NO342211B1 - Fusjonsproteiner, anvendelser derav samt fremgangsmåte for å fremstille det samme. - Google Patents

Abstract

Denne oppfinnelsen tilveiebringer fusjonsproteiner omfattende etterfølgende aminosyrer som ved å starte ved den aminoterminale enden av proteinet korresponderer til etterfølgende aminosyrer til stede i (i) et cytomegalovirus humant MHC begrenset peptid, (ii) en første peptidlinker, (iii) et humant P-2 mikroglobulin, (iv) en annen peptidlinker, (v) en HLA-A2 kjede av et humant MHC klasse l molekyl, (vi) en tredje peptidlinker, (vii) en variabel region fra en tung kjede av et scFvfragment av et antistoff, og (viii) en variabel region fra en lett kjede av et slikt scFvfragment, hvor de etterfølgende aminosyrene som korresponderer til (vii) og (viii) er bundet sammen direkte ved en peptidbinding eller ved etterfølgende aminosyrer som korresponderer til en fjerde peptidlinker, hvor antistoffet hvorfra scFv fragmentet er derivert spesifikt binder til mesotelin. Denne oppfinnelsen tilveiebringer nukleinsyrekonstruksjoner kodende for det samme, fremgangsmåter for å produsere det samme, sammensetninger og anvendelser derav.

Description

I henhold til nåværende immunovervåkningsteori lokaliserer og ødelegger immunsystemet kontinuerlig transformerte celler. Noen celler unnslipper imidlertid fra en tilsynekommende effektiv immunrespons og blir følgelig tumorøse (1-4).

Tumorunnvikelse fra immunrespons er et godt etablert fenomen demonstrert i tallrike studier og er forårsaket ved et bredt utvalg av foreslåtte mekanismer (1-4). Blant disse mekanismene er: produksjonen av undertrykkende cytokiner, tap av immundominante peptider, resistensen for drepende mekanismer (apoptose) og tap av MHC klasse I (1-4). En av unnslippingsmekanismene er vist til å være sterkt korrelert med tumorprogresjon ved tapet eller nedreguleringen av MHC klasse I molekyler. Denne unnslippelsesmekanismen er rikelig i mange tumorer og kan resultere fra et antall av forskjellige mutasjoner. Flere studier viste svake spotter i MHC klasse I belastningen og presentasjonsruten inkluderende tap av β-2-mikroglobulin, TAP1/TAP2 mutasjoner, LMP mutasjoner, tap av heterzygositet i MHC genene og nedregulering av spesifikke MHC alleler.

Nåværende strategier for cancer immunterapi benytter vanligvis de to armene av immunsystemer: de humorale og de cellulære systemene. I det første har systemisk injeksjon av monoklonale antistoffer med høy affinitet (mAb) knyttet mot celleoverflatetumor assosierte antigener demonstrert statistisk signifikant anti-tumor aktivitet i klinisk forsøk (5,6). Videre blir anti-tumor mAb som bærer effektorer slik som cytokiner eller toksiner nå evaluert i kliniske forsøk (7). Den andre hovedmetoden for spesifikk cancer immunterapi benytter den cellulære armen av immunsystemet, hovedsakelig de CD8+ cytotoksiske T-lymfocyttene. To hovedstrategier blir nå benyttet for å øke anti-tumor effektiviteten av den cellulære armen av immunsystemet (i) aktiv immunisering av pasienter med peptider kjent til å bli gjenkjent ved T-lymfocytter og (ii) adoptive overføringsterapier som muliggjør seleksjonen, aktiveringen og ekspanderingen av sterkt reaktive T-celle subpopulasjoner med forbedret antitumorpotens. I den første metoden er MHC-begrensede peptider derivert fra nylig identifiserte tumorassosierte antigener (sliks om gp100, MAGE gruppen, NY-ESO-1) benyttet for å vaksinere pasienter. Disse tumorspesifikke antigen deriverte peptidene er sterkt spesifikke på grunn av deres eksklusive ekspresjon i spesifikke vev (8-11). Den andre strategien, adoptiv celleoverføring, har nylig vist lovende resultater i metastatiske melanompasienter hvor sterkt selekterte, tumorreaktive T-celler mot forskjellige overuttrykte selvderiverte differensierings antigener ble isolert, ekspandert ex vivo og reintrodusert til pasientene. Med denne metoden ble en vedholdende klonal repopulasjon av T-celler, proliferasjon in vivo, funksjonell aktivitet og trafikkering til tumorsteder demonstrert (12-14).

En immunterapeutisk metode nylig presentert tar fordel av to godt etablerte områder: (i) den kjente effektiviteten av CD8+ cytotoksiske T-lymfocytter i elimineringen av celler som presenterer sterkt immunogene MHC/peptidkomplekser og (ii) de tumorspesifikke celleoverflate antigenene som målsøkes via rekombinante fragmenter og antistoffer, hovedsakelig enkelkjede FV fragmenter (scFv). Denne metoden benytter et rekombinant fusjonsprotein bestående av to funksjonelle distinkte enheter; (i) en enkeltkjede MHC klasse I molekyl som bærer et sterkt immunogent tumor eller viralderivert peptid og (ii) et tumorspesifikt scFv fragment med høy affinitet (15)- Flere grupper har tidligere vist at et biotinylert MHC peptid multimerisert på streptavidin eller monomere HLA-A2/influensa (Flu) matriks peptidkomplekser koblet via kjemisk konjugering til tumorspesifikke antistoffer kan indusere in vitro T-lymfocytt mediert lysis av belagte tumorceller (16-20). Disse metodene benytter imidlertid kjemisk konjugering og anvender hele antistoffer eller større fragmenter, f.eks. Fab fragmenter. Produksjon og homogenitet på grunn av koblingsstrategien så vel som tumor penetreringsmuligheter er imidlertid begrenset på grunn av den store størrelsen av slike molekyler. Lev et al. beskriver en strategi for immunoterapi av kreft som kombinerer antistoff mot et antigen-MHC-peptid kompleks med CD8 T-lymfocytters kraftige evne til å drepe kreftceller. Lev et al. beskriver en genetisk funksjon skapt mellom enkeltkjede rekombinant HLA-A2 og tumorspesifikke scFv. Disse fusjonene ble vist til å være funksjonelle in vitro og in vivo, er i stand til og spesifikt indusere T-lymfocytt mediert in vitro og in vivo lysis av målbelagte tumorceller (15). Stabiliteten av det nye kimære molekylet er sterkt avhengig av nærværet av peptidet i MHC gropen. Dissosiasjon av peptidet fra scHLA-A2 domene av det kimære molekylet kan derfor svekke dets stabilitet. Oved et al. adresserte dette problemet ved å konstruere nye kimære molekyler hvor peptidet er forbundet til scHLA-A2/scFv konstruksjonen via en kort linker. Dette nye fusjonsproteinet ble testet for dets in vitro biokjemiske og biologiske aktivitet og induserer effektiv dreping av tumorceller ved hjelp av tumor- eller virusspesifikke cytotoksiske T-lymfocytter(21).

Det er et bredt anerkjent behov for et nytt fusjonsprotein som kan opprettholde dets doble aktivitet: binde tumor målceller gjennom scFv halvdelen så vel som å mediere potent, effektiv og spesifikk cytotoksisitet gjennom rekrutteringen av CD8+ T-celler hvis spesifisitet er bestemt ved det kovalent forbundne HLA-A2 begrensede peptidet.

Den MHC klasse I begrensede CD8+ cytotoksiske T-celle (CTL) effektorarmen av den adaptive immunresponsen er best utstyrt til å gjenkjenne tumorceller som fremmede og initiere kaskaden av begivenheter som resulterer i tumordestruksjon. Tumorer har imidlertid utviklet sofistikerte strategier for å unnslippe immuneffektor mekanismer, hvor den best studerte er nedreguleringen av MHC klasse I molekyler som presenterer antigenet gjenkjent ved CTL.

For å overvinne begrensningen av tidligere metoder og utvikle nye metoder for immunterapi ble et rekombinant molekyl konstruert hvor en enkelkjede MHC spesifikt er målrettet til tumorceller gjennom dens fusjon til cancerspesifikke rekombinante antistoff fragmenter eller en ligand som binder til reseptorer uttrykt ved tumorceller.

Fusjonsprotein ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt i krav 1, sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt i krav 2, nukleinsyrekonstrukt ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt i krav 3, vektor ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt i krav 4, transformert celle ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt i krav 5, isolert preparatet av bakterielt uttrykt inklusjonslegeme ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt i krav 6, fremgangsmåte for å produsere fusjonsproteinet ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt i krav 7.

Det beskrives et fusjonsprotein omfattende etterfølgende aminosyrer som, ved å begynne ved den aminoterminale enden av proteinet, korresponderer til etterfølgende aminosyrer til stede i (i) et cytomegavirus humant MHC begrenset peptid, (ii) en første peptidlinker (iii) et humant β-2 mikroglobulin (iv) en andre peptidlinker (v) en HLA-A2 kjede av et humant MHC klasse I molekyl, (vi) en tredje peptidlinker, (vii) en variabel region fra en tung kjede av et scFv fragment av et antistoff og (viii) en variable region fra en lett kjede av slikt scFv fragment, hvor de etterfølgende aminosyrene som korresponderer til (vii) og (viii) er bundet sammen direkte ved en peptidbinding eller ved etterfølgende aminosyrer som korresponderer til en fjerde peptidlinker og der scFv fragmentet er derivert fra et antistoff som spesifikt binder til mesotelin.

Det beskrives også sammensetninger omfattende fusjonsproteinet og en bærer.

Det beskrives videre en nukleinsyrekonstruksjon kodende for et fusjonsprotein omfattende etterfølgende aminosyrer som, ved å begynne med den aminoterminale enden av proteinet, korresponderer til etterfølgende aminosyrer til stede i (i) et cytomegalovirus humant MHC begrenset peptid, (ii) en første peptidlinker, (iii) et humant β-2 mikroglobulin, (iv) en andre peptidlinker, (v) en HLA-A2 kjede fra et humant MHC klasse I molekyl, (vi) en tredje peptidlinker, (vii) en variabel region fra en tung kjede av et scFv fragment av et antistoff og (viii) en variabel region fra en lett kjede av et slikt scFv fragment, hvor de etterfølgende aminosyrene som korresponderer til (vii) og (viii) er bundet sammen direkte ved en peptidbinding eller ved etterfølgende aminosyrer som korresponderer til en fjerde peptidlinker og scFv fragmentet er derivert antistoff fra et antistoff som spesifikt binder til mesotelin.

Det beskrives videre et isolert preparat av bakterielt uttrykte inklusjonslegemer omfattende over 30 prosent ved vekt av et fusjonsprotein i overensstemmelse med oppfinnelsen.

Det beskrives også en fremgangsmåte for å fremstille et fusjonsprotein omfattende å dyrke en transformert celle omfattende fusjonsproteinet, slik at fusjonsproteinet er uttrykt, og gjenvinning av fusjonsproteinet uttrykt på denne måten.

Som et eksemplarisk molekyl av den foreliggende oppfinnelsen ble en enkelkjede MHC molekyl bestående av β-2 mikroglobulin fusjoner til α1, α2 og α3 domene av HLA-A2 via en kort peptidlinker (15 aminosyrer) fusjonert til scFv SS1 som målsøker mesotelin. For å konstruere et fusjonsprotein med kovalent bundet peptid ble et peptid på 9 aminosyrer derivert fra CM pp65 proteinet NLVPMVATV(SEQ ID NO: 4) fusjonert til den N-terminale enden av scHLA-A2(SS1 (scFv) fusjonsproteinet via en linker på 20 aminosyrer GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). Fusjonsproteinet ble uttrykt i E.coli og funksjonelle molekyler ble produsert ved in vitro refolding i nærværet av CMV/scHLA-A2/SS1 (scFv). Flow cytometristudier viste muligheten til å dekorere antigenpositive HLA-A-2 negative humane tumorceller med HLA-A2 peptidekompleksene på en måte som fullstendig var avhengig av spesifisiteten av det målsøkende antistoff fragmentet.

Aller viktigst gjorde CMV/scHLA-A2/SS1 (scFv) mediert belegging av måltumorceller dem mottakelige for effektiv og spesifikk HLA-A2 begrenset CMV peptidspesifikk CTL mediert lysis. Disse resultatene demonstrerer at anitstoffguidet tumor antigenspesifikk målsøking av MHC peptidkomplekser på tumorceller kan gjøre dem mottakelig for, å potensiere CTL dreping. Denne nye fremgangsmåten åpner nå veien for utviklingen av nye immunterapeutiske strategier basert på antistoff målsøking av naturlige beslektede MHC ligander og CTL baserte cytotoksiske mekanismer.

I sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen ble ny strategi utviklet for å remålsøke klasse I MHC peptidkomplekser på overflaten av tumorceller på en måte som er uavhengig av omfanget av klasse I MHC ekspresjon ved måltumorcellene. I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen ble derfor et molekyl med to armer benyttet. En arm, den målsøkende halvdelen, omfatter tumorspesifikke rekombinante fragmenter av antistoffet rettet til tumor eller differensierings antigener som har blitt benyttet i mange år for å målsøke radioisotoper, toksiner eller medikamenter til cancerceller. Den andre effektorarmen er et enkelkjede MHC molekyl (scMHC) bestående av humant β-2 mikroglobulin forbundet til de tre ekstracellulære domenene av den tunge kjede HLA-A2 (24, 25, WO 01/72768). Ved å forbinde gener kodende for de to armene i et enkelt rekombinant gen og uttrykkende genet, er det nye molekyle uttrykt effektivt E.coli og produsert ved for eksempel in vitro refolding i nærværet av HLA-A2-CMV peptider. Denne fremgangsmåten, som beskrevet her, gjør måltumorcellene mottakelig for lysis ved cytotoksiske T-celler uten hensyn til deres MHC ekspresjonsnivå og kan derfor bli benyttet som en ny fremgangsmåte for å potensiere CTL mediert antitumor immunitet. Denne nye fremgangsmåten vil føre til utviklingen av ny klasse av rekombinante terapeutiske midler i stand til å selektivt drepe og eliminere tumorceller ved å benytte naturlig beslektede MHC liganger og CTL baserte cytotoksiske mekanismer.

Figurer 1A-B Skjematisk representasjon av scHLA-A2/SS1 (scFv) og en pep (CMV)/scHLA-A2/SS1 (scFv) (forbindelse A).

Figur 1A illustrerer den C-terminale enden av scHLA-A2 fusjonert til den N-terminale enden av SS1 (scFv) via en linker på 4 aminosyrer. Figur 1B illustrerer at CMV pp65 peptidet, dvs. NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4) ble fusjonert til den N-temrinale enden av scHLA-A2/SS1 (scFv) via en linker på 20 aminosyrer GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6).

Figur 2 Nukleinsyresekvens kodende for forbindelse A (SEQ ID NO: 1).

Figur 3A-B Ekspresjon og rensing av forbindelse A.

Figur 3A viser SDS/PAGE analysen av isolerte inklusjonslegemer.

Figur 4B viser SDS/PAGE analysen av forbindelse A etter rensing på ionebytter kromatografi.

Figur 4 Binding av forbindelse A til rekombinant mesotelin.

Mesotelin ble immobilisert på immunplater og doseavhengig binding av forbindelse A ble monitorert ved konformasjonssensitivt mAb W6 (33,34).

Figur 5A-D Binding av forbindelse A til mesotelinuttrykkende celler. Figur 5A-B demonstrerer flow cytometrianalysen av bindingen av forbindelse A til mesotelinpositive HLA-A2-negative A431K5 celler og mesotelin-negative HLA-A2-negative A431 celler. Figur 5A viser bindingen av K1 mAb (31, 32) til A431K5 celler, og figur 5B viser fraværet av binding av K1 mAb til A431 celler. Figur 5C viser bindingen av forbindelse A til A431K5 celler, og figur 5D viser fraværet av binding av forbindelse A til A431 celler. Bindingen ble monitorert ved å benytte anti-HLA-A2 spesifikt antistoff BB7.2 (35) og et FITC-merket sekundært antistoff.

Figurer 6A-B Potensiering av CTL-mediert lysis av HLA-A2 negative tumorceller ved forbindelse A. I figur 6A ble de mesotelintransfekterte A431K5 cellene og de mesotelin-negative A431 modercellene inkuberte med forbindelse A (10 µg) og CMV spesifikke CTL i en [S<35>] mestionin frigjøringstest. Figur 6B demonstrerer doseavhengighet av forbindelse A når mesotelintransfekterte A431K5 celler og de mesotelin-negative A431 modercellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av forbindelse A og CMV spesifikke CTL i en [S<35>] metionin frigjøringstest.

Figur 12 Potensiering av CTL mediert lysis av HLA-A2 negative tumorceller ved forbindelse B og forbindelse A. Mesotelintransfekterte A431K5 celler og de mesotelinnegative A431 modercellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av forbindelse B eller forbindelse A og med CMV spesifikke CTL i en [S<35>] metioninfrigjøringstest. Figuren viser resultater av inkubering av forbindelse A med A431K5 celler, inkubering av forbindelse B med A431K5 celler, inkubering av forbindelse A med 431 celler og inkubering av forbindelse B med A431 celler.

Figur 13A-B Skjematisk representasjon av scHLA-A2/SS1 (svFv) og M1cov/scHLA-A2/SS1 (scFv). Figur 13A viser den C-terminale enden av scHLA-A2 fusjonert til den N-terminale enden av scFv via en linker på 4 aminosyrer. Figur 13B viser M158-66 peptidet fusjonert til den N-terminale enden av scHLA-A2/SS1 (scFv) via en linker på 15 aminosyrer GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8).

Figur 14 Nukleinsyresekvens kodende for M1cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) fusjonsprotein (SEQ ID NO: 23).

Figurer 15A-B Ekspresjon og rensing av M1-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) fusjonsprotein. Figur 15A viser SDS/PAGE analysen av isolerte inklusjonslegemer. Figur 15B viser SDS/PAGE analysen av M1-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) fusjonsprotein etter rensing på ionebytterkromatografi.

Figur 16 Binding av M1-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) fusjonsproteinet til rekombinant mesotelin. Mesotelin ble immobilisert på immunplater og doseavhengig binding av M1-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) ble monitorert ved konformasjonssensitivt mAb (W6).

Figurer 17A-D Binding av M1-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) fusjonsprotein til mesotelinuttrykkende celler. Figurer 17A-D viser flow cytometrianalyse av bindingen av M1-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) til mesotelin-positive HLA-A2-negative A431K5 celler og mesotelin-negative HLA-A2-negative A431 celler. Figur 17A viser bindingen av K1 mAb til A431K5 celler og figur 17B viser fraværet av binding av K1 mAb til A431 celler. Figur 17C viser bindingen av M1-cov/scHLA-A1/SS1 (scFv) fusjonsprotein til A431K5 celler, og figur 17D v iser fraværet av binding av M1-cov/scHLA-A1/SS1 (scFv) fusjonsprotein til A431 celler. Bindingen ble monitorert ved å benytte anti-HLA-A2 spesifikt antistoff BB7.2 og et FITC-merket sekundært antistoff.

Figur 18 Potensiering av CTL mediert lysis av HLA-A2-negative tumorceller ved M1-cov/scHLA-A1/SS1 (scFv) fusjonsprotein. Mesotelintransfekterte A431K5 celler og de mesotelin-negative A431 modercellene ble inkubert med forskjellig konsentrasjoner av M1-cov/scHLA-A1/SS1 (scFv) og med M1 spesifikke HLA-A2 begrensede CLT i en [S<135>] metioninfrigjørelser.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det beskrives et fusjonsprotein omfattende etterfølgende aminosyrer som, ved å starte med den aminoterminale enden av proteinet, korresponderer til etterfølgende aminosyrer til stede i (i) et cytomegalovirus humant MHC begrenset peptid, (ii) en første peptidlinker (iii), et humant β-2 mikroglobulin, (iv) en andre peptidlinker, (v) en HLA-A2 kjede av et humant MHC klasse I molekyl, (vi) en tredje peptidlinker, (viii) en variable region fra en lett kjede av slikt scFv fragment, hvor de etterfølgende aminosyrene som korresponderer til (vii) og (viii) er bundet sammen direkte ved en peptidbinding eller ved etterfølgende aminosyrer som korresponderer til en fjerde peptidlinker og scFv fragmentet er derivert fra et antistoff som spesifikt binder til mesotelin. I en utførelsesform har den første peptidlinkeren aminosyresekvensen GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). I en annen utførelsesform har den andre peptidlinkeren aminosyresekvensen GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8). I en annen utførelsesform har den tredje peptidlinkeren aminosyresekvensen ASGG (SEQ ID NO: 10). I en annen utførelsesform har den fjerde peptidlinkeren aminosyresekvensen GVGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19). I en annen utførelsesform har cytomegaloviruset humane MHC restriktive peptidet aminosyresekvensen NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4).

Som benyttet her refererer ”første peptidlinker”, ”andre peptidlinker” og ”fjerde peptidlinker” til peptider bestående av et monomert peptid hvis aminosyresekvens er GXGGS (SEQ ID NO: 20) eller en multimer derav, hvor x kan være en hver aminosyre. Disse peptidlinkerne kan være en multimer på 2-10 av et slikt monomert peptid. I enhver slik multimer kan hvert monomere peptid være det samme som eller forskjellige fra andre monomere peptider i multimeren avhengig av identiteten av aminosyre x. I en utførelsesform er x i det monomere peptidet aminosyren valin (V). I en annen utførelsesform er x i det monomere peptidet aminosyren glysin (G). I foreliggende foretrukkede utførelsesformer omfatter peptidlinkeren en multimer av tre eller fire monomere peptider, spesielt en multimer av de tre monomere peptidene hvor den mest N-terminale x er aminosyren V, og andre og tredje x er aminosyren G.

I en utførelsesform er sekvensen av de etterfølgende aminosyrene korresponderende til (viii), etterfulgt ved den fjerde peptidlinkeren, etterfulgt ved (viii) presentert i SEQ ID NO: 12.

I en annen utførelsesform har de etterfølgende aminosyrene av fusjonsproteinet, forbindelse A, aminosyresekvensen presentert i SEQ ID NO: 2.

Det beskrives også en sammensetning omfattende et fusjonsprotein i overensstemmelse med oppfinnelsen og en bærer. I en utførelsesform er fusjonsproteinet til stede i sammensetning i en terapeutisk effektiv mengde og bæreren er en farmasøytisk akseptabel bærer.

Det beskrives også en nukleinsyrekonstruksjon kodende for et fusjonsprotein omfattende etterfølgende aminosyrer som, ved å starte med den aminoterminale enden av proteinet, korresponderer til etterfølgende aminosyrer til stede i, (i) et cytomegalovirus humant MHC begrenset peptid, (ii) en første peptidlinker, (iii) et humant β-2 mikroglobulin, (iv) en andre peptidlinker, (v) en HLA-A2 kjede av et humant MHC klasse I molekyl, (vi) en tredje peptidlinker, (vii) en variabel region fra en tung kjede av et scFv fragment fra et antistoff, og (viii) en variabel region fra en lett kjede av slikt scFv fragment, hvor de etterfølgende aminosyrene som korresponderer til (vii) og (viii) er bundet sammen direkte ved en peptidbinding eller ved etterfølgende aminosyrer som korresponderer til en fjerde peptidlinker og scFv fragmentet er derivert fra et antistoff som spesifikt binder til mesotelin. I en utførelsesform har nukleinsyrekonstruksjonen nukleinsyresekvensen presentert i SEQ ID NO: 1.

Det beskrives også en vektor omfattende nukleinsyrekonstruksjonen av oppfinnelsen. Eksempler på slike vektorer er plasmider, virus, fag og lignende.

Det beskrives videre en ekspresjonsvektor omfattende nukleinsyrekonstruksjonen av oppfinnelsen og en promoter funksjonelt forbundet dertil.

Det beskrives også en transformert celle omfattende en vektor i henhold til oppfinnelsen. Den transformerte cellen kan være en eukaryot celle, f.eks. valgt fra gruppen bestående av en mammalsk celle, en insektcelle, en plantecelle, en gjærcelle og en protozoacelle. Alternativt kan den transformerte cellen være en bakteriell celle.

Det beskrives et isolert preparat av bakterielt uttrykte inklusjonslegemer omfattende over 30 prosent ved vekt av et fusjonsprotein i henhold til oppfinnelsen.

Det beskrives også en fremgangsmåte for å produsere et fusjonsprotein omfattende å dyrke den transformerte cellen av oppfinnelsen slik at fusjonsproteinet er uttrykt, og utvinne fusjonsproteinet uttrykt på denne måten. I en utførelsesform omfatter utvinningen av fusjonsproteinet å utsette det uttrykte fusjonsproteinet for størrelseseksklusjons kromatografi. I en annen utførelsesform er fusjonsproteinet uttrykt i inklusjonslegemet. I en utførelsesform omfatter fremgangsmåten videre å behandle inklusjonslegmene for å separere og refolde fusjonsproteinet og derved produsere fusjonsproteinet i aktiv form. I en annen utførelsesform omfatter behandling av inklusjonslegemer å separere fusjonsproteinet derfra å kontakte inklusjonslegemene med et denaturerende middel.

Som benyttet her betyr en ”aktiv form” av fusjonsproteinet en tredimensjonal konformasjon av fusjonsproteinet som tillater fusjonsproteinet å binde spesifikt til mesotelin når mesotelin er til stede på overflaten av en tumorcelle.

Det beskrives (i) nye fusjonsproteiner; (ii) fremgangsmåter for å fremstille det samme; (iii) nukleinsyrekonstruksjoner kodende for det samme; og (iv) fremgangsmåter for å benytte det samme for selektivt å drepe celler, spesielt cancerceller.

Prinsippene og operasjonen av den foreliggende oppfinnelsen kan bli bedre forstått med referanse til figurene og beskrivelsen presentert her.

Det må forstås at oppfinnelsen ikke er begrenset i dens anvendelse til detaljene presentert i beskrivelsen eller som eksemplifisert. Oppfinnelsen omslutter andre utførelsesformer og er i stand til å bli praktisert eller utført på ulike måter. Det må også forstås at frasologien og terminologien benyttet her er for formålet av beskrivelse og burde ikke bli ansett som begrensende.

Tumorprogresjon er ofte assosiert med sekresjonen av immunundertrykkende faktorer og/eller nedreguleringen av MHC klasse I antigenpresenterende funksjoner (2). Til og med når en spesifikk CTL respons demonstrert i pasienter, er denne responsen lav fordi anti-tumor CTL populasjon er sjelden, veldig ualminnelig, og i noen tilfeller er CTL ikke funksjonelle eller anergiske (26). Videre er det godt etablert at antallet av MHC peptidkomplekser på overflaten av tumorceller som presenterer et bestemt tumorassosiert peptid er lavt (27). Signifikante progresjoner mot å utvikle vaksiner som kan stimulere en immunrespons mot tumorer har involvert identifiseringen av protein antigenet assosiert med en ny tumortype og epitopkartlegging av tumor antigener for MHC klasse I og klasse II begrensede bindingsmotiver ble identifisert og blir nå benyttet i ulike vaksineringsprogrammer (14, 11, 8). MHC klasse I molekyler som presenteres de hensiktsmessige peptidene er nødvendig for å tilveiebringe de spesifikke signalene for gjenkjenning og dreping ved CTL. Imidlertid er hovedmekanismen for tumor unnslipping av tapet, nedreguleringen eller endringen av HLA profiler som kan gjøre målcellen ikke mottakelig for CTL lysis, til og med om cellen uttrykker det hensiktsmessige tumorantigenet.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en ny fremgangsmåte for å omgå dette problemet. Ved å redusere den foreliggende oppfinnelsen til praksis, ble tumorspesifikk målsøking av klasse I MHC peptidkomplekser på tumorceller vist til å være en effektiv og virksom strategi for å gjøre HLA-A2-negative celler mottakelig for lysis ved relevante HLA-A2 begrensede CTL. Denne nye strategien av å omdirigere CTL mot tumorceller tar fordel av anvendelsen av rekombinant anti-mesotelin antistoff fragment og CMV ligand som kan lokalisere må maligne celler som uttrykker en tumor med en relativt høy grad av spesifisitet.

Det anti-mesotelin antistoff målsøkende fragmentet og CMV liganden er fusjonert til et enkelkjede HLA-A2 molekyl som kan bli foldet effektivt og funksjonelt.

Resultatene presentert her tilveiebringer en tydelig demonstrasjon av nyttigheten av fremgangsmåten av den foreliggende oppfinnelsen for å rekruttere aktive CTL for tumorcelledreping via cancerspesifikt antistoff eller ligandguidet målsøking av scMHC peptidkomplekser. Disse resultatene baner veien for utviklingen av en ny immunterapeutisk fremgangsmåte basert på naturlig forekommende cellulære immunresponser som er omdirigert mot tumorcellene.

Det vil bli forstått at det beskrevne fusjonsproteinet eller porsjoner derav kan bli fremstilt på flere måter, inkluderende fast fase proteinsyntese. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er imidlertid minst hoveddeler av molekylene, for eksempel scHLA-A2 domene (med eller uten CMV peptidet) og scFv domene generert ved translasjon av en respektiv nukleinsyrekonstruksjon eller konstruksjoner kodende for molekylet.

Følgelig er en til tre åpne leserammer nødvendig for å syntetisere molekylene av figur 1B via translasjon. Disse åpne leserammene kan være på et enkelt, to eller tre nukleinsyremolekyler. En enkel nukleinsyrekonstruksjon kan derfor for eksempel bære en, to eller alle tre åpne leserammer. En til tre cis-virkende regulatoriske sekvenser kan bli benyttet for å kontroller ekspresjonen av den ene til tre åpne leserammer. For eksempel kan en enkel cis-virkende regulatorisk sekvens kontrollere ekspresjonen av en, to eller tre åpne leserammer, på en cistron-liknende måte. Alternativt kan tre uavhengige cis-virkende regulatoriske sekvenser bli benyttet for å kontrollere ekspersjonen av de tre åpne leserammene. Andre kombinasjoner er også forestilt seg.

De åpne leserammene og de cis-virkende regulatoriske sekvensene kan bli båret ved et til tre nukelinsyremolekyler. For eksempel er hver åpne leseramme og den cis-virkende regulatoriske sekvens båret ved et forskjellig nukleinsyremolekyl, eller alle de åpne leserammene og deres assosierte cis-virkende regulatoriske sekvenser er båret ved et enkelt nukleinsyremolekyl. Andre kombinasjoner er også forestilt seg.

Ekspresjon av fusjonsproteinet kan bli utført ved transformasjon/transfeksjon og/eller ko-transformasjon/ko-transfeksjon av en enkelt celle eller et flertall av celler med ethvert av nukleinsyremolekylene, som tjener som transformasjon/transfeksjonsvektorer (f.eks. som plasmider, fag, fagmider eller virus).

Det vil bli forstått at fusjonsproteinet hvis aminosyresekvens er presentert i SEQ ID NO: 2 og inkluderer den N-terminale aminosyre metionin, sannsynligvis representerer fusjonsproteinet som uttrykt i en bakteriell celle. Avhengig av den spesifikke bakterielle cellen benyttet for å uttrykke fusjonsproteinet, kan den N-terminale metioninet bli kløvet og fjernet. Følgelig er det betraktet at fusjonsproteiner i overensstemmelse med denne oppfinnelsen omslutter både dem med og dem uten en N-terminal metionin. Når et fusjonsprotein i overensstemmelse med oppfinnelsen er uttrykt i en eukaryot celle, vil den generelt mangle den N-terminale metioninet. Derfor må det forstås at aminosyresekvensen av uttrykte fusjonsproteiner i henhold til oppfinnelsen kan inkludere eller ikke inkludere slik N-terminal metionin avhengig av typen av celler hvor proteinene er uttrykt.

Når enn og hvor enn benyttet, er linkerpeptidet valgt fra en aminosyresekvens som er naturlig fleksibel, slik at polypeptidene forbundet derved uavhengig og nativt folder etter ekspresjon derav, som på denne måten fremmer dannelsen av et funksjonelt eller aktivt enkelkjede (sc) humant β2M/HLA kompleks, antistoff målsøkende eller humant β2M/HLA –CMV begrenset antigenkompleks.

Enhver av nukleinsyrekonstruksjonene beskrevet her omfatter minst en cis-virkende regulatorisk sekvens funksjonelt forbundet til de kodende polynukleotidene deri.

Fortrinnsvis er den cis-virkende regulatoriske sekvensen funksjonell i bakterier.

Alternativt er den cis-virkende regulatoriske sekvensen funksjonell i gjær. Alternativt er den cis-virkende regulatoriske sekvensen funksjonell i dyreceller. Alternativt er den cisvirkende regulatoriske sekvensen funksjonell i planteceller.

Den cis-virkende regulatoriske sekvensen kan inkludere en promotersekvens og ytterligere transkripsjonelle eller translasjonelle enhacersekvenser hvor alle tjener for å fremme ekspresjonen av polynukleotidene når introdusert i en vertscelle. Spesifikke eksempler på promotere er beskrevet her nedenfor i sammenheng av ulike eukaryote og prokaryote ekspresjonssystemer og i eksempelavsnittet som følger.

Det vil bli forstått at en enkel cis-virkende regulatorisk sekvens kan bli benyttet i en nukleinsyrekonstruksjon for å styre transkripsjon av et enkelt transkript som inkluderer en eller flere åpne leserammer. I det sistnevnte tilfellet kan et internt ribosom adgangssete (IRES) bli benyttet for å tillate translasjon av den internt posisjonerte nukleinsyresekvensen.

Hvor enn ko-ekspresjon av uavhengige polypeptider i en enkel celle er ønsket, må konstruksjonen eller konstruksjonene benyttet bli konfigurert slik at nivået av ekspresjon av de uavhengige polypeptidene er optimalisert, for å oppnå høyeste forhold av sluttproduktet.

Fortrinnsvis er en promoter (som et eksempel på en cis-virkende regulatorisk sekvens) benyttet ved nukleinsyrekonstruksjonen(e) av den foreliggende oppfinnelsen en sterk konstitutiv promoter slik at høye nivåer av ekspresjon er oppnådd for polynukleotidene etter vertscelletransformasjon.

Det vil bli forstått at høye nivåer av ekspresjon også kan bli utført ved å transformere vertscellen med et høy kopitall av nukleinsyrekonstruksjonen(e), eller ved å benytte cisvirkende sekvenser som stabiliseres det resulterende transkriptet og som på denne måten reduserer degraderingen eller ”turn-over” av et slikt transkript.

Som benyttet her beskriver frasen ”transformert celle” en celle hvori en eksogen nukleinsyresekvens er introdusert for derved stabilt eller transient genetisk endre vertscellen. Det kan forekomme under naturlige eller kunstige forhold ved å benytte ulike fremgangsmåter godt kjent i fagfeltet, hvor noen er beskrevet i detalj her nedenfor i sammenheng med spesifikke eksempler på vertsceller.

Den transformerte vertscellen kan være en eukaryot celle, slik som for eksempel en mammalsk celle, en insektcelle, en plantecelle, er gjærcelle og en protozoacelle, eller alternativt kan være en bakteriell celle.

Når benyttet for eukaryot vertscelle ekspresjon kan nukleinsyrekonstruksjonen(e) i henhold til den foreliggende oppfinnelsen være en skyttelvektor, som kan formere seg i både E.coli (hvor konstruksjonen omfatter en hensiktsmessig selekterbar markør og startsted for replikasjon) og være kompatibel for ekspresjon i eukaryote vertsceller. Nukleinsyrekonstruksjonen(e) i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel være et plasmid, et bacmid, en fagmid, et cosmid, en fag, et virus eller et kunstig kromosom.

Egnede mammalske ekspresjonssystemer inkluderer, men er ikke begrenset til pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pZeoSV2 (+/-), pSecTag2 , pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, hvor alle er tilgjengelige fra Invitrogen™ Corporation (Carlsbad, CA USA) , pCI som er tilgjengelig fra Promega™ Corporation (Madison WI USA) , pBK-RSV og pBK-CMV som er tilgjengelige fra Stratagene" (La Jolla, CA USA) , pTRES som er tilgjengelige fra Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA USA) og deres derivater.

Insektcellekulturer kan også bli benyttet for å uttrykke nukleinsyresekvensene av den foreliggende oppfinnelsen. Egnede insekts ekspresjonssystemer inkluderer, men er ikke begrenset til baculovirus ekspresjonssystemet og dets derivater som er kommersielt tilgjengelig fra tallrike leverandører slik som maxBac™ (Invitrogen™ Corporation, Carlsbad, CA USA) BacPak™ (Clontech* Laboratories, Inc. Mountain View, CA USA), eller Bac-to-Bac™ (Invitrogen™/Gibco*, Carlsbad, CA USA).

Ekspresjon av nukleinsyresekvensene av den foreliggende oppfinnelsen kan også bli utført i planteceller. Som benyttet her kan frasen ”planteceller” referere til planteprotoplaster, celler fra en kultur av plantevev, celler fra plantederiverte vev eller celler fra hele planter.

Det er ulike fremgangsmåter for å introdusere nukleinsyrekonstruksjoner i planteceller. Slike fremgangsmåter beror på enten stabil integrering av nukleinsyrekonstruksjonen eller en del derav i genomet av plantecellen, eller på transient ekspresjon av nukleinsyrekonstruksjonen, i hvilke tilfelle disse sekvensene ikke er stabilt integrert i genomet av plantecellen.

Det er to hovedmetoder for å utføre stabil genomisk integrering av eksogene nukleinsyresekvenser slik som dem inkludert i nukleinsyrekonstruksjonen av den foreliggende oppfinnelsen i plantecellegenomer:

(i) Agrobacterium mediert genoverføring; Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee og Rogers i Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds . Schell, J., og Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) s.2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds . Kung, S. og Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) s.93-112.

(ii) Direkte DNA opptak: Paszkowski et al., i Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., og Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) s.52-68; inkluderende fremgangsmåter for direkte oppptak av DNA i protoplaster, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. DNA opptak indusert ved kort elektrisk sjokk av planteceller: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. DNA injeksjon i planteceller eller vev ved partikkelbombardering, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; ved anvendelse av mikropipettesystemer: Neuhaus et al., Theor. Appl . Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant.(1990) 79:213-217; eller ved den direkte inkubering av DNA med spirende pollen, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. og Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) s. 197-209; og Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci . USA (1986) 83:715-719.

Agrobacterium systemet inkluderer anvendelsen av plasmidvektorer som inneholder definerte DNA segmenter som integrerer de genomiske DNA av planten.

Fremgangsmåter for inokulering av plantevevet varierer avhengig av plantearten og Agrobacterium leveringssystemet. En bredt benyttet fremgangsmåte er blad skiveprosedyren, se for eksempel Horsch et al., i Plant Molecular Biology Manual AS; Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988), s.1-9. En supplerende fremgangsmåtee benytter Agrobacterium leveringssystemet i kombinasjon med vakuum infiltrering. Agrobacterium systemet er spesielt viabelt ved dannelsen av stabilt transformerte tofrøbladete planter.

Det er ulike fremgangsmåter for direkte DNA overføring i planteceller. I elektroporering er protoplaster i korthet eksponert for et sterkt elektrisk felt. I mikroinjeksjon er DNA mekanisk injisert direkte inn i cellene ved å benytte veldig små mikropipetter. I mikropartikkel bombardering er DNA adsorbert på mikroprosjektiler slik som magnesium sulfat krystaller, wolframpartikler eller gullpartikler, og mikroprosjektilene er fysisk akselerert inn i cellene eller plantevevene. Direkte DNA overføring kan også bli benyttet for å transient transformere planteceller.

I ethvert tilfelle inkluderer egnede plantepromotere som kan bli benyttet for plantecelle ekspresjon av de første og andre nukleinsyresekvensene, men er ikke begrenset til CaMV 35S promoter, ubiquitin promoter og andre sterke promotere som kan uttrykke nukleinsyresekvensene på en konstitutiv eller vevsspesifikk måte.

Plantevirus kan også bli benyttet som transformasjonsvektorer. Virus som har blitt vist til å være nyttige for transformasjonen av plantecelleverter inkluderer CaV, TNC og BV. Transformasjon av planter ved å benytte plantevirus er beskrevet i US patent nr. 4,855,237 (BGV), EP-A 67,553 (TMV), japansk publisert søknad nr.63-14693 (TMV), og Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, s.172-189 (1988). Pseudoviruspartikler for anvendelse i å uttrykke fremmed DNA i mange verter, inkluderende planter, er beskrevet i WO 87/06261.

Konstruksjon av plante RNA virus for introduksjonen og ekspresjonen av ikke-virale eksogene nukleinsyresekvenser i planter er demonstrert ved referansene ovenfor så vel som ved Dawson W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; og Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269: 73-76.

Når viruset er et DNA virus kan konstruksjonene bli laget på viruset i seg selv.

Alternativt kan viruset først bli klonet inn i et bakterielt plasmid for å lette konstrueringen av den ønskede virale vektoren med nukleinsyresekvensene beskrevet ovenfor. Viruset kan så bli kuttet ut fra plasmidet. Om viruset er et DNA virus kan et bakterielt startsted for replikasjon bli festet til det virale DNA, som så er replikert ved bakterien. Transkripsjon av translasjon av dette DNA vil produsere kappeproteinet som vil innkapsle det virale DNA. Om viruset er et RNA virus er viruset generelt klonet som et cDNA og satt inn i et plasmid. Plasmidet er så benyttet for å lage alle konstruksjonene. RNA viruset er så produsert ved å transkribere den virale sekvensen av plasmidet og translasjon av de virale genene for å produsere proteinet som innkapsler det virale RNA.

Konstruksjon av plante RNA virus for introduksjonen og ekspresjonen i planter av ikkevirale eksogene nukleinsyresekvenser slik som dem inkludert i konstruksjonen av den foreliggende oppfinnelsen er demonstrert ved referansen ovenfor så vel som i US patent nr. 5,316,931.

Gjærceller kan også bli benyttet som vertsceller ved den foreliggende oppfinnelsen. Tallrike eksempler på gjær ekspresjonsvektorer egnet for ekspresjon av nukleinsyresekvensene av den foreliggende oppfinnelsen i gjær er kjent i fagfeltet og er kommersielt tilgjengelig. Slike vektorer er vanligvis introdusert i en gjærvertscelle via kjemiske eller elektroporerings tranformasjonsmetoder godt kjent i fagfeltet.

Kommersielt tilgjengelige systemer inkluderer for eksempel pYES<TM>(Invitrogen<TM>Corporation, Carlsbad CA, USA) eller YEX<TM>(Clontech® Laboratories, Mountain View, CA USA) ekspresjonssystemene.

Det vil bli forstått at når uttrykt i eukaryote ekspresjonssystemet slik som dem beskrevet ovenfor, inkluderer nukleinsyrekonstruksjonen fortrinnsvis en signalpeptid kodende sekvens slik at polypeptidene produsert fra de første og andre nukleinsyresekvensene er styrt via det festede signalpeptidet til sekresjonsveier. I mammalske, insekt og gjærvertsceller kan for eksempel de uttrykte polypeptidene bli skilt ut til vekstmediumet, imens i plante ekspresjonssystemer kan polypeptidene bli skilt ut i apoplasten, eller direkte i en subcellulær organelle.

En bakteriell vert kan bli transformert med nukleinsyresekvensen via tranformasjonsmetoder godt kjent i fagfeltet, inkluderende for eksempel kjemisk transformasjon (f.eks. CaCl2) eller elektroporering.

Tallrike eksempler på bakterielle ekspresjonssystemer som kan bli benyttet for å uttrykke nukleinsyresekvensene av den foreliggende oppfinnelsen er kjent i fagfeltet. Kommersielt tilgjengelige bakterielle ekspresjonssystemer inkluderer, men er ikke begrenset til pET<TM>ekspresjonssystemet, (Novagen®, EMB Bisciences, San Diageo, CA USA), pSE<TM>ekspresjonssystem (Invitrogen<TM>Corporation, Carlsbad CA, USA) eller pGEX<TM>ekspresjonssystemet (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ USA).

Som er ytterligere beskrevet i avsnittet for eksperimentelle detaljer som følger, er bakteriell ekspresjon spesielt fordelaktig siden de uttrykte polypeptidene danner egnede rene inklusjonslegemer enkelt medgjørlige for utvinning og rensing av det uttrykte polypeptidet.

Det beskrives derfor et preparat av bakterielt uttrykte inklusjonslegemer som består av over 30%, fortrinnsvis over 50%, mer foretrukket over 75%, mest foretrukket over 90% ved vekt av fusjonsproteinet eller en blanding av fusjonsproteiner av den foreliggende oppfinnelsen. Isoleringen av slike fusjonslegemer og rensingen av fusjonsproteinet/proteinene derfra er beskrevet i detalj i avsnittet for eksperimentelle detaljer som følger. Bakteriell ekspresjon av fusjonsproteinet/proteinene kan tilveiebringe høye mengder av rene og aktive former av fusjonsproteiner.

Som er ytterligere beskrevet i avsnittet for eksperimentelle detaljer som følger, danner de uttrykte fusjonsproteinene hovedsakelig rene inklusjonslegemer som enkelt er isolert via fraksjoneringsteknikker godt kjent i fagfeltet, og renset via for eksempel denaturerende/renaturende trinn.

Fusjonsproteinene beskrevet her kan bli renaturert og refoldet i nærværet av et MHC begrenset peptid, som enten er forbundet til, ko-uttrykt med eller blandet med andre polypeptider av oppfinnelsen og er i stand til å binde enkelkjede MHC klasse I polypeptidet. Som er ytterligere beskrevet i eksempelavsnittet muliggjør dette å generere et vesentlig rent MHC klasse I antigenisk peptidkompleks som videre kan bli renset via størrelses ekslusjonskromatografi.

Det vil bli forstått at CMV peptidet benyttet for redfolding kan bli ko-uttrykt sammen med (som et uavhengig peptid) eller bli fusjonert til scHLA-A2 kjeden av MHC klasse I molekylet i bakteriene. I et slikt tilfelle kan det uttrykte fusjonsproteinet og peptidet kodanne inklusjonslegemer som kan bli isolert og benyttet for MHC klasse I antigenisk peptidkompleksdannelse.

De følgende avsnittet tilveiebringer spesifikke eksempler for hvert av de ulike aspektene av oppfinnelsen beskrevet her. Disse eksemplene burde ikke bli ansett som begrensende på noen måte, ettersom oppfinnelsen kan bli praktisert på liknende, men likevel noe forskjellige måter. Disse eksemplene viser imidlertid for en fagperson hvordan man praktiserer ulike alternativer og utførelsesformer av oppfinnelsen.

Nomeklaturen benyttet her og laboratorieprosedyrene benyttet i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer generelt molekylære, biokjemiske, mikrobiologiske og rekombinante DNA teknikker. Slike teknikker er grunidg forklart i litteraturen. Se for eksempel "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al . ,

(1989) ; "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III

Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al . , "Current Protocols in

Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal , "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al . , "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al . (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", VoIs.1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) ; methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos .

4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al . (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition) , Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ,- Mishell and Shiigi (eds) , "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); available immunoassays are extensively described in the patent and scientific literature, see, for example, U.S. Pat. Nos.

3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262;

3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219;

5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al . , "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Andre generelle referanser er tilveiebrakt gjennom dette dokumentet.

Prosedyrene deri er trodd å være godt kjent i fagfeltet og er tilveiebrakt for bekvemmeligheten for leseren.

Eksperimentelle detaljer

Materialer og fremgangsmåter:

Kloning av forbindelse A

scHLA-A2/SSI (ScFv) ble konstruert som tidligere beskrevet ved å forbinde den C-terminale enden fra scHLA-A2 til den N-terminale enden fra SS1 scFv via en kort linker ASGG (SEQ ID NO: 4) (15). For å konstruere scHLA-A2/SSI (ScFv) med kovalent bundet MHC begrenset peptid, ble det MHC begrensende peptidet fusjonert med peptidlinkeren GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6) til den N-terminale enden av scHLA-A2/SSI (ScFv) molekylet ved en PCR overlappende forlengelsesreaksjon med primerne: 5 ' Ml-5 'GGAAGCGTTGGCGCATATGGGCATTCTGGGCTTCGTGTTTACC CTGGGCGGAGGAGGATCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGA TCCAGCGTACTCCAAAG3 ' (SEQ ID NO: 13) and 3'VLscSSl-5<1>GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTATTTCCAACTTTGTS ' (SEQ ID NO: 14). I 5’ M1 primeren ble en stille mutasjon satt inn ved linkersekvensen, denne endringen i sekvens skaper et BamH1 restriksjonssete.

PCR produktene ble subklonet til TA kloningsvektor pGEM-T Easy vektor, Promega<TM>Corporation, Madison, WI USA) og deretter til en T7 promoterbasert ekspresjonsvektor (PRB) ved å benytte NdeI og EcorI restriksjonssetene.

For å generere forbindelse A ble M1/scHLA-A2/SS1 (scFv) benyttet som et templat for ligering med dsDNA primere M1/scHLA-A2/SS1 (scFv) (i PRB plasmid) ble fordøyd med NdeI og BamHI og plasmidfraksjonen ble ligert til dsDNA primer inneholdende CMV peptidsekvensen og forlengelsen av linkersekvensen 5 ' CMVcovLL (kassett) : 5 ' TATGAACCTGGTGCCGATGGTCGCGACCGT TGGAGGTGGCGGTTCTGGCGGAGGAG-3<«>(SEQ ID NO: 15) and 3 ' CMVcovLL (kassett) : 5<1>GATC CTCCTCCGCCAGAACCGCCACCTCCAACGGTCGCGACCATCGGCACCAGGT TCAS ' (SEQ ID NO: 16). Sammensmeltingen av primerne (5’ CMVcovLL (kassett) og 3’CMVcovLL (kassett) ble utført ved inkubering av primerne ved 95<o>C i 2 min. etterfulgt ved 1 times inkubering ved romtemperatur. Ligeringsproduktet ble transformert til E-coli DH5 α for plasmid amplifisering. Plasmid ble renset ved QIAGEN® miniprep sett (Qiagen®, Inc., Valencia, CA USA) og prøver ble tatt for sekvensanalyse.

Ekspresjon, refolding og rensing av forbindelse A

Forbindelse A ble uttrykt i E-coli LB21 (�DE3) celler (Novagen®, Madison, WI USA) som inklusjonslegemer. Forbindelse A konstruksjon ble transformert til E-coli celler ved varmesjokk, celler ble platet og LBAMP plater og inkubert over natten ved 37<o>C. Kolonier ble overført til rikt medium (super broth) supplert med glukose, MgSO4, AMP og salter. Cellene ble dyrket til DO=2 (600 nm) ved 37<o>C, indusert med IPTG (endelig konsentrasjon 1 mM) og inkubert i ytterligere 3 timer ved 37<o>C.

Inklusjonslegemer ble renset fra cellepellet ved celleødeleggelse ved 0,2 mg/ml av lysozym etterfulgt ved tilsettingen av 2,5% Triton® x-100 (oktylfenolpoly [etylenglykoleter]x, Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) og 0,5 M NaCl. Pelletene fra inklusjonslegemene ble samlet ved sentrifugering (13.000 rpm, 60 min. ved 4<o>C) og vasket tre ganger med 50 mM Tries buffer, pH 7,4 inneholdende 20 mM EDTA. De isolerte og rensede inklusjonslegemene ble oppløst i 6 M guanidin HCl pH 7,4, etterfulgt ved reduksjon med 65 mM DTE. Oppløste og reduserte inklusjonslegemer ble refoldet ved en 1:100 fortynning i et redeox-skyflingsbuffer system inneholdende 0,1 M Tris, 0,001 M EDTA, 0,5 M arginin og 0,09 mM oksidert glutation, pH 9, og inkubering ved 10<o>C i 24 timer. Etter å ha blitt refoldet ble proteinet dialysert mot 150 mM urea, 20 mM Tris, pH 8, etterfulgt ved rensing av den løselige forbindelsen A ved ionebyttekromatografi på en Q-Sepahrose® kolonne (7,5 mm I.D.60 cm) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA), ved å benytte en saltgradient (NaCl). Toppfraksjoner inneholdende forbindelse A bli så utsatt for bufferutveksling med PBS.

Flow cytometri

Celler ble inkubert med forbindelse A (60 min. ved 4<o>C i 100 µl. (10 µl/ml), vasket og inkubert med anti-HLA-A2 mAb BB7.2 (60 min. ved 4<o>C, 10 µl/ml). Cellene ble vasket og inkubert med anti-mus FITC (60 min. ved 4<o>C, 10 µl/ml) som tjente som et sekundært antistoff. Cellene ble deretter vasket og analysert ved et FACS kaliber flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA USA).

Enzymforbundet immunsorbent test

Immunplater (Falcon®, Becton-Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ USA) ble belagt med 10 µg/ml av renset bakterielt produsert rekombinant mesotelin (O/N ved 4<o>C). Platene ble blokkert med PBS inneholdende 2% skummet melk og så inkubert med ulike konsentrasjoner av forbindelse A (60 min. ved romtemperatur) og vasket tre ganger med PBS. Binding ble detektert ved å benytte anti-HLA konformasjonsavhengig antistoff Wg/32 (60 min., romtemperatur, 1 µg/ml), plater ble vasket tre ganger med PBS og inkubert med anti-mus IgG-peroxidase (60 min., romtemperatur, 1 µg/ml). Reaksjonen ble utviklet ved å benytte TMB (DAKO) og terminert ved tilsettingen av 50 µl H2SO42N. Anti-mesotelin antistoff (K1) ble benyttet som en positiv kontroll.

Immunplatene ble analysert ved ELISA leser ved å benytte 450 nm filter (Anthos 2001<TM>, Anthos Labtech, Salzburg, Østerrike).

Cytotoksisitetstester

Cytotoksisitet le bestemt ved S<35>-metionin frigjøringstester. Målceller ble dyrket i dyrkningsplater i RPMI 10% FCS metioninfri i 2 timer, etterfulgt ved inkubering over natt med 15 µCi/ml av S<35>metionin (NEN). Målcellene ble høstet ved trypsinering og vasket to ganger med 40 ml RPMI 10% FCS. Målcellene ble plantet i 96-brønners plater (5∙10<3>celler per brønn) i RPMI+10% FCS og inkubert over natt ved 37<o>C, 5% CO2. Målceller ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av forbindelse A fusjonsproteiner i 2 timer, effektor CTL celler ble tilsatt ved forskjellige mål: effektorforhold og platene ble inkubert i 8-12 timer ved 37<o>C, 5% CO2. Etter inkubering ble S<35>-metioninfrigjøring fra målceller målt i en 25 µl prøve fra dyrkningssupernatanten. Alle tester ble utført i triplikat, lysis ble kalkulert direkte: ([eksperimentell frigjøring – spontan frigjøring/ [maksimal frigjøring – spontan frigjøring]) ∙100- Spontan frigjøring ble målt som S<35>-metionin frigjort fra målceller i fraværet av effektorceller, og maksimal frigjøring ble målt som S<35>-metionin frigjort fra målceller lysert ved 0,05 M NaOH.

Cellelinjer

A431 og A431K5 celler (epidermoid karsinom) ble opprettholdt i RPMI medium inneholdende 10% FCS, L-glutamin og pencillin/streptomycin. A431K5 cellelinjen er en human epidermoid karsinom A431 cellelinje stabilt tranfekltert med mesotelin, de transfekterte cellene ble opprettholdt med 700 µg/ml G418 (Gibco-BRL®, Invitrogen<TM>Inc., Carlsbad, CA USA).

CTL med spesifisitet for CMV pp65 epitop (NLVPMVATV) ble vennlig tilveiebrakt ved dr. Ditmar Zehn (Charitee, Berlin). CTL ble ekspandert ved inkubering med peptidpulsede, bestrålte (4000 rad) PBMC fra en frisk HLA-A2 positiv donor og ble opprettholdt i AIMV medium 8,9% FCS 50 µM 2-merkaptoetanol pencillin/streptomycin 1∙10<5>U/L.

Resultater:

Konstruksjon av forbindelse A

En konstruksjon kodende for et enkelkjede MHC molekyl bestående av β-2 mikroglobulingenet fusjonert til α1, α2 og α3 av HLA-A2 genet via en kort peptidlinker (15 aminosyrer) ble fusjonert til scFv SS1 som målsøker mesotelin (figur 1A). Denne konstruksjonen ble analysert i detalj for dens biokjemiske og biologiske aktivitet og ble funnet til å være funksjonell in-vitro og in-vivo (15). For å konstruere et fusjonsprotein med kovalent forbundet peptid ble et peptid på 9 aminosyrer derivert fra CMV pp65 proteinet (NLVPMVATV) (SEQ ID NO: 4) fusjonert til den N-terminale enden av scHLA-A2/SS1 (scFv) fusjonsproteinet via en linker på 20 aminosyrer GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6) (figur IB). Forbindelse A ble konstruert i to trinn: Først ble et kovalent fusjonsprotein kalt M1/ScHLA-A2/SS1 (scFv) konstrukert ved overlappende forlengelses PCR. I denne konstruksjonen ble influensa M158-66 peptidet GILFGFVFTL (SEQ ID NO: 21) og en linker på 15 aminosyrer fusjonert til den N-terminale enden av ScHLA-A2/SS1 (scFv) fusjonsproteinet. I denne konstruksjonen ble et nytt unikt restriksjonssete (BamHI) satt inn i linkersekvensen ved en stille mutasjon. I det andre trinnet ble PRB plasmid inneholdende den fulle sekvensen av M1/ScHLA-A2/SS1 (scFv) fordøyd med NdeI og BamHi restriksjonsenzymer. Denne fordøyingen produserte to fragmenter. Et fragment inneholder peptidet og del av linkersekvensen, og det andre fragmentet inneholder plasmidet, del av linkeren og ScHLA-A2/SS1 (scFv) sekvensen. Fragmentet som inneholder plasmidet, del av linkeren og ScHLA-A2/SS1 (scFv) sekvensen ble så ligert til dsDNA primer som koder for CMV PP65 peptidsekvensen og en utvidelse av linkersekvensen (figur 1B). Det nye plasmidet ble transformert til E-coli DH5 α celler og positive kolonier ble sendt til DNA sekvensering (figur 2).

Ekspresjon og rensing av forbindelse A

Forbindelse A bli uttrykt i E.coli BL21 celler og induksjon med isopropyl β-D-tiogalaktosidase, ble store mengder av rekombinant protein akkumulert i intracellulære inklusjonslegemer. SDS/PAGE analyse av isolerte og rensede inklusjonslegemer viste at forbindelse A med den korrekte størrelsen utgjorde 80-90% av den totale massen av inklusjonslegemer (figur 3A). De isolerte oppløste inklusjonslegemene ble redusert og refoldet in-vitro i en redox-skyflingsbuffer. Monomere løselige fusjonsproteiner (forbindelse A) ble renset ved ionebytterkromatografi på en Q-Sepharose®. SDS/PAGE analyse av forbindelse A viste et sterkt renset monomert molekyl med den forventede størrelsen på 72 kDa (figur 3B).

Biologisk aktivitet av forbindelse A

ELISA

For å teste bindingsevnen av renset forbindelse A til dets målantigen, ble rekombinant mesotelin immobilisert til immunplater. Bindingen av forbindelse A ble monitorert ved å benytte konformasjonssensitivt mAb W6/32, dette antistoffegt gjenkjenner MHC molekyler som er foldet korrekt med et peptid is in grop. Som vist i figur 4 var bindingen av forbindelse A til rekombinant mesotelin doseavhengig. Dette antyder at de to funksjonelle domenene av forbindelse A, scFv (SS1) domene og peptid/scHLA-A2 domene er foldet korrekt. Videre er scFV (SS1) domene av funksjonsproteinet i aktiv form og kan spesifikt binde mesotelin.

Flow cytometri analyse (FACS)

For å teste bindingsevnen av forbindelse A til mesotelinuttrykkende cellelinjer, ble FACS analyse gjort. Som en modell ble målceller som er HLA-A2 negative benyttet, på denne måten kan reaktiviteten av et anti-HLA-A2 mAb bli benyttet for å måle bindingen av forbindelse A til celler som uttrykker mesotelin på deres overflate. Denne modellen av mesotelin-positive HLA-A2-negative celler representerer ekstreme tilfeller hvor tumorcellene taper deres HLA ekspresjon. For FACS analysen ble derfor HLA-A2-negtive A431K5 celler benyttet, som er humane epidermoid karsinom A431 celler som ble stabilt transfektert med mesotelin. A431 humane epodermoid karsinomcellene som er mesotelin-negative og HLA-A2-negative er benyttet som negativ kontroll. Bindingen av forbindelse A er benyttet som negativ kontroll. Bindingen av forbindelse A til målcellene ble monitorert med anti-HLA-A2 mAb BB7.2 som primært antistoff, etterfulgt ved et FITC merket sekundært antistoff. Et mesotelin anti-mAb K1 ble benyttet for å teste ekspresjonsnivået av mesotelin. Som vist i figur 5A uttrykker A431K5 celler høye nivåer av mesotelin, mens A431 modercellene ikke uttrykker målantigenet. Cellelinjene A431 og A431K5 ble også testet for ekspresjonen av HLA-A2 ved å benyttet HLA-A2 spesifikt antistoff (BB7.2), begge cellelinjene var HLA-A2 negative. Når A431K5 celler imidlertid ble pre-inkubert md forbindelse; ble de positivt farget med det HLA-A2 spesifikke antistoffet BB7.2 (figur 5B). Antigen-negative A431 celler ble ikke påvirket. Den spesifikke bindingen av forbindelse A til A431K5, men ikke til A431 celler indikerer videre at bindingen er eksklusivt avhengig av interaksjonen av det målsøkende scFv domene av fusjonen med mesotelin, og at fusjonsproteinet kan binde dets målantigen som nativt uttrykt på overflaten av celler.

Cytotoksisitetstest

For å teste evnen av forbindelse A til å meditiere drepingen av HLA-A2-negative mesotelin-positive celler ved HLA-A2 begrensede CMV pp65 NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4) spesifikke CTLS, ble S<35>-metionion frigjøringstest utført ved å benytte HLA-A2-negative mesotinintransfektive A431K5 celler og de HLA-A2-negative mesotelinnegative A431 modercellene. For å bestemme det drepende potensiale av de CMV spesifikke CTL, ble cytotoksisitetstest utført ved å benytte HLA-A2-positive JY celler som var radiaktivt med MetS<35>og ladet med CMV peptidet NLVPMVATV. Den gjennomsnittlige spesifikke drepingen av JY cellene ved de CMV spesifikke CTL var 47% med et E:T forhold på 10:1 (data ikke vist). Som vist i figur 6A medierte forbindelse A effektivt drepingen av A431K5 cellene (mesotelin-positive HLA-A2-negative). Spesifikk dreping kan nå 66% i sammenlikning med pepitidlastede JY celler. Dreping med fusjonsproteinet var derfor ennå mer effektiv sammenliknet med peptidpulsede antigenpresenterende celler som representerer optimale mål. Når A431K5 målcellene ble inkubert med de CMV spesifikke CTL alene uten pre-inkubering med forbindelse A, eller når målcellene var A431 mesotelin-negative celler med eller uten pre-inkubering med forbindelse A, ble imidlertid ingen cytotoksisk aktivitet observert. Videre ble et titreringseksperiment utført for å bestemme potensen av forbindelse A, som vist i figur 6B, drepingen av mesotelin-positive A431K5 celler var doseavhening med en IC50på 0,5-1 µg/ml.

Disse resultatene indikerer drepingen av mesotelin-positive HLA-A2-negative A431K5 celler for spesifikk og kontrollert ved gjenkjenningen av mesotelin ved det målsøkende domene av forbindelse A (scFv/SS1) og spesifisiteten av CMV CTL til peptid/scHLA-A2 domene.

Denne studien demonstrerer evnen til å målsøke kovalent bundet peptid/scMHC/scFv fusjonsprotein til tumorceller som kan gjøre HLA-A2-negative celler mottakelige for lysis ved de relevante HLA-A2 begrensede CTL. Som tidligere vist ved Lev. et al., og Oved et al. (15,21), har denne strategien to hovedfordeler. Først tar den fordel av anvendelsen av rekombinante Ab fragmenter som kan lokaliseres på de maligne cellene som uttrykker en tumormarkør, vanligvis assosiert med den transformerte fenotypen (slik som vekstfaktor reseptorer og/eller differensierings antigener) med en relativt høy grad av spesifisitet. For den andre har denne strategien evnen til å rekruttere en bestemt populasjon av sterkt reaktive cytotoksiske T-celler spesifikke for en på forhånd valgt, sterkt antigenisk peptidepitop til stede i det målrettede MHC peptidkomplekset, slik som viralspesifikke T-celle epitoper. Denne plattformmetoden genererer multiple molekyler med mange tumorspesifikke scFv fragmenter som målsøker ulike tumorspesifikke antigener, kombinert med evnen til å målsøke mange typer av MHC peptidkomplekser som bærer, enkle, på forhånd valgte, og sterkt antigeniske peptider derivert fra tumor, viral eller bakterielle T-celle epitoper. Disse eksemplene presenterer et strategitrinn videre ved å fusjonere pepidet på 8 aminosyrer forbundet ved en kort linker (20AA) til det tidligere rapporterte scHLA-A2/scFv fusjonsproteinet (15AA), og på denne måten stabilisere peptidet i MHC gropen som forlenger den generelle stabiliteten av fusjonsproteinet. Som en modell for denne nye genereringen av fusjonsproteiner, er den foreliggende oppfinnelsen relatert til konstruksjon av et fusjonsprotein hvor CMV pp65 (NLVPMVATV) er fusjoner til den N-terminale enden av scHLA-A2/SS1 (scFv) molekylet og dets biokjemiske og biologiske egenskaper. Det er vist at de to domenene av det nye fusjonsproteinet kan refoldes in vitro for å danne korrekt foldede molekyler med peptidet i HLA-A2 gropen og et aktivt målsøkende domene (scFv) som spesifikt kan binde dets målantigen. Videre har dette fusjonsproteinet vellykket mediert lysisen av HLA-A2-negative mesotelin-positive tumorceller ved HLA-A2 begrensede CTL.

Tumorprogresjon er ofte assosiert med sekresjonen av immunundertrykkende faktorer og/eller nedreguleringen av MHC klasse I antigenpresenterende funksjoner (2). Til og med når en spesifikk CTL respons er demonstrert i pasienter, er denne responsen lav fordi antitumor CTL populasjonen er sjelden, veldig ualminnelig, og i noen tilfeller er CTL ikke funksjonelle eller anergiske (26). Videre er det godt etablert at antallet av MHC peptidkomplekser på overflaten av tumorceller som presenterer et bestemt tumorassosiert peptid er lavt (27). Som vist her overvant denne nye strategien disse problemene. Først er tumorcellene belagt med MHC peptidkomplekser uavhengig av deres endogene MHC ekspresjon. For det andre hindrer anvendelsen av tumorspesifikke antigener som vanligvis er del av tumor fenotypen (slik som vekstfaktor reseptorer og differensierings antigener) nedreguleringen av de antigene og forlenger virkningen av behandlingen. For det tredje og aller viktigst, kan effektordomene av MHC peptidkomplekset rekruttere spesifikke populasjoner av CLT avhengig av peptidet som er i MHC gropen.

Det er forstått at enkelte trekk av oppfinnelsen, som for klarhet er beskrevet i konteksten av separate utførelsesformer, også kan bli tilveiebrakt i kombinasjon med en enkel utførelsesform. Omvendt kan ulike trekk av oppfinnelsen, som i korthet er beskrevet i konteksten av en enkel utførelsesform, også bli tilveiebrakt separat eller i enhver egnet delkombinasjon.

Referanser

1. Gilboa.E. How tumors escape immune destruction and what we can do about it. Cancer Immunol. Immunother. 48, 382-385 (1999) .

2. Seliger,B., Maeurer,M. J. , & Ferrone , S . Antigen- processing machinery breakdown and tumor growth. Immunol. Today 21, 455-464 (2000) .

3. Garcia-Lora,A. , Algarra,I., & Garrido,F. MHC class I antigens, immune surveillance, and tumor immune escape. J. Cell Physiol 195, 346-355 (2003) .

4. Garrido,F. & Algarra,I. MHC antigens and tumor escape from immune surveillance. Adv. Cancer Res.83, 117-158 (2001) .

5. McLaughlin, P. et al . Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma: half of patients respond to a four-dose treatment program. J. Clin. Oncol.16, 2825-2833 (1998) .

6. Cobleigh,M.A. et al . Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. J. Clin. Oncol.17, 2639-2648 (1999) .

7. Pastan,I. & Kreitman,R. J. immunotoxins in cancer therapy. Curr. Opin.

Investig. Drugs 3, 1089-1091 (2002) .

8. Boon, T. Sc van der,B.P. Human tumor antigens recognized by T-lymphocytes . J. Exp. Med.183, 725-729 (1996).

9. Esche,C, Shurin,M.R., & Lotze,M.T. The use of dendritic cells for cancer vaccination. Curr. Opin. MoI. Ther.1, 72-81 (1999) .

10. Offringa,R. , van der Burg, S.H., Ossendorp, F. , Toes, R. E., & Melief,C.J. Design and evaluation of antigen-specific vaccination strategies against cancer. Curr. Opin. Immunol. 12, 576-582 (2000) .

11. Wang, E., Phan,G.Q., & Marincola, F.M. T-cell- directed cancer vaccines: the melanoma model. Expert. Opin. Biol. Ther.1, 277-290 (2001).

12. Dudley, M. E. et al . Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 298, 850-854 (2002) .

13. Dudley,M.E. & Rosenberg, S.A. Adoptive-eel1- transfer therapy for the treatment of patients with cancer. Nat. Rev. Cancer 3, 666-675 (2003).

14. Rosenberg, S.A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 411, 380-384 (2001) .

15. Lev,A. et al . Tumor-specific Ab-mediated targeting of MHC-peptide complexes induces regression of human tumor xenografts in vivo. Proc . Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 9051-9056 (2004) .

16. Donda,A. et al . In vivo targeting of an anti-tumor antibody coupled to antigenic MHC class I complexes induces specific growth inhibition and regression of established syngeneic tumor grafts. Cancer immun.3, 11 (2003).

17. Ogg,G.S. et al . Sensitization of tumour cells to lysis by virus-specific CTL using antibody-targeted MHC class I/peptide complexes. Br. J. Cancer 82, 1058-1062 (2000).

18. Robert, B., Guillaume, P. , Luescher, I . , Romero, P., & Mach,J.P. Antibodyconjugated MHC class I tetramers can target tumor cells for specific lysis by T-lymphocytes . Eur. J. Immunol. 30, 3165-3170 (2000) .

19. Robert, B. et al . Redirecting anti-viral CTL against cancer cells by surface targeting of monomeric MHC class I- viral peptide conjugated to antibody fragments. Cancer Immun. 1, 2 (2001) .

20. Savage, P. et al . Anti-viral cytotoxic T-cells inhibit the growth of cancer cells with antibody targeted HLA class I/peptide complexes in SCID mice. Int. J. Cancer 98, 561-566 (2002) .

21. Oved,K., Lev,A. , Noy,R., Segal, D. , & Reiter,Y. Antibody-mediated targeting of human single-chain class I MHC with covalently linked peptides induces efficient killing of tumor cells by tumor or viral- specific cytotoxic T-lymphocytes . Cancer Immunol. Immunother. 54, 867-879 (2005) .

22. Chang, K. & Pastan,I. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding a protein detected by the Kl antibody from an ovarian carcinoma (OVCAR-3) cell line. Int. J. Cancer 57, 90-97 (1994).

23. Chang, K. & Pastan,I. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc . Natl. Acad. Sci . U. S. A 93, 136-140 (1996) .

24. Chang, K. & Pastan,I. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 93, 136-140 (1996) .

25. Hassan, R., Bera,T., & Pastan.I. Mesothelin: a new target for immunotherapy. Clin. Cancer Res. 10, 3937-3942 (2004) .

26. Lee, P. P. et al . Characterization of circulating T- cells specific for tumorassociated antigens in melanoma patients. Nat. Med.5, 677-685 (1999).

27. Christinck,E.R. , Luscher,M.A. , Barber, B. H., & Williams, D. B. Peptide binding to class I MHC on living cells and quantitation of complexes required for CTL lysis. Nature 352, 67-70 (1991) .

28. Jain, R. K. Transport of molecules, particles, and cells in solid tumors. Annu. Rev. Biomed. Eng 1, 241-263 (1999).

29. Bromley, S. K. et al . The immunological synapse.

Annu. Rev. Immunol.19, 375-396 (2001).

30. Lanzavecchia,A. , Lezzi,G., & Viola,A. From TCR engagement to T-cell activation: a kinetic view of T-cell behavior. Cell 96, 1-4 (1999).

31. Chang, K., Pastan, I. & Willingham, M. C. Isolation and characterization of a monoclonal antibody, Kl, reactive with ovarian cancers and normal mesothelium. Int. J. Cancer 50, 373-381(1992) .

32. Chang, K., Pai, L. H., Batra, J. K., Pastan, I. & Willingham, M. C.

Characterization of the antigen (CAKl) recognized by monoclonal antibody Kl present on ovarian cancers and normal mesothelium. Cancer Res. 52, 181-186 (1992) .

33. Parham, P., Barnstable, C. J. & Bodmer, W. F. Use of a monoclonal antibody (W6/32) in structural studies of HLA-A, B, C, antigens. J. Immunol. 123, 342-349 (1979).

34. Shields, M. J. & Ribaudo, R. K. Mapping of the monoclonal antibody W6/32 : sensitivity to the amino terminus of beta2-microglobulin. Tissue Antigens 51, 567-570 (1998) .

35. Parham, P. & Brodsky, F. M. Partial purification and some properties of BB7.2. A cytotoxic monoclonal antibody with specificity for HLA-A2 and a variant of HLA-A28. Hum. Immunol.3, 277-299 (1981).