CN111333724A

CN111333724A - 一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素b的单克隆抗体yg11-1及其应用

Info

Publication number: CN111333724A
Application number: CN201811554511.2A
Authority: CN
Inventors: 杨光; 刘成华; 刘玉; 刘方杰; 高亚萍; 冯健男
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN111333724B

Abstract

本发明公开了一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的单克隆抗体YG11‑1及其应用。本发明保护一种IgG抗体(命名为YG11‑1抗体)，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区由序列表的序列1自N末端第21‑145位氨基酸残基组成；所述轻链中的轻链可变区由序列表的序列3自N末端第21‑127位氨基酸残基组成。本发明还保护YG11‑1抗体在制备治疗肠毒素B中毒的药物中的应用，在制备用于拮抗肠毒素B的药物中的应用，在制备用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用。本发明对治疗肠毒素B中毒、对于预防或治疗金黄色葡萄球菌引起的病症具有重要的应用前景。

Description

一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的单克隆抗体YG11-1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的单克隆抗体YG11-1及其应用，特别涉及该单克隆抗体在制备用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)简称金葡菌，是一种自然界中分布广泛的革兰氏阳性致病菌。据估计有20-30％的人群都携带该病原菌，该菌主要存在于人体的粘膜、皮肤、特别是鼻咽部。金葡菌可以引发一系列的疾病，从轻微的皮肤感染，到烫伤样皮肤综合征，到脓肿，再到威胁生命的肺炎、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合征等。金葡菌感染影响范围很广，可累及皮肤、软组织、呼吸道、骨髓、关节、血管等等。

肠毒素(Staphyloccucal enterotoxins,SEs)是由葡萄球菌分泌的细菌外毒素，目前已报道的有SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG等二十多种血清型，共称为葡萄球菌SE类超抗原，是细菌性食物中毒、化脓性感染、院内感染的重要毒素。肠毒素B(SEB)是SEs中毒性最强的一种毒素，可以引起食物中毒，如果直接进入血液循环，可以活化大量T细胞释放细胞因子(IFN-γ、TNF-α等)，甚至引起患者死亡。

肠毒素B作为超抗原可通过结合T细胞上特定的TCR Vβ区和MHC-Ⅱ类分子，活化T细胞，直接激活T淋巴细胞，使其释放一系列的细胞因子，主要包括IFN-γ和TNF-α等，从而引起高热、恶心、腹泻及毒素休克综合征(TSS)。由金黄色葡萄球菌肠毒素B引起的TSS的病死率可达50％，与流感并发的SEB感染的死亡率更高达90％以上，因此SEB被美国特殊作战处列为常规储存的“标准”(“经典”)生物战剂。目前临床上尚无针对SEB中毒的有效疫苗和药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的单克隆抗体YG11-1及其应用。

本发明首先保护一种IgG抗体(命名为YG11-1抗体)，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区由序列表的序列1自N末端第21-145位氨基酸残基组成；所述轻链中的轻链可变区由序列表的序列3自N末端第21-127位氨基酸残基组成。

所述重链为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列1自N末端第21-475位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列1所示的蛋白质。

所述轻链为如下(c)或(d)：(c)序列表的序列3自N末端第21-234位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)序列表的序列3所示的蛋白质。

编码YG11-1抗体的基因也属于本发明的保护范围。

编码所述重链的基因为序列表的序列2自5’末端第681-2108位核苷酸所示的DNA分子。编码所述轻链的基因为序列表的序列4自5’末端第681-1385核苷酸所示的DNA分子。

本发明还保护YG11-1抗体在制备治疗肠毒素B引起的疾病中的应用。

本发明还保护YG11-1抗体在制备用于拮抗肠毒素B的药物中的应用。

本发明还保护YG11-1抗体在制备用于中和肠毒素B的药物中的应用。

本发明还保护YG11-1抗体在制备用于抑制金黄色葡萄球菌的药物中的应用。

本发明还保护YG11-1抗体在制备用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用。

本发明还保护一种药物，其活性成分为YG11-1抗体。

所述药物的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)治疗肠毒素B引起的疾病；

(b)拮抗肠毒素B；

(c)中和肠毒素B；

(d)抑制金黄色葡萄球菌；

(e)预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病。

以上任一所述肠毒素B具体可为金黄色葡萄球菌肠毒素B。

以上任一所述肠毒素B为序列表的序列5所示的蛋白质。

以上任一所述肠毒素B为自N端至C端依次由如下两个区段组成的蛋白质：序列表的序列7所示的区段，序列表的序列5所示的区段。

以上任一所述肠毒素B引起的疾病具体可为肠毒素B引起的致死性休克综合征(SEBILS)。

以上任一所述金黄色葡萄球菌引起的疾病，具体可为金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素B引起的疾病。

以上任一所述金黄色葡萄球菌引起的疾病，具体可为金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素B引起的致死性休克综合征(SEBILS)。

本发明以肠毒素B为靶抗原，从噬菌体抗体库中快速地筛选出全人源抗肠毒素B的单克隆抗体。该单克隆抗体是一个全新的抗体，具有较高的亲和力和抑制肠毒素B的溶血活性，并能提高感染金黄色葡萄球菌的试验动物的生存率。本发明提供的抗体对于金黄色葡萄球菌的防控具有重要的应用价值。

附图说明

图1为His-SEB蛋白溶液的SDS-PAGE电泳图。

图2为His-SEB蛋白促进淋巴细胞增殖的结果图。

图3为小鼠致死实验的结果图。

图4为YG11-1抗体溶液的聚丙烯酰氨凝胶电泳图。

图5为ELISA检测YG11-1抗体的结合活性的结果图。

图6为BIAcore测定YG11-1抗体的亲和力的结果图。

图7为小鼠致死模型验证YG11-1抗体的功能的结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.4、0.2M的PBS缓冲液。淋巴细胞分离液：天津灏洋。CFSE(荧光染料)：Invitrogen。PHA(植物血凝素)：Sigma。D-氨基半乳糖(D-GlaN)：Sigma。

金黄色葡萄球菌肠毒素B又称SEB蛋白，如序列表的序列5所示，其编码序列如序列表的序列6所示。

实施例1、His-SEB蛋白的制备及其功能研究

一、His-SEB蛋白的制备

1、用序列表的序列6所示的DNA分子取代载体pET28a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒pET28a-SEB。已经测序验证。

重组质粒pET28a-SEB中，序列表的序列6所示的DNA分子与载体骨架上的编码His·tag的DNA分子融合形成融合基因，表达融合蛋白。

融合基因自上游至下游依次由如下两个区段组成：序列表的序列8所示的DNA分子，序列表的序列6所示的DNA分子。

融合蛋白自N端至C端依次由如下两个区段组成：序列表的序列7所示的区段，序列表的序列5所示的区段。融合蛋白又称His-SEB蛋白。

2、将重组质粒pET28a-SEB导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，将其命名为E.coli BL21(pET28a-SEB)。

3、将E.coli BL21(pET28a-SEB)接种至含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD_600nm值为0.6，然后加入IPTG并使其在体系中浓度为0.05mmol/L，然后37℃、200rpm振荡培养5h，然后4℃、8000rpm离心15min，收集菌体沉淀。

4、取步骤3得到的菌体沉淀，用结合缓冲液重悬，然后在冰浴上进行超声破碎，然后4℃、8000rpm离心10min，收集上清液。

结合缓冲液(pH7.4)：含20mmol/L Na₃PO₄、0.5mol/L NaCl、20mmol/L咪唑，余量为水。

5、取步骤4得到的上清液，用Ni²⁺亲和柱进行纯化。纯化过程：上样后，先用结合缓冲液洗涤以去除杂蛋白，然后用洗脱液洗脱以收集目的蛋白(收集过柱后溶液)。

洗脱液(pH7.4)：含20mmol/L Na₃PO₄、0.5mol/L NaCl和500mmol/L咪唑，余量为水。

6、取步骤5得到的过柱后溶液，转移到透析袋中，然后将透析袋置于PBS缓冲液中进行透析，然后收集透析袋中的液相，即为His-SEB蛋白溶液。

7、采用BCA蛋白定量法检测His-SEB蛋白溶液的蛋白浓度。His-SEB蛋白溶液的蛋白浓度为1mg/ml。

8、His-SEB蛋白溶液的SDS-PAGE电泳图见图1。图1中，左侧泳道为marker，右侧泳道为His-SEB蛋白溶液。

二、His-SEB蛋白促进淋巴细胞增殖

1、淋巴细胞的制备

(1)取新鲜健康人抗凝血，用等体积PBS缓冲液稀释，得到血稀释液。

(2)取两个15mL离心管，每管加入3mL淋巴细胞分离液，然后各加入5mL血稀释液，500g离心20min，吸取淋巴细胞层，用PBS缓冲液洗涤2次。

(3)CFSE标记细胞

用PBSA溶液重悬淋巴细胞并计数，得到1×10⁶个细胞/mL的细胞悬液；向细胞悬液中加入CFSE并使其在体系中的浓度为2μM，37℃避光染色10min，然后加入1/4体积预冷的小牛血清冰上孵育5min，然后1000rpm离心10min，收集细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤2次。

PBSA溶液：含1g/100ml BSA的PBS缓冲液。

2、His-SEB蛋白促进淋巴细胞增殖

用1640培养基重悬步骤1得到的细胞，得到5×10⁵个细胞/mL的细胞悬液；取24孔板，每孔加入1mL细胞悬液，然后加入His-SEB蛋白溶液(使His-SEB蛋白在体系中的浓度为1μg/ml)，培养7天，然后收集细胞，用PBS缓冲液洗涤3次后，进行流式细胞仪检测。设置用等体积PBS缓冲液代替His-SEB蛋白溶液的阴性对照处理。设置用等体积PHA溶液(使PHA在体系中的浓度为1μg/ml)代替His-SEB蛋白溶液的阳性对照处理。

结果见图2。结果表明，His-SEB蛋白能够显著的刺激淋巴细胞增殖。

三、小鼠致死实验

4种供试蛋白液：His-SEB蛋白溶液用PBS缓冲液稀释，得到蛋白浓度分别为75μg/mL、50μg/mL或25μg/mL的蛋白液；PBS缓冲液作为0浓度蛋白液。

致敏剂溶液：D-氨基半乳糖用PBS缓冲液配制成浓度为50mg/mL的溶液。

6-8周龄BALB/c雌性小鼠，随机分成4组，每组8只。

第一组：腹腔注射致敏剂溶液(0.4mL/只)，30min后腹腔注射0浓度蛋白液(0.4mL/只)，观察各组小鼠的死亡情况，每12小时统计存活率；

第二组：腹腔注射致敏剂溶液(0.4mL/只)，30min后腹腔注射25μg/mL蛋白液(0.4mL/只)，观察各组小鼠的死亡情况，每12小时统计存活率；

第三组：腹腔注射致敏剂溶液(0.4mL/只)，30min后腹腔注射50μg/mL蛋白液(0.4mL/只)，观察各组小鼠的死亡情况，每12小时统计存活率；

第四组：腹腔注射致敏剂溶液(0.4mL/只)，30min后腹腔注射75μg/mL蛋白液(0.4mL/只)，观察各组小鼠的死亡情况，每12小时统计存活率。

存活率的结果见图3。结果表明，His-SEB蛋白能够引起的致死性休克综合征(SEBinduced lethal shock SEBILS)，导致小鼠的死亡。His-SEB蛋白的上述作用效果是SEB蛋白引起的，His标签的作用仅为蛋白制备过程中的纯化。

实施例2、噬菌体抗体库筛选抗SEB蛋白的单克隆抗体

一、抗SEB单克隆抗体的生物淘选

(一)SEB组

1、第一轮亲和淘选

(1)用500μL蛋白浓度为10μg/mL的His-SEB蛋白溶液(用PBS缓冲液调整蛋白浓度)包被免疫管，4℃过夜。

(2)取所述免疫管，加入含5g/100mL脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温封闭1h。

(3)取噬菌体抗体库，加入含5g/100mL脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温封闭1h。

(4)取完成步骤(2)的免疫管，先加入无菌的PBS缓冲液洗涤3次，然后加入完成步骤(3)的噬菌体抗体库(噬菌体投入量约为1.2×10¹²)，室温静置1h。

(5)完成步骤(4)后，取所述免疫管，先加入适量无菌的PBS缓冲液洗涤(目的为洗去未结合的噬菌体)，再加入500μL pH2.2、0.1M的HCl-Glycine洗脱phage-Abs，收集洗脱液并加入1.5M的Tris-HCl(pH8.8)调节pH值至7.4。

(6)将大肠杆菌TG1单克隆接种至LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至对数生长期，得到培养菌液。

(7)将完成步骤(5)的500μL洗脱液和10mL步骤(6)得到的培养菌液混合，37℃静置30min(目的为感染)，然后4000rpm离心15min，收集菌体并均匀涂布于2YTAG平板上，37℃培养过夜。

(8)完成步骤(7)后，刮下2YTAG平板上的菌落，然后接种于2YTAG培养基中进行噬菌体展示，采用PEG/Nacl沉淀，得到噬菌体。该噬菌体即为经过一轮淘选后获得的噬菌体。

2、第二轮亲和淘选

将步骤1中(3)的“噬菌体抗体库”替换为步骤1中(8)获得的噬菌体，其它步骤均不变，得到噬菌体。该噬菌体即为经过二轮淘选后获得的噬菌体。

3、第三轮亲和淘选

将步骤1中(3)的“噬菌体抗体库”替换为步骤2获得的噬菌体，其它步骤均不变，得到噬菌体。该噬菌体即为经过三轮淘选后获得的噬菌体。

(二)对照组

按照SEB组三轮亲和淘选的步骤，将His-SEB蛋白溶液替换为PBS缓冲液，其它步骤均不变，得到相应的噬菌体(作为对照)。

各轮亲和淘选的噬菌体的数量见表1。结果表明，经过三轮淘选后，SEB组获得的重组噬菌体的数量明显呈增加趋势，而对照组中噬菌体的数量变化不大。这说明与SEB结合的噬菌体得到明显富集。

表1

淘选轮数	His-SEB蛋白(μg/mL)	噬菌体投入量	SEB组噬菌体输出量	对照组噬菌体输出量
					一轮淘选	10	1.2×10<sup>12</sup>	1.6×10<sup>4</sup>	5.6×10<sup>3</sup>
二轮淘选	10	2.5×10<sup>12</sup>	3.6×10<sup>4</sup>	1.2×10<sup>3</sup>
					三轮淘选	10	3.2×10<sup>12</sup>	5.5×10<sup>6</sup>	2.4×10<sup>3</sup>

二、抗SEB单克隆抗体阳性克隆的筛选

1、完成步骤一后，分别取SEB组三轮淘选后获得的多个克隆，接种于1mL 2YTAG培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，得到培养菌液。

2、取30μL培养菌液，接种至900μL 2YTAG培养基中，37℃、220rpm振荡培养至OD_600nm值达到0.6-0.8，然后加入5×10¹⁰的辅助噬菌体M13KO7，37℃静置30min。

3、完成步骤2后，4℃、4000rpm离心15min，收集沉淀并用1mL 2YTAK重悬，28℃、220rpm培养过夜。

4、完成步骤3后，phage-ELISA鉴定阳性克隆，并将阳性克隆进行测序。

OD>1.0的阳性克隆65个，0.5<OD<10的阳性克隆13个，OD<0.5的阳性克隆18。结果显示，克隆中阳性率为81.25％。选取ELISA信号值较高的10个克隆送测序，获得1个抗体序列，命名为YG11-1抗体。

YG11-1抗体为IgG，重链如序列表的序列1所示(序列1中第21-145位氨基酸残基组成重链可变区)，轻链如序列表的序列3所示(序列3中第21-127位氨基酸残基组成轻链可变区)。

实施例3、YG11-1抗体的功能鉴定

一、YG11-1抗体的制备

1、重组质粒的构建

用序列表的序列2所示的DNA分子取代载体pCDNA3.1(+)中HindⅢ和XhoI酶切位点之间的小片段，得到重链表达载体。序列表的序列2中，第1-584位核苷酸组成启动子，第681-2108位核苷酸编码全长重链，第2141-2196位核苷酸组成终止子。

用序列表的序列4所示的DNA分子取代载体pCDNA3.1(+)中HindⅢ和XhoI酶切位点之间的小片段，得到轻链表达载体。序列表的序列4中，第1-584位核苷酸组成启动子，第681-1385位核苷酸编码全长轻链，第1418-1473核苷酸组成终止子。

2、抗体的制备

(1)将重链表达载体和轻链表达载体等摩尔混合后，采用脂质体2000(按说明书操作)共转染293T细胞，然后采用高糖DMEM培养基(Gibco)在37℃、5％CO₂条件下培养3天，收集上清液。

(2)取步骤(1)得到的上清液，进行protein A纯化，收集纯化产物。

(3)取步骤(2)得到的纯化产物，进行超滤浓缩换液，将体系更换为PBS缓冲液，得到YG11-1抗体溶液。

采用A280nm紫外光吸收法检测YG11-1抗体溶液的抗体浓度。YG11-1抗体溶液中的抗体浓度为2mg/ml。

YG11-1抗体溶液的聚丙烯酰氨凝胶电泳图见图4。图4中，A为还原电泳，B为非还原电泳。

二、ELISA检测YG11-1抗体的结合活性

1、取酶标板，加入包被液(100μl/孔)，4℃过夜。

包被液有包被原和包被缓冲液组成，包被原在包被液中的浓度为10μg/mL。包被原为实施例1制备的His-SEB蛋白。包被缓冲液(pH9.6)：Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.94g，余量为水。

2、完成步骤1后，取所述酶标板，用PBST缓冲液洗涤三次。

3、完成步骤2后，取所述酶标板，加入含5g/100mL脱脂奶粉的PBST缓冲液，37℃封闭1h。

4、取步骤一制备的YG11-1抗体溶液，采用PBS缓冲液制备抗体浓度为10μg/mL的母液，然后采用PBS缓冲液进行三倍梯度稀释(共设10个稀释梯度)，得到不同浓度的YG11-1抗体溶液。

5、取完成步骤3的酶标板，加入PBS缓冲液(作为对照)或步骤4得到的不同浓度的YG11-1抗体溶液(每孔100μL)，37℃孵育1h。每种浓度设置3个复孔。

6、完成步骤5后，取所述酶标板，用PBST缓冲液洗涤三次(每次每孔250μL)。

7、完成步骤6后，取所述酶标板，加入HRP标记的山羊抗人IgG二抗稀释液(将HRP标记的山羊抗人IgG二抗按1:40000稀释于含5g/100mL脱脂奶粉的PBST缓冲液)，37℃孵育30min。

8、完成步骤7后，取所述酶标板，加入显色试剂(每孔100μL)，室温显色5min。显色试剂为TMB显色试剂盒中的组件。

9、完成步骤8后，取所述酶标板，加入10％H₂SO₄溶液终止显色(每孔50μL)，然后检测在450nm波长下OD值。

结果见图5(R²＝0.9938)。结果表明，YG11-1抗体可以与His-SEB蛋白结合，且结合活性较高，EC50值为12.97ng/mL。

三、BIAcore测定YG11-1抗体的亲和力

采用捕获法测定抗体的亲和力，具体步骤如下：将抗人F_C段的抗体偶联至芯片CM5的表面上，稀释步骤一制备的YG11-1抗体溶液至抗体浓度为0.5μg/mL，保证约100RU抗体被抗人Fc的抗体捕获。将His-SEB蛋白设置一系列的浓度梯度(浓度分别为33nM、13.2nM、5.3nM、2.1nM和0.85nM)流经固定相表面，测定抗体的亲和力。

结果见图6和表2。结果表明，YG11-1抗体的亲和力为16.59nM。

表2

Kon(1/MS)	Koff(1/S)	KD
			1.020E+6	0.01693	1.659E-8

四、小鼠致死模型验证YG11-1抗体的功能

供试液1：200μl His-SEB蛋白溶液(实施例1制备的His-SEB蛋白溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)与200μl YG11-1抗体溶液(步骤一制备的YG11-1抗体溶液，用PBS缓冲液调整抗体浓度)混合，得到供试液1。200μl His-SEB蛋白溶液中含20μg His-SEB蛋白。200μlYG11-1抗体溶液中含200μg YG11-1抗体。

供试液2：200μl His-SEB蛋白溶液(实施例1制备的His-SEB蛋白溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)与200μl YG11-1抗体溶液(步骤一制备的YG11-1抗体溶液，用PBS缓冲液调整抗体浓度)混合，得到供试液2。200μl His-SEB蛋白溶液中含20μg His-SEB蛋白。200μlYG11-1抗体溶液中含100μg YG11-1抗体。

供试液3：200μl His-SEB蛋白溶液(实施例1制备的His-SEB蛋白溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)与200μl YG11-1抗体溶液(步骤一制备的YG11-1抗体溶液，用PBS缓冲液调整抗体浓度)混合，得到供试液3。200μl His-SEB蛋白溶液中含20μg His-SEB蛋白。200μlYG11-1抗体溶液中含50μg YG11-1抗体。

供试液4：200μl His-SEB蛋白溶液(实施例1制备的His-SEB蛋白溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)与200μl对照IgG溶液(对照IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司货号ZDR-5001的产品，用PBS缓冲液调整抗体浓度)混合，得到供试液4。200μl His-SEB蛋白溶液中含20μg His-SEB蛋白。200μl对照IgG溶液中含200μg对照IgG。

6-8周龄BALB/c雌性小鼠，随机分成4组，每组8只。

第一组：腹腔注射致敏剂溶液(0.4mL/只)，30min后腹腔注射供试液1(0.4mL/只)，观察各组小鼠的死亡情况，每24小时统计存活率；

第二组：腹腔注射致敏剂溶液(0.4mL/只)，30min后腹腔注射供试液2(0.4mL/只)，观察各组小鼠的死亡情况，每24小时统计存活率；

第三组：腹腔注射致敏剂溶液(0.4mL/只)，30min后腹腔注射供试液3(0.4mL/只)，观察各组小鼠的死亡情况，每24小时统计存活率；

第四组：腹腔注射致敏剂溶液(0.4mL/只)，30min后腹腔注射供试液4(0.4mL/只)，观察各组小鼠的死亡情况，每24小时统计存活率。

结果见图7。结果表明，3天后，第一组小鼠生存率为37.5％，第二组小鼠生存率为12.5％，第三组和第四组小鼠生存率均为0。YG11-1抗体可以有效中和His-SEB蛋白，提高小鼠的生存率。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的单克隆抗体YG11-1及其应用

<130> GNCYX182094

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 475

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

20 25 30

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser

35 40 45

Leu Ser Asp His Ala Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr

65 70 75 80

Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys

85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Gly Asn Lys Asn Ile Asn Tyr Phe

115 120 125

Phe Gln Tyr Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

210 215 220

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

225 230 235 240

Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

370 375 380

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

385 390 395 400

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

435 440 445

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 2

<211> 2196

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540

tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag 600

aacccactgc ttactggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag acccaagctg 660

gctagggatc cgccgccacc atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct 720

gggtgcccgg gtccaccggt caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc 780

ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cagcctcagc gaccatgctg 840

tccactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggctctt atctcatatg 900

atggaagtga taaatactac aaagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca 960

atcccaagaa cacgctgtat ctgcagatga ccagtctgaa acctgaggac acggctgttt 1020

attactgtgc gagacaaggt gggaacaaaa acataaacta cttcttccag tacctggacg 1080

tctggggcca agggacaatg gtcaccgtct cttcagctag caccaagggc ccatcggtct 1140

tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg 1200

tcaaggacta cttccccgaa cccgtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg 1260

gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg 1320

tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc 1380

ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat 1440

gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa 1500

aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg 1560

tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata 1620

atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc 1680

tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca 1740

aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac 1800

cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga 1860

cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc 1920

agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc 1980

tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct 2040

ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtccccgg 2100

gtaaatagat ccaaagatcc cccgacctcg acctctggct aataaaggaa atttattttc 2160

attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca 2196

<210> 3

<211> 234

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr

35 40 45

Ile Ser Asn His Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ile

100 105 110

Asn Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 4

<211> 1473

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540

tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag 600

aacccactgc ttactggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag acccaagctg 660

gctagggatc cgccgccacc atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct 720

gggtgcccgg gtccaccggt gatattgtga tgacccagac tccatcctcc ctgtctgcgt 780

ctgtaggaga cagagtcaac atcagttgcc gggcaagtca gaccattagt aaccatttaa 840

attggtatct gcagaaacca gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt 900

tggaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca 960

ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttattaatt 1020

accctcccac tttcggccct gggaccaaac tcgagatcaa acgtacggtg gctgcaccat 1080

ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc agcgttgtgt 1140

gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc 1200

tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca 1260

gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct 1320

gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt 1380

gttagatcca aagatccccc gacctcgacc tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt 1440

gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tca 1473

<210> 5

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Lys

1 5 10 15

Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His

20 25 30

Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Leu Tyr Phe Asp

35 40 45

Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val

50 55 60

Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys

65 70 75 80

Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser

85 90 95

Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg Lys Thr

100 105 110

Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu Asp Lys

115 120 125

Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu Leu

130 135 140

Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu

145 150 155 160

Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu

165 170 175

Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn

180 185 190

Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe

195 200 205

Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp

210 215 220

Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys

225 230 235

<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gagagtcaac cagatcctaa accagatgag ttgcacaaat cgagtaaatt cactggtttg 60

atggaaaata tgaaagtttt gtatgatgat aatcatgtat cagcaataaa cgttaaatct 120

atagatcaat ttctatactt tgacttaata tattctatta aggacactaa gttagggaat 180

tatgataatg ttcgagtcga atttaaaaac aaagatttag ctgataaata caaagataaa 240

tacgtagatg tgtttggagc taattattat tatcaatgtt atttttctaa aaaaacgaat 300

gatattaatt cgcatcaaac tgacaaacga aaaacttgta tgtatggtgg tgtaactgag 360

cataatggaa accaattaga taaatataga agtattactg ttcgggtatt tgaagatggt 420

aaaaatttat tatcttttga cgtacaaact aataagaaaa aggtgactgc tcaagaatta 480

gattacctaa ctcgtcacta tttggtgaaa aataaaaaac tctatgaatt taacaactcg 540

ccttatgaaa cgggatatat taaatttata gaaaatgaga atagcttttg gtatgacatg 600

atgcctgcac caggagataa atttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caatgacaat 660

aaaatggttg attctaaaga tgtgaagatt gaagtttatc ttacgacaaa gaaaaagtga 720

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met

20

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atg 63

Claims

1.一种IgG抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区由序列表的序列1自N末端第21-145位氨基酸残基组成；所述轻链中的轻链可变区由序列表的序列3自N末端第21-127位氨基酸残基组成。

2.如权利要求1所述的IgG抗体，其特征在于：

所述重链为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列1自N末端第21-475位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列1所示的蛋白质；

3.编码权利要求1所述IgG抗体的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：编码所述重链的基因为序列表的序列2自5’末端第681-2108位核苷酸所示的DNA分子；编码所述轻链的基因为序列表的序列4自5’末端第681-1385核苷酸所示的DNA分子。

5.权利要求1或2所述IgG抗体在制备治疗肠毒素B引起的疾病的药物中的应用。

6.权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于拮抗肠毒素B的药物中的应用。

7.权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于中和肠毒素B的药物中的应用。

8.权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于抑制金黄色葡萄球菌的药物中的应用。

9.权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用。

10.一种药物，其活性成分为权利要求1或2所述IgG抗体；

所述药物的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)治疗肠毒素B引起的疾病；

(b)拮抗肠毒素B；

(c)中和肠毒素B；

(d)抑制金黄色葡萄球菌；

(e)预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病。