JPH01503006A - 細菌検定用標本の調製技法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 細菌検定用標本の調製技法 ３里９宣屡 Ａ、関連出願 本出願は、１９８７年４月１日出願の米国特許出願番号０７１０３３４３５の一 部継続出願である。

Ｂ１本発明および関連技術の分野 １９５０年代から１９６０年代初頭にかけての研究者は、喀痰（８ｐｕｔａ）な どの各種のムコイド性分泌物の組成物質が供給源および特定の疾患過程の本質に よって違いがあることを認識していた。具体的に言えば、ムコイドとして分類さ れ、感染過程に関連していると通常知られているような炎症細胞が欠如している 喀痰、および（化膿性細胞として分類されるような）細胞を含有している喀痰が 知られていた。タンパク構成成分およびＤＮＡは両者共に喀痰の粘性の一因であ るらしいことが示唆され、これを支持する証拠が集められていた。特に、ＤＮＡ ５ｅおよびプロテアーゼが喀痰および膿をある程度液状化する能力のあることが 確認された。ＤＮＡ５ｅは、化膿性喀痰に使用すれば比較的高い活性を示すよう であり、他方プロテアーゼは、ムコイド性標本に使用すれば比較的効果があった ［リーベルマン（Ｌ　ｉｅｂｅｒｍａｎ）、Ａ　ｍｅｒ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅｓｐ 、　Ｄ　１ｓｅａｓｅｓ　９７巻、６６２−６７２頁（１９６８）］。

酵素に加え、洗浄剤、塩類、酸化剤および還元剤など他の種々の物質が液状化剤 として試みられ、これらの中には、多少なりとも好適に作用するものがあった。

これらすべての物質は、実際上は、実験室の試験操作への使用および患者の治療 のための液状化など、１つまたはそれ以上の通常の目的にとっては、ある種の欠 点を有していた。

１９６０年代の初め、スルフヒドリル試剤であるＮ−アセチル−し−システィン を使用すれば、その本質が化膿性かつムコイド性であるムコイド性分泌物が効果 的に液状化されることが報告された［ウェブ（Ｗｅｂｂ）、Ｊ　、　Ｔｈｏｒａ ｃｉｃ　＆　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｓ　ＬＩｒｇ、＋　４４巻。

３３０−３４３頁（１９６２）］。この試剤は、化膿性標本の粘性に於ける重要 な一因と仮定されていた粘液（ムコイド性標本の粘性の殆どを支配していると考 えられるタンパク構成成分である）およびＤＮＡの両者を液状化できると主張さ れた。この試剤および関連化合物、ジチオトレイトール［米国特許第３．５０２ ．７７９号（１９７０年３月２４日）］によれば、従来の手法と比較し、多目的 に、多くのムコイド性標本が卓越して液状化されると判断された。スルフヒドリ ル試剤はＤＮＡ−タンパク複合体（核タンパク質ゲル）の分裂を助ける役目をす るのかもしれないが、純粋なりＮＡ溶液（これは非常に粘性があり得る）の粘性 には作用しない。上記の初期の研究者の中には、これらの調製物中に混在してい るＤＮＡ５ｅおよびプロテアーゼの作用を観察した者がいたのであろう。初期の 研究者の中にも、プロテアーゼに対するＤＮＡの阻害作用を認識していた者がい た。このように、スルフヒドリル単独で、タンパク質およびＤＮＡに於ける粘性 原因を処理できたことを示唆する主張が為されたので、これによって、他の研究 者がスルフヒドリル試剤およびＤＮＡ５ｅの組合わせの有用性を研究することが 阻止されたのかもしれない。

喀痰の流動学的性質を上記初期の研究者よりも、より定量的に測定しようとした 最近の研究者の研究では、喀痰の粘性に対するＤＮＡの作用が一般に割り引かれ て行われていた。彼らは、ＤＮＡの含有量と粘性との間に回答相関関係を見いだ せなかった。即ち、彼らは、ＤＮＡに由来する粘性が、その物理学的状態および その含有量によって左右されるものであることを完全には理解していなかったよ うである。大きい二重鎖ＤＮＡによって、短いあるいは１本鎖フラグメントに於 ける溶液よりも活性度の高い溶液となる。

このように、個々のムコイド性分泌物が種々の性質を有しており、これらの多様 性が粘性糖タンパク質およびＤＮＡが存在する相対的な量の相違に関連している 可能性があるという初期の知見があったにも拘わらず、スルフヒドリル試剤およ びＤＮＡ５ｅを組合わせてムコイド性標本の液状化を試みた報告をしている研究 者はいなかった。

細菌検定との関連性に於いて、喀痰および他のムコイド性または粘性生物学的標 本を液状化するのに使用された方法および構成物は、各種の不利益を被っていた 。希釈ＮａＯＨは標本を液状化するが、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）よりも効 能が弱く、さらにこれは多くの細菌を殺してしまい、また細菌性ＲＮＡを破壊し てしまう（従っに入手できない）。ＥＤＴＡなどの金属キレート剤は、たいした 成功を収めたわけではないが使用されてきた。アスコルビン酸／硫酸銅／過炭酸 ナトリウム混合物は、ＤＴＴに比べれば効能が少なく、また使用に際して危険性 が伴う。ドデシル硫酸ナトリウムなどの洗剤は多くの細菌に対して毒性を示し、 ＤＴＴよりも効能は少なく、染色技法の妨げとなる。次亜塩素酸ナトリウムも染 色技法の妨げとなり、多くの細菌を殺してしまい、研究の対象とするには幾分好 ましくない。

喀痰および他のムコイド性または粘性標本の液状化に関連する問題に加え、この ような標本から細菌種を単離または濃縮することは、ある特定の場合には問題を 包含している。特に、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ＠）属の 細菌は、喀痰標本の密度が極めて水に近く、従って遠心分離が効率良く行えない ので、喀痰標本から満足のいく定量性で分離することが困難である。

マイコバクテリウム属の微生物は、ヒトの致死率および罹患率に顕著に関与して いる。Ｍ、ラベルクロシス（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は臨床的に最も 意義のあるマイコバクテリウム病原体である。１９８３年には、推定５０．００ ０人のアメリカ人が結核に罹った、という報告が２３，８４６ケースあった。Ｔ Ｂ統計：州および市、罹患率および致死率の週間報告［５ｔａｔｅｓ　ａｎｄ　 Ｃ１ｔｉｅｓ、Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　ａｎｄ　Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　Ｉｅｅｋｌ ｙ　Ｒｅｐｏｒｔ、　３３巻、６２頁（１９８３）］、結核は、世界的にみれば 年に約３００万人が死亡する原因となっている［ヨーマンズ（Ｙｏｕ＋５ａｎｓ 、　Ｇ、　Ｐ、）、ラベルクロシス（Ｔ　ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、１０７頁 、サランダース（Ｓ　ａｕｎｄｅｒｓＸフィラデルフィア：　１９７９）］。２ 番目に最も臨床的に意義のあるマイコバクテリウム属の類は、Ｍ、アビウム（Ｍ 、　ａｖｉｕｍ）およびＭ、イントラセルラレ（Ｍ、１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ ｒｅ）から構成されるＭ、アビウム・コンプレックスである［グツド＆ニーグー （Ｇｏｏｄ　＆　５ｎｉｄｅｒ）、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、　１４６巻 、８２９−８３３頁（１９８２）］。

マイコバクテリウム種を検出、単離および同定する伝統的な方法には、抗酸性染 色法、培養技法および生化学的な確認操作がある。

マイコバクテリウムの存在性は、適当に染色処理した標本を顕微鏡学的に調査す ることで決定される。抗酸性桿菌の存在は、マイコバクテリウムの存在を示して いる。マイコバクテリウムの初期検出を行った後、さらに標本を加工し、培養す ればよい。２つの最も普通に使用される培養培地は、ローラエンスタイン−ジエ ンセン（Ｌ　ｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊ　ｅｎｓｅｎ）培地およびミドルプルツク （Ｍ　１ｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）培地である。増殖させた後、分別検定を適用し、 マイコバクテリウム種の存在に関して同定を行うことができる。疾病コントロー ルセンター（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、マ イコバクテリウム種を９０％近く特異的に同定できる検定法の１８シリーズを推 奨している［クーピカ（Ｋｕｂｉｃａ、Ｇ、Ｐ、）、ザーｖイコバクテリア（Ｔ ｈｅＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）　：出典書籍（Ｓ　ｏｕｒｃｅｂｏｏｋ）　、 パートＡ（Ｋｕｂｉｃａ＆Ｗａｙｎｅ（ワイネ）著）、１３３−１７５頁、マー セル・デツカ−（ＭａｒｃｅｌＤ　ｅｋｋａｒ）、ニューヨーク：　１９８４］ 。

喀痰からマイコバクテリウムを濃縮するのに使用される技法にも、まず第１にＤ ＴＴで（液状化するまで）処理し、ＮａＯＨで処理しく非マイコバクテリウムを 絶滅させ、付随した白血球細胞からマイコバクテリウムを遊離させる）、次いで ３８００　Ｘ９で約１５分間遠心分離し、得られた溶液を中和することが包含さ れる。ベレット化マイコバクテリウムを回収することは非能率的であり、またこ の方法は、回収が定量的でないので、理論的には感受性検定法に適さない。さら に、使用されるＮａＯＨ試剤は、マイコバクテリウムを標本中に非中性状態で長 時間おき過ぎるとマイコバクテリウムを殺してしまうかもしれない。クロロホル ム抽出、凝結反応（フロキユレーシヨン）、浮遊遠心分離法（ｆｌｏｔａｔｉｏ ｎ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）および水酸化アルミニウムまたは水酸化マ グネシウムゲル中に於けるエントラップメント（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）などの 他の濃縮法は、極めて非能率的であるか、問題をはらんでおり、従って今日では 広範に使用されてはいない［ミリス（Ｍｉｌｌｉｓ、　Ｈ，Ｓ、）およびキーー ミングス（Ｃｕｓｓｉｎｇｓ、　Ｍ、　Ｍ、　）の「結核の診断および実験法（ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｊ　（１９５２）　、スプリングフィールド （Ｓ　ｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ）、トーマス（Ｃ，Ｃ，Ｔｈｏｍａｓ、）の総説を 参照］。マイコバクテリウムを遠心分離するためには、通常の遠心分離より高速 超遠心分離が若干優れているが、これは高価であり、定量的な回収を行うことが できない。

Ｒ更９１句 本発明は、特に、生物学的標本中の選択された細菌種の存在または不存在を検出 するための検定法に関連するものであって、（１）ムコイド性分泌物および他の 粘性を有する生物学的標本を液状化すること、（２）マイコバクテリウムなどの 細菌種を濃縮することに関する。

従って、本発明の第１の目的は、ムコイド性分泌物および他の粘性を有する生物 学的標本を、ジスルフィド結合還元剤およびＤＮＡ消化剤からなる液状化用組合 わせ物を利用して液状化するための改良法および構成物を提供することにある。

本発明の第２の目的は、細菌種を生物学的標本（ムコイド性分泌物標本などの粘 性を有する生物学的標本のみに限られない）から濃縮することに関する。この目 的に照らし、本発明は、標本中の白血球細胞に随伴した細菌を、無傷の白血球細 胞を直接分離（例えば、・遠心分離）するによって濃縮し、次いでこの白血球細 胞を、注目の細菌は実質的に細胞無傷のままで残るように選択的に細胞溶解する という方法および手段を提供するものである。

本明細書によって開示している方法および構成物は広範囲の細菌検定法、例えば 核酸パイプリダイゼーシ蓑ン、培養および染色技法に適用することができる。

肛裡μ返朋 本発明は、ムコイド性分泌物標本または他の生物学的標本を選択された細菌種の 存在に関して分析するのに有用な改良法および構成物に関する。詳細には、本発 明は、例えば喀痰、頚部粘液、気管支粘液、膣粘液またはヒトもしくは他の動物 から得られる他の粘液などのムコイド性分泌物標本が特定の細菌種に感染されて いないかどうかを決定するための改良手段を開示するものである。本発明はさら に、他の生物学的試料、即ち尿、脳を髄液、全血もしくは他の体液および分泌物 にも適用することができる。

本発明は、このような検定を行う上で従来では内在していた多ぐの問題に関する ものである。第１に、本発明は、粘膜分泌物試料、例えば喀痰、他の粘性を有す る生物学的試料を液状化できる改良手段を提供する。このような液状化は、選択 された細菌種を効果的かつ正確に分析するためには必須である。この目的に本発 明では、ジスルフィド結合還元剤およびＤＮＡ消化剤からなる液状化用組合わせ 物を使用する。好ましい還元剤はジチオトレイトールであり、他方好ましいＤＮ Ａ消化剤は、ウシの膵臓から精製されたデオキシリボヌクレアーゼ■である。こ れらの成分は、ムコイド性分泌物標本を液状化する上に於いて、並外れて優れた 試剤の代表であり、同様に、これらの組合わせ物は、このような標本中の選択さ れた細菌種を好適に分析するのに必要とされる他の要件にも適合している。多く の液状化法が従来使用されてきたが、本発明の方法と同程度に有効と思われる方 法はない。

第２に、本発明は、選択細菌種の存在に関して分析することを目的とした、この ような、細菌種を粘膜分泌物標本または他の生物学的標本から濃縮するための改 良法に関する。詳細に言えば、従来技術ではマイコバクテリウム属に於ける細菌 種のような上記の細菌種を濃縮または単離する上に於いて、甚大な困難性を有し ており、その理由は、通常の標本加工培地（ｓｐｅｃｉｍｅｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎｇ　ｍｅｄｉａ）中にあるこのような細菌種が遠心分離などの常法を使用し ても分離に役立たないからである。本発明では、細菌を伴った白血球を好ましく は遠心分離で濃縮し、次いで細菌が実質的に細胞無傷で残るように選択的に細胞 溶解するものである。次ぎに、このように濃縮された細菌、例えばマイコバクテ リウムを、本発明の方法および構成物を使用して濃縮標本中で検定することがで きる。

本発明の方法および構成物は、抗酸性染色法、培養法、生化学的な確認操作、お よび特に核酸ハイブリダイゼーシッン法などの多くの細菌検定システムに使用す るのに適している。本発明は喀痰試料中のマイコバクテリウムの存在に関して検 定するのには特に適している。

本発明に於いて核酸ハイブリダイゼーション法は、３時間以内の標本の加工で、 喀痰または他のムコイド性分泌物標本からマイコバクテリウムを直接同定するの に好適に使用される。核酸ハイブリダイゼーシロン検定は、相補的な核酸の鎖が 一緒になって二重鎖の複合体（コンプレックス）を形成する能力に基づくもので ある。これに関しては概してミンソン＆ダービー（Ｍ　１ｎｓｏｎ＆　Ｄ　ａｒ ｂｙ）、　ｒハイブリダイゼーション技術（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅｓ）Ｊ　、　Ｎｅｗ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｐ　 ｒａｃｔｉｃａｌ　Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ、　１８５−２２９頁、Ａ　１ａｎＲ， Ｌ　ｉｓｓ、　Ｉ　ｎｃ、　（二ニーヨーク、１９８２）を参照。このような検 定は、ジェンーブローブインコーポレイテッド（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ　Ｉｎｃ、 ）［サン・ティエゴ、カルフォルニア］から入手できる。これらには、例えば標 的微生物のりボゾームＲＮＡに対して相補的なＩｔｓ　ｌ標識化１本鎖ＤＮＡプ ローブを使用することができる［コーン（Ｋｏｈｎｅ）らのレギオメラ（Ｌｅｇ ｉｏｎｅｌｌａ）に於けるＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　２ｎｄ　Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（トーンスベリ−（Ｔｈｏｒｎ ｓｂｅｒｒｙ）ら＆１ｉ）１０７−１０８頁、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔ ｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ワシントン：１９８４）］。細胞溶解 技法を使用してリボゾームＲＮＡを微生物から遊離させた後、ｌ”ｌ−ＤＮＡプ ローブを標的微生物のりボゾームＲＮＡと結合させて安定なりＮＡ　：　ＲＮＡ バイブリドを形成させる。残った標識化非−ハイブリダイズプローブを、固相分 離懸濁液を使用してハイブリダイズしたＤＮＡプローブから分離する。吸収され た標識化ＤＮＡ：　ＲＮＡバイブリドをガンマ−カウンターで計数し、試験結果 を、ネガティブコントロールの計数に対する患者の標本の計数の比率として計算 する。

既述した検定法ではそれぞれ、出発物質である喀痰もしくは他のムコイド性分泌 物標本、または他の粘性を有する生物学的標本の粘性を減じるために液状化工程 を利用する。喀痰の粘性は、粘液性糖タンパク質が存在することにその一因があ る。さらに、化膿性（感染した）喀痰または他の生物学的試料は、破壊された細 菌（例えば、マイコバクテリウム）および死亡した白血球細胞（主としてマクロ ファージおよび顆粒球）に由来する宿主の防御反応の結果として発生した粘性Ｄ ＮＡを多量に含有しているかもしれない。

本発明は、ジスルフィド（システィン）結合還元剤およびＤＮＡ５ｅなどのＤＮ Ａ消化剤の混合物を利用して、出発物質喀痰試料または他の粘性もしくはムコイ ド性生物学的試料の液状化を図るものである。これらの試剤は、試剤に由来する ジスルフィド結合およびホスホジエステル結合の開裂作用程度が、組合わせて満 足のいく液状化レベルに達するのに十分であるように、選択および適用すべきで ある。具体的には、非常に好ましいジスルフィド結合還元剤はジチオトレイトー ル（ＤＴＴ）であり、他方非常に好ましいＤＴＴ消化剤は、ウシ膵臓から精製さ れたデオキシリボヌクレアーゼＩ　（ＤＮＡｓｅｌ）である。他の有用なジスル フィド結合還元剤としては、Ｎ−アセチル−システィン、システィンおよび２− メルカプトエタン・スルホネートを挙げることができる。エンドヌクレアーゼは 一般に好ましく、エキソヌクレアーゼよりも有効な液状化物質である。

このような物質を組合わせることにより、従来行われていた、あるいは当業界既 知の方法および構成物よりも優っている液状化の成績が得られることが発見され た。ＤＮＡ還元剤は、例えば粘液性糖タンパク質に於いてタンパク様鎖（ｐｒｏ ｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ　ｃｈａｉｎｓ）を架橋しているジスルフィド結合を開裂 し、他方、ＤＮＡ５ｅｌ酵素は、例えば化膿性喀痰標本中に存在するＤＮＡ分子 を開裂するので、上記これらの物質は、組合わせれば役立つようである。

喀痰または他のムコイド性分泌物の出発標本は、既述の還元剤およびＤＮＡ消化 剤を連続して、あるいは同時に暴露させて液状化することができる。典型的な技 法としては、′ＤＴＴの０．９％滅菌生理食塩水０．ＯＩＭ溶液１３１１２を、 等量の喀痰試料に加える。次いで、その試料が液状化するまで（通常は１分より も短い）、試料を旋回（ｖｏｒｔｅｘ）する。次いで、得られた試料を室温（１ ８−２５℃）で５分間インキュベートし、もう１度手短に旋回する。次いで、５ ０１ｇ容量の円錐形遠心管中に於いて、可溶化した喀痰（２１１２）をＤＴＴの ０．９％滅菌生理食塩水約０．１Ｍ溶液約１ＩＩＱと一緒にする。

次いで、この混合物に、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣ１！、５ｍＭ　ＭｇＣｆｆ ｔ、５ｅＭ　ＣａＣｆｆ−（０，０２％アジ化ナトリウム保存剤）中の濃度約７ ５００キロユニツト／ＭＱのＤＮＡ５ｅ！　（ウシ膵臓から精製、ジグｖ−ケミ カルＣｏ、　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）またはクーパー・バイ オメディカルズ（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、約１０００−２０ ００キロユニツ）／ｉｇ）を４滴加える。この混合物を手短に旋回し、室温で５ 分間インキコベートする。次ぎに、この円錐形遠心管に、混合しながら０．９％ 滅菌生理食塩水約３０ｘＱを加え、試料を、揺動バケットローターで５分間１９ ００−２１００Ｘ９にて遠心分離する。

ＤＮＡ５ｅ溶液は、好ましくは、ＤＮＡ５ｅの酵素活性の活性化、保存中の酵素 の安定化（Ｃａ”″）および遠心分離中に於ける喀痰試料中の白血球細胞の細胞 壁の安定化に役立つマグネシウム（Ｍｇ”）およびカルシウム（Ｃａ″″）の供 給源を含有させる。本発明の１つの重要な側面は、細菌の濃縮操作中、標本中の 白血球細胞（粘膜性喀痰の場合には主としてマクロファージ）が細胞無傷の状態 で保持されるならば、喀痰試料からマイコバクテリウムを濃縮（即ち、分離また は単離）して濃縮標本にすることのできる能力は、極めて高められるという発見 である。この成績は、このような白血球細胞が免疫応答中に、例えばマイコバク テリウムのような標的細菌を高程度に随伴するという事実に基づ（ものである。

このような随伴性は、細菌が白血球細胞の内部に侵入する性質、または細菌に対 する白血球細胞の表面粘着の性質によるものであるかもしれない。本発明は、こ の随伴性を利用し、容易に到達できる回転速度の通常の遠心法を使用して標的細 菌の濃縮能および単離能を改良したものである。

この意義のある発見に照らせば、出発喀痰試料を液状化するのに使用される構成 物には、粘液性糖タンパク質およびＤＮＡ成分を素早（かつ完全に消化できると 共に、同時に標本中に残存している白血球細胞の細胞的完全性を実質的に分解し ないような構成物を選択しなければならないことは明らかである。喀痰または他 のムコイド性分泌物標本の消化（液状化）を助けると共に、同時に白血球細胞の 安定性を高めるＭｇ！″またはＣａ”のような成分が望ましいことも明らかであ る。

さらに、本明細書で既述したような標本消化剤に於ける、注意して選択した組合 わせ物を使用することは、好成績を収める検定の計画全体にとって非常に便利で あるという後記の考察も理解できるであろう。詳細には、核酸ハイブリダイゼー ション型の検定法に関連してＤ　Ｎ　Ａ　ｓｅまたは他のヌクレアーゼを使用す ることは、このような酵素がこの検定法の後期に使用されるハイブリダイゼーシ ヨンプローブおよび／または細菌性標的核酸を消化するであろう事実が仮定され る通常の情況下では、不便であるとみなせるであろう。しかしながら、本発明は この問題を回避しており、後期の加工段階で特異的に不活化され得るある種のＤ ＮＡ５ｅを利用することによって、ＤＮＡ５ｅ消化剤を高い有用性で使用するこ とができる。しかし、同等に重要な事実は、本発明で使用するＤＮＡ５ｅは他の 物質、例えば細胞溶解剤が存在していたとしてもＤＮＡ５ｅの活性を保持してお り、本発明を実施する上に於いてもこれを使用していることである。従って、本 明細書に於いて特許請求している液状化剤（標本の消化のための液状化剤）の組 合わせ物は、顕著に良好な液状化の成績を収めることに加え、検定全体として実 施する本発明に注意して適合させることに配慮する。ウシ膵臓から精製されたＤ ＮＡ５ｅＩは、細胞溶解試剤（特に、デオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕ ｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ））の存在下でもその活性を保持できるＤＮＡ消 化剤の１つの例であり、従ってこのＤＮＡ消化剤は本発明を実施する上で好まし いものである。

本発明の使用に適した液状化剤に伴う機能的要件は、白血球細胞の液状化および 遠心分離の後に続く反応工程に関連している。無傷の白血球細胞および随伴細菌 を含有している、遠心分離によって得られるペレットは得られた上清をデカント することによって単離される。この上清は消化された、あるいは死亡した白血球 細胞および細菌、過剰のＤＴＴおよびＤ　Ｎ　Ａ　ｓｅ、ならびにムコイド性分 泌物標本の消化性液状化の後に残った糖タンパク質およびＤＮＡを含有している かもしれない。次に、この時点で、細菌を、例えば白血球細胞の溶解によって無 傷の白血球細胞から分離する。細胞を溶解するための多くの方法は当業界既知で あるが、本発明を最も好適に実施するためには、白血球細胞を溶解することがで き、随伴細菌を遊離すると同時にその遊離細菌を無傷の細胞として保存できる溶 解試剤を利用する。さらに、細胞溶解され、濃縮された標本に後期に加えられ、 白血球細胞（または、もし存在するならば他の溶解細胞）から遊離されたＤＮＡ 物質を消化するＤＮＡ５ｅの内、少なくとも１つのＤＮＡ５ｅの活性を阻害しな い溶解試剤を使用することが最も好適である。

培養法、染色法または核酸ハイブリダイゼーション法によって検定されるべき、 選択された細菌種の場合は、白血球細胞を溶解した後でも、選択細菌種を細胞無 傷の形態で保持させることが必須であろう。例えば、培養法では、後の増殖のた めに生存細胞が必要であり、染色法では主として、少なくとも細胞無傷の細菌が 必要である。

核酸ハイブリダイゼーション検定に於ける細菌の検定工程は選択細菌種の溶解を 伴うものであるが、それでも、時期を早まった細胞溶解は、細菌中の標的ＲＮＡ またはＤＮＡを、濃縮された標本中に存在しているかもしれないＲＮＡ５ｅおよ びＤＮＡ５ｅに暴露してしまうので、最終的なハイブリダイゼーション検定工程 の前までは細菌を細胞無傷の状態で保持することが都合よい。例えば、このよう なヌクレアーゼは、溶解した白血球細胞、ベレット中に溶解された他の細胞、ま たは上溝を遠心分離し、デカントした後に濃縮標本中に残っている喀痰から由来 し得る。さらに、白血球細胞または他の溶解微生物から遊離されたＤＮＡを消化 させるために、付加的なりＮＡｓｅを溶解した白血球細胞の濃縮標本に加えるこ とが好ましいが、しかし、このようなりＮＡｓｅは、検定のために選択された細 菌種がベレット化白血球細胞の濃縮標本を溶解した後で細胞無傷でない場合には 、これらの細菌種のＤＮＡを攻撃する可能性がある。これらすべての理由から、 検定のために選択された細菌種を細胞無傷のままで残しておく方法によって白血 球細胞を溶解することが好ましい。

マイコバクテリウムの場合、溶解試剤であるデオキシコール酸ナトリウムは、濃 縮標本中で、マイコバクテリウムを付随した白血球細胞を溶解することができ、 その間、濃縮標本中に存在するＲＮＡ５ｅまたは他の成分によるマイコバクテリ ウムのＲＮＡの破壊に対抗してマイコバクテリウムを細胞無傷のままに保持する ことのできることが発見された。マイコバクテリウムはデオキシコール酸ナトリ ウムに対しても、白血球細胞がこの溶解剤で溶解された後にマイコバクテリウム が培養物中の生存性を保持する程度まで細胞無傷であると考えられる。サルモネ ラ（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌｇ）などの腸胆汁− 耐性の病原体のような他の細菌も、付随白血球細胞のデオキシコール酸ナトリウ ムによる細胞溶解に対して細胞無傷のままであろう細菌種の例である。

デオキシコール酸の他の塩も、その他の溶解剤がよいように、選択的溶解を行う 上で好適であり得る。既述の選択的溶解を行うのに好適なあらゆる溶解試剤、即 ち、細胞無傷の形態である注目の選択された細菌種を遊離する態様で濃縮白血球 細胞を溶解することが本発明の範囲内に属されることは理解できるであろう。本 明細書に於いては、細菌が特定の検定方法によって検定することができる物理的 形態で保持されているならば、その検定方法に関して「細胞無傷」である。例え ば、培養検定は一般に、検定に対して選択された細菌が培養生存の程度まで細胞 無傷であることが必要であろうし、一方、核酸ハイブリダイゼーション検定は一 般に、細菌中の標的ＲＮＡまたはＤＮＡが、例えば標本中に残ったＲＮＡ５ｅま たはＤＮＡ５ｅの攻撃から保護される程度にまで細菌が細胞無傷であることが必 要であろう。「細胞無傷」に於ける他の定義は、他の検定方法にとって適切であ るかもしれない。従って、上記に加え、白血球細胞が濃縮工程の間に有用なレベ ルの標的細菌への付随性を保持できるならば、その白血球細胞は、既述した液状 化および濃縮の後に細胞無傷であるとみなすことができる。

ベレット化した無傷の白血球細胞の濃縮標本を溶解すれば、ＤＮＡなどの遊離さ れた細胞内成分は通常、濃縮標本を、その後の検定の簡便な加工にとっては粘性 の強すぎる形態にするものである。従って、溶解白血球細胞の濃縮標本にＤＮＡ ５ｅまたは濃縮標本中で白血球細胞もしくは他の溶解細胞から遊離された核酸物 質を消化できる他の酵素を加えると有用である。白血球細胞を溶解するのに使用 される溶解試剤は、少なくとも１つのＤＮＡ５ｅまたはこの後期の溶解性消化工 程に適した他の酵素の活性を阻害しない物質であるべきである。デオキシコール 酸ナトリウムがこの場合も適当な溶解試剤である。これとは対照的に、溶解試剤 ドデシル硫酸ナトリウムはＤＮＡ５ｅおよびＲＮＡ５ｅの殆どを不活化するもの であり、従ってヌクレアーゼを使用してその後の消化を行う場合には白血球細胞 の濃縮標本を溶解するには好ましくない溶解試剤の例である。

本発明に係る後期の溶解性ＤＮＡ消化工程はウシ膵臓から精製したＤＮＡ５ｅＩ を使用して行えば、液状化され、かつ溶解された濃縮標本を得ることができる。

このＤＮＡ５ｅは出発ムコイド性分泌物標本の最初の液状化で使用したものと同 じであり、本発明を実施する上では好ましいものである。他のＤＮＡ５ｅも利用 することができ、これらも本発明の範囲内に属される。既述したように、このよ うな消化剤は、白血球細胞の濃縮標本を溶解するのに使用される溶解試剤に対し て安定であるべきである。相補的ＤＮＡから構成されるプローブを加えるべき核 酸ハイブリダイゼーシ言ン検定に於ける例のように、消化剤の選択に当たっては 、ＤＮＡ５ｅまたは他の後期溶解性消化剤を不活化するその後の加工工程に於い て都合の良いと思われる程度までの消化剤を選択するという事実に留意すべきで ある。

ウシ膵臓由来のＤＮＡ５ｅｌはこれらの要件を満足するものである。

注目の細菌種（このようなものが標本中に存在していれば）を付随したペレット 化した無傷の白血球細胞を含有する濃縮標本の溶解は、上清をデカントした後に 行う。溶解試剤の適量、即ちデオキシコール酸ナトリウム（水中、１６％）の場 合には出発喀痰試料ＩＭＣに対して約２滴（約６０μｍ２）を白血球細胞ペレッ トに加える。

次いで、このベレットを、旋回ミキサーを使用して懸濁し、室温で５分間インキ ュベートする。

この溶解工程の後、ＤＮＡ５ｅなどのＤＮＡ消化剤を濃縮標本に加える。ウシ膵 臓ＤＮＡ５ｅＩ　７４４６キロユニツト／ｘＱを含有する溶液の場合、１滴（約 ５０μｇ）には、溶解工程に於いて白血球細胞から遊離されたＤＮＡを消化し、 適当に液状化するのに十分な酵素が含有されている。この消化混合物を約２０− ２５℃で約５分間インキコベートすれば、以後の検定工程にとって十分に液状化 された濃縮標本が得られる。溶解し、消化したばかりのこの濃縮標本を直ぐに選 択された細菌種の存在に関して試験しない場合、例えばマイコバクテリウムのよ うな場合には、約２−８℃で２４時間保存することができる場合がある。

マイコバクテリウム属の細菌は、細胞壁に高含量のろう様脂質物質（ｖａｘｙ　 １ｉｐｉｄ　ｓａｔｅｒｉａｌｇ）を有していることが一因となって、自身の細 胞の完全性が破壊されることに対しては比較的抵抗力がある。

このような細菌は、核酸ハイプリダイゼーシ璽ン検定を目的としたデオキシコー ル酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウムなどの溶解試剤に対して細胞無傷 の状態を保持している。遠心分離で濃縮された標本中の白血球細胞を溶解するこ とのできる溶解剤に対して安定である他の細菌種も、上述の濃縮、溶解および消 化工程にしたがって処理することができる。既述したように、腸胆汁耐性の病原 体はこのカテゴリー内に包含することができる。しかし、他方、検定に際して選 択された細菌種が、例えば白血球細胞の溶解工程の間に十分な細胞無傷の状態を 保持できない場合もある。このような場合には、本発明の技法は、ある種の修飾 工程を行うことで依然として好適に実施することができる。

第１に、広い範囲の細菌種に適用できる一般的な技法である、細菌を付随した白 血球細胞の単離方法によって、検定されるべき選択細菌種を喀痰試料から濃縮す る。この技法は、例えば、以後の加工工程で遭遇するかもしれない細胞の完全性 の問題はあるにしても、最初の濃縮工程として利用することができる。

核酸ハイブリダイゼーション検定の場合は、検定されるべき細菌種の核酸成分を 、核酸を分解し得るＤＮＡ５ｅまたはＲＮＡ５ｅなどの物質に暴露することから 避けることが望ましい。注目した細菌種を、白血球細胞の溶解に際して細胞無傷 の状態に保護できない場合には、溶解した濃縮標本中に存在しているかもしれな いＤＮＡ５ｅまたはＲＮＡ５ｅを同時に不活化する溶解工程を直接行うことが望 ましいであろう。例えば、ペレット化した白血球細胞を、ＤＮＡ５ｅおよびＲＮ Ａ５ｅを阻害または変性するドデシル硫酸ナトリウムで溶解し、次いで遊離され た核酸（主としてＤＮＡ）を開裂でき、溶解した濃縮標本の粘性を小さくするこ とのできる音波処理工程を行えばよい。別法としては、一般にＤＮＡ５ｅまたは ＲＮＡ５ｅを不活化しないデオキシコール酸ナトリウムなどの溶解剤を、ＲＮＡ ５ｅ阻害物質および付加ＤＮＡ５ｅと共に使用すればよい。この組合わせによれ ば、溶解白血球細胞および細菌から遊離されたＤＮＡが消化され、従って濃縮標 本の粘性を小さくし、同時に核酸ハイブリダイゼー”シ１ン検定に於けるハイブ リダイゼータ１ンの標的として使用されるはずの細菌性ＲＮＡ分子の分解が妨げ られる。当然ながら、付加ＤＮＡ５ｅは、ＤＮＡハイブリダイゼーシぢンブロー ブ（あるいはＲＮＡプローブを使用することもできる）を標本に加える前には、 不活性でなければならないであろう。

選択細菌種は、濃縮標本中の白血球細胞を濃縮した後に検定することができる。

好ましくは、この検定工程は、既述の溶解および消化工程に従い行う。選択細菌 種を培養する場合には、濃縮標本を処理して、望ましくない細菌種を殺し、同時 に選択細菌種を保持するようにする。比較的頑丈なマイコバクテリウムの場合、 この工程は、濃縮標本（既に溶解および消化を行った標本）を希釈水酸化ナトリ ウムで処理すれば行うことができる。別法とすれば、ドデシル硫酸ナトリウムに よる処理はマイコバクテリウム以外の細菌種を多く選択的に殺すらしい。選択的 に選択細菌種を培養するもう１つの方法は、注目の細菌種以外の微生物のすべて またはその殆どの増殖を阻害する培養培地を使用することである。

選択細菌種の存在に関しての好ましい検定方法は、核酸パイプリダイゼーシ１ン 検定法に関連する。上述のように調製した、溶解し、消化した濃縮標本であって 、例えば細胞無傷のマイコバクテリウムを含有する標本の定量的量の試料（例え ば、１００μＱ）を、細菌を溶解するために容器に移す。細菌の溶解は、核酸ハ イブリダイゼーションの操作を妨害し得る標本中のＤＮＡ５ｅおよびＲＮＡ５ｅ を不活化する前に行うべきでない。ドデシル硫酸ナトリウムは、このような不活 化剤として使用することができ、さらにこれはタンパク質および他の細胞成分の 可溶化に役立つ。ガラスピーズ（ｇｌＢｇ　ｂｅａｄｓ）およびドデシル硫酸ナ トリウムなどの溶解試剤を含有するガラス製溶解用チューブ（ｇｌａｓｓ　ｌｙ ｓｉｎｇ　ｔｕｂｅ）であって、その使用が係属中の米国特許出願第８４１，８ ６０号（１９８６年３月２０日出願）に開示されているチューブは、この細菌の 溶解工程には特に適している。この溶解用チューブに栓をし、水浴音波処理器［ 水浴ソニケーター］　（５０−７０℃）中に置き、約１５分間音波処理する。［ 任意のエネルギー転移を保証するため、水浴音波処理器の水を好ましくは、この 操作の前に約１５分間音波処理することによって脱気し音波処理の後、溶解した 濃縮細菌試料を、係属中の米国特許出願第８１６，７１１号（１９８６年１月７ 日出願）に開示されている核酸ハイブリダイゼーション検定にかけることができ る。プローブ反応混合物には、ハイブリダイイー２９フ反応の速度を速め、残っ たＤＮＡ５ｅの活性を阻害するジイソブチルスルホスクシネートなどの洗浄剤様 の試剤を含有させることができる。

実施例１ デオキシコール酸ナトリウムを使用した白血球細胞の溶解、ＤＮＡ５ｅｌを使用 した粘性の排除 喀痰（０，２５ｚｅ）を、ジチオトレイトールのリン酸緩衝液（１Ｍジチオトレ イトール、０．１Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．５））溶液を旋回ミキサー を使用して混合した。３０％デオキシコール酸塩（ｄｅｏｘｙｃｈｏａｔｅ）溶 液（０，５１１２）を加えると、これにより、標本は、白血球からＤＮＡが遊離 し、素早く、非常に粘性の高いものになった。デオキシリボヌクレアーゼＩ　（ ５μｇ／ｌｌｌ２）１０μｅを加え、標本を再び混合した。室温で数分間放置す ると粘性が消失した。

この実験は、ＤＮＡが喀痰標本に於ける粘性の原因となり得、またＤＮＡ５ｅＩ がＤＮＡを分解し、５％デスオキシコール酸ナトリウムの存在下で喀痰粘性を減 少させるよう作用し得ることを示していた。さらに、この実験は、ある種の喀痰 標本が、粘性の原因であるＤＮＡを効率的に分解する程に十分に高いレベルの内 在性ＤＮＡ５ｅを有していないことをも示していた。

顕微鏡観察で１００Ｘの塗抹標本１個当たり５０個以上の白血球を含有する化膿 性喀痰１．５ｊ！（！を、０．Ｏｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．５）中 、０．００１Ｍ　ジチオトレイトール０．５．ｗｆｆと混合した。この試料を旋 回ミキサーで数秒間混合し、室温に１５分間放置した。この時間は液状化してし まう時間であった。５０μｅ部分量を試験管に移し、１０％デオキシコール酸ナ トリウムの２容量と共に混合して粘性を素早く増加させた。次いで、この粘性は １０−２０秒経過すると消失した。

この実験は、低濃度のジチオトレイトールに暴露させても、使用した条件下では 白血球細胞を溶解しないか、あるいは喀痰標本中に白血球細胞のＤＮＡを遊離さ せないことを示した。デスオキシコール酸ナトリウムを追加すると、細胞は溶解 され、溶液に粘性を与える細胞自身のＤＮＡが遊離された。この粘性は、この標 本中で自然に減少したが、これは内在性ＤＮＡ５ｅの作用に由来するものであっ た。

血液の型および粘液膿の型のすべてを包含した型である１２個の喀痰標本を、１ Ｍジチオトレイトール、０．１Ｍ　トリス−ＨＣＱＣｐＨ＝８．０）および０． ２５％ＤＮＡ５ｅｌを含有する可溶化剤の等量と混合した。

すべての喀痰は急速にかつ完全に液状化した。

叉施週１ 保存していた喀痰試料（抗酸性塗抹が陽性の３つの喀痰標本から得た）を、ＩＭ 　ジチオトレイトール、０．１Ｍ）リス−ＭＣＩ２　（ｐＨ＝８．０）の等量と 共に混合した。Ｏ，ＩＭ　ＭｇＣＱ２５０μＱをＤＮＡ５ｅｌ　（２０ｍｇ／ｘ １２　；　１４００ユニット／ｘｇ　；　０．１５ＭＮａＣＱ、５０ｍＭ　Ｃａ ＣＱｔ）１０１１Ｑと共に加えた。

この喀痰標本は十分に液状化された。Ｍ　ｇ　ＣＱ　！を加えると、二価カチオ ン（ＤＮＡｓｅが活性を示すために必要）を特に加えない従来からの処置試料と 比較すると、液状化反応は加速されたようであった。

Ｈ＝８．０）、ＩＭ　ジチオトレイトールと旋回させることによって混合した。

液状化喀痰を臨床用遠心分離（ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）によ って３分間遠心分離にかけた。上清を確保し、放置した。得られたペレットを０ ．１５Ｍ　ＮａＣ０５１Ｑ　テ１回洗浄シタ。＄１−６−標識化ＤＮＡプローブ を用いたハイブリダイゼーションによって、この試料をマイコバクテリウムのｒ ＲＮＡに関して検定した。

ハイブリダイゼーションの動力学は、この細胞関連のフラクション中、０．５１ １！喀痰当たり少な（とも１．６Ｘ１０’個のマイコバクテリウムがあることを 示した。上清のフラクシヨンにはマイコバクテリウムが検出されず、検出されず に存在し得る最大の数はＩＩＩ（２当たり約２Ｘ１０＠個と計算された。マイコ バクテリウムのＲＮＡを上清フラクシヨンに加えた後、ハイブリダイゼーション 検定を行うことで、上清に関するネガティブな結果は、ハイブリダイゼーション 検定を阻害する成分に基づくものではないことがわかった。これにより、マイコ バクテリウムは比較的低い遠心分離の力で液状化喀痰標本から効率良（ペレット 化できると結論付けられる。

叉範週玉 ４つの抗酸性陽性の喀痰標本を使用した実施例５のプロトコールによる検定報告 実施例５に於ける実験プロトコールを、さらに４つの喀痰標本に関して報告した 。その結果を以下に示す。

ムを含有していた。上清は最大で全量３Ｘ１０’個のマイコバクテリウムを含有 していた。

Ｗ杢Ｚ：細胞ペレットは全量約４Ｘ１０”個のマイコバクテリウムを含有してい た。上清は最大で全量１ｘｌＯ１１個のマイコバクテリウムを含有していた。

ムを含有していた。上清は最大で全量Ｉ　Ｘ　１０’個の÷イコバクテリウムを 含有していた。

標本４：細胞ペレットは全量約３Ｘ１０＠個のマイコバクテリウムを含有してい た。上清は最大で全量２Ｘ１０’個のマイコバクテリウムを含有していた。

これらの実験により、マイコバクテリウムを喀痰試料の白血球細胞フラクション 中に回収できることを確認した。

国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ６ｇ１０Ｑ９５９ ｉｎ　ｌ　ｍ１ｍ　ｍ　ｌ＾５ｓｂｕ＋＋ｅｅ　Ｎａｐ、＋〒／　ｊ　！　Ｑ　 ：　Ｓ　、＋　＋　、７　Ｑ　：　ＱＰＣＴ／ＵＳ６８１００９５９ ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｆｉｅｌｄｓ　５ｅａｒｃｈ。

（Ｄ工ＴＨＩＯＴＨＲＥＩＴＯＬ　ＯＲＤＴＴ）ｎｄ （ＤＮＡＡＳＥ　ＯＲＤＮＡ５Ｅ　ＯＲＤＥＯＸＹＲＩＢＯＮ’ＵＣＬＥＡＳＥ ）

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．ムコイド性分泌物標本または他の粘性を有する生物学的標本を液状化するた めの方法であって、 （ａ）該標本をジスルフィド結合還元剤と接触させて該標本中のタンバク様分子 内に於けるジスルフィド結合を開裂させる工程、および （ｂ）該標本をＤＮＡ消化剤と接触させて該標本中のＤＮＡ分子内に於けるホス ホジエステル結合を開裂させる工程からなることを特徴とする方法。
2. ２．ジスルフィド結合還元剤がジチオトレイトールである請求項１に記載の方法 。
3. ３．ＤＮＡ消化剤がデオキシリボヌクレアーゼＩである請求項１に記載の方法。
4. ４．ムコイド性分泌物標本をジチオトレイトールおよびデオキシリボヌクレアー ゼＩと接触させる工程を包含する該ムコイド性分泌物標本を液状化する方法。
5. ５．ムコイド性分泌物標本が喀痰標本である請求項４に記載の方法。
6. ６．喀痰標本を、ジチオトレイトールおよびデオキシリボヌクレァーゼＩからな る混合物と接触させる請求項５に記載の方法。
7. ７．選択された生物種の存在に関してムコイド性分泌物または他の粘性を有する 生物学的標本を検定するためのキットであって、該生物種を検定する前に該標本 を液状化ずる手段を有している該キットに於いて、該標本を液状化するための請 求項１に記載の手段を当該キット中に有するという改良。
8. ８．選択された細菌種の存在に関してムコイド性分泌物標本を検定するためのキ ットであって、該細菌種を検定する前に該標本を液状化する手段を有している該 キットに於いて、該標本を液状化するための請求項４に記載の方法に係る手段を 当該キット中に有するという改良。
9. ９．選択された細菌種の存在に関して喀痰標本を検定するためのキットであって 、該細菌種を検定する前に該標本を液状化する手段を有している該キットに於い て、該標本を液状化するための請求項６に記載の方法に係る手段を当該キット中 に有するという改良。
10. １０．選択された細菌種がマイコバクテリウムまたは腸胆汁−耐性病原体である 請求項７に記載の改良。
11. １１．選択された細菌種がマイコバクテリウムまたは腸胆汁−耐性病原体である 請求項８に記載の改良。
12. １２．選択された細菌種がマイコバクテリウムまたは腸胆汁−耐性病原体である 請求項９に記載の改良。
13. １３．選択された細菌種の存在に関してムコイド性分泌物標本または他の粘性を 有する生物学的標本を検定するための方法であって、該細菌種を検定する前に該 標本を液状化し、核酸ハイブリダイゼーション技法によって該細菌種を検定する 工程からなる該方法に於いて、該標本を、該標本中のＤＮＡ分子に於けるホスホ ジエステル結合を開裂できるＤＮＡ消化剤からなる消化混合物と接触させて該標 本を液状化するという改良。
14. １４．消化混合物がさらに標本中に於けるジスルフィド結合を開裂できるジスル フィド結合還元剤を含有するという請求項１３に記載の改良。
15. １５．ＤＮＡ消化剤がデオキシリボヌクレアーゼＩである請求項１３に記載の方 法。
16. １６．ジスルフィド結合還元剤がジチオトレイトールである請求項１４に記載の 方法。
17. １７．選択された細菌種の存在に関して生物学的標本を検定するための方法であ って、選択された細菌種を該生物学的標本から濃縮して濃縮標本とし、該濃縮標 本を該選択された細菌種に関して検定する工程からなる該方法に於いて、該生物 学的標本から、該選択された生物種の一部を随伴している白血球細胞を濃縮する ことによって当該濃縮標本を調製する工程を含む改良。
18. １８．生物学的種が粘膜分泌物標本を含有する請求項１７に記載の改良。
19. １９．粘膜分泌物標本が喀痰を含有する請求項１８に記載の改良。
20. ２０．選択された細菌種がマイコバクテリウムまたは腸胆汁−耐性病原体である 請求項１７に記載の改良。
21. ２１．濃縮工程が遠心分離からなる請求項１７に記載の改良。
22. ２２．濃縮標本が実質的に細胞無傷の白血球細胞を含有する請求項１７に記載の 改良。
23. ２３．選択された細菌種を生物学的標本から濃縮するための方法であって、 （ａ）該選択された細菌種を随伴している白血球細胞を該生物学的標本から濃縮 して濃縮標本を調製する工程、および（ｂ）該濃縮標本中の該白血球細胞を、溶 解試剤で溶解して溶解された白血球細胞および該選択された細菌種の実質的に細 胞無傷の細菌を含有する溶解濃縮標本を調製する工程からなることを特徴とする 方法。
24. ２４．生物学的標本がムコイド性分泌物標本を含有する請求項２３に記載の方法 。
25. ２５．選択された細菌種がマイコバクテリウムまたは腸胆汁−耐性病原体である 請求項２３に記載の方法。
26. ２６．溶解試剤がデオキシコール酸の塩からなる請求項２３に記載の方法。
27. ２７．ＤＮＡ消化剤を使用し、溶解濃縮標本を液状化する工程をさらに包含する 請求項２３に記載の方法。
28. ２８．ＤＮＡ消化剤がデオキシリボヌクレアーゼＩである請求項２７に記載の方 法。
29. ２９．溶解試剤が、ＤＮＡ消化剤を不活化しない溶解試剤の中から選ばれる請求 項２７に記載の方法。
30. ３０．溶解試剤がデオキシコール酸の塩からなる請求項２９に記載の方法。
31. ３１．液状化工程により、選択された細菌種の実質的に細胞無傷の細菌を含有す る液状化された溶解濃縮標本を調製する請求項２７に記載の方法。
32. ３２．選択された細菌種の存在に関して生物学的標本を検定するためのキットで あって、選択された細菌種を該生物学的標本から濃縮して濃縮標本とする手段を 有する該キットに於いて、該濃縮標本を調製する請求項１７に記載の改良に係る 手段を該キット内に有することを特徴とする改良。
33. ３３．選択された細菌種の存在に関して生物学的標本を検定するためのキットで あって、選択された細菌種を該生物学的標本から濃縮する手段を有する該キット に於いて、該細菌種を濃縮するための請求項２３に記載の方法に係る手段を該キ ット内に有することを特徴とする改良。
34. ３４．溶解濃縮標本を液状化する手段をさらに包含するキットに於いて、溶解濃 縮標本を液状化する請求項２７に記載の方法に係る手段をキット内に有すること を特徴とする改良。
35. ３５．選択された細菌種の存在に関してムコイド性分泌物標本または他の生物学 的標本を検定するための方法であって、（ａ）請求項２３に記載の方法によって 、該選択された細菌種をムコイド性分泌物標本または他の生物学的標本から濃縮 して溶解濃縮標本を調製する工程、および （ｂ）該選択された細菌種に関して該溶解濃縮標本を検定する工程からなること を特徴とする方法。
36. ３６．検定工程が、選択された細菌種を検出するのに適した核酸ハイブリダイゼ ーション工程であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
37. ３７．検定工程が、選択された細菌種を検出するのに適した培養工程であること を特徴とする請求項３５に記載の方法。
38. ３８．検定工程が、選択された細菌種を検出するのに適した染色工程であること を特徴とする請求項３５に記載の方法。
39. ３９．標本がムコイド性分泌物標本である請求項３５に記載の方法。
40. ４０．選択された細菌種がマイコバクテリウムまたは腸胆汁−耐性病原体である 請求項３５に記載の方法。
41. ４１．ムコイド性分泌物標本が喀痰を含有する請求項３９に記載の方法。
42. ４２．生物学的標本がムコイド性分泌物標本である請求項３３に記載のキット。
43. ４３．ムコイド性分泌物標本が喀痰を含有する請求項４２に記載の方法。
44. ４４．生物学的標本がムコイド性分泌物標本である請求項３５に記載のキット。
45. ４５．ムコイド性分泌物標本が喀痰を含有する請求項４４に記載のキット。