｖ）で表
わす）は、ポリアクリル酸塩の方が通常約0.2〜
10％の範囲−0.5〜５％程度が望ましい−、ポリ
メタクリル酸塩は通常約1.0〜50％の範囲−５〜
25％程度が望ましい−である。これらのポリマー
の分子量は、広い範囲にわたるが、通常約5000〜
1000000ダルトン、望ましい分子量は約50000〜
500000ダルトンである。 アニオン性重合体であるポリアクリル酸塩およ
びポリメタクリル酸塩は、核酸ハイブリダイゼー
シヨンの促進因子としてとりわけ利点が大きいこ
とが明らかになつた。本発明の意図および範囲を
逸脱することなくこの目的のために同等の種々の
アクリル酸塩重合体を使用できることは明白であ
る。アクリル酸塩の様々な単独重合体および共重
合体は、本発明の化合物がもつハイブリダイゼー
シヨン促進特性を有することが予期され、従つて
本明細書の特許請求の目的にとつては本発明の化
合物と同等であるとみなされる。 本発明は、水性媒体中における２種の相補的な
ポリヌクレオチドセグメントのハイブリダイゼー
シヨン速度を増大したい場合に常に有用である。
相補的なポリヌクレオチドセグメントは、通常別
個のポリヌクレオチド鎖の一部もしくは全体を成
している。本明細書で使用するポリヌクレオチド
という用語には、鎖がもつと短いオリゴヌクレオ
チドと表記されることがあるものや、RNA、
DNAおよびその適当な誘導体が含まれる。本発
明のポリマーを含む水性媒体中においては、
DNA−DNAハイブリツド、RNA−RNAハイブリ
ツドおよびDNA−RNAハイブリツドの形成速度
が高められる。 速度増大効果の主たる適用対象は核酸ハイブリ
ダイゼーシヨン法である。本発明のポリマーの使
用は、特定のハイブリダイゼーシヨンフオーマツ
トに限定されないが、使用することが望ましく使
用による利点が大きいフオーマツトがありうる。
しかしながら、一般的にいつて、ハイブリダイゼ
ーシヨンの実施の仕方は本発明のポリマーの使用
にとつてあまり重要な問題ではなく、現在知られ
ているハイブリダイゼーシヨンフオーマツトなら
びに今後改善されるであろうフオーマツトに本発
明を適用することができよう。 一般にハイブリダイゼーシヨン法は、(a)１本鎖
の被検核酸と測定すべき塩基配列と実質的に相補
的な配列をもつポリヌクレオチドプローブを含む
混合液を作成するステツプと、(b)ハイブリダイズ
したプローブを検出するステツプから構成され
る。用いられる特定のハイブリダイゼーシヨンフ
オーマツトに依存するが、混合液を作成する前に
被検核酸の固定化を行うこと、プローブにラベル
すること、プローブを固定すること、および／ま
たは被検核酸およびプローブを両方とも溶液中に
存在させることができる。 普通のハイブリダイゼーシヨンフオーマツトの
中でもとりわけ有用であるのは、被検核酸または
ポリヌクレオチドプローブを固体支持体に固定す
るフオーマツト（固相ハイブリダイゼーシヨン）
とポリヌクレオチドが全て溶液中に存在するフオ
ーマツト（溶液ハイブリダイゼーシヨン）であ
る。 Ａ 固相ハイブリダイゼーシヨン 固相ハイブリダイゼーシヨンでは、ハイブリ
ダイゼーシヨンに関与するポリヌクレオチドの
１つを適当な方法によつて１本鎖の形態で固体
支持体に固定する。有用な固体支持体はよく知
られており、核酸と共有結合する、あるいは非
共有結合で結合する支持体が用いられる。非共
有結合の支持体の場合は、一般に疎水結合が行
われると理解されているが、その材料としては
ニトロセルロースや合成誘導体のナイロン、含
フツ素ポリ炭化水素などの合成ポリマー材や自
然に形成される材料があり、フイルターや固体
シートなど様々な形で用いられる。共有結合支
持体は、化学的に反応する基あるいはジクロロ
トリアジンやジアゾベンジルオキシメチルなど
活性化されてポリヌクレオチドと結合できる基
を有する材料でつくられる。 代表的な固相ハイブリダイゼーシヨン法の場
合、まず被検核酸を１本鎖の形で支持体に固定
する。この第一のステツプは、試料を支持体に
集めて検出を促進する手段として用いることが
できるとともに、試料の相補鎖の再生を防止す
る。次にラベルしたプローブの１本鎖ポリヌク
レオチドを支持体に接触させる。適切にラベル
することによりハイブリダイゼーシヨンの結果
を検出することができる。代表的な固相ハイブ
リダイゼーシヨンは次のように行われる。 (1) 試料について核酸の遊離、変性を行い、得
られた１本鎖核酸を固体支持体に固定する。
たとえば、体液などの液体試料をニトロセル
ロースメンブレンに塗布し、堆積した細胞を
溶解し、分離されたDNAを変性する。そし
てメンブレンを真空中で80℃下２時間ベーキ
ングして１本鎖DNAをメンブレンに固定す
る。別法として、細胞をまず溶解し、分離し
たDNAを変性してからニトロセルロースメ
ンブレンに塗布する方法もある。 (2) 適当なハイブリダイゼーシヨン条件下でラ
ベルしたプローブを支持体に過剰に接触させ
る。適当な条件というのは、たとえば、緩衝
液（２×SSCなど）、牛血清アルブミンなど
のタンパク、フイコール（Ficoll）、ポリビ
ニルピロリドン、仔牛胸腺やサケ精子などの
変性DNAおよび本発明のポリマーを含むプ
レハイブリダイゼーシヨン溶液で40〜60℃下
処理して、メンブレンへのDNAの非特異的
な吸着を防ぐことである。インキユベーシヨ
ンの時間が通常より長い点を除いて、普通の
ハイブリダイゼーシヨン条件はプレハイブリ
ダイゼーシヨン条件と同じである。 (3) メンブレンを単に洗つて、固定された１本
鎖核酸とハイブリダイズしなかつたプローブ
を除去する。 (4) ラベルの特性に応じた方法で支持体に結合
したラベルの測定を行う。 本発明は固体支持体に被検核酸を固定する固相
ハイブリダイゼーシヨン法においてとくに有利で
ある。ハイブリダイゼーシヨン速度の増大効果
は、比較的少量の核酸を固定し、ハイブリダイゼ
ーシヨン水性媒体中で過剰なプローブを固相に接
触させる場合が最も顕著だからである。 ラベルには普通 ³²Pなどの放射性同位元素が用
いられ、シンチレーシヨン計数管もしくはオート
ラジオグラフイーで検出を行うが、以下で詳しく
記述するように、放射性同位元素を用いない検出
方法もある。 上記の代表的なプロトコルに別のステツプを付
け加えることもできる。たとえば、とくに短い
DNAセグメントまたはRNAセグメント（100塩基
より少ないぐらいの）を固定する場合は、グリオ
キサルを用いてこのポリヌクレオチドの誘導体を
つくり、それから支持体に固定することができ
る。また、通常標準的な方法に従つて試料の精製
を行い核酸を分離してから、反応性セルロースに
ポリヌクレオチドを共有結合させる方法もある。 核酸を固定化しラベルしたプローブを使用する
代わりに、既知の方法によりin situで被検核酸
にラベルし、その後で固定化したプローブを加え
ることも可能である。測定法は同じで、支持体に
結合したラベルを検出する。このタイプのフオー
マツトでとくに重要なのは、固定化RNAプロー
ブとRNA−RNAハイブリツドまたはRNA−DNA
ハイブリツドに特異的に結合する抗体もしくはそ
のフラグメント（ラベルするのが望ましい）を用
いてRNAやDNAの配列を検出するものである。
このフオーマツトの詳細は、1984年６月１日申請
の米国特許出願Ser.No.616、132号に記述されて
いる。 サンドイツチハイブリダイゼーシヨン法も重要
である。この方法では、プローブの相同性のある
配列の相互排他的な２セグメントのうちの一方を
固定し、他方はラベルする。そして、細菌の核酸
が存在すれば、固定されたプローブセグメントと
ラベルしたプローブセグメントで２重にハイブリ
ダイゼーシヨンが行われる。最後の測定では、こ
の場合も支持体に結合したラベルを検出する。こ
の方法の詳細は「メソツド・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）」65：468
（1980年）および「ジーン（Gene）」21：77〜85
（1983年）に記載されている。 Ｂ 溶液ハイブリダイゼーシヨン 溶液ハイブリダイゼーシヨン法は、溶液フオ
ーマツトにおける細菌核酸の検出に用いること
ができる。この方法では通常、RNAであれ
DNAであれ、相同性のある配列が１本鎖であ
ることが要求される。そしてこれがプローブポ
リヌクレオチドとされる。 溶液ハイブリダイゼーシヨンの場合、必要な
らまず試料中の細胞から溶解によつて被検核酸
を分離して変性する。このステツプには試料を
100℃まで加熱することや、塩基にさらすこと
を含めることができる。そして過剰な量のプロ
ーブを含む溶液を加えると、プローブの望まし
い特異性と感度を実現するため経験的に決定し
た温度およびイオン強度の条件下でハイブリダ
イゼーシヨンが行われる。 ハイブリツドの検出ならびに定量は様々な方
法で行うことができる。たとえば、ハイブリダ
イゼーシヨンが終わつたら、１本鎖特異的なヌ
クレアーゼS₁を用いて残存１本鎖核酸を加水分
解していくつもの小断片とし、酸沈澱とそれに
続く遠心もしくはろ過によつてハイブリツドを
集め、加水分解された１本鎖ポリヌクレオチド
から分離する。そして集められた沈澱物の量の
測定を行う。ヒドロキシアパタイトを用いるク
ロマトグラフイーによつて１本鎖ポリヌクレオ
チドとハイブリダイズされたポリヌクレオチド
を分離する方法もある。プローブにラベルし、
プローブのシグナルがハイブリダイゼーシヨン
の前後で異なることが測定されうる場合は、分
離のステツプを省くことができる（公開されて
いる出願番号第70685のヨーロツパ特許出願を
参照）。 固相法でも溶液法でも実施することができる
別の重要な方法に、抗体もしくはそのフラグメ
ント（なるべくラベルする）と挿入複合体との
結合によつてハイブリツドを検出する方法があ
る。この方法は、1983年12月12日申請の米国特
許出願Ser.No.560、429に記載されている。 本発明を適用できるハイブリダイゼーシヨン法
では様々なラベルが用いられる。放射性同位元素
のラベルとしては ³H、 ³⁵S、 ³²P、 ¹²⁵Iおよび
¹⁴Cがある。放射性同位元素の他に、ハプテンま
たは配位子、螢光剤、化学発光剤、発色団、ある
いは酵素、酵素補助因子、酵素基質、酵素阻害剤
などの酵素反応関与物質（これらに限定されな
い）をラベルに用いることができる。 本発明は試薬系、すなわち、所望するハイブリ
ダイゼーシヨン法の実施に必要な全ての要素を含
む試薬の組合せもしくは手段も提供する。試薬系
は、試験装置構成における試薬の適合性が保たれ
る混合物として、あるいは試験キツトとして、す
なわち必要な試薬を含む１個ないし数個の容器、
装置あるいは類似のものの組合せを包装し、検定
の実施に関する説明書を通常添付したキツトとし
て、包装された形態で提供される。本発明の試薬
系は本書に記載する様々なハイブリダイゼーシヨ
ン法を実施するための全構成物を含むが、最低限
本発明のポリマーとプローブから構成される。試
薬系の中でとくに好ましいのは、(1)試料を処理し
て細菌の核酸を分離、変性して得られる１本鎖核
酸を固定できる固体支持体、(2)本明細書に記載の
種々のタイプの中から選ばれたラベルしたポリヌ
クレオチドプローブ、および(3)本発明のポリマー
から成る、固相ハイブリダイゼーシヨン用の試験
キツトである。このキツトには、被検核酸を固定
化した後で支持体の核酸吸着部位を飽和するため
に使用する外来核酸をその他の随意選択したプレ
ハイブリダイゼーシヨン溶液用成分と共に含ませ
ることができる。また、試料を処理して１本鎖核
酸を分離するためのアルカリなどの溶解・変性剤
も加えることができる。ハイブリダイゼーシヨン
反応の構成要素がプレハイブリダイゼーシヨン溶
液と異なる場合は、かかる構成要素もキツトに含
めるとよい。試薬系には緩衝剤や希釈剤、標準試
薬など、本法において知られておりユーザーの見
地や商売上の観点から望ましいと思われるその他
の材料や溶液ももちろん含めることができる。 以下の例において本発明について説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。 例 材料と方法 Ａ ³⁵SラベルしたDNAプローブの調製 Hindで切断したλDNA［ニユーイングラ
ンド・バイオラブス（New England
BioLabs）、マサチユーセツツ州ベバリー］を
ニツクトランスレーシヨンによつてラベルし
た。基本的にリグビー（Rigby）ら（「ジヤー
ナル・オブ・モレキユラー・バイオロジー（J.
Mol.Biol.）」113：237〜251、1977年）の方法
に従つたが、［α ³⁵P］dATPの代わりにデオ
キシアデノシン5′−［α−チオ− ³⁵S］三リン
酸塩（〜1000−1500Ci／ｍmol、ニユー・イン
グランド・ニユークリア（New England
Nuclior）、マサチユーセツツ州ボストン）を使
用し、反応は３時間インキユベートした。ラベ
ルしたDNAは、NACS−52_TM樹脂クロマトグラ
フイー［ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
（Bethesds Research Laboratories）、メリー
ランド州ゲイザースバーグ］をメーカーの推奨
する方法に従つて実施し、フリーヌクレオチド
から分離した。次にエタノールで沈澱し、10ｍ
Ｍジチオトレイトール（DTT）を含むTE緩衝
液（１ｍＭトリス−HCl、PH7.21ｍＭ
EDTA）で溶解して−20℃下保存した。DNA
の濃度は、モーガン（Morgan）ら（「ニユーク
レイツク・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids
Research）」７：547〜569、1979年）に従い、
エチジウムブロミドを用いた螢光法によつて測
定した。得られた標品は、比活性がマイクログ
ラムにつき、１分当り５×10⁶〜4.8×10⁷カウ
ント（cpm／μｇ）で、必要な比活性のプロー
ブとするため、ラベルしていないλDNAの
Hind消化物で希釈した。 ニツクトランスレーシヨンでラベルしたλ
DNAのHind断片のサイズは、変性用アルカ
リ性１％アガロースゲルを用いた電気泳動法に
よつて測定したが、6600塩基対より大きいもの
は６％弱、6600〜2000塩基対は42％、2000〜
560塩基対は33％、そして、560塩基対より小さ
いものは20％であつた。 Ｂ ニトロセルロースメンブレンへのDNAの固
定 ニトロセルロースメンブレン［BA85シー
ト、シユラヒエル・アンド・シユール
（Schleicher and Schuell）、ニユーパンプシヤ
ー州キーン］を少なくとも15分間水に浸してか
らろ過装置（ミニホールド、シユラヒエル・ア
ンド・シユール）に設置した。次に15×SSPE
（１×SSPE：0.18M NaCl、10ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝剤、PH7.7、１ｍＭ EDTA）0.5ml
を各ウエルに流した。λDNAの熱変性Hind
断片とキヤリヤーDNA（サケ精子DNA）を15
×SSPEに希釈し、必要なレベルのλ−Hind
DNAとキヤリヤーDNA5μｇを含むアリコー
ト200μを各ウエルに塗布した。ニトロセル
ロースへのラベルしたプローブの非特異的な吸
着を測定するための対照ウエルはキヤリヤー
DNA5μｇのみで調製した。そして15×
SSPE250μで各ウエルを洗い、メンブレン
は、風乾してから80℃下２時間、真空オーブン
でベーキングを行つた。最後に、ウエルで囲ま
れた0.28cm²の円を切り取り、使用するまでデシ
ケーター内に室温で保存した。 Ｃ ポリマー貯蔵溶液の調製 ポリマー貯蔵溶液は次の濃度（重量／容量）
の水溶液とした。 デキストラン硫酸、ナトリウム塩［分子量
500000、シグマ・ケミカル社（Sigma
Chemical Co.）、ミズーリ州セントルイス］−
20％溶液 ポリ（メタクリル酸）［分子量不明、ポリサ
イエンシズ（Poly−sciences）、ペンシルバニ
ア州ウオーリントン］−40％溶液。5N NaOHで
中和。 ポリ（アクリル酸）（分子量〜90000、〜
300000、〜450000、ポリサイエンシズ）−10％
溶液、10N NaOHで中和。 Ｄ ハイブリダイゼーシヨン反応 ハイブリダイゼーシヨン反応は、きつく栓を
したポリスチレンチユーブ（10×50mm）の中で
行われた。DNAが吸着したニトロセルロース
デイスクは、６×SSPEに少し浸してからチユ
ーブ内に置いた。次に６×SSPE、５×デンハ
ート溶液（１×デンンハート：0.02％フイコー
ル、0.02％ポリビニルピロリドンおよび0.02％
牛血清アルブミン）、0.5％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、100μｇ／ml変性サケ精子DNAおよび本
発明のポリマーから成るプレハイブリダイゼー
シヨン溶液60μを加えた。チユーブは65℃下
一晩インキユベートした。これに熱変性してか
らジチオトレイトールで70ｍＭとした望ましい
比活性をもつ ³⁵Sラベルしたプローブ10μを
加えて反応を開始させた。反応混合物は65℃下
必要な時間インキユベートし、それからニトロ
セルロースデイスクを２×SSPE0.75ml、0.1％
ドデシル硫酸ナトリウムで、室温下５分間３
回、65℃下10分間２回、そして室温下各５分間
２回洗つた。デイスクは十分水気を切つて乾燥
させ、結合した ³⁵Sを測定した。各データポイ
ントは同じ様に調製した３個のデイスクの結果
の平均であり、ラベルしたDNAの非特異的な
吸着に関する補正を行つている。 結 果 Ａ ハイブリダイゼーシヨン速度に対するポリマ
ー濃度の影響 各ポリマーの濃度を変えて初期ハイブリダイ
ゼーシヨン速度の測定を行つた。ニトロセルロ
ースフイルターにはλDNAのHind消化物5n
ｇを固定し、 ³⁵S−DNA（4.5×10⁶cpm／μ
ｇ）0.1μｇとハイブリダイズさせた。図１に
示したように、デキストラン硫酸の場合は、濃
度が５％になるまでハイブリダイゼーシヨン速
度は増大した。いくつかの実験では、多くの研
究室で用いられている濃度である10％で速度が
さらに多少上昇することが観察された。10％デ
キストラン硫酸の場合と同じ速度をポリメタク
リル酸塩で達成するには20％の濃度が必要であ
つた（図２）。ポリアクリル酸塩（分子量
90000）は、1.5％という低濃度のときが最も速
度増大効果が大きかつた（図３）。 平均分子量300000と450000のポリアクリル酸
塩の結果は、分子量90000の場合とほぼ同じで
あつた。 分子量1000000のポリアクリル酸塩溶液は粘
性が大きすぎて扱い難く、分子量90000の場合
が最も粘性が小さかつたので、以後の研究には
これを用いた。 Ｂ ポリマー存在下のハイブリダイゼーシヨン速
度の比較 ハイブリダイゼーシヨン反応の進行の具合
を、ポリマーが存在しない場合、10％デキスト
ラン硫酸、1.5％ポリアクリル酸塩および20％
ポリメタクリル酸塩が存在する場合について24
時間測定した。ニトロセルロースフイルターに
はλDNAのHind消化物5nｇを固定し、 ³⁵S
−DNA（4.5×10⁶cpm／μｇ）0.1μｇとハイ
ブリダイズさせた。 データはダグレビー（Duggleby）（「アナ
ル・バイオケム（Anal.Biochem.）」110：９〜
18、1981年）の記述する非線形回帰法によつて
一時速度論モデルに合わせた。試験ポイントは
一時反応用に作成された曲線に適合している
（図４）。曲線の作成に用いた反応速度定数を表
１に示した。各ポリマーの存在下で測定した速
度の間に大きな差はなかつたが、ポリマー存在
下の速度は、存在しない場合より約３倍速かつ
た。

【表】 Ｃ ニトロセルロースメンブレンへのプローブの
非特異的な吸着 ニトロセルロースメンブレンへの ³⁵S−
DNAプローブの非特異的吸着は、10％デキス
トラン硫酸によつて約４倍増加した（図５）。
各ニトロセルロースフイルターにはサケ精子
DNA5μｇを固定し、プレハイブリダイゼーシ
ヨン処理を行つてから ³⁵SラベルしたλDNA
のHind消化物0.1μｇを加えてハイブリダイ
ゼーシヨン条件下インキユベートした。インキ
ユベーシヨンの初期においては、1.5％ポリア
クリル酸塩または20％ポリメタクリル酸塩存在
下の非特異的吸着は、ポリマーが存在しない対
照の２倍であつたが、24時間経過する頃には両
者の差はほとんどなくなつた。 Ｄ ポリマーによるハイブリダイゼーシヨンの促
進と固定DNAレベルの関係 ポリマーの非存在下および1.5％ポリアクリ
ル酸塩、10％硫酸デキストランの存在下におい
て、フイルターに固定したλDNAのHind消
化物と ³⁵S−DNAのハイブリダイゼーシヨン
反応を行い、4.5時間後にハイブリダイズした
³⁵S−DNAの量を測定した。各フイルターには
必要量のHind消化λDNAを固定し、 ³⁵S−
DNA（比活性：16.7×10⁶cpm／μｇ）100nｇ
と4.5時間反応させた。表２に示すように、フ
イルターのDNAレベルが増大するにつれて両
ポリマーによるハイブリダイゼーシヨン促進効
果は弱まつており、１μｇDNAではポリマー
による反応促進効果はみられなかつた。固定
DNAのレベルが高い場合にハイブリダイゼー
シヨンがポリマーによつて促進されないのは、
ポリマー存在下ではプローブの自己アニーリン
グが速められて、フイルターのDNAとハイブ
リダイズしうる１本鎖プローブが減少するため
であると考えられる。

【表】 ［考察］ デキストラン硫酸、ポリアクリル酸塩、ポリメ
タクリル酸塩の各アニオン性重合体は、溶性
DNAとニトロセルロースに固定した相補的な
DNAとのハイブリダイゼーシヨンを促進した。
濃度を最適にした場合、各ポリマーの反応促進効
果はほぼ同じであつた（図４）。至適濃度は、ポ
リアクリル酸塩が1.5％、ポリメタクリル酸塩が
20％、そしてデキストラン硫酸が10％であつた。
ポリアクリル酸塩は、低濃度で効果があり、また
最も安価なポリマーであるので、ハイブリダイゼ
ーシヨン反応におけるデキストラン硫酸の代替物
としてとりわけ魅力的である。 ポリアクリル酸塩およびポリメタクリル酸塩の
もう１つの利点は、デキストラン硫酸を使用した
場合に比べてニトロセルロースメンブレンへの
DNAプローブの非特異的吸着が少ないことであ
る（図５）。上記ウエツトマー（Wetmur）やラ
ンキ（Ranki）らも報告しているように、セルロ
ースやニトロセルロースの支持体の場合、デキス
トラン硫酸存在下では非特異的な吸着が問題にな
つている。ポリアクリル酸塩またはポリメタクリ
ル酸塩の存在下では、最初非特異的な吸着は増加
するが、その後ポリマーが存在していないときの
レベルまで減少する（図５）。これに対し、デキ
ストラン硫酸を同じ条件下で使用した場合、非特
異的な吸着のレベルはより高く、長時間のインキ
ユベーシヨン中もほぼ同じレベルが維持される。 ポリマーによるDNAハイブリダイゼーシヨン
の促進効果は、ニトロセルロースメンブレンに固
定されたDNAの量が少ないときの方が大きかつ
た（表２）。これは特定の非常に低いレベルの
DNA配列の検出を改善することにつながりうる
思いがけない結果である。ポリメタクリル酸塩、
そしてとりわけポリアクリル酸塩は、核酸ハイブ
リダイゼーシヨンの促進因子として、従来用いら
れてきたデキストラン硫酸にまさる利点を有して
いる。 明白なことであるが、本発明の意図および範囲
を逸脱することなく、上に述べ来たつた本発明の
部分的変更やバリエーシヨンを多々行うことが可
能である。

【図面の簡単な説明】

図１から図３は、ハイブリダイゼーシヨン速度
に対するポリアクリル酸塩およびポリメタクリル
酸塩の影響をデキストラン硫酸と比較して示した
グラフである。図４は、最適濃度のポリマー存在
下でのハイブリダイゼーシヨン速度を比較して示
したグラフである。図５は、ニトロセルロース支
持体へのDNAの非特異的な吸着に対するポリマ
ーの影響を示したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水性媒体中にポリアクリル酸塩またはポリメ
   タクリル酸塩を含ませるステツプからなることを
   特徴とする水性媒体中の２つの相補的なポリヌク
   レオチド断片のハイブリダイゼーシヨンの速度を
   上げるための方法。 ２ ポリアクリル酸塩を水性媒体に加える特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ 水性媒体が約0.2〜約10％（ｗ／ｖ）の濃度
   のポリアクリル酸塩溶液を含む特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 ４ ポリアクリル酸塩の濃度が約1.5％（ｗ／
   ｖ）である特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ ポリメタクリル酸塩を水性媒体に加える特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 水性媒体が約1.0〜約50％（ｗ／ｖ）の濃度
   のポリメタクリル酸塩を含む特許請求の範囲第５
   項記載の方法。 ７ ポリメタクリル酸塩の濃度が約20％（ｗ／
   ｖ）である特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ ポリアクリル酸塩またはポリメタクリル酸塩
   の分子量が約50000〜500000ダルトンである特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ９ 被検核酸および塩基配列が測定すべき配列と
   相補的なポリヌクレオチドプローブを含む水性試
   験媒体を形成するステツプ(a)と、ハイブリツド形
   成したプローブを測定するステツプ(b)から成る、
   １本鎖核酸を含む試料中の特定のポリヌクレオチ
   ドの配列を測定するための方法であつて、 水性媒体中にポリアクリル酸塩またはポリメタ
   クリル酸塩を含ませることを特徴とする方法。 １０ プローブと共に試験媒体を形成する前に被
   検１本鎖核酸の固定化を行う特許請求の範囲第９
   項記載の方法。 １１ ニトロセルロースへの吸着によつて被検核
   酸の固定化を行う特許請求の範囲第１０項記載の
   方法。 １２ プローブを標識化する特許請求の範囲第１
   ０項記載の方法。 １３ プローブの固定化を行う特許請求の範囲第
   ９項記載の方法。 １４ 被検核酸とプローブの両方が試験媒体に溶
   解している特許請求の範囲第９項記載の方法。 １５ 水性媒体にポリアクリル酸塩を加える特許
   請求の範囲第９項記載の方法。 １６ 水性媒体が約0.2〜約10％（ｗ／ｖ）の濃
   度のポリアクリル酸塩溶液を含む特許請求の範囲
   第１５項記載の方法。 １７ ポリアクリル酸塩の濃度が約1.5％（ｗ／
   ｖ）である特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８ ポリアクリル酸塩の分子量が約50000〜約
   500000ダルトンである特許請求の範囲第１５項記
   載の方法。 １９ 試料中の特定のポリヌクレオチド配列を測
   定するための、 (1) 塩基配列が測定すべき配列と相補的なポリヌ
   クレオチドプローブ 及び (2) ポリアクリル酸塩またはポリメタクリル酸塩 からなることを特徴とする試薬系。 ２０ プローブとポリアクリル酸塩から成る特許
   請求の範囲第１９項記載の試薬系。 ２１ プローブとポリメタクリル酸塩から成る特
   許請求の範囲第１９項記載の試薬系。 ２２ ポリアクリル酸塩またはポリメタクリル酸
   塩の分子量が約50000〜約500000ダルトンである
   特許請求の範囲第１９項記載の試薬系。 ２３ 試料中の１本鎖核酸を固定することができ
   る固体支持体を含む特許請求の範囲第１９項記載
   の試薬系。 ２４ 固体支持体がニトロセルロースである特許
   請求の範囲第２３項記載の試薬系。 ２５ プローブが標識化されている特許請求の範
   囲第２３項記載の試薬系。 ２６ プローブが固定化されている特許請求の範
   囲第１９項記載の試薬系。