CN109487000A - 引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组合及其应用。本发明公开了一种用于念珠菌属的5种念珠菌LAMP引物组合及其应用。本发明提供的引物组合，由SEQ ID No.1～28所示的28条引物组成。本发明提供的引物组合可应用于检测是否含有白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和/或光滑念珠菌，可应用于检测待测样本中是否含有白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和/或光滑念珠菌。本发明提供的引物组合鉴定用于念珠菌属的5种念珠菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组合及其应用。
背景技术
侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)又称侵袭性真菌感染(invasivefungal infection，IFI)、深部真菌感染(deep fungal infection,DFI)，是指真菌侵入人体组织、血液，在其中生长和繁殖，引起炎症反应，并导致组织损害、器官功能障碍的病理生理过程。近二三十年来，随着实体器官和造血干细胞移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂等新技术在临床中的广泛应用，使侵袭性真菌病的发病率和病死率逐年升高，已日益成为导致住院患者死亡的主要原因之一。由于感染侵袭性真菌病多发于入住ICU，高龄，糖尿病，恶性血液系统疾病，念珠菌定植，侵袭性操作，应用抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂等人群中，其机体免疫力低下，重症死亡率高，因此对侵袭性真菌感染的早期检测及确定感染菌种有极为重要的意义。
念珠菌病通常由念珠菌(Candida)导致，该病可发生于口腔、咽喉、阴道或血管中。念珠菌属是人体内最大的真菌正常菌群，也是机会真菌或条件致病真菌中最常见者，其所致疾病在侵袭性真菌病中排首位，其中念珠菌血流感染占医院获得性血流感染中的第四位，病死率可高达39.2％(ICU 47.1％)。主要引起人类感染者主要为白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌等。
现有的侵袭性真菌感染检测方法主要包括常规检查法和特殊检查法两种。其中常规检查法主要包括：1)真菌显微镜检，即直接涂片染色镜检；2)真菌培养鉴定；3)组织病理学检查。特殊检查法主要包括：1)血清学检查；2)分子生物学检查。其中常规检查法仍被视为确诊侵袭性真菌感染的基石，但其存在敏感度较低，操作繁复，阴性结果不能排除诊断，检测周期较长(通常需要几天到几周的时间)等问题，而导致延误病情及用药，增加死亡率等；血清学检测难以排除真菌某些属的种间抗原抗体交叉反应从而导致误判。相较前两种方法，分子生物学技术具有高特异性和高准确性的优点，并可从基因水平阐明真菌种群之间和中内的分类学关系，因而在近年来越来越得到广泛认可和应用。目前建立的相关分子学诊断方法有普通PCR方法、脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、实时荧光定量PCR技术(RTFQ-PCR)等，其共有的问题是对实验操作要求较高，检测时间较长(2.5h-3h)左右。因此，建立快速准确的分子诊断方法，为临床提供早期诊疗依据是解决现状的关键。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种引物组合及其应用。引物组合鉴定用于检测常见的五种念珠菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)、由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ组成；
(a2)、由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ和所述引物组Ⅴ中的一个或两个以上的组合物组成；
(a3)、包括所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ和所述引物组Ⅴ；
其中所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；
所述引物Ⅰ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b1)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(b2)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b3)、与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b4)、如(b1)、(b2)或(b3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b5)、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(b6)、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b7)、与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b8)、如(b5)、(b6)或(b7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b9)、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
(b10)、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b11)、与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b12)、如(b9)、(b10)或(b11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b13)、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
(b14)、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b15)、与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b16)、如(b13)、(b14)或(b15)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b17)、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
(b18)、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b19)、与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b20)、如(b17)、(b18)或(b19)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b21)、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
(b22)、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b23)、与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b24)、如(b21)、(b22)或(b23)所示序列的互补序列；
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP和引物Ⅱ-BIP组成；
所述引物Ⅱ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(c1)、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
(c2)、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(c3)、与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(c4)、如(c1)、(c2)或(c3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅱ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(c5)、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
(c6)、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(c7)、与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(c8)、如(c5)、(c6)或(c7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅱ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(c9)、具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
(c10)、具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(c11)、与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(c12)、如(c9)、(c10)或(c11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅱ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(c13)、具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
(c14)、具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(c15)、与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(c16)、如(c13)、(c14)或(c15)所示序列的互补序列；
所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成；
所述引物Ⅲ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d1)、具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
(d2)、具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d3)、与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d4)、如(d1)、(d2)或(d3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d5)、具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
(d6)、具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d7)、与SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d8)、如(d5)、(d6)或(d7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d9)、具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
(d10)、具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d11)、与SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d12)、如(d9)、(d10)或(d11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d13)、具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
(d14)、具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d15)、与SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d16)、如(d13)、(d14)或(d15)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d17)、具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
(d18)、具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d19)、与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d20)、如(d17)、(d18)或(d19)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d21)、具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
(d22)、具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d23)、与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d24)、如(d21)、(d22)或(d23)所示序列的互补序列；
所述引物组Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成；
所述引物Ⅳ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e1)、具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；
(e2)、具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e3)、与SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e4)、如(e1)、(e2)或(e3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e5)、具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；
(e6)、具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e7)、与SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e8)、如(e5)、(e6)或(e7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e9)、具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列；
(e10)、具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e11)、与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e12)、如(e9)、(e10)或(e11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e13)、具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；
(e14)、具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e15)、与SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e16)、如(e13)、(e14)或(e15)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e17)、具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；
(e18)、具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e19)、与SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e20)、如(e17)、(e18)或(e19)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e21)、具有SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列；
(e22)、具有SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e23)、与SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e24)、如(e21)、(e22)或(e23)所示序列的互补序列；
所述引物组Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB组成；
所述引物Ⅴ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f1)、具有SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列；
(f2)、具有SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f3)、与SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f4)、如(f1)、(f2)或(f3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f5)、具有SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列；
(f6)、具有SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f7)、与SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f8)、如(f5)、(f6)或(f7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f9)、具有SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列；
(f10)、具有SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f11)、与SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f12)、如(f9)、(f10)或(f11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f13)、具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列；
(f14)、具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f15)、与SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f16)、如(f13)、(f14)或(f15)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f17)、具有SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列；
(f18)、具有SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f19)、与SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f20)、如(f17)、(f18)或(f19)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f21)、具有SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列；
(f22)、具有SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f23)、与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f24)、如(f21)、(f22)或(f23)所示序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组Ⅰ中所述引物Ⅰ-F3、所述引物Ⅰ-B3、所述引物Ⅰ-FIP、所述引物Ⅰ-BIP、所述引物Ⅰ-LF和所述引物Ⅰ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
所述引物组Ⅱ中所述引物Ⅱ-F3、所述引物Ⅱ-B3、所述引物Ⅱ-FIP、所述引物Ⅱ-BIP、所述引物Ⅱ-LF和所述引物Ⅱ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
所述引物组Ⅲ中所述引物Ⅲ-F3、所述引物Ⅲ-B3、所述引物Ⅲ-FIP、所述引物Ⅲ-BIP、所述引物Ⅲ-LF和所述引物Ⅲ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
所述引物组Ⅳ所述引物Ⅳ-F3、所述引物Ⅳ-B3、所述引物Ⅳ-FIP、所述引物Ⅳ-BIP、所述引物Ⅳ-LF和所述引物Ⅳ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
所述引物组Ⅴ所述引物Ⅴ-F3、所述引物Ⅴ-B3、所述引物Ⅴ-FIP、所述引物Ⅴ-BIP、所述引物Ⅴ-LF和所述引物Ⅴ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。
本发明还提供了所述的引物组合在扩增白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌的核酸分子中的应用。
本发明还提供了所述的引物组合在检测和/或鉴定白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌中的应用。
本发明还提供了所述的引物组合在制备检测和/或鉴定白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌的试剂盒中的应用。
本发明还提供了包括所述的引物组合的试剂盒，所述试剂盒的用途包括：
Ⅰ、鉴定白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌；
Ⅱ、检测待测样本中是否含有白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌。
本发明还提供了一种鉴定白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌的方法，包括如下步骤：
(1)获得待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用所述的引物组合中的引物进行环介导等温扩增，获得扩增结果；
(3)根据所述扩增结果获得鉴定结果。
在本发明的一些具体实施方案中，如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有白色念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有近平滑念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有热带念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有克柔念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有光滑念珠菌。
本发明还提供了一种检测待测样本中是否含有稻根霉菌、伞状毛霉菌、卷枝毛霉菌和/或微小根毛霉的方法，包括如下步骤：
(1)获得待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用所述的引物组合中的引物进行环介导等温扩增，获得扩增结果；
(3)根据所述扩增结果获得检测结果。
在本发明的一些具体实施方案中，如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有白色念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有近平滑念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有热带念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有克柔念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有光滑念珠菌。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组Ⅰ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅰ-F3、0.5μmol所述引物Ⅰ-B3、2.0μmol所述引物Ⅰ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅰ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅰ-LF和1.0μmol所述引物Ⅰ-LB；
所述引物组Ⅱ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅱ-F3、0.5μmol所述引物Ⅱ-B3、2.0μmol所述引物Ⅱ-FIP和2.0μmol所述引物Ⅱ-BIP；
所述引物组Ⅲ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅲ-F3、0.5μmol所述引物Ⅲ-B3、2.0μmol所述引物Ⅲ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅲ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅲ-LF和1.0μmol所述引物Ⅲ-LB。
所述引物组Ⅳ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅳ-F3、0.5μmol所述引物Ⅳ-B3、2.0μmol所述引物Ⅳ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅳ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅳ-LF和1.0μmol所述引物Ⅳ-LB。
所述引物组Ⅴ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅴ-F3、0.5μmol所述引物Ⅴ-B3、2.0μmol所述引物Ⅴ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅴ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅴ-LF和1.0μmol所述引物Ⅴ-LB。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒还可包括反应液，所述反应液具体可为博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅰ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅱ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP和引物Ⅱ-BIP的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅲ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅳ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅴ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温50min。
所述待测样本可为人(Homo sapiens)的痰液。
本发明中，所述实现环介导等温扩增具体可体现为：在利用荧光定量PCR进行检测时可出现环介导等温扩增曲线。所述环介导等温扩增曲线可为为典型的“S型”扩增曲线。
本发明还保护所述引物组合在检测待测菌是否含有白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌中的应用。
本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌中的应用。
本发明中，白色念珠菌的菌株号为CGMCC2.2086。光滑念珠菌的菌株号为CGMCC3.08115。近平滑念珠菌的菌株号为CICC1257。热带念珠菌的菌株号为CICC1272。克柔念珠菌的菌株号为CICC1273。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的碳青霉烯类耐药基因。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。
本发明的反应体系配比为：反应体系10μL：(6.7～7.3)μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、(0.8～1.2)μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。
本发明提供的引物组合鉴定用于检测常见的五种念珠菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2中采用引物组Ⅰ的检测结果；
图2示实施例2中采用引物组Ⅱ的检测结果；
图3示实施例2中采用引物组Ⅲ的检测结果；
图4示实施例2中采用引物组Ⅳ的检测结果；
图5示实施例2中采用引物组Ⅴ的检测结果；
图6～图24示实施例3中反应体系1至反应体系15的检测结果；
图25～图29示实施例4中反应体系1至反应体系5的检测结果；
图30～图34示实施例5中样本一至样本五的检测结果；
图35示对比试验中本发明提供的引物对白色念珠菌检测的灵敏度结果；
图36示对比试验中对比引物对白色念珠菌检测的灵敏度结果；
图37示对比试验中本发明提供的引物对白色念珠菌检测的特异性结果；
图38示对比试验中对比引物对白色念珠菌检测的特异性结果；
图39示对比试验中本发明提供的引物对热带念珠菌检测的灵敏度结果；
图40示对比试验中对比引物对热带念珠菌检测的灵敏度结果；
图41示对比试验中本发明提供的引物对热带念珠菌检测的特异性结果；
图42示对比试验中对比引物对热带念珠菌检测的特异性结果；
图43示对比试验中本发明提供的引物对近平滑念珠菌检测的灵敏度结果；
图44示对比试验中对比引物对近平滑念珠菌检测的灵敏度结果；
图45示对比试验中本发明提供的引物对近平滑念珠菌检测的特异性结果；
图46示对比试验中对比引物对近平滑念珠菌检测的特异性结果；
图47示对比试验中本发明提供的引物对光滑念珠菌检测的灵敏度结果；
图48示对比试验中对比引物对光滑念珠菌检测的灵敏度结果；
图49示对比试验中本发明提供的引物对光滑念珠菌检测的特异性结果；
图50示对比试验中对比引物对光滑念珠菌检测的特异性结果；
图51示对比试验中本发明提供的引物对克柔念珠菌检测的灵敏度结果；
图52示对比试验中对比引物对克柔念珠菌检测的灵敏度结果；
图53示对比试验中本发明提供的引物对克柔念珠菌检测的特异性结果；
图54示对比试验中对比引物对克柔念珠菌检测的特异性结果。
具体实施方式
本发明公开了一种引物组合及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的引物组合及其应用中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
反应液为博奥生物集团有限公司产品，产品目录号为CP.440020。
DNA拷贝数的计算方法如下：
1 A260吸光度值＝ds DNA 50μg/ml；
核酸浓度＝(OD260)×(稀释倍数)×(50)＝x ng/μl；
平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；
摩尔＝6.02×1023；
平均分子量(MW):dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；
拷贝数计算公式:
(6.02×1023copies/摩尔)×(x ng/μl×10-9)/(DNA长度×660)＝copies/μl。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ的制备
试剂盒由五个LAMP引物组组成，每个引物组用于检测一种念珠菌。
用于检测白色念珠菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(SEQ ID No.1)：GTAATATGAATTGCAGAT；
外引物B3(SEQ ID No.2)：CCATTGTCAAAGCG；
内引物FIP(SEQ ID No.3)：
GCATGCCCTCCGGAATACTCGTGAATCATCGAATCTTT；
内引物BIP(SEQ ID No.4)：CGTCGTTTCTCCCTCAAACCGCCTTACCACTACC；
环引物LF(SEQ ID No.5)：AGAGGGCGCAATGT；
环引物LB(SEQ ID No.6)：TGTTGAGCAATACGACTTGGG。
用于检测近平滑念珠菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(SEQ ID No.7)：GAAGATTCTATTACTGATTGG；
外引物B3(SEQ ID No.8)：CTTTTACCCCATTGCA；
内引物FIP(SEQ ID No.9)：CCAACCCTCAATGCTTTTATCACCATTTTTGATGAAG；
内引物BIP(SEQ ID No.10)：
GACTCGACAAATTTGAAGACCTGAATGAGAGAAGTTCTGG。
用于检测热带念珠菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(SEQ ID No.11)：GAGCGTCATTTCTCC；
外引物B3(SEQ ID No.12)：GCTTATTGATATGCTTAAGTTC；
内引物FIP(SEQ ID No.13)：CTTAAAATAAGTTTCCACGTTCCCCGGGTTTGGT；
内引物BIP(SEQ ID No.14)：
AACGCTTATTTTGCTAGTGAGTCCTACCTGATTTGAG；
环引物LF(SEQ ID No.15)：CAAACCTAGCGTATT；
环引物LB(SEQ ID No.16)：GCCACCACAATT。
用于检测克柔念珠菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(SEQ ID No.17)：GGATCTCTTGGTTCT；
外引物B3(SEQ ID No.18)：TCGCTCCCTTTCAG；
内引物FIP(SEQ ID No.19)：
AAGAACTCGATGATTCACGATGAAGAGCGCAGCGAA；
内引物BIP(SEQ ID No.20)：GCCTGTTTGAGCGTCGTTTTACAGCGTCGTC；
环引物LF(SEQ ID No.21)：TTCACACTAGGTAT；
环引物LB(SEQ ID No.22)：TGCGCAGAGTTGGG。
用于检测光滑念珠菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(SEQ ID No.23)：TCTCTTGGTTCTCGCATC；
外引物B3(SEQ ID No.24)：CACATACTGATATGGCCTACA；
内引物FIP(SEQ ID No.25)：
CGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGGATGAAGAACGCAGCGAAAT；
内引物BIP(SEQ ID No.26)：
TCTGGTATTCCGGGGGGCATGAGAGTATCACTCACTACCAAAC；
环引物LF(SEQ ID No.27)：GCAATTCACATTACGTATCGC；
环引物LB(SEQ ID No.28)：TTGAGCGTCATTTCCTTCTC。
用于检测白色念珠菌的引物组命名为引物组Ⅰ。用于检测近平滑念珠菌的引物组命名为引物组Ⅱ。用于检测热带念珠菌的引物组命名为引物组Ⅲ。用于检测克柔念珠菌的引物组命名为引物组Ⅳ。用于检测光滑念珠菌的引物组命名为引物组Ⅴ。
检测念珠菌引物组合由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ组成，该引物组合中，各单链DNA各自独立包装。
引物组Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
引物组Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP的摩尔比为0.5：0.5：2：2；
引物组Ⅲ中，引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。
引物组Ⅳ中，引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。
引物组Ⅴ中，引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。
实施例2念珠菌引物组合的特异性
一、待测样本的制备
待测样本1：白色念珠菌基因组
待测样本2：近平滑念珠菌基因组
待测样本3：热带念珠菌基因组
待测样本4：克柔念珠菌基因组
待测样本5：光滑念珠菌基因组
二、待测样本的检测
各个待测样本分别进行如下步骤进行检测：
以步骤一的基因组为模板，分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ对步骤一制备的五个基因组—白色念珠菌基因组、近平滑念珠菌基因组、热带念珠菌基因组、克柔念珠菌基因组和光滑念珠菌基因组进行环介导等温扩增检测，每个引物组合均检测五种基因组。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ或引物组Ⅴ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
采用引物组Ⅰ的结果见图1。只有当待测样本为白色念珠菌基因组的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图1中白色念珠菌所指曲线和PC所指曲线)。当待测样本为待测样本2、3、4或5的时候均不显示阳性扩增曲线。图1中为待测样本1的结果；图1中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本2、待测样本3、待测样本4和待测样本5的结果，其余均为未添加模板的结果。
采用引物组Ⅱ的结果见图2。只有当待测样本为近平滑念珠菌基因组的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图2中近平滑念珠菌所指曲线和PC所指曲线)。当待测样本为待测样本1、3、4或5的时候均不显示阳性扩增曲线。图2中为待测样本2的结果；图2中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本1、待测样本3、待测样本4和待测样本5的结果，其余均为未添加模板的结果。
采用引物组Ⅲ的结果见图3。只有当待测样本为热带念珠菌基因组的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图3中热带念珠菌所指曲线和PC所指曲线)。当待测样本为待测样本1、2、4或5的时候均不显示阳性扩增曲线。图3中为待测样本3的结果；图3中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本1、待测样本2、待测样本4和待测样本5的结果，其余均为未添加模板的结果。
采用引物组Ⅳ的结果见图4。只有当待测样本为克柔念珠菌基因组的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图4中克柔念珠菌所指曲线和PC所指曲线)。当待测样本为待测样本1、2、3或5的时候均不显示阳性扩增曲线。图4中为待测样本4的结果；图4中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本1、待测样本2、待测样本3和待测样本5的结果，其余均为未添加模板的结果。
采用引物组Ⅴ的结果见图5。只有当待测样本为光滑念珠菌基因组的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图5中光滑念珠菌所指曲线和PC所指曲线)。当待测样本为待测样本1、2、3或4的时候均不显示阳性扩增曲线。图5中为待测样本5的结果；图5中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本1、待测样本2、待测样本3和待测样本4的结果，其余均为未添加模板的结果。
以上结果表明，本发明提供的念珠菌引物组合中的五个引物组分别对其靶标基因有很高的特异性。
实施例3念珠菌鉴定引物组合的灵敏性
待测样本1：实施例2的白色念珠菌基因组。
待测样本2：实施例2的近平滑念珠菌基因组。
待测样本3：实施例2的热带念珠菌基因组。
待测样本4：实施例2的克柔念珠菌基因组。
待测样本5：实施例2的光滑念珠菌基因组。
1、待测样本的基因组，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ或引物组Ⅴ进行环介导等温扩增。
待测样本为待测样本1时，采用引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本2时，采用引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本3时，采用引物组Ⅲ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本4时，采用引物组Ⅳ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本5时，采用引物组Ⅴ进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为103、5×102、102或101)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ或引物组Ⅴ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
根据稀释液中基因组拷贝数的不同，共如下15个反应体系：
反应体系1：1μL稀释液中含有的白色念珠菌基因组DNA拷贝数分别为103；
反应体系2：1μL稀释液中含有的白色念珠菌基因组DNA拷贝数分别为5×102；
反应体系3：1μL稀释液中含有的白色念珠菌基因组DNA拷贝数分别为102；
反应体系4：1μL稀释液中含有的白色念珠菌基因组DNA拷贝数分别为5×101；
反应体系5：1μL稀释液中含有的白色念珠菌基因组DNA拷贝数分别为2×101；
反应体系6：1μL稀释液中含有的近平滑念珠菌基因组DNA拷贝数分别为103；
反应体系7：1μL稀释液中含有的近平滑念珠菌基因组DNA拷贝数分别为5×102；
反应体系8：1μL稀释液中含有的近平滑念珠菌基因组DNA拷贝数分别为102；
反应体系9：1μL稀释液中含有的热带念珠菌基因组DNA拷贝数分别为103；
反应体系10：1μL稀释液中含有的热带念珠菌基因组DNA拷贝数分别为5×102；
反应体系11：1μL稀释液中含有的热带念珠菌基因组DNA拷贝数分别为102；
反应体系12：1μL稀释液中含有的克柔念珠菌基因组DNA拷贝数分别为103；
反应体系13：1μL稀释液中含有的克柔念珠菌基因组DNA拷贝数分别为5×102；
反应体系14：1μL稀释液中含有的克柔念珠菌基因组DNA拷贝数分别为102。
反应体系15：1μL稀释液中含有的光滑念珠菌基因组DNA拷贝数分别为103；
反应体系16：1μL稀释液中含有的光滑念珠菌基因组DNA拷贝数分别为5×102；
反应体系17：1μL稀释液中含有的光滑念珠菌基因组DNA拷贝数分别为102。
反应体系18：1μL稀释液中含有的光滑念珠菌基因组DNA拷贝数分别为5×101；
反应体系19：1μL稀释液中含有的光滑念珠菌基因组DNA拷贝数分别为2×101。
每个反应体系设置20次重复。
如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
结果见图6～图24。
引物组Ⅰ检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图6)、5×102(图7)、102(图8)和5×101(图9)时20个检测均可检测出来且重复性好，2×101(图10)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组Ⅰ的灵敏度为5×101个拷贝数/反应体系。
引物组Ⅱ检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图11)和5×102(图12)时20个检测均可检测出来且重复性好，102(图13)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组Ⅱ的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。
引物组Ⅲ检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图14)和5×102(图15)时20个检测均可检测出来且重复性好，102(图16)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组Ⅲ的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。
引物组Ⅳ检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图17)和5×102(图18)时20个检测均可检测出来且重复性好，102(图19)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组Ⅳ的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。实施例4、反应体系的筛选
引物组Ⅴ检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图20)、5×102(图21)、102(图22)和5×101(图23)时20个检测均可检测出来且重复性好，2×101(图24)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组Ⅰ的灵敏度为5×101个拷贝数/反应体系。
实施例4反应体系的筛选
1、提取待测样本的基因组DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1制备的引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。
反应体系1(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。
反应体系2(10μL)：6.7μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1.2μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。
反应体系3(10μL)：6.5μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1.3μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。
反应体系4(10μL)：7.3μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、0.8μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。
反应体系5(10μL)：7.5μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、0.7μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。
引物混合物即引物组Ⅱ的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用恒温扩增仪检测荧光信号。
每个反应体系设置8次重复。
如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
结果见图25～图29。引物组合检测靶标基因在反应体系1、反应体系2和反应体系4时8个检测均可检测出来且重复性好，引物组合检测靶标基因在反应体系3和反应体系5时8个检测不可完全出峰且重复性较差。
因此确定反应体系配比为：反应体系10μL：(6.7～7.3)μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、(0.8～1.2)μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。
实施例5利用念珠菌鉴定引物组合检测临床样本
待测样本为如下样本一、样本二、样本三、样本四或样本五：
样本一：已通过PCR测序鉴定确认含有白色念珠菌的人的痰液；
样本二：已通过PCR测序鉴定确认含有近平滑念珠菌的人的痰液；
样本三：已通过PCR测序鉴定确认含有热带念珠菌的人的痰液；
样本四：已通过PCR测序鉴定确认含有克柔念珠菌的人的痰液；
样本五：已通过PCR测序鉴定确认含有光滑念珠菌的人的痰液。
1、提取待测样本的总DNA。
2、以步骤1提取的总DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组对这五个样本进行环介导等温扩增，每个引物组合均检测五种样本。
反应体系与反应条件均同实施例2。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
样本一的结果见图30。只有采用引物组Ⅰ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅰ以外的其它两个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图30为引物组Ⅰ的结果；图30中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ的结果，其余均为未添加模板的结果。
样本二的结果见图31。只有采用引物组Ⅱ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅱ以外的其它两个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图31为引物组Ⅱ的结果；图31中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为引物组Ⅰ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ的结果，其余均为未添加模板的结果。
样本三的结果见图32。只有采用引物组Ⅲ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅲ以外的其它两个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图32为引物组Ⅲ的结果；图32中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ的结果，其余均为未添加模板的结果。
样本四的结果见图33。只有采用引物组Ⅳ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅳ以外的其它两个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图33为引物组Ⅳ的结果；图33中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅴ的结果，其余均为未添加模板的结果。
样本五的结果见图34。只有采用引物组Ⅴ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅴ以外的其它两个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图34为引物组Ⅴ的结果；图34中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ的结果，其余均为未添加模板的结果。
以上结果表明，利用本发明提供的念珠菌鉴定引物组合可以进行5种常见念珠菌的检测，结果准确可靠。
对比试验
1白色念珠菌
对比引物序列：
表1
| F3-1 | SEQ ID No.29 | ATATGAATTGCAGAT |
| B3-1 | SEQ ID No.30 | CCATTGTCAAAG |
| FIP-1 | SEQ ID No.31 | TGCCCTCCGGAATACTCGTGAATCATCGAATCTTT |
| BIP-1 | SEQ ID No.32 | CGTCGTTTCTCCCTCAAACCGCCTTACCA |
| LF-1 | SEQ ID No.33 | GAGGGCGCAATGT |
| LB-1 | SEQ ID No.34 | TGTTGAGCAATACGCCTTG |
采用现引物序列与对比引物序列，进行对比试验。
灵敏度对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行检测限级的20重复扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×102)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
结果：现采用引物重复性优于对比引物。
特异性对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行四种无关菌模板的扩增。
模板：光滑念珠菌的菌株号为CGMCC3.08115。近平滑念珠菌的菌株号为CICC1257。热带念珠菌的菌株号为CICC1272。克柔念珠菌的菌株号为CICC1273。制备上述四种菌的基因组。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的模板拷贝数为104)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
结果：现采用引物特异性良好，无非特异扩增；对比引物出现近平滑念珠菌及热带念珠菌的非特异性扩增。
2热带念珠菌
对比引物序列：
表2
采用现引物序列与对比引物序列，进行对比试验。
灵敏度对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行检测限级的20重复扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×102)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
结果：现采用引物重复性优于对比引物。
特异性对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行四种无关菌模板的扩增。
模板：白色念珠菌的菌株号为CGMCC2.2086。光滑念珠菌的菌株号为CGMCC3.08115。近平滑念珠菌的菌株号为CICC1257。克柔念珠菌的菌株号为CICC1273。制备上述四种菌的基因组。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的模板拷贝数为104)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
结果：现采用引物特异性良好，无非特异扩增；对比引物出现白色念珠菌的非特异性扩增。
3近平滑念珠菌
对比引物序列：
表3
| F3-3 | SEQ ID No.41 | GATTCTATTACTGATTG |
| B3-3 | SEQ ID No.42 | CTTTTACCCGATTGC |
| FIP-3 | SEQ ID No.43 | CCAACCCTCAATGCTTTTATCACCATTTTTGATG |
| BIP-3 | SEQ ID No.44 | CGACAAATTTGAAGACCTGAATGAGAGAAGTTCTGG |
采用现引物序列与对比引物序列，进行对比试验。
灵敏度对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行检测限级的20重复扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×102)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
结果：现采用引物重复性优于对比引物。
特异性对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行四种无关菌模板的扩增。
模板：白色念珠菌的菌株号为CGMCC2.2086。光滑念珠菌的菌株号为CGMCC3.08115。克柔念珠菌的菌株号为CICC1273。热带念珠菌的菌株号为CICC1272。制备上述四种菌的基因组。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的模板拷贝数为104)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
结果：分别检测现采用引物特异性良好，无非特异扩增；对比引物出现白色念珠菌及热带念珠菌的非特异性扩增。
4光滑念珠菌
对比引物序列：
表4
| F3-4 | SEQ ID No.45 | CTCTTGGTTCTCGC |
| B3-4 | SEQ ID No.46 | CACATACTGATATGGCCT |
| FIP-4 | SEQ ID No.47 | CAAAGATTCGATGATTCACGGGATGAAGAACGCAGCGAA |
| BIP-4 | SEQ ID No.48 | GTATTCCGGGGGGCATGAGAGTATCACTCACTACCAA |
| LF-4 | SEQ ID No.49 | GCAATTCACATTACGTAT |
| LB-4 | SEQ ID No.50 | TTGAGCGTCATTTCCTTC |
采用现引物序列与对比引物序列，进行对比试验。
灵敏度对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行检测限级的20重复扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×102)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
反应重复：20重复
结果：现采用引物重复性优于对比引物。
特异性对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行四种无关菌模板的扩增。
模板：白色念珠菌的菌株号为CGMCC2.2086。克柔念珠菌的菌株号为CICC1273。热带念珠菌的菌株号为CICC1272。近平滑念珠菌的菌株号为CICC1257。制备上述四种菌的基因组。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的模板拷贝数为104)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
结果：现采用引物特异性良好，无非特异扩增；对比引物出现热带念珠菌非特异性扩增。
5克柔念珠菌
对比引物序列：
表5
| F3-5 | SEQ ID No.51 | GGATCTCTTGGTT |
| B3-5 | SEQ ID No.52 | CGCTCCCTTTCAG |
| FIP-5 | SEQ ID No.53 | AAGAACTCGATGATTCACGATGAAGAGCGCAGCG |
| BIP-5 | SEQ ID No.54 | GCCTGTTTGAGCGTCGTTTTTACAGCGTC |
| LF-5 | SEQ ID No.55 | TTCACACTAGGTA |
| LB-5 | SEQ ID No.56 | GCGCAGAGTTGGG |
采用现引物序列与对比引物序列，进行对比试验。
灵敏度对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行检测限级的20重复扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×102)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
结果：现采用引物重复性优于对比引物。
特异性对比：
实验设计：采用现引物和对比引物，进行四种无关菌模板的扩增。
模板：白色念珠菌的菌株号为CGMCC2.2086。光滑念珠菌的菌株号为CGMCC3.08115。热带念珠菌的菌株号为CICC1272。近平滑念珠菌的菌株号为CICC1257。制备上述四种菌的基因组。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的模板拷贝数为104)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应引物：现用引物与对比引物
结果：现采用引物特异性良好，无非特异扩增；对比引物出现白色念珠菌的非特异性扩增。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 博奥生物集团有限公司
<120> 引物组合及其应用
<130> MP1729048
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaatatgaa ttgcagat 18
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccattgtcaa agcg 14
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatgccctc cggaatactc gtgaatcatc gaatcttt 38
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtcgtttct ccctcaaacc gccttaccac tacc 34
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agagggcgca atgt 14
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgttgagcaa tacgacttgg g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaagattcta ttactgattg g 21
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttttacccc attgca 16
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccaaccctca atgcttttat caccattttt gatgaag 37
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gactcgacaa atttgaagac ctgaatgaga gaagttctgg 40
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagcgtcatt tctcc 15
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcttattgat atgcttaagt tc 22
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttaaaataa gtttccacgt tccccgggtt tggt 34
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacgcttatt ttgctagtga gtcctacctg atttgag 37
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caaacctagc gtatt 15
<210> 16
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccaccacaa tt 12
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggatctcttg gttct 15
<210> 18
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgctccctt tcag 14
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aagaactcga tgattcacga tgaagagcgc agcgaa 36
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcctgtttga gcgtcgtttt acagcgtcgt c 31
<210> 21
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttcacactag gtat 14
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgcgcagagt tggg 14
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tctcttggtt ctcgcatc 18
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cacatactga tatggcctac a 21
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgttcaaaga ttcgatgatt cacgggatga agaacgcagc gaaat 45
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tctggtattc cggggggcat gagagtatca ctcactacca aac 43
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcaattcaca ttacgtatcg c 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttgagcgtca tttccttctc 20
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atatgaattg cagat 15
<210> 30
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccattgtcaa ag 12
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgccctccgg aatactcgtg aatcatcgaa tcttt 35
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cgtcgtttct ccctcaaacc gccttacca 29
<210> 33
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gagggcgcaa tgt 13
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tgttgagcaa tacgccttg 19
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gagcgtcatt tctccct 17
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tattgatatg cttaagttca g 21
<210> 37
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aaaataagtt tccacgttcc ccgggtttgg tgttg 35
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aacgcttatt ttgctagtga gtcctacctg atttgaggtc aa 42
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caaacctagc gtattg 16
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gccaccacaa tttattt 17
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gattctatta ctgattg 17
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cttttacccg attgc 15
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ccaaccctca atgcttttat caccattttt gatg 34
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cgacaaattt gaagacctga atgagagaag ttctgg 36
<210> 45
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ctcttggttc tcgc 14
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cacatactga tatggcct 18
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
caaagattcg atgattcacg ggatgaagaa cgcagcgaa 39
<210> 48
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gtattccggg gggcatgaga gtatcactca ctaccaa 37
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcaattcaca ttacgtat 18
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttgagcgtca tttccttc 18
<210> 51
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ggatctcttg gtt 13
<210> 52
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cgctcccttt cag 13
<210> 53
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aagaactcga tgattcacga tgaagagcgc agcg 34
<210> 54
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gcctgtttga gcgtcgtttt tacagcgtc 29
<210> 55
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ttcacactag gta 13
<210> 56
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gcgcagagtt ggg 13
Claims (10)
1.引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)、由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ组成；
(a2)、由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ和所述引物组Ⅴ中的一个或两个以上的组合物组成；
(a3)、包括所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ和所述引物组Ⅴ；
其中所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；
所述引物Ⅰ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b1)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(b2)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b3)、与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b4)、如(b1)、(b2)或(b3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b5)、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(b6)、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b7)、与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b8)、如(b5)、(b6)或(b7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b9)、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
(b10)、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b11)、与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b12)、如(b9)、(b10)或(b11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b13)、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
(b14)、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b15)、与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b16)、如(b13)、(b14)或(b15)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b17)、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
(b18)、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b19)、与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b20)、如(b17)、(b18)或(b19)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅰ-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(b21)、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
(b22)、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(b23)、与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(b24)、如(b21)、(b22)或(b23)所示序列的互补序列；
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP和引物Ⅱ-BIP组成；
所述引物Ⅱ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(c1)、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
(c2)、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(c3)、与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(c4)、如(c1)、(c2)或(c3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅱ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(c5)、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
(c6)、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(c7)、与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(c8)、如(c5)、(c6)或(c7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅱ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(c9)、具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
(c10)、具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(c11)、与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(c12)、如(c9)、(c10)或(c11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅱ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(c13)、具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
(c14)、具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(c15)、与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(c16)、如(c13)、(c14)或(c15)所示序列的互补序列；
所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成；
所述引物Ⅲ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d1)、具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
(d2)、具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d3)、与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d4)、如(d1)、(d2)或(d3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d5)、具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
(d6)、具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d7)、与SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d8)、如(d5)、(d6)或(d7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d9)、具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
(d10)、具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d11)、与SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d12)、如(d9)、(d10)或(d11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d13)、具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
(d14)、具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d15)、与SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d16)、如(d13)、(d14)或(d15)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d17)、具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
(d18)、具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d19)、与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d20)、如(d17)、(d18)或(d19)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅲ-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(d21)、具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
(d22)、具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(d23)、与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(d24)、如(d21)、(d22)或(d23)所示序列的互补序列；
所述引物组Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成；
所述引物Ⅳ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e1)、具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；
(e2)、具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e3)、与SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e4)、如(e1)、(e2)或(e3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e5)、具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；
(e6)、具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e7)、与SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e8)、如(e5)、(e6)或(e7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e9)、具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列；
(e10)、具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e11)、与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e12)、如(e9)、(e10)或(e11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e13)、具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；
(e14)、具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e15)、与SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e16)、如(e13)、(e14)或(e15)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e17)、具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；
(e18)、具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e19)、与SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e20)、如(e17)、(e18)或(e19)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅳ-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(e21)、具有SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列；
(e22)、具有SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(e23)、与SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(e24)、如(e21)、(e22)或(e23)所示序列的互补序列；
所述引物组Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB组成；
所述引物Ⅴ-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f1)、具有SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列；
(f2)、具有SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f3)、与SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f4)、如(f1)、(f2)或(f3)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f5)、具有SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列；
(f6)、具有SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f7)、与SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f8)、如(f5)、(f6)或(f7)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f9)、具有SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列；
(f10)、具有SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f11)、与SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f12)、如(f9)、(f10)或(f11)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f13)、具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列；
(f14)、具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f15)、与SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f16)、如(f13)、(f14)或(f15)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f17)、具有SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列；
(f18)、具有SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f19)、与SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f20)、如(f17)、(f18)或(f19)所示序列的互补序列；
所述引物Ⅴ-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(f21)、具有SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列；
(f22)、具有SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(f23)、与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
(f24)、如(f21)、(f22)或(f23)所示序列的互补序列。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组Ⅰ中所述引物Ⅰ-F3、所述引物Ⅰ-B3、所述引物Ⅰ-FIP、所述引物Ⅰ-BIP、所述引物Ⅰ-LF和所述引物Ⅰ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
所述引物组Ⅱ中所述引物Ⅱ-F3、所述引物Ⅱ-B3、所述引物Ⅱ-FIP、所述引物Ⅱ-BIP、所述引物Ⅱ-LF和所述引物Ⅱ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
所述引物组Ⅲ中所述引物Ⅲ-F3、所述引物Ⅲ-B3、所述引物Ⅲ-FIP、所述引物Ⅲ-BIP、所述引物Ⅲ-LF和所述引物Ⅲ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
所述引物组Ⅳ所述引物Ⅳ-F3、所述引物Ⅳ-B3、所述引物Ⅳ-FIP、所述引物Ⅳ-BIP、所述引物Ⅳ-LF和所述引物Ⅳ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
所述引物组Ⅴ所述引物Ⅴ-F3、所述引物Ⅴ-B3、所述引物Ⅴ-FIP、所述引物Ⅴ-BIP、所述引物Ⅴ-LF和所述引物Ⅴ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。
3.如权利要求1或2所述的引物组合在扩增白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌的核酸分子中的应用。
4.如权利要求1或2所述的引物组合在检测和/或鉴定白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌中的应用。
5.如权利要求1或2所述的引物组合在制备检测和/或鉴定白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌的试剂盒中的应用。
6.包括如权利要求1或2所述的引物组合的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的用途包括：
Ⅰ、鉴定白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌；
Ⅱ、检测待测样本中是否含有白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌。
7.一种鉴定白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和/或克柔念珠菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用如权利要求1或2所述的引物组合中的引物进行环介导等温扩增，获得扩增结果；
(3)根据所述扩增结果获得鉴定结果。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有白色念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有近平滑念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有热带念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有克柔念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或候选含有光滑念珠菌。
9.一种检测待测样本中是否含有稻根霉菌、伞状毛霉菌、卷枝毛霉菌和/或微小根毛霉的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用如权利要求1或2所述的引物组合中的引物进行环介导等温扩增，获得扩增结果；
(3)根据所述扩增结果获得检测结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有白色念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有近平滑念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有热带念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有克柔念珠菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有光滑念珠菌。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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