JPS61128900A - アニオン性重合体による核酸ハイブリダイゼーシヨンの促進方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は相補的なポリヌクレオチドセグメントの特異的
分子結合、すなわち普通ハイブリダイゼーションとして
知られているものに関する発明であり、とくに特定のポ
リヌクレオチド配列を測定するための核酸ハイブリダイ
ゼーション法および試薬系に適用されるものである。核
酸ハイブリダイゼーション法の原理は、ポリヌクレオチ
ド塩基配列の測定および単離の手段として組換え遺伝子
の分野の研究者によって開発されたものである。２本鎖
の形態の核酸を変性することによって得られるＤＮＡや
ＲＮＡなどの　１本鎖の核酸は、適当な条件下で相補的
な　１本鎖核酸とハイブリダイズ（再結合）する。かか
る相補的な核酸プローブを、検出が容易な化学物質で標
識することにより、　１木釦の被検核酸を含む試験媒体
中のポリヌクレオチド塩基配列の存在を検出することが
可能になった。

ハイブリダイゼーション技術は、組換えＤＮＡの分野だ
けでなく、他の様々な分野、とりわけ人間医学および獣
医学、塵業、食品科学の分野における分析上重要なポリ
ヌクレオチドの検出に応用することができる□。就中こ
の技術は、細菌やビールスなどの病原体の検出、同定や
、細菌の抗生物質耐性のスクリーニング、踵状赤血球貧
血や地中海貧血などの遺伝性疾患の診断の補助、あるい
はガン化した細胞の発見に利用することができる。ハイ
ブリダイゼーション法の概観ならびに現在および将来に
おけるその意義に関する考察が「バイオテクノロジー（
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ　　（ＩＨ３年８月
）の４７１〜４７８ページに掲載されている。

［発明の背景］ 以下の情報は、本発明に関連があると出願人が考える事
項を開示するために提供するものである。ただし、以下
の事項のいずれかが本発明に先行する技術であると認め
るわけでは必ずしもなく、またそのように解釈すべきで
もない。

ウェットマー　（Ｗｅｔｍｕｒ）　（１９７４年）は、
溶液中のＩＮＮ　Ａのハイブリダイゼーション速度が１
０％デキストラン硫酸によって約１０倍高められること
を見出している　（「バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌ
ｙｍｅｒｓ）　Ｊ１４：　２５１？〜２５２４）。非イ
オン性重合体のデキストランによるハイブリダイゼーシ
ョン促進効果ははるかに小さく、またハイブリダイゼー
ション速度の対数とポリマー溶液の粘度の間には線形の
関係が存在した。ウオール（Ｗａｈｌ）ら　（１！１１
７０年）は、共有結合によって　１木鎖ＤＮＡをジアゾ
ベンジルオキシメチルセルロースに固定し、溶液中にお
ける放射性同位元素で標識したＤＮＡの／＼イブリダイ
ゼーション速度を１０％デキストラン硫酸によって　１
００倍も高めたと報告している　（「プロシーディング
−ナショナル・アカデミ−・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　Ｊ　７８：　３
８８３〜３６８７）　。米国特許第４，３０２，２０４
号には、デキストラン硫酸や他の荷電多糖類を用いて、
ポリヌクレオチドの一方を共有結合で固相に固定したハ
イブリダイゼーション反応の速度を上げる方法が示ネれ
ている。非常に少量のＤＮＡ配列の検出が必要な場合は
、１０％デキストラン硫酸がしばしばハイブリダイゼー
ションに使用されている。

ハイブリダイゼーション反応は長時間のインキュベーシ
ョンを必要とする傾向があり、ハイブリダイゼーション
法を実施する多くの場合においてインキュベーションを
短縮する手段が有用でありうるが、ハイブリダイゼーシ
ョン速度の増進にデキストラン硫酸を使用することには
欠点がある。すなわち、このポリマーは比較的高価であ
り、大量に、サチン法の場合のように面積の広い支持体
をハイブリダイゼーション溶液でおおう必要がある場合
はとくに大量に用いられる。また１０％デキストラン硫
酸は、」二記のウオール（Ｗａｈｌ）らやラニキ（Ｒａ
ｎｉｋｉ）ら　（「微生物学・免疫学の最新の話題（Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ　ａｎｄ１ｍｍｕｎｏｌｏｇ’Ｊ）　Ｊ　１０
４：　３０７〜３１８　、１９８３年）が報告している
ように、ニトロセルロースやセルロースの支持体への標
嵐化（ラベル化）したＤＮＡプローブの非特異的な吸着
を増大させる。

レンツ（Ｒｅｎｚ）とクルツ（Ｋｕｒｚ）　（１９８４
年）は、ペルオキシダーゼでラベルした核酸を用いたハ
イブリダイゼーションでは、デキストラン硫酸よりポリ
エチレングリコールの方がすぐれていることを見出して
いる　（「ニュークレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）Ｊ　１２
：３４３５〜３４４４）。しかしながら、ポリアクリル
酸塩については、ＤＮＡのハイブリダイゼーション速度
に影響を与えないと報告されている　［スビラナ（Ｓｕ
ｂ　ｉ　ｒａｎａ）とドティ（Ｄａｔｙ）、［パイオポ
リマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）　Ｊ　４：　１７
１〜１８７）。

［発明の要約］ アクリル耐塩のアニオン重合体が水性媒体における相補
的なポリヌクレオチドセグメントのハイブリダイゼーシ
ョン速度を上げることが判った。

そしてこの新しい速度増進化合物は、従来量も普通に用
いられてきた化合物であるデキストラン硫酸に優る利点
を有しており、微生物による分解に耐え、かつハイブリ
ダイゼーション速度を上げる能力に関してはデキストラ
ン硫酸と同等である。

この反応促進効果は、溶液試験および被検核酸を固定化
しラフルしたプローブを使用する固相検定をはじめとす
るハイブリダイゼーション法においてとりわけ有用であ
る。通常用いられるニトロセルロース支持体へのプロー
ブの非特異的な吸着は、デキストラン硫酸存在下よりポ
リアクリル酸塩やポリメタクリル酸塩存在下の方がかな
り少ない。ポリアクリル酸塩がとくに有利であるのは、
低濃度で効果があるためと、デキストラン硫酸に比べて
相当安価であるためである。

［好ましい実施態様の説明］ ポリアクリル酸塩およびポリメタクリル酸塩は、ｉｎ　
５ｉｔｕで形成されうるか、あるいはこれらのポリマー
をナトリウム、カリウム、アンモニウムなどの塩の形で
加えることによって形成されうるアニオン型でハイブリ
ダイゼーション水性媒体に存在することになる。塩の選
択に当たっては、ハイブリダイゼーション媒体の他の構
成要素に対する特定の対カチオンの影響を考慮する。た
とえば、沈殿を防ぐために硫酸ドデシルを界面活性剤と
して用いる場合はカリウム塩を選択しないことが多い。

ハイブリダイゼーション媒体は水性であり、ポリアクリ
ル酸塩またはポリメタクリル酸塩の他に、緩衝剤や有機
溶媒、界面活性剤、非特異的核酸、およびフィコール（
Ｆｉｃｏｌｌ）　［７アーマシア１１７　ｙイアｅケミ
カルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）　（−−ニーシャーシー州ビス力タウェイ）から
市販の蔗糖とエビクロロヒドリンの共重合体］やポリビ
ニルピロリドンなどのポリマーを含むことができる。ハ
イブリダイゼーション媒体中のポリアクリル酸塩および
ポリメタクリル酸塩の濃度　（容量に対する重量百分率
（ｗ／ｖ）で表わす）は、ポリアクリル酸塩の方が通常
約０．２〜１０％の範囲□０．５〜５％程度が望ましい
□、ポリメタクリル酸塩は通常約　１．０〜５０％の範
囲□５〜２５％程度が望ましい□である。これらのポリ
マーの分子量は、広い範囲にわたるが、通常約５．００
０〜１，０００，０００ダルトン、望ましい分子量は約
５０，０００〜５００，０００ダルトンである。

アニオン性重合体であるポリアクリル酸塩およびポリメ
タクリル酸塩は、核酸ハイブリダイゼーションの促進因
子としてとりわけ利点が大きいことが明らかになった。

本発明の意図および範囲を逸脱することなくこの目的の
ために同等の種々のアクリル酸塩重合体を使用できるこ
とは明白である。アクリル酸塩の様々な単独重合体およ
び共重合体は、本発明の化合物がもつハイブリダイゼー
ション促進特性を有することが予期され、従って本明細
書の特許請求の目的にとっては本発明の化合物と同等で
あるとみなされる。

本発明は、′水性媒体中における　２個の相補的なポリ
ヌクレオチドセグメントのハイブリダイゼーション速度
を増大したい場合に常に有用である。

相補的なポリヌクレオチドセグメントは、通常別個のポ
リヌクレオチド鎖の一部もしくは全体を成している。本
明細書で使用するポリヌクレオチドという用語には、鎖
がもっと短いオリゴヌクレオチドと表記されることがあ
るものや、ＲＮＡ　、ＤＮＡおよびその適当な誘導体が
含まれる。本発明のポリマーを含む水性媒体中において
は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、　ＲＮＡ−ＲＮＡハ
イブリッドおよびＩＩＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成
速度が高められる。

速度増大効果の主たる適用対象は核酸ハイブリダイゼー
ション法である。本発明のポリマーの使用は、特定のハ
イブリダイゼーションフォーマットに限定されないが、
使用することが望ましく使用による利点が大きいフォー
マットがありうる。

しかしながら、一般的にいって、ハイブリダイゼーショ
ンの実施の仕方は本発明のポリマーの使用にとってあま
り重要な問題ではなく、現在知られているハイブリダイ
ゼーションフォー“マットな′らびに今後改善されるで
あろうフォーマットに本発明を適用することができよう
。

一般にハイブリダイゼーション法は、（ａ）　　１本鎖
の被検核酸と測定すべき塩基配列と実質的に相補的な配
列をもつポリヌクレオチドプローブを含む混合液を作成
するステップと、（ｂ）ハイブリダイズしたプローブを
検出するステップから構成される。用いられる特定のハ
イブリダイゼーションフォーマットに依存するが、混合
液を作成する前に被検核酸の固定化を行うこと、プロー
ブにラベルすること、プローブを固定すること、および
／または被検核酸およびプローブを両方とも溶液中に存
在させることができる。

普通のハイブリダイゼーションフォーマットの中でもと
りわけ有用であるのは、被検核酸またはポリヌクレオチ
ドプローブを固体支持体に固定するフォーマット（固相
ハイブリダイゼーション）とポリヌクレオチドが全て溶
液中に存在するフォーマット（溶液ハイブリダイゼーシ
ョン）である。

Ａ、固相ハイブリダイゼーション 固相ハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーシ
ョンに関与するポリヌクレオチドの　１つを適当な方法
によって　１本鎖の形態で固体支持体に固定する。有用
な固体支持体はよく知られており、核酸と共有結合する
、あるいは非共有結合で結合する支持体が用いられる。

非゛共有結合の支持体の場合は、一般に疎水結合が行わ
れると理解されているが、その材料としては二１０セル
ロースや合成誘導体のナイロン、含フツ素ポリ炭化水素
などの合成ポリマー材や自然に形成される材料があり、
フィルターや固体シートなど様々な形で用いられる。共
有結合支持体は、化学的に反応する基あるいはジクロロ
トリアジンやジアゾベンジルオキシメチルなど活性化さ
れてポリヌクレオチドと結合できる基を有する材料でつ
くられる。

代表的な固相ハイブリダイゼーション法の場合、まず被
検核酸を　１本鎖の形で支持体に固定する。この第一の
ステップは、試料を支持体に集めて検出を促進する手段
として用いることができるとともに、試料の相補鎖の再
生を防止する。次にラベルしたプローブの　１木鎖ポリ
ヌクレオチドを支持体に接触させる。適切にラベルする
ことによりハイブリダイゼーションの結果を検出するこ
とができる。代表的な固相ハイブリダイゼーションは次
のように行われる。

（１）試料について核酸の遊離、変性を行い、得られた
　１本鎖核酸を固体支持体に固定する。

たとえば、体液などの液体試料をニトロセルロースメン
ブレンに塗布し、堆積した細胞を溶解し、分離されたＤ
ＮＡを変性する。そしてメンブレンを真空中で８０°Ｃ
下２時間ベーキングして　１木鎖１１ＮＡをメンブレン
に固定する。別法として、細胞をまず溶解し、分離した
ＤＮＡを変性してからニトロセルロースメンブレンに塗
布する方法もある。

（２）適当なハイブリダイゼーション条件下でラベルし
たプローブを支持体に過剰に接触させる。

適当な条件というのは、たとえば、緩衝液（２×ＳＳＣ
など）、牛血清アルブミンなどのタンパク、フィコール
（Ｆｉｃｏｌｌ）、ポリビニルピロリドン、仔牛胸腺や
サケ精子などの変性ＤＮＡおよび本発明のポリで−を含
むプレハイブリダイゼーション溶液で４０〜６０℃下処
理して、メンブレンへのＩＩＮＡの非特異的な吸着を防
ぐことである。インキーベーションの時間が通常より長
い点を除いて、普通のハイブリダイゼーション条件はプ
レハイブリダイゼーション条件と同じである。

（３）メンブレンを単に洗って、固定された　１末鎖核
酸とハイブリダイズしなかったプローブを除去する。

（４）ラベルの特性に応じた方法で支持体に結合したラ
ベルの測定を行う。

本発明は固体支持体に被検核酸を固定する固相ハイブリ
ダイゼーション法においてとくに有利である。ハイブリ
ダイゼーション速度の増大効果は、比較的少量の核酸を
固定し、ハイブリダイゼーション水性媒体中で過剰なプ
ローブを固相に接触させる場合が最も顕著だからである
。

ラベルには普通３２ｐなどの放射性同位元素が用いられ
、シンチレーション計数管もしくはオートラジオグラフ
ィーで検出を行うが、以下で詳しく記述するように、放
射性同位元素を用いない検出方法もある。

上記の代表的なプロトコルに別のステップを付は加える
こともできる。たとえば、とくに短いＤＮＡセグメント
またはＲＮＡセグメン）　（１００塩基より少ないぐら
いの）を固定する場合は、グリオキサルを用いてこのポ
リヌクレオチドの誘導体をつくり、それから支持体に固
定することができる。また、通常標準的な方法に従って
試料の精製を行い核酸を分離してから、反応性セルロー
スにポリヌクレオチドを共有結合させる方法もある。

核酸を固定化しラベルしたプローブを使用する代わりに
、既知の方法によりｉｎ　５ｉｔｕで被検核酸にラベル
し、その後で固定化したプローブを加えることも可能で
ある。測定法は同じで、支持体に結合したラベルを検出
する。このタイプのフォーマットでとくに重要なのは、
固定化ＲＮＡプローブと　ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリ・ン
ドまたは　ＲＮＡ−１１１ＮＡハイブリツドに特異的に
結合する抗体もしくはそのフラグメント　（ラベルする
のが望ましい）を用いてＲＮＡやＩＩＮＡの配列を検出
するものである。このフォーマットの詳細は、１９８４
年６月　１日申請の米国特許出願Ｓｅｔ、　Ｎｏ、　６
１６，１３２号に記述されている。

サンドイッチハイブリダイゼーション法も重要である。

この、方法では、プローブの相同性のある配列の相互排
他的な２セグメントのうちの一方ヲ固定し、他方はラベ
ルする。そして、細菌の核酸が存在すれば、固定された
プローブセグメントとラベルしたプローブセグメントで
２重にハイブリダイゼーションが行われる。最後の測定
では、この場合も支持体に結合したラベルを検出する。

この方法の詳細は「メソッド会イン・エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏ＋Ｊｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　Ｊ
　８５：　４ＢＢ（１！１１８０年）および「ジーン（
Ｇｅｎｅ）Ｊ　２１：　７？　〜８５　（Ｉｎ２年）に
記載されている。

Ｂ、溶液ハイブリダイゼーション 溶液ハイブリダイゼーション法は、溶液フォーマットに
おける細菌核酸の検出に用いることができる。この方法
では通常、ＲＮＡであれＤＮＡであれ、相同性のある配
列が１本鎖であることが要求される。そしてこれがプロ
ーブポリヌクレオチドとされる。

溶液ハイブリダイゼーションの場合、必要ならまず試料
中の細胞から溶解によって被検核酸を分離して変性する
。このステップには試料を　１０００Ｃまで加熱するこ
とや、塩基にさらすことを含めることができる。そして
過剰な量のプローブを含む溶液を加えると、プローブの
望ましい特異性と感度を実現するため経験的に決定した
温度およびイオン強度の条件下でハイブリダイゼーショ
ンが行われる。

ハイブリッドの検出ならびに定量は様々な方法で行うこ
とができる。たとえば、ハイブリダイゼーションが終わ
ったら、　１本鎖特異的なヌクレアーゼＳ１を用いて残
存１本鎖核酸を加水分解していくつもの小断片とし、酸
沈澱とそれに続く遠心もしくはろ過によってハイブリッ
ドを集め、加水分解された　１木鎖ポリヌクレオチドか
ら分離する。そして集められた沈澱物の量の測定を行う
。ヒドロキシアパタイトを用いるクロマトグラフィーに
よって　１本鎖ポリヌクレオチドとハイブリダイズされ
たポリヌクレオチドを分離する方法もある。プローブに
ラベルし、プローブのシグナルがハイブリダイゼーショ
ンの前後で異なることが測定されうる場合は、分離のス
テップを省くことができる　（公開されている出願番号
第７０，８８５のヨーロッパ特許出願を参照）。゛ 固相法でも溶液法でも実施することができる別の重要な
方法に、抗体もしくはそのフラグメン）・（なるべくラ
ベルする）と挿入複合体との結合によってハイブリッド
を検出する方法がある。

この方法は、１９８３年１２月１２日申請の米国特許出
願Ｓｅｔ、　ＮＯ，５６０，４２９に記載されている。

本発明を適用できるハイブリダイゼーション法では様々
なラベルが用いられる。放射性同位元素のラベルとして
は３Ｈ１３５Ｓ、３２’ｐ　、　１２５　Ｉおよび１４
Ｃがある。放射性同位元素の他に、ハブテンまたは他の
配位子、螢光剤、化学発光剤、発色団、あるいは酵素、
酵素補助因子、酵素基質、酵素阻害・剤なとの酵素反応
関与物質（これらに限定されない”）をラベルに用いる
ことができる。

本発明は試薬系、すなわち、所望するハイブリダイゼー
ション法の実施に必要な全ての要素を含む試薬の組合せ
もしくは手段も提供する。試薬系は、試験装置構成にお
ける試薬の適合性が保たれる混合物として、あるいは試
験キットとして。

すなわち必要な試薬を含む　１個ないし数個の容器、装
置あるいは類似のものの組合せを包装し、検定の実施に
関する説明書を通常添付したキットとして、包装された
形態で提供される。本発明の試薬系は本書に記載する様
々なハイブリダイゼーション法を実施するための全構成
物を含むが、最低限本発明のポリマーとプローブから構
成される。試薬系の中でとくに好ましいのは、（１）試
料を処理して細菌の核酸を分離、変性して得られる　１
本鎖核酸を固定できる固体支持体、（２）本明細書に記
載の種々のタイプの中から選ばれたラベルしたポリヌク
レオチドプローブ、および（３）本発明のポリマーから
成る、固相ハイブリダイゼーション用の試験キットであ
る。このキットには、被検核酸を固定化した後で支持体
の核酸吸着部位を飽和するために使用する外来核酸をそ
の他の随意選択したプレハイブリダイゼーション溶液用
成分と共に含ませることができる。また、試料を処理し
て１本鎖核酸を分離するためのアルカリなどの溶解・変
性剤も加えることができる。ハイブリダイゼーション反
応の構成要素がプレハイブリダイゼーション溶液と異な
る場合は、かかる構成要素もキットに含めるとよい。試
薬系には緩衝剤や希釈剤、標準試薬など、末法において
知られておりユーザーの見地や商売上の観点から望まし
いと思われるその他の材料や溶液ももちろん含めること
ができる。

以下の例において本発明について説明するが、本発明は
これらに限定されるものではない。

例 材料と方法 ｐ、　、　３５ＳラベルしたＤＮＡプローブの調製Ｈｉ
ｎｄｍで切断したんＤＮＡ　Ｉニューイングランド・バ
イオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ
）、マサチューセッツ州へ／＜！Ｊ〒］ヲニックトラン
スレーションによってラベルした。基本的にリグビー（
Ｒｉｇｂｙ）ら　（「ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　Ｊ　
１１３：　２３７〜２５１．　１９７７年）の方法に従
ったが、　［α３５Ｐ　］ｄＡＴＰの代わりにデオキシ
アデノシン５゛−［α−チオ−３５Ｓ］三リン醸塩（〜
１０００−１５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ニュー・イングラ
ンド・ニュークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ
ｌｉｏｒ）、マサチューセッツ州ボストン）を使用し、
反応は３時間インキュベートした。ラベルしたＤＮＡは
、ＮＮＡＣ３−５２Ｔ　樹脂クロマトグラフィー　［ベ
テスダΦリサーチΦラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、メリ
ーランド州ゲイザースバーグ］をメーカーの推奨する方
法に従って実施し、フリーヌクレオチドから分離した。

次にエタノールで沈澱し、１０ｍＭジチオトレイトール
（ＩＩＴＴ）を含むＴＥ緩衝液（１ｍＭ）リスーＨＣ文
、　ＰＨ７，２，１ｍＭＥＤＴＡ）で溶解して一２０℃
下保存した。　ＤＮＡの濃度は、モーガン（Ｍｏｒｇａ
ｎ）ら　（「ニュークレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）Ｊ７：
　５４？〜５８９．１９７８年）に従い、エチジウムプ
ロミドを用いた螢光法によって測定した。得られた標品
は、比活性がマイクログラムにつき　１分当り　５Ｘ１
０’　〜４．８Ｘ１０７カウント　（ｃｐｍ／　ｐ−ｇ
）で、必要な比活性のプローブとするため、ラベルして
いないλＤＮＡの旧ｎｄｍ消化物で希釈した。

こツクトランスレーションでラベルした入ＤＮＡの旧ｎ
ｄＩＩＩ断片のサイズは、変性用アルカリ性１％アガロ
ースゲルを用いた電気泳動法によって測定したが、６６
００塩基対より大きいものは６％弱、８６００〜２００
０塩基対は４２％、２０００〜５６０塩基対は３３％、
そして５６０塩基対より小さいものは２０％であった。

Ｂ、ニトロセルロースメンブレンへのＤＮＡの固定ニト
ロセルロースメンブレン　［ＢＡ８５シート、シュラヒ
エル・アント拳ジュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ丁ａｎｄ
　５ｃｈｕｅｌｌ）、ニューバンプシャー州キーン３を
少なくとも１５分間水に浸してからろ過装置（ミニホー
ルド、シュラヒエル・アンドｅジュール）に設置した。

次に１５Ｘ　！１ｌｉｓＰＥ（ＩＸ　５ＳＰＥ：　０．
１８ＭＮａＣｆＬ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、
ｐ）ｌ　７．７．１ｍＭ　Ｅ［１ＴＡ）０．５’＋＋／
を各ウェルに流した。入ＩＩＮＡの熱変性旧ｎｄＩＩＩ
断片とキャリヤー［ＩＮＡＣサケ精子ＤＮＡ）を１５Ｘ
　５ＳＰＥに希釈し、必要なレベルの入−）ｆｉｎｄ［
［［］ＮＡ　とキャリヤー［］ＮＡ　　５川ｇを含むア
リコート２００ｇ文を各ウェルに塗布した。ニトロセル
ロースへのラベルしたプローブの非特異的な吸着を測定
するための対照ウェルはキャリヤーＤＮＡ　　、５ｇｇ
のみで調製した。そして１５Ｘ　５ＳＰＥ　２５０　ｌ
Ｌ文で各ウェルを洗い、メンブレンは、風乾してから８
０°Ｃ下　２時間、真空オーブンでベーキングを行った
。最後に、ウェルで囲まれたＱ、２８ｃｎ（の円を切り
取り、使用するまでデシケータ−内に室温で保存した。

Ｃ，ポリマー貯蔵溶液の調製 ポリマー貯蔵溶液は次の濃度（重量／容量）の水溶液と
した。

デキストラン硫酸、ナトリウムＰａ［分子量５（１０，
０００、シグマ・ケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、）、ミズーリ州セントルイス］−２０％溶
液 ポリ　（メタクリル酸）　［分子量不明、ポリサイエン
シズ（Ｐｏｌｙ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）　、ペンシルバニ
ア州つォーリントン］−４０％溶液。５Ｎ　　ＮａＯＨ
で中和。

ポリ　（アクリル酸）　（分子量〜９０．０００、〜３
００，０００、〜４５０，０００　、ポリサイエンシズ
）−工０％溶液。ＩＯＮ　　ＮａＯＨで中和。

Ｄ、ハイブリダイゼーション反応 ハイブリダイゼーション反応は、きつく栓をしたポリス
チレンチューブ（ＩＯＸ　５０ｍｍ）の中で行われた。

ＤＮＡが吸着したニトロセルロースディスクは、６ＸＳ
ＳＰＥに少し浸してからチューブ内に置いた。次に６Ｘ
ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液（１×デンハー）　：　
０．０２％フィコール、０．（１２％ポリビニルピロリ
ドンおよび０．０２％牛血清アルブミン）、０．５％ド
デシル硫酸ナトリウム、　１００　ｇ　ｇ／−変性サケ
精子ＤＮＡおよび本発明のポリマーから成るプレハイブ
リダイゼーション溶液６０Ｊｉ、文を加えた。チューブ
は６５°Ｃ下−晩インキュベートシた。

これに熱変性してからジチオトレイトールで７０ｍＭと
した望ましい比活性をもつ３５Ｓラベルしたプローブ１
０角文を加えて反応を開始させた。反応混合物は８５℃
下必要な時間インキュベートし、それからこトロセルロ
ースディスクヲ２ＸＳＳＰＥ０．７５．、Ｊ、　０．１
％ドデシル硫酸ナトリウムで、室温下５分間３回、６５
℃下１０分間２回、そして室温下洛５分間２回洗った。

ディスクは十分水気を切って乾燥させ、結合した３５Ｓ
を測定した。各データポイントは同じ様に調製した３個
のディスクの結果の平均であり、ラベルした［ｌＮＡの
非特異的な吸着に関する補正を行っている。

結果 Ａ、ハイブリダイゼーション速度に対するポリマー濃度
の影響 各ポリマーの濃度を変えて初期ハイブリダイゼーション
速度の測定を行った。ニトロセルロースフィルターには
入ＤＮＡの旧ｎｄｌｌＩ消化物５ｎｇを固定し、””５
−ＤＮＡ　（４，５Ｘ　１１０６ｃｐ／ｌＪ、ｇ）　０
．ｌｐＬｇとハイブリダイズさせた。図１に示したよう
に、デキストラン硫酸の場合は、濃度が５％になるまで
ハイブリダイゼーション速度は増大した。いくつかの実
験では、多くの研究室で用いられている濃度である１０
％で速度がさらに多少上昇することが観察された。１０
％デキストラン硫酸の場合と同じ速度をポリメタクリル
酸塩で達成するには２０％の濃度が必要であった　（図
２）。ポリアクリル酸塩　（分子３９０，０００）は、
　１．５％という低濃度のときが最も速度増大効果が大
きかった　（図３）。

平均分子量３ｏｏ、ｏｏｏと４５０，０００のポリアク
リル酸塩の結果は、分子量９０，０００の場合とほぼ同
じであった。

分％ｉ　１，０００，０００のポリアクリル酸塩溶液は
粘性が大きすぎて扱い難く、分子量９ｏ、ｏｏｏの場合
が最も粘性が小さかったので、以後の研究にはこれを用
いた。

Ｂ、ポリマー存在下のハイブリダイゼーション速度の比
較 ハイブリダイゼーション反応の進行の具合を、ポリマー
が存在しない場合、１０％デキストラン硫酸、　１．５
％ポリアクリル酸塩および２０％ポリメタクリル酸塩が
存在する場合について２４時間測定した。ニトロセルロ
ースフィルタ− ＨｉｎｄＩＩＩ消化物５ｎｇを固定し、３５Ｓ−［ＩＮ
Ａ（４．５Ｘ　１０８ｃｐｍ／ｐＬｇ）　０．１ｇｇと
ハイブリダイズさせた。

データはググレビー（Ｄｕｇｇｌｅｂｙ）（ｒアナル・
バイオケム（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）Ｊ　１１
０：　９　〜１６、１９８１年）の記述する非線形回帰
法によって一時速度論モデルに合わせた。試験ポイント
は一時反応用に作成された曲線に適合している　（図４
）。曲線の作成に用いた反応速度定数を表１に示した。

各ポリマーの存在下で測定した速度の間に大きな差はな
かったが、ポリマー存在下の速度は、存在しない場合よ
り約３倍速かった。

表１ハイブリダイゼーション反応速度定数条件　　　　
　　　　　　反応速度定数（Ｈｒ’）ポリマーが存在し
ない　　　　　０．１４１０％硫酸デキストラン　　　
　　０．４５１、５％ポリアクリル酸塩　　　　０．５
６２０％ポリメタクリル酸塩　　　　０．４８Ｃ．ニト
ロセルロースメンブレンへのプローフッ非特異的な吸着 ニトロセルロースメンブレンへの３５３−、ＤＮＡプロ
ーブの非特異的吸着は、１０％デキストラン硫酸によっ
て約４倍増加した．（図５）。各二トロセルロースフィ
ルターにはサケ精子ＤＮＡ　　５＃ｇを固定し、プレハ
イブリダイゼーション処理を行ってから３５Ｓラベルし
た入ＤＮＡの旧ｎｄＩＩＩ消化物０．ＩＩＬｇを加えて
ハイブリダイゼーション条件下インキユベートシた。イ
ンキュベーションの初期においては、　１．５％ポリア
クリル酸塩または２０％ポリメタクリル酸塩存在下の非
特異的吸着は、ポリマーが存在しない対照の２倍であっ
たが、２４時間経過する頃には両者の差はほとんどなく
なった。

Ｄ、ポリマーによるハイブリダイゼーションの促進と固
定ＤＮＡレベルの関係 ポリマーの非存在下および１．５％ポリアクリル酸塩、
１０％硫酸デキストランの存在下において、フィルター
に固定したλＤＮＡの旧ｎｄＩＩＩ消化物と３５３−Ｄ
ＮＡのハイブリダイゼーション反応を行い、４．５時間
後にハイブリダイズした３５３−ＤＮＡの量をＪｌｌｌ
定した。各フィルターには必要量の旧ｎｄｍ消化λ［ｌ
ＮＡを固定し、３５Ｓ　−ＤＮＡ　（比活性：　１６、
７Ｘ１０６ｃｐｍ／　ｉＬ　ｇ）　１１００ｎと　４．
５時間反応させた。表２に示すように、フィルターのＤ
ＮＡレベルが増大するにつれて両ポリマーによるハイブ
リダイゼーション促進効果は弱まっており、　ＩＩＬｇ
ＤＮＡではポリマーによる反応促進効果はみられなかっ
た。固定ＤＮＡのレベルが高い場合にハイブリダイゼー
ションがポリマーによって促進されないのは、ポリマー
存在下ではプローブの自己アニーリングが速められて、
フィルターのＤＮＡとハイブリダイズしうる　１本鎖プ
ローブが減少するためであると考えられる。

表２．ポリマーによるハイブリダイゼーションの促進と
固定ＤＮＡレベルの関係 固定ＤＮＡ　　ＤＮＡヱと口り匹、丘住υ２　　　　　
　０．７　　　．１．９　　　　　　＋、７１０　　　
　　　２．５　　　　４．７　　　　４．５１００　　
　　　　１４．９　　　１１．８　　　　１２．５［考
察］ デキストラン硫酸、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル
酸塩の各アニオン性重合体は、溶性ＤＮＡとニトロセル
ロースに固定した相補的な［ｌＮＡとのハイブリダイゼ
ーションを促進した。濃度を最適にした場合、各ポリマ
ーの反応促進効果はほぼ同じであった（図４）。至適濃
度は、ポリアクリル酸塩が１．５％、ポリ、メタクリル
酸塩が２０％、そしてデキストラン硫酸が１０％であっ
た。ポリアクリル酸塩は、低濃度で効果があり、また最
も安価なポリマーであるので、ハイブリダイゼーション
反応におけるデキストラン硫酸の代替物としてとりわけ
魅力的である。

ポリアクリル酸塩およびポリメタクリル酸塩のもう　１
つの利点は、デキストラン硫酸を使用した場合に比へて
ニトロセルロースメンブレンへのＤＮＡプローブの非特
異的吸着が少ないことである　（図５）。上記のウェッ
トマー（Ｗｅｔｍｕｒ）やランキ（Ｒａｎｋｉ）らも報
告しているように、セルロースやニトロセルロースの支
持体の場合、デキストラン硫酪存在下では非特異的な吸
着が問題になっている。ポリアクリル酸塩またはポリメ
タクリル酸塩の存在下では、最初非特異的な吸着は増加
するが、その後ポリマーが存在していないときのレベル
まで減少する　（図５）。これに対し、デキストラン硫
酸を同じ条件下で使用した場合、非特異的な吸着のレベ
ルはより高く、長時間のインキュベーション中もほぼ同
じレベルが維持される。

ポリマーによるＤＮＡハイブリダイゼーションの促進効
果は、ニトロセルロースメンブレンに固定されたＤＮＡ
の量が少ないときの方が大きかった（表２）。これは特
定の非常に低レベルのＤＮＡ配列の検出を改善すること
につながりうる思いがけない結果である。ポリメタクリ
ル酸塩、そしてとりわけポリアクリル酸塩は、核酸ハイ
ブリダイゼーションの促進因子として、従来用いられて
きたデキストラン硫酸にまさる利点を有している。

明白なことであるが、本発明の意図および範囲を逸脱す
ることなく、上に述べ来たった本発明の部分的変更やバ
リエーションを多々行うことが可能である。

【図面の簡単な説明】

図１から図３は、ハイブリダイゼーション速度に対する
ポリアクリル酸塩およびポリメタクリル酸塩の影響をデ
キストラン硫酸と比較して示したグラフである。 図４は、最適濃度のポリマー存在下でのハイブリダイゼ
ーション速度を比較して示したグラフである。 図５は、ニトロセルロース支持体へのＤＮＡの非＃異的
な吸着に対するポリマーの影響を示したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性媒体中にポリアクリル酸塩またはポリメタクリ
   ル酸塩を含ませるステップからなることを特徴とする水
   性媒体中の２つの相補的なポリヌクレオチド断片のハイ
   ブリダイゼーションの速度を上げるための方法。 ２、ポリアクリル酸塩を水性媒体に加える特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、水性媒体が約０．２〜約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の
   ポリアクリル酸塩溶液を含む特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ４、ポリアクリル酸塩の濃度が約１．５％（ｗ／ｖ）で
   ある特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、ポリメタクリル酸塩を水性媒体に加える特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ６、水性媒体が約１．０〜約５０％（ｗ／ｖ）の濃度の
   ポリメタクリル酸塩を含む特許請求の範囲第５項記載の
   方法。 ７、ポリメタクリル酸塩の濃度が約２０％（ｗ／ｖ）で
   ある特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、ポリアクリル酸塩またはポリメタクリル酸塩の分子
   量が約５０，０００〜５００，０００ダルトンである特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、被検核酸および塩基配列が測定すべき配列と相補的
   なポリヌクレオチドプローブを含む水性試験媒体を形成
   するステップ（ａ）と、ハイブリッド形成したプローブ
   を測定するステップ（ｂ）から成る、１本鎖核酸を含む
   試料中の特定のポリヌクレオチドの配列を測定するため
   の方法であって、 水性媒体中にポリアクリル酸塩またはポリメタクリル酸
   塩を含ませることを特徴とする方法。 １０、プローブと共に試験媒体を形成する前に被検１本
   鎖核酸の固定化を行う特許請求の範囲第９項記載の方法
   。 １１、ニトロセルロースへの吸着によって被検核酸の固
   定化を行う特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、プローブを標識化する特許請求の範囲第１０項記
   載の方法。 １３、プローブの固定化を行う特許請求の範囲第９項記
   載の方法。 １４、被検核酸とプローブの両方が試験媒体に溶解して
   いる特許請求の範囲第９項記載の方法。 １５、水性媒体にポリアクリル酸塩を加える特許請求の
   範囲第９項記載の方法。 １６、水性媒体が約０．２〜約１０％（ｗ／ｖ）の濃度
   のポリアクリル酸塩溶液を含む特許請求の範囲第１５項
   記載の方法。 １７、ポリアクリル酸塩の濃度が約１．５％（ｗ／ｖ）
   である特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、ポリアクリル酸塩の分子量が約５０，０００〜約
   ５００，０００ダルトンである特許請求の範囲第１５項
   記載の方法。 １９、試料中の特定のポリヌクレオチド配列を測定する
   ための、 （１）塩基配列が測定すべき配列と相補的なポリヌクレ
   オチドプローブ 及び （２）ポリアクリル酸塩またはポリメタクリル酸塩 からなることを特徴とする試薬系。 ２０、プローブとポリアクリル酸塩から成る特許請求の
   範囲第１９項記載の試薬系。 ２１、プローブとポリメタクリル酸塩から成る特許請求
   の範囲第１９項記載の試薬系。 ２２、ポリアクリル酸塩またはポリメタクリル酸塩の分
   子量が約５０，０００〜約５００，０００ダルトンであ
   る特許請求の範囲第１９項記載の試薬系。 ２３、試料中の１本鎖核酸を固定することができる固体
   支持体を含む特許請求の範囲第１９項記載の試薬系。 ２４、固体支持体がニトロセルロースである特許請求の
   範囲第２３項記載の試薬系。 ２５、プローブが標識化されている特許請求の範囲第２
   ３項記載の試薬系。 ２６、プローブが固定化されている特許請求の範囲第１
   ９項記載の試薬系。