CN106397585A

CN106397585A - 一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN106397585A
Application number: CN201610608555.3A
Authority: CN
Inventors: 朱建国; 王曼; 王婷婷
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2017-02-15

Abstract

本发明公开了一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其应用。本发明的真核表达单链抗体至少具有由如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的牛抗体轻链可变区VL和如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的牛抗体重链可变区VH以及由中间连接肽Linker按照VL‑Linker‑VH的顺序进行连接构成的牛源单链抗体片段VL‑Linker‑VH。将该片段的编码基因插入真核表达载体，构建成单链抗体真核表达质粒pcDNA3.1‑scFv后，将该pcDNA3.1‑scFv直接注射小鼠乳腺组织,能显著提高细胞因子IFN‑γ和IL‑4的含量(P<0.05),降低炎症因子TNF‑α的含量(P<0.05)，维持乳腺结构的相对完整，减少炎性细胞的浸润，对小鼠提供一定的保护作用。

Description

一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途，属于基因工程技术领域。

背景技术

单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无Fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。

奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌，流行率达到了50％，导致的经济损失最大。主要是因为金黄色葡萄球菌具有传染性且治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈；目前针对金黄色葡萄球菌全菌和各个毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的预防，但是效果均不理想。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及可以大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途。本发明的真核表达单链抗体能够与金黄色葡萄球菌特异性结合，且具有一定的抑菌活性，能够用于制备治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎药物的研究。

本发明技术方案具体介绍如下。

本发明提供一种牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，其至少具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的牛抗体轻链可变区VL、如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的牛抗体重链可变区VH以及由中间连接肽Linker按照VL-Linker-VH的顺序进行连接构成的牛源单链抗体片段VL-Linker-VH。

本发明中，所述的牛源单链抗体片段VL-Linker-VH具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种上述牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的编码基因scFv。

本发明还提供一种上述牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的制备方法，具体步骤如下：

(1)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区基因VH；

(2)利用SOE-PCR法将连接肽linker与VL基因和VH基因相连构建牛源性单链抗体基因；

(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中，构建重组质粒；

(4)将步骤(3)的重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；

(5)用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，富集淘选；

(6)采用phage ELISA,用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，筛选得到的阳性克隆即为牛源性抗金黄色葡萄球菌真核表达单链抗体。

进一步的，本发明还提供上述牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核单链抗体在制备治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎药物中的用途。

本发明的技术原理是采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出牛抗体编码基因的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因。利用SOE-PCR(重组链延伸反应)法，将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体编码基因(scFv)，该scFv是按照VL-Linker-VH的顺序进行连接的，并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中构建单链抗体初级文库，辅助噬菌体M13KO7拯救初级文库；用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原经过四轮的富集淘选后，采用phage ELISA方法筛选阳性克隆，证明该单链抗体具有抗金黄色葡萄球菌的体外中和活性，并测序后进行Clustalw多序列比较。

本发明的独特之处，首先是在构建重组牛源单链抗体表码基因(ScFv)时，按照VL-Linker-VH的顺序，将牛抗体轻链可变区(VL)和牛抗体重链可变区(VH)用中间的Linker进行连接,构成的牛源单链抗体片段(VL-Linker-VH)，这样连接被本发明证明构建重组牛源scFv更为有效。而一般的文献报道都是按照VH-Linker-VL的顺序连接的；其次本发明将筛选到的阳性克隆的单链抗体编码基因(scFv)克隆到真核表达质粒pcDNA3.1，构建成单链抗体真核表达质粒pcDNA3.1-scFv，直接注射小鼠乳腺组织,可以在组织内表达单链抗体蛋白,抗体在体内持续时间长，能显著提高细胞因子IFN-γ和IL-4的含量(P<0.05),降低炎症因子TNF-α的含量(P<0.05)，维持乳腺结构的相对完整，减少炎性细胞的浸润，对小鼠提供一定的保护作用。

本发明的有益效果是：抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体基因(scFv)直接注射小鼠乳腺,抗体在组织内持续表达，能与金黄色葡萄球菌特异性结合，能够用于奶牛乳腺炎的防控的进一步研究。

附图说明

图1是实施例1的噬菌粒载体pCANTAB5E的结构图。

图2是phage ELISA筛选到的8个scFv阳性克隆图示；注：NC为阴性对照，ZW1-ZW88为scFv阳性克隆。

图3是重组质粒pcDNA3.1-scFvs双酶切鉴定图示；注：M.Marker 2000；1.scFvZW12双酶切；2.scFvZW88双酶切。

图4是Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在COS-1细胞中的表达图示；注：β-actin基因作为内参，1.未转染的COS-1细胞；2.转染空质粒pcDNA3.1；3.转染质粒pcDNA3.1-scFv12；4.转染质粒pcDNA3.1-scFv88。

图5是Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在小鼠乳腺的表达时相图示；注：Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在小鼠乳腺的表达时向(n＝3),β-actin基因作为内参。生理盐水和空质粒pcDNA3.1分别为空白对照(C)和阴性对照(NC)，β-actin基因作为内参。

图6是真核表达单链抗体注射后乳腺组织细菌计数图；注：图中数据均以平均值±标准误表示(n＝6)；不同字母标注的代表差异显著P<0.05，相同字母标注的代表差异不显著。

图7是真核表达单链抗体(scFv)对细胞因子含量影响图；注：图中数据均以平均值±标准误表示(n＝6)；不同字母标注的代表差异显著P<0.05，相同字母标注的代表差异不显著，其中，(a)为TNF-α，(b)为IL-1β，(c)为IL-6。

具体实施方式

实施例中采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法，各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得，其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的方法准确获得。

实施例1牛源噬菌体单链抗体库的构建

1、采集患乳腺炎的奶牛血液，ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，继续后续实验。将抗凝血提取牛外周血白细胞，用Trizol法(TRIZOL Reagent购自TaKaRa公司)提取总RNA。以提取的总RNA为模版，采用Oligo primer，根据反转录试剂盒(cDNA第1链合成试剂盒购自TaKaRa公司)的产品说明操作步骤，合成第1链cDNA。

2、分析已发表文献中的牛抗体编码基因可变区序列，根据其FR区设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中VH F和VH R用于扩增VH区；VL F和VL R用于扩增VL区。其中，VLF、VH R分别含有Sfi I和Not I酶切位点；VH F、VL R含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小

3、VH和VL基因的扩增以cDNA为模版，VH F、VH R为引物扩增VH基因；VL F、VL R为引物扩增VL基因。PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物(25μM)各1μL，ddH₂O 8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据AxyGEN公司提供的胶回收说明书操作)。

4、ScFv基因的获得通过重组链延伸反应(SOE-PCR)将含有Linker序列的VL和VH基因连接为ScFv基因(VL-linker-VH)，并加入Sfi I和Not I酶切位点。

5、初级文库的构建根据常规分子克隆方法(参照J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》)，ScFv基因和pCANTAB5E载体分别经Sfi I和Not I双酶切后，将ScFv基因插入pCANTAB5E载体，构建重组表达质粒(参见图1)，并将其电转化TG1感受态细胞，转化50次，合并所有电转化培养液，取一小部分系列稀释后涂布于YT-AG固体培养板，30℃过夜培养计算库容量(挑取克隆进行菌落PCR和质粒双酶切验证，测序验证库的多样性)；通过菌落PCR计算阳性率，得到实际的库容量。将剩余的细菌培养液通过辅助噬菌体M13KO7拯救后建立初级文库。

实施例2牛源抗金黄色葡萄球菌单链抗体的筛选

1、富集淘选制备金黄色葡萄球菌全菌抗原(ATCC25923)，4℃包被过夜；用含4％脱脂奶粉的PBS封闭96孔板37℃孵育2h；向96孔板中加入上述步骤中制备好的单链抗体噬菌体抗体库，37℃孵育2h，用PBST和PBS各洗10次，洗掉未结合的游离噬菌体；每孔加入100μl0.2mol/L Gly-Hcl缓冲液(pH＝2.2)洗脱特异性结合的噬菌体，加入50μl 1mol/L Tris-Hcl(PH＝9.1)中和洗脱液；将剩余部分洗脱液感染大肠杆菌TG1后，重复上述步骤。如此重复3-5轮，在第一轮过后，要增加洗涤的严谨性：洗脱前用PBST洗脱20次后用PBS洗涤20次。

2、phage ELISA筛选从第四轮中随机取96个克隆，用M13K07拯救后制备重组噬菌体。金黄色葡萄球菌全菌抗原(ATCC25923)用50mmol/L碳酸氢钠盐溶液(pH9.6)于4℃包被过夜，4％脱脂奶粉溶液封闭1h后用PBST(0.1％Tween20，以下同)洗涤3次；加入上述制备好的噬菌体单链抗体，37℃反应2h，PBST和PBS各洗涤6次；加入HRP-antiM13抗体100μL(1:4000)，37℃反应1h，PBST和PBS各洗涤6次；TMB显色，2mol/L硫酸终止反应，酶标仪读取OD450值，同时设辅助噬菌体M13K07为阴性对照。ELISA结果的判定以P/N(P为阳性孔的OD450值，N为阴性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N＜2.1为可疑；P/N＜1.5为阴性(图2)。(参照姚火春主编《兽医微生物学实验指导》)。

实施例3重组scFv序列分析

对获得的单链抗体编码基因进行测序，证明其按照正确的阅读框顺序插入到噬菌粒载体pCANTAB5E中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其序列顺序是VL-Linker-VH(图3)。

实施例4pcDNA3.1-scFv重组质粒的转染

1无内毒素质粒的提取

采用天根无内毒素质粒大量提取试剂盒，具体操作步骤如下：

(1)含有目的质粒的克隆接种于相应抗生素抗性的的LB培养液中，37℃过夜培养；

(2)取200菌液，8000r/min离心3min，弃上清；

(3)加入10mL Buffer P1(使用前应加入RNase A)悬浮菌体；

(4)加入10mL Buffer P2，温和的翻转离心管，此时溶液透亮，室温放置5min；

(5)加入10mL Buffer P4，温和的上下翻转6-8次，至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min后8000r/min离心10min，使白色沉淀沉于管底；

(6)将全部上清液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的管中；

(7)向滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中，吸附柱CP6预先经过平衡液BL处理；

(8)室温8000r/min离心2min后弃滤液，将吸附柱放回离心管，加入10mL BufferPW，8000r/min离心2min，弃去滤液；

(9)重复上述操作；

(10)向吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，8000r/min离心2min，弃去滤液；

(11)将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000r/min离心5min，目的是将吸附柱中残余的乙醇去除；

(12)将吸附柱置于新的管中，放置2min使乙醇挥发干净；在吸附柱中央加入1.5mL生理盐水(提前65℃预热来提高洗脱的效率)；静置10min后8000r/min离心2min，管中的液体即为提取的质粒。

2重组质粒pcDNA3.1-scFv的双酶切鉴定

pcDNA3.1-scFvs经过Not I和EcoR I双酶切后，可得到750bp的目的基因片段和5000bp的载体片段(图3.2)，表明重组质粒构建成功。

3pcDNA3.1-scFv的测序结果

通过特异性的引物扩增目的基因pcDNA3.1-scFvs，切胶回收纯化后，与pMD18-T-Vector相连，获得的重组质粒经过质粒双酶切验证正确后测序。测序结果表明，插入序列与实验设计一致，并且读码框完全正确。因此通过PCR方法成功构建了pcDNA3.1-scFvs目的基因。

实施例5Western blot分析pcDNA3.1-scFv重组质粒的转染效果

采用脂质体的方法将重组质粒pcDNA3.1-scFv12转染COS-1细胞，Western blot分析结果表明，pcDNA3.1-scFv不仅可以在细胞内表达，也能分泌到培养液上清中进行分泌型表达。

1转染流程

(1)转染前一天，将COS-1cell接种到24孔板中，每个孔中加入1.5-2×10⁵个细胞，控制细胞转染时的密度为60-80％；

(2)实验分为四组，一组为细胞对照组；一组为空质粒pcDNA3.1组，另外两组为重组质粒pcDNA3.1-scFvs实验组，每组均设三个复孔；

(3)分别将1μg待转染质粒和2μL脂质体稀释在不含双抗的DMEM培养基中混匀，室温孵育10min后将两者混合，室温放置20min,制备DNA-脂质体复合物；

(4)吸去步骤(1)中细胞培养板中的培养基，将上述制备的复合物加到培养板中，置于培养箱培养；

(5)6h后，除去细胞上清，更换为500μL含10％FBS的DMEM培养基；

(6)转染48h后，收取总蛋白通过Western blot来验证重组蛋白的表达。

2His-tag的单克隆抗体来检测细胞样本的表达情况

(1)收集转染的实验组细胞及对照组细胞的培养液，13000rpm离心3-5min去除细胞碎片，取上清备用；

(2)收集转染的实验组细胞及对照组细胞经胰蛋白酶消化，冷的PBS洗细胞3遍，5min/次；

(3)每份细胞样品加入100μL的Western blot裂解液，冰上裂解40min，超声破碎；13000rpm离心3-5min，收获上清液；

(4)电泳：取上步中的上清液样本和步骤(1)中的细胞培养液的上清样本加入蛋白上样缓冲液煮沸后进行SDS-PAGE电泳；

(6)转膜：取下凝胶，切去浓缩胶，根据分离胶的大小裁剪滤纸和PVDF膜。将滤纸和PVDF膜放入蛋白转移缓冲液浸泡10min。在转膜仪上从负极到正极按照滤纸、凝胶、PVDF膜和滤纸的先后顺序制成夹层，打开电源，恒流转膜；

(7)封闭：转膜结束后将PVDF膜放于3％BSA封闭液中，室温封闭2h；

(8)一抗孵育：封闭结束后，将PVDF膜移至用3％BSA稀释的His-Tag Mouse mAb一抗中(1:4000稀释)，室温孵育2h后，用TBST洗涤3次，每次8min；

(9)二抗孵育：将PVDF膜移至用3％BSA稀释的过氧化物酶标记羊抗鼠IgG的二抗中(1:4000稀释)，室温孵育1h后，用TBST洗涤3次，每次8min；

(10)显影：洗涤结束后将膜置于保鲜膜内，化学发光试剂A和B等比例混合后均匀加在PVDF膜上，暗室内作用5min；将等大的X-胶片放在膜上，曝光适当的时间后取出胶片进行显影定影。图4是Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在COS-1细胞中的表达图示。

实施例6抗金黄色葡萄球菌的真核表达scFv在小鼠乳腺内的表达时效

pcDNA3.1-scFv质粒100μg经乳腺导管注射到小鼠的第四对乳腺中，注射动作要缓慢，操作要轻柔，注射完成后充分按摩小鼠的乳腺，注射剂量为100μL。空白对照每只小鼠第四对乳腺注射生理盐水100μL，阴性对照组每只小鼠第四对乳腺注射空质粒pcDNA3.1100μg。分别在注射后1d、3d、5d、7d、9d和11d收集小鼠的右侧乳腺(每个时间点三只小鼠)，加入RIPA裂解液后匀浆，13000rpm离心3-5min，收获上清液；上清液样本加入蛋白上样缓冲液煮沸后进行SDS-PAGE电泳，然后通过Western blot验证目的蛋白的表达情况。

怀孕7d的昆明小鼠经第四对乳腺导管注入pcDNA3.1-scFv质粒200μg，生理盐水和pcDNA3.1空质粒分别作为空白对照和阴性对照，注射后1d、3d、5d、7d、9d和11d收集小鼠的右侧乳腺进行Western blot验证，β-actin基因作为内参。结果显示，scFv蛋白在3d的时候开始表达，7d的时候表达量上升，可维持到11d(图5)。

实施例7抗金黄色葡萄球菌scFv基因对小鼠乳腺炎的保护功能研究

1动物的分组及处理

(1)泌乳期昆明小鼠30只，随机分为5组，每组6只。分别为：空白对照组(Control,C)，阴性对照组(Negative Control,NC)，阳性对照组(Positive Control,PC),单链抗体低剂量处理组(ScFv-Low，SL)和单链抗体高剂量处理组(ScFv-High，SH)。空白对照组和阴性对照组在泌乳7d的时候经第四对乳腺导管注射pcDNA3.1空质粒100μg；单链抗体低剂量处理组和单链抗体高剂量处理组在泌乳7d的时候经第四对乳腺导管注射pcDNA3.1-scFv粒，SL注射100μg，SH注射200μg。注射前4h保证小鼠充分吮吸乳汁，为了保证重组质粒充分被乳腺细胞吸收而不随乳汁被小鼠吮吸，注射后将小鼠与母鼠隔离6h。7d后，阳性对照组攻入青霉素(攻入干扰剂前2h将各组小鼠与母鼠隔离)，75％的酒精消毒，每只小鼠第四对乳腺注入300μL青霉素注射液(100mg/mL)。

6h过后，空白对照组每只小鼠第四对乳腺注入50μL生理盐水，阴性对照组，阳性对照组和两个单链抗体处理组每只小鼠第四对乳腺注入50μL(金黄色葡萄球菌浓度为10⁸cfu/mL)细菌悬液。48h后脱颈处死小鼠，收集血液，快速剪开腹部的皮肤，观察乳腺的变化，取第四对乳腺，待测。

(2)数据统计

用Excel 2010和SPSS18.0方差分析对试验数据进行统计分析，结果以平均数±标准误(Mean±SE)表示。P<0.05为差异显著,P>0.05为差异不显著。

2乳腺炎组织的细菌计数

脱颈处死小鼠后，快速剪开腹部的皮肤，取第四对左侧乳腺，按照一定的比例加入生理盐水进行匀浆，将匀浆液取一小部分倍比稀释后涂布Baird-Parker(BP)培养基，37℃培养24h后计算细菌数。结果如图6所示，空白对照组没有细菌，ScFv-High组与NC组相比，细菌数明显降低(P<0.05)，ScFv-Low与NC组相比，细菌数有降低的趋势。

3乳腺炎组织细胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的含量

脱颈处死小鼠后，快速剪开腹部的皮肤，小鼠第四对左侧乳腺加入生理盐水匀浆后匀浆液离心取上清，ELISA试剂盒检测TNF-α，IL-1β和IL-6的含量。与对照组相比,PC和NC组的TNF-α，IL-1β和IL-6三个细胞因子的含量显著升高(P<0.05)；与NC组相比，ScFv-Low组TNF-α，IL-1β和IL-6三个细胞因子的含量没有明显的变化；与NC组相比，ScFv-High组IL-1β的含量显著降低(P<0.05)，TNF-α和IL-6的含量有降低的趋势(图7)。

Claims

1.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，其特征在于，其至少具有如SEQID No.1所示的氨基酸序列的牛抗体轻链可变区VL和如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的牛抗体重链可变区VH以及由中间连接肽Linker按照VL-Linker-VH的顺序进行连接构成的牛源单链抗体片段VL-Linker-VH。

2.根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，其特征在于：所述的牛源单链抗体片段VL-Linker-VH具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的编码基因。

4.一种根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(5)用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，富集淘选；

5.一种根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体在制备治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎药物中的用途。