CN103570831B - 牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其至少具有如SEQ？ID？No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ？ID？No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。该单链抗体能与金黄色葡萄球菌特异性结合并具有一定的体内抗感染活性，在用于诊断、预防及治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关试剂或药物中，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种抗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的基因工程单链抗体、表达该单链抗体的表达载体和宿主细胞、该单链抗体的制备方法以及其用途，所述单链抗体能与金黄色葡萄球菌特异性结合并具有一定的体内抗感染活性。
背景技术
单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体有三种形式：1）直接在细胞质中表达；2）与其它菌体融合表达融合蛋白；3）分泌表达具有功能的单链抗体。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1）分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2）组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清楚快，肾脏蓄积很少；4）无Fc段，非特异结合低；5）易于通过基因工程大量生产；6）易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。
奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌，流行率达到了50%，导致的经济损失最大。主要是因为一方面金黄色葡萄球菌具有传染性，另一方面金黄色葡萄球菌对治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及可以大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体及其制备方法和应用，该单链抗体能与金黄色葡萄球菌特异性结合并具有一定的体内抗感染活性，在用于诊断、预防及治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关试剂或药物中，具有良好的应用前景。
本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其至少具有如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽，所述中间连接肽为（GGAAGATCTAGAGGACTGACC）。
所述的单链抗体具有如SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。
本发明的一种编码所述牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体的基因，其具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。
为了方便地对单链抗体进行检测纯化和进一步的操作，可以在上述序列的基础上进一步涉及酶切位点和识别序列，优选的进一步含有内切酶位点NotI、NcoI和识别序列，其中NcoI：CCATGGNotI：GCGGCCGC。
本发明的一种含有编码上述单链抗体基因的表达载体。
所述的表达载体为原核表达载体，优选为pOPE101-XP载体。
本发明的一种由上述表达载体转化的宿主细胞，所述的宿主细胞为JM109细胞。
本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL；
（2）利用SOE-PCR法将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体基因；
（3）将步骤（2）的牛源性单链抗体基因克隆到原核表达载体pOPE101-XP中，构建重组质粒；
（4）将步骤（3）的原核表达载体pOPE101-XP转化入大肠杆菌，培养、表达单链抗体；
（5）分离纯化步骤（4）所得培养产物即获得所述牛源性抗奶牛乳腺炎的单链抗体。（按照上海意泓生物科技有限公司纯化柱说明书操作进行）
需要说明的是,以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例)，各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得,其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的发法准确获得。
本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体在用于制备奶牛乳腺炎的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。
本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体在用于制备奶牛乳腺炎的预防、治疗药物中的应用。
本发明的技术原理是采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区（VH）基因和轻链可变区（VL）基因。利用SOE-PCR（重组链延伸反应）法将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体（ScFv）基因，并将其克隆到原核表达载体pOPE101-XP中，构建重组质粒并转入大肠杆菌表达，间接ELISA筛选原核表达的抗金黄色葡萄球菌单链抗体的阳性克隆，并测序后进行Clustalw多序列比较。动物保护实验证明该单链抗体具有抗金黄色葡萄球菌的体内抗感染活性。
有益效果
本发明提供的牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，能与金黄色葡萄球菌特异性结合，具有一定的体内抗感染活性，在用于诊断、预防及治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关试剂或药物中，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的pOPE101重组载体的结构图；
图2为牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体的编码基因及对应的氨基酸序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
牛源性抗奶牛乳腺炎单链抗体的制备
1：采集患乳腺炎的奶牛血液，ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，继续后续实验。将抗凝血提取外周核单细胞，用Trizol法（TRIZOLReagent购自TaKaRa公司）提取总RNA。以提取的总RNA为模版，采用Oligoprimer，根据反转录试剂盒（cDNA第1链合成试剂盒购自TaKaRa公司）的产品说明操作步骤，合成第1链cDNA。
2：根据已发表文献的牛抗体编码基因可变区序列(MadhuriKotia,2010MolecularImmunology；2011，vaccine)的FR区设计扩增抗体轻、重链的引物（表1），其中VH1F和VH1R用于扩增VH区；VL1F和VL1R用于扩增VL区；VH2R、VH2F用于VH基因加入酶切位点和Linker序列；VL2F、VL2R用于VL基因加入酶切位点和Linker序列。其中，VL2F、VH2R分别含有NotI和NcoI酶切位点；VH2F、VL2R含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
3：VH和VL基因的扩增
以cDNA为模版，VH1F、VH1R为引物扩增VH基因；VL1F、VL1R为引物扩增VL基因。PCR反应体系为25μL：2×PCRmix12.5μL，模版cDNA2μL，上下游引物（25μM）各1μL，ddH2O8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因（根据AxyGEN公司提供的胶回收说明书操作）。
4：ScFv基因的获得
分别以VH和VL基因为模板，VH2R、VL2F为引物PCR扩增带有Linker的重链可变区和轻链可变区基因，PCR条件同上。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的基因（含有Linker序列的VH和VL基因）。通过重组链延伸反应(SOE-PCR)将含有Linker序列的VH和VL基因连接为ScFv基因，并加入NotI和NcoI酶切位点。
5：ScFv基因原核表达质粒的构建
根据常规分子克隆方法（参照J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》），ScFv基因和pOPE101-XP载体分别经NotI和NcoI双酶切后，将ScFv基因插入pOPE101-XP载体，构建重组表达质粒（参见图1），并将其转化E.coliJM109感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）。转化的克隆进行菌液PCR鉴定和质粒双酶切鉴定。
6：ScFv的诱导表达
将鉴定后的阳性克隆在含Amp+（终浓度为100μM）的LB液体培养基中培养至菌液OD600至0.6。将菌液分为三份，分别为诱导组、TES处理组和非诱导组。诱导组和TES处理组在菌液中加入IPTG(终浓度100μM)，于30℃诱导6h，收集菌液。菌液经离心收集沉淀，一份为诱导组，另一份用冰冷的TES(50mmol/LTrils-HCl，1mmol/LEDTA,250g/LSucose重悬，冰上放置15min，离心收集上清为TES处理组。根据默克公司的《pETSystemManual》进行分离纯化。
实施例2
抗原特异性ScFv的间接ELISA筛选
制备金黄色葡萄球菌全菌抗原（ATCC-25923）用50mmol/L碳酸氢钠盐溶液(pH9.6)于4℃包被过夜，5%脱脂奶粉溶液封闭1h后用PBST(含0.1%Tween20，以下同)洗涤3次；取TES处理菌液上清50μL，与4%脱脂奶粉溶液50μL混匀后加入上述包被好的金黄色葡萄球菌全菌抗原，37℃反应2h，PBST洗涤；加入Myc-TagMousemAb（Myc-标签鼠单克隆抗体购自RayBioTech公司）100μL(1:2000)37℃反应2h，PBST洗涤；加入Peroxidase-conjugatedAffinipureGoagtAnti-MouseIgG（购自Abmart公司）100μL(1:4000)，37℃反应1h，PBST洗涤；TMB显色，2mol/L硫酸终止反应，酶标仪读取OD450值，同时设未诱导菌液上清为表达阴性对照，BSA为抗原阴性对照。阳性克隆经3次重复性试验验证（参照姚火春主编《兽医微生物学实验指导》）。三次重复试验的单链抗体阳性克隆的平均OD450值为0.65，而未诱导菌液上清为表达阴性对照，平均OD450值为0.12，BSA为抗原阴性对照平均OD450值为0.16。间接ELISA结果的判定以P/N(P为阳性孔的OD450值，N为阴性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N＜2.1为可疑；P/N＜1.5为阴性。
实施例3
对获得的单链抗体编码基因进行测序，证明其由759个核苷酸及据此推测的253个氨基酸组成，所述核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。
实施例4
单链抗体与金黄色葡萄球菌反应原性测定
制备金黄色葡萄球菌全菌抗原（ATCC-25923）用50mmol/L碳酸氢钠盐溶液(pH9.6)于4℃包被过夜，5%脱脂奶粉溶液封闭1h后用PBST(含0.1%Tween20，以下同)洗涤3次；将纯化的单链抗体原核表达产物稀释到1ug/ml后，取50μL，与4%脱脂奶粉溶液50μL混匀后加入上述包被好的金黄色葡萄球菌全菌抗原，37℃反应2h，PBST洗涤；加入Myc-TagMousemAb（Myc-标签鼠单克隆抗体购自RayBioTech公司）100μL(1:2000)37℃反应2h，PBST洗涤；加入Peroxidase-conjugatedAffinipureGoagtAnti-MouseIgG（购自Abmart公司）100μL(1:4000)，37℃反应1h，PBST洗涤；TMB显色，2mol/L硫酸终止反应，酶标仪读取OD450值，同时设未诱导菌液上清为表达阴性对照，BSA为抗原阴性对照。阳性克隆经3次重复性试验验证（参照姚火春主编《兽医微生物学实验指导》）。三次重复试验的单链抗体阳性克隆的平均OD450值为0.73，而未诱导菌液上清为表达阴性对照平均OD450值为0.11，BSA为抗原阴性对照平均OD450值为0.18。间接ELISA结果的判定以P/N(P为阳性孔的OD450值，N为阴性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N＜2.1为可疑；P/N＜1.5为阴性。结果表明本发明提供单链抗体对金黄色葡萄球菌抗原具有良好的反应原性，可以作为检测金黄色葡萄球菌的单链抗体。
实施例5
单链抗体对感染金黄色葡萄球菌的Balb/c小鼠治疗试验
将60只Balb/c小鼠随机分为2组，每组30只，分别为实验组和对照组。用PBS稀释单链抗体蛋白，调节抗体蛋白终质量浓度0.55mg/ml,实验组小鼠每只双后肢肌肉注射100ul（0.55mg/ml）抗体蛋白,对照组小鼠每只双后肢肌肉注射100ul（0.55mg/ml）未诱导原核表达菌液，各组小鼠在注射后的第二天，每只小鼠尾静脉注射致死菌量的金黄色葡萄球菌（ATCC-25923）1.0x108CFU,观察7-10天，统计各组小鼠的存活率。结果显示，尾静脉注射细菌10天后，实验组小鼠死亡13只，存活17只，存活率为56.6%，而对照组死亡26只，存活4只，存活率为13.3%.
实验组存活率与对照组存活率相比，差异显著P<0.05,说明本发明提供的单链抗体具有一定的抗金黄色葡萄球菌感染的活性，可以用于金黄色葡萄球菌感染的预防和治疗。
Claims (11)
1.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其至少具有如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。
2.根据权利要求1所述的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其特征在于：所述的中间连接肽为GGAAGATCTAGAGGACTGACC。
3.根据权利要求1所述的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其特征在于：所述的单链抗体具有如SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。
4.一种编码如权利要求1所述单链抗体的基因，其具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述核苷酸序列中进一步包括内切酶位点NotI、NcoI和识别序列，其中NcoI：CCATGG，NotI：GCGGCCGC。
6.一种含有如权利要求5或4所述基因的表达载体。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为原核表达载体。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为pOPE101-XP载体。
9.一种由权利要求6所述表达载体转化的宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为JM109细胞。
11.一种如权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体在制备治疗奶牛乳腺炎药物、或奶牛乳腺炎的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。
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