CN111381050A - Reg3β/ HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，包括如下步骤：（1）体外研究Reg3β对EAM小鼠心肌浸润巨噬细胞再编程及分泌HMGB1的影响及机制；（2）体外研究HMGB1对心肌细胞去分化、增殖及Reg3β释放的影响及机制；（3）体内验证Reg3β/N2‑HMGB1环路调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制。本发明首次提出EAM时心肌细胞与浸润Mφ通过Reg3β/N2‑HMGB1环路相互作用，形成正反馈调节，促进Mφ再编程，参与受损心肌修复，为全面了解巨噬细胞在心肌炎发生和转归过程中的作用奠定基础，也为临床治疗心血管疾病提供新的思路和靶点。
Description
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种Reg3β/ HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法。
背景技术
心肌炎是指心肌中有局限性或弥漫性的炎性病变，可由病毒感染、物理、化学等多种因素引起。近年来心肌炎发病率不断增加，病情轻重不等，表现差异很大，婴幼儿病情多较重，成年人多较轻。轻者可无明显病状，重者可并发严重心律失常、心功能不全、心源性休克或心力衰竭甚至是心脏猝死，严重威胁人类的身心健康。因此，阐明心肌炎的炎症损伤及其受损心肌功能重塑的机制，对于积极预防心肌炎的发生、提高人民生活质量具有重要意义；同时为开展以心肌功能重塑为目的免疫治疗奠定基础。由柯萨奇病毒或心肌球蛋白α链（MyHC-α）诱导产生的实验性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）是研究这一疾病的有效模型。
心肌炎是炎症导致心肌细胞坏死、释放高迁移率族蛋白B1（high mobility groupbox 1，HMGB1）等损伤相关的分子模式，激活心脏定居免疫细胞，如肥大细胞等，导致单核/巨噬细胞（macrophages，Mφ）在心肌组织中大量浸润，参与心肌炎的发生、发展。有研究表明心肌浸润Mφ通过在局部微环境下的再编程参与心肌损伤、心肌细胞再生与心肌功能重塑三个阶段，然而调控心脏Mφ再编程的微环境因素目前仍不完全清楚。Mφ是高度异质性的细胞群体，分布广泛，可塑性强，功能具有多样性，在维持体内稳态、促进组织器官发育、参与受损组织修复、抵抗病原微生物感染及免疫调节中发挥不同的作用。根据存在部位和功能表型的差异，可将Mφ分为两类: 炎性Mφ（inflammatory macrophages，iMφ）和组织定居Mφ（tissue resident macrophages，ResMφ）。两类Mφ具有不同的组织来源与发育路径：iMφ是短寿命的细胞群体，主要由外周循环中的Ly6Chi单核细胞分化而来，当机体出现炎症或组织器官受损时，被招募至炎症部位，并在局部微环境的作用下分化、发育，从而发生抗感染免疫效应；ResMφ主要起源于胚胎时期的卵黄囊（yolk sac，YS）（表型为Ly6C-），少数来源于胎肝以及外周循环中的单核细胞（表型均为Ly6Chi），并且ResMφ定居器官的微环境也可调控其发育，心脏稳态时，ResMφ主要通过Ly6C-Mφ增殖维持自我更新，随着年龄的增加Ly6C-Mφ增殖能力下降，主要依赖招募Ly6Chi单核细胞维持更新；在此过程中，Ly6ChiMφ逐步取代Ly6C-Mφ，致使受损组织修复功能减弱。
各组织巨噬细胞互不相同，具有不同的转录谱和功能。大量的研究表明组织功能需求信号调控Mφ的分化、发育，是决定Mφ表型与功能的重要因素。在EAM发生发展的过程中，局部微环境随之呈现不同的变化，不断促进Mφ功能与表型的再编程，相继成为炎症Mφ（M1）、炎症消退Mφ（M2）和组织修复Mφ（M2），从而参与心肌的炎症发生、炎症消退、修复与再生等过程。因此，阐明Mφ在心肌炎局部微环境下的再编程机制是有效控制和延缓心肌损伤的重要途径。
心肌细胞释放的再生基因蛋白Reg3β（regenerating islet derived protein 3beta，再生胰岛衍生蛋白3β），在Mφ再编程中发挥着重要作用。Reg3β属于钙依赖型凝集素超家族的成员，是一个多功能分泌蛋白，具有抗炎、抗凋亡、促增殖和再生以及参与组织修复等功能。有研究表明心肌受损时去分化的心肌细胞释放Reg3β，进而招募单核/巨噬细胞聚集，参与受损心肌的修复，Reg3β缺失会延缓心肌修复过程；但众多研究者之前的研究结果显示心肌受损时单核细胞迁移和浸润主要依赖于ANG II-CCR2/5轴。由此推论，Reg3β可能在招募脾脏Ly6Chi单核/巨噬细胞浸润至受损心肌组织过程中发挥了一些作用，但其更重要的作用是调控了心肌局部微环境中Mφ的再编程。
HMGB1是一种核DNA结合蛋白，进化高度保守、广泛表达于多种组织细胞。HMGB1由A、B两个基因盒以及一个酸性尾端构成，结构功能分析显示B基因盒是发挥炎症的功能区域，A基因盒是B基因盒的拮抗位点[23]；在A、B两个基因盒上包含三个保守的对氧化敏感的半胱氨酸残基：Cys23、Cys45（A基因盒）和Cys106（B基因盒），据此可将HMGB1分为氧化型和还原型，其中只有还原型HMGB1具有生物学活性。作为损伤相关分子模式，在损伤等应激条件下，还原型HMGB1可由坏死的细胞被动释出，或由活化的Mφ等免疫细胞主动分泌。
综上所述，心肌炎是以免疫细胞浸润、进行性心肌损伤、后期组织损伤修复纤维化为主要特征的炎性疾病，Mφ在心肌炎各阶段不同微环境的调控下再编程其功能和表型，参与心肌炎的发生、发展过程。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种Reg3β/ HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，利用Reg3β/ HMGB1环路调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的机制，为全面了解巨噬细胞在心肌炎发生和转归过程中的作用奠定基础，也为临床治疗心血管疾病提供新的思路和靶点。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，包括如下步骤：
（1）体外研究Reg3β对EAM小鼠心肌浸润巨噬细胞再编程及分泌HMGB1的影响及机制；
（2）体外研究HMGB1对心肌细胞去分化、增殖及Reg3β释放的影响及机制；
（3）体内验证Reg3β/N2-HMGB1环路调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制。
其中，步骤（1）包括如下步骤：
（1-1）构建EAM小鼠模型，分离脾脏Ly6Chi单核细胞和Ly6ChiF4/80+细胞（注：EAM时，心肌浸润单核/Mφ多数由脾脏迁移而来），体外以Reg3β处理；
（1-2）检测细胞表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2 的表达，观察ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的分泌；
（1-3）研究HMGB1的表达并鉴定其糖基化修饰，从而分析Reg3β对心肌浸润Mφ表型、功能再编程及HMGB1分泌的影响；
（1-4）检测PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ等转录因子磷酸化水平，并观察使用相应的转录因子抑制剂或siRNA后对Mφ上述表型和功能的影响，研究Reg3β调控心肌浸润巨噬细胞再编程的机制。
其中，步骤（1-1）的具体步骤为：
（1-1-1）构建EAM小鼠模型：根据以往报道的方法建立EAM模型，即利用MyHC-α与CFA 1:1充分乳化后，分别在第0d、7d免疫BALB/c小鼠；
（1-1-2）分离Ly6Chi单核细胞和Ly6ChiF4/80+细胞：分离EAM小鼠脾脏Ly6Chi单核细胞、Ly6ChiF4/80+细胞（心肌浸润单核/Mφ多数由脾脏迁移而来），并用250 ng/mL Reg3β处理。
其中，步骤（1-2）的具体步骤为：
（1-2-1）Reg3β对Mφ表型的影响：流式细胞术（FACS）检测Reg3β处理前后细胞表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2的表达变化；
（1-2-2）Reg3β对Mφ分泌功能的影响：采用RayBiotech公司细胞因子抗体芯片检测细胞培养上清中ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1等的分泌；Western blot检测细胞iNOS、Arg1的表达。
其中，步骤（1-3）的详细步骤为：Reg3β对Mφ分泌HMGB1的影响：ELISA检测细胞培养上清中HMGB1的水平，LC-MS/MS鉴定HMGB1糖基化修饰。
其中，步骤（1-4）中Reg3β调控心肌浸润巨噬细胞再编程的机制的具体步骤为：
（1-4-1）Western blot检测Reg3β处理前后细胞中PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ等转录因子的磷酸化水平；
（1-4-2）分别使用PU.1、STAT6、IRF4、PPARγ siRNAs或转录抑制剂预处理Mφ细胞，再加入250 ng/mL的Reg3β，重复步骤（1-2）~（1-3），观察对Mφ表型、功能及N2-HMGB1表达的影响，探讨Reg3β调控Mφ再编程的分子机制。
其中，步骤（2）包括如下步骤：
（2-1）从无血清培养的Mφ上清中经亲和层析分离和鉴定HMGB1，处理出生3-5天小鼠的心肌细胞；
（2-2）检测心肌细胞特异性去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2以及细胞内和培养上清中Reg3β的表达，观察细胞增殖能力的变化；
（2-3）分析HMGB1对小鼠心肌细胞去分化、增殖及Reg3β表达的影响；
（2-4）检测信号通路分子ERK1/2、Akt分子的磷酸化情况以及GSK3β/β-catenin的表达，并观察使用相应信号分子拮抗剂或siRNA后对心肌细胞上述去分化标志表达和增殖能力的影响，研究HMGB1调控心肌细胞去分化/增殖的机制。
其中，步骤（2-1）的具体步骤为：
（2-1）HMGB1的分离与鉴定：从无血清培养的Mφ上清中经亲和层析分离、纯化HMGB1，经过LC-MS/MS分析，确定其糖基化修饰位点；
（2-2）心肌细胞的分离、鉴定与处理：选择出生3-5d的小鼠，断颈处死，取心脏，用0.08％胶原酶II与0.125%胰酶等比混合后消化心肌组织，离心后种植于含有20%FBS的MEM培养基中；利用cTnT免疫荧光染色鉴定心肌细胞；分别用无关对照蛋白、250 ng/mL N2-HMGB1及250 ng/mL 重组HMGB1处理原代心肌细胞6 h、12 h、24 h后，进行以下分析；
步骤（2-2）的具体步骤为：HMGB1对心肌细胞去分化能力的影响：免疫荧光检测各处理组心肌细胞表面特异性去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2的表达；
步骤（2-3）的具体步骤为：
（2-3-1）HMGB1对心肌细胞增殖能力的影响：上述各处理组细胞固定后免疫荧光检测Ki67的表达，同时采用CFSE检测细胞的增殖能力；
（2-3-2）HMGB1对去分化心肌细胞释放Reg3β的影响：Western blot检测各处理组心肌细胞培养上清中以及胞内Reg3β的表达；
步骤（2-4）中HMGB1调控心肌细胞去分化与增殖的分子机制研究包括如下步骤：
（2-4-1）Western blot检测各处理组心肌细胞中Erk1/2、Akt磷酸化水平以及GSK3β/β-catenin的表达；
（2-4-2）分别使用ERK1/2抑制剂（U0126）、Akt抑制剂（Isobavachalcone）以及GSK-3β抑制剂（TWS119）预处理心肌细胞1h，再加入250ng/mL的N2-HMGB1，重复步骤（2-2）~（2-3），观察对心肌细胞去分化能力、增殖能力及Reg3β释放的影响，探讨N2- HMGB1调控心肌细胞去分化与增殖的分子机制。
其中，步骤（3）包括如下步骤：
（3-1）分别构建αMHC-Cre（αMHC是心肌细胞特异性标志）、Reg3βLacZ/flox、CD11b-Cre、HMGB1LacZ/flox BALB/c小鼠，前两者杂交获得Reg3β-/-BALB/c小鼠（敲除心肌细胞中Reg3β的小鼠），后两者杂交获得HMGB1-/-BALB/c小鼠（敲除单核/Mφ中HMGB1的小鼠）；
（3-2）分别在WT、Reg3β-/-、单核/Mφ-/-（以clodronate liposome 选择性敲除单核/Mφ）及HMGB1-/-BALB/c小鼠基础上诱导EAM模型，21天后采用心脏超声和MRI检测左心室功能；
（3-3）取各组小鼠心脏组织行HE染色和Sirius-red染色分别观察心肌病理改变和纤维化程度，检测心肌细胞RUNX1、cKIT、DAB2等特异性去分化标志、Reg3β的表达以及ERK1/2、Akt、GSK3β/β-catenin等信号通路的活化情况；
（3-4）观察心肌组织Mφ浸润，检测Mφ表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2等的表达、分泌HMGB1、ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的功能、HMGB1的糖基化修饰情况以及PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ等相关转录因子的磷酸化水平变化，从而在体内验证Reg3β/N2-HMGB1调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制。
其中，步骤（3-1）包括：构建单核/Mφ敲除小鼠（单核/Mφ-/-）、单核/Mφ细胞HMGB1敲除小鼠（HMGB1-/-）以及心肌细胞Reg3β敲除小鼠（Reg3β-/-）；具体步骤为：
（3-1-1）单核/Mφ-/-小鼠构建：BALB/c小鼠以clodronate liposome（35 mg/kg/d）注射3d，敲除单核/Mφ；
（3-1-2）Reg3β-/-小鼠的构建：分别构建αMHC-Cre、Reg3βLacZ/floxBALB/c小鼠，两者进行杂交获得Reg3β-/-BALB/c小鼠，即选择性敲除心肌细胞中Reg3β的小鼠；
（3-1-3）HMGB1-/-小鼠的构建：分别构建CD11b-Cre、HMGB1LacZ/floxBALB/c小鼠，两者进行杂交获得HMGB1-/-BALB/c小鼠，即选择性敲除单核/Mφ中HMGB1的小鼠；
步骤（3-2）包括：体内验证EAM小鼠去分化心肌细胞释放的Reg3β调控心肌浸润巨噬细胞再编程的作用和机制；具体步骤为：
（3-2-1）分别在WT、Reg3β-/-、单核/Mφ-/--BALB/c基础上诱导EAM模型；
（3-2-2）诱导EAM 21d后利用心脏超声和MRI分析LVAW和LVPW、LVEDD和LVESD评估左心室功能；
步骤（3-3）的具体步骤为：
（3-3-1） 断颈处死小鼠，收集血清，取出心脏组织固定制作石蜡切片，备用；
（3-3-2）HE染色观察心肌组织的病理改变，免疫荧光检测心肌细胞去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2的改变；
（3-3-3）Sirius-red染色观察心肌纤维化程度，免疫荧光检测Mφ表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin1/2的表达，观察心肌组织中Mφ的浸润情况；
（3-3-4）细胞因子抗体芯片检测血清中ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1的水平，Western blot检测心肌组织iNOS、Arg1的表达；
（3-3-5）ELISA检测血清中HMGB1的表达，LC-MS/MS分析其糖基化修饰；
（3-3-6）Western blot检测去分化心肌细胞中PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ等转录因子的磷酸化水平；
步骤（3-4）中体内验证EAM小鼠再编程巨噬细胞分泌的HMGB1调控心肌细胞去分化机制的具体步骤为：
（3-4-1）分别在WT、HMGB1-/-BALB/c小鼠基础上构建EAM模型；
（3-4-2）将小鼠分成以下几组处理：WT+生理盐水，WT+抗-HMGB1中和抗体，HMGB1-/-BALB/c+生理盐水，HMGB1-/-BALB/c+N2-HMGB1，HMGB1-/-BALB/c+ 重组HMGB1；
（3-4-3）诱导EAM 21d后利用心脏超声心和MRI分析LVAW和LVPW、LVEDD和LVESD评估左心室功能；
（3-4-4）断颈处死小鼠，收集血清，取出心脏组织固定制作石蜡切片，备用；
（3-4-5）HE染色观察心肌组织的病理改变，免疫荧光检测心肌细胞去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2的改变；
（3-4-6）Sirius-red染色观察心肌纤维化程度，免疫荧光检测Mφ表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin1/2的表达，观察心肌组织中Mφ的浸润情况；
（3-4-7）免疫荧光检测心肌组织ki67的表达，观察心肌细胞的增殖能力改变；
（3-4-8）Western blot检测心肌组织与血清中Reg3β的表达；
（3-4-9）Western blot检测心肌组织中Erk1/2、Akt磷酸化水平以及GSK3β/β-catenin的表达。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
上述方案中，首次提出EAM时心肌细胞与浸润Mφ通过Reg3β/N2-HMGB1环路相互作用，形成正反馈调节，促进Mφ再编程，参与受损心肌修复，为全面了解巨噬细胞在心肌炎发生和转归过程中的作用奠定基础，也为临床治疗心血管疾病提供新的思路和靶点。
附图说明
图1为本发明中体外实验的流程图；
图2为本发明中体内实验的流程图；
图3为本发明中Reg3β缺失对EAM后期心肌纤维化程度的影响示意图；
图4为本发明中Reg3β诱导心肌浸润Mφ M2特征分子的表达示意图；
图5为本发明中Reg3β诱导心肌浸润Mφ Arg1的表达示意图；
图6为本发明中HMGB1诱导心肌细胞去分化标志分子的表达示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
如图1、图2所示，本发明提供一种Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，包括如下步骤：
（1）体外研究Reg3β对EAM小鼠心肌浸润巨噬细胞再编程及分泌HMGB1的影响及机制；包括如下步骤：
（1-1）构建EAM小鼠模型，分离脾脏Ly6Chi单核细胞和Ly6ChiF4/80+细胞（注：EAM时，心肌浸润单核/Mφ多数由脾脏迁移而来），体外以Reg3β处理；
（1-2）检测细胞表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2 的表达，观察ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的分泌；
（1-3）研究HMGB1的表达并鉴定其糖基化修饰，从而分析Reg3β对心肌浸润Mφ表型、功能再编程及HMGB1分泌的影响；
（1-4）检测PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ等转录因子磷酸化水平，并观察使用相应的转录因子抑制剂或siRNA后对Mφ上述表型和功能的影响，研究Reg3β调控心肌浸润巨噬细胞再编程的机制。
（2）体外研究HMGB1对心肌细胞去分化、增殖及Reg3β释放的影响及机制；包括如下步骤：
（2-1）从无血清培养的Mφ上清中经亲和层析分离和鉴定HMGB1，处理出生3-5天小鼠的心肌细胞；
（2-2）检测心肌细胞特异性去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2以及细胞内和培养上清中Reg3β的表达，观察细胞增殖能力的变化；
（2-3）分析HMGB1对小鼠心肌细胞去分化、增殖及Reg3β表达的影响；
（2-4）检测信号通路分子ERK1/2、Akt分子的磷酸化情况以及GSK3β/β-catenin的表达，并观察使用相应信号分子拮抗剂或siRNA后对心肌细胞上述去分化标志表达和增殖能力的影响，研究HMGB1调控心肌细胞去分化/增殖的机制。
（3）体内验证Reg3β/N2-HMGB1环路调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制；包括如下步骤：
（3-1）分别构建αMHC-Cre（αMHC是心肌细胞特异性标志）、Reg3βLacZ/flox、CD11b-Cre、HMGB1LacZ/flox BALB/c小鼠，前两者杂交获得Reg3β-/-BALB/c小鼠（敲除心肌细胞中Reg3β的小鼠），后两者杂交获得HMGB1-/-BALB/c小鼠（敲除单核/Mφ中HMGB1的小鼠）；
（3-2）分别在WT、Reg3β-/-、单核/Mφ-/-（以clodronate liposome 选择性敲除单核/Mφ）及HMGB1-/-BALB/c小鼠基础上诱导EAM模型，21天后采用心脏超声和MRI检测左心室功能；
（3-3）取各组小鼠心脏组织行HE染色和Sirius-red染色分别观察心肌病理改变和纤维化程度，检测心肌细胞RUNX1、cKIT、DAB2等特异性去分化标志、Reg3β的表达以及ERK1/2、Akt、GSK3β/β-catenin等信号通路的活化情况；
（3-4）观察心肌组织Mφ浸润，检测Mφ表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2等的表达、分泌HMGB1、ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的功能、HMGB1的糖基化修饰情况以及PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ等相关转录因子的磷酸化水平变化，从而在体内验证Reg3β/N2-HMGB1调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制。
实施例1
下面以具体的实施例进一步阐述本发明的技术方案。
一种Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，包括如下步骤：
步骤1、体外研究Reg3β对EAM小鼠心肌浸润巨噬细胞再编程及分泌HMGB1的影响及机制
1.1、构建EAM小鼠模型：根据以往报道的方法建立EAM模型，即利用MyHC-α与CFA 1:1充分乳化后，分别在第0 d、7 d免疫BALB/c小鼠。
1.2、分离Ly6Chi单核细胞和Ly6ChiF4/80+细胞：分离EAM小鼠脾脏Ly6Chi单核细胞、Ly6ChiF4/80+细胞（心肌浸润单核/Mφ多数由脾脏迁移而来），并用250 ng/mL Reg3β处理。
1.3、Reg3β对Mφ表型的影响：流式细胞术（FACS）检测Reg3β处理前后细胞表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2的表达变化。
1.4、Reg3β对Mφ分泌功能的影响：采用RayBiotech公司细胞因子抗体芯片检测细胞培养上清中ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1等的分泌；Western blot检测细胞iNOS、Arg1的表达。
1.5、Reg3β对Mφ分泌HMGB1的影响：ELISA检测细胞培养上清中HMGB1的水平，LC-MS/MS鉴定HMGB1糖基化修饰。
1.6、Reg3β调控Mφ再编程的分子机制研究：
1.6.1、Western blot检测Reg3β处理前后细胞中PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ等转录因子的磷酸化水平；
1.6.2、分别使用PU.1、STAT6、IRF4、PPARγ siRNAs或转录抑制剂预处理Mφ细胞，再加入250 ng/mL的Reg3β，重复上述步骤1.3~1.5，观察对Mφ表型、功能及N2-HMGB1表达的影响，探讨Reg3β调控Mφ再编程的分子机制。
步骤2、体外研究HMGB1对心肌细胞去分化、增殖及Reg3β释放的影响及机制
2.1、HMGB1的分离与鉴定：从无血清培养的Mφ上清中经亲和层析分离、纯化HMGB1，经过LC-MS/MS分析，确定其糖基化修饰位点。
2.2、心肌细胞的分离、鉴定与处理：选择出生3-5d的小鼠，断颈处死，取心脏，用0.08％胶原酶II与0.125%胰酶等比混合后消化心肌组织，离心后种植于含有20%FBS的MEM培养基中；利用cTnT免疫荧光染色鉴定心肌细胞；分别用无关对照蛋白、250 ng/mL N2-HMGB1及250 ng/mL 重组HMGB1处理原代心肌细胞6 h、12 h、24 h后，进行以下分析。
2.3、HMGB1对心肌细胞去分化能力的影响：免疫荧光检测各处理组心肌细胞表面特异性去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2的表达。
2.4、HMGB1对心肌细胞增殖能力的影响：上述各处理组细胞固定后免疫荧光检测Ki67的表达，同时采用CFSE检测细胞的增殖能力。
2.5、HMGB1对去分化心肌细胞释放Reg3β的影响：Western blot检测各处理组心肌细胞培养上清中以及胞内Reg3β的表达。
2.6、HMGB1调控心肌细胞去分化与增殖的分子机制研究
2.6.1、Western blot检测各处理组心肌细胞中Erk1/2、Akt磷酸化水平以及GSK3β/β-catenin的表达；
2.6.2、分别使用ERK1/2抑制剂（U0126）、Akt抑制剂（Isobavachalcone）以及GSK-3β抑制剂（TWS119）预处理心肌细胞1h，再加入250ng/mL的N2-HMGB1，重复步骤2.3~2.5，观察对心肌细胞去分化能力、增殖能力及Reg3β释放的影响，探讨N2- HMGB1调控心肌细胞去分化与增殖的分子机制。
步骤三、体内验证Reg3β/ HMGB1环路调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制
3.1、构建单核/Mφ敲除小鼠（单核/Mφ-/-）、单核/Mφ细胞HMGB1敲除小鼠（HMGB1-/-）以及心肌细胞Reg3β敲除小鼠（Reg3β-/-）
3.1.1、单核/Mφ-/-小鼠构建：BALB/c小鼠以clodronate liposome（35 mg/kg/d）注射3d，敲除单核/Mφ；
3.1.2、Reg3β-/-小鼠的构建：分别构建αMHC-Cre、Reg3βLacZ/floxBALB/c小鼠，两者进行杂交获得Reg3β-/-BALB/c小鼠，即选择性敲除心肌细胞中Reg3β的小鼠。
3.1.3、HMGB1-/-小鼠的构建：分别构建CD11b-Cre、HMGB1LacZ/floxBALB/c小鼠，两者进行杂交获得HMGB1-/-BALB/c小鼠，即选择性敲除单核/Mφ中HMGB1的小鼠。
3.2、体内验证EAM小鼠去分化心肌细胞释放的Reg3β调控心肌浸润巨噬细胞再编程的作用和机制
3.2.1、分别在WT、Reg3β-/-、单核/Mφ-/--BALB/c基础上诱导EAM模型；
3.2.2、诱导EAM 21d后利用心脏超声和MRI分析LVAW和LVPW、LVEDD和LVESD评估左心室功能；
3.2.3、断颈处死小鼠，收集血清，取出心脏组织固定制作石蜡切片，备用；
3.2.4、HE染色观察心肌组织的病理改变，免疫荧光检测心肌细胞去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2的改变；
3.2.5、Sirius-red染色观察心肌纤维化程度，免疫荧光检测Mφ表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2的表达，观察心肌组织中Mφ的浸润情况；
3.2.6、细胞因子抗体芯片检测血清中ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1的水平，Western blot检测心肌组织iNOS、Arg1的表达；
3.2.7、ELISA检测血清中HMGB1的表达，LC-MS/MS分析其糖基化修饰。
3.2.8、Western blot检测去分化心肌细胞中PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ等转录因子的磷酸化水平。
3.3、体内验证EAM小鼠再编程巨噬细胞分泌的HMGB1调控心肌细胞去分化机制
3.3.1、分别在WT、HMGB1-/-BALB/c小鼠基础上构建EAM模型；
3.3.2、将小鼠分成以下几组处理：WT+生理盐水，WT+抗-HMGB1中和抗体，HMGB1-/-BALB/c+生理盐水，HMGB1-/-BALB/c+N2-HMGB1，HMGB1-/-BALB/c+ 重组HMGB1；
3.3.3、诱导EAM 21d后利用心脏超声心和MRI分析LVAW和LVPW、LVEDD和LVESD评估左心室功能；
3.3.4、断颈处死小鼠，收集血清，取出心脏组织固定制作石蜡切片，备用；
3.3.5、HE染色观察心肌组织的病理改变，免疫荧光检测心肌细胞去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2的改变；
3.3.6、Sirius-red染色观察心肌纤维化程度，免疫荧光检测Mφ表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2的表达，观察心肌组织中Mφ的浸润情况；
3.3.7、免疫荧光检测心肌组织ki67的表达，观察心肌细胞的增殖能力改变；
3.3.8、Western blot检测心肌组织与血清中Reg3β的表达；
3.3.9、Western blot检测心肌组织中Erk1/2、Akt磷酸化水平以及GSK3β/β-catenin的表达。
图3所示为本发明中Reg3β缺失对EAM后期心肌纤维化程度的影响示意图，在WT和Reg3β-/-BABL/c小鼠建立EAM模型。第21d，断颈处死小鼠，取心脏组织固定、切片，Sirius-red染色观察心肌纤维化的程度（40×）。对照组：为野生型BALB/c未诱导EAM；WT：为野生型BALB/c诱导EAM；Reg3β-/-：为Reg3β-/-BABL/c诱导EAM。**P<0.01，与对照组相比；***P<0.001，与对照组相比；#P<0.05，与WT相比。图3中，对照组：未处理BALB/c小鼠；WT：野生型BALB/c小鼠建立EAM模型；Reg3β -/-：Reg3β基因敲除BALB/c小鼠建立EAM模型。
图4所示为本发明中Reg3β诱导心肌浸润Mφ M2特征分子的表达示意图，分离EAM小鼠心肌浸润Mφ，分别以生理盐水、IL-4（阳性对照）、Reg3β（250 ng/mL）处理，qRT-PCR检测M2型 Mφ特征分子CD206、Fizz1、Ym1的表达。***P<0.001，**P<0.01，与对照组相比。
图5所示为本发明中Reg3β诱导心肌浸润Mφ Arg1的表达示意图，分别以生理盐水、IL-4、Reg3β（250 ng/mL）处理心肌浸润Mφ及巨噬细胞株ANA-1，qRT-PCR检测Mφ Arg1的表达。*P<0.05，与对照组相比；**P<0.01，与处理组相比。
图6所示为本发明中HMGB1诱导心肌细胞去分化标志分子的表达示意图，取出生3-5d的小鼠心脏，以胶原酶II联合胰酶消化分离心肌细胞，使用250ng/mL的HMGB1处理12h，qRT-PCR检测心肌去分化标志分子c-kit、RUNX1、DAB2的表达。*p<0.05，与对照组相比。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）体外研究Reg3β对EAM小鼠心肌浸润巨噬细胞再编程及分泌HMGB1的影响及机制；
（2）体外研究HMGB1对心肌细胞去分化、增殖及Reg3β释放的影响及机制；
（3）体内验证Reg3β/N2-HMGB1环路调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制。
2.根据权利要求1所述的Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，步骤（1）包括如下步骤：
（1-1）构建EAM小鼠模型，分离脾脏Ly6Chi单核细胞和Ly6ChiF4/80+细胞，体外以Reg3β处理；
（1-2）检测细胞表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2 的表达，观察ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的分泌；
（1-3）研究HMGB1的表达并鉴定其糖基化修饰，从而分析Reg3β对心肌浸润Mφ表型、功能再编程及HMGB1分泌的影响；
（1-4）检测PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ转录因子磷酸化水平，并观察使用相应的转录因子抑制剂或siRNA后对Mφ上述表型和功能的影响，研究Reg3β调控心肌浸润巨噬细胞再编程的机制。
3.根据权利要求2所述的Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，步骤（1-1）的具体步骤为：
（1-1-1）构建EAM小鼠模型：根据以往报道的方法建立EAM模型，即利用MyHC-α与CFA 1:1充分乳化后，分别在第0d、7d免疫BALB/c小鼠；
（1-1-2）分离Ly6Chi单核细胞和Ly6ChiF4/80+细胞：分离EAM小鼠脾脏Ly6Chi单核细胞、Ly6ChiF4/80+细胞，并用250 ng/mL Reg3β处理。
4.根据权利要求2所述的Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，步骤（1-2）的具体步骤为：
（1-2-1）Reg3β对Mφ表型的影响：流式细胞术检测Reg3β处理前后细胞表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2的表达变化；
（1-2-2）Reg3β对Mφ分泌功能的影响：采用RayBiotech公司细胞因子抗体芯片检测细胞培养上清中ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1的分泌；Western blot检测细胞iNOS、Arg1的表达。
5.根据权利要求2所述的Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，步骤（1-3）的详细步骤为：Reg3β对Mφ分泌HMGB1的影响：ELISA检测细胞培养上清中HMGB1的水平，LC-MS/MS鉴定HMGB1糖基化修饰。
6.根据权利要求2所述的Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，步骤（1-4）中Reg3β调控心肌浸润巨噬细胞再编程的机制的具体步骤为：
（1-4-1）Western blot检测Reg3β处理前后细胞中PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ转录因子的磷酸化水平；
（1-4-2）分别使用PU.1、STAT6、IRF4、PPARγ siRNAs或转录抑制剂预处理Mφ细胞，再加入250 ng/mL的Reg3β，重复步骤（1-2）~（1-3），观察对Mφ表型、功能及N2-HMGB1表达的影响，探讨Reg3β调控Mφ再编程的分子机制。
7.根据权利要求1所述的Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，步骤（2）包括如下步骤：
（2-1）从无血清培养的Mφ上清中经亲和层析分离和鉴定HMGB1，处理出生3-5天小鼠的心肌细胞；
（2-2）检测心肌细胞特异性去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2以及细胞内和培养上清中Reg3β的表达，观察细胞增殖能力的变化；
（2-3）分析HMGB1对小鼠心肌细胞去分化、增殖及Reg3β表达的影响；
（2-4）检测信号通路分子ERK1/2、Akt分子的磷酸化情况以及GSK3β/β-catenin的表达，并观察使用相应信号分子拮抗剂或siRNA后对心肌细胞上述去分化标志表达和增殖能力的影响，研究HMGB1调控心肌细胞去分化/增殖的机制。
8.根据权利要求7所述的Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，
步骤（2-1）的具体步骤为：
（2-1）HMGB1的分离与鉴定：从无血清培养的Mφ上清中经亲和层析分离、纯化HMGB1，经过LC-MS/MS分析，确定其糖基化修饰位点；
（2-2）心肌细胞的分离、鉴定与处理：选择出生3-5d的小鼠，断颈处死，取心脏，用0.08％胶原酶II与0.125%胰酶等比混合后消化心肌组织，离心后种植于含有20%FBS的MEM培养基中；利用cTnT免疫荧光染色鉴定心肌细胞；分别用无关对照蛋白、250 ng/mL N2-HMGB1及250 ng/mL 重组HMGB1处理原代心肌细胞6 h、12 h、24 h后，进行以下分析；
步骤（2-2）的具体步骤为：HMGB1对心肌细胞去分化能力的影响：免疫荧光检测各处理组心肌细胞表面特异性去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2的表达；
步骤（2-3）的具体步骤为：
（2-3-1）HMGB1对心肌细胞增殖能力的影响：上述各处理组细胞固定后免疫荧光检测Ki67的表达，同时采用CFSE检测细胞的增殖能力；
（2-3-2）HMGB1对去分化心肌细胞释放Reg3β的影响：Western blot检测各处理组心肌细胞培养上清中以及胞内Reg3β的表达；
步骤（2-4）中HMGB1调控心肌细胞去分化与增殖的分子机制研究包括如下步骤：
（2-4-1）Western blot检测各处理组心肌细胞中Erk1/2、Akt磷酸化水平以及GSK3β/β-catenin的表达；
（2-4-2）分别使用ERK1/2抑制剂、Akt抑制剂以及GSK-3β抑制剂预处理心肌细胞1h，再加入250ng/mL的N2-HMGB1，重复步骤（2-2）~（2-3），观察对心肌细胞去分化能力、增殖能力及Reg3β释放的影响，探讨N2- HMGB1调控心肌细胞去分化与增殖的分子机制。
9.根据权利要求1所述的Reg3β/ HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，步骤（3）包括如下步骤：
（3-1）分别构建αMHC-Cre、Reg3βLacZ/flox、CD11b-Cre、HMGB1LacZ/flox BALB/c小鼠，前两者杂交获得Reg3β-/-BALB/c小鼠，后两者杂交获得HMGB1-/-BALB/c小鼠；
（3-2）分别在WT、Reg3β-/-、单核/Mφ-/-及HMGB1-/-BALB/c小鼠基础上诱导EAM模型，21天后采用心脏超声和MRI检测左心室功能；
（3-3）取各组小鼠心脏组织行HE染色和Sirius-red染色分别观察心肌病理改变和纤维化程度，检测心肌细胞RUNX1、cKIT、DAB2特异性去分化标志、Reg3β的表达以及ERK1/2、Akt、GSK3β/β-catenin信号通路的活化情况；
（3-4）观察心肌组织Mφ浸润，检测Mφ表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2的表达、分泌HMGB1、ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的功能、HMGB1的糖基化修饰情况以及PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ相关转录因子的磷酸化水平变化，从而在体内验证Reg3β/N2-HMGB1调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制。
10.根据权利要求9所述的Reg3β/ HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，
步骤（3-1）包括：构建单核/Mφ敲除小鼠、单核/Mφ细胞HMGB1敲除小鼠以及心肌细胞Reg3β敲除小鼠；具体步骤为：
（3-1-1）单核/Mφ-/-小鼠构建：BALB/c小鼠以clodronate liposome注射3d，敲除单核/Mφ；
（3-1-2）Reg3β-/-小鼠的构建：分别构建αMHC-Cre、Reg3βLacZ/floxBALB/c小鼠，两者进行杂交获得Reg3β-/-BALB/c小鼠，即选择性敲除心肌细胞中Reg3β的小鼠；
（3-1-3）HMGB1-/-小鼠的构建：分别构建CD11b-Cre、HMGB1LacZ/floxBALB/c小鼠，两者进行杂交获得HMGB1-/-BALB/c小鼠，即选择性敲除单核/Mφ中HMGB1的小鼠；
步骤（3-2）包括：体内验证EAM小鼠去分化心肌细胞释放的Reg3β调控心肌浸润巨噬细胞再编程的作用和机制；具体步骤为：
（3-2-1）分别在WT、Reg3β-/-、单核/Mφ-/-ALB/c基础上诱导EAM模型；
（3-2-2）诱导EAM 21d后利用心脏超声和MRI分析LVAW和LVPW、LVEDD和LVESD评估左心室功能；
步骤（3-3）的具体步骤为：
（3-3-1） 断颈处死小鼠，收集血清，取出心脏组织固定制作石蜡切片，备用；
（3-3-2）HE染色观察心肌组织的病理改变，免疫荧光检测心肌细胞去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2的改变；
（3-3-3）Sirius-red染色观察心肌纤维化程度，免疫荧光检测Mφ表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin1/2的表达，观察心肌组织中Mφ的浸润情况；
（3-3-4）细胞因子抗体芯片检测血清中ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1的水平，Western blot检测心肌组织iNOS、Arg1的表达；
（3-3-5）ELISA检测血清中HMGB1的表达，LC-MS/MS分析其糖基化修饰；
（3-3-6）Western blot检测去分化心肌细胞中PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ等转录因子的磷酸化水平；
步骤（3-4）中体内验证EAM小鼠再编程巨噬细胞分泌的HMGB1调控心肌细胞去分化机制的具体步骤为：
（3-4-1）分别在WT、HMGB1-/-BALB/c小鼠基础上构建EAM模型；
（3-4-2）将小鼠分成以下几组处理：WT+生理盐水，WT+抗-HMGB1中和抗体，HMGB1-/-BALB/c+生理盐水，HMGB1-/-BALB/c+N2-HMGB1，HMGB1-/-BALB/c+ 重组HMGB1；
（3-4-3）诱导EAM 21d后利用心脏超声心和MRI分析LVAW和LVPW、LVEDD和LVESD评估左心室功能；
（3-4-4）断颈处死小鼠，收集血清，取出心脏组织固定制作石蜡切片，备用；
（3-4-5）HE染色观察心肌组织的病理改变，免疫荧光检测心肌细胞去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2的改变；
（3-4-6）Sirius-red染色观察心肌纤维化程度，免疫荧光检测Mφ表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin1/2的表达，观察心肌组织中Mφ的浸润情况；
（3-4-7）免疫荧光检测心肌组织ki67的表达，观察心肌细胞的增殖能力改变；
（3-4-8）Western blot检测心肌组织与血清中Reg3β的表达；
（3-4-9）Western blot检测心肌组织中Erk1/2、Akt磷酸化水平以及GSK3β/β-catenin的表达。
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