WO2020045368A1 - 不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬，ワクチンなどの評価方法 - Google Patents

不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬，ワクチンなどの評価方法 Download PDF

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和雄 宮▲崎▼
敦史 山中
稔 岡田
覚 千住
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国立大学法人 熊本大学
国立大学法人大阪大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing monocytes or dendritic cell-mediated infectious microorganisms in vitro, a method for evaluating therapeutic agents for such microbial infectious diseases, and the like.
  • dengue virus is a virus that has been studied for many years to cause infections in humans, and has been empirically identified as a K562 cell line derived from human chronic myelogenous leukemia, a Vero cell line derived from kidney epithelial cells of African green monkey, and a Syrian hamster kidney-derived cell line. Studies have been performed using cell lines such as the BHK cell line.
  • BHK cell line Although there is an advantage that evaluation using these cell lines can be easily performed, there is a problem that it cannot always be said that infection or proliferation in a human body is reflected.
  • monocytes and dendritic cells derived from human living bodies By using monocytes and dendritic cells derived from human living bodies, it is possible to analyze the mechanisms and antigens that are closer to the living body, and thus the development of new drugs and vaccines is expected. Theoretically, it is possible to evaluate infectious diseases using leukocyte-like cells derived from a human body, and an infectious disease evaluation using cells isolated from a tissue extracted from an individual is also being performed. For example, it has been reported that hematopoietic stem cells derived from cord blood, bone marrow, and peripheral blood can be differentiated in vitro into blood cells, and further into monocytes and induced cells.
  • monocytes or dendritic cell-mediated infectious microorganisms mediate monocytes and dendritic cells, but the full conditions such as conditions suitable for virus growth are not yet available. Not disclosed. Therefore, there is a problem that even in experiments using cells isolated from an individual, the experiments are not necessarily performed under conditions suitable for the study of monocytes or dendritic cell-mediated infectious microorganisms to be studied.
  • iPS-MC myeloid cells
  • iPS-ML self-proliferating myeloid cell lines
  • CD14-ML monocyte cell lines
  • Non-Patent Document 10 the dendritic cells derived from iPS-ML (iPS-ML-DC) described above It has been shown that dengue virus infects and that HLA activates matching T cells (Non-Patent Document 10). However, when iPS cells are used, cancer remains due to remaining iPS cells, and it is difficult to induce stable and reliable differentiation of myeloid cells from iPS. There were many issues such as the necessity of reliably sorting only the lineage cells. Also, while CD4 + monocytes have excellent ability as antigen presenting cells (Non-patent Document 11), it has been known that iPS-derived myeloid cells (iPS-ML) have low CD4 expression (Non-patent Document 12). ).
  • virus isolation from infected patients is an important task for confirmation of infection, inspection and research.
  • Virus isolation is performed by collecting blood from infected patients and performing work using cultured cells.
  • cultured cells For example, in the case of dengue virus, it is common to use a serum sample within 5 to 6 days after onset and C6 / 36 cells, a human Aedes albopictus cultured cell line, etc. (Non-patent Document 13).
  • Non-patent Document 13 Non-patent Document 13
  • the virus concentration in the serum sample and the time from the sampling to the start of culture affect the efficiency of virus isolation, and virus isolation is not always successful.
  • Non-Patent Document 14 For example, in the case of dengue virus, it is known that the virus concentration in a serum sample decreases due to recovery of a patient, and that the number of surviving viruses after blood collection decreases over time. Therefore, the success rate of virus isolation was about 60%, and it was known that this rate was even lower after 5 days after the onset, when the amount of virus was considered to be small (Non-Patent Document 14).
  • an attenuated vaccine uses attenuated virus mutants obtained by repeating subculture many times using heterologous cultured cells as vaccines.
  • viral mutations occur very rarely, and require a long study period, that is, a culture period.
  • the rotavirus vaccine (RV1) which is an attenuated vaccine
  • the human virus is passaged 33 times with the African green monkey kidney cell line, then subjected to limiting dilution 3 times, and the selected strain is further passaged 7 times with Vero cells. It has been reported that they could be obtained for the first time by substituting (Non-Patent Document 15).
  • Non-Patent Document 15 As described above, it has been generally known that an attenuated mutant cannot be obtained unless a large number of cultures are performed.
  • an object of the present invention is to find a method that is more stable, reproducible, economical, and easy to operate in the study of infectious microorganisms mediated by monocytes or dendritic cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method capable of obtaining a mutant of a monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism in a short-term culture.
  • the present inventors conducted studies on infecting monocytes and dendritic cells prepared and prepared by various methods with dengue virus in order to find a method for providing monocytes and dendritic cells suitable for infectious disease research.
  • the present inventors have found that dengue virus can efficiently infect and proliferate cells having phagocytic ability (eg, dendritic cells) obtained by the above method, and completed the present invention.
  • the virus that infects these cells has a faster growth rate and produces more progeny virus and virus-like particles.
  • the present inventors have provided a novel method for research and development, such as a method for evaluating drugs such as compounds and vaccines, for treating monocyte or dendritic cell-mediated infectious microbial infections. .
  • they succeeded in finding that they could be used for vaccine production and construction / development / production of mutants by enabling the growth of monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganisms.
  • the present invention solves these problems by using iPS cells, particularly by immortalizing and using monocyte cells. That is, by adopting a method for immortalizing monocyte cells, it is possible to easily obtain a population of only monocyte cells stably.
  • cells obtained by immortalizing monocyte cells express CD4 and thus have higher antigen-presenting ability than iPS-derived dendritic cells, and are considered to be suitable cells for vaccine research.
  • the present invention provides a monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism infection model excellent in CD4 expression.
  • the present invention solves the problem in virus isolation that has been difficult with conventional cultured cells due to the influence of the virus concentration in the sample.
  • proliferative human monocyte cells obtained by immortalizing iPS cell-derived, human cord blood-derived, ES cell-derived, or bone marrow cells or peripheral blood-derived CD14-positive cells
  • phagocytic cells eg, dendritic cells
  • the present invention succeeded in providing a separation evaluation system that improves the success rate of virus separation.
  • the present invention provides an excellent virus isolation cell.
  • the present invention further solves the problem that it takes a long time to obtain a virus mutant that is an attenuated virus in vaccine development. That is, according to the present invention, proliferable human monocyte cells obtained by immortalizing iPS cell-derived, human cord blood-derived, ES cell-derived, or bone marrow cells or peripheral blood-derived CD14-positive cells; Even when cells with phagocytic ability (eg, dendritic cells) obtained by inducing differentiation of sphere cells are infected with a low concentration of virus, they do not require long-term cultivation and have different morphologies. It is possible to obtain a virus mutant that forms plaques. As a result, virus mutants can be obtained in a short period of time and are considered to be suitable cells for vaccine research. Therefore, the present invention provides cells excellent in mutant production for virus vaccine research.
  • proliferable human monocyte cells obtained by immortalizing iPS cell-derived, human cord blood-derived, ES cell-derived, or bone marrow cells or peripheral blood-derived CD14
  • the present invention relates to the following inventions.
  • a method for maintaining and culturing monocytes or dendritic cell-mediated infectious microorganisms A monocyte into which at least one gene selected from the BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2, and LYL1 genes and the cMYC gene have been introduced;
  • a method for maintaining and culturing monocytes or dendritic cell-mediated infectious microorganisms Introducing at least one gene selected from a BMI1 gene, an EZH2 gene, an MDM2 gene, an MDM4 gene, a HIF1A gene, a BCL2 gene and a LYL1 gene, and a cMYC gene into monocytes; Inducing dendritic cells to differentiate from any of said monocytes; A method comprising infecting the obtained monocytes or dendritic cells with the infectious microorganism, and culturing the infected cells.
  • a method for identifying a therapeutic agent for infectious disease of monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism A monocyte into which at least one gene selected from the group consisting of BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2 and LYL1 in the presence of a test drug and cMYC gene, or Infecting dendritic cells differentiated from monocytes with the infectious microorganism, Measuring the level of infection of the infectious microorganism in the monocytes or the dendritic cells; Determining from the measured infection of the infectious microorganism whether the test drug has the therapeutic effect on the infectious disease,
  • the measured infection level of the infectious microorganism is lower than the infection level of a control in which the cells are infected with the infectious microorganism in the absence of the test drug, Is determined to have the infectious disease treatment effect.
  • a method for producing a mutant strain of a monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism A monocyte into which at least one gene selected from the BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2, and LYL1 genes and the cMYC gene have been introduced; Infecting dendritic cells with said infectious microorganism, Culturing infected monocytes or said dendritic cells to grow said infectious microorganisms; A method comprising isolating a mutant strain from the grown infectious microorganism.
  • a method for producing a vaccine for monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganisms A monocyte into which at least one gene selected from the BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2, and LYL1 genes and the cMYC gene have been introduced; Infecting dendritic cells with said infectious microorganism, Culturing infected monocytes or said dendritic cells to grow said infectious microorganisms; Recovering the grown infectious microorganism.
  • a method for separating an infectious microorganism from blood derived from an infectious disease patient of a monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism A monocyte into which at least one gene selected from the BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2 and LYL1 genes and the cMYC gene have been introduced, or differentiation-induced from said monocyte Contacting dendritic cells with said patient-derived blood; Culturing infected cells, A method comprising identifying infected microorganisms by detecting and / or identifying microorganisms in cultured cells.
  • the monocytes are cells obtained by inducing differentiation of human pluripotent stem cells or human hematopoietic stem cells, or cells obtained by isolation from human peripheral blood.
  • the method according to (8), wherein the human pluripotent stem cells are iPS cells.
  • (11) The method according to (10), wherein the human pluripotent stem cells are iPS cells.
  • At least one gene selected from the BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene, HIF1A gene, BCL2 gene and LYL1 gene is the BMI1 gene, BCL2 gene or LYL1 gene, (1) to (12) The method according to any one of claims 1 to 4.
  • the present invention it is possible to study and evaluate microorganisms that cause infectious diseases mediated by monocytes or dendritic cells. For example, by using the present invention, it is possible to culture and evaluate diseases that were difficult to culture and evaluate using human blood donated blood cell materials, and to study and treat infectious diseases, anti-infective drugs, Vaccine development will be possible. Further, the method of the present invention enables drug screening evaluation with little error in the development of a therapeutic drug for a blood-related disease.
  • FIG. 2 is a photograph showing May-Giemsa staining of dendritic cell-like cells induced by stimulating immortalized human monocyte cells with IL4. It is a plate design figure in a dengue virus infection experiment. Human monocytes or dendritic cells to be evaluated were placed in the left half of a 96-well plate, and control cells, K562 cells, were seeded in the right half. Different dilutions of the virus solution were added to each row (1-12) of the well.
  • DENV-1 dengue virus type 1
  • DENV-2 dengue virus type 2
  • DENV-3 dengue virus type 3
  • DENV-4 dengue virus type 4
  • AH dengue virus type 4
  • ML monocyte-like cells
  • K562 K562 cell line
  • FIG. 4 is a photograph of the evaluation results using dendritic cells (DC: dendritic cells, K562: K562 cell line).
  • FIG. 5 is an enlarged photograph of A5, C5, E5, and G5 wells (upper row) of FIG. 4 and A7, C7, E7, and G7 wells (lower row) of FIG. A1 indicates the first row and the first column of the plate in FIG. It is a graph which shows the result of having measured the amount of virus release of a monocyte-like cell (A) and a dendritic cell-like cell (B).
  • the vertical axis represents the amount of virus released into the culture supernatant (log10 @ plaque forming unit (PFU) / mL).
  • PFU plaque forming unit
  • D4 dengue virus type 1
  • DEV-2 type 2
  • DEV-3 type 3
  • DEV-4 type 4
  • the group not purified by the filter was measured with a flow cytometer for the unfiltered group (Non @ filter) and the group purified by a mesh filter with 12 ⁇ m lattice holes (12 ⁇ m).
  • the vertical axis shows the area of side scattered light (SSC-A), and the horizontal axis shows the result of detection of forward scattered light (FSC-H).
  • SSC-A side scattered light
  • FSC-H forward scattered light
  • FIG. 4 is a plate design diagram showing that the virus dilution rate was increased and the infection was evaluated at a low virus concentration from the dengue virus infection experiment in FIG. 3.
  • the following description is based on experiments performed using dengue virus type 4 (DENV-4). 1 ⁇ 10 5 cells described in A to D are added to each well, and the virus is added according to the multiplicity of infection (MOI).
  • MOI multiplicity of infection
  • A1 arrow stripe
  • dengue virus type 4 (DENV-4) is infected at a rate of 0.39 (particles) to one peripheral blood-derived immortalized monocytic cell (CD14-ML).
  • CD14-ML peripheral blood-derived immortalized monocytic cell
  • FIG. 3 is a view showing the results of a plaque dengue virus infection experiment. Both peripheral blood-derived dendritic cells (CD14-DC: open arrow) and iPS cell-derived dendritic cells (iPS-DC: black arrow) proliferate and release virus even in the presence of very low concentrations of virus.
  • FIG. 3 is a view showing the results of a plaque dengue virus infection experiment. It is a figure using dengue virus type 1 and performing infection while performing virus dilution. Plaque spots (white arrows) of the plaques change at the concentration of large spots (black arrows), indicating that the virus may be mutated between the two.
  • the present invention provides a method for maintaining and culturing a monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism, the method comprising selecting from BMI1 gene, EZH2 gene, MDM2 gene, MDM4 gene, HIF1A gene, BCL2 gene and LYL1 gene.
  • a method comprising infecting a monocyte into which at least one gene to be obtained and a cMYC gene have been introduced, or a dendritic cell differentiated from the monocyte, with the infectious microorganism.
  • the invention provides a method of maintaining and culturing monocytes or dendritic cell-mediated infectious microorganisms, comprising: Introducing at least one gene selected from a BMI1 gene, an EZH2 gene, an MDM2 gene, an MDM4 gene, a HIF1A gene, a BCL2 gene and a LYL1 gene, and a cMYC gene into monocytes; Inducing dendritic cells to differentiate from any of said monocytes; and A method comprising infecting the obtained monocytes or dendritic cells with the infectious microorganism.
  • monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism means viruses, fungi, protozoa, and the like that include infection of monocytes or dendritic cells in the course of their survival and proliferation.
  • Such monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganisms include flaviviridae viruses that cause dengue, such as dengue virus, Japanese encephalitis virus, West Nile virus, yellow fever virus, Murray Valley virus, St. Louis encephalitis virus, Zika virus, tick-borne encephalitis virus and the like.
  • monocytes as a raw material can be obtained by a method of collecting from peripheral blood, a method of inducing differentiation from pluripotent stem cells, a method of inducing differentiation from other somatic cells such as fibroblasts, and the like.
  • monocytes are collected from peripheral blood, methods for isolating and preparing cells expressing CD14 molecule in human peripheral blood are known.
  • human peripheral blood is gently diluted with an equal volume of physiological saline, phosphate buffered physiological saline, Hanks' buffer, or the like.
  • the diluted blood is gently layered on Ficoll® (GE Healthcare) in a centrifuge tube, and centrifuged at 15-30 ° C., 500-1000 ⁇ g for 20 minutes.
  • the white band-like layer between the yellowish plasma and the transparent ficoll is collected as a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) fraction composed of lymphocytes and monocytes.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • the collected peripheral blood mononuclear cell fraction may be further washed and used as necessary.
  • Monocytes can be obtained by further collecting cells expressing the CD14 molecule from the collected PBMC fraction.
  • the solid phase to which the anti-CD14 antibody is bound is brought into contact with PBMC to bind monocytes to the solid phase, and the unbound cells are washed and removed, thereby allowing separation and recovery.
  • PBMC peripheral blood
  • monocytes can be obtained by directly contacting peripheral blood with a solid phase to which an anti-CD14 antibody is bound without separating PBMC from peripheral blood.
  • pluripotent stem cell means a cell having pluripotency and self-renewal ability.
  • pluripotency is synonymous with pluripotency and means a state of cells that can be differentiated into cells of a plurality of lineages by differentiation.
  • pluripotency refers to a state capable of differentiating into all types of cells constituting a living body (totipotency), and a state capable of differentiating into all types of cells except extraembryonic tissues (differentiation).
  • Pluripotency a state capable of differentiating into cells belonging to some cell lineages (multipotency), and a state capable of differentiating into one type of cell (unipotency) Including. Therefore, “pluripotent stem cells” in the present specification include stem cells, embryonic stem (ES) cells, embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer (“ntES cells”), and germ stem cells (“GS cells”). ), Embryonic germ cells (“EG cells”), and induced pluripotent stem (iPS) cells, and hematopoietic stem cells.
  • ES embryonic stem
  • GS cells germ stem cells
  • EG cells Embryonic germ cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • Whether a certain cell is a pluripotent stem cell is determined, for example, when the test cell forms an embryoid body in an in vitro culture system, or after culturing (differentiation treatment) under differentiation-inducing conditions.
  • the cells can be determined to be pluripotent stem cells.
  • Methods for obtaining pluripotent stem cells are known. For example, iPS cells are obtained by somatic cells having three or more types of reprogramming genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Esrrb, Glis1, E-cadherin, shp53, UTX and H1foo).
  • Induction of differentiation of pluripotent stem cells into monocytes can be carried out, for example, by using macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and interleukin 3 (IL-3) (Fernadondo @ O. Martinez et al., Experimental @ Hematology (2008); 36: 1167- 1175). ), Or by contacting IFN- ⁇ or PMA (Annable Glorleau et al., J Immunol 1999; 162: 3491-3497) with pluripotent stem cells. Monocytes that have been induced to differentiate may be collected and purified, if necessary, only from CD14-expressing cells by the method described above.
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • IL-3 interleukin 3
  • the obtained monocytes are transfected with at least one gene selected from BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2 and LYL1 genes, and cMYC gene to introduce the function of monocytes. While maintaining the expression, the proliferation ability can be added.
  • at least one gene selected from the BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, and HIF1A genes is combined with the cMYC gene, or the BMI1 gene is combined with the BCL2 gene or the LYL1 gene and the cMYC gene. Combination.
  • the introduction of these genes into monocytes can be performed with reference to WO2012 / 043651 and JP-A-2017-131136. For example, they can be introduced by infecting monocytes with a lentiviral vector carrying these genes.
  • Infection and culture of monocytes and dendritic cell-mediated infectious microorganisms can be carried out by contacting the cells with a solution containing monocyte and dendritic cell-mediated infectious microorganisms.
  • a medium used for infection and / or culture after infection include an IMDM solution, an RPMI solution, an ⁇ -MEM solution, a MEM medium, and a DMEM solution.
  • human or bovine plasma protein fraction fetal bovine serum or human serum, saccharides such as glucose and D-mannitol, nucleobases such as amino acids and adenine, sodium hydrogen phosphate, ⁇ -tocopherol, linoleic acid, cholesterol, It may contain sodium selenite, human holotransferrin, human insulin, ethanolamine, 2-mercaptoethanol, EPO, TPO, sodium bicarbonate, methylcellulose, and the like.
  • antibiotics such as gentamicin, ampicillin, penicillin, and strepromycin; inorganic salts; and buffers such as HEPES, phosphate buffer, and acetate buffer may be added.
  • 10% fetal bovine serum is added to ⁇ -MEM (10% fetal bovine serum) medium supplemented with non-essential amino acids, or RPMI1640 medium (SIGMA) containing hypoxanthine and HEPES (SIGMA).
  • SIGMA RPMI1640 medium
  • SIGMA hypoxanthine and HEPES
  • Sodium bicarbonate 100 units / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • the culturing time can be appropriately set according to the type of cells, microorganisms, medium, and the like, and can be, for example, 24 to 96 hours, 36 to 84 hours, and 72 hours.
  • the number of cultures may be a small number, for example, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 or 1 time.
  • Other culture conditions can be determined according to general human cell culture conditions, for example, at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the present invention provides a method of identifying an agent for treating an infection of a monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism, comprising: A monocyte into which at least one gene selected from the group consisting of BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2 and LYL1 in the presence of a test drug and cMYC gene, or Infecting dendritic cells differentiated from monocytes with the infectious microorganism, Measuring the level of infection of the infectious microorganism in the monocytes or the dendritic cells; And determining whether the test drug has the therapeutic effect on the infectious disease from the measured infection of the infectious microorganism.
  • the measured infection level of the infectious microorganism is lower than the infection level of a control in which the cells are infected with the infectious microorganism in the absence of the test drug, Is determined to have the infectious disease treatment effect.
  • the measurement of the infection level of the infectious microorganism is carried out by measuring the infectious titer of the microorganism contained in the supernatant after completion of the culture using Cell-ELISA, immunostaining, plaque forming method, or PCR method. be able to. Alternatively, the measurement can be performed by fixing the infected cells after completion of the culture and performing immunostaining or Cell ELISA.
  • the screening method of the present invention comprises the steps of: Immobilizing, and contacting the immobilized cells with an antibody specific for the monocyte and dendritic cell-mediated infectious microorganism.
  • the Cell-ELISA method includes contacting an antibody (primary antibody) which specifically binds to the microorganism with the immobilized cells, removing unbound antibody (washing),
  • the labeled antibody (secondary antibody) capable of binding to the primary antibody is brought into contact with the immobilized cells after contacting with the primary antibody, the unbound antibody is removed (washed), and the immobilized antibody is removed.
  • the method may include measuring the labeling level (intensity, area, number, etc.) of the secondary antibody bound to the cell, and calculating the infection level of the microorganism that has infected the cell from the measured labeling level.
  • the immunostaining method comprises contacting a labeled antibody capable of specifically binding to the microorganism with the immobilized cells, removing (washing) unbound antibody, and immobilizing the immobilized antibody. Measuring the labeling level (intensity, area, number, etc.) of the antibody bound to the cells, and calculating the infection level of the microorganisms that have infected the cells from the measured labeling level.
  • a detectable label such as a radioactive label, an enzyme label, a fluorescent label, a bioluminescent label, a chemiluminescent label, a metal, or a near-infrared light label can be used.
  • monocytes or dendritic cells were recovered from culture supernatants or cell lysates of infected monocytes or dendritic cells.
  • the microorganism-containing liquid with a cell line known to be infected by the microorganism (eg, a K562 cell line, a Vero cell line, or a BHK cell, etc.); adding the mixed cell / microorganism liquid to a medium; Culturing for 12 hours to 10 days, immobilizing infected cells after culturing, and contacting the immobilized cells with an antibody specific for the monocytes and dendritic cell-mediated infectious microorganisms. You may go out.
  • the contact of the microorganism-specific antibody with the immobilized cells can be specifically performed by the above-described Cell-ELISA method or immunostaining method.
  • Infection of monocytes or dendritic cells with monocytes and dendritic cells mediated by infectious microorganisms When performed by PCR, for example, recovered from culture supernatants or cell lysates of monocytes or dendritic cells after infection It can be performed by performing a real-time PCR method using a microorganism-containing liquid as a sample.
  • the “infection level” is not particularly limited as long as it reflects the number of infected microorganisms, and is, for example, PFU, PFU / mL, the area of the infected area, the amount of microorganisms (units), or the concentration of microorganisms (units / mL). ) Can be used.
  • the “infection level of a control in which the cells were infected with the infectious microorganism in the absence of the test drug” was used as a control test simultaneously with the test drug, in the absence of the test drug, in the presence of the BMI1 gene, EZH2.
  • Gene, MDM2 gene, MDM4 gene, HIF1A gene, BCL2 gene and at least one gene selected from LYL1 gene and cMYC gene-introduced monocytes, or dendritic cells differentiated from said monocytes It may be obtained by infecting the infectious microorganism and measuring the infection level of the infectious microorganism in the monocytes or the dendritic cells.
  • the control infection level may be obtained from a control test performed in advance or separately.
  • the two levels compared are those obtained from tests performed under the same conditions. If the infection level measured in the presence of the test drug is lower than the control infection level measured in the absence of the test drug, the test drug is considered to have the infectious disease treatment effect. Is determined.
  • the present invention provides a method of producing a mutant of a monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism, comprising: A monocyte into which at least one gene selected from the BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2, and LYL1 genes and the cMYC gene have been introduced; Infecting dendritic cells with said infectious microorganism, Culturing infected monocytes or said dendritic cells to grow said infectious microorganisms; A method comprising isolating a mutant strain from the grown infectious microorganism.
  • a monocyte or a dendritic cell-mediated infectious microorganism can be efficiently propagated in an environment close to a living body in vitro, so that mutations that can occur in the living body can be simulated in vitro.
  • the culturing can be carried out for any period of time until the mutant strain is generated, and during the culturing period, new cells can be infected as necessary and / or the medium can be changed. Isolation of the mutant strain can be performed by isolation of the infected microorganism and sequencing thereof.
  • a microorganism-containing solution after culturing for an arbitrary period is appropriately diluted to infect a cell line known to be infected by the microorganism (eg, a Vero cell line or BHK cell) to form a single plaque.
  • a cell line known to be infected by the microorganism eg, a Vero cell line or BHK cell
  • microorganisms can be isolated.
  • the formation of a single plaque can be performed in the same manner as in the plaque forming method described above.
  • the gene of the isolated microorganism is analyzed and compared with the gene sequence of the original microorganism at the time of infection, and if the gene sequence of the original microorganism differs from the gene sequence of the isolated microorganism, the isolation
  • the obtained microorganism can be identified as a mutant strain. Analysis of the gene sequence can be performed using a commercially available DNA sequencer or next-generation sequencer (NGS).
  • NGS next-generation sequencer
  • Mutants are not particularly limited, and include, for example, mutants that are weakly pathogenic and can be used as live vaccines, and drug-resistant mutants.
  • the present invention provides a method for producing a vaccine for a monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism, comprising: A monocyte into which at least one gene selected from the BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2, and LYL1 genes and the cMYC gene have been introduced; Infecting dendritic cells with said infectious microorganism, Culturing infected monocytes or said dendritic cells to grow said infectious microorganisms; Recovering the grown infectious microorganism.
  • the infectious microorganisms that have proliferated can be recovered from the culture supernatant or from the lysate after cell disruption.
  • the collected microorganism is used after being appropriately purified as necessary.
  • As a purification method density gradient centrifugation, ultrafiltration, affinity chromatography and the like can be used.
  • the obtained microorganism can be used as it is as a live vaccine.
  • the microorganism can be an inactivated vaccine (including toxoid).
  • the method of the present invention further comprises degrading the recovered infectious microorganism and, if necessary, recovering an antigenic portion from the degraded product, or Extracting and inactivating toxins in sexual microorganisms may be included.
  • the present invention includes a vaccine produced by the above method. Further, the present invention provides a method for preventing microbial infection, which comprises administering the vaccine to a subject that may be infected with monocytes or dendritic cell-mediated infectious microorganisms, and the method for preventing the infection of monocytes or monocytes. The present invention also includes a method for treating a microbial infection, which comprises administering to a subject infected with a dendritic cell-mediated infectious microorganism. The method for producing and administering the vaccine preparation can be appropriately performed using methods well known in the art.
  • the present invention is a method of separating an infectious microorganism from blood of a patient infected with a monocyte or dendritic cell-mediated infectious microorganism, the method comprising: A monocyte into which at least one gene selected from the BMI1, EZH2, MDM2, MDM4, HIF1A, BCL2, and LYL1 genes and the cMYC gene have been introduced; Contacting dendritic cells with said patient-derived blood; Culturing infected cells, The present invention relates to a method comprising identifying an infected microorganism by detecting and / or identifying the microorganism in a cultured cell.
  • Infection and culture can be performed according to the above-mentioned methods.
  • Detection and / or identification of microorganisms in cultured cells can be performed by a method widely known in the art depending on the microorganism of interest, for example, by a method using PCR or a method using an antibody. be able to.
  • monocytes or dendritic cells are mammalian monocytes or dendritic cells, preferably human monocytes or human dendritic cells.
  • Dengue virus Four serotypes of dengue virus were used for infection assessment. The strains used were Mochizuki strain (dengue type 1 virus), NGC strain (dengue type 2 virus), H87 strain (dengue type 3 virus), and H241 strain (dengue type 4 virus), all of which are prototype strains. Based on known methods, each virus used the supernatant released into the culture of infected Vero cells.
  • a medium obtained by adding sodium hydrogencarbonate (final concentration 0.225%), 100 unit / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin to an RPMI1640 medium (SIGMA) containing hypoxanthine and HEPES (SIGMA) was used. used.
  • Example 1 Preparation of human peripheral blood-derived immortalized monocytic cells (CD14-ML) and dendritic cells (production of human peripheral blood-derived immortalized monocytic cells) Human immortalized monocytic cells derived from human peripheral blood were prepared with reference to a previously reported report (WO2012 / 043651 and JP-A-2017-131136).
  • a CD14-positive fraction was taken from human peripheral blood, and genes reported as mouse immortalized hematopoietic stem cells (Myc, Myb, Hob8, TLX1, E2A-pbx1, MLL, Ljx2, RARA, Hoxa9, Notch1, v- raf / v-myc, MYST3-NCOA2, Evi1, HOXB6, HOXB4, ⁇ -catenin, Id1) or a gene reported in human immortalized monocyte cells.
  • Immortalized monocytic cell lines were cultured in ⁇ -MEM medium containing 20% FBS, 50 ng / ml M-CSF, and 50 ng / ml GM-CSF. And stored under liquid nitrogen using a commercially available cell preservation solution.
  • the staining was performed using a commercially available staining solution (Sigma), Giemsa staining or May Giemsa staining based on a known staining method, and measurement was performed with a high magnification microscope (400 to 1000 times).
  • the stored immortalized monocyte cell line was cultured in ⁇ -MEM medium (containing 20% FBS, 50 ng / ml M-CSF, and 50 ng / ml GM-CSF) at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. It was maintained and prepared by exchanging the medium once every three days.
  • Dendritic cells are obtained by culturing immortalized monocytes in the presence of 50 ng / ml M-CSF, 50 ng / ml GM-CSF, and 20 ng / ml IL-4 for 3 days to differentiate into dendritic cells. And used for cell evaluation.
  • FIG. 1 shows the results of confirming the properties of human monocyte-like cells prepared by the method of Example 1. This result indicates that the obtained human monocyte-like cells are cells expressing surface markers (CD11 and CD14) specific to monocyte cells.
  • CD11 and CD14 surface markers specific to monocyte cells.
  • the mixed expression level of various CD14 suggests that not only classical monocytes but also intermediate and non-classical monocyte cells are included.
  • FIG. 2 shows a Giemsa-stained diagram of the human monocyte-like cell group of Example 1.
  • the Giemsa stain shows a protrusion in the shape of the cell membrane, suggesting that some cells are undergoing dendritic cell transformation due to physical stimulation.
  • Example 2 Preparation of immortalized monocytic cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPS-ML) Human immortalized monocytic cells derived from human induced pluripotent stem (iPS) cells were previously reported (WO2012 / 043651 and Opened 2017-131136). Specifically, undifferentiated iPS cells were seeded on Matrigel such as laminin 511 previously coated as a basement membrane and seeded, and differentiation-inducing culture was started using ⁇ -MEM medium (containing 20% FBS). Thereafter, the culture was continued once every three days while changing the ⁇ -MEM medium (containing 20% FBS).
  • ⁇ -MEM medium containing 20% FBS
  • the cells were treated with trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) -collagenase solution (37 ° C., 60 minutes), dissociated and collected, and a cell suspension was prepared by pipetting operation. . Subsequently, cells derived from one 10 cm diameter dish were suspended in 10 ml of DMEM medium (containing 10% FBS), seeded on two 10 cm diameter dishes without feeder cells and without gelatin coating, and allowed to stand. After 3 hours, the cells that did not adhere to the dish were collected and passed through a 100-micrometer mesh (BD Falcon Cell Strainer) to obtain a cell suspension from which aggregated cell clumps had been removed.
  • trypsin-EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the cell suspension obtained above was suspended in ⁇ -MEM medium (containing 20% FBS, 50 ng / ml @ M-CSF and 100 ng / ml @ GM-CSF) and cultured. After about 3 to 9 days, floating or weakly adherent cells appeared, and it was observed that the number of cells gradually increased.
  • the floating cells (iPS-MC) were collected, and the expression of CD45, a leukocyte marker molecule, and CD11b or CD33, a myeloid cell marker, was confirmed using a flow cytometer.
  • This immortalized monocytic cell line was cultured in an ⁇ -MEM medium containing 20% FBS, 50 ng / ml @ M-CSF, and 50 ng / ml @ GM-CSF. Cells were obtained and stored under liquid nitrogen using a commercially available cell preservation solution.
  • the adjusted human immortalized monocyte-like cell group was recovered, suspended in a culture solution, and passed through a mesh filter (12 ⁇ m, manufactured by Murata Manufacturing Co., Ltd.) which had been preliminarily blended with the solution.
  • the passed cell group was collected and centrifuged to make the cell size uniform.
  • FIG. 7 shows the results of measurement by a flow cytometer after filter purification as physical properties of the human immortalized monocyte-like cell population prepared by the methods of Example 1 and Example 2.
  • the human peripheral blood-derived monocyte cells (CD14-ML) prepared in Example 1 can be purified by filter purification or the like.
  • immortalized monocytic cells derived from human induced pluripotent stem (iPS) cells (iPS-ML) can be produced to a certain size by measuring the cells after filtration through a filter. Indicates that the cell rate increases.
  • iPS-ML immortalized monocytic cells derived from human induced pluripotent stem cells
  • the facility for preparing human monocytes and dendritic cells and the facility for evaluating infection be located on the same facility, transfer may be necessary.
  • the cells were transferred under the following conditions. Approximately 1 ⁇ 10 7 human immortalized monocyte cells or dendritic cells prepared as described in Examples 1 and 2 were transferred to a low-adsorption coated T-25 flask immediately before the start of transfer, and filled with medium. Was. After being sealed in a biopouch in a sealed state, it was transferred into a tack pack (manufactured by Tamai Kasei). Cell transfer was performed at around 36 ° C. using the thermostat in the same box.
  • an aneropack manufactured by Mitsubishi Gas
  • the transfer time was about 24 hours. After the transfer (after about 24 hours), the cell viability was 70% or more, and no change was observed in the state of the cells.
  • Example 5 Dengue virus infection test using human peripheral blood-derived immortalized monocytic cells (CD14-ML) and dendritic cells Immediately after arrival at the transfer destination, human peripheral blood-derived immortalized monocyte cells (CD14-ML) Alternatively, dendritic cells were detached using trypsin, transferred from a T-25 flask to a centrifuge tube, and the collected cells were used for evaluation. When not used immediately, the medium was transferred to a 100 mm dish or the like, and the medium was replaced every three days.
  • human peripheral blood-derived immortalized monocytic cells CD14-ML
  • CD14-ML human peripheral blood-derived immortalized monocyte cells
  • human peripheral blood-derived immortalized monocytic cells (CD14-ML) (1 ⁇ 10 7 cells) were placed in a 96-well plate so that the final cell number was 1 ⁇ 10 5 cells / well. Seeded.
  • the dendritic cell wells were cultured in ⁇ -MEM medium containing IL-4 (containing 20% FBS, 50 ng / ml M-CSF, 50 ng / ml GM-CSF, and 20 ng / ml IL-4).
  • Wells were cultured in an ⁇ -MEM medium containing no IL-4 (containing 20% FBS, 50 ng / ml M-CSF, and 50 ng / ml GM-CSF) at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 3 days. . The obtained cells were used for evaluation.
  • ⁇ -MEM medium containing no IL-4 (containing 20% FBS, 50 ng / ml M-CSF, and 50 ng / ml GM-CSF) at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 3 days.
  • the obtained cells were used for evaluation.
  • dengue virus of each serotype prepared was combined with human peripheral blood-derived immortalized monocytic cells (CD14-ML) or dendritic cells (1 ⁇ 10 5 cells / well) in a 96-well plate.
  • the cells were mixed, infected, and cultured in an evaluation medium at 37 ° C. and 5% CO 2 . After 72 hours, the culture supernatant was collected, and the infectious titer of the progeny virus contained in the supernatant was measured based on the plaque assay.
  • the virus dilution was inoculated into Vero cells, adsorbed at 37 ° C. for 1 hour, and cultured in MEM supplemented with 1% methylcellulose at 37 ° C.
  • the cells after the culture were fixed with acetone / methanol for immunostaining.
  • the immunostaining was performed by a known method using a mouse-derived flavivirus cross-linked monoclonal antibody (D1-4G2-4-15 (ATCC (registered trademark) HB-112)) as a primary antibody (at room temperature for 30 minutes).
  • the next antibody was reacted with a biotin-labeled anti-mouse IgG antibody (at room temperature for 30 minutes), an avidin / biotin complex (at room temperature for 30 minutes), and a VIP substrate (at room temperature for 10 minutes).
  • the number of infected cells that became immunopositive was counted under a microscope to calculate the virus titer.
  • immortalized monocyte cells derived from infected human peripheral blood after culturing for 72 hours were fixed with acetonemethanol and subjected to immunostaining.
  • the immunostaining was performed by a known method using a mouse-derived flavivirus cross-linked monoclonal antibody (D1-4G2-4-15 (ATCC (registered trademark) HB-112)) as a primary antibody (at room temperature for 30 minutes).
  • the next antibody was reacted with a biotin-labeled anti-mouse IgG antibody (at room temperature for 30 minutes), an avidin / biotin complex (at room temperature for 30 minutes), and a VIP substrate (at room temperature for 10 minutes).
  • the immunopositive infected cells were observed and evaluated under a microscope.
  • FIG. 4 shows the cells in each well stained. When virus infection is observed, it is stained intensely, and human dendritic cells (rows 1 to 6: white arrow) stain well even with a lower concentration of virus compared to the positive control (rows 7 to 12: black arrow).
  • red arrow human dendritic cells
  • FIG. 5 A
  • monocyte-like cells A1 were able to confirm infection much more strongly than the control (A7) sensitized with the same concentration of virus. Proved to be more suitable for dengue virus type 1, monocyte-like cells (A1) were able to confirm infection much more strongly than the control (A7) sensitized with the same concentration of virus. Proved to be more suitable for
  • Fig. 6 shows the amount of virus released by dengue virus sensitization. Since the amount of virus released from dendritic cells was higher than that of K562 cells as a positive control, it became clear that the method was suitable for virus propagation and acquisition of mutants using cells closer to humans.
  • Example 6 Dengue virus infection test 2 using human monocyte-like and dendritic-like cells Immortalized monocytes derived from human peripheral blood (CD14-ML) and human induced pluripotent stem cells (iPS-ML) are immediately detached using trypsin or the like upon arrival at the transfer destination. The medium was transferred from the T-25 flask to a centrifuge tube, collected, transferred to a 100 mm dish or the like, and the medium was changed every three days.
  • CD14-ML human peripheral blood
  • iPS-ML human induced pluripotent stem cells
  • human monocyte-like cells (1 ⁇ 10 7 ) were seeded on a 96-well plate so that the final cell number was 1 ⁇ 10 5 cells / well.
  • ⁇ -MEM medium (20% FBS, 50 ng / ml M-CSF, 50 ng / ml GM-CSF) when evaluating as monocyte-like cells, and IL-4 when evaluating with dendritic cells
  • the cells were cultured in an ⁇ -MEM medium (containing 20% FBS, 50 ng / ml M-CSF, 50 ng / ml GM-CSF, and 20 ng / ml IL-4) for 3 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. Three days later, the obtained cells were used for evaluation.
  • dengue virus of each serotype adjusted for MOI concentration was mixed with human dendritic cells (1 ⁇ 10 5 cells / well) in a 96-well plate to infect, and then infected at 37 ° C., 5
  • the cells were cultured in the evaluation medium under the condition of% CO 2 . After 72 hours, the culture supernatant was collected, and the infectious titer of the progeny virus contained in the supernatant was measured based on the plaque assay.
  • the next antibody was reacted with a biotin-labeled anti-mouse IgG antibody (at room temperature for 30 minutes), an avidin / biotin complex (at room temperature for 30 minutes), and a VIP substrate (at room temperature for 10 minutes).
  • Plaque assay results of dendritic cells derived from human peripheral blood (CD14-DC) and dendritic cells derived from human induced pluripotent stem (iPS) cells (iPS-DC) using dengue virus type 4 (DENV-4) Is shown in FIG.
  • dengue virus type 4
  • the progeny virus released into the supernatant at the time of recovery is included. Therefore, the cells are stained after secondary culture on Vero cells.
  • dendritic cells derived from human peripheral blood CD14-DC
  • dendritic cells derived from human induced pluripotent stem (iPS) cells IPS-DC
  • concentration indicated by white and black arrows; 100 times or more the sensitivity of existing cells, or 10,000 times or more depending on the type of virus proliferates and can be detected.
  • Evaluation under such experimental conditions provides a highly sensitive virus test and isolation, and provides an environment that allows cultivation of other flaviviruses and other viruses that have been difficult to culture in the past due to low virus concentrations. It was clarified that drug evaluation could be performed.
  • FIG. 11 shows the results of a plaque assay of dendritic cells (CD14-DC) derived from human peripheral blood using dengue virus type 1 (DENV-1). Plaque formation reflects the state of the virus. In this test, small spots (white arrows) and large spots (black arrows) were observed. This result suggests a change in the state of the virus, suggesting that the virus mutation may have occurred in only one infection experiment. To provide a new R & D method (construction, development, or production of vaccine strains) for issues that previously required long periods of time to construct and develop vaccine candidate strains because of the difficulty of causing mutations. Became clear.
  • R & D method construction, development, or production of vaccine strains

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Abstract

本発明は，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物研究における安定性，再現性，経済性，及び操作容易性に関する課題に鑑みてなされたものであり，増殖能を有する単球を利用した単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の維持培養する方法を提供することを目的とする。本発明は，ＣＤ１４陽性細胞に遺伝子を導入して得られた増殖可能なヒト単球細胞，及び，当該単球細胞を分化誘導することにより得られる貪食能を有する細胞（例えば，樹状細胞）にデングウイルスが効率よく感染・増殖できることを見出したことに基づく。これにより，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物感染症治療のための，化合物やワクチンなどの医薬品の評価のための新規方法を提供するものである。

Description

不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬，ワクチンなどの評価方法
　本発明は，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける培養方法または当該微生物感染症治療薬の評価方法などに関する。
　感染症研究において，標的となる病原菌が単球や樹状細胞を介して増殖する場合，既に構築された細胞株を用いた研究がおこなわれてきた。例えばデングウイルスは，長年研究されてきたヒトに感染症を引き起こすウイルスであり，経験的にヒト慢性骨髄性白血病由来のＫ５６２細胞株，アフリカミドリザルの腎臓上皮細胞由来のＶｅｒｏ細胞株，シリアンハムスター腎臓由来のＢＨＫ細胞株など細胞株を用いて研究がおこなわれてきた。しかし，これら細胞株を用いた評価は容易に行えるという利点があるものの，必ずしもヒト生体内における感染や増殖を反映しているとは言えないという問題があった。
　ヒト生体由来の単球や樹状細胞を用いることで，より生体に近いメカニズムや抗原の解析を行うことができることから，それによる新しい医薬やワクチンの開発が期待される。理論的にはヒト生体由来の白血球様細胞を用いて感染症評価を行うことは可能であり，個体より摘出した組織をもとに単離した細胞を用いた感染症評価も行われている。例えば，臍帯血・骨髄・末梢血由来の造血幹細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏにて血球細胞，更には単球及び誘導細胞へと分化できることが報告されている。また，ＥＳ・ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導を行うことにより単球及び更に分化した樹状細胞などを調製する方法も報告されている（特許文献１，非特許文献１～９）。しかし，単球や樹状細胞は生体外で継続的に増殖させることが困難であることから，摘出由来の細胞を用いる場合には細胞調製を行う度に個体からの抽出と単離が必要であり，操作が煩雑であり費用も高額となるという問題があった。また，これらの方法は，分化誘導に期間を要し，単球細胞および分化させた樹状様細胞の供給量が少なく研究に必要な量を継続的に提供し続けるのは難しいという問題があった。また，細胞が由来する個体や細胞を調製する条件が毎回異なる可能性があることから，再現性の評価が困難であるという問題があった。
　このように，ヒト生体内における感染や増殖の状態を十分反映しながら再現性良く単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を評価できる細胞はこれまで存在しなかった。
　このような実験上の制約から，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物が単球や樹状細胞を介在することは判明しているものの，ウイルス増殖に適した条件などの全容については未だ明らかにされていない。そのため個体から摘出した細胞を用いた実験においても，研究対象となる単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の研究に適した条件で行っているとは限らないという問題もあった。
　一方で，癌などの免疫療法において細胞治療を行う際に大量の抗原提示細胞を調製する必要があることから，増殖可能な単球，マクロファージ，樹状細胞などの抗原提示細胞に関する研究がおこなわれている。ｉＰＳ細胞から分化誘導したミエロイド系細胞（ｉＰＳ－ＭＣ）や末梢血由来単球に遺伝子導入を行い，自己増殖能を有するミエロイド系細胞株（ｉＰＳ－ＭＬ）及び単球細胞株（ＣＤ１４－ＭＬ）を作製したことが報告がされている（特許文献２及び特許文献３）。
　更に，デングウイルス感染モデルとして，単球由来の樹状細胞はその品質，増殖，ドナー依存性の特徴から限界があったところ，上述のｉＰＳ－ＭＬ由来の樹状細胞（ｉＰＳ－ＭＬ－ＤＣ）にデングウイルスが感染すること，ＨＬＡがマッチするＴ細胞を活性化することが示されている（非特許文献１０）。しかし，ｉＰＳ細胞を用いた場合には，ｉＰＳ細胞が残存することによる癌化やｉＰＳからミエロイド系細胞を安定的かつ高確実に分化誘導することが困難であること，誘導後の細胞集団からミエロイド系細胞のみを確実に分取する必要があることなど課題が多かった。また，ＣＤ４＋単球が抗原提示細胞としての能力に優れる（非特許文献１１）ところ，ｉＰＳ由来のミエロイド細胞（ｉＰＳ－ＭＬ）は，ＣＤ４の発現が低いことが知られていた（非特許文献１２）。
　また，感染患者からのウイルス分離は，感染確認ならびに検査・研究のため重要な作業である。ウイルス分離は感染患者の血液などを採取し，培養細胞を用いて作業を行うことにより実施されている。例えば，デングウイルスの場合，発症後５～６日以内の血清試料とヒトスジシマカ培養細胞株であるＣ６／３６細胞などを用いて行うのが一般的である（非特許文献１３）。しかし，血清試料中のウイルス濃度や試料採取から培養開始までの時間等がウイルス分離の効率に影響し，必ずしもウイルス分離が成功するものではないという問題があった。例えば，デングウイルスの場合，血清試料中のウイルス濃度が患者の回復により減少することや，採血後の生存ウイルス数が継時的に減少することが知られている。そのため，ウイルス分離の成功率は６０％程度であり，ウイルス量が少ないとされる発症後5日目以降ではさらにこの割合が低いことが知られていた（非特許文献１４）。
　他にも，ワクチンの開発においてウイルスを変異させるための培養を可能とする培養細胞が必要とされている。特に弱毒性ワクチンの開発は，異種培養細胞などを用い，継代を何度も繰り返すことで得られた弱毒化したウイルス変異体をワクチンとして利用する。しかし，ウイルス変異はごく稀にしかおきないため長時間の検討期間，すなわち培養期間が必要とされる。例えば，弱毒性ワクチンであるロタウイルスワクチン（ＲＶ１）の場合，ヒトウイルスをアフリカミドリザル腎株化細胞で３３回継代後，３回限界希釈して選択された株をさらにＶｅｒｏ細胞で７回継代することではじめて獲得できたことが報告されている（非特許文献１５）。このように，一般的に多くの培養回数を経ないと弱毒化変異株が獲得できないことが知られていた。
ＷＯ２００８／０５６７３４ ＷＯ２０１２／０４３６５１ 特開２０１７－１３１１３６
Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ　Ｐ．Ｊら，Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１５１５－１５１８． Ｌｉｎｄｍａｒｋ　Ｈら，Ｅｘｐ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ（２００４）３００：３３５－３４４． Ｚｈａｎ　Ｘら，Ｌａｎｃｅｔ（２００４）３６４：１６３－１７１． Ｓｌｕｋｖｉｎ　ＩＩら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）１７６：２９２４－２９３２． Ｏｄｅｇａａｒｄ　ＪＩら，Ｊ　Ｌｅｕｋｏｃ　Ｂ　ｉｏｌ（２００７）８１：７１１－７１９． Ｓｕ　Ｚら，Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ（２００８）１４：６２０７－６２１７． Ｔｓｅｎｇ　ＳＹら，Ｒｅｇｅｎ　Ｍｅｄ（２００９）４：５１３－５２６． Ｓｅｎｊｕ　Ｓら，Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（２００７）２５：２７２０－２７２９． Ｃｈｏｉ　ＫＤら，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ（２００９）１１９：２８１８－２８２９． Ｄａｏ　Ｈｕｙ　Ｍａｎｈｒａら，Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ．　（２０１８）ｄｏｉ：　１０．１０９９／ｊｇｖ．０．００１１１９． Ｇ．　Ｓｚａｂｏら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）；４７（２）：１１１－２０． Ｃｈｉｈｉｒｏ　Ｋｏｂａら，ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１３；　８（６）：　ｅ６７５６７． 亀岡，モダンメディア　６１巻９号２０１５［臨床検査アップデート］　２６５． Ｒｉｃｈｉａｒｄ　Ｇ．　Ｊａｒｍａｎら，Ａｍ　Ｊ　Ｔｒｏｐ　Ｍｅｄ　Ｈｙｇ．　２０１１；　８４（２）：　２１８－２２３． ロタウイルスワクチンに関するファクトシート（平成２４年９月２８日）　国立感染症研究所
　即ち，本発明は，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物研究において，より安定性，再現性，経済性，及び操作容易性を有する方法を見出すことを課題とする。また、本発明は、短期間の培養で単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の変異体を取得可能な方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは，感染症研究に適した単球および樹状細胞を提供する方法を模索すべく，種々の方法で調製・作製された単球および樹状細胞にデングウイルスを感染させる検討を行った。その結果，ヒト臍帯血由来，ＥＳ細胞由来又は骨髄細胞もしくは末梢血由来のＣＤ１４陽性細胞に遺伝子を導入して得られた増殖可能なヒト単球細胞，及び，当該単球細胞を分化誘導することにより得られる貪食能を有する細胞（例えば，樹状細胞）にデングウイルスが効率よく感染・増殖できることを見出し，本発明を完成させた。特に，これらの細胞に感染したウイルスの増殖速度は速く，より多くの子孫ウイルス及びウイルス様粒子を産生する。これにより，本発明者らは単球又は樹状細胞介在型感染性微生物感染症治療のための，化合物やワクチンなどの医薬品の評価法など，研究開発のための新規方法を提供するに至った。更に，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の増殖を可能とすることで，ワクチンの製造や変異株の構築・開発・作製に使用できることを見出すことに成功した。
　更に，本発明は，特には単球細胞を不死化して使用することにより，ｉＰＳ細胞を用いることによるこれらの課題を解決するものである。すなわち，単球細胞を不死化する方法を採用することにより，安定的に単球細胞のみの集団を容易に得ることが可能である。また，単球細胞を不死化して得られた細胞は，ＣＤ４を発現しているため，ｉＰＳ由来の樹状細胞と比較してより抗原提示能が高く，ワクチン研究に適した細胞であると考えられる。よって，本発明はＣＤ４の発現に優れる単球又は樹状細胞介在型感染性微生物感染モデルを提供するものである。
　更に，本発明は，試料内のウイルス濃度などの影響を受けることにより従来の培養細胞では困難であったウイルス分離における問題を解決するものである。本発明者らの見出したところによれば，ｉＰＳ細胞由来，ヒト臍帯血由来，ＥＳ細胞由来又は骨髄細胞もしくは末梢血由来のＣＤ１４陽性細胞を不死化して得られた増殖可能なヒト単球細胞，及び，当該単球細胞を分化誘導することにより得られる貪食能を有する細胞（例えば，樹状細胞）を利用することにより，希薄なウイルス量であっても，細胞内で十分に増殖させることが可能であった。その結果，本発明はウイルス分離の成功率を向上させる分離評価系を提供することに成功した。よって，一態様において，本発明は優れたウイルス分離用細胞を提供するものである。
　更に，本発明は，ワクチン開発において，弱毒性ウイルスであるウイルス変異株を取得するために長期間かかるという課題を解決するものである。すなわち，本発明によれば，ｉＰＳ細胞由来，ヒト臍帯血由来，ＥＳ細胞由来又は骨髄細胞もしくは末梢血由来のＣＤ１４陽性細胞を不死化して得られた増殖可能なヒト単球細胞，及び，当該単球細胞を分化誘導することにより得られる貪食能を有する細胞（例えば，樹状細胞）に低濃度のウイルスを感染させた場合であっても，長期間の培養を必要とすることなく、異なる形態のプラークを形成するウイルス変異株を獲得することが可能である。その結果，ウイルス変異体が短期間で獲得することができ，ワクチン研究に適した細胞であると考えられる。よって，本発明はウイルス・ワクチン研究のための変異株産生に優れる細胞を提供するものである。
　具体的には，本発明は以下の発明に関する。
（１）　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって，
　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること、及び
　感染した細胞を培養することを含む方法。
（２）　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって，
　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とを単球に導入すること，
　任意前記単球から樹状細胞を分化誘導すること，
　得られた単球又は樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること、及び
　感染した細胞を培養することを含む方法。
（３）　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症治療薬を同定する方法であって，
　被検薬の存在下でＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，
　前記単球又は前記樹状細胞における前記感染性微生物の感染レベルを測定すること，
　測定された前記感染性微生物の感染から，該被検薬が前記感染症治療効果を有するか否かを判定することを含む方法，
　ここで，測定された前記感染性微生物の感染レベルが，前記被検薬の非存在下で前記細胞に前記感染性微生物を感染させたコントロールの感染レベルと比較して少ない場合，当該被検薬は前記感染症治療効果を有すると判定される。
（４）　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の変異株を作製する方法であって，
　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，
　感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること，
　増殖した前記感染性微生物の中から，変異株を単離することを含む方法。
（５）　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物のワクチンを製造する方法であって，
　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，
　感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること，
　増殖した前記感染性微生物を回収することを含む方法。
（６）　更に，回収された前記感染性微生物を不活化することを含む，（６）に記載の方法。
（７）　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症患者由来血液から該感染微生物を分離する方法であって、
　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞と前記患者由来血液とを接触させること，
　感染した細胞を培養すること，
　培養細胞中の微生物を検出及び／又は同定することにより、感染微生物を特定することを含む方法。
（８）　前記単球が，ヒト多能性幹細胞又はヒト造血幹細胞を分化誘導することにより得られた細胞，又は，ヒト末梢血から単離することにより得られた細胞である，（１）～（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）　前記ヒト多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、（８）に記載の方法。
（１０）　ヒト多能性幹細胞又はヒト造血幹細胞を分化誘導することにより単球を調製すること，又は，ヒト末梢血から単離することにより単球を調製することをさらに含む，（１～（７のいずれか１項に記載の方法。
（１１）　前記ヒト多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、（１０）に記載の方法。
（１２）　前記感染性微生物がデングウイルスである，（１）～（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子が，ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ２遺伝子若しくはＬＹＬ１遺伝子である，（１）～（１２）のいずれか１項に記載の方法。
　本発明により，単球又は樹状細胞を介在する感染症を引き起こす微生物の研究・評価が可能となる。例えば，ヒト献血由来の血球材料では培養・評価が難しく研究することが難しかった疾患に対しても，本発明を使用することで培養・評価が可能になり，感染症研究・抗感染症薬・ワクチン開発を行うことが可能となる。また，本発明の方法により，血液が関与する疾患の治療薬開発において，誤差の少ない薬剤スクリーニング評価が可能となる。
作製した不死化ヒト単球細胞における表面マーカーＣＤ１１およびＣＤ１４の発現をフローサイトメーターにて分析した結果を示すプロット図である。使用抗体：ＦＩＴＣで反応する抗ＣＤ１１抗体，抗ＣＤ１４抗体。 不死化ヒト単球細胞をＩＬ４で刺激することにより誘導した樹状細胞様細胞をメイ－ギムザ染色した写真である。 デングウイルス感染実験におけるプレートデザイン図である。９６穴プレートの左半分に評価するヒト単球細胞もしくは樹状細胞を入れ，右半分にコントロール細胞であるＫ５６２細胞を播種した。ウェルの各行（１－１２）に異なる希釈倍率のウイルス液を添加した。ウェルの列（Ａ－Ｈ）毎に異なる種類のデングウイルス（ＤＥＮＶ－１：デングウイルス１型，ＤＥＮＶ－２：デングウイルス２型，ＤＥＮＶ－３：デングウイルス３型，及び，ＤＥＮＶ－４：デングウイルス４型を添加した。 図３のプレートデザインを用い，実施例１において調整したヒト樹状様細胞と陽性対象であるＫ５６２細胞とを比較した結果を示す写真である。デングウイルス感染実験後に，ウイルス感染を染色により可視化した。 図４のプレートの一部のウェルを拡大した写真である。（Ａ）単球様細胞を用いた結果の写真である（ＭＬ：単球様細胞，Ｋ５６２：Ｋ５６２細胞株）。左から順に図４のＡ１，Ｃ１，Ｅ１，Ｇ１ウェル（上段），及び，図４のＡ７，Ｃ７，Ｅ７，Ｇ７ウェル（下段）の拡大写真である。（Ｂ）樹状様細胞を用いた評価結果の写真である（ＤＣ：樹状様細胞，Ｋ５６２：Ｋ５６２細胞株）。左から順に図４のＡ５，Ｃ５，Ｅ５，Ｇ５ウェル（上段），及び，図４のＡ７，Ｃ７，Ｅ７，Ｇ７ウェル（下段）の拡大写真である。なお，Ａ１とは図４のプレートのＡ行１列目を指す。 単球様細胞（Ａ）及び樹状細胞様細胞（Ｂ）のウイルス放出量を測定した結果を示すグラフである。縦軸は，培養上清中へのウイルス放出量（ｌｏｇ１０　プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）／ｍＬ）を表す。横軸は左から順に，デングウイルス１型（ＤＥＮＶ－１）（Ｄ１），２型（ＤＥＮＶ－２）（Ｄ２），３型（ＤＥＮＶ－３）（Ｄ３），４型（ＤＥＮＶ－４）（Ｄ４）を示す。 作成した不死化ヒト単球細胞（末梢血由来単球細胞：ＣＤ１４－ＭＬ，　ｉＰＳ細胞由来単球細胞：ｉＰＳ－ＭＬ）における物理的精製及び膜強度を測定するために，フィルター後の細胞をフローサイトメーターにて分析した結果を表すプロット図である。フィルターによる精製を行なっていない群を未フィルター群（Ｎｏｎ　ｆｉｌｔｅｒ）および格子穴１２ｕｍのメッシュフィルターにて精製した群（１２ｕｍ）についてフローサイトメーターにて測定した。縦軸は側方散乱光の面積（ＳＳＣ－Ａ），横軸は前方散乱光（ＦＳＣ－Ｈ）の検出結果を示す。精製度合いを可視化するために，便宜的に分割し，エリア１，２，それ以外の存在比について示す。評価における再現性確保のためエリア２の細胞数存在比を一定の範囲にすることで管理を志向する。 図３のデングウイルス感染実験より，ウイルス希釈倍率を大きくしウイルス低濃度下での感染評価を行ったプレートデザイン図である。デングウイルス４型（ＤＥＮＶ－４）を用いて行なった実験を元に記載する。各ＷｅｌｌにＡからＤに記載の細胞を１ｘ１０＾５個入れ，感染多重度（ＭＯＩ）に従いウイルスを添加させる。例えば，Ａ１（矢印ストライプ）では1個の末梢血由来不死化単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）に対し０．３９（粒子）の割合でデングウイルス４型（ＤＥＮＶ－４）を感染させている。 プラークデングウイルス感染実験について，ウイルス希釈倍率をより大きくしたプレートデザイン図である。図８において感染評価後，上清中に含まれるウイルス量を可視化するために，Ｖｅｒｏ細胞に上清を播種し培養後，免疫染色させる。数字は図８に該当する。例えば，図８のＡ１の上清を１０倍希釈して播種したのが左上のＷｅｌｌである。 プラークデングウイルス感染実験結果について示した図である。末梢血由来樹状様細胞（ＣＤ１４－ＤＣ：白矢印）及びｉＰＳ細胞由来樹状様細胞（ｉＰＳ－ＤＣ：黒矢印）いずれも，ウイルス極めて低い濃度での存在下においてもウイルスを増殖させ放出していることを示す。 プラークデングウイルス感染実験結果について示した図である。デングウイルス１型を使用し，ウイルス希釈を行いながら感染した図である。プラークが薄い斑点状（白矢印）のものが大きな斑点（黒矢印）にある濃度で変化しており，両者間ではウイルスが変異している可能性を示す。
　一態様において，本発明は，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって，ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させることを含む方法に関する。
　別の態様において，本発明は，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって，
　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とを単球に導入すること，
　任意前記単球から樹状細胞を分化誘導すること，及び，
　得られた単球又は樹状細胞に前記感染性微生物を感染させることを含む方法に関する。
＜単球および樹状細胞介在型感染性微生物＞
　本明細書において，「単球又は樹状細胞介在型感染性微生物」とは，その生存・増殖過程において単球又は樹状細胞への感染が含まれるウイルス，菌，および原虫などを意味する。このような単球又は樹状細胞介在型感染性微生物としては，デング熱を引き起こすフラビウイルス科のウイルス，例えば，デングウイルス，日本脳炎ウイルス，西ナイルウィルス，黄熱ウイルス，マレー渓谷ウイルス，セントルイス脳炎ウイルス，ジカウィルス，ダニ媒介性脳炎ウイルスなどが含まれる。
＜単球の調製方法＞
　本発明において，原料となる単球は，末梢血から採取する方法，多能性幹細胞から分化誘導させる方法，繊維芽細胞などの他の体細胞から分化誘導させる方法などにより得ることができる。単球を末梢血から採取する場合，ヒトの末梢血中のＣＤ１４分子を発現する細胞を分離・調製する方法は公知である。例えば，ヒト末梢血を等量の生理的食塩水，リン酸緩衝生理的食塩水，あるいは，ハンクス緩衝溶液などで穏やかに希釈する。希釈した血液を，遠心管中のフィコール（登録商標）（ＧＥ　ヘルスケア社）上に静かに積層し，１５～３０℃，５００～１０００×ｇで２０分間遠心分離する。黄色がかった血漿と透明のフィコールの中間の白い帯状の層をリンパ球・単球から成る末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分として回収する。回収された末梢血単核細胞画分は必要に応じて更に洗浄して用いてもよい。回収されたＰＢＭＣ画分から更にＣＤ１４分子を発現する細胞を回収することにより，単球を得ることができる。例えば，抗ＣＤ１４抗体が結合している固相とＰＢＭＣを接触させて当該固相に単球を結合させ，非結合の細胞を洗浄して除去することにより，分離回収することができる。例えば，このような固相として磁気ビーズを用いる方法などが知られている（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ１４（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）など）。また，末梢血からＰＢＭＣを分離することなく，末梢血を直接抗ＣＤ１４抗体が結合している固相と接触させることにより単球を得ることもできる。
　単球を多能性細胞から分化させて得る場合，多能性細胞からから単球を誘導する方法は公知である。本明細書において，「多能性幹細胞」とは，多能性及び自己複製能を有する細胞を意味する。本明細書において，「多能性」とは，多分化能と同義であり，分化により複数の系統の細胞に分化可能な細胞の状態を意味する。本明細書における，多能性は，生体を構成する全ての種類の細胞に分化可能な状態（分化全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）），胚体外組織を除く全ての種類の細胞に分化可能な状態（分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）），一部の細胞系列に属する細胞に分化可能な状態（分化多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）），及び１種類の細胞に分化可能な状態（分化単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ））を含む。よって，本明細書における「多能性幹細胞」は，幹細胞，胚性幹（ＥＳ）細胞，核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（「ｎｔＥＳ細胞」），生殖幹細胞（「ＧＳ細胞」），胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」），および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞，及び造血幹細胞を含む。ある細胞が多能性幹細胞であるかどうかは，たとえば，被検細胞が体外培養系において胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙ）を形成する場合，又は，分化誘導条件下で培養（分化処理）した後に所望の細胞に分化する場合，当該細胞は多能性幹細胞であると判定することができる。多能性幹細胞の取得方法は公知であり，例えば，ｉＰＳ細胞は体細胞に３種類以上の初期化遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ－Ｍｙｃ，Ｌ－Ｍｙｃ，Ｎａｎｏｇ，Ｌｉｎ２８，Ｅｓｒｒｂ，Ｇｌｉｓ１，Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，ｓｈｐ５３，ＵＴＸ及びＨ１ｆｏｏなど）を導入することにより得られることが報告されている。
　多能性幹細胞から単球への分化誘導は，例えば，マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）とインターロイキン３（ＩＬ－３）（Ｆｅｒｎａｄｎｄｏ　Ｏ．　Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（２００８）；３６：１１６７－１１７５参照）。），あるいは，ＩＦＮ－γ又はＰＭＡ（Ａｎｎａｂｅｌｌｅ　Ｇｒｏｌｌｅａｕら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９９９；　１６２：３４９１－３４９７）を多能性幹細胞に接触させることにより行うことができる。分化誘導された単球は必要に応じて上述の方法によりＣＤ１４を発現する細胞のみ回収して精製してもよい。
　繊維芽細胞などの他の体細胞から単球を分化誘導させる方法としては，Ｔａｋａｈｉｒｏ　Ｓｕｚｕｋｉら，“Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｙｔｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｎｅｔｗｏｒｋ　Ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｓ　Ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．”ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ（２０１２）ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３３４７４に記載の方法が挙げられる。
　得られた単球は，ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とを導入することにより，単球の機能を維持しながら増殖能を付加することができる。好ましくは，ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，及びＨＩＦ１Ａ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子との組み合わせか，あるいは，ＢＭＩ１遺伝子とＢＣＬ２遺伝子若しくはＬＹＬ１遺伝子とｃＭＹＣ遺伝子との組み合わせである。単球へのこれらの遺伝子の導入は，ＷＯ２０１２／０４３６５１及び特開２０１７－１３１１３６号の記載を参酌して行うことができる。例えば，これらの遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを単球に感染させることにより，導入することができる。
＜樹状細胞の調製方法＞
　単球からの樹状細胞の誘導は，既報（Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ　Ｃｈａｐｕｉｓら，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）２７（２）：４３１－４１．；Ｍａｒｃ　Ｄａｕｅｒら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３）１７０（８）：４０６９－４０７６．；Ｆｉｇｄｏｒ　ＣＧら，Ｎａｔ　Ｍｅｄ．（２００４）１０（５）：４７５－８０；Ｈｅｌｍｕｔ　Ｊｏｎｕｌｅｉｔら，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）２７（１２）：３１３５－４２）に従い，例えば，２００ＩＵ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－４の存在下で単球を培養することにより行うことができる。
＜単球および樹状細胞介在型感染性微生物の感染及び培養＞
　単球又は樹状細胞への単球および樹状細胞介在型感染性微生物の感染は，単球および樹状細胞介在型感染性微生物含有溶液と細胞とを接触することにより行うことができる。感染を行う際及び／又は感染後の培養に使用する培地としては，例えばＩＭＤＭ溶液，ＲＰＭＩ溶液，α－ＭＥＭ溶液，ＭＥＭ培地，ＤＭＥＭ溶液が挙げられる。また，添加物として，ヒトまたはウシ血漿タンパク質画分，ウシ胎児血清やヒト血清，グルコース，Ｄ－マンニトールなど糖類，アミノ酸，アデニンなど核酸塩基，リン酸水素ナトリウム，α－トコフェロール，リノール酸，コレステロール，亜セレン酸ナトリウム，ヒトホロトランスフェリン，ヒトインスリン，エタノールアミン，２－メルカプトエタノール，ＥＰＯ，ＴＰＯ，炭酸水素ナトリウム，メチルセルロース等が含まれていてもよい。また，必要に応じて，ゲンタマイシン，アンピシリン，ペニシリン，ストレプロマイシンなどの抗生剤；無機塩類；ＨＥＰＥＳ，リン酸緩衝剤，酢酸緩衝剤などの緩衝剤を加えてもよい。具体的な例としては，非必須アミノ酸を添加したα－ＭＥＭ（１０％　ウシ胎児血清）培地，あるいは，ヒポキサンチン，ＨＥＰＥＳ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）に，１０％ウシ胎児血清，炭酸水素ナトリウム，１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した培地を使用して行うことができる。培養時間は、細胞、微生物及び培地の種類などに応じて適宜設定することができるが、例えば、２４～９６時間、３６～８４時間、７２時間とすることができる。変異体取得のために感染細胞を培養する場合、培養回数は少ない回数でよく、例えば、１～５回、１～４回、１～３回、１～２回又は１回であってもよい。その他の培養条件は、一般的なヒト細胞の培養条件に準じて決定することができ、例えば、３７℃，５％ＣＯ２条件下とすることができる。
＜治療薬スクリーニング方法＞
　別の態様において，本発明は，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症治療薬を同定する方法であって，
　被検薬の存在下でＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，
　前記単球又は前記樹状細胞における前記感染性微生物の感染レベルを測定すること，
　測定された前記感染性微生物の感染から，該被検薬が前記感染症治療効果を有するか否かを判定することを含む方法に関する。
　ここで，測定された前記感染性微生物の感染レベルが，前記被検薬の非存在下で前記細胞に前記感染性微生物を感染させたコントロールの感染レベルと比較して少ない場合，当該被検薬は前記感染症治療効果を有すると判定される。
　前記感染性微生物の感染レベルの測定は，培養終了後の上清中に含まれる前記微生物の感染力価をＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ，免疫染色，プラーク形成法，又はＰＣＲ法を用いて測定することにより行うことができる。あるいは，培養終了後の感染細胞を固定し，免疫染色又はＣｅｌｌ　ＥＬＩＳＡを行うことにより測定することができる。
　単球又は樹状細胞への単球および樹状細胞介在型感染性微生物の感染レベルをＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ又は免疫染色により行う場合，本発明のスクリーニング方法は，感染後の単球又は樹状細胞を固定化すること，及び当該単球および樹状細胞介在型感染性微生物に特異的な抗体を固定化された細胞に接触させることを含んでいてもよい。例えば，本明細書において，Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法は，当該微生物に特異的に結合する抗体（１次抗体）を固定化された細胞に接触させること，非結合の抗体を（洗浄）除去すること，該１次抗体と結合可能な標識化抗体（２次抗体）を１次抗体と接触後の固定化された細胞に接触させること，非結合の抗体を（洗浄）除去すること，固定化された細胞に結合した２次抗体の標識レベル（強度・エリア・数等）を測定すること，測定された標識レベルから，細胞に感染した微生物の感染レベルを算出することを含んでいてもよい。あるいは，本明細書において，免疫染色法は，当該微生物に特異的に結合可能な標識化抗体を固定化された細胞に接触させること，非結合の抗体を（洗浄）除去すること，固定化された細胞に結合した前記抗体の標識レベル（強度・エリア・数等）を測定すること，測定された標識レベルから，細胞に感染した微生物の感染レベルを算出することを含んでいてもよい。標識化抗体に用いられる標識としては，放射能標識，酵素標識，蛍光標識，生物発光標識，化学発光標識，金属，近赤外光標識等の検出可能な標識を用いることができる。
　単球又は樹状細胞への単球および樹状細胞介在型感染性微生物の感染レベルをプラーク形成法により行う場合，感染後の単球又は樹状細胞の培養上清又は細胞破砕物から回収した微生物含有液を当該微生物が感染することが知られている細胞株（例えば，Ｋ５６２細胞株，Ｖｅｒｏ細胞株，又はＢＨＫ細胞など）と混合し，混合した細胞／微生物液を培地中に添加し，１２時間～１０日間培養すること，培養後の感染細胞を固定化すること，及び当該単球および樹状細胞介在型感染性微生物に特異的な抗体を固定化された細胞に接触させることを含んでいてもよい。微生物に特異的な抗体の固定化された細胞への接触は，具体的には，上述のＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法又は免疫染色法により行うことができる。
　単球又は樹状細胞への単球および樹状細胞介在型感染性微生物の感染レベルＰＣＲ法により行う場合，例えば，感染後の単球又は樹状細胞の培養上清又は細胞破砕物から回収した微生物含有液をサンプルとしてリアルタイムＰＣＲ法を実施することにより行うことができる。
　「感染レベル」は，感染微生物数を反映する数値であれば特に制限されるものではなく，例えば，ＰＦＵ，ＰＦＵ／ｍＬ，感染エリアの面積，微生物量（個），又は微生物濃度（個／ｍＬ）などを用いることができる。「前記被検薬の非存在下で前記細胞に前記感染性微生物を感染させたコントロールの感染レベル」は，被検薬と同時に，コントロール試験として，被検薬非存在下で，ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，及び，前記単球又は前記樹状細胞における前記感染性微生物の感染レベルを測定することにより得てもよい。あるいは，予め又は別途行ったコントロール試験からコントロール感染レベルを得てもよい。好ましくは，比較される２つのレベルは，同じ条件で行われた試験により得られたレベルである。被検薬の存在下で測定された感染レベルが，前記被検薬の非存在下で測定されたコントロールの感染レベルと比較して少ない場合，当該被検薬は前記感染症治療効果を有すると判定される。
＜変異株作製方法＞
　別の態様において，本発明は，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の変異株を作製する方法であって，
　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，
　感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること，
　増殖した前記感染性微生物の中から，変異株を単離することを含む方法に関する。
　微生物は増殖することにより，一定の確率で変異が導入されることが知られている。本発明によりｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を生体内に近い環境下で効率よく増殖させることが可能となったことから，生体内で起こり得る変異を疑似的にｉｎ　ｖｉｔｒｏで導入することができる。培養は，変異株が生じるまで任意の期間行うことができ，培養期間中は，必要に応じて新しい細胞に感染させ，及び／又は培地を交換してもよい。変異株の単離は，感染した微生物の単離とその配列決定により行うことができる。すなわち，任意の期間培養した後の微生物含有液を適宜希釈して当該微生物が感染することが知られている細胞株（例えば，Ｖｅｒｏ細胞株やＢＨＫ細胞など）に感染させ，シングルプラークを形成させることにより，微生物を単離することができる。シングルプラークの形成は，上述のプラーク形成法と同様に行うことができる。単離された微生物の遺伝子を解析し，感染させたときのオリジナルの微生物の遺伝子配列と比較し，オリジナルの微生物の遺伝子配列と単離された微生物の遺伝子配列が異なる場合には，該単離された微生物が変異株であると同定することができる。遺伝子配列の解析は市販のＤＮＡシーケンサーや次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いて行うことができる。
　変異株としては，特に限定されるものではないが，例えば，病原性が弱く生ワクチンとして利用可能な変異株や，薬剤耐性変異株が挙げられる。
＜ワクチン製造方法＞
　別の態様において，本発明は，単球又は樹状細胞介在型感染性微生物のワクチンを製造する方法であって，
　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，
　感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること，
　増殖した前記感染性微生物を回収することを含む方法に関する。
　増殖した前記感染性微生物は，培養上清から回収することもできるし，細胞破砕後の破砕液から回収することもできる。回収された微生物は必要に応じて適宜精製して用いる。精製方法としては，密度勾配遠心分離，限外ろ過，アフィニティクロマトグラフィなどを用いることができる。微生物が既に病原性が減弱化された株である場合，得られた微生物をそのまま生ワクチンとして使用することができる。あるいは，前記微生物は不活化ワクチン（トキソイドを含む）とすることができる。不活化ワクチンとして利用する場合，本発明の方法は，更に，回収された前記感染性微生物を分解すること，及び必要に応じて分解物の中から抗原性部分を回収すること，あるいは，前記感染性微生物中の毒素を抽出して不活化することを含んでいてもよい。
　更に，本発明は，前記方法により製造されたワクチンを包含する。更に，本発明は，当該ワクチンを単球又は樹状細胞介在型感染性微生物に感染する可能性がある対象に投与することを含む，前記微生物感染の予防方法，並びに，当該ワクチンを単球又は樹状細胞介在型感染性微生物に感染した対象に投与することを含む，前記微生物感染症の治療方法をも包含する。ワクチン製剤の製造方法及び投与方法は，当技術分野周知の方法を用いて適宜行うことができる。
＜感染微生物単離方法＞
　別の態様において，本発明は、単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症患者由来血液から該感染微生物を分離する方法であって、
　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞と前記患者由来血液とを接触させること，
　感染した細胞を培養すること，
　培養細胞中の微生物を検出及び／又は同定することにより、感染微生物を特定することを含む方法に関する。
　感染及び培養は、上述の方法に準じて行うことができる。培養細胞中の微生物を検出及び／又は同定は、目的の微生物に応じて、本技術分野において広く知られた方法により行うことができ、例えば、ＰＣＲを利用した方法や抗体を利用した方法で行うことができる。
　本明細書全体にわたって、単球又は樹状細胞は哺乳動物の単球又は樹状細胞であり、好ましくは、ヒト単球又はヒト樹状細胞である。
　以下，実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが，本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお，本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また，本実施例において用いたデングウイルス，感染試験用培地およびデングウイルスは以下の通りである。
（デングウイルス）
　４つの血清型のデングウイルスを感染評価に用いた。用いた株は，望月株（デング１型ウイルス），ＮＧＣ株（デング２型ウイルス），Ｈ８７株（デング３型ウイルス），Ｈ２４１株（デング４型ウイルス）であり，いずれもプロトタイプ株である。公知の方法に基づき，各ウイルスは感染Ｖｅｒｏ細胞の培養液中に放出された上清を用いた。
（感染試験用培地）
　評価培地としては，ヒポキサンチン，ＨＥＰＥＳ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）に，炭酸水素ナトリウム（最終濃度０．２２５％），１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した培地を使用した。
（実施例１）ヒト末梢血由来不死化単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）の作製及び樹状細胞の作製
（ヒト末梢血由来不死化単球細胞の作製）
　ヒト末梢血由来ヒト不死化単球細胞は，既報（ＷＯ２０１２／０４３６５１及び特開２０１７－１３１１３６）を参考に作製した。詳しくは，ヒト末梢血よりＣＤ１４陽性画分を取り出し，マウス不死化造血幹細胞として報告されている遺伝子（Ｍｙｃ，Ｍｙｂ，Ｈｏｂ８，ＴＬＸ１，Ｅ２Ａ－ｐｂｘ１，ＭＬＬ，Ｌｊｘ２，ＲＡＲＡ，Ｈｏｘａ９，Ｎｏｔｃｈ１，ｖ－ｒａｆ／ｖ－ｍｙｃ，ＭＹＳＴ３－ＮＣＯＡ２，Ｅｖｉ１，ＨＯＸＢ６，ＨＯＸＢ４，β－ｃａｔｅｎｉｎ，Ｉｄ１）もしくは，ヒト不死化単球細胞報告にある遺伝子を導入し作製した。不死化単球細胞株は，２０％ＦＢＳ，５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ，及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦを含有するα－ＭＥＭ培地中で培養し，培養開始から４～５週間後に，増殖性細胞として獲得し，市販の細胞保存液を用い液体窒素下で保存した。
（調製した細胞の確認）
　調製した細胞が単球様細胞であることを確認するために，濃縮による色の評価，表面マーカーの測定，および，ギムザ染色などによる形態観察などを感染評価前に行った。濃縮による色の評価は，遠沈管で細胞を回収した際の目視における細胞の色で測定した。表面マーカー測定は，ＣＤ１１抗体，ＣＤ１４抗体（いずれもＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いて，Ｓｙｓｍｅｘ社のフローサイトメーターＣｙＦｌｏｗｓｐａｃｅを使用して行った。また染色については，市販の染色液（Ｓｉｇｍａ社）を用いて，公知の染色法に基づきギムザ染色もしくはメイギムザ染色をし，高倍顕微鏡（４００～１０００倍）にて測定した。
（不死化単球細胞からの樹状細胞の調製）
　保存した不死化単球細胞株を，α－ＭＥＭ培地（２０％ＦＢＳ，５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ，及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ含有）中，３７℃，５％ＣＯ２インキュベータ内で培養し，３日に一度培地交換を行うことで維持し調製した。樹状細胞は，不死化単球細胞を，５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ，５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ，及び２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－４の存在下で３日間培養して樹状細胞へと分化させることにより調製し，細胞評価に使用した。
　図１に実施例１の方法により調製したヒト単球様細胞の性質を確認した結果を示す。この結果は，得られたヒト単球様細胞が単球系細胞に特異的な表面マーカー（ＣＤ１１およびＣＤ１４）を発現する細胞であることを示す。種々のＣＤ１４の発現量が混在していることから，古典的単球のみならず，中間・非古典的単球系細胞も含まれている事が示唆された。
　図２に実施例１のヒト単球様細胞群のギムザ染色図を示す。ギムザ染色図により，細胞膜の形状に突起部分が認められ，一部物理的刺激などにより樹状様細胞形質転化しつつある細胞が含まれることを示唆する。
（実施例２）ヒト人工多能性幹細胞由来不死化単球細胞（ｉＰＳ－ＭＬ）の作製
　ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来ヒト不死化単球細胞は，既報（ＷＯ２０１２／０４３６５１及び特開２０１７－１３１１３６）を参考に作製した。詳しくは，未分化なｉＰＳ細胞を，ラミニン５１１などマトリゲルをあらかじめ基底膜としてコートした上に播種し，α－ＭＥＭ培地（２０％ＦＢＳ含有）を用いて分化誘導培養を開始した。以降，３日に１度，α－ＭＥＭ培地（２０％ＦＢＳ含有）を交換しつつ培養を継続した。分化誘導開始から１８日後，トリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）－コラゲナーゼ液を使用して細胞を処置（３７℃，６０分）して解離させて回収し，ピペッティング操作により細胞浮遊液を作製した。続いて，直径１０ｃｍのディッシュ１枚に由来する細胞を１０ｍｌのＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ含有）に懸濁し，フィーダー細胞なし，ゼラチンコートなしの直径１０ｃｍのディッシュ２枚に播種し静置した。３時間後，ディッシュに付着しなかった細胞を回収し，１００マイクロメートルのメッシュ（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製　セルストレイナー）を通過させることにより，凝集細胞塊を除いた細胞浮遊液を得た。
　前述で得た細胞浮遊液を，α－ＭＥＭ培地（２０％ＦＢＳ，５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ，及び１００ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ含有）に浮遊させ培養を行った。その後，３～９日程度経過すると，浮遊性あるいは弱付着性の細胞が出現し，徐々に細胞数が増加していくのが観察された。この浮遊細胞（ｉＰＳ－ＭＣ）を回収し，フローサイトメーターを用い白血球マーカー分子であるＣＤ４５，および，ミエロイド系細胞マーカーであるＣＤ１１ｂあるいはＣＤ３３の発現を確認した。
　前述で得た浮遊細胞（ｉＰＳ－ＭＣ）にマウス不死化造血幹細胞として報告されている遺伝子（Ｍｙｃ，Ｍｙｂ，Ｈｏｂ８，ＴＬＸ１，Ｅ２Ａ－ｐｂｘ１，ＭＬＬ，Ｌｊｘ２，ＲＡＲＡ，Ｈｏｘａ９，Ｎｏｔｃｈ１，ｖ－ｒａｆ／ｖ－ｍｙｃ，ＭＹＳＴ３－ＮＣＯＡ２，Ｅｖｉ１，ＨＯＸＢ６，ＨＯＸＢ４，β－ｃａｔｅｎｉｎ，Ｉｄ１）もしくは，ヒト不死化単球細胞報告にある遺伝子を導入しヒト人工多能性幹細胞由来不死化単球細胞を作製した。この不死化単球細胞株は，２０％ＦＢＳ，５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ，及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦを含有するα－ＭＥＭ培地中で培養し，培養開始から４～５週間後に，増殖性細胞として獲得し，市販の細胞保存液を用い液体窒素下で保存した。
（実施例３）調製したヒト不死化単球様細胞のフィルター精製
　調整したヒト末梢血由来不死化単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）とヒト人工多能性幹細胞由来不死化単球細胞（ｉＰＳ－ＭＬ）に対し，製品供給を行うにあたり両細胞における物理的性質を評価した。すなわち，製品供給時は，感染症研究に一度に１０００万細胞個から１億細胞個程度評価に利用するため大量での細胞培養が必要となる。評価再現性を担保するため，ロットならびにバッチ間の誤差を最小限に抑えることが望まれる。このような量の制御は，物理的なフィルター精製の方が，フローサイトメーター等より，コスト・作業時間面で優位であると想定した。そこで，調整したヒト不死化単球様細胞群を回収したのち，培養液で懸濁させ，あらかじめ液でなじませておいたメッシュフィルター（１２μｍ，株式会社村田製作所製）を通過させた。通過した細胞群を回収し，遠心分離させることで，一定の細胞サイズに揃えた。
　図７に実施例１及び実施例２の方法で調整したヒト不死化単球様細胞群の物理的性質としてフィルター精製後のフローサイトメーターでの測定結果を示す。実施例１で作成したヒト末梢血由来の単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）は，フィルター精製等により精製可能であることを示唆する。一方，ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来不死化単球細胞（ｉＰＳ－ＭＬ）は，フィルター濾過後の細胞を測定すると一定のサイズに生成が可能であるが，細胞の裁断などにより死細胞率が増加することを示す。これによりヒト末梢血由来の不死化単球様細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）の方がヒト多能性幹細胞由来不死化単球様細胞（ｉＰＳ－ＭＬ）より，細胞膜もしくはストレスに強いことを示唆する。
（実施例４）調製したヒト単球様細胞の移送
　ヒト単球および樹状様細胞群の調製施設と感染評価施設が同一施設にあるのが望ましいが，移送が必要な場合もある。調製した細胞群を感染評価施設へ移送する場合，下記条件で移送した。実施例１および実施例２の記載に従い調製したヒト不死化単球細胞もしくは樹状細胞の各１×１０７個程度を低吸着コートしたＴ－２５フラスコに移送開始直前に移し替え，培地で満たした。容器を密閉した状態でバイオパウチに内包した後，タックパック（玉井化成製）に入れ移送した。細胞移送は，同ボックスの恒温剤により３６℃前後で行った。また，密閉せずフィルターキャップを使用する場合には，バイオパウチにアネロパック（三菱ガス株式会社製）を同封しＯ２並びにＣＯ２濃度を制御しながら輸送した。移送時間は２４時間程度であった。移送後（約２４時間後）細胞生存率は７０％以上であり，細胞の状態に変化は認められなかった。
（実施例５）ヒト末梢血由来不死化単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）および樹状細胞を用いたデングウイルス感染試験
　移送先到着後，速やかにヒト末梢血由来不死化単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）又は樹状様細胞をトリプシンを用いて剥離し，Ｔ－２５フラスコから遠沈管に移し替え，回収した細胞を評価に使用した。即時使用しない場合においては，１００ｍｍディッシュなどに移し替え，３日おきに培地を交換した。
　図３に示したプレートデザインに従い，ヒト末梢血由来不死化単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）（１×１０７個）を終細胞数が１×１０５個／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した。樹状細胞のウェルは，ＩＬ－４を含有するα－ＭＥＭ培地（２０％　ＦＢＳ，５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ，５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ，及び２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－４含有）中，単球細胞のウェルはＩＬ－４を含有しないα－ＭＥＭ培地（２０％ＦＢＳ，５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ，及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ含有）中，３７℃，５％ＣＯ２インキュベータ内で３日間培養した。得られた細胞を評価に使用した。
　図３に示したプレートデザインに従い，調整した各血清型のデングウイルスを９６ウェルプレート中のヒト末梢血由来不死化単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）又は樹状細胞（１×１０５個／ウェル）と混合して感染させ，３７℃，５％ＣＯ２条件下，評価培地中で培養した。７２時間後に培養上清を回収し，上清中に含まれる子孫ウイルスの感染力価をプラークアッセイ法に基づき測定した。具体的には，ウイルス希釈液をＶｅｒｏ細胞に接種し，３７℃で１時間吸着後，１％メチルセルロース添加ＭＥＭ中，３７℃で３日間培養した。培養後の細胞をアセトンメタノールで固定して免疫染色を行った。免疫染色は公知の方法に基づき，マウス由来のフラビウイルス交差モノクローナル抗体（Ｄ１－４Ｇ２－４－１５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－１１２））を１次抗体（室温３０分間）とし，順次，２次抗体にビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（室温３０分間），アビジン・ビオチン複合体（室温３０分間），ＶＩＰ基質（室温１０分間）を反応させた。免疫陽性となる感染細胞数を顕微鏡下で計測してウイルス力価を算出した。
　また，７２時間培養後の感染ヒト末梢血由来不死化単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）細胞をアセトンメタノールで固定して免疫染色を行った。免疫染色は公知の方法に基づき，マウス由来のフラビウイルス交差モノクローナル抗体（Ｄ１－４Ｇ２－４－１５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－１１２））を１次抗体（室温３０分間）とし，順次，２次抗体にビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（室温３０分間），アビジン・ビオチン複合体（室温３０分間），ＶＩＰ基質（室温１０分間）を反応させた。免疫陽性となる感染細胞を顕微鏡下で観察・評価した。
　染色された各ウェルの細胞を図４に示す。ウイルス感染が認められると濃く染色され，ヒト樹状様細胞（１～６列：白矢印）が陽性対照（７～１２列：黒矢印）と比較し低濃度のウイルスであってもよく染色しているのが判別できた。よって，本実施例１に記載の方法により作製した増殖能力を有する単球から誘導された樹状細胞は，デングウイルスによる感染を受けることが示された。このような実験条件下で医薬品候補物質を添加することにより，デングウイルス感染阻害能を評価することができると考えられる。図５（Ａ）に示す様に，デングウイルス１型に関して単球様細胞（Ａ１）は同濃度のウイルスを感作した対照（Ａ７）と比べ極めて強く感染が確認でき，その結果，薬剤の定量評価にはより適していることが明らかとなった。
　デングウイルス感作による，ウイルス放出量を図６に示す。樹状細胞のウイルス放出量は陽性対照であるＫ５６２細胞より多いことから，よりヒトに近い細胞を用いたウイルス増殖および変異株の獲得に適していることが明らかとなった。
（実施例６）ヒト単球様及び樹状様細胞を用いたデングウイルス感染試験２
　ヒト末梢血由来不死化単球細胞（ＣＤ１４－ＭＬ）及びヒト人工多能性幹細胞由来不死化単球細胞（ｉＰＳ－ＭＬ）は、移送先に到着後，速やかにトリプシンなどを用いて剥離し，Ｔ－２５フラスコから遠沈管に移し替え，回収し後，１００ｍｍディッシュなどに移し替え，３日おきに培地を交換した。
　図８に示したプレートデザインに従い，ヒト単球様細胞（１×１０７個）を終細胞数が１×１０５個／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した。単球様細胞のまま評価する場合は，α－ＭＥＭ培地（２０％　ＦＢＳ，５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ，５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ）で，樹状様細胞で評価する場合はＩＬ－４を含有するα－ＭＥＭ培地（２０％　ＦＢＳ，５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ，５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ，及び２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－４含有）中，３７℃，５％ＣＯ２インキュベータ内で３日間培養した。３日後，得られた細胞を評価に使用した。
　図８に示したプレートデザインに従い，ＭＯＩ濃度を調整した各血清型のデングウイルスを９６ウェルプレート中のヒト樹状様細胞（１×１０５個／ウェル）と混合して感染させ，３７℃，５％ＣＯ２条件下，評価培地中で培養した。７２時間後に培養上清を回収し，上清中に含まれる子孫ウイルスの感染力価をプラークアッセイ法に基づき測定した。具体的には，図９に示すプレートデザインにより図８の各Ｗｅｌｌの上清（ウイルスが増殖し放出されたと思われる）を希釈率に従いＶｅｒｏ細胞に接種し，３７℃で１時間吸着後，１％メチルセルロース添加ＭＥＭ中，３７℃で３日間培養した。培養後の細胞をアセトンメタノールで固定して免疫染色を行った。免疫染色は公知の方法に基づき，マウス由来のフラビウイルス交差モノクローナル抗体（Ｄ１－４Ｇ２－４－１５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－１１２））を１次抗体（室温３０分間）とし，順次，２次抗体にビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（室温３０分間），アビジン・ビオチン複合体（室温３０分間），ＶＩＰ基質（室温１０分間）を反応させた。
　デングウイルス４型（ＤＥＮＶ－４）を用い，ヒト末梢血由来の樹状様細胞（ＣＤ１４－ＤＣ）及びヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来樹状様細胞（ｉＰＳ－ＤＣ）のプラークアッセイ結果を図１０に示す。デングウイルスがヒト樹状様細胞内に侵入・増殖し，子孫ウイルスが放出されると，回収時に上清内に放出された子孫ウイルスが含まれる。そのため，Ｖｅｒｏ細胞上での２次培養後染色される。一般的に使用されるＫ５６２細胞やＶｅｒｏ細胞でのウイルス検出限界と比較し，ヒト末梢血由来の樹状様細胞（ＣＤ１４－ＤＣ）及びヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来樹状様細胞（ｉＰＳ－ＤＣ）極めて低濃度（白及び黒矢印の濃度。既存細胞の１００倍以上，ウイルス種によっては１００００倍以上の感度）のウイルスであっても増殖し，検出可能であることが示唆された。このような実験条件下で評価することにより，高感度なウイルス検査や単離，さらには他のフラビウイルスを始め，これまでウイルス濃度が低く培養が難しかったウイルスなどに対し培養可能な環境を提供することで，薬剤評価ができることが明らかとなった。
　デングウイルス１型（ＤＥＮＶ－１）を用い，ヒト末梢血由来の樹状様細胞（ＣＤ１４－ＤＣ）のプラークアッセイ結果を図１１に示す。プラークの形成にはウイルスの状態が反映される。本試験では小さな斑点（白矢印）と大きな斑点（黒矢印）が認められた。本結果は，ウイルスの状態の変化を示唆し，わずか１回のみの感染実験のみでウイルス変異が起きている可能性を示唆するものである。これまで変異を引き起こすのが困難なため、ワクチン候補株の構築・開発作成に長期間を必要としていた課題に対し，新たな研究開発法（ワクチン株の構築、開発、または作製法）を提供できることが明らかとなった。

Claims (15)

  1. 　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって，
    　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること、及び
    　感染した細胞を培養することを含む方法。
  2. 　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって，
    　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とを単球に導入すること，
    　任意前記単球から樹状細胞を分化誘導すること，
    　得られた単球又は樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること、及び
    　感染した細胞を培養することを含む方法。
  3. 　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症治療薬を同定する方法であって，
    　被検薬の存在下でＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，
    　前記単球又は前記樹状細胞における前記感染性微生物の感染レベルを測定すること，
    　測定された前記感染性微生物の感染から，該被検薬が前記感染症治療効果を有するか否かを判定することを含む方法，
    　ここで，測定された前記感染性微生物の感染レベルが，前記被検薬の非存在下で前記細胞に前記感染性微生物を感染させたコントロールの感染レベルと比較して少ない場合，当該被検薬は前記感染症治療効果を有すると判定される。
  4. 　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の変異株を作製する方法であって，
    　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，
    　感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること，
    　増殖した前記感染性微生物の中から，変異株を単離することを含む方法。
  5. 　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物のワクチンを製造する方法であって，
    　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること，
    　感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること，
    　増殖した前記感染性微生物を回収することを含む方法。
  6. 　更に，回収された前記感染性微生物を不活化することを含む，請求項６に記載の方法。
  7. 　単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症患者由来血液から該感染微生物を分離する方法であって、
    　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と，ｃＭＹＣ遺伝子とが導入された単球，又は，前記単球から分化誘導された樹状細胞と前記患者由来血液とを接触させること，
    　感染した細胞を培養すること，
    　培養細胞中の微生物を検出及び／又は同定することにより、感染微生物を特定することを含む方法。
  8. 　前記単球が，ヒト多能性幹細胞又はヒト造血幹細胞を分化誘導することにより得られた細胞，又は，ヒト末梢血から単離することにより得られた細胞である，請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記ヒト多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 　ヒト多能性幹細胞又はヒト造血幹細胞を分化誘導することにより単球を調製すること，又は，ヒト末梢血から単離することにより単球を調製することをさらに含む，請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記ヒト多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記感染性微生物がデングウイルスである，請求項１～請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　培養時間が、２４～９６時間である、請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　培養回数が１～５回である、請求項４に記載の方法。
  15. 　ＢＭＩ１遺伝子，ＥＺＨ２遺伝子，ＭＤＭ２遺伝子，ＭＤＭ４遺伝子，ＨＩＦ１Ａ遺伝子，ＢＣＬ２遺伝子及びＬＹＬ１遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子が，ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ２遺伝子若しくはＬＹＬ１遺伝子である，請求項１～請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
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