CN109929803A - 一种巨噬细胞极化抑制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种巨噬细胞极化抑制剂及其应用，现提出如下方案，一种巨噬细胞极化抑制剂Dnmt3aos、一种包含有权利要求1所述的抑制剂Dnmt3aos的试剂盒以及一种巨噬细胞极化抑制剂Dnmt3aos的应用。本发明表明Dnmt3aos在巨噬细胞极化中起着至关重要的作用，明确Dnmt3aos‑Dnmt3a轴介导的DNA异常甲基化可能在巨噬细胞极化中起关键作用，将丰富对巨噬细胞极化机制的理解，为研究巨噬细胞极化提供理论数据支持。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种巨噬细胞极化抑制剂及其应用。
背景技术
巨噬细胞作为免疫系统的重要组分，普遍存在于血液、淋巴和组织中，具有明显的异质性和可塑性，在体内外微环境影响下，极化成不同的表型，呈现出不同的功能。根据激活方式和分泌的细胞因子不同，巨噬细胞主要分为经典激活(Classically activatedmacrophage,M1)和替代激活(Alternatively activated macrophage,M2)两大类型：M1型巨噬细胞可由脂多糖(lipopolysaceharides,LPS)和干扰素γ(IFN-γ)以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)诱导形成，通过释放高水平的促炎因子如白细胞介素-12(interleukin 12,IL-12)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和氧化代谢物如一氧化氮(nitric oxide,NO)，并高表达抗原呈递必需的细胞表面分子包括MHCⅡ及协同刺激分子CD80和CD86参与诱导Th1型免疫应答，直接吞噬和杀伤病原微生物或肿瘤细胞；而M2型巨噬细胞则由Th2型细胞因子(如IL-4、IL-13等)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导形成，通过分泌免疫抑制性细胞因子如IL-10和转化生长因子β(transforminggrowth factorβ,TGF-β)等发挥免疫调节的作用，并高表达精氨酸酶1(Arginase 1,Arg-1)、类几丁质酶3样分子3(chitinase 3-like 3,Chi3l3或称YM1)和类抵抗素α(resistin-like-α,Retnlα或称Fizz1)分子，参与寄生虫感染、组织修复、血管生成和肿瘤进展等。鉴于巨噬细胞的重要作用，深入研究调控巨噬细胞极化的分子机制，将增进我们对不同类型免疫相关疾病发生、发展机制的理解，为此类疾病的治疗提供一个新的方向。然而，巨噬细胞极化的调控机制还有待进一步阐明。
LncRNA是目前各研究领域的一个热点。lncRNA指的是长度＞200nt的RNA分子，结构上与mRNA有一定程度的相似性，但不编码蛋白，是一种保守性较低的非编码RNA，其在转录沉默和激活、染色体修饰、核内运输等过程均具有重要功能，最近的研究证实lncRNA与巨噬细胞的分化和活化有关。表观遗传学调控的基因表达在细胞分化、发育过程中至关重要，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰(甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化)、RNA干扰等。DNA甲基转移酶(DNMT)3a和3b催化DNA甲基化，其中，胞嘧啶在CpG二核苷酸上的DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰，CpG常常富集在基因的启动子区。低甲基化基因的启动子通常与转录活性基因相关，而DNA高甲基化可导致基因沉默。然而，到目前为止，关于表观遗传修饰在巨噬细胞极化中的作用报道很少。最近研究发现，组蛋白甲基化和Dnmt3b介导的DNA甲基化与巨噬细胞极化有关。然而，目前尚未有研究报道lncRNA调控Dnmt3a表达介导的DNA甲基化修饰在巨噬细胞极化过程中的作用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的缺点，而提出的一种巨噬细胞极化抑制剂及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种巨噬细胞极化抑制剂Dnmt3aos，其序列号如表1所示。
一种包含有权利要求1所述抑制剂Dnmt3aos的试剂盒。
一种巨噬细胞极化抑制剂Dnmt3aos的应用，包含以下步骤，其步骤如下：
S1:体外制备了M1和M2巨噬细胞
从BALB/c小鼠的股骨和胫骨中分离获得骨髓细胞，在L929条件培养基诱导下诱导成BMDM，并用LPS和IFN-γ刺激获得M1，利用IL-4刺激获得M2巨噬细胞；然后运用基因芯片技术，选择具有至少两倍表达差异并且P值<0.05的差异lncRNAs的巨噬细胞。
S2:检测Dnmt3aos在巨噬细胞的表达
分别提取BMDM细胞的细胞核和细胞质RNA，利用RT-qPCR技术检测Dnmt3aos在核质中的表达水平。
S3:Dnmt3aos在巨噬细胞再极化实验
分别用LPS/IFN-γ和IL-4处理S1步骤中具有M1和M2表型的巨噬细胞，使其重新极化为M2和M1表型，然后检测M1/M2巨噬细胞中的iNOS和Arg1标志基因的表达情况。
S4:Dnmt3aos表达与巨噬细胞极化实验
利用S3步骤中被Dnmt3aos极化的巨噬细胞，检测Dnmt3aos在巨噬细胞当中的Dnmt3aos的表达；
利用siRNA分别抑制Dnmt3aos和Dnmt3a的表达，运用RT-qPCR和WB技术分别检测巨噬细胞中Dnmt3aos和Dnmt3a的基因以及蛋白表达。
S5:1.Dnmt3aos的体外功能实验
利用siRNA抑制巨噬细胞中Dnmt3aos的表达，然后结合M1/M2巨噬细胞体外极化模型来观察Dnmt3aos在巨噬细胞极化中的功能。
本发明的有益效果：
该发明通过利用巨噬细胞极化抑制剂对巨噬细胞的极化实验，表明Dnmt3aos在巨噬细胞极化中起着至关重要的作用，以及Dnmt3aos的体外功能实验，明确Dnmt3aos-Dnmt3a轴介导的DNA异常甲基化可能在巨噬细胞极化中起关键作用，将丰富对巨噬细胞极化机制的理解，为研究巨噬细胞极化提供理论数据支持。
附图说明
图1为采用real-time PCR技术检测BMDM细胞中抑制Dnmt3aos后Dnmt3aos mRNA的相对表达的示意图。
图2为采用ELISA技术检测抑制BMDM中Dnmt3aos表达后，利用LPS/IFN-γ刺激24H后细胞上清中NO的含量的示意图；
图3为real-time PCR技术检测抑制BMDM中Dnmt3aos表达后，利用LPS/IFN-γ刺激24H后，M1巨噬细胞相关标志物INOS、TNF-α、IL-12的表达的示意图
图4为试剂盒检测抑制BMDM中Dnmt3aos表达后，IL-4刺激24H后细胞裂解液中Urea的含量的示意图；
图5为real-time PCR技术检测抑制BMDM中Dnmt3aos表达后，IL-4刺激24H后，M2巨噬细胞相关标志物Arg1、YM1、FIZZ1的表达的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-5，一种巨噬细胞极化抑制剂Dnmt3aos，其序列号如表1所示。
表1：
一种包含有权利要求1所述抑制剂Dnmt3aos的试剂盒。
一种巨噬细胞极化抑制剂Dnmt3aos的应用，包含以下步骤，其步骤如下：
S1:体外制备了M1和M2巨噬细胞
从BALB/c小鼠的股骨和胫骨中分离获得骨髓细胞，在L929条件培养基诱导下诱导成BMDM，并用LPS和IFN-γ刺激获得M1，利用IL-4刺激获得M2巨噬细胞；然后运用基因芯片技术，选择具有至少两倍表达差异并且P值<0.05的差异lncRNAs的巨噬细胞。
S2:检测Dnmt3aos在巨噬细胞的表达
分别提取BMDM细胞的细胞核和细胞质RNA，利用RT-qPCR技术检测Dnmt3aos在核质中的表达水平。
S3:Dnmt3aos在巨噬细胞再极化实验
分别用LPS/IFN-γ和IL-4处理S1步骤中具有M1和M2表型的巨噬细胞，使其重新极化为M2和M1表型，然后检测M1/M2巨噬细胞中的iNOS和Arg1标志基因的表达情况。
S4:Dnmt3aos表达与巨噬细胞极化实验
利用S3步骤中被Dnmt3aos极化的巨噬细胞，检测Dnmt3aos在巨噬细胞当中的Dnmt3aos的表达；
利用siRNA分别抑制Dnmt3aos和Dnmt3a的表达，运用RT-qPCR和WB技术分别检测巨噬细胞中Dnmt3aos和Dnmt3a的基因以及蛋白表达。
S5:1.Dnmt3aos的体外功能实验
利用siRNA抑制巨噬细胞中Dnmt3aos的表达，然后结合M1/M2巨噬细胞体外极化模型来观察Dnmt3aos在巨噬细胞极化中的功能。
该发明：
通过利用巨噬细胞极化抑制剂对巨噬细胞的极化实验，表明Dnmt3aos在巨噬细胞极化中起着至关重要的作用，以及Dnmt3aos的体外功能实验，明确Dnmt3aos-Dnmt3a轴介导的DNA异常甲基化可能在巨噬细胞极化中起关键作用，将丰富对巨噬细胞极化机制的理解，为研究巨噬细胞极化提供理论数据支持。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种巨噬细胞极化抑制剂Dnmt3aos，其序列号如表1所示。
2.一种包含有权利要求1所述抑制剂Dnmt3aos的试剂盒。
3.一种巨噬细胞极化抑制剂Dnmt3aos的应用，包含以下步骤，其步骤如下：
S1:体外制备了M1和M2巨噬细胞
从BALB/c小鼠的股骨和胫骨中分离获得骨髓细胞，在L929条件培养基诱导下诱导成BMDM，并用LPS和IFN-γ刺激获得M1，利用IL-4刺激获得M2巨噬细胞；然后运用基因芯片技术，选择具有至少两倍表达差异并且P值<0.05的差异lncRNAs的巨噬细胞。
S2:检测Dnmt3aos在巨噬细胞的表达
分别提取BMDM细胞的细胞核和细胞质RNA，利用RT-qPCR技术检测Dnmt3aos在核质中的表达水平。
S3:Dnmt3aos在巨噬细胞再极化实验
分别用LPS/IFN-γ和IL-4处理S1步骤中具有M1和M2表型的巨噬细胞，使其重新极化为M2和M1表型，然后检测M1/M2巨噬细胞中的iNOS和Arg1标志基因的表达情况。
S4:Dnmt3aos表达与巨噬细胞极化实验
利用S3步骤中被Dnmt3aos极化的巨噬细胞，检测Dnmt3aos在巨噬细胞当中的Dnmt3aos的表达；
利用siRNA分别抑制Dnmt3aos和Dnmt3a的表达，运用RT-qPCR和WB技术分别检测巨噬细胞中Dnmt3aos和Dnmt3a的基因以及蛋白表达。
S5:1.Dnmt3aos的体外功能实验
利用siRNA抑制巨噬细胞中Dnmt3aos的表达，然后结合M1/M2巨噬细胞体外极化模型来观察Dnmt3aos在巨噬细胞极化中的功能。
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| CN109929803A true CN109929803A (zh) | 2019-06-25 |
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| CN201910193246.8A Pending CN109929803A (zh) | 2019-03-14 | 2019-03-14 | 一种巨噬细胞极化抑制剂及其应用 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN109929803A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110484615A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-22 | 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） | lncRNA在病毒性心肌炎中调控巨噬细胞极化的应用 |
| CN113197880A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-08-03 | 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） | 一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用 |
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2019
- 2019-03-14 CN CN201910193246.8A patent/CN109929803A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110484615A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-22 | 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） | lncRNA在病毒性心肌炎中调控巨噬细胞极化的应用 |
| CN110484615B (zh) * | 2019-08-27 | 2021-11-02 | 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） | lncRNA在病毒性心肌炎中调控巨噬细胞极化的应用 |
| CN113197880A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-08-03 | 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） | 一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用 |
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