ES2601105T3

ES2601105T3 - Método para estimular respuestas de células T específicas de antígeno usando células dendríticas cocultivadas aceleradas

Info

Publication number: ES2601105T3
Application number: ES10714449.5T
Authority: ES
Inventors: Roberto Mallone; Emanuela Martinuzzi
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2009-04-14
Filing date: 2010-04-13
Publication date: 2017-02-14
Anticipated expiration: 2030-04-13
Also published as: WO2010119307A1; JP2012523242A; US20120094865A1; EP2419730A1; EP2419730B1; WO2010119033A1; JP5776684B2; US9091679B2

Abstract

Un método para estimular respuestas de células T específicas de antígeno (Ag) en una muestra de sangre o de células mononucleares de sangre periférica no fraccionada (PBMC) aislada de un sujeto, que comprende las siguientes etapas: a) cultivar dicha muestra de sangre o muestra de PBMC no fraccionada en un medio que induce la diferenciación de células dendríticas (DC), comprendiendo dicho medio factor estimulador de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF) e interleuquina 4 (IL-4); b) madurar dichas DC; en el que se añade un Ag durante las etapas a) y/o b).

Description

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sombreado) y con cultivos en ausencia de citoquinas (perfiles de puntos). Se obtuvieron resultados similares madurando las acDC y moDC con anti-CD40/IFN-α (no mostrado). (b) Potencia estimuladora en ensayos ELISpot de IFN-γ de acDC y moDC maduradas con TNF-α/PGE2/IL-1β o dejadas inmaduras. Para acDC, se cultivaron PBMC completas (1 x 106/pocillo) como anteriormente en presencia o ausencia de PPD de M. tuberculosis durante 48 horas. Se aislaron monocitos autólogos por adherencia de PBMC (1 x 106/pocillo) y se estimularon como anteriormente durante 7 días para obtener moDC. Después se añadieron PBMC autólogas frescas (1 x 106/pocillo) a las moDC con o sin PPD durante 48 horas. Posteriormente se recuperaron las células no adherentes y se sometieron a ELISpot de IFN-γ. (c) Variabilidad entre ensayos analíticos de ELISpot de IFN-γ con acDC. Se descongelaron 3 alícuotas de PBMC congeladas de la misma extracción de sangre y se ensayaron como se describe. Coeficiente de variación (CV)=9,6 %. Se indican aquí los recuentos de manchas de IFN-γ basales ("sin Ag") e inducidas por TTX junto con las respuestas TTX netas (con el basal sustraído) y en posteriores paneles d, e (cultivos de acDC madurados con anti-CD40/IFN-α). (d) Variabilidad entre ensayos preanalíticos y analíticos de ELISpot de IFN-γ con acDC. Se obtuvieron PBMC del mismo individuo en 4 ocasiones diferentes y se ensayaron como se describe. CV=5,4 %. (e) Variabilidad entre muestras frescas y crioconservadas. Las PBMC de una única extracción de sangre se ensayaron frescas o congeladas y posteriormente se ensayaron tras descongelarse. CV=6,9 %. Todos los paneles son representativos de experimentos realizados por triplicado. Figura 3. Las células T específicas de Ag expandidas en acDC pueden aislarse y clonarse. (a) Esquema del ELISpot con acDC y procedimiento de generación de clones de células T. se indujeron acDC añadiendo GM-CSF e IL-4 junto con Ag proteico a PBMC marcadas con CFSE en el día 0, seguido en el día 1 por TNFα/PGE2/IL-1β. En el día 2, se transfirieron las células no adherentes a pocillos de ELISpot durante 6 horas y posteriormente se recubrieron y pusieron de vuelta en cultivo. Se cuantificaron respuestas específicas de Ag por ELISpot. En el día 8-10, la fracción correspondiente de células en proliferación (CFSEbajo) se clasificó en células individuales, se expandió a través de 3 ciclos de estimulación y se ensayó para la especificidad de Ag en el día

28. (b) ELISpot de IFN-γ con acDC representativo después de estimulación con TTX o control. (c) Proliferación con CFSE de PBMC recuperadas de pocillos ELISpot. Se muestra una comparación de la expansión convencional frente a la dirigida por acDC. (d) La fracción CFSEbajo específica de TTX se clasificó y clonó. Se muestra un ensayo de recuerdo de uno de estos clones sobre DC pulsadas con TTX y control por tinción de IFNγ intracelular.

Figura 4. Ag proteicos/peptídicos y diferentes periodos de estimulación desencadenan diferentes respuestas de células T. (a) Se realizaron ensayos ELISpot de IFN-γ dirigidos por acDC y moDC como en la Fig. 1b sobre PBMC con reducción magnética de CD4 o son reducción estimuladas con una vacuna hexavalente (Hexa). (b) ELISpot de IFN-γ realizado sobre PBMC cultivadas con o sin el cóctel de acDC. Las PBMC de un sujeto HLA-A2+ (A*0201)-DR4+ (DR*0401) se estimularon con el péptido Flu MP58-66 restringido a HLA-A2, péptido Flu HA306-318 restringido a DR4 o TTX, como se indica. Los péptidos se añadieron después de las primeras 24 horas de cultivo, mientras se introdujo TTX ab initio. (c) Respuestas ELISpot de IFN-γ específicas de TTX en estimulaciones de acDC realizadas sobre PBMC con reducción magnética de células CD45RA+ o CD45RO+ o dejadas sin reducir. Los resultados se expresan como respuestas relativas de IFN-γ normalizadas a las PBMC no reducidas. (d) Respuestas ELISpot de IFN-γ e IL-10 contra TTX y KLH sobre PBMC estimuladas con acDC marcadas con CFSE. (e) Se recuperaron PBMC marcadas con CFSE de los pocillos de ensayo del panel (d) y se cultivaron durante 10 días adicionales en ausencia de estímulos adicionales y citoquinas. Se muestra la proliferación en CFSE de células T CD4+ y CD8+ contra diferentes Ag. Se realizaron estimulaciones en los paneles (a-e) madurando las acDC con TNF-α/PGE2/IL-1β y son representativas de tres experimentos independientes (excepto para el panel c, donde se muestra la media ± ETM de tres experimentos diferentes). Figura 5. La secreción de IFN-γ específica de antígeno y regulación positiva de CD137 se amplifican por acDC en PBMC y sangre completa. (a) Ensayo de captura de IFN-γ realizado sobre PBMC en ausencia (fila superior) o presencia (fila inferior) de acDC. Después de 48 horas de incubación, se capturó IFN-γ secretado sobre la superficie de células no adherentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los números porcentuales indican la fracción IFN-γ+CD4+ (izquierda) o IFN-γ+CD8 (derecha) entre las PBMC. (b) Ensayos de regulación positiva de CD137 realizados sobre PBMC purificadas con (fila inferior) o sin (fila superior) amplificación por acDC durante un cultivo de 48 horas, como anteriormente. (c) Se estimuló la sangre completa de la misma extracción en paralelo añadiendo Ag con (inferior) o sin (superior) acDC. Al final del cultivo de 48 horas, se lisaron los glóbulos rojos y se analizaron las muestras como para el panel (b). Aquí los diagramas de puntos se sincronizaron sobre células T CD4+ (izquierda) o CD8+ (derecha) para permitir la comparación entre las PBMC y la sangre completa. Los números porcentuales, por lo tanto, indican la fracción CD137+ entre células T CD4+ o CD8+. Los resultados se refieren a experimentos representativos realizados por triplicado usando el cóctel de maduración anti-CD40/IFN-α. Figura 6. Las acDC amplifican la secreción de citoquinas en sangre completa. (a) Se cultivó sangre completa (250 ml) durante 48 horas con o sin TTX en presencia (círculos) o ausencia (cuadrados) de acDC (incluyendo antiCD40/IFN-α para la maduración). Se recuperaron los sobrenadantes de plasma y se midieron las citoquinas por ensayo Luminex de perlas. Se muestran solamente las citoquinas que muestran secreción específica de Ag significativa. Los resultados se expresan como concentraciones netas de citoquinas estimuladas por TTX (símbolos rellenos) después de sustraer los valores basales (representados por símbolos abiertos). (b) Comparación de la secreción de citoquinas de PBMC (símbolos rellenos) y sangre completa (símbolos abiertos) después de estimulación con acDC en dos sujetos diferentes (símbolos de círculo y rombo, respectivamente). Los resultados se expresan como concentraciones netas de citoquinas estimuladas por TTX

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Alleva et al. (J Clin Invest. 107:173, 2001) informaron de la detección de una respuesta celular contra el epítopo de insulina B9-23 en pacientes con T1D, usando un ensayo ELISpot directo. Arif et al., (J Clin Invest. 113:451, 2004) informaron de la detección de una respuesta celular contra varios péptidos derivados de proinsulina usando un ensayo ELISpot indirecto. En este artículo, se incubaron células mononucleares de sangre periférica con péptidos

5 antigénicos antes del ensayo ELISpot.

Sin embargo, esos estudios han sido globalmente difíciles de reproducir fuera de sus laboratorios de origen. Esto pone de relieve los impedimentos técnicos de dichos procedimientos, y la baja sensibilidad global de estos sistemas de detección.

Por lo tanto, se usaron los procedimientos basados en acDC descritos en esta solicitud para investigar las respuestas de células T CD4+ específicas de células β de T1D. Se consideraron diferentes grupos de pacientes y se hicieron varias observaciones clave: en primer lugar, se caracterizaron adultos con T1D captados en el diagnóstico por una alta prevalencia (83,3 %) de respuestas específicas de proinsulina (PI), que contrastaba con la rareza de 15 estas respuestas en pacientes antiguos (5,4 %; P<0,0001). Por el contrario, las respuestas específicas de GAD estuvieron representadas de forma similar -aunque a frecuencias más bajas -independientemente de la duración de T1D. En segundo lugar, niños con T1D de nueva aparición no presentaban ninguna respuesta de células T específicas de PI. Controles sanos (tanto adultos como niños) no presentaban ninguna respuesta de células T específicas de PI excepto en dos casos (frecuencia del 8,7 %). En ambos casos, estos sujetos albergaban factores de riesgo de T1D no reconocidos previamente, que son positivos para el haplotipo de susceptibilidad HLA-DR4/DQ8 en un caso, y para Ab anti-GAD en el otro. Los parientes de 1er grado en riesgo (n=10; definidos como individuos positivos para Ab contra células de los islotes, frecuentemente junto con otros marcadores de Ab) presentaban un cuadro algo intermedio, con un 30,0 % de los individuos ensayados positivos para respuestas específicas de PI. De forma importante, solamente 1 de los 10 individuos ensayados ha desarrollado T1D hasta ahora, y se había

25 identificado correctamente como en alto riesgo de progresión de T1D por el ensayo ELISpot asado en acDC. Sin el deseo de limitarse a teoría alguna, se hipotetiza de que la diferencia que se observa entre pacientes de T1D de nueva aparición y antiguos refleja una respuesta reguladora inducida por tratamiento con insulina, con implicaciones importantes para ensayos clínicos dirigidos a prevenir la enfermedad bloqueando la destrucción autoinmunitaria de células β en sujetos en riesgo. Esta respuesta reguladora puede ser, en algunos casos, una natural independiente de terapia con insulina, como se observa en niños.

Ejemplo 6: detección potenciada de respuestas de células T específicas de antígeno por células dendríticascocultivadas aceleradas (acDC)

35 Resumen

La detección de células T específicas de antígeno (Ag) a menudo está limitada por la sensibilidad del ensayo. Por lo tanto, se ideó un enfoque para potenciar el procesamiento y presentación de Ag a células T en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas y de ratón acelerando la inducción y maduración de células dendríticas (DC) in situ (mencionadas como DC cocultivadas aceleradas, acDC). Las PBMC no fraccionadas o sangre completa se incubaron durante 48 h con Ag proteico o peptídico y cócteles de citoquinas para inducir, pulsar y madurar rápida y secuencialmente las acDC. De forma simultánea, se procesó y/o presentó el Ag a células T adyacentes, abreviando, por tanto, múltiples etapas que conducen a la activación de células T y minimizando las necesidades de tiempo, manipulación y sangre. Las respuestas de células T provocadas eran específicas de Ag,

45 como se detecta por diferentes lecturas (secreción de citoquinas, proliferación, regulación positiva de CD137, unión de multímeros de Ag de leucocitos humanos). Los ensayos basados en acDC puede encontrar aplicaciones valiosas para controlar las respuestas de células T en diferentes entornos, tales como en enfermedades víricas, tumorales o autoinmunitarias.

Introducción

A pesar del papel central de las células T en el montaje de respuestas contra diferentes antígenos (Ag) foráneos y autoantígenos, la detección diagnóstica rutinaria de procesos mediados por el sistema inmunitario, por ejemplo, en enfermedad infecciosos o autoinmunitarias, depende en gran medida, si no exclusivamente, de la medición de 55 respuestas de anticuerpos (Ab). Sin embargo, los Ab no siempre median o reflejan la patología subyacente y pueden ser poco informativos cuando el proceso inmunitario está predominantemente mediado por células T (1). La única aplicación clínica fiable de los ensayos de células T específicas de Ag hasta la fecha ha sido en el diagnóstico de infección por M. Tuberculosis (2). Además, la importancia de medir de forma eficaz la inmunidad de células T alcanza más allá de las aplicaciones de diagnóstico (3). El control de células T también es necesario para evaluar las terapias de inmunomodulación dirigidas a reforzar la inmunidad específica de virus o tumor, o la inactivación de la inmunidad contra tejidos propios (4) o trasplantados (5). Las herramientas de exploración de células T para evaluar el potencial inmunogénico de proteínas de remplazo (por ejemplo, factores de coagulación) (6) o de vacunas

(7) están igualmente demandadas.

65 La ausencia de ensayos rutinarios de células T humanas, se debe a las dificultades intrínsecas en la medición de las respuestas de células T. Las células T específicas para un Ag dado están presentes en una frecuencia muy baja en

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Shanghái, China).

Inducción de acDC en PBMC. El estudio se aprobó por los comités éticos y todos los sujetos dieron consentimiento informado por escrito. Las PBMC se aislaron y se usaron frescas o congeladas como se describe (26). En el día 0, 5 las PBMC se sembraron (106 células/100 µl/pocillo) en placas de fondo plano de 96 pocillos en medio AIM-V suplementado con 1000 U/ml de GM-CSF, 500 U/ml de IL-4 (R&D, Lille, Francia) y que contenían Ag proteicos (0,110 µg/ml). Después de 24 h (día 1), se añadieron estímulos de maduración, que comprenden los siguientes reactivos en diferentes combinaciones (véase la Fig. 1c): 1000 U/ml de TNF-α, 10 ng/ml de IL-1β, 1000 U/ml IFN-γ (todos de R&D), 1 mM de PGE2 (Calbiochem, San Diego, CA); CpG ODN2216 (5 µg/ml; Cell Sciences, Canton, MA), poliI:C (20 µg/ml; Cayla/InvivoGen, Toulouse, Francia), LPS (100 ng/ml; de E. coli 055:B5, Sigma), Ab anti-CD40 (10 µg/ml; clon G28.5, producido de forma local), IFN-α-2a (1000 U/ml; Roferon-A, Roche, Neuilly-sur-Seine, Francia). Los cócteles de maduración usados en cada experimento se detallan en las leyendas de la figura. Se añadió IL-7 (0,5 ng/ml; R&D) junto con estímulos de maduración (26). Cuando se usaron, los Ag peptídicos se añadieron en el día 1 junto con los estímulos de maduración. En el día 2 (48 h después del inicio del cultivo), se recogieron las células no

15 adherentes, se lavaron y se analizaron.

Inducción de acDC en sangre completa. Se distribuyó sangre heparinizada no diluida fresca (250 µl) en tubos de 1,5 ml, se añadieron citoquinas y Ag como para la estimulación de PBMC, y la sangre hemolisada y/o los sobrenadantes del plasma se analizaron después de 48 h.

Caracterización de DC. Para generar moDC, se cultivaron monocitos purificados con GM-CSF/IL-4 durante 6 días y se maduraron con TNF-α/PGE2/IL-1β durante 24 h adicionales. Se determinaron los fenotipos de las acDC y moDC de 7 días tiñendo con Ab específicos para HLA-DR, CD14, CD80, CD86 y CD11c (BD). La actividad endocítica se evaluó por captación de fluorescencia de dextrano-FITC. Se realizaron experimentos de citometría de flujo sobre un

25 FACSAria equipado con láseres de 488, 633 y 407 nm (BD).

Ensayos ELISpot. Después de 48 h de incubación de acDC en PBMC, se lavaron las células no adherentes, se resuspendieron en AIM-V fresco y se ensayaron durante 6 h como se describe (27). Se contaron las manchas en un Bioreader 5000 Pro-SF (BioSys, Karben, Alemania) y se determinaron las medias de 3-6 réplicas. Las lecturas de ELISpot se expresan como SFC/106 PBMC y están con el fondo sustraído (para las respuestas espontáneas en presencia de BSA o sin Ag, que eran idénticas en todos los casos) (27).

Ensayos de CFSE y clonación de células T. Se tiñeron PBMC con CFSE 0,1 mM (Invitrogen/Molecular Probes) y se usaron para cultivos de acDC como se ha descrito anteriormente. Después de 2 días, se lavaron las células no

35 adherentes, se transfirieron a placas ELISpot durante 6 h, después se volvieron a sembrar en placas de fondo en U de 96 pocillos. Después de 5-8 días de cultivo, las células se tiñeron para CD4/CD8. Se clasificó una única célula CD4+ CFSEdim en cada pocillo de una placa de fondo en U de 96 pocillos. Cada pocillo contenía IL-2 (20 U/ml; R&D), IL-4 (5 ng/ml), anti-CD3 (OKT3, 30 ng/ml) y 2 x 105 PBMC irradiadas de dos donantes no relacionados (15). Las células se alimentaron cada 7 días con citoquinas frescas. Se ensayaron los clones en crecimiento después de ~3 semanas por tinción intracelular de IFN-γ después de incubación con moDC pulsadas con Ag o no pulsadas.

Ensayos de captura de IFN-γ y regulación positiva de CD137. Se realizó captura de IFN-γ usando un kit de IFNγ-aloficocianina de Miltenyi. CD137 se tiñó con Ab 4B4 (BD) marcado con ficoeritrina (PE).

45 Ensayos de multímeros de HLA. Se usaron pentámeros HLA-A0201 marcados con PE cargados con Flu MP58-66

o péptido de control (ProImmune, Oxford, RU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los tetrámeros HLA-DR0401 marcados con PE cargados con Flu HA306-318 o péptido de control los proporcionaron amablemente los Dr. E. James y G.T. Nepom (Benaroya Research Institute, Seattle, WA) y se usaron como se describe (28).

Estimulación de acDC de ratón. Se inmunizaron de forma subcutánea ratones Balb/c con 50 mg de KLH en adyuvante completo de Freund en la base de la cola. Después de 14 días, se recogieron las células sanguíneas, se hemolisaron y se sembraron en placas de 48 pocillos (2 x 106 células/pocillo). Se añadieron GM-CSF e IL-4 de ratón (R&D) como para acDC humanas, con o sin KLH (0,1 mg/ml); se añadió LPS (10 ng/ml) en el día 1 y los ensayos ELISpot se realizaron en el día 2 como se describe (27).

55 Ensayos combinados de citoquinas. Se analizaron sobrenadantes de cultivos de acDC de 48 h en una plataforma Luminex (Bio-Plex 200, Bio-Rad, Gladesville, NSW, Australia) usando un panel Milliplex (Millipore/Abacus, Brisbane, QLD, Australia) que comprendía las siguientes citoquinas y quimioquinas: G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-17, MIP-1α, MIP-1β y TNF-α.

Análisis estadísticos. Todos los gráficos se presentan como medias ± ETM de >3 experimentos independientes. Todos los análisis estadísticos fueron de dos variables y se realizaron de acuerdo con la distribución variable y el tamaño de muestra usando Graph-Pad Prism 5 (La Jolla, CA).

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Referencias del ejemplo 6

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