JP2002524024A - インターナライズするＥｒｂＢ２抗体 - Google Patents

インターナライズするＥｒｂＢ２抗体

Info

Publication number
JP2002524024A
JP2002524024A JP2000545565A JP2000545565A JP2002524024A JP 2002524024 A JP2002524024 A JP 2002524024A JP 2000545565 A JP2000545565 A JP 2000545565A JP 2000545565 A JP2000545565 A JP 2000545565A JP 2002524024 A JP2002524024 A JP 2002524024A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
seq
antibodies
amino acid
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000545565A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002524024A5 (ja
Inventor
ジェイムズ ディー． マークス，
マリー アリックス プール，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Original Assignee
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA filed Critical THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Publication of JP2002524024A publication Critical patent/JP2002524024A/ja
Publication of JP2002524024A5 publication Critical patent/JP2002524024A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/812—Liposome comprising an antibody, antibody fragment, antigen, or other specific or nonspecific immunoeffector

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規のｅｒｂＢ２結合性のインターナライズする抗体を提供する。この抗体（Ｆ５およびＣ１と命名する）は、ｃ−ｅｒｂＢ２抗原に特異的に結合し、そして結合すると、ｃ−ｅｒｂＢ２マーカーを有する細胞に容易にインターナライズする。１以上のエフェクター分子に付着したＦ５抗体および／またはＣ１抗体を含むキメラ分子もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願に対する相互参照） 本出願は、米国特許法第１１９条ｅ項のもとで、１９９８年４月２４日に出願
された仮出願である米国出願６０／０８２，９５３号の利益を請求する。この出
願は、全ての目的において、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】 （連邦政府に援助された研究開発のもとでなされた発明の権利に関する記載） 本発明は、国防総省助成金ＤＡＭＤ１７−９６−１−６２４４およびＤＡＭＤ
１７−９４−４４３３によって部分的に支援された。アメリカ合衆国政府は、本
発明にいくらかの権利を有し得る。
【０００３】 （発明の分野） 本発明は、免疫診断および免疫治療の分野に関する。さらに詳細には、本発明
は、ｃ−ｅｒｂＢ−２を特異的に結合する新規なヒト抗体の発現、およびこれら
の抗体を含むキメラ分子に関する。
【０００４】 （発明の背景） 一般的に、特定のクラスの細胞（例えば、腫瘍細胞）に特異的に結合する抗体
を同定することが所望されている。このような抗体は、時折、「標的化抗体」と
呼ばれ、種々のエフェクター分子（例えば、リポソーム、サイトトキシン、標識
など）を標的細胞に指向させる（送達する）ために使用され得る。
【０００５】 標的化抗体は、癌の研究および処置において特に関心を持たれてきた。癌研究
の主要な目的は、正常細胞と質的もしくは量的に異なる腫瘍抗原を同定すること
である（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（１９９４）Ｃａ：Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．ｆｏ
ｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ．４４：４３−６４）。このような抗原の存在および
／または量は抗体によって検出され得、このような検出は、診断試験および予後
試験の基礎を構成する。さらに、これらの抗体は、これらのエフェクター機能（
Ｂｒｏｗｎら（１９８９）Ｂｌｏｏｄ．７３：６５１−６６１）を介してか、ま
たはこの抗体に細胞毒を結合させる（Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ．２３８：１０９８−１１０４；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：５４７−５５１）ことより、
直接的に腫瘍細胞を選択的に殺傷するために使用され得る。
【０００６】 腫瘍細胞上で過剰発現される抗原の証明にもかかわらず、抗体の使用は、固形
腫瘍の診断および処置に関して限られた成功を収めてきたにすぎない（Ｒｉｅｔ
ｈｍｕｌｌｅｒら（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：６４
７−６５５、およびＲｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉ
ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：７３２−７３９の概説を参照のこと）。これらの有
用性は、腫瘍特異的抗体の不足、抗体の免疫原性、低い結合親和性、および乏し
い腫瘍浸透により妨げられてきた。
【０００７】 非特異的な毒性は、抗体が腫瘍細胞に特異的に高親和性で結合しないことに起
因する。その結果として、非特異的な細胞殺傷が生じる。さらに、外来イムノト
キシン分子は、ヒトにおいて、強力な免疫応答を誘起する。イムノトキシン分子
の毒素部分の免疫原性は、最近、ＲＮａｓｅのヒトアナログを使用することによ
り克服された（Ｒｙｂａｋら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，８９：３１６５）。しかし、マウス抗体部分は、いまだに有意な
免疫原性である（Ｓａｗｌｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３５：１
５３０）。
【０００８】 高親和性腫瘍特異的ヒト抗体が利用可能であるならば、免疫原性を避けられ得
、かつ毒性を減少させ得る。しかし、従来のハイブリドーマ技術を使用してヒト
モノクローナル抗体を産生することは、極端に困難であることが証明されている
（Ｊａｍｅｓら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１００：５）。
さらに、精製腫瘍特異的抗原の不足のために、インタクトな腫瘍細胞で免疫する
か、または部分的に精製した抗原で免疫することが必要とされる。産生されたほ
とんどの抗体は、正常な細胞とも共通の抗原と反応し、それ故、腫瘍特異的な標
的化分子としての使用に不適切である。
【０００９】 （発明の要旨） 本発明は、新規な２つのインターナライズする抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体を提供
する。これらは、本明細書において、それぞれＦ５およびＣ１と称される。好ま
しい抗体は、ｃ−ｅｒｂＢ−２レセプターに特異的に結合する。これらは、Ｆ５
誘導抗体またはＣ１誘導抗体である（すなわち、Ｆ５および／またはＣ１により
結合されるｃ−ｅｒｂＢ−２レセプターエピトープに結合する抗体）。これらの
抗体は、好ましくは、配列番号１、配列番号２、保存的置換を有する配列番号１
、および保存的置換を有する配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含む。特に好ましい抗体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と少
なくとも７０％の配列同一性を共有し、そして細胞のｃ−ｅｒｂＢ−２に対して
少なくとも１０5Ｍの結合親和性を有する。１つの実施態様において、これらの
抗体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と、多くて３０残基だけ異
なるアミノ酸配列を有する。この抗体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、ま
たは少なくとも３つの、配列番号１および／または配列番号２の相補性決定領域
（ＣＤＲ）を含み得る。さらに、あるいは代替的に、この抗体は、少なくとも１
つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの、配列番号１および／または配列
番号２のフレームワーク領域を含み得る。特に好ましいＦ５抗体およびＣ１抗体
は、それぞれ、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００１０】 別の実施態様において、本発明は、Ｆ５またはＣ１に対して惹起された抗イデ
ィオタイプ抗体と交叉反応する抗体を提供する。従って、本発明は、ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２レセプターに特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、配列番号１
または配列番号２に示されるポリペプチド配列に由来する少なくとも１０の連続
するアミノ酸配列を含む。そしてこの抗体は、抗原として提示された場合、配列
番号１または配列番号２に示されるポリペプチド配列に特異的に結合する抗イデ
ィオタイプ抗体の産生を誘起する。そしてこの抗体は、配列番号１および配列番
号２に示されるポリペプチドに対して惹起され、配列番号１および配列番号２に
示されるポリペプチドで完全に免疫吸着された抗血清に結合しない。これらの抗
体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同
一性を共有し得、そして細胞上のｃ−ｅｒｂＢ−２に対して少なくとも１０：Ｍ
．の結合親和性を有する。この抗体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸
配列と、多くて３０残基だけ異なるアミノ酸配列を含み得る。この抗体は、配列
番号１または配列番号２の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
【００１１】 本発明はまた、Ｆ５またはＣ１によって特異的に認識されるエピトープも提供
する。これらは、本明細書中に提供されるＦ５抗体またはＣ１抗体を利用するエ
ピトープマッピング法によって容易に同定される。
【００１２】 なお別の実施態様において、本発明は、エフェクター分子を、ｃ−ｅｒｂＢ−
２レセプターを保有する細胞に特異的に送達する方法を提供する。この方法は、
本明細書中に記載されるＣ１誘導抗体またはＦ５誘導抗体のいずれかに付着させ
たエフェクター分子を含むキメラ分子を提供する工程、ならびにｃ−ｅｒｂＢ−
２を保有する細胞とこのキメラ分子とを接触させ、それによって、このキメラ分
子がこの細胞に特異的に結合する工程を包含する。特に好ましい実施態様におい
て、キメラ分子の全てまたは一部は、細胞中にインターナライズされる。好まし
いエフェクター分子としては、サイトトキシン、標識、放射性核種、薬物、リポ
ソーム、リガンド、抗体などか挙げられるが、これらに限定されない。特に好ま
しい実施態様において、エフェクター分子はタンパク質であるか、またはタンパ
ク質を含み、そしてキメラ分子は融合タンパク質である。特に好ましい標的細胞
は、癌（例えば、転移性腫瘍または固形腫瘍、例えば、乳癌）細胞である。
【００１３】 本発明はまた、本明細書中に記載されるエフェクター分子のいずれかに結合さ
れた、本明細書中に記載される抗体のいずれかを含むキメラ分子も提供する。好
ましいキメラ分子は、ｃ−ｅｒｂＢ−２を保有する細胞と結合する。特に好まし
いキメラ分子は、融合タンパク質である。
【００１４】 本発明はまた、本明細書中に記載される種々の構築物をコードする核酸も提供
する。従って、１つの実施態様において、本発明は、ｃ−ｅｒｂＢ−２レセプタ
ーに特異的に結合する抗体をコードする核酸を提供する。ここで、この抗体は、
Ｆ５（配列番号１）またはＣ１（配列番号２）によって結合されるエピトープに
特異的に結合するＦ５誘導抗体またはＣ１誘導抗体である。好ましい核酸は、配
列番号１、配列番号２、保存的置換を有する配列番号１、および保存的置換を有
する配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。特に好ま
しい核酸は、配列番号１または配列番号２の抗体をコードする核酸と、ストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする。他の好ましい核酸は、配列番号１また
は配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の配列同一性を共有する抗体
をコードし、そしてここで、この抗体は、細胞上のｃ−ｅｒｂＢ−２に対して少
なくとも１０μＭの結合親和性を有する。特に好ましい核酸は、配列番号１また
は配列番号２のアミノ酸配列と、多くて３０残基だけ異なるアミノ酸配列をコー
ドする。別の好ましい核酸は、配列番号１または配列番号２の１以上の相補性決
定領域（ＣＤＲ）をコードする。他の好ましい核酸は、配列番号１または配列番
号２のアミノ酸配列をコードする配列を含む。
【００１５】 キメラタンパク質が融合タンパク質である場合、本発明はまた、このキメラタ
ンパク質をコードする核酸も提供する。
【００１６】 別の実施態様において、本発明は、本明細書中に記載される核酸のいずれかを
発現する細胞（例えば、真核生物細胞または原核生物細胞）を提供する。
【００１７】 本発明はまた、薬学的組成物も提供する。薬学的組成物は、好ましくは、薬理
学的な賦形剤、および１つ以上の本明細書中に記載されるＦ５誘導抗体またはＣ
１誘導抗体を含む。
【００１８】 本明細書中に記載されるように、病理学的状態（例えば、癌）の診断および処
置のためのキット、または本明細書中に記載されるスクリーニング法もしくはト
ランスフェクション法のいずれかの実行のためのキットもまた提供される。
【００１９】 （定義） 本明細書中に記載される場合、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫
グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１以上のポリペ
プチドからなるタンパク質をいう。認められた免疫グロブリン遺伝子としては、
κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリ
ン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。
重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは、順番にそれぞれ
、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定
する。
【００２０】 代表的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含むことが公知であ
る。各々の四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一な対から構成され、各々の対
は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）と１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤ）とを
有する。各々の鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０以上のアミ
ノ酸の可変領域を規定する。用語、可変軽鎖（ＶL）および可変重鎖（ＶH）は、
それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００２１】 抗体は、インタクトな免疫グロブリンとしてか、または種々のペプチダーゼで
の消化により生成された、多数のよく特徴付けられたフラグメントとして存在す
る。従って、例えば、ペプシンは、抗体をヒンジ領域のジスルフィド結合の下で
消化して、Ｆａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’2を産生する。Ｆａｂは、ジスル
フィド結合によりＶH−ＣH１と結合した軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’2は、ヒンジ
領域のジスルフィド架橋を破壊する穏やかな条件下で還元され得、それにより、
（Ｆａｂ’）2二量体はＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は、実質
的には、ヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのさら
に詳細な記載については、Ｆｎｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）を参照の
こと）。種々の抗体フラグメントが、インタクトな抗体の消化に関して定義され
ている一方で、当業者は、このようなＦａｂ’フラグメントが化学的にかまたは
組換えＤＮＡ方法論を利用することによってデノボ合成され得ることを理解する
。従って、用語、抗体は、本明細書中で使用される場合、抗体全体の改変によっ
て産生されたか、または組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボ合成された抗体フ
ラグメントもまた含み得る。好ましい抗体としては、単鎖抗体（単一のポリぺプ
チド鎖として存在する抗体）、より好ましくは単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖまたはｓ
ｃＦｖ）が挙げられ、これらでは、可変重鎖と可変軽鎖とが共に結合され（直接
的またはペプチドリンカーを介して）、連続したポリぺプチドを形成する。単鎖
Ｆｖ抗体は、共有結合したＶH-ＶLヘテロ二量体であり、これは、直接的にかま
たはペプチドコードリンカーによってかのいずれかで結合されたＶH−コード領
域およびＶL−コード領域を含む核酸配列から発現され得る。Ｈｕｓｔｏｎら（
１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５
８８３。ＶHおよびＶLは、単一のポリぺプチド鎖として互いに結合される一方で
、ＶHドメインおよびＶLドメインは、非共有結合的に会合する。糸状ファージの
表面上で発現されるべき第１の機能的な抗体分子は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であ
ったが、代替の発現ストラテジーもまた、首尾の良い結果であった。例えば、Ｆ
ａｂ分子は、一方の鎖（重鎖または軽鎖）がｇ３キャプシドタンパク質に融合さ
れ、そしてその相補鎖が、可溶性分子としてペリプラズムに輸送される場合、フ
ァージ上に提示され得る。この２つの鎖は、同じレプリコン上または異なるレプ
リコン上にコードされ得る；各々のＦａｂ分子内の２つの抗体鎖が翻訳後にアセ
ンブルし、そしてこの二量体が、ｇ３ｐに対する一方の鎖の結合を介してファー
ジ粒子中に組み込まれることは重要な点である（例えば、米国特許第５７３３７
４３号を参照のこと）。ｓｃＦｖ抗体、および多くの他の構造（天然では凝集さ
れるが化学的に分離された、抗体Ｖ領域に由来する軽鎖ポリぺプチドおよび重鎖
ポリぺプチドを、抗原結合部位の構造に実質的に類似する三次元構造に折り畳む
分子に変換すること）は、当業者に公知である（例えば、米国特許第５，０９１
，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９５６，７７８号を参
照のこと）。特に好ましい抗体としては、ファージ上に提示される全ての抗体が
挙げられ、本発明者は、好ましい抗体は、ファージ上に提示される全ての抗体を
含むべきだと考える（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂおよびジスルフィド結合
したＦｖ（Ｒｅｉｔｅｒ（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１３２３−
１３３１））。
【００２２】 「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン
分子の部分をいう。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ
末端の可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖
のＶ領域内の３つの高度に異なるストレッチは「超可変領域」といわれ、これは
、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知の、より保存された隣接ス
トレッチ間に挿入される。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリン中の超可変
領域の間に、および免疫グロブリン中の超可変領域に隣接して、天然に見出され
るアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖
の３つの超可変領域は、抗原結合「表面」を形成するために３次元空間中に互い
に関連して配置される。この表面は、標的抗原の認識および結合を媒介する。重
鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ
」といわれ、そして例えば、ＫａｂａｔらのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、
Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐ
ｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９
８７）によって特徴付けられる。
【００２３】 「インターナライズする抗体」は、細胞表面上のレセプターまたは他のリガン
ドに結合する際に、細胞内に（例えば、細胞の小胞または他の小器官内に、ある
いは細胞質内に）輸送される抗体である。
【００２４】 本明細書中で使用される場合、用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特
性」は、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンに特異的である抗原との間
に生じる型の非共有結合的相互作用をいう。免疫学的結合相互作用の強さまたは
親和性は、その相互作用の解離定数（Ｋd）によって表現され得る。ここで、よ
り小さなＫｄは、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的
結合特性は、当該分野で周知の方法を用いて定量され得る。そのような１つの方
法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴う
。ここで、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、およ
び両方向における速度に等しく影響を与える幾何学的パラメーターに依存する。
従って、「オン速度定数」（ｋon）および「オフ速度定数」（ｋoff）の両方は
、会合および解離の濃度および実際の速度の算出によって決定され得る。ｋoff
／ｋonの比は、親和性に関連しない全パラメーターの削除を可能にし、従って、
解離定数Ｋdに等しい（一般に、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９：４３９〜４７３を参照のこと）。
【００２５】 句「タンパク質に特異的に結合する」または「〜と特異的に免疫反応性」は、
抗体に対して言及される場合、タンパク質および他の生物製剤の異種集団の存在
下においてタンパク質の存在を決定する結合反応をいう。従って、指定されたイ
ムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、特定のタンパク質に結合し、そしてサン
プル中に存在する他のタンパク質に有意な量で結合しない。このような条件下に
おけるタンパク質への特異的な結合は、特定のタンパク質に対する特異性につい
て選択される抗体を必要とし得る。例えば、Ｆ５抗体またはＣ１抗体は、ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２を結合し、そして組織サンプル中に存在する他のタンパク質に結合し
ないｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質を生じ得る。種々のイムノアッセイ形式は、特
定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る
。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性
であるモノクローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的な免疫
反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式および条件の記載につ
いては、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００２６】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」は、本明細書中
で交換可能に使用されて、隣接残基のα−アミノ基とカルボキシ基との間のペプ
チド結合によって互いに連結される直鎖のアミノ酸残基を示す。アミノ酸残基は
、好ましくは、天然の「Ｌ」異性体形態である。しかし、「Ｄ」異性体形態の残
基は、所望の機能的特性がポリペプチドによって保持される限り、任意のＬ−ア
ミノ酸残基と置換され得る。さらに、アミノ酸は、２０の「標準的」アミノ酸に
加えて、修飾されたアミノ酸および通常でないアミノ酸（これは、米国特許法施
行規則１．８２２（ｂ）（４）に列挙されるアミノ酸を含むが、これらに限定さ
れない）を含む。さらに、アミノ酸残基配列の開始および終りのダッシュは、１
つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列に対するペプチド結合またはカルボキシル
末端基もしくはヒドロキシル末端基に対する共有結合のいずれかを示すことに注
意するべきである。
【００２７】 用語「結合ポリペプチド」は、抗原に対する抗体の結合に類似の様式で、標的
分子（例えば、細胞レセプター）に特異的に結合するポリペプチドをいう。結合
ポリペプチドは、結合ポリペプチドが免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリ
ン遺伝子のフラグメントに究極的に由来しない点で、抗体から区別される。
【００２８】 用語「Ｆ５抗体」または「Ｃ１抗体」は、代表的に、それぞれＦ５またはＣ１
によって結合されるエピトープに結合する抗体をいう。好ましいＦ５抗体または
Ｃ１抗体は、インターナライズする抗体である。基本型の抗体に言及するために
使用される場合、Ｆ５およびＣ１は、それぞれ配列番号１および配列番号２の配
列を有する抗体をいう。Ｆ５抗体はまた、本実施例において３ＴＦ５ともいわれ
る。
【００２９】 用語「保存的置換」は、タンパク質またはペプチドに関して、その分子の活性
（特異性または結合親和性）を実質的に変更しないアミノ酸置換を示すために使
用される。代表的には、保存的アミノ酸置換としては、あるアミノ酸の、類似の
化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸への置換が挙げ
られる。以下の６つの各群は、代表的な、互いに保存的置換であるアミノ酸を含
む： １）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
；および ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００３０】 用語「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリ
ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。特に限
定されない限り、この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、そして天然
に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知
のアナログを含む核酸を含む。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、そ
れらの保存的に修飾された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補的配
列ならびに明確に示された配列を含む。
【００３１】 特に、縮重コドン置換体は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの
第３位が、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配
列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８；およびＣａｓｓｏｌら（
１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅ
ｓ ８：９１〜９８）。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によっ
てコードされるｍＲＮＡに対して交換可能に使用される。
【００３２】 用語「単離された（した）」または「生物学的に純粋（な）」は、その天然状
態において見出されるような、通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的
に含まない物質をいう。しかし、用語「単離された（した）」は、電気泳動ゲル
または他の分離媒体に存在する成分に対する言及を意図しない。単離された成分
は、そのような分離媒体を含まず、そして別の適用での使用、または既に新たな
適用／環境での使用ができる形態である。
【００３３】 用語「同一（の）」もしくはパーセント「同一性」、またはパーセント「相同
性」は、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、以下の配列比較
アルゴリズムの１つを使用して、あるいは視覚的検査によって測定されるような
、最大の対応について比較および整列される場合、同一であるか、あるいは示さ
れた割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同一である２つ以上の配列または
サブ配列をいう。
【００３４】 句「実質的に同一（の）」は、２つの核酸またはポリペプチドに関して、以下
の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、あるいは視覚的検査によって測定さ
れるような、最大の対応について比較および整列される場合、少なくとも３０ヌ
クレオチドのウインドウにわたって、好ましくは少なくとも４０ヌクレオチドの
ウインドウにわたって、より好ましくは少なくとも８０ヌクレオチドのウインド
ウにわたって、そして最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、１５０ヌ
クレオチド、２００ヌクレオチドまたはそれ以上のウインドウにわたって、少な
くとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％またはさらに少
なくとも９８％のアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列またはサブ配列を
いう。
【００３５】 配列比較について、代表的には、一方の配列は、試験配列が比較される参照配
列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列
は、コンピュータへ入力され、必要であれば、サブ配列の座標が指定され、そし
て配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較ア
ルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対す
る試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００３６】 比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａ
ｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的
相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズ
ムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性についての検索方法
によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ＧＡＰ、ＢＥＳ
ＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕ
ｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＴＦＡＳ
ＴＡ）によって、または視覚的検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）によっ
て、実行され得る。
【００３７】 有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関
係またはパーセント配列同一性を示すために、順次の対アラインメントを用いて
関連する配列の群から複数の配列アラインメントを作製する。これはまた、アラ
インメントを作製するために使用されるクラスター関係を示す系統樹（ｔｒｅｅ
ｏｒ ｄｅｎｄｏｇｒａｍ）をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇおよ
びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６
０の、順次のアラインメント法の単純化した方法を使用する。使用される方法は
、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１
５３によって記載される方法に類似である。プログラムは、３００の配列まで整
列可能である。それぞれの最大長は、５，０００ヌクレオチドまたは５，０００
アミノ酸である。複数のアラインメント手順は、２つの最も類似の配列の対のア
ラインメントで始まり、２つの整列した配列のクラスターを生成する。次いで、
このクラスターは、次に最も関連したクラスターまたは整列された配列のクラス
ターに整列される。配列の２つのクラスターは、２つの個々の配列の対アライン
メントの単純な拡張によって整列される。最終的なアラインメントは、一連の順
次の対アラインメントによって達成される。プログラムは、配列比較の領域につ
いて特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチドの座標を指定するこ
と、ならびにプログラムパラメーターを指定することによって実行される。例え
ば、参照配列は、以下のパラメーターを用いて、他の試験配列と比較して、パー
セント配列同一性の関係を決定し得る：デフォルトギャップウエイト（３．００
）、デフォルトギャップ長さウエイト（０．１０）、および重み付け末端ギャッ
プ。
【００３８】 パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切であるアルゴリ
ズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら
（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０に記載される。Ｂ
ＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅ
ｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、公に入手可能
である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列さ
れる場合、幾分正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはＴを満たすかのいず
れかである、問い合わせ配列中の短いワード長Ｗを同定することにより、まず高
スコア付け配列対（ＨＳＰ）を同定することを包含する。。Ｔは、近傍ワードス
コア閾値といわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の近傍ワード
ヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを見出すために検索を開始するための
シードとして働く。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加
する限り、各配列に沿って両方向に伸張される。両方向におけるワードヒットの
伸張は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値
から量Ｘだけ減少する場合；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの集積
に起因して、累積スコアがゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に
到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラ
インメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルト
として、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリク
ス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９２５を参照のこと）アラインメント
（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する
。
【００３９】 パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはま
た、２つの配列間の類似性の統計的分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎおよ
びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９０：５８７３〜５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによっ
て提供される、類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。これ
は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の
指標を提供する。例えば、試験核酸の、参照核酸に対する比較における最小合計
確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは
約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に類似であると見なされる。
【００４０】 ２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる指標
は、以下に記載のように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２
の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交叉反応性であることであ
る。従って、例えば、代表的には、２つのペプチドが、保存的置換のみが異なる
場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸
配列が実質的に同一であるという別の指標は、以下に記載のように、ストリンジ
ェントな条件下で、２つの分子が、互いにハイブリダイズすることである。
【００４１】 用語「特異的にハイブリダイズする」または「特異的ハイブリダイゼーション
」または「選択的にハイブリダイズする」は、その配列が複雑な混合物（例えば
総細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、
特定のヌクレオチド配列に対して核酸分子が優先的に結合すること、二重鎖にな
ること、またはハイブリダイズすることをいう。
【００４２】 用語「ストリンジェントな条件」は、プローブが、その条件下でその標的配列
に優先的にハイブリダイズし、そしてその他の配列にはより少ない程度でハイブ
リダイズするか、または全くハイブリダイズしない条件をいう。サザンハイブリ
ダイゼーションおよびノザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイ
ゼーション実験の文脈における「ストリンジェントハイブリダイゼーション」お
よび「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であ
り、そして異なる環境パラメータの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーション
への広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ 第Ｉ部、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓ
ｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ
」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高度にストリ
ンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度
およびｐＨで、特定配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。
このＴｍは、標的配列の５０％が、（規定されたイオン強度およびｐＨの下で）
完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジ
ェントな条件は、特定のプローブに対するＴｍに等しいように選択される。
【００４３】 サザンまたはノザンブロットにおいて、フィルター上の１００より多い相補的
残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションに対するストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃における１ｍｇのヘパリンをともな
う５０％ホルムアミドであって、ハイブリダイゼーションは一晩行われる。高度
にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃における０．１５Ｍ ＮａＣｌで
約１５分である。ストリンジェント洗浄条件の例は、６５℃における０．２×Ｓ
ＳＣ洗浄１５分間である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜
３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ＳＳＣ緩衝液の記述につ
いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）前述、を参照のこと）。しばしば、高ストリンジェ
ンシー洗浄に先行して低ストリンジェンシー洗浄を行い、バックグラウンドプロ
ーブシグナルを取り除く。例えば、１００ヌクレオチドより多い二重鎖の例示の
中程度のストリンジェンシー洗浄は、４５℃における１×ＳＳＣで１５分間であ
る。例えば、１００ヌクレオチドより多い二重鎖の例示の低ストリンジェンシー
洗浄は、４０℃における４〜６×ＳＳＣで１５分間である。一般に、特定のハイ
ブリダイゼーションアッセイにおいて、非関連プローブに対して観察されたシグ
ナル／ノイズ比より２×（またはより高い）の比は、特異的ハイブリダイゼーシ
ョンの検出を示す。ストリンジェント条件下、互いにハイブリダイズしない核酸
は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、なお実質的に
同一である。例えば、これは、核酸のコピーが、遺伝子コードにより許容される
最大コドン縮重度を用いて作製される場合に生じる。
【００４４】 抗体を参照する場合、用語Ｆ５およびＣ１は、それぞれ配列番号１および２の
抗体をいう。好適なＦ５およびＣ１抗体は、配列番号１および２の抗体をそれぞ
れ、またはＦ５およびＣ１の結合特異性が保存される限り、これらの配列の保存
的置換をさらに含む。このＦ５由来およびＣ１由来抗体は、それぞれ、Ｆ５また
はＣ１の（アミノ酸または核酸からの）抗体由来配列である。好ましくは、この
Ｆ５由来抗体およびＣ１由来抗体は、１）鎖シャフリングによる誘導；２）ＣＤ
Ｒの部位特異的変異誘発による誘導；３）エラープローンＰＣＲ、Ｅ．ｃｏｌｉ
の突然変異誘発遺伝子株、または「ＤＮＡシャフリング（Ｃｒａｍｅｒｉら（１
９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１００−１０２）」のいずれか
による配列中への複数変異の導入による誘導を含むが、これらに限定されないい
くつかの型の誘導の１つにより得られる。このＦ５およびＣ１誘導抗体は、１）
Ｆ５およびＣ１により認識されるｃ−ｅｒｂＢ−２エピトープ；および／または
２）抗Ｆ５またはＣ１抗イディオタイプ抗体のいずれかとのそれらの交叉反応性
により認識される。好ましくは、Ｆ５およびＣ１抗体は、約２：Ｍ、より好まし
くは、約１：Ｍより小さい、そして最も好ましくは約１００ｎＭより小さい結合
親和性を有するか、またはより良好にかつ好ましくは、ファージディスプレイラ
イブラリーを（Ｆ５およびＣ１がそれぞれ結合するエピトープの親和性について
）スクリーニングすることにより由来し得、そこでは、既知のＦ５またはＣ１可
変重（ＶH）鎖が複数の可変軽（ＶL）鎖と組み合わせて発現されるか、または逆
に既知のＦ５またはＣ１可変軽鎖が、複数の可変重（ＶH）鎖と組み合わせて発
現される。Ｆ５またはＣ１由来抗体はまた、本明細書で記載されるように、可変
重鎖または可変軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）中へ
の変異の導入により産生されるような抗体を含む。最後に、Ｆ５およびＣ１抗体
は、Ｆ５またはＣ１およびそれらの誘導体に適用されるようなこれらの改変方法
の任意の組み合わせにより産生されるような抗体を含む。
【００４５】 キメラ分子は、その中に、それらの自然の状態では別々に存在する２つ以上の
分子が一緒に結合し、その構成分子のすべての所望の機能性を有する単一の分子
を形成する分子である。このキメラ分子は、各々が別々に合成された２つの分子
を共有結合することにより調製され得るが、当業者は、このキメラ分子が融合タ
ンパク質である場合、このキメラが単一の「結合」分子としてデノボで調製され
得ることを認識する。
【００４６】 融合タンパク質は、その中で、構成分子がすべてポリペプチドであって，そし
て互いに末端ペプチド結合により付着（融合）し、その結果、キメラ分子は、連
続する単一鎖のポリペプチドである。種々の構成成分は、互いに直接付着し得る
か、または１つ以上のペプチドリンカーにより結合し得る。
【００４７】 エフェクター部分または分子は、代表的には、標的細胞（例えば、ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２を過剰発現する腫瘍）に送達されることが所望される特徴的活性を有する
分子または部分である。エフェクター分子は、サイトトキシン、標識、放射線核
種、リガンド、抗体、薬物、リポソーム、およびウイルスをｃ−ｅｒｂＢ−２発
現細胞に感染し得るようにするウイルス外被タンパク質を含む。
【００４８】 「標的」細胞は、本発明の、ファージディスプレイライブラリーのメンバーま
たはキメラ分子により特異的に結合される細胞または細胞型をいう。好適な標的
細胞は、それに対してインターナライズする抗体または結合ポリペプチドが求め
られる細胞である。代表的には、この標的細胞は、細胞型に特徴的である標的分
子の発現または過剰発現により特徴付けられる。従って、例えば、標的細胞は、
ｃ−ｅｒｂＢ−２のようなマーカーを過剰発現する腫瘍細胞のような細胞であり
得る。
【００４９】 「標的部分」は、標的分子に特異的に結合する部分（例えば分子）をいう。標
的分子が細胞の表面上にある分子であり、そして標的化部分がキメラ分子の成分
である場合、この標的化部分は、このキメラ分子を、標的を保有する細胞に特異
的に結合する。標的化部分がポリペプチドである場合、それは、「標的化ポリペ
プチド」と称され得る。
【００５０】 細胞を参照して用いられる場合、用語「インターナライズする」または「イン
ターナライズされた」は、細胞の外側から内側への部分（例えばファージ）の輸
送をいう。このインターナライズされた部分は、細胞内区画、例えば、液胞、リ
ソソーム、小胞体、ゴルジ体、または細胞自身の細胞質ゾル中に配置され得る。
【００５１】 インターナライズするレセプターまたはマーカーは、外部細胞表面上に存在す
る分子であり、それは、抗体または結合タンパク質により特異的に結合される場
合、その抗体または結合タンパク質の細胞へのインターナライゼーションを生じ
る。インターナライズするレセプターまたはマーカーは、レセプター（例えば、
ホルモン、サイトカインまたは成長因子レセプター）リガンド、およびそれに対
する結合がインターナリゼーションを生じるその他の細胞表面マーカーを含む。
【００５２】 用語「異種核酸」は、それが見出される細胞に自然ではないか、またはその究
極の起源が「異種核酸」が現在見出される細胞または細胞株ではない、核酸をい
う。
【００５３】 イディオタイプは、抗体の高度に可変的な抗原結合部位を表し、そしてそれ自
身免疫原性である。抗体媒介免疫応答の生成の間、個体は、抗原に対する抗体、
および抗イディオタイプ抗体を発達させ、その免疫原性結合部位（イディオタイ
プ）は抗原を模倣する。抗イディオタイプ抗体はまた、抗体またはそのフラグメ
ントを用いた免疫化により生成され得る。
【００５４】 「ファージディスプレイライブラリー」は、ファージ（例えば糸状ファージ）
のコレクションをいい、ここでファージが外部（代表的には異種）タンパク質を
発現する。外部タンパク質は、ファージが接触されるその他の部分と自由に相互
作用する（結合する）。外部タンパク質をディスプレイする各ファージは、この
ファージディスプレイライブラリーの「メンバー」である。
【００５５】 用語「糸状ファージ」は、その表面上に異種ポリペプチドをディスプレイし得
るウイルス粒子をいう。当業者は、種々のバクテリオファージが、本発明で採用
され得ることを認識し得るが、好適な実施態様では、ベクターは、例えば、ｆ１
、ｆｄ、Ｐｆ１、Ｍ１３などのような糸状バクテリオファージであるか、または
それに由来する。この糸状ファージは、テトラサイクリンのような選択マーカー
を含み得る（例えば「ｆｄ−ｔｅｔ」）。種々の糸状ファージディスプレイ系が
当業者に周知である（例えば、Ｚａｃｈｅｒら（１９８０）Ｇｅｎｅ ９：１２
７〜１４０、Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５〜１
３１７（１９８５）；およびＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ（１９８８）Ｇｅ
ｎｅ ７３：３０５〜３１８を参照のこと）。
【００５６】 「ウイルスパッケージングシグナル」は、ウイルスキャプシド中への核酸の取
り込みを指向するに必要かつ十分な核酸配列である。
【００５７】 アセンブリ細胞は、その中で核酸がウイルス外被タンパク質（キャプシド）中
にパッケージングされ得る細胞である。アセンブリ細胞は、１つ以上の異なるウ
イルス粒子（例えば、通常または衰弱ファージおよびヘルパーファージ）で感染
され得、このウイルス粒子は個々にまたは組み合わせて核酸のウイルスキャプシ
ド中へのパッケージングを指向させる。
【００５８】 以下の略号が本明細書で用いられる：ＡＭＰ、アンピシリン；ｃ−ｅｒｂＢ−
２ ＥＣＤ、ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメイン；ＣＤＲ、相補性決定領域；Ｅ
ＬＩＳＡ、酵素連結免疫吸着アッセイ；ＦＡＣＳ、蛍光活性化細胞ソーター；Ｆ
Ｒ、フレームワーク領域；Ｇｌｕ、グルコース；ＨＢＳ、ヘペス緩衝化生理食塩
水、１０ｍＭ ヘペス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；ＩＭＡＣ、固定化
金属アフィニティークロマトグラフィー；ｋon、会合速度定数；ｋoff、解離速
度定数；ＭＰＢＳ、ＰＢＳ中のスキムミルク粉末；ＭＴＰＢＳ、ＴＰＢＳ中のス
キムミルク粉末；ＰＢＳ，リン酸緩衝化生理食塩水、２５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、
１２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＵ、共
鳴単位；ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ、単一鎖Ｆｖフラグメント；ＴＰＢＳ、ＰＢＳ
中０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０；ＳＰＲ、表面プラズモン共鳴；Ｖｋ、免
疫グロブリンκ軽鎖可変領域；Ｖλ、免疫グロブリンλ軽鎖可変領域；ＶL、免
疫グロブリン軽鎖可変領域；ＶH、免疫グロブリン重鎖可変領域；ｗｔ、野生型
。
【００５９】 （詳細な説明） （Ｉ．序論） 本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕオンコジーンのｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質産物
の細胞外ドメインに特異的に結合する新規ヒト抗体を提供する。このｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２マーカーは、乳癌およびその他の腺腫の３０〜５０％で過剰発現し、そし
てそれ故、癌のような腫瘍細胞を特異的に標的する有用な細胞表面マーカーを提
供する。先に知られた抗ｃｅｒｂＢ−２抗体とは対照的に、本発明の抗体（本明
細書ではＦ５またはＣ１抗体と呼ばれる）は、完全にヒト抗体である。従って、
これらの抗体のヒト宿主への投与は、免疫原性応答をほとんど惹起しないか全く
惹起しない。
【００６０】 さらに、本発明のＦ５およびＣ１抗体は、細胞中に迅速にインターナライズす
る。従って、これらは、標的細胞中にエフェクター部分を送達するために非常に
有用である。さらに、インターナライズする抗体またはポリペプチドが一旦同定
されると、それを用いて、先に知られたインターナライズする細胞標的（例えば
レセプター）を同定するために、１つ以上の細胞または細胞株を再プローブし得
る。
【００６１】 その他のｃ−ｅｒｂＢ−結合抗体はインターナライズされないことが知られて
いる。従って、特定の理論に拘束されることなく、本発明のＦ５およびＣ１抗体
の効果的なインターナリゼーションが、これらの抗体に結合される特異的なエピ
トープの結果であると考えられる。Ｆ５およびＣ１抗体の両方が同じエピトープ
を結合し、そして本明細書で同定されたこのＦ５およびＣ１抗体（例えば、配列
番号１および２）を用いて、同じエピトープに結合する他の抗体が容易に同定さ
れ得ると考えられる。従って、１つの好適な実施態様において、本発明は、Ｆ５
またはＣ１により結合される、ｃ−ｅｒｂＢ２レセプターエピトープに特異的に
結合する抗体を提供する。この型の特に好適な抗体は、インナーナライズする抗
体である。
【００６２】 ｃ−ｅｒｂＢ２レセプターを発現する細胞を高度に特異的に標的すること、お
よび結合分子の効果的なインターナリゼーションのため、本発明のＣ１およびＦ
５抗体は、標的細胞（例えば癌細胞）へのまたはその中にエフェクター分子を送
達するために良く適している。従って、別の好適な実施態様では、本発明は、エ
フェクター分子に結合した、Ｆ５またはＣ１抗体（すなわちＦ５またはＣ１によ
り結合されるエピトープに結合する抗体）を含むキメラ分子をさらに提供する。
このＦ５またはＣ１抗体は、ｃ−ｅｒｂＢ−２マーカーを保持する細胞にこのキ
メラ分子を特異的に結合するために供される標的する分子として作用し、それに
よってこの標的細胞にエフェクター分子を送達する。
【００６３】 エフェクターは、標的細胞（例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現する腫瘍）
に送達されることが所望される分子または多分子構造（例えば、リポソーム、フ
ァージ外被（キャプシド）、またはインタクトファージ）である。好適なエフェ
クターは、特徴的な活性（例えば、薬物送達、細胞傷害性、蛍光、放射活性など
）を有する。エフェクター分子は、サイトトキシン、標識、放射核種、リガンド
、抗体、薬物、核酸、ホルモン、成長因子、リポソーム、およびウイルスをｃ−
ｅｒｂＢ−２発現細胞に感染し得るようにするウイルス外被タンパク質を含むが
これらに限定されない。標的に一旦送達されると、このエフェクター分子は、そ
の特徴的活性を奏する。
【００６４】 例えば、１つの実施態様では、このエフェクター分子がサイトトキシンである
場合、このキメラ分子は、このサイトトキシンが、ｃ−ｅｒｂＢ−２マーカーを
保有する腫瘍細胞を特異的に標的とする、強力な細胞殺傷性薬剤として作用する
。腫瘍細胞を特異的に標的とするキメラサイトトキシンは当業者に周知である（
例えば、Ｐａｓｔａｎら（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１
：３３１〜３５４０参照のこと）。
【００６５】 別の実施態様では、このキメラ分子は、インビボまたはインビトロで腫瘍細胞
の存在または不在を検出するため、またはインビボで腫瘍細胞を位置決めするた
めに用いられ得る。これらの方法は、検出可能な標識である、エフェクター分子
を含むキメラ分子を提供する工程を含む。Ｃ１またはＦ５抗体は、このキメラ分
子を、ｃ−ｅｒｂＢ−２マーカーを発現する腫瘍細胞に特異的に結合させ、次い
でこれらは、検出可能な標識とのそれらの結合によりマークされる。細胞結合標
識の次の検出は、腫瘍細胞の存在および／または塊および／または位置を示す。
【００６６】 なお別の実施態様では、エフェクター分子は、抗体、抗原結合ドメイン、成長
因子、またはリガンドを含むがこれらに限定されない別の特異的結合部分であり
得る。次いでこのキメラ分子は、高度に特異的な二官能性リンカーとして作用す
る。このリンカーは、キメラタンパク質が結合する細胞または細胞成分を結合し
、そしてその間の相互作用を増大するように作用し得る。従って、例えば、「エ
フェクター」成分が、抗レセプター抗体または抗体フラグメントである場合、Ｃ
６抗体成分は、ｃ−ｅｒｂＢ−２保有癌細胞を特異的に結合し、その一方、エフ
ェクター成分は、免疫細胞の表面上のレセプター（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４
、ＦｃＩ、ＦｃＩＩおよびＦｃＩＩＩレセプター）を結合する。従って、このキ
メラ分子は、標的癌細胞に向かう免疫応答を増大および指向するために作用し得
る。
【００６７】 なおさらに別の実施態様において、エフェクター分子は薬理学的因子（例えば
、薬物）であり得る。それゆえ、Ｃ１またはＦ５抗体は、ビンブラスチン、ビン
デシン、メルファラン、Ｎ−アセチルメルファン、メトトレキサート、アミノプ
テリン、ドキソルビシン（ｄｏｘｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン、ゲニス
テイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）（チロシンキナーゼインヒビター）、アンチセン
ス分子および当業者に公知の他の薬理学的因子のような薬剤に結合され、それに
よってｃ−ｅｒｂＢ−２を発現する腫瘍細胞に対してこれらの薬理学的因子を特
異的に標的させ得る。
【００６８】 あるいは、Ｆ５またはＣ１抗体は治療用組成物を含有するビヒクルに結合され
得る。このようなビヒクルには、リポソーム、ミセル、種々の合成ビーズなどが
挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】 本発明のキメラ分子は必要に応じて、単一のエフェクターに結合した複数の標
的化する部分（Ｆ５および／またはＣ１抗体）、または反対に、単一の標的化す
る部分に結合した複数のエフェクター分子を含むことを、当業者は理解する。な
お他の実施態様において、このキメラ分子は、複数の標的化する部分および複数
のエフェクター分子の両方を含有する。それゆえ、例えば、本発明は、Ｆ５また
はＣ１抗体が細胞傷害性分子に結合されると同時に、別の分子（例えば、抗体ま
たは別のリガンド）がその毒素の他の末端に結合されている、「二重標的化した
」細胞傷害性キメラ分子を提供する。このような二重標的化サイトトキシンは、
例えば、ＰＥのアミノ末端で、ドメインＩａを置換したＦ５またはＣ１抗体およ
びドメインＩＩＩに挿入された抗−ＴＡＣ（Ｆｖ）を包含し得る。他の抗体もま
た、適切なエフェクター分子であり得る。
【００７０】 上記のように、本発明の好ましいＦ５およびＣ１抗体は、インターナライズす
る抗体である。しばしば、このようなインターナライズする抗体は、エフェクタ
ー分子の存在を伴わない場合でさえ生物学的活性を有する。多くのレセプター（
例えば、増殖因子レセプター）は、リガンドの効果を調整または調節する方法と
してインターナリゼーションを使用する。例えば、リガンド結合は、シグナル伝
達およびレセプターインターナリゼーションを生じ得る。次いで、レセプター数
の減少は、さらなるリガンドの効果のダウンレギュレーションを引き起こす。同
一のことが、増殖因子レセプターに結合する抗体で生じる（Ｈｕｒｗｉｔｚら（
１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：３３５３−
３３５７）。例えば、「増殖因子は、それらの細胞表面レセプターに結合してそ
れらの固有の触媒活性を活性化し、それによって細胞応答を導くシグナル伝達カ
スケードを開始することによって作用する。増殖因子／レセプター複合体は、細
胞表面膜の静的常在因子（ｓｔａｔｉｃ ｒｅｓｉｄｅｎｔ）ではないが、イン
ターナリゼーションのエンドサイトーシス的輸送プロセス、および再利用または
分解への選別をうける。結果として、増殖因子は細胞外培地から枯渇され、そし
てそれらのレセプターはダウンレギュレーションをうける。これらの輸送プロセ
スは、シグナル伝達増殖因子／レセプター複合体の動力学に対するそれらの影響
のために、細胞の挙動応答の重要なモジュレーターである（Ｒｅｄｄｙら（１９
９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６９６−１６９９）。
【００７１】 ＥｒｂＢ２系において、ＥｒｂＢ２結合抗体が増殖を阻害する１つのメカニズ
ムは、レセプターインターナリゼーションおよびダウンレギュレーションを引き
起こすことである（Ｈｕｒｗｉｔｚら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：３３５３−３３５７）。増殖因子レセプターに結合
するインターナライズする抗体を、増殖インヒビターまたは刺激抗体にすること
もまた可能であり得る。例えば、ＥＧＦのマイトジェン特性は、ＥＧＦのＥＧＦ
レセプターに対する親和性を低下させることによって増加した。より低い親和性
のＥＧＦはレセプターシグナル伝達を引き起こすが、これは野生型ＥＧＦよりも
インターナリゼーションが減少しており、そしてダウンレギュレーションされて
いる（おそらく、そのより低い親和性による）（Ｒｅｄｄｙら（１９９６）Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６９６−１６９９）。それゆえ、Ｃ１また
はＦ５インターナライズする抗体の親和性を低下することによって、それを増殖
因子にし得る。本発明のＦ５およびＣ１インターナライズする抗体は、増殖阻害
および増殖刺激の両方に対するリード化合物／薬物を提供し得る。
【００７２】 （ＩＩ． Ｆ５およびＣ１抗体の調製／合成） 本明細書中に提供される配列情報を使用すれば、明らかに列挙されたＦ５およ
びＣ１抗体は、デノボ化学合成または組換えＤＮＡ発現技術のいずれかにより慣
用的に作製され得る。同様に、本発明の方法に従って同定された改変型Ｆ５およ
びＣ１抗体ならびに本発明のキメラ分子は、デノボ合成され得るか、または組換
え的に発現され得る（特に、キメラ分子が融合タンパク質である場合）。
【００７３】 （Ａ． 化学合成） 本発明のＦ５およびＣ１抗体は、周知のペプチド合成方法を使用して化学的に
合成され得る。配列のＣ−末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、続いて配列
中の残りのアミノ酸が連続的に添加される固相合成は、Ｃ１およびＦ５抗体の化
学合成のための１つの好ましい方法である。固相合成についての技術は、Ｂａｒ
ａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４頁、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第Ａ部、Ｍｅｒｒｉ
ｆｉｅｌｄら（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２
１５６、およびＳｔｅｗａｒｔら（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌにより記載される。
【００７４】 代表的に、Ｆ５およびＣ１抗体は、自動ペプチド合成機（例えば、Ｅｐｐｅｎ
ｄｏｒｆ Ｓｙｎｏｓｔａｔ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）またはＭｉｌｌｉｇ
ｅｎ９０５０（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ））を使用して化学的に合成されるが
、組成ペプチド合成の手動方法もまた使用され得る。１つの実施態様において、
合成は、米国特許第５，５４７，９３９号に記載されるように、ポリエチレング
リコールポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）グラフト樹脂上であり、そしてＮα−Ｆ
ｍｏｃアミノ酸誘導体を使用する。他の樹脂および合成化学（例えば、Ｔ−ｂｏ
ｃ）が使用され得る。
【００７５】 （Ｂ． 組換え発現） 好ましい実施態様において、本発明のＦ５またはＣ１抗体は、本明細書中に提
供されるポリペプチドおよび核酸配列と組み合わせて、当業者に周知の標準的技
術を使用して調製される。このポリペプチド配列は、本明細書により開示される
特定のＦ５またはＣ１抗体をコードする適切な核酸配列を決定するために使用さ
れ得る。この核酸配列は、当業者に周知の標準的方法に従って種々の発現系に対
する特定のコドン「優先性」を反映するために最適化され得る。あるいは、本明
細書中に提供されるこの核酸配列はまた、Ｆ５またはＣ１抗体を発現するために
使用される。
【００７６】 提供された配列情報を使用して、この核酸は、当業者に公知の多数の標準的方
法に従って合成され得る。オリゴヌクレオチド合成は、好ましくは、市販の固相
オリゴヌクレオチド合成機（Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（１９
８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８）で行
なわれるか、またはＢｅａｕｃａｇｅらにより記載される固相ホスホルアミダイ
トトリエステル法（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２）を使用して手作業で合成され
る。
【００７７】 Ｆ５またはＣ１抗体をコードする核酸が一旦合成されると、この核酸は標準的
な方法に従って増幅され得、そして／またはクローニングされ得る。これらの目
的を達成するための分子クローニング技術は当該分野において公知である。例え
ば、Ｆ５またはＣ１抗体遺伝子をコードする、組換え核酸の構築に適切である広
範な種々のクローニングおよびインビトロ増幅方法は、当業者に公知である。こ
れらの技術の例示、および多数のクローニング実験を通して当業者を導くに充分
な説明は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５２巻Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第
２版）第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁事業
）（１９９４補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見出される。組換えイムノグロブリン
を産生する方法もまた、当該分野において公知である。Ｃａｂｉｌｌｙ，米国特
許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３を参照のこと。
【００７８】 インビトロ増幅方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（
ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカ−ゼ増幅および他のＲＮＡ媒介技術を含む）を介して
当業者を導くに十分な技術の例示は、Ｂｅｒｇｅｒ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡ
ｕｓｅｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２
０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａ
ｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ３６−４７
；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３，
８１−９４；Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６，１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ ３５，１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７−１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８，２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ
，（１９８９）Ｇｅｎｅ ４，５６０；ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９
０）Ｇｅｎｅ ８９，１１７に見出される。インビトロでの増幅された核酸の改
良されたクローニング方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３
９号に記載される。
【００７９】 Ｆ５またはＣ１抗体に対する核酸が、一旦単離されそしてクローニングされる
と、当業者に公知の種々の組換え操作された細胞において、遺伝子を発現し得る
。このような細胞の例には、細菌、酵母、糸状菌、昆虫（特にバキュロウィルス
ベクターを使用する）、および哺乳動物細胞が挙げられる。当業者は、Ｆ５また
はＣ１抗体の発現に利用可能である多数の発現系における知識があることが期待
される。
【００８０】 簡単に要約すると、Ｆ５またはＣ１抗体をコードする天然または合成核酸の発
現は、代表的には、抗体をコードする核酸をプロモーター（これは構成性または
誘導性のいずれかである）に作動可能に連結し、そしてこの構築物を発現ベクタ
ーに組み込むことによって達成される。このベクターは原核生物、真核生物、ま
たはその両方での複製および／または組み込みに適切であり得る。代表的なクロ
ーニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列ならびにＦ５ま
たはＣ１抗体をコードする核酸の発現の調節に有用であるプロモーターを含む。
このベクターは、必要に応じて、少なくとも１つの独立ターミネーター配列を含
む遺伝子発現カセット、真核生物および原核生物の両方でこのカセットの複製を
可能にする配列（すなわち、シャトルベクター）ならびに原核生物系および真核
生物系の両方に対する選択マーカーを含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前述を参照のこ
と。
【００８１】 クローニングした核酸の高レベルの発現を得るために、代表的には、転写を指
示する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写
／翻訳ターミネーターを含む発現プラスミドを構築することが一般的である。Ｅ
．ｃｏｌｉでのこの目的に適切な調節領域の例示は、Ｙａｎｏｆｓｋｙ（１９８
４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４により記載される
Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター領域
、ならびにＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚおよびＨａｇｅｎ（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ
．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３９９−４４５により記載されるファージラムダ（ＰL
）の左側のプロモーターである。Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換されるＤＮＡベクタ
ーに選択マーカーを含ませることもまた、有用である。このようなマーカーの例
示としては、アンピシリン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコールに
対して耐性を示す遺伝子が挙げられる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでの使用のための
選択マーカーに関する詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。
【００８２】 Ｆ５またはＣ１抗体を発現するための発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ種（Ｐａｌｖａら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５；Ｍｏｓｂ
ａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ，３０２：５４３−５４５）ならびにＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａを用いて利用可能である。Ｅ．ｃｏｌｉ系が好ましい。
【００８３】 原核生物細胞により産生されるＦ５またはＣ１抗体は、適切な折り畳みのため
のカオトロピック薬剤に曝すことを必要とし得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからの
精製の間に、発現されたタンパク質は、必要に応じて変性され、次いで再生され
る。このことは、例えば、細菌系により産生された抗体を、例えば、グアニジン
ＨＣｌのようなカオトロピック薬剤中に可溶化することにより達成される。次い
で、この抗体を、ゆっくりと透析するか、またはゲルろ過を行うかのいずれかに
よって再生する。米国特許第４，５１１，５０３号を参照のこと。
【００８４】 哺乳動物細胞に遺伝子をトランスフェクションし、そして発現する方法は、当
該分野において公知である。細胞の核酸での形質導入は、例えば、Ｆ５またはＣ
１核酸を含有するウィルス性ベクターを、このベクターの宿主範囲内の細胞と共
にインキュベートする工程を包含する。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編）（１９９０）またはＭ．Ｋ
ｒｉｅｇｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９０）ならびにそれらに引用される参考文献を参
照のこと。
【００８５】 本発明において使用される細胞の培養物（細胞株および組織または血液サンプ
ル由来の培養細胞を含む）は、当該分野において周知である。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ
（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９９４））およびその中に引用される参考文献は、細胞の培養に対
する一般的な指針を提供する。
【００８６】 抗体を使用し、そして操作する技術は、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒ
ｅｅｎｅ，ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡおよびその中に援用され
る参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびにＫｏｈｌｅｒ ａｎ
ｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７に見
出される。
【００８７】 １つの好ましい実施態様において、Ｆ５またはＣ１抗体遺伝子は、発現ベクタ
ー、例えば、ｐＵＣ１１９Ｓｆｉ／ＮｏｔＨｉｓｍｙｃ（Ｓｃｈｉｅｒら（１９
９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１：６３−７１）にサブクローニン
グされる。このことによって、ｓｃＦｖのＣ−末端にヘキサヒスチジンタグの付
加が生じる。Ｆ５またはＣ１ ｓｃＦｖ ＤＮＡを含有するｐＨＥＮ−１ベクタ
ーＤＮＡは、アルカリ溶解ミニプレプ法により調製され、ＮｃｏＩおよびＮｏｔ
Ｉで消化され、そしてｓｃＦｖ ＤＮＡが１．５％アガロースゲル上で精製され
る。Ｆ５またはＣ１ ｓｃＦｖ ＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化した
ｐＵＣ１１９Ｓｆｉｌ／ＮｏｔｌＨｉｓｍｙｃに連結し、そして連結混合物をエ
レクトロコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ２１５１を形質転換するために使用した。発現に関しては、１００：ｇ／ｍ
ｌアンピシリンおよび０．１％グルコースを含有する２００ｍｌの２×ＴＹ培地
に、ｐＵＣ１１９Ｓｆｉ１／ＮｏｔｌＨｉｓｍｙｃ中にＦ５またはＣ１遺伝子を
保有するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１を接種した。この培養物を３７℃で０．８
のＡ600ｎｍまで増殖させる。可溶性ｓｃＦｖは、１ｍＭの終濃度までＩＰＴＧ
を添加することにより発現誘導し、そしてこの培養物をシェーカーフラスコ中で
一晩３０℃で増殖させる。
【００８８】 次いで、Ｆ５抗体またはＣ１抗体は、以下のプロトコールを使用して、ペリプ
ラズムから収集され得る：細胞を、４０００ｇにて１５分間遠心分離することに
よって収集し、１０ｍｌの氷冷した３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％スクロース中に最懸濁し、そして氷上で２０分間イ
ンキュベートした。次いで、細菌を６０００ｇにて１５分間遠心分離することに
よってペレット化し、そして「ペリプラズム画分」を、３０，０００ｇにて２０
分間遠心分離することによって清澄化した。次いで、上清を、４℃にて一晩、８
ＬのＩＭＡＣローディング緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、
５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に対して透析し、次いで、０．
２ミクロンのフィルターを通して濾過した。
【００８９】 好ましい実施態様において、このＦ５および／またはＣ１ ｓｃＦｖは、ＩＭ
ＡＣによって精製される。すべての工程は、好ましくは４℃にて実施される。２
ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を含むカラムを２０ｍｌのＩＭＡＣカ
ラム洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２５０ｍＭイミダゾール）および２０ｍｌのＩＭＡＣローディング緩衝液
を用いて洗浄した。次いで、ペリプラズム調製物をこのカラム上にロードし、そ
してこのカラムを連続的に、５０ｍｌのＩＭＡＣローディング緩衝液、および５
０ｍｌのＩＭＡＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５０
０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール）を用いて洗浄した。タンパク質を２
５ｍｌのＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール）を用いて溶出し、そして４ｍｌの
画分を収集した。Ｆ５およびＣ１抗体は、２８０ｎｍでの吸光度によって検出さ
れ得、そしてｓｃＦｖ画分が溶出され得る。二量体ｓｃＦｖおよび凝集したｓｃ
Ｆｖを取り除くために、サンプルをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０（Ａｍｉｃｏｎ）
中で１ｍｌ未満の容量に濃縮し得、そしてＨＢＳの泳動緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅ
ｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ
７５カラム上で分画し得る。
【００９０】 最終調製物の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって１アリコートをアッセイする
ことによって評価され得る。タンパク質のバンドは、クマシー染色によって検出
され得る。次いで、濃度は、分光光度的に、１．０のＡ280が０．７ｍｇ／ｍｌ
のｓｃＦｖ濃度に対応すると仮定して、測定され得る。
【００９１】 （ＩＩＩ．改変されたＦ５およびＣ１抗体の改変および／または選択） 好ましい実施態様において、新たな（異なる）Ｆ５またはＣ１抗体の産生は、
抗体（例えば、抗体全体、抗体フラグメント、または単鎖抗体）を産生する工程
、次いで、それがＦ５またはＣ１抗体であること（すなわち、それがＦ５または
Ｃ１抗体によって結合されるエピトープと結合すること、およびより好ましくは
それがインターナライズされること）を確認するためにその抗体をスクリーニン
グする工程を包含する。スクリーニングされる抗体は、種々の手段によって無作
為に産生され得、インビボで（例えば、ｃ−ｅｒｂＢ２エピトープで動物を免疫
化することによって）作製され得るか、またはエキソビボで、例えば、ファージ
ディスプレイライブラリーもしくは他のディスプレイライブラリーにおいて作製
され得る。次いで、そのように作製された抗体は、ｃ−ｅｒｂＢ２結合親和性に
ついて、および／またはＦ５もしくはＣ１エピトープへの特異的結合について、
および／またはｃ−ｅｒｂＢ２レセプターもしくはそのフラグメントを保有する
細胞内へのインターナリゼーションについて、スクリーニングされる。
【００９２】 （Ａ）スクリーニングのためのＦ５誘導抗体およびＣ１誘導抗体の産生） 代替的に、Ｆ５およびＣ１誘導抗体は、本明細書中に提供されるＦ５配列およ
びＣ１配列を利用するいくつかのストラテジーのうちの１つによって、好ましく
は獲得される。このような方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：１）鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）による誘導
；２）ＣＤＲの部位特異的突然変異誘発による誘導；３）誤りがちなＰＣＲ、Ｅ
．ｃｏｌｉの突然変異誘発株、または「ＤＮＡシャッフリング」のいずれかによ
る、配列内に複数の突然変異を導入することによる誘導。これらの誘導抗体は、
「ライブラリーアプローチ」を含む。ここでは、Ｆ５またはＣ１に基づく変異配
列のライブラリーが作製され、次いで、結合機能が選択される。
【００９３】 （１）ファージ（ｐａｇｅ）ディスプレイライブラリーの産生） 細菌に感染するウイルス（バクテリオファージまたはファージ）の表面上で抗
体フラグメントを発現する能力は、１０10の非結合クローンよりも大きなライブ
ラリーから、単一の結合抗体フラグメントを単離することを可能にする。ファー
ジの表面上で抗体フラグメントを発現させるために（ファージディスプレイ）、
ファージ表面タンパク質（ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子の中に抗体フラグメン
トの遺伝子を挿入し、そして抗体フラグメント−ｐＩＩＩ融合タンパク質を、フ
ァージ表面上で提示させる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３４８：５５２−５５４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）。ファージ表面
上の抗体フラグメントは機能的であるので、抗原結合抗体フラグメントを保有す
るファージは、抗原アフィニティクロマトグラフィーによって非結合ファージか
ら分離され得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８
：５５２−５５４）。抗体フラグメントの親和性に依存して、２０倍〜１，００
０，０００倍の濃縮係数が、単回のアフィニティ選択によって得られる。しかし
、溶出されたファージで細菌を感染させることによって、より多くのファージが
増殖され得、そして別の回の選別に供され得る。この様式において、１回におい
て１０００倍濃縮されることは、２回の選択で１，０００，０００倍になり得る
（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５
４）。従って、濃縮率が低い場合でさえ（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）、複数回のアフィニティー選択が、
稀なファージの単離へと導き得る。抗原に対するファージ抗体ライブラリーの選
択は濃縮を生じるので、大部分のクローンは、４回の選択の後に抗原に結合する
。従って、比較的少数の（数百の）クローンのみが、抗原への結合について分析
されることを必要とする。特定の好ましい実施態様において、多価のファージデ
ィスプレイ系が、実施例において示されるように好ましいということが注目され
る。
【００９４】 好ましい実施態様において、結合についての分析は、抗体フラグメント遺伝子
と遺伝子ＩＩＩとの間にアンバーコドンを含ませることによって単純化される。
このアンバーコドンは、単に宿主細菌株を変換することによって、提示された抗
体フラグメントと可溶性の（ネイティブの）抗体フラグメントとの間を容易に切
り替えることを可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）。
【００９５】 ヒト抗体は、ファージ上で非常に大きくかつ多様性のＶ遺伝子レパートリーを
提示することによって、事前の免疫なしで作製され得る（Ｍａｒｋｓら、（１９
９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）。１つの実施態様に
おいて、ヒト末梢血リンパ球中に存在する天然のＶHレパートリーおよびＶLレパ
ートリーが、ＰＣＲによって非免疫化されたドナーから単離された。Ｖ遺伝子レ
パートリーは、ＰＣＲを使用することによって一緒に無作為にスプライスされて
、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーが作製された。これを、ファージベクター中にク
ローニングして３０００万のファージ抗体（同上）のライブラリーを作製した。
この単一の「未処理の」ファージ抗体ライブラリーから、１７より多くの異なる
抗原（ハプテン、ポリサッカリド、およびタンパク質を含む）に対して、結合抗
体フラグメントが単離されている（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓら、（１９９３）、Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：７７９−７８３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、（１９９
３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）
、Ｎａｔｕｒｅ．３５２：６２４−６２８）。抗体は、自己タンパク質（ヒトサ
イログロブリン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子、およびＣＥＡ（Ｇｒｉｆｆｉ
ｔｈｓら、（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４）を含む）に対し
て作製されている。インタクトな細胞上で直接的に選択することによって、細胞
表面抗原に対する抗体を単離することもまた可能である。例えば、４つの異なる
赤血球細胞表面抗原に対する抗体フラグメントは、赤血球上で直接的に選択する
ことによって、作製された（Ｍａｒｋｓら、（１９９３）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ．１０：７７９−７８３）。抗体は、５，０００部位／細胞ほどに低
い表面密度で、血液型抗原に対して作製された。抗体フラグメントは、選択に使
用される抗原に対して高度に特異的であり、そして凝集アッセイおよび免疫蛍光
アッセイにおいて機能的であった。より低い密度の抗原に対する抗体は、最初に
、目的の抗原を欠損した高度に関連のある細胞型に対してファージ抗体ライブラ
リーを選択することによって作製された。このネガティブ選択は、より高密度の
抗原に対する結合体を除去した。そして目的の抗原を発現する細胞上での枯渇し
たファージ抗体ライブラリーの引き続く選択が、この抗原に対する抗体の単離を
生じた。この大きさおよび多様性のライブラリーを用いて、いくつかの結合体に
対して少なくとも１つが、この時点のタンパク質抗原の７０％に対して単離され
得る。抗体フラグメントは、選択のために用いられる抗原に対して高度に特異的
であり、そして１：Ｍ〜１００ｎＭの範囲の親和性を有する（Ｍａｒｋｓら、（
１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ
ｓら、（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４）。より大きなファー
ジ抗体ライブラリーは、より高い割合の抗原に対してより高い結合親和性の、よ
り多くの抗体の単離を生じる。
【００９６】 適切な大きなファージディスプレイ抗体ライブラリーの作製は、本明細書中に
提供される実施例において、詳細に記載される。
【００９７】 （２）ファージディスプレイは、抗体親和性を増大させるために使用され得
る） より親和性の高い抗体を作製するために、結合Ｆ５抗体または結合Ｃ１抗体の
配列に基づいて（例えば、本明細書中に記載されるｓｃＦｖ Ｆ５抗体またはｓ
ｃＦｖ Ｃ１抗体に基づいて）、変異抗体遺伝子レパートリーを作製し、そして
ファージ表面上で発現する。より親和性の高いｓｃＦｖは、上記、実施例、およ
びＳｃｈｉｅｒら（１９９６）ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３：５５１−５６
７に記載のように、抗原に対して選択される。
【００９８】 より親和性の高いｓｃＦｖは、上記のように、抗原に対するアフィニティクロ
マトグラフィーによって選択される。変異ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを作製す
るための１つのアプローチは、新たなパートナーを作製するために、Ｖ遺伝子の
レパートリーで本来のＶH遺伝子またはＶL遺伝子を置換えることであった（鎖シ
ャッフリング）（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６
２４−６２８）。鎖シャッフリングおよびファージディスプレイを使用すること
によって、ハプテンフェニルオキサゾロン（ｐｈＯｘ）に結合するヒトｓｃＦｖ
抗体フラグメントの親和性は、３００ｎＭから１ｎＭへ（３００倍）増大した（
Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７
８３）。
【００９９】 従って、例えば、Ｆ５またはＣ１抗体の親和性を変更するために、Ｆ５または
Ｃ１のＶH遺伝子、およびヒトＶH遺伝子レパートリーを含有する変異ｓｃＦｖ遺
伝子レパートリーが作製され得る（軽鎖シャッフリング）。ｓｃＦｖ遺伝子レパ
ートリーは、ファージディスプレイベクターｐＨＥＮ−１中にクローニングされ
得（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．、１９：４１３３−４１３７）、そして形質転換後に形質転換体のライブラリ
ーが得られる。ファージは、実施例に記載のように調製されそして濃縮される。
【０１００】 同様に、重鎖シャッフリングについて、Ｆ５もしくはＣ１のＶHＣＤＲ１およ
び／またはＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３、ならびに軽鎖がヒトＶH遺伝子
レパートリーを含有するベクター中にクローニングされて、ファージ抗体ライブ
ラリー形質転換体が作製される。抗体親和性を増大させるための鎖シャッフリン
グの詳細な記載については、Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２５５：２８−４３、１９９６を参照のこと。
【０１０１】 Ｃ１およびＦ５選択は、溶液中で、ビオチン化されたｃ−ｅｒｂＢ−２と共に
ファージをインキュベートすることによって実施され得る。抗原濃度は、各回で
低減され、選択の最終回までに所望のＫd未満の濃度が達成される。このことは
、親和性に基づいたファージの選択を生じる（Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６）。
【０１０２】 （３）結合親和性を改善するための部位特異的突然変異誘発） 抗原接触アミノ酸側鎖の大部分は、相補鎖決定領域（ＣＤＲ）に局在化され、
３つはＶH（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）にあり、そして３つはＶL（
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）にある（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８
６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７５５−８；Ｎｈａｎら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．、２１７：１３３−１５１）。これらの残基は、抗原に対する抗体
親和性を担う結合エネルギーの大部分に寄与する。他の分子において、リガンド
と接触するアミノ酸を変異させることは、１つのタンパク質分子のその結合パー
トナーに対する親和性を増大させる有効な手段であることが示されている（Ｌｏ
ｗｍａｎら（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３４：５６４−５７８；
Ｗｅｌｌｓ（１９９０）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：８５０９−８５１
６）。ＣＤＲの部位特異的突然変異誘発およびｃ−ｅｒｂＢ−２に対するスクリ
ーニングを使用して、結合親和性ならびに／またはＦ５およびＣ１抗体のインタ
ーナリゼーションを改善されたＣ６抗体を作製し得る。
【０１０３】 （４）より親和性の高いヒトｓｃＦｖを作製するためのＣＤＲの無作為化） 単純な部位特異的突然変異誘発の拡大において、部分的にかまたは完全にＣＤ
Ｒが無作為化された（ＶLのＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ならびにＶHのＣＤＲ１、
ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）変異抗体ライブラリーが作製され得る。１つの実施
態様において、各ＣＤＲは、鋳型としてＦ５またはＣ１を使用することによって
、個々のライブラリー中で無作為化される。各ＣＤＲライブラリー由来の最も親
和性の高い変異体のＣＤＲ配列を組合わせて、親和性の付加的な増大を獲得する
。類似のアプローチが使用されて、成長ホルモンレセプターに対するヒト成長ホ
ルモン（ｈＧＨ）の親和性は、３．４×１０-10から９．０×１０-13Ｍへと１５
００倍を超えて増大されている（Ｌｏｗｍａｎら、（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．、２３４：５６４−５７８）。
【０１０４】 ＶH ＣＤＲ３は結合ポケットの中心を占め、従ってこの領域における変異は
、親和性における増大を生じるようである（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９５）、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：３８２−３８６）。１つの実施態様においては、４つ
のＶH ＣＤＲ３残基が、ヌクレオチドＮＮＳを使用することによって一度に無
作為化される（例えば、Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）、Ｇｅｎｅ，１６９：１４
７−１５５；ＳｃｈｉｅｒおよびＭａｒｋｓ（１９９６）、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．７：９７−１０５、１９９６
；ならびにＳｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１
−５６７、１９９６を参照のこと）。
【０１０５】 ライブラリーを作製するために、Ｆ５またはＣ１のＶHフレームワーク３にア
ニールし、そしてＶH ＣＤＲ３およびフレームワーク４の一部分をコードする
オリゴヌクレオチドが合成される。無作為化されるべき４つの部分においては、
配列ＮＮＳが使用され、ここではＮ＝４つのヌクレオチドのうちのいずれかであ
り、そしてＳ＝ＣまたはＴである。このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲを使用し
てＦ５またはＣ１のＶH遺伝子を増幅するために使用され、変異Ｆ５ ＶH遺伝子
レパートリーまたは変異Ｃ１ ＶH遺伝子レパートリーを作製する。ＰＣＲを、
Ｃ６ＮＩＬ３−Ｂ１軽鎖遺伝子と共にＶH遺伝子レパートリーをスプライスする
ために使用し、そして得られるｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを、ファージディス
プレイベクターｐＨＥＮ−１中にクローニングした。連結されたベクターＤＮＡ
を使用して、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な
Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、１．０×１０7クローン（同上）を超えるファージ
抗体ライブラリーを作製する。
【０１０６】 より親和性の高い変異ｓｃＦｖを選択するために、ファージ抗体ライブラリー
の各回の選択を、上記のようにビオチン化したｃ−ｅｒｂＢ−２の量を低減して
行った。代表的には、選択の第３回目および第４回目由来の９６のクローンを、
９６ウェルプレート上でＥＬＩＳＡによって、ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する結合に
ついてスクリーニングする。２０〜４０個のＥＬＩＳＡ陽性クローン由来のｓｃ
Ｆｖを１０ｍｌの培養物中で発現させ、このペリプラズムを収集し、そしてｓｃ
ＦｖのｋoffをＢＩＡｃｏｒｅによって測定する。最も緩徐なｋoffを有するクロ
ーンを配列決定し、そして各々の特有のｓｃＦｖを、例えば、ｐＵＣ１１９ Ｓ
ｆ−ＮｏｔｍｙｃＨｉｓ中へサブクローニングする。ｓｃＦｖを１Ｌの培養物中
で発現させ、そして前出で記載したように精製する。精製されたｓｃＦｖの親和
性を、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定する。
【０１０７】 （５）ホモ二量体の作製） Ｆ５またはＣ１（ｓｃＦｖ’）2抗体を作製するために、２つのＦ５ ｓｃＦ
ｖまたは２つのＣ１ ｓｃＦｖを、リンカー（例えば、炭素リンカー、ペプチド
など）を通してか、または例えば、２つのシステイン間のジスルフィド結合を通
してかのいずれかで連結させる。従って、例えば、ジスルフィド連結したＦ５
ｓｃＦｖを作製するために、Ｆ５のカルボキシ末端にあるｍｙｃタグとヘキサヒ
スチジンタグとの間に部位特異的突然変異誘発によってシステイン残基が導入さ
れる。正確な配列の導入は、ＤＮＡ配列決定によって確認され得る。この構築物
がｐＵＣ１１９にある場合、ｐｅｌＢリーダーは、発現ｓｃＦｖをペリプラズム
へと指向させ、そしてクローニング部位（ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ）は、Ｆ５ま
たはＣ１変異ｓｃＦｖを導入するために存在する。発現ｓｃＦｖは、ＩＭＡＣに
よる精製を容易にするために、Ｃ−末端にｍｙｃタグ、続いて、２つのグリシン
、１つのシステイン、次いで６つのヒスチジンを有する。２つのシステイン残基
間のジスルフィド結合形成の後、２つのｓｃＦｖは、約２６アミノ酸（２つの１
１アミノ酸ｍｙｃタグおよび４つのグリシン）によって互いに分離される。
【０１０８】 ｓｃＦｖは、この構築物から発現され得、ＩＭＡＣによって精製され得、そし
てゲル濾過によって分析され得る。（ｓｃＦｖ’）2二量体を産生するために、
システインは、１ｍＭの∃−メルカプトエタノールとのインキュベーションによ
って還元され、そしてｓｃＦｖの半分がＤＴＮＢの添加によってブロックされる
。ブロックされたｓｃＦｖおよびブロックされていないｓｃＦｖは、一緒にイン
キュベートされて（ｓｃＦｖ’）2を形成し、そして得られた物質はゲル濾過に
よって分析され得る。Ｆ５およびＣ１ ｓｃＦｖ’単量体、ならびにＦ５および
Ｃ１（ｓｃＦｖ’）2二量体の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定する。
【０１０９】 特に好ましい実施態様において、（ｓｃＦｖ’）二量体は、リンカーを通して
，より好ましくはペプチドリンカーを通してｓｃＦｖ’フラグメントを連結する
ことによって作製される。これは、当業者に周知の広範な種々の手段によって達
成され得る。例えば、１つの好ましいアプローチは、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９
９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６
４４８によって記載される（ＷＯ ９４／１３８０４もまた参照のこと）。
【０１１０】 （Ｂ）Ｆ５抗体またはＣ１抗体の認識／選択） 上記のように、１つの実施態様において、本発明は、有効にインターナライズ
される２つの抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体を提供する。本明細書中でＦ５（配列番号
１）およびＣ１（配列番号２）として示されるこれらの抗体は、以前に認識され
ていなかったｃ−ｅｒｂＢ−２の外部ドメイン上のエピトープに特異的に結合し
、それによってこのエピトープを特徴付ける。提供される情報を使用することに
よって、同じエピトープに結合する他のＦ５およびＣ１抗体が、慣用的に調製さ
れ得る。
【０１１１】 新たなＣ１またはＦ５抗体を産生するために使用される方法（例えば、ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２を用いての動物の免疫化、単鎖抗体ライブラリー中でのドメインシャ
ッフリングなど）に関わりなく、この産生された抗体が好ましいＦ５抗体または
Ｃ１抗体であることを確認するために、推定Ｆ５およびＣ１抗体は、好ましくは
以下についてスクリーニングされる：１）ｃ−ｅｒｂＢ−２についての結合親和
性、および／または２）Ｆ５エピトープ／Ｃ１エピトープの特異的結合；ならび
に３）インターナリゼーション。
【０１１２】 （１）抗体／ポリペプチド結合親和性の測定） 上記に説明されたように、アビディティの増大についての選択は、標的抗原（
例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２）に対する抗体（例えば、改変されたＦ５またはＣ１
）の親和性を測定することを含む。そのような測定を作製する方法は、同時係属
中の出願ＵＳＳＮ ０８／６６５，２０２号において詳細に記載される。簡潔に
は、例えば、Ｆ５、Ｃ１、またはＦ５誘導抗体もしくはＣ１誘導抗体の、ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２への結合の動力学のＫdは、ＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴に
基づくバイオセンサー）で測定される。この技術について、抗原は、質量におけ
る変化を検出し得る誘導体化されたセンサーチップとカップリングされる。抗体
がセンサーチップを通過するときに、抗体は抗原と結合し、定量化され得る質量
変化を生じる。抗体濃度の関数としての会合速度の測定を使用して、会合速度定
数（ｋon）を計算し得る。会合相（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）の後
に、緩衝液をチップに通過させそして抗体の解離速度（ｋoff）が決定される。
ｋonは、代表的に１．０×１０2〜５．０×１０6の範囲であると測定され、そし
てｋoffは、１．０×１０-1〜１．０×１０-6の範囲であると測定される。平衡
定数Ｋdは、しばしばｋoff／ｋonとして計算され、従って、代表的に１０-5〜１
０-12の範囲であると測定される。この様式において測定された親和性は、溶液
中で蛍光消光滴定によって測定される親和性と良く相関する。
【０１１３】 好ましいＦ５およびＣ１抗体は、少なくとも１０-5Ｍの結合親和性、より好ま
しくは少なくとも１μＭの結合親和性、そして最も好ましくは少なくとも１００
ｎＭ、１０ｎＭ、または１ｎＭでさえもの結合親和性を有する細胞上のｃ−ｅｒ
ｂＢ−２ Ｆ５エピトープおよびｃ−ｅｒｂＢ−２ Ｃ１エピトープに結合する
。
【０１１４】 （２）Ｆ５および／またはＣ１によって結合されるエピトープを結合する抗
体の同定） Ｆ５およびＣ１抗体（例えば、Ｃ１およびＦ５によって結合される同じエピト
ープに結合する抗体）は、適切に免疫化された動物由来の血清から、またはエキ
ソビボ系（例えば、無作為な抗体ライブラリー）から、ｃ−ｅｒｂＢ−２エピト
ープに結合するためにＣ１またはＦ５と競合する抗体について選択することによ
って、同定（選択）され得る。Ｆ５およびＣ１誘導抗体は、以下：１）Ｆ５およ
びＣ１によって認識されるｃ−ｅｒｂＢ−２エピトープ；および／または２）抗
Ｆ５イディオタイプ抗体もしくは抗Ｃ１イディオタイプ抗体のいずれかとの、そ
れらの交叉反応性によって認識される。標的化およびインターナリゼーションの
ためには、高親和性のＦ５抗体およびＣ１抗体が好ましい。しかし、アンタゴニ
ストをアゴニストへ変換することが所望される場合には、低親和性のＦ５抗体お
よびＣ１抗体が好ましいものであり得ることが予期される。さらに、多くの適用
について、迅速かつ有効なインターナリゼーションは親和性よりも重要であり、
そして迅速にインターナリゼーションされる低親和性抗体は、それほど迅速には
インターナライズされない高親和性抗体よりも好ましいとされ得る。
【０１１５】 （ａ）抗イディオタイプ抗体との交叉反応性） イディオタイプは、抗体の高度に可変性である抗原結合部位を表し、そしてこ
れ自体免疫原性である。抗体媒介性免疫応答の発生の間に、個体は、抗原に対す
る抗体、ならびに高イディオタイプ抗体（この免疫原性結合部位（イディオタイ
プ）は、抗原を模擬する）を発達させる。
【０１１６】 次いで、Ｆ５誘導抗体およびＣ１誘導抗体は、Ｆ５抗イディオタイプ抗体およ
びＣ１抗イディオタイプ抗体と特異的に結合するそれらの能力によって認識され
得る。すなわち、Ｆ５誘導抗体およびＣ１誘導抗体は、好ましくは、Ｆ５抗イデ
ィオタイプ抗体またはＣ１抗イディオタイプ抗体を有するＦ５およびＣ１と交叉
反応性である。
【０１１７】 抗イディオタイプ抗体は、当業者に周知の標準的な方法を使用することによっ
て、Ｆ５またはＣ１の可変領域に対して惹起され得る。簡潔には、抗イディオタ
イプ抗体は、本発明の抗体（例えば、Ｆ５抗体もしくはＣ１抗体、またはそれら
のフラグメント（例えば、ＣＤＲ））を動物に注射し、それによって抗体上の種
々の抗原決定基（イディオタイプ領域における決定基を含む）に対する抗血清を
誘導することによって作製され得る。
【０１１８】 抗分析物抗体の産生のための方法は、当該分野において周知である。大きな分
子量の抗原（約５０００ダルトンより大きい）は、動物に直接的に注射され得る
が、小さな分子量の化合物（約５０００ダルトン未満）は、それらを免疫原性に
するために、好ましくは、高分子量の免疫原性キャリア（通常は、タンパク質）
とカップリングされる。免疫化に応答して産生される抗体は、血清、腹水、免疫
グロブリン（Ｉｇ）画分、ＩｇＧ画分として、またはアフィニティ精製された単
一特異的な物質として利用され得る。
【０１１９】 ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、上記のように調製される本発明の抗
体を用いて動物を免疫することによって調製され得る。一般的には、この抗体（
例えば、ファージディスプレイライブラリー）が誘導された動物を一員とする種
であり、かつアロタイプが整合した動物を免疫化することが所望され得る。この
ことは、非イディオタイプ決定基に対して指向された抗体の産生を最小化する。
次いで、上記のように得られた抗血清は、通常、ファージディスプレイライブラ
リーが誘導されたのと同じ種由来の正常な血清に対して大量に吸収させ、それに
よって、非イディオタイプ決定基に対して指向された抗体を排除する。吸収は、
正常な（非免疫）血清タンパク質をグルタルアルデヒドと架橋することによって
形成されるゲルに対して抗血清を通過させることによって達成され得る。抗イデ
ィオタイプ特異性を有する抗体は、一直線にゲルを通過するが、非イディオタイ
プ決定基についての特異性を有する抗体は、ゲルと結合する。不溶性ポリサッカ
リド支持体（例えば、セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ））上での非免疫血清
タンパク質の固定化もまた、吸収のための適切なマトリックスを提供する。
【０１２０】 モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔ
ｕｒｅ ２５６：４９５の方法を用いて作製され得る。特に、モノクローナル抗
イディオタイプ抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る。この技術
は、（１）目的の抗原またはハプテンキャリア結合体（すなわち、本発明の抗体
または結果物（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ））で免疫されたマウス由来の脾臓細胞
を、（２）薬物（例えば、８−アザグアニン）に対する耐性について選択された
マウス骨髄腫細胞株に融合する工程を含む。一般に、免疫グロブリンを分泌しな
い骨髄腫細胞株の使用が所望される。いくつかのそのような株は、当該分野で公
知である。好ましい細胞株は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３である。この細胞株は
、ＣＲＬ−１５８０のようにアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託さ
れている。
【０１２１】 融合は、確立された方法（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ、Ｒ．Ｋｅｎｎｅｔｔ、Ｊ．ＭｃＫｅａｒｎおよびＫ．Ｂｅｃｈｔｏｌ編、
Ｎ．Ｙ．、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９８０、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｔｏ
ｐｉｃｓ ｉｎ ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙおよびＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８
１巻、Ｆ．Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｍ．ＰｏｔｔｅｒおよびＮ．Ｌ．Ｗａｒｎｅｒ編
、Ｎ．Ｙ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９７８を参照のこと）に従っ
て、ポリエチレングリコールの存在下で実施され得る。融合細胞および非融合細
胞の得られた混合物を、ヒポキサンチンアミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選
択培地にプレートアウト（ｐｌａｔｅ ｏｕｔ）する。これらの条件下では、ハ
イブリッド細胞のみが増殖する。
【０１２２】 十分な細胞増殖が生じた時点で（代表的には、融合後１０〜１４日）、培養培
地を収集し、そして固相ＲＩＡおよび酵素結合免疫吸着検定法を含む多くの方法
のいずれか１つによってモノクローナルイディオタイプ抗分析物抗体の存在につ
いてスクリーニングする。次いで、所望の特異性の抗体を含む培養ウェルからの
細胞を、増大させ、そして再クローニングする。次いで、目的の抗体に対して陽
性を維持するそれらの培養物由来の細胞は、通常、感受性の、組織適合性の、プ
リスタン初回刺激（ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）マウスにおける腹水腫瘍
のように継代される。
【０１２３】 腹水は、腹膜腔の穿刺により収集され、抗体について再検査され、そして上記
のように精製される。非分泌骨髄腫株が融合に使用される場合、モノクローナル
抗体のアフィニティー精製は、通常必要がない。なぜなら、抗体は、すでにその
抗原結合特性に対して均質であるからである。必要なのは、腹水の夾雑タンパク
質からそれを単離すること（すなわち、免疫グロブリン画分を産生すること）の
みである。
【０１２４】 あるいは、目的のハイブリッド細胞株は、血清を含まない組織培養物中で増殖
され得、そして抗体は、培養培地から採取される。一般に、これは、大量の抗体
を得るあまり望ましくない方法である。なぜなら、収量が低いからである。細胞
をマウスに静脈的に通過させることおよび血清から抗体を採取することがまた、
可能である。この方法は、一般的に好ましくない。なぜなら、採血あたりの得ら
れ得る血清の量が少なく、そして他の血清成分からの広範な精製が必要だからで
ある。しかし、いくつかのハイブリドーマは、腹水腫瘍のように増殖しない。従
って、抗体を得る代替的なこれらの方法の１つを使用しなければならない。
【０１２５】 （ｂ）Ｆ５またはＣ１との交叉反応性） 抗イディオタイプ抗体の代わりに、推定のＦ５誘導抗体およびＣ１誘導抗体は
、それぞれｃ−ｅｒｂＢ−２ Ｆ５エピトープおよびｃ−ｅｒｂＢ−２ Ｃ１エ
ピトープに対するＦ５およびＣ１との交叉反応性によって同定され得る。
【０１２６】 これは、ネイティブもしくは組換えｃ−ｅｒｂＢ−２を発現する細胞を提供す
ることによってか、または固体支持体に付着した単離ｃ−ｅｒｂＢ−２を提供す
ることによって確認され得る。エピトープ−マッピング形式における、推定Ｆ５
（またはＣ１）と、Ｆ５またはＣ１（それぞれ配列番号１および２）との間の競
合は、これらの抗体が同じエピトープについて競合することを確証する。次いで
、この推定抗体を、以下に記載のようにスクリーニングする。
【０１２７】 （ｃ．交叉反応性の測定） 好ましくは、競合結合形式でのイムノアッセイが交叉反応性決定に使用される
。例えば、Ｆ５もしくはＣ１エピトープまたは抗イディオタイプ抗体が固体支持
体に固定される。そのアッセイに添加された、推定のＦ５由来もしくはＣ１由来
抗体（例えば、ファージディスプレイライブラリーからの選択により作製される
）が、固定されたエピトープまたは抗イディオタイプ抗体に結合する、それぞれ
配列番号１および２のＦ５もしくはＣ１抗体と競合する。推定のＦ５由来もしく
はＣ１由来抗体が固定タンパク質に対するＦ５もしくはＣ１抗体（配列番号１お
よび２）の結合と競合する能力を比較する。標準的な計算を使用して、タンパク
質に対する交叉反応性の割合を計算する。
【０１２８】 推定のＦ５由来もしくはＣ１由来抗体がＦ５もしくはＣ１と競合し、そして同
じ標的に対してＦ５もしくはＣ１に匹敵するかまたはこれらより大きな結合親和
性を有する場合、推定のＦ５由来もしくはＣ１由来抗体はＦ５もしくはＣ１（由
来）抗体と考えられる。
【０１２９】 （３．Ｃ１およびＦ５抗体インターナリゼイションの測定） １つの実施態様において、本発明は、インターナライズするＦ５もしくはＣ１
抗体を同定するための方法を提供する。この方法は、「標的」細胞を１またはそ
れ以上の推定のＦ５もしくはＣ１抗体（例えば、ファージディスプレイライブラ
リーのメンバー）と接触させる工程を包含する。適切なインキュベーション期間
の後、この細胞を洗浄して外部に結合したファージ（ライブラリーメンバー）を
除去し、次いで細胞溶解によりインターナライズしたファージを遊離させる。細
胞溶解物中のインターナライズしたファージを回収し、そしてインターナライズ
したファージを含む溶解物を使用して細菌宿主を感染させることによって増殖さ
せ得る。感染した細菌の増殖が、その後の選択ラウンドに使用され得るファージ
の増殖を導く。各選択ラウンドが、より効率的にインターナライズされるか、標
的細胞に関してより特異的であるか、または改善された結合特性を有するファー
ジを富化する。
【０１３０】 好ましくは、ファージディスプレイライブラリーを、サブトラクティブ（ｓｕ
ｂｔｒａｃｔｉｖｅ）細胞株と接触させて（すなわち、サブトラクティブ細胞株
を標的細胞および培養培地に添加して）、「標的」細胞に特異的でないファージ
ディスプレイライブラリーのメンバーを除去する。好ましくは、そのライブラリ
ーの非特異的な結合メンバーが、サブトラクティブ細胞株により除かれ得る前に
インターナライズされない（隔離される）ように、サブトラクティブ細胞株を、
そのファージディスプレイライブラリーのメンバーがインターナライズされない
条件下（例えば、約４℃〜約２０℃の温度、より好ましくは約４℃の温度）で添
加する。
【０１３１】 非特異的結合抗体を削除した後、「標的」細胞を洗浄して、このサブトラクテ
ィブ細胞株を除去し、そして非特異的に結合したかまたは弱く結合したファージ
を除去する。
【０１３２】 次いで、インターナリゼーションが生じ得る条件下（約３５℃〜約３９℃の温
度、より好ましくは約３７℃の温度）で標的細胞を培養する。インターナリゼー
ション培養期間の持続時間は、抗体（ファージディスプレイメンバー；これに関
して選択が生じる）のインターナリゼーション速度を決定する。より短いインタ
ーナリゼーション期間を用いて、より迅速なインターナライズする抗体が選択さ
れる一方、より長いインターナリゼーション期間では、より緩慢なインターナラ
イズする抗体が選択される。インターナリゼーション期間は、好ましくは約１２
０分未満であり、より好ましくは約６０分未満であり、そして最も好ましくは約
３０分未満であり、あるいは約２０分未満でさえある。
【０１３３】 インターナリゼーション期間の間、標的細胞は、インターナリゼーションが生
じ得る条件下で増殖されることに気をつける。多くの細胞株について、このこと
は、細胞を培養プレートに付着させて培養することを包含する。
【０１３４】 インターナリゼーションが生じた後、標的細胞を洗浄してインターナライズさ
れないもの（例えば、表面結合ファージ）を除去する。
【０１３５】 次いで、細胞をきれいな培地に移動させ得る。細胞が付着性である好ましい実
施態様において、これら細胞をトリプシン処理して、細胞を、細胞外マトリクス
に結合するファージ抗体を含み得る細胞外マトリクスから遊離させる。細胞を溶
液中に遊離させることにより、より十分な洗浄を可能にし、そしてこれら細胞を
新しい培養フラスコへ移すことにより、組織培養皿に粘着しているかもしれない
任意のファージを後に残す。
【０１３６】 次いで、細胞を大量のＰＢＳで洗浄し、そして溶解してインターナライズした
ファージを遊離させる。次いで、このファージを増殖し得、例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉに感染させて次の選択ラウンドのためのファージを産生させ得る。インターナ
ライズしたファージを実際に視覚化する必要はないことに気をつける。単純な細
胞溶解および以前にインターナライズしたファージの増殖は、インターナライズ
するファージディスプレイメンバーを回収するに十分である。インターナライズ
するファージライブラリーメンバーについて選択する方法もまた、関連出願たる
ＵＳＳＮ６０／０８２，９５３および本明細書に提供される実施例に記載される
。
【０１３７】 （ＩＶ．Ｆ５およびＣ１エピトープ） 別の実施態様において、本発明は、本発明のＦ５およびＣ１抗体によって特異
的に認識されそして結合されるエピトープを提供する。このインターナライズす
るエピトープは、それぞれＦ５およびＣ１により特異的に結合される能力によっ
て特徴づけられる。したがって、Ｆ５エピトープは、Ｆ５に特異的に結合する、
ｃ−ｅｒｂＢ２の領域（配列番号１）であり、他方、Ｃ１エピトープは、Ｃ１（
配列番号２）に特異的に結合する、ｃ−ｅｒｂＢ２の領域である。Ｆ５およびＣ
１は共に、同じｃ−ｅｒｂＢ２エピトープに結合すると考えられる。
【０１３８】 Ｆ５およびＣ１エピトープは、標準的な技術を使用するエピトープマッピング
（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２
，２５９−２７４を参照）により同定され得る。この技術は、重複するｃ−ｅｒ
ｂＢ２ペプチドの合成を包含する。次いで、合成ペプチドを、Ｆ５およびＣ１そ
れぞれに対してスクリーニングし、そして結合特異性およびアフィニティーによ
り特徴的なＦ５およびＣ１エピトープを同定し得る。
【０１３９】 Ｆ５およびＣ１エピトープマッピングのためのペプチドは、「マルチピン」ペ
プチド合成技術（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５
：１１８４−１１９０を参照）を使用して簡便に調製され得る。ｃ−ｅｒｂＢ２
の公知配列（例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ０４６２６またはＣｏｕｓｓｅ
ｎｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１１３２−１１３９）を使用して
、重複するｃ−ｅｒｂＢ２ポリペプチド配列を、一続きの１またはそれ以上の９
６ウェルマイクロテストプレート中のプラスチックピン上に連続様式で個々に合
成し得る。
【０１４０】 このマルチピンペプチドシステムを用いるエピトープマッピングのための手順
は、米国特許第５，７３９，３０６号に記載されている。簡潔には、最初に、ピ
ンを、ＰＢＳ中に２％ウシ血清アルブミンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含
むプレコート緩衝液で１時間室温にて処理する。次いで、ピンを、プレコート緩
衝液中に抗体Ｆ５もしくはＣ１を２μｇ／ｍｌで含む、９６ウェルマイクロテス
トプレートの個々のウェルに挿入する。インキュベーションは室温にて１時間で
ある。ピンをＰＢＳＴ中で洗浄し（毎回１０分間の３回のリンス）、次いで１０
０μｌのＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１：４，０００の希釈率で
含む、９６ウェルマイクロテストプレートのウェル中で室温にて１時間インキュ
ベートする。ピンを、前述のように洗浄した後、呈色反応のために、ジアンモニ
ウム２，２’−アジノ−ビス［３−エチルベンズチアゾリン−ｂ−スルホネート
］（ＡＢＴＳ）のペルオキシダーゼ基質溶液およびＨ2Ｏ2（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ
＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，Ｍｄ）を含むウェル中に室温にて３０分間入れる。プレートを、４９２
ｎｍのバックグランド吸収波長に対してプレートリーダー（例えば、Ｂｉｏ Ｔ
ｅｋ ＥＬＩＳＡプレートリーダー）により４０５ｎｍで読み取る。発色を示す
ウェルが、そのウェル中のｃ−ｅｒｂＢ−２由来ペプチドとＦ５もしくはＣ１と
の反応性を示した。
【０１４１】 （Ｖ．キメラ分子の調製） 別の実施態様において、本発明は、エフェクター分子に付着したＦ５もしくは
Ｃ１抗体を含むキメラ分子を提供する。上記での説明のように、本発明のキメラ
分子のエフェクター分子成分は、ｃ−ｅｒｂＢ−２を発現する細胞へ送達するこ
とが所望される活性を有する任意の分子であり得る。適切なエフェクター分子に
は、サイトトキシン（例えば、ＰＥ、リシン、アブリンまたはＤＴ）、放射性核
種、リガンド（例えば、成長因子、抗体、蛍光もしくは放射性標識のような検出
可能な標識）、および治療組成物（例えば、直接融合もしくは結合体化した薬物
）、種々の薬物もしくは他の薬剤（例えば、核酸）を含む「カプセル」（例えば
、リポソーム、合成ポリマーカプセル、ウイルスキャプシド、生ウイルス）が含
まれる。
【０１４２】 エフェクター分子は、代表的には、標的細胞（例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２を過
剰発現する腫瘍）へ送達されることが消耗される特徴的な活性を有する。エフェ
クター分子には、サイトトキシン、標識、放射性核種、リガンド、抗体、薬物、
リポソーム、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス分子、ペプチド核酸
など）を含むウイルスもしくはウイルスキャプシド、およびそのウイルスがｃ−
ｅｒｂＢ−２発現細胞に感染可能にするウイルス外被タンパク質が含まれる。標
的に一旦送達されると、エフェクター分子は、その特徴的な活性を働かせる。
【０１４３】 例えば、エフェクター分子がサイトトキシンである１つの実施態様において、
キメラ分子は、サイトトキシンを、ｃｅｒｂＢ−２マーカーを有する腫瘍細胞に
特異的に標的化する強力な細胞殺傷剤として作用する。腫瘍細胞を特異的に標的
化するキメラサイトトキシンは、当業者に周知である（例えば、Ｐａｓｔａｎら
（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：３３１−３５４を参照
）。
【０１４４】 別の実施態様において、キメラ分子は、インビボまたはインビトロで腫瘍細胞
が存在するかしないかを検出し、そして／またはインビボまたはインビトロで腫
瘍細胞を定量化し、そして／またはインビボで腫瘍細胞を局在化するために使用
され得る。これらの方法には、Ｆ５もしくはＣ１抗体に付着した検出可能な標識
である、エフェクター分子を含むキメラ分子を提供することを含む。Ｆ５もしく
はＣ１抗体は、キメラ分子を、ｃ−ｅｒｂＢ−２マーカーを発現する腫瘍細胞に
特異的に結合させる。抗体は、次いで、検出可能な標識との結合によりマークさ
れる。引き続く細胞結合標識の検出は、腫瘍細胞の存在および／または位置を示
す。
【０１４５】 なお別の実施態様において、エフェクター分子は、別の特異的な結合部分であ
り得る。この特異的な結合部分は、抗原結合ドメイン、成長因子、またはリガン
ドを含むがこれらに限定されない。次いで、キメラ分子は、高度に特異的な二官
能性リンカーとして作用する。このリンカーは、キメラタンパク質が結合する細
胞または細胞成分の間を結合させ、そしてそれらの間の相互作用を増強するよう
に作用し得る。したがって、例えば、「エフェクター」成分が抗レセプター抗体
または抗体フラグメントである場合、Ｆ５もしくはＣ１抗体成分は、抗レセプタ
ー抗体または抗体フラグメントに特異的に結合する一方、エフェクター成分は、
免疫細胞の表面上のレセプター（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＦｃＩ、ＦｃＩ
Ｉ、およびＦｃＩＩＩレセプター）に結合する。したがって、キメラ分子は免疫
応答を増強し、そして免疫応答を標的ガン細胞へ指向させるように作用し得る。
【０１４６】 なお別の実施態様において、エフェクター分子は、薬理学的薬剤（例えば、薬
物）か、または薬理学的薬剤を含むビヒクルであり得る。このことは、単に、非
致死性の生物学的応答を誘発することが所望される場合に、特に適切である。し
たがって、Ｆ５もしくはＣ１抗体レセプターは、薬物（例えば、ビンブラスチン
、ビンデシン、メルファラン、Ｎ−アセチルメルファラン、メトトレキサート、
アミノプテリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ゲニステイン（チロシンキ
ナーゼインヒビター）、アンチセンス分子、および当業者に公知の他の薬理学的
薬剤に結合され得、それによってこれら薬理学的薬剤を、ｃ−ｅｒｂＢ−２を発
現する腫瘍細胞に特異的に標的化し得る。
【０１４７】 あるいは、Ｆ５もしくはＣ１抗体は、治療組成物を含むビヒクルに結合され得
る。このようなビヒクルには、リポソーム、ミセル、種々の合成ビーズもしくは
ポリマーカプセル、ウイルスキャプシド、生ウイルスなどが含まれるが、これら
に限定されない。
【０１４８】 当業者は、本発明のキメラ分子が、必要に応じて、単一のエフェクターに結合
した複数の標的化部分を含むか、または逆に単一の標的化部分に結合した複数の
エフェクター分子を含むことを理解する。なお他の実施態様において、キメラ分
子は、複数の標的化部分および複数のエフェクター分子を共に含む。したがって
、例えば、本発明は、Ｆ５もしくはＣ１抗体が細胞傷害性分子に付着されている
一方で、別の分子（例えば、抗体または別のリガンド）がそのトキシンの他方の
末端に結合されている、「二重に標的化された」サイトトキシンキメラ分子を提
供する。このような二重に標的化されたサイトトキシンは、例えば、ＰＥのアミ
ノ末端でドメインＩａと置換され、そしてドメインＩＩＩに抗ＴＡＣ（Ｆｖ）を
挿入されたＦ５もしくはＣ１抗体を含み得る。他の抗体もまた適切なエフェクタ
ー分子であり得る。
【０１４９】 （Ａ．サイトトキシン） 特に好ましいサイトトキシンには、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン、
Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａトキシン、リシン、およびアブリンが含まれる。Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンおよびＤｉｐｈｔｈｅｒｉａトキシンが特にキメ
ラサイトトキシンに頻繁に使用される。
【０１５０】 （１．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシン（ＰＥ）） ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンＡ（ＰＥ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって分泌される、極端に活性なモノマータンパク
質であり（分子量６６ｋＤ）、これは、延長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボ
シル化を触媒する（酸化ＮＡＤのＡＤＰリボシル部分のＥＦ−２への転移を触媒
する）ことによるＥＦ−２の不活化によって真核細胞におけるタンパク質合成を
阻害する。
【０１５１】 このトキシンは、協力して細胞傷害性を引き起こす３つの構造ドメインを含む
。ドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）は細胞結合を媒介する。ドメインＩＩ（
アミノ酸２５３〜３６４）は細胞質ゾル中へのトランスロケーションを担い、そ
してドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は延長因子２のＡＤＰリボシル
化（これは、このタンパク質を不活化し細胞死を引き起こす）を媒介する。ドメ
インＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）の機能は未だ規定されていないままである
が、その大部分（アミノ酸３６５〜３８０）は、細胞傷害性を喪失することなく
欠失され得る（Ｓｉｅｇａｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４
：１４２５６−１４２６１を参照）。
【０１５２】 好ましいＰＥ分子の最大の細胞傷害特性のために、この分子に対するいくつか
の改変が推奨される。標的細胞の細胞質中にこの組換え分子をトランスロケート
するために、この分子への適切なカルボキシル末端配列が好ましい。効果的であ
ることが見出されているアミノ酸配列には、ＲＥＤＬＫ（ネイティブのＰＥのよ
うな）、ＲＥＤＬ、ＲＤＥＬ、もしくはＫＤＥＬ、これらの反復、または本明細
書では「内質保持配列」と呼ばれる、タンパク質を小胞体中に維持もしくはリサ
イクルするように機能する他の配列が含まれる。例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら
（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３０８−
３１２およびＳｅｅｔｈａｒａｍら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
６：１７３７６−１７３８１を参照。
【０１５３】 標的化分子はドメインＩａと置換して挿入され得る。同様な挿入は、Ｈｅｉｍ
ｂｒｏｏｋら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
７：４６９７−４７０１に記載されるＴＧＦ−ＰＥ４０分子（ＴＰ４０とも呼ば
れる）として公知のものにおいて達成されている。他のＰＥ改変体については、
Ｄｅｂｉｎｓｋｉら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，５：４０もまた
参照。
【０１５４】 ＰＥ分子は、組換え手段によりＦ５もしくはＣ１抗体と融合され得る。タンパ
ク質鎖をコードする遺伝子は、当業者に公知の任意のクローニング手順によりｃ
ＤＮＡまたはゲノムの形態でクローニングされ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１
９８９）を参照。種々のリガンドと融合されたＰＥをコードする遺伝子をクロー
ニングする方法は、当業者に周知である。例えば、Ｓｉｅｇａｌｌら（１９８９
）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，３：２６４７−２６５２；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９
７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：４５３８−４５４
２を参照。
【０１５５】 当業者は、さらなる改変、欠失、挿入などが本発明のキメラ分子またはＦ５も
しくはＣ１キメラ分子をコードする核酸配列に対してなされ得ることを理解する
。特に、欠失または変化は、標的細胞に対する融合タンパク質の細胞傷害性を増
大させるため、またはその抗体の抗原なしで細胞に対する非特異的細胞傷害性を
減少させるために、ＰＥ、またはＰＥに抗体遺伝子を接続するリンカーにおいて
なされ得る。このような全ての構築物は、当業者に周知の遺伝子工学の方法（一
般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照）によって作製され得、そしてタンパ
ク質を種々の臨床的もしくは生物学的適用に特に適切にする親和性、特異性、安
定性、および毒性という種々の性質を有するそのタンパク質を産生し得る。
【０１５６】 （２．ジフテリアトキシン（ＤＴ）） ＰＥと同様に、ジフテリアトキシン（ＤＴ）は、延長因子２（ＥＦ−２）をＡ
ＤＰリボシル化し、それによりタンパク質合成を阻害することによって細胞を殺
傷する。しかし、ジフテリアトキシンは、ジスルフィド架橋により連結した２つ
の鎖ＡおよびＢに分割される。ＰＥとは対照的に、ＤＴの鎖Ｂ（これはカルボキ
シル末端にある）はレセプター結合を担い、鎖Ａ（これはアミノ末端に存在する
）は酵素活性を含む（Ｕｃｈｉｄａら（１９７２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７５：９
０１−９０３；Ｕｃｈｉｄａら（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８
：３８３８−３８４４）。
【０１５７】 本発明の標的化分子−ジフテリアトキシン融合タンパク質は、Ｄｉｐｈｔｈｅ
ｒｉａトキシンＢ鎖の短縮により除去される、ネイティブなレセプター結合ドメ
インを有し得る。残基３８９から始まるカルボキシル末端配列が除去されている
ＤＴであるＤＴ３８８は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９１）Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８０：５４５−５５１において示されてい
る。
【０１５８】 ＰＥキメラサイトトキシンと同様に、ＤＴ分子は、Ｆ５もしくはＣ１抗体に化
学的に結合体化され得るが、組換え手段によってもまた融合タンパク質として調
製され得る。タンパク質鎖をコードする遺伝子は、当業者に公知の任意のクロー
ニング手順により、ｃＤＮＡまたはゲノムの形態でクローニングされ得る。種々
のリガンドと融合されたＤＴをコードする遺伝子をクローニングする方法もまた
、当業者に周知である。例えば、成長因子−ＤＴ融合タンパク質の発現を記載す
るＷｉｌｌｉａｍｓら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１８
８５−１１８８９を参照。
【０１５９】 本明細書中で使用される用語「ジフテリアトキシン」（ＤＴ）とは、完全長の
ネイティブなＤＴ、または改変されているＤＴをいう。改変は、代表的には、Ｂ
鎖中の標的化ドメインの除去を含み、より具体的には、Ｂ鎖のカルボキシル領域
の短縮を含む。
【０１６０】 （Ｂ．検出可能な標識） 用語「検出可能な標識」とは、検出可能な物理的もしくは化学的性質を有する
任意の物質をいう。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野で十分
に開発されており、そして一般に、このような方法で有用な任意の標識が本発明
に適用され得る。したがって、標識は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学
的、電気的、光学的もしくは化学的手段により検出可能な分析任意の組成物であ
る。本発明において有用な標識には、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ TM ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド
、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または32 Ｐ）、蛍光タンパク質（例えば、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ブルー蛍
光タンパク質（ＢＦＰ）、イエロー蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、レッド蛍光タン
パク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ）、酵素（例えば、ＬａｃＺ、ＣＡＴ、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびマーカー遺伝子産物
として、またはＥＬＩＳＡにおいてのいずれかで検出可能な酵素として一般的に
使用されるその他のもの）、およびコロイド状金または色つき硝子もしくはプラ
スチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）の
ような比色標識が含まれる。このような標識の使用を教示する特許には、米国特
許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号
；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号
；および第４，３６６，２４１号が含まれる。
【０１６１】 蛍光標識は単一種の有機分子に限定されず、無機分子、有機および／または無
機分子の多分子混合物、クリスタル、ヘテロポリマーなどを含むことが認識され
る。したがって、例えば、シリカ殻に囲まれたＣｄＳｅ−ＣｄＳコア殻ナノクリ
スタル（ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ）は、生物学的分子と
のカップリングのために、容易に誘導体化され得る（Ｂｒｕｃｈｅｚら（１９９
８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１３−２０１６）。同様に、高度に蛍光性の
量子ドット（硫化亜鉛でキャップしたセレン化カドミウム）は、超感受性生物学
的検出における使用のために生体分子に共有結合されている（Ｗａｒｒｅｎおよ
びＮｉｅ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１６−２０１８）。
【０１６２】 標識は、当該分野において周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に直接
もしくは間接的に結合され得る。非放射性標識は、しばしば、間接的手段により
付着される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、その分子に共有結
合される。次いで、リガンドは、固有の性質として検出可能であるか、またはシ
グナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物）に共
有結合しているかのいずれかである、抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン
）分子に結合する。多くのリガンドおよび抗リガンドが使用され得る。リガンド
が天然のリガンドを有する場合、例えば、ビオチン、チロキシン、およびコルチ
ゾルである場合、そのリガンドは、その標識された天然に存在する抗リガンドと
共に使用され得る。あるいは、任意のハプテンもしくは抗原性化合物が、抗体と
共に使用され得る。これらの分子はまた、シグナル発生化合物と直接もしくはリ
ンカーにより結合され得る。
【０１６３】 このような標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、
放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出さ
れ得、蛍光マーカーは発せられた照明を検出する光検出器を使用して検出され得
る。酵素標識は、代表的には、その酵素を基質と共に提供され、そしてその基質
に対する酵素の作用による反応産物を検出することにより検出され、そして比色
標識は、色つき標識を単純に視覚化することによって検出される。
【０１６４】 （Ｃ．リガンド） 上記で説明したように、エフェクター分子はまた、リガンドまたは抗体であり
得る。特に好ましいリガンドおよび抗体は、免疫細胞の表面マーカーに結合する
ものである。このような抗体をエフェクター分子として利用するキメラ分子は、
そのリガンドもしくは抗体の結合パートナーを有する免疫細胞と、ｃ−ｅｒｂＢ
−２を発現する腫瘍細胞との間の結合を確立する二官能性リンカーとして作用す
る。適切な抗体および成長因子は当業者に公知であり、これには、ＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、抗Ｔａｃ、ＴＧＦαな
どが含まれる。
【０１６５】 （Ｄ．他の治療的部分） 他の適切なエフェクター分子には、薬理学的薬剤または種々の薬理学的薬剤を
含むカプセル化システムが含まれる。したがって、Ｆ５もしくはＣ１抗体は、腫
瘍に直接送達されるべき薬物に直接付着され得る。このような薬物は当業者に周
知であり、これには、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ゲニステイン、アンチ
センス分子、リボザイムなどが含まれるが、それらに限定されない。
【０１６６】 あるいは、エフェクター分子には、薬物、核酸（例えば、タンパク質核酸を含
むがこれに限定されないアンチセンス核酸）のような治療組成物、または循環系
への直接曝露から好ましくは保護された別の治療的部分を含む、リポソーム、ポ
リマーカプセル、ウイルスキャプシド、ウイルス、またはミセルのようなカプセ
ル化システムが含まれ得る。抗体に付着したリポソームを調製する手段は、当業
者に周知である。例えば、米国特許第４，９５７，７３５号およびＣｏｎｎｏｒ
ら（１９８５）Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，２８：３４１−３６５を参照。
【０１６７】 特に好ましい実施態様において、リポソームは、外部親水性ポリマー（例えば
、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を有する、「ステルス」（立体的に安定
化された）リポソームである。抗体は、同時係属中の米国特許出願第０８／６６
５，２０２号に記載されるように、親水性ポリマーを介してリポソームに結合さ
れ得る。
【０１６８】 （Ｅ．エフェクター分子へのＦ５もしくはＣ１抗体の付着） 当業者は、Ｆ５もしくはＣ１抗体およびエフェクター分子が任意の順序で一緒
に結合され得ることを理解する。したがって、エフェクター分子は、Ｆ５もしく
はＣ１抗体のアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかに結合され得る。Ｆ
５またはＣ１抗体はまた、エフェクター分子の内部領域に結合され得、あるいは
逆にエフェクター分子は、その付着がその分子のそれぞれの活性を妨げない限り
、Ｆ５もしくはＣ１抗体の内部位置に結合され得る。
【０１６９】 Ｆ５もしくはＣ１抗体およびエフェクター分子は、当業者に周知の多くの手段
のうちの任意のものにより付着され得る。代表的には、エフェクター分子は、Ｆ
５もしくはＣ１抗体に、直接もしくはリンカー（スペーサー）を通じてのいずれ
かで結合される。しかし、エフェクター分子がポリペプチドである場合、単鎖融
合タンパク質としてキメラ分子を組換え的に発現させることが好ましい。
【０１７０】 （ｉ．Ｆ５もしくはＣ１抗体へのエフェクター分子の結合体化） １つの実施態様において、標的化分子であるＦ５もしくはＣ１抗体は、エフェ
クター分子（例えば、サイトトキシン、標識、リガンド、または薬物もしくはリ
ポソーム）に化学的に結合体化される。分子を化学的に結合体化させる手段は、
当業者に周知である（例えば、抗ガン薬、放射標識を含む標識、酵素などへの抗
体の結合を記載する、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎ
ｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第４章，Ｂｉｒｃｈ ａｎ
ｄ Ｌｅｎｎｏｘ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．
（１９９５）を参照）。
【０１７１】 抗体または他のペプチド標的化分子に薬剤を付着させる手順は、その薬剤の化
学構造に従って変化する。このポリペプチドは、代表的には、そのエフェクター
を結合するエフェクター分子上の適切な官能基との反応に利用可能である種々の
官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）または遊離アミン（−ＮＨ2）基を含
む。
【０１７２】 あるいは、標的化分子および／またはエフェクター分子は、さらなる反応性官
能基を露わにするかまたはこれを付着するように誘導体化され得る。この誘導体
化は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ
Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手可能なリンカーのような、多くのリンカー分子のう
ちの任意のリンカーの付着を含み得る。
【０１７３】 本明細書で使用する「リンカー」は、標的化分子をエフェクター分子に結合さ
せるために使用される分子である。リンカーは、標的化分子とエフェクター分子
の両方と共有結合を形成し得る。適切なリンカーは当業者に周知であり、これに
は、直鎖もしくは分枝鎖の炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチ
ドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。標的化分子およびエフェクタ
ー分子がポリペプチドである場合、リンカーは、その側鎖を通じて（例えば、シ
ステインとのジスルフィド架橋を通じて）、構成アミノ酸と結合され得る。しか
し、好ましい実施態様において、リンカーは、末端アミノ酸のα炭素のアミノ基
およびカルボキシル基に結合される。
【０１７４】 特定の薬剤上の基と反応性である一方の官能基および抗体と反応性である別の
基を有する二官能性リンカーが、所望の免疫結合体を形成するために使用され得
る。あるいは、誘導体化には、標的化分子の化学的処理（例えば、遊離アルデヒ
ド基を作製するための、過ヨウ素酸塩を用いる、このタンパク質抗体に付着した
糖部分のグリコール切断）が含まれる。この抗体上の遊離アルデヒド基は、薬剤
上の遊離アミンもしくはヒドラジン基と反応させられて、その薬剤を抗体に結合
させ得る。（米国特許第４，６７１，９５８号を参照）。ポリペプチド（例えば
、抗体または抗体フラグメント）上に遊離のスルフヒドリル基を作製する手順も
また公知である（米国特許第４，６７９，８３９号を参照）。
【０１７５】 放射性核種金属キレート、トキシン、および薬物を含む種々の化合物をタンパ
ク質（例えば、抗体）に付着するための多くの手順およびリンカー分子は公知で
ある。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５
８号、第４，６５９，８３９号、第４，４１４，１４８号、第４，６９９，７８
４号；第４，６８０，３３８号；第４，５６９，７８９号；および第４，５８９
，０７１号、ならびにＢｏｒｌｉｎｇｈａｕｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７
：４０７１−４０７５（１９８７）（これらは参考として本明細書中に援用され
る）を参照。特に、種々のイムノトキシンの作製は当該分野で周知であり、例え
ば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅｓ：Ａｉｍｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔ」、Ｔｈｏｒｐｅら
、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１６８〜１９０頁；Ｗａｌｄ
ｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６５７（１９９１），米国特許第４，５
４５，９８５号および第４，８９４，４４３号に見出され得る。
【０１７６】 いくつかの状況において、キメラ分子がその標的部位に到達した場合、標的化
分子からエフェクター分子が遊離されることが望ましい。したがって、エフェク
ターが標的部位で遊離されるべき場合、標的部位の近接部で切断可能な結合を含
むキメラ結合体が使用され得る。抗体から薬剤を遊離するための結合の切断は、
標的細胞の内部または標的部位の近接部のいずれかで免疫結合体に供される酵素
活性または条件により誘発され得る。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存
在する条件下で（例えば、腫瘍関連酵素または酸性ｐＨに曝露された場合に）切
断可能なリンカーが使用され得る。
【０１７７】 多くの異なる切断可能なリンカーが当業者に公知である。米国特許第４，６１
８，４９２号；第４，５４２，２２５号および第４，６２５，０１４号を参照。
これらリンカー基からの薬剤の遊離のための機構は、例えば、光不安定性結合の
照射および酸触媒加水分解を含む。米国特許第４，６７１，９５８号は、例えば
、患者の補体系のタンパク質分解酵素によりインビボで標的部位にて切断される
リンカーを含む免疫結合体の記載を含む。抗体への種々の放射線診断化合物、放
射線治療化合物、薬物、トキシン、および他の薬剤の付着について報告されてい
る大量の方法を考慮すれば、当業者は、所定の薬剤を抗体または他のポリペプチ
ドに付着させる適切な方法を決定し得る。
【０１７８】 ｉｉ）融合タンパク質の生成 Ｆ５抗体もしくはＣ１抗体および／またはエフェクター分子が相対的に短い（
すなわち、約５０アミノ酸未満）場合、これらは、標準的な化学的ペプチド合成
技術を用いて合成され得る。両方の分子が相対的に短い場合、このキメラ分子は
、単一の連続的なポリペプチドとして合成され得る。あるいは、Ｆ５抗体または
Ｃ１抗体およびエフェクター分子は、別々に合成され、次いで一方の分子のアミ
ノ末端を他方の分子のカルボキシル末端と縮合し、それによってペプチド結合を
形成することによって融合され得る。あるいは、標的化分子およびエフェクター
分子は、各々、ペプチドスペーサー分子の一方の末端と縮合され、それによって
連続的な融合タンパク質を形成し得る。
【０１７９】 配列のＣ末端アミノ酸が、不溶性支持体に付着され、続いて配列中の残りのア
ミノ酸が連続的に付加される固相合成は、本発明のポリペプチドの化学合成のた
めに好ましい方法である。固相合成のための技術は、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ；３〜２８４頁、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐａｒｔ Ａ．、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９〜２１５６（１９６３）、
ならびにＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，
Ｉ１１．（１９８４）によって記載されている。
【０１８０】 好ましい実施態様において、本発明のキメラ融合タンパク質は、組換えＤＮＡ
方法論を用いて合成される。一般に、この方法は、この融合タンパク質をコード
するＤＮＡ配列を作製すること、このＤＮＡを、特定のプロモーターの制御下の
発現カセット中に置くこと、このタンパク質を宿主において発現させること、こ
の発現されたタンパク質を単離すること、そして必要とされる場合にはこのタン
パク質を再生することを含む。
【０１８１】 本発明の融合タンパク質（例えば、Ｆ５またはＣ１ Ａｂ−ＰＥ）をコードす
るＤＮＡは、任意の適切な方法によって調製され得る。この方法には、例えば以
下が挙げられる：適切な配列のクローニングおよび制限、またはＮａｒａｎｇら
（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９のホスホトリエステ
ル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｏｍｏｌ．６８：１０９〜１
５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅ
ｔｔ．、２２：１８５９〜１８６２のジエチルホスホロアミダイト法；および米
国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法のような方法による直接的な化学
合成。
【０１８２】 化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的配列との
ハイブリダイゼーションによって、または鋳型としてこの一本鎖を使用するＤＮ
Ａポリメラーゼを用いる重合体化によって、二本鎖に変換され得る。当業者は、
ＤＮＡの化学合成が約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列は、より
短い配列の連結によって得られ得ることを認識する。
【０１８３】 あるいは、サブ配列がクローニングされて、そして適切なサブ配列が適切な制
限酵素を用いて切断され得る。次いで、このフラグメントは連結されて、所望の
ＤＮＡ配列を生成し得る。
【０１８４】 好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡは、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅方法を用いてクローニング
され得る。従って、例えば、Ｆ５抗体またはＣ１抗体についての遺伝子は、第１
の制限部位を含むセンスプライマー、および第２の制限部位を含むアンチセンス
プライマーを用いて、核酸鋳型（クローン）から増幅され得る。これは、成熟Ｆ
５抗体配列またはＣ１抗体配列をコードし、そして末端制限部位を有する核酸を
生成する。細胞毒素（または、他のポリペプチドエフェクター）は、制限酵素を
用いてそのエフェクターをコードするプラスミドから切り出され、Ｆ５抗体また
はＣ１抗体にアニーリングするのに適切な切断末端を生成し得る。配列の連結お
よび構築物のベクターへの導入は、Ｆ５−エフェクター分子融合タンパク質また
はＣ１−エフェクター分子融合タンパク質をコードするベクターを生成する。こ
のようなＰＣＲクローニング方法は、当業者に周知である（例えば、ＰＥ融合タ
ンパク質の調製について、Ｄｅｂｉｎｓｋｉら（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ、５８：７４４〜７４８を参照のこと）。
【０１８５】 ２つの分子は、ともに直接的に連結され得るが、当業者は、この分子が、１つ
以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーによって離れさせられ得ることを理
解する。一般に、このスペーサーは、そのタンパク質に連結すること、またはそ
れらの間の幾分の最小の距離もしくは他の空間的関係を保存すること以外には、
特定の生物学的活性を有さない。しかし、このスペーサーの構成アミノ酸は、折
り畳み、有効電荷、または疎水性のような分子のいくつかの特性に影響を及ぼす
ように選択され得る。当業者は、所望される場合、ＰＣＲプライマーが、Ｆ５抗
体またはＣ１抗体とエフェクター分子との間にアミノ酸リンカーまたはスペーサ
ーを導入するように選択され得ることを理解する。
【０１８６】 この融合タンパク質をコードする核酸配列は、以下を含む種々の宿主細胞にお
いて発現され得る：Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、および種々の高等真核
生物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株およびＨｅｌａ細胞株）、なら
びに骨髄腫細胞株。組換えタンパク質遺伝子は、各宿主についての適切な発現制
御配列に作動可能に連結される。Ｅ．ｃｏｌｉについて、この遺伝子は、プロモ
ーター（例えば、Ｔ７、ｔｒｐ、またはλプロモーター）、リボソーム結合部位
、そして好ましくは転写終結シグナルを含む。真核生物細胞について、制御配列
は、プロモーター、そして好ましくは免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイト
メガロウイルスなど由来のエンハンサー、およびポリアデニル化配列を含み、そ
してスプライスドナーおよびアクセプター配列を含み得る。
【０１８７】 本発明のプラスミドは、周知の方法（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについては塩化カ
ルシウム形質転換、そして哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム処理または
エレクトロポレーション）によって、選択された宿主細胞に移入され得る。プラ
スミドによって形質転換された細胞は、プラスミドに含まれる遺伝子（例えば、
ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子、およびｈｙｇ遺伝子）によって与
えられる抗生物質に対する耐性によって選択され得る。
【０１８８】 一旦発現されると、組換え融合タンパク質は、以下を含む当該分野の標準的な
手順に従って精製され得る：硫酸アンモニウム沈降法、アフィニティーカラム、
カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動など（一般には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
、Ｎ．Ｙ．（１９８２）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ 第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０
）を参照のこと）。好ましい実施態様において、融合タンパク質は、実施例１お
よび２において記載されるようなアフィニティー精製方法を用いて精製される。
少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋な組成物が好ましく、そして
９８〜９９％またはそれ以上の均質性が薬学的使用のために最も好ましい。一旦
部分的にまたは所望の均質性まで精製されると、次いでこのポリペプチドは、治
療に使用され得る。
【０１８９】 当業者は、化学合成、生物学的発現、または精製の後に、Ｆ５抗体−エフェク
ター融合タンパク質またはＣ１抗体−エフェクター融合タンパク質が、構成ポリ
ペプチドのネイティブのコンフォメーションとは実質的に異なるコンフォメーシ
ョンを有し得ることを理解する。この場合において、ポリペプチドを変性および
還元すること、次いでこのポリペプチドを好ましいコンフォメーションに再折り
畳みさせることが必要であり得る。タンパク質を還元および変性させる方法およ
び再折り畳みを誘導する方法は、当業者に周知である（Ｄｅｂｉｎｓｋｉら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：１４０６５〜１４０７０；Ｋｒｅ
ｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、
４：５８１〜５８５；ならびにＢｕｃｈｎｅｒら（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、２０５：２６３〜２７０を参照のこと）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋ
ｉらは、グアニジン−ＤＴＥ中の封入体タンパク質の変性および還元を記載して
いる。次いで、このタンパク質は、酸化されたグルタチオンおよびＬ−アルギニ
ンを含むレドックス緩衝液中で再折り畳みされる。
【０１９０】 当業者は、生物学的活性を低減させることなく、Ｆ５抗体−エフェクター融合
タンパク質またはＣ１抗体−エフェクター融合タンパク質に対して改変がなされ
得ることを認識する。いくつかの改変が、融合タンパク質への標的化分子のクロ
ーニング、発現、または取り込みを促進するためになされ得る。このような改変
は当業者に周知であり、そして例えば開始部位を提供するためにアミノ末端に付
加されるメチオニン、または簡便に置かれる制限部位または末端コドンを作製す
るためにいずれかの末端に置かれるさらなるアミノ酸が挙げられる。
【０１９１】 （ＶＩ．診断用アッセイ） 上記で説明したように、Ｆ５抗体またはＣ１抗体は、インビボ検出もしくはイ
ンビトロ検出および／またはｃ−ｅｒｂＢ−２の定量のため、従ってｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２の発現によって特徴付けられる癌の診断および／または局在化において使
用され得る。
【０１９２】 Ａ）ｃ−ｅｒｂＢ−２のインビボ検出 本発明のＦ５抗体およびＣ１抗体ならびに／またはキメラ分子は、ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２を保有する細胞（例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２陽性癌腫）のインビボ検出お
よび局在化のために使用され得る。そのような検出は、インビボで検出可能な標
識に連結したＦ５抗体またはＣ６抗体を含むキメラ分子を生物に投与することを
含む。そのような標識は、当業者に周知であり、そして以下が挙げられるがそれ
らに限定されない：Ｘ線またはＣＡＴスキャンによって検出され得る金またはバ
リウムのような電子密標識、シンチログラフィーを用いて検出され得る種々の放
射能標識、ならびに陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ）および磁気共鳴像（ＭＲＩ）
を使用して検出され得る種々の磁性物質および常磁性物質。Ｆ５抗体またはＣ１
抗体は、標識を、ｃ−ｅｒｂＢ−２保有細胞と会合させ、次いでこれは適切な検
出方法を用いて検出および局在化される。
【０１９３】 Ｂ）ｃ−ｅｒｂＢ−２のインビトロ検出 本発明のＦ５抗体およびＣ１抗体はまた、例えば、生物から得られた生物学的
サンプル中のｃ−ｅｒｂＢ−２のインビトロでの検出のために有用である。その
ようなサンプル中のｃ−ｅｒｂＢ−２の検出および／または定量は、ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２を過剰発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の存在もしくは非存在または量
を示す。
【０１９４】 ｃ−ｅｒｂＢ−２抗原は、患者由来の生物学的サンプル（例えば、患者由来の
細胞または組織サンプル）中で定量され得る。本明細書中で使用される生物学的
サンプルは、ｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現する細胞と相関付けされ、そしてそれ
を示し得るｃ−ｅｒｂＢ−２抗原濃度を含む生物学的組織または液体のサンプル
である。好ましい生物学的サンプルは、血液、尿、および組織生検を含む。
【０１９５】 特に好ましい実施態様において、ｃ−ｅｒｂＢ−２は、正常な乳房組織サンプ
ルまたは悪性の乳房組織サンプル由来の乳房組織細胞において定量される。サン
プルは、代表的にはヒト患者から採取されるが、このアッセイは、一般に哺乳動
物（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、およびブタ）、および最も詳細には霊
長類（例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、マカク、およびヒヒ）、ならびに
げっ歯類（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）に由来する細胞におい
てｃ−ｅｒｂＢ−２を検出するために使用され得る。
【０１９６】 組織または液体サンプルは、当業者に周知の標準的な方法によって、最も代表
的には生検または静脈穿刺によって、患者から単離される。サンプルは、必要な
場合に適切な緩衝液中での希釈によって必要に応じて前処理されるか、または所
望される場合に濃縮される。種々の緩衝液（例えば、リン酸塩、Ｔｒｉｓなど）
のうちの１つを生理的ｐＨにて使用する、多くの標準的な緩衝水溶液のいずれか
が使用され得る。
【０１９７】 Ｃ）アッセイ形式（ｃ−ｅｒｂＢ−２の検出または定量） １）免疫学的結合アッセイ ｃ−ｅｒｂＢ−２ペプチド（分析物）または抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体は、好ま
しくはｃ−ｅｒｂＢ−２ペプチドに特異的に結合する捕獲剤としてＦ５抗体また
はＣ１抗体を利用するイムノアッセイにおいて検出される。
【０１９８】 本明細書中で使用される場合、イムノアッセイは、分析物（ｃ−ｅｒｂＢ−２
）を特異的に結合する抗体（例えば、Ｆ５抗体またはＣ１抗体）を利用するアッ
セイである。イムノアッセイは、ｃ−ｅｒｂＢ−２分析物を単離、標的化、およ
び定量するための他の物理学的特性または化学的特性とは対照的なＦ５抗体また
はＣ１抗体への特異的な結合の使用によって特徴付けられる。
【０１９９】 ｃ−ｅｒｂＢ−２マーカーは、多くの十分に認識された免疫学的結合アッセイ
のいずれかを使用して検出および定量され得る（例えば、米国特許第４，３６６
，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同
第４，８３７，１６８号を参照のこと）。一般的なイムノアッセイの概説につい
ては、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第３７巻：Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｓａｉ編，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７版、Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅ
ｒｒ編（１９９１）もまた参照のこと）。
【０２００】 本発明のイムノアッセイは、例えば以下において概説されるようないくつかの
構成のいずれかにおいて実施される：Ｍａｇｇｉｏ（編）（１９８０）Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，
Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｔｉｊａｎ（１９８５）「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅ
ｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ
，前出；Ｃｈａｎ（編）（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ
；ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ（編）（１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａ
ｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ならびにＮｇｏ（編）（１９８８）Ｎｏｎ ｉｓｏｔｏｐ
ｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ。
【０２０１】 イムノアッセイは、頻繁には、捕獲剤および分析物によって形成される結合複
合体（すなわち、Ｆ５抗体−ｅｒｂＢ−２複合体またはＣ１抗体−ｅｒｂＢ−２
複合体）に特異的に結合し、そしてこれを標識する標識化剤を利用する。標識化
剤自体は、抗体／分析物複合体を含む部分のうちの１つであり得る。従って、標
識化剤は、標識されたｃ−ｅｒｂＢ−２ペプチドまたは標識されたＦ５抗体もし
くはＣ１抗体であり得る。あるいは、標識化剤は、必要に応じて、Ｆ５抗体また
はＣ１抗体、ｃ−ｅｒｂＢ−２ペプチド、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体／ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２ペプチド複合体に特異的に結合するか、あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２または
Ｆ５抗体もしくはＣ１抗体に共有結合的に連結されている改変された捕獲基（例
えば、ビオチン）に特異的に結合する第３の部分（例えば、別の抗体）である。
【０２０２】 １つの実施態様において、標識化剤は、Ｆ５抗体またはＣ１抗体に特異的に結
合する抗体である。そのような薬剤は、当業者に周知であり、そして最も代表的
にはＦ５抗体またはＣ１抗体が由来する特定の動物種の抗体（例えば、抗種抗体
）を特異的に結合する標識された抗体を含む。従って、例えば、捕獲剤がヒト由
来のＦ５抗体またはＣ１抗体である場合、標識剤はマウス抗ヒトＩｇＧ、すなわ
ちヒト抗体の定常領域に特異的な抗体であり得る。
【０２０３】 免疫グロブリン定常領域を特異的に結合し得る他のタンパク質（例えば、連鎖
球菌性プロテインＡまたはプロテインＧ）もまた、標識化剤として使用される。
これらのタンパク質は、連鎖球菌性細菌の細胞壁の正常な構成成分である。これ
らは、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域と強い非免疫原性反応性を示す。
一般には、Ｋｒｏｎｖａｌら（１９７３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１：１４
０１〜１４０６、およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．、１３５：２５８９〜２５４２を参照のこと。
【０２０４】 アッセイを通じて、試薬の各組み合わせの後に、インキュベーションおよび／
または洗浄工程が必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒〜数時間
、好ましくは約５分〜約２４時間で変化し得る。しかし、インキュベーション時
間は、アッセイ形式、分析物、溶液の容量、濃度などに依存する。このアッセイ
は、一定の範囲の温度（例えば、５℃〜４５℃）で行われ得るが、アッセイは、
通常には周囲温度で行われる。
【０２０５】 ａ）非競合的アッセイ形式 ｃ−ｅｒｂＢ−２を検出するためのイムノアッセイは、代表的には競合的また
は非競合的のいずれかである。非競合的イムノアッセイは、捕獲された分析物（
この場合においてはｃ−ｅｒｂＢ−２）の量が直接的に測定されるアッセイであ
る。例えば、１つの好ましい「サンドウィッチ」アッセイにおいて、捕獲剤（例
えば、Ｆ５抗体またはＣ１抗体）は、それが固定される固体基材に直接的または
間接的に結合される。これらの固定されたＦ５抗体またはＣ１抗体は、試験サン
プル（例えば、乳房腫瘍組織由来の生物学的サンプル）中に存在するｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２を捕獲する。次いで、このように固定されたｃ−ｅｒｂＢ−２は、標識を
保有する第２のｃ−ｅｒｂＢ−２抗体のような標識化剤によって結合される。あ
るいは、この第２の抗体は、標識を欠き得るが、今度は第２の抗体が由来する種
の抗体に特異的な標識された第３の抗体に結合され得る。遊離の標識された抗体
は、洗い流され、そして残りの結合した標識された抗体が検出される（例えば、
この標識が放射能である場合にはγ検出器を用いて）。当業者は、例えばサンプ
ル中のＦ５抗体またはＣ１抗体の存在、量、またはアビディティーが、固定され
たｃ−ｅｒｂＢ−２ペプチドへの結合によって測定される場合、分析物および捕
獲剤が、必要に応じて、上記のアッセイにおいて逆にされることを認識する。
【０２０６】 ｂ）競合的アッセイ形式 競合的アッセイにおいて、サンプル中に存在する分析物（例えば、ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２）の量は、サンプル中に存在する分析物によって捕獲剤（例えば、Ｆ５抗
体またはＣ１抗体）から置換された（または、競争して離れた（ｃｏｍｐｅｔｅ
ａｗａｙ））添加された（外因性の）分析物の量を測定することによって間接
的に測定される。１つの競合的アッセイにおいて、既知の量のｃ−ｅｒｂＢ−２
が、定量されていない量のｃ−ｅｒｂＢ−２とともに試験サンプルに添加され、
そしてこのサンプルは、捕獲剤（例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２を特異的に結合する
Ｆ５抗体またはＣ１抗体）と接触される。Ｆ５抗体またはＣ１抗体に結合する添
加されたｃ−ｅｒｂＢ−２の量は、この試験サンプル中に存在するｃ−ｅｒｂＢ
−２の濃度に逆比例する。
【０２０７】 Ｆ５抗体またはＣ１抗体は、固体基材上に固定され得る。Ｆ５抗体またはＣ１
抗体に結合したｃ−ｅｒｂＢ−２の量は、ｃ−ｅｒｂＢ−２−Ｃ６抗体複合体中
に存在するｃ−ｅｒｂＢ−２の量を測定することによって、あるいは残りの複合
体化していないｃ−ｅｒｂＢ−２の量を測定することによってのいずれかで決定
される。同様にサンプル中のｃ−ｅｒｂＢ−２の量が既知であり、そしてサンプ
ル中のＦ５抗体またはＣ１抗体の量またはアビディティーが決定される特定の実
施態様において、ｃ−ｅｒｂＢ−２は、捕獲剤になり（例えば、固体基材に固定
される）、そしてＦ５抗体またはＣ１抗体は、分析物になる。
【０２０８】 ｃ）非特異的結合の減少 当業者は、イムノアッセイにおいて、そして分析物の精製の間に非特異的結合
を低減させることが頻繁に望ましいことを理解する。このアッセイがｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２、Ｆ５抗体もしくはＣ１抗体、または固体基材上に固定された他の捕獲剤
を含む場合、その基材への非特異的な結合の量を最小化することが望ましい。そ
のような非特異的な結合を低減する手段は、当業者に周知である。代表的には、
この手段は、タンパク質様組成物でこの基材をコートすることを含む。詳細には
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチンのようなタンパク
質組成物が広範に使用される。
【０２０９】 ｂ）基材 上述のように、アッセイに依存して、種々の成分（ｃ−ｅｒｂＢ−２、Ｆ５も
しくはＣ１、またはｃ−ｅｒｂＢ−２もしくはＦ５もしくはＣ１に対する抗体を
含む）が、必要に応じて固体表面に結合される。種々の固体表面に生体分子を固
定するための多くの方法が、当該分野において公知である。例えば、固体表面は
、メンブレン（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイターディッシュ（例
えば、ＰＶＣ、ポリプロピレン、またはポリスチレン）、試験管（ガラスまたは
プラスチック）、ディップスティック（例えば、ガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレ
ン、ポリスチレン、ラテックスなど）、微量遠心分離管、またはガラスビーズ、
シリカビーズ、プラスチック性ビーズ、金属性ビーズ、もしくはポリマービーズ
であり得る。所望の成分は、共有結合され得るか、または非特異的結合を通じて
非共有結合的に付着され得る。
【０２１０】 広範な種々の有機ポリマーおよび無機ポリマー（天然および合成の両方）は、
固体表面のための材料として使用され得る。例示的なポリマーには、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリ
レート、ポリ（エチレンテレフタラート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニル
ブチレート）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコーン、ポリホ
ルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどが挙げら
れる。使用され得る他の材料には、紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド
、半導電性物質、セメントなどが挙げられる。さらに、タンパク質（例えば、ゼ
ラチン）、リポポリサッカリド、シリケート、アガロース、およびポリアクリル
アミドのようなゲルを形成する物質が使用され得る。いくつかの水相を形成する
ポリマー（例えば、デキストラン、ポリアルキレングリコール、または界面活性
剤（例えば、リン脂質、長鎖（１２〜２４炭素原子）アルキルアンモニウム塩な
ど））もまた適切である。固体表面が多孔性である場合、種々の孔サイズが、系
の性質に依存して使用され得る。
【０２１１】 表面を調製する際に、種々の特性を得るために複数の種々の物質（例えば、積
層品）が使用され得る。例えば、非特異的結合を回避し、共有結合を容易にし、
シグナル検出を増強するなどのために、タンパク質コーティング（例えば、ゼラ
チン）を使用し得る。
【０２１２】 化合物と表面との間の共有結合が所望される場合、表面は、通常には多官能性
であるか、または多官能化され得る。表面上に存在し、そして連結のために使用
され得る官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基
、ヒドロキシル基、メルカプト基などを含み得る。広範な種々の化合物を種々の
表面に連結する様式は周知であり、そして文献において十分に例示されている。
例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｉｃｈｉｒｏ Ｃｈｉｂａ
ｔａ、Ｈａｌｓｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８、およびＣｕ
ａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５ ３０５９（１９７０）
を参照のこと。
【０２１３】 共有結合に加えて、アッセイ成分を非共有結合するための種々の方法が使用さ
れ得る。非共有結合は、代表的には表面への化合物の非特異的な吸着である。代
表的には、表面は、第２の化合物でブロックされて、標識されたアッセイ成分の
非特異的結合を防止する。あるいは、表面は、１つの成分と非特異的に結合する
が、別の成分と有意には結合しないように設計される。例えば、コンカナバリン
Ａのようなレクチンを保有する表面は、化合物を含む炭水化物には結合するが、
グリコシル化を欠く標識されたタンパク質には結合しない。アッセイ成分の非共
有結合付着における使用のための種々の固体表面は、米国特許第４，４４７，５
７６号および同第４，２５４，０８２号に概説されている。
【０２１４】 ２）その他のアッセイフォーマット ｃ−ｅｒｂＢ−２ポリペプチドまたはＦ５もしくはＣ１抗体はまた、当業者に
周知の多くのその他の手段のいずれかによって検出および定量化され得る。これ
らは、分光光度法、Ｘ線撮影法、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散ク
ロマトグラフィーなどのような分析生化学的方法、および流体またはゲル沈降反
応、免疫拡散（シングルまたはダブル）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイなど
のような種々の免疫学的方法を含む。
【０２１５】 ウェスタンブロット分析および関連する方法もまた、試料中のｃ−ｅｒｂＢ−
２ペプチドおよびＦ５またはＣ１抗体の存在を検出および定量するために用い得
る。一般に、この技法は、分子量を基に、ゲル電気泳動により試験産物を分離す
ること、分離された産物を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィル
ター、ナイロンフィルーター、または誘導体化ナイロンフィルター）にトランス
ファーすること、およびこの試料を、ｃ−ｅｒｂＢ−２ペプチドまたは抗ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２抗体のいずれかを特異的に結合する抗体とインキュベートすることを
包含する。この抗体は、固体支持体上の目的の生物学的薬剤に特異的に結合する
。これらの抗体は直接標識されるか、あるいは、適切に抗ｃ−ｅｒｂＢ−２また
はｃ−ｅｒｂＢ−２のいずれかを結合する抗体に特異的に結合する標識抗体（例
えば、マーカー遺伝子に対する抗体がヒト抗体である場合、標識ヒツジ抗ヒト抗
体）を用いて次に検出される。
【０２１６】 その他のアッセイフォーマットは、特異的分子（例えば、抗体）を結合するよ
うに設計され、そしてカプセル化された試薬またはマーカーを放出するリポソー
ムを用いるリポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）を含む。次いで放出された化学
物質は、標準的技法に従って検出される（Ｍｏｎｒｏｅら（１９８６）Ａｍｅｒ
．Ｃｌｉｎ．Ｐｏｒｄ．Ｒｅｖ．５：３４〜４１を参照のこと）。
【０２１７】 （ＶＩＩ．薬学的組成物） 本発明のＦ５およびＣ１抗体およびキメラ分子は、予防的および／または治療
的処置のために、エアロゾルまたは経皮的にのような、非経口、局所、経口、ま
たは局在投与に有用である。薬学的組成物は、投与の方法に依存して種々の単位
用量形態で投与され得る。例えば、経口投与に適切な単位用量形態は、粉末、錠
剤、ピル、カプセルおよびロゼンジを含む。本発明の融合タンパク質および薬学
的組成物は、経口的に投与される場合，消化から保護されなければならないこと
が認識される。代表的には、これは、タンパク質を、それを酸加水分解および酵
素的加水分解に対して耐性にする組成物と複合体化することによるか、またはリ
ポソームのような適切な耐性キャリア中にこのタンパク質をパッケージングする
ことによるいずれかで達成される。消化からタンパク質を保護する手段は当該分
野で周知である。
【０２１８】 本発明の薬学的組成物は、静脈内投与または体腔または器官の管腔中への投与
のような非経口投与に特に有用である。投与のための組成物は、一般に、薬学的
に受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア中に溶解されたキメラ分子の溶
液を含む。例えば、緩衝化生理食塩水などの種々の水性キャリアが用いられ得る
。これらの溶液は無菌であり、そして一般に所望されない事項は含まない。これ
らの組成物は、従来の周知の滅菌技法により滅菌され得る。この組成物は、必要
に応じて、生理学的条件に近づくために、ｐＨ調整および緩衝化薬剤、毒性調整
剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、乳酸ナトリウムなどの薬学的に受容可能な補助物質を含み得る。これらの
処方物中のキメラ分子の濃度は非常に広範に変化し得、そして選択された投与の
特定の様式および患者の必要性に従って、主に、流体容量、粘度、体重などに基
づいて選択される。
【０２１９】 従って、静脈内投与のための代表的な薬学的組成物は、１日あたり患者あたり
約０．１〜１０ｍｇである。１日あたり患者あたり０．１から約１００ｍｇの用
量が、特に、体腔中または器官の管腔中へのような、血流中ではなく隔離された
部位に薬物が投与される場合、用いられ得る。非経口的に投与可能な組成物を調
製する方法は、当業者に公知または明らかであり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ
（１９８０）のような刊行物により詳細に記載されている。
【０２２０】 本発明の融合タンパク質またはそのカクテル（すなわち他のタンパク質ととも
に）を含む組成物は、治療処置のために投与され得る。治療的適用には、組成物
は、疾患、代表的にはｃ−ｅｒｂＢ−２陽性癌を患う患者に、この疾患およびそ
の合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するに十分な量で投与される。こ
れを達成するために適切な量は「治療的に有効な用量」として規定される。この
使用に有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の一般的状態に依存する。
【０２２１】 この組成物の単回または複数回投与が、患者によって必要なおよび耐えられる
用量および頻度に依存して投与され得る。いずれにしても、この組成物は、患者
を効率的に処置するために十分な量の本発明のタンパク質を提供する。
【０２２２】 本発明の細胞傷害性融合タンパク質の種々の使用のなかで、タンパク質の傷害
性作用により取り除かれ得る特定のヒト細胞により引き起こされる種々の疾患状
態が含まれる。１つの適用は、サイトトキシンに付着したＦ５またはＣ１抗体の
使用によるような、癌の処置である。
【０２２３】 別のアプローチは、細胞表面マーカー（レセプター）を結合するリガンドを用
いることを含み、そこでリガンド物質を保有するキメラ結合細胞は、ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２過剰発現腫瘍細胞と結合する。この分子のリガンド部分は、意図された使
用に従って選択される。このリガンドに対する標的として供し得るＴ細胞の膜上
のタンパク質は、ＦｃＩ、ＦｃＩＩおよびＦｃＩＩＩ、ＣＤ２（Ｔ１１）、ＣＤ
３、ＣＤ４およびＣＤ８を含む。標的として供し得るＢ細胞上に優先的に見出さ
れるタンパク質は、ＣＤ１０（ＣＡＬＬＡ抗原）、ＣＤ１９およびＣＤ２０を含
む。ＣＤ４５は、リンパ様細胞上に広範に存在する可能な標的である。リガンド
エフェクターを保有するキメラ分子に対する、これらおよびその他の可能な標的
リンパ球標的分子は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ、Ａ．Ｊ．Ｍ
ｃＭｉｃｈａｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９
８７）に記載されている。当業者は、上記のような、なおその他の型の細胞上で
発現されたレセプターに結合するリガンドエフェクターが選択され得ることを理
解し、これには、例えば、上皮増殖因子レセプターなどのような、膜糖タンパク
質またはリガンドまたはホルモンレセプターがある。
【０２２４】 （ＶＩＩＩ．診断または処置のためのキット） 別の実施態様では、本発明は、腫瘍の処置のため、またはｃ−ｅｒｂＢ−２を
過剰発現する細胞の検出のためのキット提供する。代表的には、キットは、本発
明のキメラ分子（例えば、Ｆ５および／またはＣ１抗体−標識、Ｆ５および／ま
たはＣ１抗体−サトイトキシン、Ｆ５および／またはＣ１抗体−リガンドなど)
を含む。さらに、このキットは、必要に応じて、キメラ分子の使用の手段を開示
する指示（すなわちプロトコル）を含む指令事項を含み得る（例えば、サイトト
キシンとして、腫瘍細胞の検出のため、免疫応答を増強するためなど）。代表的
には、指令事項は、書かれたかまたはプリントされた事項を含むが、これらに限
定されない。このような指令書を保存およびエンドユーザーにこれらを連絡し得
る任意の媒体が本発明により意図される。このような媒体は、電気的保存媒体（
例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例えば
ＣＤ ＲＯＭ）などを含むが、これらに限定されない。このような媒体は、この
ような指令事項を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。
【０２２５】 キットはまた、キットが設計される特定の適用を容易にするさらなる成分を含
み得る。従って、例えば、キットが、エフェクター分子が検出可能な標識である
キメラ分子を含む場合、キットは、この標識を検出する手段をさらに含み得る（
例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセッ
ト、ヒツジ抗ヒト抗体のような適切な二次標識、など)。キットは、特定の方法
の実施に慣用的に用いられる緩衝液およびその他の試薬をさらに含み得る。この
ようなキットおよび適切な内容物は当業者に周知である。
【０２２６】 （実施例） 以下の実施例は、請求項に記載の発明を例示するために提供され、制限するも
のではない。
【０２２７】 （実施例１：１０9〜１０11のメンバーを含む、非免疫ヒトＦａｂファージ抗
体ライブラリーの作製） 先の１０7メンバーのファージディスプレイライブラリーの操作は、２つの主
要な制限を示した：１）Ｆａｂの発現レベルは、特徴付けのために適切な材料を
産生するには低すぎた、および２）このライブラリーは比較的不安定である。こ
れらの制限は、ファージベクター中にライブラリーを作製し、そしてｃｒｅ−ｌ
ｏｘ組換え系の使用の結果である。従って、本発明者らは、このプロジェクトの
最良のアプローチは、ファージミドベクターを用いて非常に大きなｓｃＦｖライ
ブラリーを作製することであったと決定した。目的は、本発明者らの先の３．０
×１０7メンバーｓｃＦｖライブラリーより少なくとも１００倍大きいライブラ
リーを生成することであった。採用されたアプローチは、別々のレプリンコン上
にＶHおよびＶLライブラリーをクローン化し、これらを重複伸長によりスプライ
シングすることによりｓｃＦｖ遺伝子レパートリー中に組み合わせ、そしてこの
ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーをファージディスプレイベクターｐＨＥＮ１中にク
ローン化することであった。ヒト末梢血リンパ球および脾臓ＲＮＡを、ＩｇＭ重
鎖定常領域そして、κおよびλ軽鎖定常領域プライマー、ならびに合成された第
１鎖ｃＤＮＡでプライムした。第１鎖ｃＤＮＡを、ＶＨ ＶκｋおよびＶλ遺伝
子レパートリーのＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。
【０２２８】 このＶH遺伝子レパートリーを、ベクターｐＵＣ１１９Ｓｆｉ−Ｎｏｔ中に、
Ｎｃｏ１−ＮｏｔＩフラグメントとしてクローン化し、８．０×１０8メンバー
のライブラリーを作製した。このライブラリーを、ＰＣＲフィンガープリンティ
ングにより多様化した。一本鎖リンカーＤＮＡを、ＰＣＲおよびベクターｐＨＥ
ＮＩＸｓｃＦｖ中へのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてクローン化された
レパートリーを用いて、ＶL遺伝子レパートリー上にスプライスし、７．２×１
０6メンバーのライブラリーを作製した。このＶHおよびＶL遺伝子レパートリー
は、それらの個々のベクターから増幅され、そしてｓｃＦｖ遺伝子レパートリー
を作製するためにＰＣＲを用いて一緒にスプライスされた。このｓｃＦｖ遺伝子
レパートリーは、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてベクター中にクローン
化し、７．０×１０9メンバーのｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーを作製した
。このライブラリーは、ＢｓｔＮ１フィンガープリントにより測定したとき、多
様であった。
【０２２９】 このライブラリーの質を確認するため、ファージを調製し、そして１４の異な
るタンパク質抗原について選択した。結果を表１に示す。ｓｃＦｖ抗体が、選択
に用いたすべての抗原に対して、抗原あたり単離された３〜１５（平均８．７）
の特有のｓｃＦｖを有して得られた（表１）。
【０２３０】
【表１】 これを、より小さなｓｃＦｖライブラリーから得られた結果と都合良く比較する
（選択に用いた抗原の７０％のみに対して得られた１〜数個のバインダー）。４
つの抗ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｃＦｖおよび４つの抗Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｓｃＦｖ
の親和性を、ＢＩＡコア中の表面プラスモン共鳴を用いて測定し、そして抗ｃ−
ｅｒｂＢ−２ｓｃＦｖについて４．０×１０-9Ｍ〜２．２×１０-10Ｍ、および
抗Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｓｃＦｖについて２．６×１０-8Ｍ〜７．１５×１０-8 Ｍの範囲であることを見出した（表２）。ｓｃＦｖは、選択に用いた抗原に高度
に特異的であった（図２）。このライブラリーはまた、抗原の複合体混合物につ
いて首尾良く選択され得る。
【０２３１】
【表２】 例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ基本小体（クラミジア疾
患の原因生物）に関する選択は、クラミジアを特異的に認識する７つを生じた（
表１および図３）。このｓｃＦｖは、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ウェスタンブロッ
ティング、エピトープマッピングおよび免疫沈降を含む、多くの免疫学的アッセ
イにおいて首尾良く用い得る。各抗原に対する結合抗体の数、および結合性ｓｃ
Ｆｖの親和性は、最良のファージ抗体ライブラリーから得られた結果に匹敵する
（表３）。従って、このライブラリーは、任意の抗原に対するヒト抗体のパネル
の供給源として、少なくとも２次ネズミ応答に等価な親和性で確立された。
【０２３２】
【表３】 これらの実験は、高い複雑度のヒトｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーの作製
から、高親和性ヒトｓｃＦｖのパネルが、任意の精製抗原に対して生成され得る
ことを示す。このようなライブラリーは、新規な細胞表面マーカーを同定するた
めに細胞の表面をプローブするために理想的である。
【０２３３】 （実施例２：レセプター媒介エンドサイトーシスおよび引き続く回復による細
胞中へのｓｃＦｖの取り込み） 上記の７．０×１０9メンバーのｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーを、悪性
の乳腫瘍細胞株ＭＢ２３１およびＺＲ−７５−１に対して、正常乳細胞株ＨＢＬ
１００に対するネガティブ選択とともにまたはなしの両方で選択した。同様の結
果が、上記のセクション中で記載されたように得られた。悪性を非悪性細胞株か
ら識別し得なかったｓｃＦｖが単離された。
【０２３４】 選択の特異性を増加するために、ファージ結合細胞表面レセプターが、レセプ
ター媒介エンドサイトーシスにより細胞中に取り込まれ得、次いで、この細胞を
溶解することにより細胞から回収され得ることが仮定された。これは、１）ファ
ージは、レセプター媒介エンドサイトーシスによりインターナライズされ得る、
および２）ファージは、リソソーム分解に先立って細胞内から感染状態で回収さ
れ得ると仮定された。インターナライズされたファージ抗体を選択する能力は、
２つの主要な利点を有する：１）インターナリゼーションし得るレセプターに結
合する抗体の同定、および２）選択プロセスにおける付加されたレベルの特異性
である。インターナライズされる抗体の同定は、インターナリゼーションが必須
である多くの標的化治療アプローチに高度に有用であり得る（例えば、イムノト
キシン、標的化リポソーム、標的化遺伝子治療ベクターおよびその他）。
【０２３５】 Ａ）Ｆ５またはＣ１ファージのレセプター媒介インターナリゼーション 原理の証明を決定するために、本発明者らは、Ｃ６．５ファージおよびＣ６．
５二価抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）ファージ（同時係属中の出願ＵＳＳＮ０８／６６
５，２０２を参照のこと）を利用した。本発明者らは、先に、Ｃ６．５ｓｃＦｖ
がインターナライズするが、速度が遅く、しかも、Ｃ６．５二価抗体が幾分より
良好にインターナライズすることを示した（おそらくそれがレセプター二量体化
を引き起こすため）。Ｃ６．５ファージ、Ｃ６．５二価抗体ファージまたは無関
連の抗Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍファージを、ＳＫＢＲ３細胞（ｃ−ｅｒｂＢ２発現乳
腫瘍細胞株）と、３７℃または４℃でインキュベートし、そして非インターナラ
イズファージをＰＢＳおよび低ｐＨグリシン緩衝液を用いた連続的洗浄により除
去した。次いで、細胞を、透過処理し、そしてビオチン化抗Ｍ１３抗体、次いで
ストレプトアビジンＴｅｘａｓ Ｒｅｄを添加した。次いで、細胞を共焦点顕微
鏡を用いることにより調査した。Ｃ６．５ファージおよびＣ６．５二価抗体ファ
ージの両方が、細胞質内に観察された。約１％の細胞がインターナライズされた
Ｃ６．５ファージを有し、そして２０％の細胞が、インターナライズされたＣ６
．５二価抗体ファージを有していた。抗Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍファージのインター
ナリゼーションはなかった。
【０２３６】 感染性ファージが特異的に摂取され、そして細胞内から回収され得るか否かを
決定するために、Ｃ６．５ファージまたはＣ６．５二価抗体ファージを、３７℃
でＳＫＢＲ３細胞とインキュベートした。非結合ファージは、ＰＢＳを用いた洗
浄により除去され、そして細胞表面に結合したファージは、低ｐＨグリシンを用
いた２回の洗浄により溶出した。次いで細胞を溶菌し、そして各フラクション（
最初および第２番目のグリシン洗浄液および細胞質フラクション）を用いてＥ．
ｃｏｌｉ ＴＧ１を感染した。抗Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍファージより２０倍（Ｃ６
．５）または３０倍（Ｃ６．５二価抗体）多いファージが細胞表面に結合した（
グリシン１洗浄）（表４）。第２番目のグリシン洗浄の後、細胞表面からの感染
性性ファージの力価は減少し、洗浄が表面結合ファージを除去するため効果的で
あったことを示す（表４）。細胞溶解の後、力価は、第２番目のグリシン洗浄か
ら、１０倍（Ｃ６．５ファージ）または５０倍（Ｃ６．５二価抗体ファージ）よ
り多く増加した。本発明者らは、この力価が細胞内部から回収されたファージを
表すと考える。
【０２３７】 細胞内部からのファージの回収量は、ＥｒｂＢ２結合Ｃ６．５について、抗ボ
ツリヌスファージより１００倍高く、Ｃ６．５二価抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）ファ
ージより２００倍高い（表４）。
【０２３８】
【表４】 まとめると、この結果は、以下を示す：１）ファージ結合細胞表面レセプター
は、細胞によって取り込まれ得、そして感染性ファージは、細胞質から回収され
得る。取り込みの量は、非結合ファージの取り込みより有意により多く、そして
１００〜２００倍の差異が、ライブラリーからの富化を可能にする範囲内で良好
である。この結果からわからないことは、ファージ抗体がレセプター媒介インタ
ーナリゼーションを媒介するか否か、またはそれらが単に、膜代謝回転によって
結合後に取り込まれるか否か、ということである。
【０２３９】 （Ｂ）ファージ抗体ライブラリーからのインターナライズする抗体の選択およ
び特徴付け） 上記の結果は、本発明者らを、上記のファージ抗体ライブラリーの選択を試み
、インターナライズされた新規なファージ抗体を同定するよう駆り立てた。ファ
ージ抗体をライブラリーからレスキューし、そしてＳＫＢＲ３細胞上で選択した
。選択のために、ファージを３７℃で細胞と共にインキュベートし、非結合ファ
ージを、ＰＢＳで細胞を洗浄することによって除去し、そして細胞表面抗原に結
合したファージを、低ｐＨグリシンでの連続的な洗浄によって除去した。次いで
、細胞を、インターナライズされたファージを遊離させるために溶解し、そして
溶解物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１を感染させ、次回の選択のためのファ
ージを調製した。３回の選択を行った。各回の選択由来の１００のクローンを、
ＳＫＢＲ３細胞への結合について、およびＥｒｂＢ２細胞外ドメインへの結合に
ついて、ＥＬＩＳＡによって分析した。本発明者らは、ＳＫＢＲ２細胞は高レベ
ルで発現することが公知であり、そしてＥｒｂＢ２はインターナライズされるこ
とが公知であるレセプターであることから、おそらく、ＥｒｂＢ２に対する結合
物を獲得したようであると仮定した。各回の選択後、細胞質から回収したファー
ジの力価は増加した（表５）。３回目の後、クローンの４５％が、ＳＫＢＲ３細
胞結合に陽性であり、そして１７％が、ＥｒｂＢ２に結合した（表５）。
【０２４０】
【表５】 独特な結合物の数を推定するため、ＥＬＩＳＡ陽性クローンからｓｃＦｖ遺伝
子をＰＣＲ増幅し、ＢｓｔＮ１での消化によって、フィンガープリントした。２
個の独特な制限パターンを同定した。ｓｃＦｖ遺伝子を配列決定し、そして２つ
の独特なＥｒｂＢ２結合ｓｃＦｖを同定した。ＥｒｂＢ２に結合しなかったＳＫ
ＢＲ３ ＥＬＩＳＡ陽性クローンの同様の分析によって、さらなる１１の独特な
ｓｃＦｖを同定した。
【０２４１】 ファージ抗体がＳＫＢＲ３細胞に特異的であることを確証するために、ファー
ジを、各独特なクローンから調製し、そしてＳＫＢＲ３細胞（高ＥｒｂＢ２発現
細胞（ｅｘｐｒｅｓｓｅｒ））および２つの他の上皮腫瘍細胞株（ＳＫ−ＯＶ−
３（中程度のＥｒｂＢ２発現細胞）およびＭＣＦ７（低ＥｒｂＢ２発現細胞））
ならびに正常乳房細胞株（ＨＳ５７８Ｂ）への結合について分析した。各独特な
クローンは、腫瘍細胞株を特異的に染色したが、正常乳房細胞株は染色しなかっ
た。
【０２４２】 ＳＫＢＲ３細胞およびＭＣＦ７細胞を、ファージ抗体Ｃ６．５（陽性コントロ
ール）、３ＴＦ５および３ＧＨ７と共にインキュベートした。後者２つのクロー
ンは、３ＴＦ５結合ＥｒｂＢ２および３ＧＨ７に結合する抗原（未知）を用いて
、ライブラリーから単離した。３つ全てのファージ抗体は、強くＳＫＢＲ３Ｄ細
胞（選択細胞株でかつ高ＥｒｂＢ２発現細胞）を染色する。Ｃ６．５ファージは
、弱くＭＣＦ７細胞（低ＥｒｂＢ２発現細胞）を染色する。ライブラリー由来の
抗ＥｒｂＢ２クローン３ＴＦ５は、３ＧＨ７同様、Ｃ６．５よりかなり強くＭＣ
Ｆ７細胞を染色する。
【０２４３】 ＳＫＢＲ３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＣＦ７およびＨＳＴ５７８細胞を、ネイティ
ブの精製ｓｃＦｖ ３ＴＦ５および３ＧＨ７を使用して研究した。これらの研究
のために、ｓｃＦｖ遺伝子を、ｓｃＦｖのＣ末端にヘキサヒスチジンタグを融合
するベクター内へ、サブクローニングした。次いで、ｓｃＦｖを発現し、細菌ペ
リプラズムから収集し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって
精製した。２つのｓｃＦｖは、ＳＫＢＲ３細胞を強く染色し、そして正常乳房細
胞株ＨＳＴ５７８を染色しない。低いＥｒｂＢ２発現細胞株ＭＣＦ７については
わずかな染色、およびＳＫ−ＯＶ−３細胞（中程度のＥｒｂＢ２発現細胞）につ
いては中程度の染色である。一般に、染色の強度は、ファージによって確認され
るよりも低い。このことは、ファージ染色のための二次抗体は、相当なシグナル
増幅を生じる主要外被タンパク質（２５００コピー／ファージ）を認識するので
予想できることである。
【０２４４】 抗ＥｒｂＢ２ファージ抗体３ＴＦ５をさらに研究して、それが実際にインター
ナライズされるか否かを決定した。この抗体を、そのインターナリゼーションが
ＥｒｂＢ２結合Ｃ６．５と比較され得るので、最初の研究のために選択した。５
．０×１０11の３ＴＦ５またはＣ６．５ファージを、ＳＫＢＲ３細胞と共に、３
７℃または４℃でインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、３ＴＦ５ファージは
、Ｃ６．５ファージよりも強く細胞を染色した。低ｐＨグリシンでの洗浄後、共
焦点顕微鏡によって、３ＴＦ５ファージは、９５％よりも多くの細胞によってイ
ンターナライズされる一方、Ｃ６．５は、数パーセントの細胞にしかインターナ
ライズされないことが明らかになった。いずれの抗体も４℃でのインキュベーシ
ョンは、インターナリゼーションを導かなかった。
【０２４５】 ネイティブの精製３ＴＦ５ ｓｃＦｖを、同様に分析し、そしてこれもまた、
ＳＫＢＲ３細胞によって効率的にインターナライズされた。ネイティブ３ＴＦ５
ｓｃＦｖは、ゲル濾過によって決定されるように、認知し得る二量体化または
凝集を伴わず、モノマーとしてのみ存在した。
【０２４６】 これらの実験は、ファージ抗体が細胞によってインターナライズされ得、そし
て細胞質から回収され得ることを実証する。インターナライズする細胞表面レセ
プターに結合するファージは、非結合ファージの１００倍より多く富化され得る
。この富化のレベルは、細胞表面上で選択することによって達成される富化より
も多い。本発明者らは、このアプローチをライブラリー選択に適用し、そしてＳ
ＫＢＲ−３細胞に結合し、インターナライズされるファージ抗体を単離した。こ
れらの抗体のいくつかは、ＥｒｂＢ２に結合するが、純粋な抗原上で選択するこ
とによって生成された抗体（例えば、Ｃ６．５）よりも、より効率的にインター
ナライズされる。ＳＫＢＲ−３および他の乳房腫瘍細胞株に特異的に結合し、そ
して効率的にインターナライズされる、他の多くの抗体を単離した。これらの抗
体は、腫瘍の標的化、および潜在的な、新規なインターナライジング腫瘍細胞レ
セプターを同定するために有用であることを証明するはずである。
【０２４７】 （実施例３：変異ファージ抗体ライブラリーの作製および適切な乳房腫瘍細胞
株上での選択による、所望の結合特性を有する抗体フラグメントの親和性の増加
） ファージディスプレイは、従来のハイブリドーマ技術を使用して産生され得な
い親和性を有する抗体を産生するための可能性を有する。超高親和性ヒト抗体フ
ラグメントは、優れた腫瘍貫入、長期の腫瘍滞留および循環からの迅速なクリア
ランスを生じ得、高い特異性を導く。従って、本発明者らは、超高親和性ヒト抗
体フラグメントを生成するための方法論を開発するために一連の実験を行った。
実験を、以下の問題に答えるために行った：１）より低い抗体結合物のバックグ
ラウンドの中から、希少なより高い親和性のファージ抗体について選択およびス
クリーニングするための最も効果的な方法は何であるか；２）最も高い親和性の
ファージ抗体の選択を確実にするために、抗原から結合ファージを取り出すため
の最も効果的な手段は何であるか；３）変異ファージ抗体ライブラリーを作製す
るための最も効果的な技術（ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発）は何
であるか；４）抗体分子のどの領域が、抗体フラグメントの親和性を最も効果的
に増加するために、変異誘発のために選択されるべきか。
【０２４８】 これらの問題に答えるために、本発明者らは、ヒトｓｃＦｖ Ｃ６．５を研究
した。このヒトｓｃＦｖ Ｃ６．５は、腫瘍抗原ＥｒｂＢ−２（３２）の細胞外
ドメイン（ＥＣＤ）に、１．６×１０-8ＭのＫdおよび６．３×１０-3Ｓ-1のＫo ff で、結合する（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，１：６３−７１）。Ｃ６．５の単離および特徴付けは、以下に間単に記載さ
れ、同時継続出願ＵＳＳＮ ０８／６６５，２０２号に詳細に記載される。
【０２４９】 インビボにおける優れた腫瘍：正常組織の比にもかかわらず、Ｃ６．５の定量
的送達は、放射免疫療法を使用して動物において腫瘍を治癒するのに適切ではな
い（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６３
−７１）。腫瘍への抗体の定量的送達を改善するために、Ｃ６．５の親和性を増
加した。最初に、示差的なＥ．ｃｏｌｉまたは宿主株毒性での増殖よりむしろ、
親和性に基づいてファージ抗体の選択を可能にする技術を開発した（Ｓｃｈｉｅ
ｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３；Ｓｃｈｉｅｒら
（１９９６）Ｇｅｎｅ １６９：１４７−１５５；Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）
Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７：９７
−１０５）。次いで、本発明者らは、親和性の最大の増分を達成するためにｓｖ
Ｆｃ遺伝子のどの位置を変異させるかを決定した（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３；Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｇｅ
ｎｅ；Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５
６７）。ランダム変異誘発は、抗原と接触するアミノ酸を含む相補性決定部位（
ＣＤＲ）の部位特異的変異誘発と同程度の親和性の増大を生じなかった。ＣＤＲ
の多様化から得られた結果は、以下のことを示した：１）親和性の最大の増大は
、結合ポケット（ＶLおよびＶH ＣＤＲ３）の中心に位置するＣＤＲを変異させ
ることにより達成された；２）ＣＤＲ残基の半分は、ｓｃＦｖにおける構造的役
割を有し、そして変異した場合、野生型のように復帰する；および３）これらの
構造的残基は、相同な原子結晶構造上でのモデリングによって、ライブラリーの
構築の前に同定され得る。これらの観察は、ホモロジーモデリングによって構造
的役割を有すると仮定された残基を保存して、変異が、ランダムにＶHおよびＶL ＣＤＲ３内に連続的導入される、抗体の親和性を増加するための一般的なスト
ラテジーの開発を導いた（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２６３：５５１−５６７）。このアプローチを使用して、Ｃ６．５の親和性は、
１．３×１０-11ＭのＫd（同上）へ、１２００倍に増加した。
【０２５０】 体内分布研究によって、２４時間目での腫瘍の親和性とｓｃＦｖ／グラムの注
入用量パーセント（％ＩＤ／ｇ）との間の密接な相関が明らかになった（Ａｄａ
ｍｓら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：４８５−４９０）。最大程度
の腫瘍滞留が、125Ｉ−Ｃ６ＭＬ３−９（１．４２％ＩＤ／ｇ、Ｋd＝１．０×１
０-9Ｍ）で観察された。有意により少ない腫瘍滞留が、125Ｉ−Ｃ６．５（０．
８０％ＩＤ／ｇ、Ｋd＝１．６×１０-8）およびＣ６Ｇ９８Ａ（０．１９％ＩＤ
／ｇ、Ｋd＝３．２×１０-7Ｍ）で達成された。腫瘍：正常器官の比もまた、親
和性の差異を反映した（例えば、２４時間目でのＣ６ＭＬ３−９、Ｃ６．５およ
びＣ６Ｇ９８Ａについて、それぞれ、腫瘍：血液の比が１７．２、１３．３、３
．５および２．６、ならびに腫瘍：肝臓の比が２６．２、１９．２、４．０およ
び３．１）。より高い親和性のｓｃＦｖの研究は、継続中である。この結果は、
ハイブリドーマ技術からは達成可能でない値まで抗体親和性を増加する本研究者
らの能力を実証し、腫瘍標的化における親和性の重要性を確証した。
【０２５１】 （実施例４：Ｃ６．５ベースの乳癌治療の前臨床開発） Ｃ６．５ベースの乳癌治療を開発するために、２つのアプローチを共同的に追
求した。１つの共同研究において、Ｃ６．５ベースの分子を、放射免疫療法のた
めに操作している。定量的腫瘍送達および抗体フラグメントの滞留を増加するた
めに、二量体ｓｃＦｖ「二価抗体」を、ＶHおよびＶLドメインの間のリンカーを
１５アミノ酸から５アミノ酸に短縮することによって作製した。続いて、対合形
成が、２つの異なる鎖の相補的ドメイン間で生じ、２つの結合部位で、安定な非
共有結合した二量体を作製する。インビトロで、Ｃ６．５のＶ遺伝子から生成さ
れる二価抗体は、Ｃ６．５ ｓｃＦｖに比べて、ＳＫ−ＯＶ−３細胞の表面上で
の有意により高い明らかな親和性およびより長い滞留を有する（Ｔ1/2＞５時間
対５分）（Ａｄａｍｓら（１９９８）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．）。Ｃ６．
５二価抗体の体内分布研究は、２４時間目で６．５％ＩＤ／ｇ（対して、Ｃ６．
５ ｓｃＦｖについては、たった１％ＩＤ／ｇ）を示した。二価抗体の滞留を７
２時間にわたって試験して、そして累積曲線下面積（ＡＵＣ）値を測定した場合
、得られる腫瘍：器官のＡＵＣ比は、他の一価または二価のｓｃＦｖ分子につい
て報告された比より大きかった。これらの分子の治療能力は、ヌードマウスにお
ける放射免疫療法研究において試験されている。Ｃ６．５ベースの分子のインビ
ボでの特徴付けは、正式には技術目的の１つではないので、本発明者らは、Ｃ６
．５およびＣ６．５ベースの二価抗体の親和性変異体を使用し続け、抗体親和性
、大きさおよび結合価の間の関係、ならびにＮＩＨ Ｒ０１ １ ＣＡ６５５５
９−０１Ａ１の一部としての特異的腫瘍標的化を研究した。
【０２５２】 第二の共同研究において、Ｃ６．５ベースの分子を、ドキソルビシン含有ステ
ルス（ｓｔｅａｌｔｈ）リポソームをＥｒｂＢ２発現乳癌に対して標的するため
に使用している（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
３６：６６−７５）。ｓｃＦｖのリポソームへの化学的結合を促進するために、
Ｃ６．５遺伝子を、ｓｃＦｖのＣ末端で遊離のシステイン残基の付加を生じるＥ
．ｃｏｌｉ発現ベクター内へサブクローニングした。精製Ｃ６．５ｃｙｓ ｓｃ
Ｆｖを、リポソームに結合し、インビトロでの取り込みを、ＳＫＢＲ３細胞を使
用して決定した。全取り込み量は、６時間目で３．４ｍｍｏｌリン脂質／１０6
細胞であり、取り込みの７０％がインターナライズされた。この取り込みは、Ｇ
ｅｎｅｎｔｅｃｈの４Ｄ５抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ’を使用して達成された取り込み
に匹敵する。非結合型リポソームの取り込みは、存在しなかった。結果は、Ｃ６
．５がＥｒｂＢ２エピトープに結合し、ＥｒｂＢ２エピトープが、ハイブリドー
マ（４Ｄ５）から産生される抗体の最良のインターナリゼーションに匹敵する速
度でのインターナリゼーションを生じることを示す。ｓｃｉｄマウスにおけるイ
ンビボ治療研究は、Ｃ６．５標的化リポソームが、非標的型リポソーム、または
非標的型リポソームおよび全身性４Ｄ５抗体との組み合わせよりも、より大きな
程度の腫瘍の緩解、およびより高い治癒比率を引き起こすことを示した。
【０２５３】 （結論） 本明細書中に記載された実験は、マウスの免疫化によって産生される抗体の親
和性に匹敵する親和性を有する精製抗原に対するヒト抗体のパネルを提供し得る
、大量の（７．０×１０9メンバー）ファージ抗体ライブラリーが作製されたこ
とを確立する。細胞表面レセプターに結合するファージ抗体は、細胞によってイ
ンターナライズされ、そして細胞内で感染性状態に回復され得る。非インターナ
ライズ抗体を１００倍より高く超えるインターナライズするファージ抗体の富化
を可能にする方法論が開発された。次いで、これらの方法論を適用して、ＳＫＢ
Ｒ−３細胞上のインターナライズするレセプターに結合する新規なｓｃＦｖ抗体
を選択した。これらの抗体のいくつかは、ＥｒｂＢ２に結合するが、Ｃ６．５ベ
ースのｓｃＦｖよりも効率的にインターナライズされる。より多くの抗体は、未
知のインターナライズするレセプターに結合する。これらｓｃＦｖの全ては、Ｓ
ＫＢＲ−３細胞または関連する腫瘍細胞株に特異的に結合する。これらの結果は
、この選択アプローチが、１つの細胞型（悪性）と別の細胞型（非悪性）を区別
し得る抗体を生成するための強力なアプローチであることを示す。さらに、本発
明者らは、結合について選択するだけでなく、機能（インターナリゼーション）
について選択することも可能であることを実証した。近々、本発明者らはさらに
、単離した抗体を特異性に関して特徴付けし、そしてＥｒｂＢ２結合ｓｃＦｖの
場合においては、親和性に関して特徴付けする。より長期的には、本発明者らは
、以下のためにこれらの試薬を使用する：１）インターナリゼーション割合に対
する親和性および結合価の効果を研究する；そして２）免疫沈降を使用して結合
された抗原を同定する。これらの結果は、有用な治療標的である新規なインター
ナライズする腫瘍細胞表面レセプターの同定をおそらく導く。このアプローチが
有用であると証明された場合、本発明者らは、このアプローチを原発性腫瘍細胞
およびＤＣＩＳに対して適用することを予定である。本発明者らはまた、リポソ
ーム標的化について３ＴＦ５（Ｃ６．５より早くインターナライズされるＥｒｂ
Ｂ２結合ｓｃＦｖ）を評価するつもりである。おそらく、３ＴＦ５は、Ｃ６．５
より効果的である。
【０２５４】 さらに、これらの実験は、インビトロでの抗体親和性を、インビボでこれまで
に達成されなかった値まで増加させるための方法論を実証する。本発明者らは、
これらの方法論を適用し、新規なＥｒｂＢ２結合ｓｃＦｖを生成した。
【０２５５】 （実施例５：Ｆ５およびＣ１のエピトープマッピング） ＳＫＲＢ３細胞によってインターナライズされる２つの独特なファージ抗体を
同定した（上記のＦ５およびＣ１）。これらのファージは、同じライブラリーを
組換えＥｒｂＢ２について選択する場合、いずれも単離されなかった。この理由
を決定するために、Ｆ５のＫd（３．２×１０-7Ｍ）およびＣ１のＫd（Ｋd＝１
．０×１０-6Ｍ）を測定した。これらのＫdは、組換えＥｒｂＢ２に対して選択
された４つのｓｃＦｖについて測定したＫdより有意に高かった（Ｋd＝０．１〜
０．６５ｎＭ）。より高いＫdのインターナライズするファージ抗体は、組換え
ＥｒｂＢ２に対する選択について、より低いＫdのインターナライズしないファ
ージ抗体と競合するはずであり、そしておそらく選択プロセスの間に損失された
。モノマーとしてインターナライズされる抗体は、おそらく稀であり、そしてラ
イブラリー中にはより高い親和性のファージ抗体より、より低い親和性のファー
ジ抗体がより多く存在するので、インターナライズする抗体は、高いＫdの抗体
であることは驚くことではない。インターナライズされる抗体はおそらく稀であ
るので、本発明者らは、Ｆ５およびＣ１が、おそらく同じエピトープを認識する
と仮定した。このことは、競合アッセイを使用して確認した（図２）。従って、
仮定したように、Ｆ５およびＣ１は同じエピトープを認識し、そしてＣ６．５と
は違うエピトープを認識する。同じアッセイを使用して、本発明者らは、Ｆ５お
よびＣ１が、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５（ヒト化された場合
、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎとして公知である）とは違うエピトープを認識することを
確証した。
【０２５６】 本明細書中に記載される実施例および実施態様は、単なる例示目的であり、こ
れらを考慮して種々の改変または変更が当業者に示唆されるが、これらは本出願
の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解され
る。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目
的のためにその全体が参考として本明細書に援用される。
【０２５７】 （配列表） （配列番号１：ｓｃＦｖ Ｆ５配列）
【０２５８】
【表６】 （配列番号２：ｓｃＦｖ−Ｃ１配列）
【０２５９】
【表７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、大ヒトｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーの構築のための方法を示す
。ライブラリー構築の戦略は、ｓｃＦｖ遺伝子アセンブリの効率を増加するため
、およびアセンブルされたｓｃＦｖ遺伝子のクローニングの効率を増加する両方
のためにライブラリー構築の個々の工程を最適化することを含んだ。（Ａ）最初
に、リンパ球からのｍＲＮＡを用いて、ＲＴＰＣＲによりＶHおよびＶL遺伝子レ
パートリーを生成し、これらを、異なるベクター中にクローン化し、それぞれ、
８．０×１０8および７．２×１０6メンバーのＶHおよびＶL遺伝子ライブラリー
を作製した。このクローン化Ｖ遺伝子ライブラリーは、ｓｃＦｖアセンブリのた
めの安定かつ無限のＶHおよびＶL遺伝子の供給源を提供した。ペプチド（Ｇ4Ｓ
）3をコードするＤＮＡを、ＶLライブラリーの５’末端中に取り込んだ。これは
、２つのＤＮＡフラグメントをスプライシングするＰＣＲによるｓｃＦｖ遺伝子
の生成を可能にした。先に、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーは、ＶH、ＶL、および
リンカーＤＮＡからなる、３つの別のＤＮＡフラグメントからアセンブルされた
。（Ｂ）ＶHおよびＶL遺伝子レパートリーは、別のライブラリーから増幅され、
そして重複伸長ＰＣＲを用いてｓｃＦｖ遺伝子レパートリーにアセンブルした。
ＶHおよびＶL遺伝子レパートリーを再増幅するために用いたプライマーは、ＶH
遺伝子の５’末端の２００ｂｐ上流、およびＶL遺伝子の２００ｂｐ下流にアニ
ールした。これらの長いオーバーハングは、効率的な制限酵素消化を確実にした
。（Ｃ）このｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し
、そしてプラスミドｐＨＥＮ１中に、ファージディスプレイのためにＭ１３遺伝
子ＩＩＩ外被タンパク質遺伝子（）との融合体としてクローン化した。
【図２】 図２は、Ｆ５、Ｃ１およびＣ６．５ｓｃＦｖのエピトープマッピングを示す。
増加する濃度の可溶性ｓｃＦｖ（○）、ｓｃＦｖ−Ｃ１（△）またはｓｃＦｖ−
Ｃ６．５（□）による、Ｆ５ファージ（左パネル）、Ｃ１ファージ（中央パネル
）またはＣ６．５ファージ（右パネル）の結合の阻害。結合ファージは、抗Ｍ１
３ビオチン化Ａｂおよびストレプトアビジン−ＰＥを用いて検出した。結果は、
最大平均蛍光強度（ＭＦＩ）の％で表す。可溶性Ｆ５およびＣ１は、Ｆ５または
Ｃ１ファージの結合を阻害したが、Ｃ６．５ファージの結合を阻害しなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 プール， マリー アリックス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94110， サン フランシスコ， ペラルタ アベ ニュー ナンバー５ 165 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA45 CA04 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 HA17 4C084 AA17 NA14 ZB262 4C085 AA13 AA15 BB01 CC05 CC22 CC29 DD23 DD35 EE01 4H045 AA11 AA30 BA41 CA40 DA50 DA76 DA86 EA28 EA51 FA72 FA74

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｆ５またはＣ１によって結合されるｃ−ｅｒｂＢ２レセプタ
    ーエピトープに特異的に結合する、抗体。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体がインターナライズ
    する抗体である、抗体。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が、配列番号１、配
    列番号２、保存的置換を有する配列番号１および保存的置換を有する配列番号２
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗体。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が、配列番号１また
    は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有し、そして
    該抗体が、細胞上のｃ−ｅｒｂＢ２に対して少なくとも１０Ｍの結合親和性を有
    する、抗体。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体のアミノ酸配列が、
    前記配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列とは、３０残基以下異なる、抗
    体。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が配列番号１の相補
    性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が配列番号２の相補
    性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が配列番号１の相補
    性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも２つ含む、抗体。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が配列番号２の相補
    性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも２つ含む、抗体。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が、配列番号１の
    相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号２の相補性決定領域からなる群より
    選択される、少なくとも２つの相補性決定領域を含む、抗体。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が、配列番号１の
    相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号２の相補性決定領域からなる群より
    選択される、少なくとも３つの相補性決定領域を含む、抗体。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の抗体であって、該抗体が、配列番号１
    のアミノ酸配列の３つの相補性決定領域を有する、抗体。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の抗体であって、該抗体が、配列番号２
    のアミノ酸配列の３つの相補性決定領域を有する、抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が配列番号１のア
    ミノ酸配列を有する、抗体。
  15. 【請求項１５】 請求項１に記載の抗体であって、該抗体が配列番号２のア
    ミノ酸配列を有する、抗体。
  16. 【請求項１６】 ｃ−ｅｒｂＢ２レセプターに特異的に結合する抗体であっ
    て、該抗体が、配列番号１または配列番号２に示すポリペプチド配列からの少な
    くとも１０の連続するアミノ酸を含み、ここで、 該抗体は、抗原として提示される場合、配列番号１または配列番号２に示すポ
    リペプチド配列に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体の産生を誘発し；そし
    て 該抗体は、配列番号１および配列番号２に示すポリペプチドに完全に免疫吸着
    させた、配列番号１および配列番号２に示すポリペプチドに対して惹起された抗
    血清には結合しない、 抗体。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の抗体であって、該抗体は、配列番号１
    または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有し、そ
    して該抗体は、細胞上のｃ−ｅｒｂＢ２に対して少なくとも１０：Ｍの結合親和
    性を有する、抗体。
  18. 【請求項１８】 請求項１６に記載の抗体であって、該抗体のアミノ酸配列
    が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列とは、３０残基以下異なる、抗
    体。
  19. 【請求項１９】 請求項１６に記載の抗体であって、該抗体が配列番号１の
    相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体。
  20. 【請求項２０】 請求項１６に記載の抗体であって、該抗体が配列番号２の
    相補性決定領域を含む、抗体。
  21. 【請求項２１】 請求項１６に記載の抗体であって、該抗体が配列番号１の
    アミノ酸配列を有する、抗体。
  22. 【請求項２２】 請求項１６に記載の抗体であって、該抗体が配列番号２の
    アミノ酸配列を有する、抗体。
  23. 【請求項２３】 ｃ−ｅｒｂＢ２レセプターを有する細胞に対してエフェク
    ター分子を特異的に送達する方法であって、該方法は、以下の工程： 請求項１または１６に記載の抗体に付着した該エフェクター分子を含むキメラ
    分子を提供する工程；および 該ｃ−ｅｒｂＢ２を有する細胞を、該キメラ分子と接触させ、それによって、
    該キメラ分子が該細胞に特異的に結合する、工程、 を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の方法であって、前記エフェクター分子
    が、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンドおよび抗体から
    なる群より選択される、方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２３に記載の方法であって、前記キメラ分子が融合
    タンパク質である、方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２３に記載の方法であって、前記細胞がガン細胞で
    ある、方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の方法であって、前記ガン細胞が乳ガン
    細胞である、方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２３に記載の方法であって、前記抗体が配列番号１
    または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有し、 そして該抗体がｃ−ｅｒｂＢ２について、少なくとも１０Ｍの結合親和性を有す
    る、方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２３に記載の方法であって、前記抗体のアミノ酸配
    列が配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列とは、３０残基以下異なる、方
    法。
  30. 【請求項３０】 請求項２３に記載の方法であって、前記抗体が、配列番号
    １の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２３に記載の方法であって、前記抗体が、配列番号
    ２の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２３に記載の方法であって、前記抗体が、配列番号
    １のアミノ酸配列を有する、方法。
  33. 【請求項３３】 請求項２３に記載の方法であって、前記抗体が、配列番号
    ２のアミノ酸配列を有する、方法。
  34. 【請求項３４】 ｃ−ｅｒｂＢ２を有する細胞に特異的に結合するキメラ分
    子であって、該キメラ分子が、請求項１または１６に記載の抗体に付着したエフ
    ェクター分子を含む、キメラ分子。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載のキメラ分子であって、前記エフェクタ
    ー分子が、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンドおよび抗
    体からなる群より選択される、キメラ分子。
  36. 【請求項３６】 請求項３４に記載のキメラ分子であって、該キメラ分子は
    融合タンパク質である、キメラ分子。
  37. 【請求項３７】 請求項３４に記載のキメラ分子であって、前記細胞がガン
    細胞である、キメラ分子。
  38. 【請求項３８】 請求項３７に記載のキメラ分子であって、前記ガン細胞が
    乳ガン細胞である、キメラ分子。
  39. 【請求項３９】 請求項３４に記載のキメラ分子であって、前記抗体が配列
    番号１または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有
    し、そして該抗体がｃ−ｅｒｂＢ２について少なくとも１０：Ｍの結合親和性を
    有する、キメラ分子。
  40. 【請求項４０】 請求項３４に記載のキメラ分子であって、前記抗体のアミ
    ノ酸配列が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列とは、３０残基以下異
    なる、キメラ分子。
  41. 【請求項４１】 請求項３４に記載のキメラ分子であって、前記抗体が配列
    番号１の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、キメラ分子。
  42. 【請求項４２】 請求項３４に記載のキメラ分子であって、前記抗体が配列
    番号２の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、キメラ分子。
  43. 【請求項４３】 請求項３４に記載のキメラ分子であって、前記抗体が配列
    番号１のアミノ酸配列を有する、キメラ分子。
  44. 【請求項４４】 請求項３４に記載のキメラ分子であって、前記抗体が配列
    番号２のアミノ酸配列を有する、キメラ分子。
  45. 【請求項４５】 Ｆ５（配列番号１）またはＣ１（配列番号２）に結合され
    るエピトープに特異的に結合する抗体をコードする、核酸。
  46. 【請求項４６】 請求項４５に記載の核酸であって、該核酸は、配列番号１
    、配列番号２、保存的置換を有する配列番号１および保存的置換を有する配列番
    号２からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする、核酸。
  47. 【請求項４７】 請求項４５に記載の核酸であって、該核酸は、配列番号１
    または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有する抗
    体をコードし、そして該抗体が、細胞上のｃ−ｅｒｂＢ２に対して少なくとも１
    ０Ｍの結合親和性を有する、核酸。
  48. 【請求項４８】 請求項４５に記載の核酸であって、該核酸は、前記配列番
    号１または配列番号２のアミノ酸配列とは、３０残基以下異なる、前記抗体のア
    ミノ酸配列をコードする、核酸。
  49. 【請求項４９】 請求項４５に記載の核酸であって、該核酸は、配列番号１
    の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、核酸。
  50. 【請求項５０】 請求項４５に記載の核酸であって、該核酸は、配列番号２
    の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、核酸。
  51. 【請求項５１】 請求項４５に記載の核酸であって、該核酸は、配列番号１
    のアミノ酸配列をコードする、核酸。
  52. 【請求項５２】 請求項４５に記載の核酸であって、該核酸は、配列番号２
    のアミノ酸配列をコードする、核酸。
  53. 【請求項５３】 薬理学的な賦形剤および請求項１または１６に記載の抗体
    を含む、薬学的組成物。
  54. 【請求項５４】 薬理学的な賦形剤および請求項３４に記載のキメラ分子を
    含む、薬学的組成物。
JP2000545565A 1998-04-24 1999-04-23 インターナライズするＥｒｂＢ２抗体 Pending JP2002524024A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8295398P 1998-04-24 1998-04-24
US60/082,953 1998-04-24
US09/250,056 US7244826B1 (en) 1998-04-24 1999-02-12 Internalizing ERB2 antibodies
US09/250,056 1999-02-12
PCT/US1999/007395 WO1999055367A1 (en) 1998-04-24 1999-04-23 INTERNALIZING ErbB2 ANTIBODIES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002524024A true JP2002524024A (ja) 2002-08-06
JP2002524024A5 JP2002524024A5 (ja) 2006-05-25

Family

ID=26768027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000545565A Pending JP2002524024A (ja) 1998-04-24 1999-04-23 インターナライズするＥｒｂＢ２抗体

Country Status (9)

Country Link
US (6) US7244826B1 (ja)
EP (1) EP1071460B1 (ja)
JP (1) JP2002524024A (ja)
AT (1) ATE412432T1 (ja)
AU (1) AU769304B2 (ja)
CA (1) CA2326377C (ja)
DE (1) DE69939820D1 (ja)
ES (1) ES2316186T3 (ja)
WO (1) WO1999055367A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010522538A (ja) * 2006-12-12 2010-07-08 モルフォシス・アー・ゲー 内在化
US7763244B2 (en) 2002-07-01 2010-07-27 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to Reg IV
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7563874B2 (en) * 1998-08-31 2009-07-21 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
CA2380813A1 (en) * 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
DK2199393T3 (da) 2000-04-17 2012-11-26 Dyax Corp Hidtil ukendte fremgangsmåder til opbygning af biblioteker over genetiske pakker, der kollektivt viser medlemmerne af en forskelligartet familie af peptider, polypeptider eller proteiner
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
ES2331646T3 (es) 2000-05-19 2010-01-12 Genentech, Inc. Ensayo para la deteccion de genes para mejorar la probabilidad de una respuesta eficaz a una terapia contra el cancer basada en antagonistas de erbb.
PT2316940E (pt) 2000-12-18 2013-10-16 Dyax Corp Bibliotecas orientadas de pacotes genéticos
ITRM20010408A1 (it) * 2001-07-10 2003-01-10 Univ Napoli Federico Ii Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2.
JPWO2003009870A1 (ja) * 2001-07-25 2004-11-11 三菱ウェルファーマ株式会社 乳癌治療薬
US20040067532A1 (en) 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
US6987270B2 (en) 2003-05-07 2006-01-17 General Electric Company Method to account for event losses due to positron range in positron emission tomography and assay of positron-emitting isotopes
WO2005037911A2 (en) 2003-08-26 2005-04-28 Smithkline Beecham Corporation Heterofunctional copolymers of glycerol and polyethylene glycol, their conjugates and compositions
RU2006122952A (ru) * 2003-11-28 2008-01-10 Митра Медикал Аб (Se) ТЕРАПИЯ, НАПРАВЛЕННАЯ ПРОТИВ АНТИГЕНОВ Erb
ES2616047T3 (es) 2004-05-03 2017-06-09 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomas útiles para la administración de fármacos
AU2005295072A1 (en) 2004-10-08 2006-04-20 Alza Corporation Method of insertion of a lipid-linked moiety into a pre-formed lipid assembly using microwaves
CN101141981A (zh) 2005-01-21 2008-03-12 健泰科生物技术公司 Her抗体的固定剂量给药
EP2153848A3 (en) * 2005-01-27 2010-07-21 The Regents of the University of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinium neurotoxins
GB0503546D0 (en) * 2005-02-21 2005-03-30 Hellenic Pasteur Inst Antibody
DK1850874T3 (da) 2005-02-23 2013-11-11 Genentech Inc Forlængelse af tid til sygdomsprogression eller overlevelse for ovariecancer ved anvendelse af pertuzumab
LT2511301T (lt) * 2006-08-04 2018-04-10 Medimmune Limited Žmogaus antikūnas prieš erbb2
EP2132573B1 (en) 2007-03-02 2014-04-23 Genentech, Inc. Predicting response to a her dimerisation inhbitor based on low her3 expression
CA2680741A1 (en) 2007-03-22 2009-01-15 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
US20090175784A1 (en) 2007-05-11 2009-07-09 Joshua Goldstein Anti-Alpha V Immunoliposome Composition, Methods, and Uses
US9551033B2 (en) 2007-06-08 2017-01-24 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment
PL2171090T3 (pl) 2007-06-08 2013-09-30 Genentech Inc Markery ekspresji genów odporności guza na leczenie hamujące HER2
BRPI0816785A2 (pt) 2007-09-14 2017-05-02 Adimab Inc bibliotecas de anticorpos sintéticos racionalmente desenhadas, e, usos para as mesmas
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US9873957B2 (en) 2008-03-13 2018-01-23 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel HC CDR3 designs
CA2722409C (en) 2008-04-24 2017-12-12 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr1, cdr2, and cdr3 and novel lc cdr1, cdr2, and cdr3 designs
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
EP2313434A4 (en) 2008-07-31 2013-03-27 Univ California NEUTRALIZING ANTIBODIES OF BOTULINIC NEUROTOXINS
US8734795B2 (en) 2008-10-31 2014-05-27 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof
TWI461211B (zh) 2009-03-20 2014-11-21 Genentech Inc 抗－ｈｅｒ抗體
SG176073A1 (en) 2009-05-29 2011-12-29 Hoffmann La Roche Modulators for her2 signaling in her2 expressing patients with gastric cancer
US9556249B2 (en) 2010-02-18 2017-01-31 Genentech, Inc. Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
EP2542589A4 (en) * 2010-03-04 2013-08-07 Symphogen As ANTIBODIES AND COMPOSITIONS ANTI-HER2
US8609095B2 (en) 2010-03-04 2013-12-17 Symphogen A/S Anti-HER2 antibodies and compositions
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
EP2576621B1 (en) 2010-05-27 2019-04-10 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
JP6082344B2 (ja) 2010-05-27 2017-02-15 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２エピトープに対するモノクローナル抗体
EP3741883B1 (en) 2010-07-16 2022-12-14 Adimab, LLC Antibody libraries
WO2012047427A2 (en) 2010-08-31 2012-04-12 The Regents Of The University Of California Antibodies for botulinum neurotoxins
EP2643353A1 (en) 2010-11-24 2013-10-02 Novartis AG Multispecific molecules
CN107252417A (zh) 2010-12-06 2017-10-17 梅里麦克制药股份有限公司 在使用包含蒽环类化疗剂的erbb2靶向免疫脂质体的治疗中防止心肌毒性的剂量和给药
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
EP2675918B1 (en) 2011-02-15 2017-11-08 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for delivering nucleic acid to a cell
US20140170149A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
CN103796678B (zh) 2011-04-20 2018-02-27 健玛保 针对her2的双特异性抗体
EP2744824A1 (en) 2011-08-17 2014-06-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Neuregulin antibodies and uses thereof
WO2013043864A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to endothelial targeting
WO2013063229A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 The Regents Of The University Of Michigan Her2 targeting agent treatment in non-her2-amplified cancers having her2 expressing cancer stem cells
CA2857114A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Genentech, Inc. Erbb3 mutations in cancer
US9376715B2 (en) 2011-12-09 2016-06-28 Roche Molecular Systems, Inc Methods for detecting mutations in the catalytic subunit of the phosphoinositol-3 kinase (PIK3CA) gene
EP2831115A1 (en) 2012-03-27 2015-02-04 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
AU2013202947B2 (en) 2012-06-13 2016-06-02 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan
US9717724B2 (en) 2012-06-13 2017-08-01 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies
WO2013192294A1 (en) * 2012-06-20 2013-12-27 Boston 3T Biotechnologies, Inc. Cellular therapies for treating and preventing cancers and other immune system disorders
JP6998646B2 (ja) 2012-11-30 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－ｌ１阻害剤併用療法を必要とする患者の同定
EP2925361A4 (en) 2012-12-03 2016-06-29 Merrimack Pharmaceuticals Inc COMBINATION THERAPY FOR THE TREATMENT OF HER-2 POSITIVE CANCERS
WO2015066543A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting her2 and her3 with bispecific antibodies in cancerous cells
SG11201608192SA (en) 2014-04-11 2016-10-28 Medimmune Llc Bispecific her2 antibodies
TWI695011B (zh) 2014-06-18 2020-06-01 美商梅爾莎納醫療公司 抗ｈｅｒ２表位之單株抗體及其使用之方法
WO2016022723A1 (en) 2014-08-05 2016-02-11 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies for treating her2-positive cancers that are resistant to her2-targeted therapies
CA2974988A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for improved cognition
EP3262216A4 (en) * 2015-02-24 2018-12-05 Academia Sinica A phage-displayed single-chain variable fragment library
US11318131B2 (en) 2015-05-18 2022-05-03 Ipsen Biopharm Ltd. Nanoliposomal irinotecan for use in treating small cell lung cancer
MX2018001659A (es) 2015-08-20 2018-05-28 Ipsen Biopharm Ltd Terapia de combinacion que usa irinotecan liposomal y un inhibidor de poli(adp-ribosa) polimerasa (parp) para el tratamiento del cancer.
CN108495629A (zh) 2015-08-21 2018-09-04 益普生生物制药有限公司 使用包含脂质体伊立替康和奥沙利铂的组合疗法治疗转移性胰腺癌的方法
US10456360B2 (en) 2015-10-16 2019-10-29 Ipsen Biopharm Ltd. Stabilizing camptothecin pharmaceutical compositions
US20180271998A1 (en) 2015-12-04 2018-09-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Disulfide-stabilized fabs
EP3389714A4 (en) 2015-12-14 2019-11-13 MacroGenics, Inc. BISPECIFIC MOLECULES HAVING IMMUNOREACTIVITY TO PD-1 AND CTLA-4 AND METHODS OF USE
EP3454863A1 (en) 2016-05-10 2019-03-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
CA3040395A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Ipsen Biopharm Ltd. Treating gastric cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan, oxaliplatin, 5-fluoruracil (and leucovorin)
CN110325209A (zh) 2017-02-24 2019-10-11 宏观基因有限公司 能够结合cd137和肿瘤抗原的双特异性结合分子及其用途
RU2020122822A (ru) 2017-12-12 2022-01-13 Макродженикс, Инк. Биспецифичные связывающие cd16 молекулы и их применение при лечении заболеваний
JP7337079B2 (ja) 2018-02-15 2023-09-01 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型ｃｄ３結合ドメイン、及び疾患の治療のための併用療法におけるその使用
US20220118060A1 (en) 2019-02-04 2022-04-21 The Regents Of The University Of California Exercise-induced circulatory factors for amelioration of cognitive, neurological, and regenerative dysfunction during aging
US11883432B2 (en) 2020-12-18 2024-01-30 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor system with adaptable receptor specificity

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5169774A (en) 1984-02-08 1992-12-08 Cetus Oncology Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4892827A (en) 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US4996490A (en) * 1986-11-18 1991-02-26 Atlantic Richfield Company Microwave apparatus and method for measuring fluid mixtures
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
IL99553A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing oligonucleotides linked to expression elements,a kit for the preparation of vectors useful for the expression of a diverse population of random peptides and methods utilizing the same
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
JPH08502645A (ja) 1992-09-04 1996-03-26 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 表面レセプター及び表面異種タンパク質を同時発現するファージミド
WO1994011496A1 (en) 1992-11-10 1994-05-26 Ixsys, Inc. Soluble peptides having constrained, secondary conformation in solution and method of making same
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
WO1994026787A1 (en) 1993-05-07 1994-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for generating cell type specific phage antibody libraries
US5631158A (en) 1993-10-25 1997-05-20 Creative Biomolecules, Inc. Methods and compositions for high protein production from non-native DNA
US6214388B1 (en) * 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5736388A (en) 1994-12-30 1998-04-07 Chada; Sunil Bacteriophage-mediated gene transfer systems capable of transfecting eukaryotic cells
WO1997000271A1 (en) 1995-06-14 1997-01-03 The Regents Of The University Of California Novel high affinity human antibodies to tumor antigens
SE9503151D0 (sv) 1995-09-13 1995-09-13 Bioinvent Internatioal Ab Combined ligand and receptor display
AU2678097A (en) 1996-04-16 1997-11-07 Immusol Incorporated Targeted viral vectors
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
AU3737297A (en) 1996-08-05 1998-02-25 Brigham And Women's Hospital Bacteriophage-mediated gene therapy
US6054312A (en) 1997-08-29 2000-04-25 Selective Genetics, Inc. Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors
WO2002002641A1 (en) * 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7763244B2 (en) 2002-07-01 2010-07-27 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to Reg IV
JP2010522538A (ja) * 2006-12-12 2010-07-08 モルフォシス・アー・ゲー 内在化
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
US8173424B2 (en) 2012-05-08
CA2326377A1 (en) 1999-11-04
US20150239976A1 (en) 2015-08-27
WO1999055367A1 (en) 1999-11-04
EP1071460A4 (en) 2004-09-08
EP1071460B1 (en) 2008-10-29
EP1071460A1 (en) 2001-01-31
US7892554B2 (en) 2011-02-22
ES2316186T3 (es) 2009-04-01
US9388244B2 (en) 2016-07-12
US20160279262A1 (en) 2016-09-29
US20080108135A1 (en) 2008-05-08
WO1999055367A9 (en) 2000-03-02
US20130337039A1 (en) 2013-12-19
US8974792B2 (en) 2015-03-10
CA2326377C (en) 2016-12-06
AU769304B2 (en) 2004-01-22
ATE412432T1 (de) 2008-11-15
US20110218333A1 (en) 2011-09-08
DE69939820D1 (de) 2008-12-11
AU3742999A (en) 1999-11-16
US7244826B1 (en) 2007-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9388244B2 (en) Internalizing ErbB2 antibodies
JP4493845B2 (ja) インターナライズする抗体を選択する方法
EP0873363B1 (en) High affinity human antibodies to tumor antigens
US6180336B1 (en) Labelling and selection of molecules
CA2749339A1 (en) Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
JP2013534813A (ja) 抗ｃｄ１３３抗体一本鎖可変断片、及びこれらの使用
CA2386926A1 (en) Antibody to human gastrointestinal epithelial tumor antigen related to alpha 6 beta 4 integrin
AU2004201055B2 (en) Internalizing ErbB2 antibodies
AU2007234594A1 (en) Internalizing ErbB2 antibodies
MXPA00010440A (en) INTERNALIZING ErbB2 ANTIBODIES
JP3923534B6 (ja) 分子の標識及び選択
MXPA00010434A (en) Methods of selecting internalizing antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060328

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060328

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090107

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090406

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090413

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090501

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090511

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090513

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090518

RD13 Notification of appointment of power of sub attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433

Effective date: 20090626

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090707

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20090827

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20091028

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100301

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20100421

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20100618

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20100830

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20100830

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101014

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120228

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120305

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120328

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120403

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120501

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20120501

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20120501

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120528

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120625