CN104926941A - 牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体、制备方法及其用途。所述的单链抗体所述单链抗体包括牛抗体轻链可变区VL、中间连接肽Linker和牛抗体重链可变区VH，其连接顺序是VL-Linker-VH；其中：所述牛抗体轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No：1～8所示；所述牛抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：9～16所示。本发明将筛选到的阳性克隆的单链抗体(scFv)联合应用进行体内外抑制金黄色葡萄球菌试验，取得了理想的抑菌效果，本发明单链抗体可用于制备预防和治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎药物。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体的说，涉及一种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体、制备方法以及其用途。
背景技术
单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无Fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。
奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌，流行率达到了50％，导致的经济损失最大。主要是因为金黄色葡萄球菌具有传染性且治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈；目前针对金黄色葡萄球菌全菌和各个毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的预防，但是效果均不理想。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及可以大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体、制备方法及其用途。本发明的单链抗体能够与金黄色葡萄球菌特异性结合，且具有一定的抑菌活性，能够用于制备金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺炎预防和治疗药物。
本发明技术方案具体介绍如下。
本发明提供一种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体，所述单链抗体包括牛抗体轻链可变区VL、中间连接肽Linker和牛抗体重链可变区VH，其连接顺序是VL-Linker-VH；其中：
所述牛抗体轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No：1～8所示；
所述牛抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：9～16所示。
本发明中，所述中间连接肽的氨基酸序列如下：
GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGATCT。
本发明中，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No：17～24所示。
本发明还提供一种含有编码上述单链抗体基因的载体。上述载体为噬菌粒载体，优选为pCANTAB5E载体。
本发明还提供一种由上述噬菌粒载体转化的宿主细胞，其为TG1细胞。
本发明还提供一种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区基因VH；
(2)利用SOE-PCR法将linker与VL基因和VH基因相连构建牛源性单链抗体基因；
(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中，构建重组质粒；
(4)将步骤(3)的重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体M13KO7扩增建立初级单链抗体文库；
(5)用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，富集淘选四轮；
(6)采用phage ELISA,用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，筛选阳性克隆；
(7)分离纯化步骤(6)所得培养产物即获得所述牛源性抗金黄色葡萄球菌的单链抗体(按照上海意泓生物科技有限公司纯化柱说明书操作进行)。
本发明还进一步提供上述牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体在制备金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺炎预防和治疗药物中的应用。本发明中，将筛选到的阳性克隆的单链抗体(scFv)联合应用进行体内外抑制金黄色葡萄球菌试验，取得了理想的抑菌效果。
需要说明的是,以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法，各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得，其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的方法准确获得。
本发明中，在构建重组牛源单链抗体(scFv)时，按照VL-Linker-VH的顺序，将牛抗体轻链可变区(VL)和牛抗体重链可变区(VH)用中间的Linker进行连接，构成的牛源单链抗体片段(VL-Linker-VH)，这样连接被本发明证明构建重组牛源scFv更为有效，而一般的文献报道都是按照VH-Linker-VL的顺序连接的；本发明中的牛源抗金黄色葡萄球菌的基因工程单链抗体(scFv)能与金黄色葡萄球菌特异性结合，抗体联合具有一定的体外抑菌活性和对金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎的体内保护作用，而且8个scFv联合应用效果更佳。
附图说明
图1是实施例1的噬菌粒载体pCANTAB5E的结构图。
图2是phage ELISA筛选到的8个scFv阳性克隆；其中：phage ELISA筛选到的8个scFv阳性克隆，NC为阴性对照，ZW1-ZW88为scFv阳性克隆。
图3是筛选到的8个scFv单独和联合体外抑菌结果；其中：PC为阳性对照，ZW1-ZW88为scFv单个抑菌结果；Mixture为8个scFv联合抑菌结果。Blank为空白对照。
图4是8个单链抗体(scFv)对细胞因子IL-4的含量影响；其中：C空白对照，PC阳性对照，NC阴性对照，scFv为单链抗体处理组。
图5是8个单链抗体(scFv)炎症因子TNF-α的含量影响；其中：C空白对照，PC阳性对照，NC阴性对照，scFv为单链抗体处理组。
具体实施方式
实施例1牛源噬菌体单链抗体库的构建
1：采集患乳腺炎的奶牛血液，ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，继续后续实验。将抗凝血提取牛外周血白细胞，用Trizol法(TRIZOL Reagent购自TaKaRa公司)提取总RNA。以提取的总RNA为模版，采用Oligo primer，根据反转录试剂盒(cDNA第1链合成试剂盒购自TaKaRa公司)的产品说明操作步骤，合成第1链cDNA。
2：分析已发表文献中的牛抗体编码基因可变区序列，根据其FR区设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中VH F和VH R用于扩增VH区；VL F和VL R用于扩增VL区。其中，VLF、VH R分别含有Sfi I和Not I酶切位点；VH F、VL R含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
3：VH和VL基因的扩增以cDNA为模版，VH F、VH R为引物扩增VH基因；VL F、VLR为引物扩增VL基因。PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物(25μM)各1μL，ddH2O 8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据AxyGEN公司提供的胶回收说明书操作)。
4：ScFv基因的获得通过重组链延伸反应(SOE-PCR)将含有Linker序列的VL和VH基因连接为ScFv基因(VL-linker-VH)，并加入Sfi I和Not I酶切位点。
5：初级文库的构建根据常规分子克隆方法(参照J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》)，ScFv基因和pCANTAB5E载体分别经Sfi I和Not I双酶切后，将ScFv基因插入pCANTAB5E载体，构建重组表达质粒(参见图1)，并将其电转化TG1感受态细胞，转化50次，合并所有电转化培养液，取一小部分系列稀释后涂布于YT-AG固体培养板，30℃过夜培养计算库容量(挑取克隆进行菌落PCR和质粒双酶切验证，测序验证库的多样性)；通过菌落PCR计算阳性率，得到实际的库容量。将剩余的细菌培养液通过辅助噬菌体M13KO7拯救后建立初级文库。
实施例2牛源抗金黄色葡萄球菌单链抗体的筛选
1：富集淘选制备金黄色葡萄球菌全菌抗原(ATCC25923)，4℃包被过夜；用含4％脱脂奶粉的PBS封闭96孔板37℃孵育2h；向96孔板中加入上述步骤中制备好的单链抗体噬菌体抗体库，37℃孵育2h，用PBST和PBS各洗10次，洗掉未结合的游离噬菌体；每孔加入100μl 0.2mol/L Gly-Hcl缓冲液(pH＝2.2)洗脱特异性结合的噬菌体，加入50μl 1mol/LTris-Hcl(PH＝9.1)中和洗脱液；将剩余部分洗脱液感染大肠杆菌TG1后，重复上述步骤。如此重复3-5轮，在第一轮过后，要增加洗涤的严谨性：洗脱前用PBST洗脱20次后用PBS洗涤20次。
2：phage ELISA筛选从第四轮中随机取96个克隆，用M13K07拯救后制备重组噬菌体。金黄色葡萄球菌全菌抗原(ATCC25923)用50mmol/L碳酸氢钠盐溶液(pH9.6)于4℃包被过夜，4％脱脂奶粉溶液封闭1h后用PBST(0.1％Tween20，以下同)洗涤3次；加入上述制备好的噬菌体单链抗体，37℃反应2h，PBST和PBS各洗涤6次；加入HRP-antiM13抗体100μL(1:4000)，37℃反应1h，PBST和PBS各洗涤6次；TMB显色，2mol/L硫酸终止反应，酶标仪读取OD450值，同时设辅助噬菌体M13K07为阴性对照。ELISA结果的判定以P/N(P为阳性孔的OD450值，N为阴性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N＜2.1为可疑；P/N＜1.5为阴性(图2)。(参照姚火春主编《兽医微生物学实验指导》)。
实施例3重组scFv序列分析
对获得的8个单链抗体ZW.1,ZW.2,ZW.12,ZW.22,ZW.33,ZW.68,ZW.73,ZW.88编码基因进行测序，证明其按照正确的阅读框顺序插入到噬菌粒载体pCANTAB5E中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.17～24所示，其序列顺序是VL-Linker-VH。
实施例4重组scFv序列表达产物纯化
将获得的8个单链抗体ZW.1,ZW.2,ZW.12,ZW.22,ZW.33,ZW.68,ZW.73,ZW.88和pET-28a载体经过NcoI和NotI双酶切后连接转化大肠杆菌Rosetta，经IPTG诱导表达并进行纯化。
实施例5scFv体外抑菌实验
将获得的8个单链抗体ZW.1,ZW.2,ZW.12,ZW.22,ZW.33,ZW.68,ZW.73,ZW.88按照一定的浓度配比混合后与106cfu/mL的金黄色葡萄球菌在LB培养基内共同孵育，生理盐水和青霉素分别作为阴性对照和阳性对照组，每6h测一次OD600直至阴性对照组菌液浓度不再变化。结果显示24h后，单链抗体联合处理组与青霉素处理组菌液一直透亮，OD600值约为0.06；而生理盐水处理组菌液浑浊度明显增加，OD600值约为1.08(图3)。
实施例6金黄色葡萄球菌小鼠乳腺炎模型保护实验
泌乳10-15d昆明小鼠随机分为4组，对照组,阴性对照,阳性对照组和抗体处理组。对照组和阴性对照组第四对乳腺各攻入150μL生理盐水，阳性对照组第四对乳腺各攻入100μL青霉素(100mg/mL)，抗体处理组第四对乳腺各攻入150μL单链抗体混合液(1.1mg/mL)，6h后，对照组第四对乳腺各攻入生理盐水50μL，阴性对照，阳性对照组和抗体处理组第四对乳腺各攻入108cfu/mL的金黄色葡萄球菌50μL，48h后，处死小鼠，采集血液检测相关细胞因子，以评估保护效果。
在金黄色葡萄球菌小鼠乳腺炎模型保护试验中，与生理盐水处理的阴性对照组相比，8个单链抗体(scFv)能显著提高细胞因子IL-4的含量(P<0.05)(图4)，降低炎症因子TNF-α的含量(P<0.05)(图5)，维持乳腺结构的相对完整，减少炎性细胞的浸润，对小鼠提供一定的保护作用。该单链抗体(scFv)具有良好的应用前景，能在制备金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎预防和治疗药物中应用。
Claims (8)
1.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体，其特征在于，所述单链抗体包括牛抗体轻链可变区VL、中间连接肽Linker和牛抗体重链可变区VH，其连接顺序是VL-Linker-VH；其中：
所述牛抗体轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No：1～8所示；
所述牛抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：9～16所示。
2.根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体，其特征在于，所述中间连接肽的氨基酸序列如下：
GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGATCT。
3.根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No：17～24所示。
4.一种含有编码牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体基因的载体，其特征在于，该载体为噬菌粒载体。
5.根据权利要求4所述的含有编码牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体基因的载体，其特征在于，该载体为pCANTAB5E载体。
6.一种由权利要求4或5所述载体转化的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞为TG1细胞。
7.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区基因VH；
(2)利用SOE-PCR法将中间连接肽linker与VL基因和VH基因相连构建牛源性单链抗体基因；
(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中，构建重组质粒；
(4)将步骤(3)的重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体M13KO7扩增建立初级单链抗体文库；
(5)用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，富集淘选四轮；
(6)采用phage ELISA,用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，筛选阳性克隆；
(7)分离纯化步骤(6)所得培养产物，即获得所述牛源性抗金黄色葡萄球菌的单链抗体。
8.权利要求1-3之一所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体在制备金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺炎预防和治疗药物中的应用。
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