CN105452864A - 用于检测幽门螺杆菌感染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于在对象中检测幽门螺杆菌(H.pylori)感染的方法,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测针对FliD的免疫应答,其中所述免疫应答包括抗FliD抗体。
Description
本发明涉及用于检测螺杆菌(Helicobacter)感染并且更特别地用于检测幽门螺杆菌(H.pylori)感染的方法,免疫应答作为生物标志物的用途,螺杆菌蛋白质作为生物标志物的用途,编码螺杆菌蛋白质的核酸作为生物标志物的用途,以及用于在检测螺杆菌感染并且更特别地用于检测幽门螺杆菌感染之方法中使用的试剂盒。
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori),是一种微需氧的革兰氏阴性螺旋菌,其定居在约一半世界人口中并且被认为是人特有的胃部病原体(Michetti等,1999)。大多数感染个体患有无症状的慢性胃炎。然而,在一些对象中,感染引起慢性胃炎、消化性溃疡形成和萎缩,并且在粘膜相关淋巴组织(mucosa-associatedlymphoidtissue,MALT)淋巴瘤、胃腺癌和原发性胃非霍奇金氏淋巴瘤的形成中发挥着重要作用(Suganuma等,2001)。
世界卫生组织将幽门螺杆菌归类为I类致癌原(Goto等,1999),并且已在动物模型中证明了致癌作用的直接证据(Honda等,1998;T.Watanabe等,1998)。根除幽门螺杆菌可以预防人类的胃癌(Uemura等,2001)。在高胃癌风险的群体中考虑了测试&治疗策略(Yamaoka等,1998)。然而,这些方法因缺少有效且可负担的筛选系统(尤其是对于社会经济地位较低的国家)而受到阻碍。在这些国家中,仅血清学测试可应用,其中大多数具有不良的性能或者没有经过很好的验证。对于幽门螺杆菌血清学,已知且描述了数种特异性单一标志物。这些因素已被应用于多种诊断方法,但是其几乎所有都具有很大的限制使得其不适用于幽门螺杆菌诊断。例如,细胞毒素相关蛋白(cytotoxin-associatedprotein,CagA)是表征非常良好的幽门螺杆菌蛋白质。其在cag-PAI(细胞毒素相关基因毒力岛)上进行编码并且被描述为致癌蛋白质(Franco等,2005;Murata-Kamiya等,2007)。这种蛋白质也是高免疫原性抗原,使得其可成为血清学测试经常采用的标志物。CagA阳性可以被用作幽门螺杆菌毒力的指示物,原因是感染CagA阳性菌株的个体处于发生胃与十二指肠疾病的较高风险下。然而,其不适于用作单一标志物,原因是仅幽门螺杆菌菌株的亚组为CagA阳性。而且,CagA阳性不是活性感染的特点,原因是根除了幽门螺杆菌的患者多年维持着针对CagA的抗体(Fusconi等,1999)。因此,其在血清学测试中应一直与其他适当的抗原组合以确定阳性。另一种表征良好的幽门螺杆菌蛋白质是空泡细胞毒素(vacuolatingcytotoxin,VacA)。报道称,其引起暴露于幽门螺旋杆菌上清液或经纯化蛋白质的细胞中的空泡形成(Cover&Blaser,1992)。vacA基因编码140kDa的原毒素,其中氨基端信号序列和羧基端片段在分泌期间被蛋白质水解切割,从而产生了分子质量为88kDa的活性蛋白质,所述活性蛋白质聚集成六聚体并形成孔(Montecucco&deBernard,2003)。该蛋白质由两个不同的区域组成。信号序列(s1a、s1b、s2)和中间区域(m1、m2),二者均具有似乎调控细胞毒性活性的高等位基因变化(Atherton等,1995)。VacA的高多样性使得该蛋白质不适用于血清学测试。
另一种表征很好的幽门螺杆菌蛋白质GroEL属于分子伴侣家族,其是许多蛋白质在应力条件下进行适当折叠所需的(Dunn等,1992)。在不同的研究中,表明该蛋白质在不同的幽门螺杆菌菌株中是高度保守的,并且其血清阳性甚至高于感染患者中对于CagA的血清阳性(Macchia等,1993;Suerbaum等,1994)。另外,在由本发明人进行的研究中,观察到GroEL的阳性血清状态在德国胃癌患者中比在匹配对照中更为常见(数据未公开)。另外,表明针对GroEL的抗体在幽门螺杆菌感染的疾病相关损失之后持续得更久。因此,GroEL可为适用于现症感染或既往感染的标志物,并且可有助于克服由于感染清除而低估幽门螺杆菌相关胃癌风险的问题(Gao等,2009)。
因此,本发明所基于的问题是提供具有高敏感性和/或高特异性的用于检测幽门螺杆菌感染的方法。本发明所基于的另一个问题是提供这样的测定:与现有技术的测定相比,其产生较少假阳性和较少假阴性结果,特别是在基于群体的方法中。本发明所基于的又一个问题是提供用于分别用于执行所述方法和所述测定的手段。本发明所基于的再一个问题是提供用于幽门螺杆菌感染患者的生物标志物,其中特别地,所述生物标志物优选地显示出与其他细菌和任何蛋白质、肽或编码所述蛋白质和肽的核酸分子没有任何交叉反应性。
本发明所基于的这些和其他问题通过所附独立权利要求的主题来解决。一些优选的实施方案可由所附从属权利要求获得。
本发明所基于的这些和其他问题还通过以下实施方案来解决。
实施方案1:用于在对象中检测螺杆菌感染并且更优选地幽门螺杆菌感染的方法,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测针对FliD的免疫应答。
实施方案2:实施方案1所述的方法,其中如果在来自所述对象的样品中检测到针对FliD的免疫应答,则所述对象正患有螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染,或者所述对象过去已经经历过螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
实施方案3:实施方案1至2中任一个所述的方法,其中如果在来自所述对象的样品中检测不到针对FliD的免疫应答,则所述对象未患螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
实施方案4:实施方案1至2中任一个所述的方法,其中如果在来自对象的样品中检测不到针对FliD的免疫应答,则所述对象过去已经经历过螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
实施方案5:实施方案1至4中任一个所述的方法,其中所述针对FliD的免疫应答是针对FliD的抗体应答,优选抗FliD抗体应答。
实施方案6:实施方案5所述的方法,其中所述针对FliD的免疫应答是针对FliD的抗体应答,并且其中所述针对FliD的抗体应答包含选自包括IgG抗体和IgA抗体之组中的至少一种抗FliD抗体。
实施方案7:实施方案5所述的方法,其中所述针对FliD的免疫应答是抗FliD抗体应答,并且其中所述抗FliD抗体应答包含选自包括IgG抗体和IgA抗体之组中的至少一种抗FliD抗体。
实施方案8:实施方案1至7中任一个所述的方法,其中所述对象感染有表达FliD的螺杆菌,优选幽门螺杆菌。
实施方案9:实施方案1至8中任一个所述的方法,其中所述对象不同于免疫抑制的对象,优选地,所述对象不同于进行免疫抑制治疗的对象。
实施方案10:实施方案1至9中任一个所述的方法,其中所述方法还包括检测螺杆菌(优选幽门螺杆菌)的一种或更多种抗原。
实施方案11:实施方案10所述的方法,其中螺杆菌(优选幽门螺杆菌)的一种或更多种抗原选自包括CagA、VacA、GroEL、Hp0231、JHp0940和HtrA的组。
实施方案12:实施方案1至11中任一个所述的方法,其中所述方法包括使所述样品与FliD或其片段反应。
实施方案13:实施方案13所述的方法,其中所述方法包括使所述样品与全长FliD反应。
实施方案14:实施方案12至13中任一个所述的方法,其中所述针对FliD的免疫应答包含能够与FliD相互作用的体液化合物和能够与FliD相互作用的细胞化合物中的至少一种,其中至少一种体液化合物和/或细胞化合物与FliD相互作用,优选地至少一种与FliD相互作用的体液化合物和/或细胞化合物与FliD形成相互作用产物。
实施方案15:实施方案14所述的方法,其中所述针对FliD的免疫应答是针对FliD的抗体应答并且其中所述针对FliD的抗体应答与FliD形成相互作用产物。
实施方案16:实施方案14所述的方法,其中所述针对FliD的免疫应答是抗FliD抗体应答并且所述抗FliD应答与FliD形成相互作用产物。
实施方案17:实施方案14所述的方法,其中所述针对FliD的免疫应答包含至少一种抗FliD抗体并且所述抗FliD抗体与FliD形成相互作用产物。
实施方案18:实施方案14至17中任一个所述的方法,其中检测所述相互作用产物。
实施方案19:实施方案18所述的方法,其中直接检测所述相互作用产物。
实施方案20:实施方案18所述的方法,其中间接检测所述相互作用产物。
实施方案21:实施方案1至20中任一个所述的方法,其中所述检测通过ELISA或线免疫测定进行。
实施方案22:实施方案1至20中任一个所述的方法,其中所述检测通过侧向流测定(lateralflowassay)进行。
实施方案23:实施方案1至22中任一个所述的方法,其中所述样品选自包括血清、血浆和全血的组。
实施方案24:实施方案1至23中任一个所述的方法,其中所述对象是人类并且螺杆菌感染是幽门螺杆菌感染。
实施方案25:实施方案24所述的方法,其中与所述样品反应的FliD是来自幽门螺杆菌的FliD。
实施方案26:实施方案25所述的方法,其中所述FliD包含根据SEQIDNO:1的氨基酸序列。
实施方案27:实施方案1至23中任一个所述的方法,其中所述对象是猪并且螺杆菌感染是猪螺杆菌(Helicobactersuis)感染。
实施方案28:实施方案27所述的方法,其中与所述样品反应的FliD是来自猪螺杆菌(H.suis)的FliD。
实施方案29:实施方案28所述的方法,其中所述FliD包含根据SEQIDNO:3的氨基酸序列。
实施方案30:实施方案1至23中任一个所述的方法,其中所述对象是猫并且螺杆菌感染是猫螺杆菌(Helicobacterfelis)感染。优选地,猫选自包括家猫、野猫、小型猫科动物和大型猫科动物的组。
实施方案31:实施方案30所述的方法,其中与所述样品反应的FliD是来自猫螺杆菌(H.felis)的FliD。
实施方案32:实施方案31所述的方法,其中所述FliD包含根据SEQIDNO:5的氨基酸序列。
实施方案33:实施方案1至32中任一个所述的方法,其中用于在人中检测螺杆菌感染(优选幽门螺杆菌感染)之方法的敏感性大于90%和/或97%或以下。
实施方案34:实施方案1至33中任一个所述的方法,其中用于在人中检测螺杆菌感染(优选幽门螺杆菌感染)之方法的特异性大于90%和/或99%或以下。
实施方案35:对象中针对FliD的免疫应答作为生物标志物的用途。
实施方案36:实施方案35所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物。
实施方案37:实施方案35至36中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物,其中所述对象是人并且螺杆菌是幽门螺杆菌。
实施方案38:实施方案35至36中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物,其中所述对象是猪并且螺杆菌是猪螺杆菌。
实施方案39:实施方案35至36中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物,其中所述对象是猫并且螺杆菌是猫螺杆菌。
实施方案40:根据实施方案35至39中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是预测性生物标志物。
实施方案41:根据实施方案35至40中任一个所述的用途,其中所述免疫应答是针对FliD的抗体应答。
实施方案42:根据实施方案35至41中任一个所述的用途,其中所述免疫应答是针对FliD的抗FliD抗体应答。
实施方案43:试剂盒,其包含FliD或其片段和至少一种另外的构成要素。
实施方案44:实施方案43所述的试剂盒,其中所述至少一种另外的构成要素选自包括缓冲剂、固相和说明书散页(leaflet)的组。
实施方案45:实施方案43至44中任一个所述的试剂盒,其中FliD是全长FliD。
实施方案46:根据实施方案43至44中任一个所述的试剂盒,其中FliD包含氨基酸序列并且其中所述氨基酸序列选自包括以下的组:根据SEQIDNO:1的氨基酸序列、根据SEQIDNO:3的氨基酸序列和根据SEQIDNO:5的氨基酸序列。
实施方案47:根据实施方案43至46中任一个所述的试剂盒,其中所述试剂盒适用于用来在对象中检测螺杆菌感染的方法或者在用于在对象中检测螺杆菌感染的方法中使用。
实施方案48:根据实施方案47所述的试剂盒,其中所述试剂盒适用于实施方案1至34中任一个所述的方法或者在实施方案1至34中任一个所述的方法中使用。
实施方案49:用于在对象中检测螺杆菌感染并且更优选幽门螺杆菌感染的方法,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测FliD。
实施方案50:实施方案49所述的方法,其中如果在来自所述对象的样品中检测到FliD,则所述对象正患有螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染,或者所述对象过去已经经历过螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
实施方案51:实施方案49至50中任一个所述的方法,其中如果在来自所述对象的样品中检测不到FliD,则所述对象未患螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
实施方案52:实施方案49至51中任一个所述的方法,其中如果在来自所述对象的样品中检测不到FliD,则所述对象过去已经经历过螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
实施方案53:实施方案49至52中任一个所述的方法,其中所述对象感染表达FliD的螺杆菌,优选幽门螺杆菌。
实施方案54:实施方案49至53中任一个所述的方法,其中所述方法还包括检测螺杆菌(优选幽门螺杆菌)的一种或更多种抗原。
实施方案55:实施方案54所述的方法,其中螺杆菌(优选幽门螺杆菌)的一种或更多种抗原选自包括CagA、VacA、GroEL、Hp0231、JHp0940和HtrA的组。
实施方案56:实施方案49至55中任一个所述的方法,其中FliD是全长FliD或其片段。
实施方案57:实施方案49至56中任一个所述的方法,其中所述方法包括使所述样品与相互作用剂反应,其中所述相互作用剂与FliD或其片段相互作用,优选地所述相互作用剂与FliD或其片段特异性相互作用。
实施方案58:实施方案57所述的方法,其中所述相互作用剂与全长FliD或FliD的片段相互作用。
实施方案59:实施方案57至58中任一个所述的方法,其中所述相互作用剂选自包括抗体、适配体和spiegelmer的组。
实施方案60:实施方案59所述的方法,其中所述相互作用剂是抗体,其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
实施方案61:实施方案56至60中任一个所述的方法,其中所述相互作用剂与所述对象中存在的FliD形成相互作用产物。
实施方案62:实施方案61所述的方法,其中检测所述相互作用产物。
实施方案63:实施方案62所述的方法,其中直接检测所述相互作用产物。
实施方案64:实施方案62所述的方法,其中间接检测所述相互作用产物。
实施方案65:实施方案49至64中任一个所述的方法,其中所述检测通过ELISA或线免疫测定进行。
实施方案66:实施方案49至63中任一个所述的方法,其中所述检测通过侧向流测定进行。
实施方案67:根据实施方案49至56中任一个所述的方法,其中通过质谱法检测FliD。
实施方案68:根据实施方案67所述的方法,其中质谱法选自包括LC-ESI-MS/MS、MALDI-MS、串联MS、TOF/TOF、TOF-MS、TOF-MS/MS、三重四级(triplequadrupole)MS和三重四级MS/MS的组。
实施方案69:实施方案49至68中任一个所述的方法,其中所述对象是人类并且螺杆菌感染是幽门螺杆菌感染。
实施方案70:实施方案69所述的方法,其中所述FliD来自幽门螺杆菌。
实施方案71:实施方案70所述的方法,其中所述FliD包含根据SEQIDNO:1的氨基酸序列。
实施方案72:实施方案49至68中任一个所述的方法,其中所述对象是猪并且螺杆菌感染是猪螺杆菌感染。
实施方案73:实施方案72所述的方法,其中所述FliD来自猪螺杆菌。
实施方案74:实施方案73所述的方法,其中所述FliD包含根据SEQIDNO:3的氨基酸序列。
实施方案75:实施方案49至68中任一个所述的方法,其中所述对象是猫并且螺杆菌感染是猫螺杆菌感染。
实施方案76:实施方案75所述的方法,其中所述FliD来自猫螺杆菌。
实施方案77:实施方案76所述的方法,其中所述FliD包含根据SEQIDNO:5的氨基酸序列。
实施方案78:实施方案49至77中任一个所述的方法,其中所述样品选自包括粪便、血清、血浆和全血的组,优选地,所述样品是粪便。
实施方案79:FliD作为生物标志物的用途。
实施方案80:实施方案79所述的用途,其中所述生物标志物是对象感染螺杆菌的生物标志物。
实施方案81:实施方案79至80中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物,其中所述对象是人并且螺杆菌是幽门螺杆菌。
实施方案82:实施方案81所述的用途,其中FliD包含根据SEQIDNO:1的氨基酸序列。
实施方案83:实施方案80至81中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物,其中所述对象是猪并且螺杆菌是猪螺杆菌。
实施方案84:实施方案83所述的用途,其中FliD包含根据SEQIDNO:3的氨基酸序列。
实施方案85:实施方案80至81中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物,其中所述对象是猫并且螺杆菌是猫螺杆菌。
实施方案86:实施方案85所述的用途,其中FliD包含根据SEQIDNO:5的氨基酸序列。
实施方案87:根据实施方案79至86中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是预测性生物标志物。
实施方案88:试剂盒,其包含能够与FliD或其片段相互作用的相互作用剂以及至少一种另外的构成要素。
实施方案89:实施方案88所述的试剂盒,其中所述至少一种另外的构成要素选自包括缓冲剂、固相和说明书散页的组。
实施方案90:实施方案89所述的试剂盒,其中所述相互作用剂能够与FliD或其片段特异性相互作用。
实施方案91:实施方案88至90中任一个所述的试剂盒,其中所述相互作用剂选自包括抗体、适配体和spiegelmer的组。
实施方案92:根据实施方案88至91中任一个所述的试剂盒,其中所述试剂盒适用于用来在对象中检测螺杆菌感染的方法或者在用于在对象中检测螺杆菌感染的方法中使用。
实施方案93:根据实施方案92所述的试剂盒,其中所述试剂盒适用于实施方案49至78中任一个所述的方法或者在实施方案49至78中任一个所述的方法中使用。
实施方案94:用于在对象中检测螺杆菌感染并且更优选幽门螺杆菌感染的方法,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测编码FliD的核酸。
实施方案95:实施方案94所述的方法,其中所述核酸是编码FliD的基因组核酸,优选DNA。
实施方案96:实施方案94所述的方法,其中所述核酸是编码FliD的mRNA。
实施方案97:实施方案94至96中任一个所述的方法,其中如果在来自所述对象的样品中检测到编码FliD的核酸,则所述对象正患有螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染,或者所述对象过去已经经历过螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
实施方案98:实施方案94至97中任一个所述的方法,其中如果在来自所述对象的样品中检测不到编码FliD的核酸,则所述对象未患螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
实施方案99:实施方案94至98中任一个所述的方法,其中如果在来自所述对象的样品中检测不到编码FliD的核酸,则所述对象过去已经经历过螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
实施方案100:实施方案94至99中任一个所述的方法,其中所述对象感染表达FliD的螺杆菌,优选幽门螺杆菌。
实施方案101:实施方案94至100中任一个所述的方法,其中所述方法还包括检测螺杆菌(优选幽门螺杆菌)的一种或更多种抗原;和/或编码螺杆菌(优选幽门螺杆菌)的一种或更多种抗原的核酸。
实施方案102:实施方案101所述的方法,其中螺杆菌(优选幽门螺杆菌)的一种或更多种抗原选自包括CagA、VacA、GroEL、Hp0231、JHp0940和HtrA的组。
实施方案103:实施方案94至102中任一个所述的方法,其中FliD是全长FliD或其片段。
实施方案104:实施方案94至103中任一个所述的方法,其中所述方法包括使所述样品与相互作用剂反应,其中所述相互作用剂与编码FliD的核酸相互作用,优选地所述相互作用剂与编码FliD的核酸特异性相互作用。
实施方案105:实施方案104所述的方法,其中所述相互作用剂与编码全长FliD或FliD的片段的核酸相互作用。
实施方案106:实施方案104至105中任一个所述的方法,其中所述相互作用剂选自包括引物和探针的组。
实施方案107:实施方案104至106中任一个所述的方法,其中所述相互作用剂和所述样品中存在的所述编码FliD的核酸形成相互作用产物。
实施方案108:实施方案107所述的方法,其中检测所述相互作用产物。
实施方案109:实施方案108所述的方法,其中直接检测所述相互作用产物。
实施方案110:实施方案108所述的方法,其中间接检测所述相互作用产物。
实施方案111:根据实施方案94至103中任一个所述的方法,其中编码FliD的核酸分子通过质谱法、PCR或杂交测定进行检测。
实施方案112:根据实施方案111所述的方法,其中质谱法选自包括LC-ESI-MS/MS、MALDI-MS、串联MS、TOF/TOF、TOF-MS、TOF-MS/MS、三重四级MS和三重四级MS/MS的组。
实施方案113:实施方案94至112中任一个所述的方法,其中所述对象是人类并且螺杆菌感染是幽门螺杆菌感染。
实施方案114:实施方案113所述的方法,其中所述编码FliD的核酸来自幽门螺杆菌。
实施方案115:实施方案114所述的方法,其中所述编码FliD的核酸包含根据SEQIDNO:2的核苷酸序列。
实施方案116:实施方案94至112中任一个所述的方法,其中所述对象是猪并且螺杆菌感染是猪螺杆菌感染。
实施方案117:实施方案116所述的方法,其中所述编码FliD的核酸来自猪螺杆菌。
实施方案118:实施方案117所述的方法,其中所述编码FliD的核酸包含根据SEQIDNO:4的核苷酸序列。
实施方案119:实施方案94至112中任一个所述的方法,其中所述对象是猫并且螺杆菌感染是猫螺杆菌感染。
实施方案120:实施方案119所述的方法,其中所述编码FliD的核酸来自猫螺杆菌。
实施方案121:实施方案120所述的方法,其中所述FliD包含根据SEQIDNO:6的氨基酸序列。
实施方案122:实施方案94至121中任一个所述的方法,其中所述样品选自包括粪便、血清、血浆和全血的组,优选所述样品是粪便。
实施方案123:编码FliD的核酸作为生物标志物的用途。
实施方案124:实施方案123所述的用途,其中所述生物标志物是对象感染螺杆菌的生物标志物。
实施方案125:实施方案123至124中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物,其中所述对象是人并且螺杆菌是幽门螺杆菌。
实施方案126:实施方案125所述的用途,其中所述编码FliD的核酸包含根据SEQIDNO:2的核苷酸序列。
实施方案127:实施方案124至125中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物,其中所述对象是猪并且螺杆菌是猪螺杆菌。
实施方案128:实施方案127所述的用途,其中所述编码FliD的核酸包含根据SEQIDNO:4的核苷酸序列。
实施方案129:实施方案124至125中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆菌的生物标志物,其中所述对象是猫并且螺杆菌是猫螺杆菌。
实施方案130:实施方案129所述的用途,其中所述编码FliD的核酸包含根据SEQIDNO:6的核苷酸序列。
实施方案131:根据实施方案123至130中任一个所述的用途,其中所述生物标志物是预测性生物标志物。
实施方案132:试剂盒,其包含能够与编码FliD或其片段的核酸相互作用的相互作用剂以及至少一种另外的构成要素。
实施方案133:实施方案132所述的试剂盒,其中所述至少一种另外的构成要素选自包括缓冲剂、固相和说明书散页的组。
实施方案134:实施方案133所述的试剂盒,其中所述相互作用剂能够与FliD或其片段特异性相互作用。
实施方案135:实施方案132至134中任一个所述的试剂盒,其中所述相互作用剂选自包括引物和探针的组。
实施方案136:根据实施方案132至135中任一个所述的试剂盒,其中所述试剂盒适用于用来在对象中检测螺杆菌感染的方法或者在用于在对象中检测螺杆菌感染的方法中使用。
实施方案137:根据实施方案136所述的试剂盒,其中所述试剂盒适用于实施方案94至122中任一个所述的方法或者在实施方案94至122中任一个所述的方法中使用。
本发明人出乎意料地发现,FliD(其是也被称为“钩相关蛋白2同源物(hook-associatedprotein2homologue”的蛋白质),是感染螺杆菌特别是幽门螺杆菌的标志物。本发明人还出乎意料地发现,FliD和/或针对FliD的免疫应答可以有利地用作血清学分析中的标志物,并因此分别用作基于或利用待测试螺杆菌特别是幽门螺杆菌感染之对象的样品的任何方法和测定中的标志物,其中所述样品优选地选自包括血清样品、血浆样品、血样品和粪便样品的组。最后,本发明人出乎意料地发现,基于FliD和/或编码FliD的核酸可以检测对象对螺杆菌特别是幽门螺杆菌的感染,其中FliD和/或编码FliD的核酸用作唯一的标志物。换言之,根据本发明,仅基于并且分别依赖于FliD和/或编码其的核酸就可以诊断对象对螺杆菌特别是幽门螺杆菌的感染。对于由感染螺杆菌特别是幽门螺杆菌的对象形成的针对FliD的免疫应答也是如此:根据本发明,仅基于并且分别依赖于针对FliD的免疫应答就可以诊断对象对螺杆菌特别是幽门螺杆菌的感染,其中所述针对FliD的免疫应答由所述对象产生。本发明的另一个优点在于,可以测定通常通过无创性方法获得的样品中之针对FliD的免疫应答和FliD本身,所述无创性方法与通过有创性方法(如生物活检)取得样品的现有技术中的许多检测方法不同。
本领域技术人员应知道,本发明原则上可以应用于检测对象对螺杆菌的任何感染,只要该螺杆菌编码和/或表达FliD。本领域技术人员还应知道,通常,不同物种的对象(例如,人)会感染不同物种的螺杆菌。在对象是人的情况下,螺杆菌的物种是幽门螺杆菌。在对象是猪的情况下,螺杆菌的物种是猪螺杆菌。在对象是猫(包括大型猫科动物)的情况下,螺杆菌的物种是猫螺杆菌。本说明书特别地涉及在人中检测幽门螺杆菌。但是,提及幽门螺杆菌和人仅是出于清楚的原因进行并且考虑上述描述,涉及幽门螺杆菌和人的任何实施方案都同样适用于表达FliD或其同源物的任何其他螺杆菌,以及任何其他物种的对象。优选地,其他物种的对象是患或可能患螺杆菌感染和幽门螺杆菌之同源物种感染的任何哺乳动物,其中这样的螺杆菌和幽门螺杆菌之同源物种表达FliD或其同源物。
本领域技术人员还应知道,对于螺杆菌的每个物种,通常存在多种菌株。螺杆菌物种的这些菌株之FliD的氨基酸序列和核酸序列在氨基酸序列方面通常示出非常高的同一性。更具体地,生物信息学分析揭示了FliD氨基酸序列在所有(>200)幽门螺杆菌菌株中都存在并且是高度保守的。FliD在本发明人分析的约200种幽门螺杆菌菌株中具有97%的同源性。有趣的是,除了其他一些具有部分同源性的非幽门螺杆菌的物种,没有其他已知的与幽门螺杆菌的FliD具有显著基因组或蛋白质组同源性的生物体。幽门螺杆菌FliD蛋白的比较示出FliD在螺杆菌物种中的高度保守,但是其与大部分其他细菌以及真核生物体不同。该分析与该蛋白质的高抗原性预测一起提供了事实上无交叉反应性的理由。
此外,事实上感染或能够感染对象的所有菌株都表达FliD。这解释了为何根据本发明,FliD事实上是幽门螺杆菌各菌株的标志物,并且分别是感染各对象物种的螺杆菌物种之各菌株的标志物。换言之,几乎所有的幽门螺杆菌阳性患者都示出针对FliD的免疫应答。
幽门螺杆菌FliD蛋白质是组装功能性鞭毛的必需元件,而FliD突变菌株是完全非运动性的。鞭毛蛋白在细菌运动性中起核心作用并且是幽门螺杆菌感染侵袭和持续所必需的(Eaton等,1996)。幽门螺杆菌的运动性是胃黏膜损伤发病机理的毒力因子(S.Watanabe等,1997)。幽门螺杆菌FliD基因编码76-kDa的蛋白质(Kim等,1999)。幽门螺杆菌的FliD操纵子由FlaG、FliD和FliS基因以所述顺序组成,受σ(28)依赖性启动子控制。可以以P96786.4在数据库UniProtKB/Swiss-Prot中找到来自幽门螺杆菌之FliD的条目提供了其氨基酸序列和如在幽门螺杆菌多种菌株中所发现的FliD突变等。
本发明的用于在对象中检测螺杆菌感染(优选在对象中检测幽门螺杆菌感染)的方法的特征还可以是这样的:其包括测定来自所述对象的样品是否包含针对FliD的免疫应答、FliD或编码FliD的核酸的步骤。如果来自所述对象的样品包含针对FliD的抗体应答、FliD或编码FliD的核酸,则所述对象正患有螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染;或者过去已经经历过螺杆菌感染,优选幽门螺杆菌感染。
本发明的用于在对象中检测螺杆菌感染(优选在对象中检测幽门螺杆菌感染)的方法也可以应用于不知道是否患有螺杆菌感染(优选幽门螺杆菌感染)的对象,或者不知道是否已经经历过螺杆菌感染(优选幽门螺杆菌感染)的这样的对象。在这一点上,本发明在另一个方面涉及用于确定对象是否正患有螺杆菌感染(优选幽门螺杆菌感染),或者是否过去已经经历过螺杆菌感染(优选幽门螺杆菌感染)的方法。
如本文中优选使用的,表述“过去(inthepast)”是指在由对象获得了或获得样品的时间点之前的时间点,其中所述样品是与本发明的多个方面和/或多个实施方案有关并且特别地在检测对象中的幽门螺杆菌和/或幽门螺杆菌感染中以及在诊断对象中的幽门螺杆菌和/或幽门螺杆菌感染中所使用的样品。
关于本发明的多个方面,特别是本发明的多种方法,本领域技术人员应知道,由感染螺杆菌特别是幽门螺杆菌的对象产生的免疫应答和抗FliD抗体应答持续若干年。这种抗FliD抗体应答的发生率通常在根除幽门螺杆菌后1至5年后为约50%,在根除幽门螺杆菌后6至10年后为约50%,在根除幽门螺杆菌后11至15年后为约25%并且在根除幽门螺杆菌后16至20年后为约25%。鉴于此,诊断为幽门螺杆菌阳性的对象可为在取得样品时实际上正患有幽门螺杆菌感染的对象,或者过去已经经历过幽门螺杆菌感染并且抗FliD免疫应答仍然存在的对象。
就针对FliD的免疫应答是针对FliD的抗体应答并且更具体地是抗FliD抗体应答而言,所述抗FliD抗体通常是IgG或IgA。该类特异性可以用于通过使用抗IgG和/或抗IgA抗体作为检测抗体或捕获抗体来检测抗FliD抗体。在对象是人的实施方案中,检测抗体和捕获抗体优选地是抗人IgG和/或抗人IgA。
关于本发明的多个方面,特别是本发明的多种方法,在一个实施方案中,所述方法可另外地包括检测一种或更多种螺杆菌抗原或者编码所述螺杆菌抗原的核酸。在一个实施方案中,所述螺杆菌抗原是幽门螺杆菌抗原。在另一个实施方案中,所述抗原选自包括CagA、VacA、GroEL、Hp0231、JHp0940和HtrA的组,这些抗原是本领域公知的并且例如在以下文献中进行了描述:YakoobJ等(YakoobJ等,GutandLiver,第4卷,第3期,2010年9月,第345-350页)、SabarthN等(SabarthN等,InfectionandImmunity,2002年11月,第6499-6503页)、GaoL.等(GaoL.等,CancerRes2009;69:(15).2009年8月1日,第6164-6170页)、YamaokaY(YamaokaY,JMedMicrobiol.2008年5月;57(Pt5):545-553页)、MiehlkeS等(MiehlkeS等,Int.J.Cancer:87,322-327(2000))和AthertonJC等(AthertonJC等,CurrentMicrobiology,第39(1999)卷,第211-218页)。CagA的氨基酸序列在本文中公开为SEQIDNO:7,CagA的核苷酸序列在本文中公开为SEQIDNO:8,VacA的氨基酸序列在本文中公开为SEQIDNO:9,VacA的核苷酸序列在本文中公开为SEQIDNO:10,GroEL的氨基酸序列在本文中公开为SEQIDNO:11,GroEL的核苷酸序列在本文中公开为SEQIDNO:12,Hp0231的氨基酸序列在本文中公开为SEQIDNO:13,Hp0231的核苷酸序列在本文中公开为SEQIDNO:14,JHp0940的氨基酸序列在本文中公开为SEQIDNO:15,JHp0940的核苷酸序列在本文中公开为SEQIDNO:16,HtrA的氨基酸序列在本文中公开为SEQIDNO:17,并且HtrA的核苷酸序列在本文中公开为SEQIDNO:18。
在本发明方法的一个实施方案中,通过在来自对象的样品中检测针对FliD的免疫应答,特别是在样品中检测抗FliD抗体来检测所述对象中的螺杆菌感染,更优选幽门螺杆菌感染,所述样品与FliD反应。在一个实施方案中,将样品添加至FliD。优选地,在所述方法中FliD连接至固相。将FliD添加至样品也在本发明的范围内。优选地,FliD以溶液,更优选地以水溶液(如缓冲溶液)添加。在一个优选实施方案中,FliD与样品反应,其中FliD连接至固相。本领域技术人员应知道,FliD与样品在这样的条件下反应,以使得如果所述样品包含针对FliD的免疫应答(特别是抗FliD抗体),则形成相互作用产物。优选地,这样的相互作用产物是FliD和样品中所包含的抗FliD抗体的复合物。
由此形成的相互作用产物可以被直接或间接检测。在直接检测相互作用产物的实施方案中,与样品反应的FliD包含允许检测FliD(特别是当与抗FliD抗体相互作用时)的标记。该类型的标记对于本领域技术人员是已知的并且涵盖放射性标记、荧光标记、染料、纳米颗粒(如金)和酶(如辣根过氧化物酶)。另一些标记是本文中关于抗体标记所公开的那些标记。在间接检测相互作用产物的实施方案中,使相互作用产物随后与检测剂反应,其中所述检测剂与所述相互作用产物特异性结合。所述检测剂可为抗体,优选抗IgG或IgA抗体。检测剂自身通常包含允许所述检测剂之检测(优选地当检测剂与相互作用产物特异性结合时)的标记。
在本发明方法的一些优选实施方案中,相互作用产物通过本领域技术人员已知的酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定来检测(LottspeichF.andZorbasH(编),Bioanalytik,SpektrumAkademischerVerlagHeidelberg,1998)。ELISA可为间接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA或非竞争性ELISA。
在本发明方法的一个替代优选实施方案中,相互作用产物通过侧向流测试来检测,侧向流测试也被称为侧向流免疫色谱测定,其例如在US6,485,982中进行了描述。在一个实施方案中,所述侧向流测试用于本发明的任何方法,其中在来自对象的样品中检测抗FliD抗体。出于举例说明本发明方法实施方案的目的,将描述侧向流测试,其中检测来自对象(其中所述对象是人)之样品的抗FliD抗体。
该技术基于一系列毛细管床(capillarybed),例如多片多孔纸或聚合物。这些组件各自能够快速地运输流体,例如血清、血浆或血。样品垫(pad)充当海绵并保存过量的样品流体。当样品垫饱和时,流体移动至其中存在与抗人抗体缀合的纳米颗粒(优选金纳米颗粒)的缀合物垫。当样品流体迁移至该元件时,其溶解颗粒并且在一个组合的反应中,样品和缀合物混合物流动通过多孔结构。以这种方式,固定在纳米颗粒表面上的抗体在进一步迁移通过下一个毛细管基质时与样品中存在的人IgG结合。在该元件(其通常为疏水膜如硝酸纤维素)上固定有抗原和对照(例如,人IgG)作为测试线或对照线。一旦现在与缀合物颗粒结合的人IgG到达这些线,则固定在膜上的抗原将特异性地捕获抗体复合物。一段时间之后,越来越多的颗粒聚集在抗体部位处并且出现了可简单检测的有色带。在一个实施方案中,仅存在一种抗原,即FliD。在另一个实施方案中,除FliD之外还存在一种或更多种抗原。优选地,一种或更多种抗原选自包括CagA、VacA、GroEL、Hp0231、JHp0940和HtrA的组。
在本发明方法的另一个替代优选实施方案中,通过线测定(lineassay)来检测相互作用产物。这种线测定通常包括多个条带。在所述条带上,高度纯化的重组FliD或能够与FliD相互作用的相互作用剂被固定在条带上。所述条带优选地由硝酸纤维素膜制成。在测试条带上固定FliD以检测样品中的抗FliD抗体,或者FliD与抗FliD抗体结合的情况下,在测试条带上固定抗FliD抗体以检测样品中的FliD的情况下,将条带与样品,优选地与稀释的血清或血浆样品一起孵育,并且抗FliD抗体与FliD结合。在第二步中,将条带与抗人免疫球蛋白抗体(IgG和IgA)一起孵育,其与辣根过氧化物酶偶联。通过由过氧化物酶催化的染色反应来检测特异性结合的抗体。如果抗原-抗体反应发生,形成了相互作用产物,则在条带上的对应点处将出现黑带。在一个实施方案中,测试条带上端的对照带为:
a)条带编号下的反应对照带,其必须示出每个样品的反应。
b)缀合物对照带(IgG、IgA)用于检查所检测的抗体类别。如果例如使用用于检测IgG抗体的测试条带,则IgG缀合物显示清楚带。
c)“截断对照(cut-offcontrol)”:该带的强度允许评估单个抗原带的反应性。
具有该类设计并且抗原不同于FliD的测定从根本上以“recomLineHelicobacterIgG”或“recomLineHelicobacterIgA”可得自于德国诺伊里德的MikrogenGmbH(参考:http://www.mikrogen.de/uploads/txoemikrogentables/dokumente/GARL HP001EN.pdf)。
在用于在对象中检测螺杆菌感染并且更优选地幽门螺杆菌感染的本发明方法的一个实施方案中,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测FliD,FliD通过例如在以下文献中描述的质谱法来检测:LottspeichF.和ZorbasH(编),Bioanalytik,SpektrumAkademischerVerlagHeidelberg,1998。
其中在来自对象的样品中检测FliD的本发明方法的那些实施方案中,与FliD一起形成相互作用产物的相互作用剂优选地为选自包括抗体、适配体和spiegelmer的组中的一种。所述相互作用剂的产生在本领域技术人员的能力范围内。
与FliD结合并且更特别地与FliD特异性结合的抗体的产生对于本领域技术人员是已知的,并且例如在Harlow,E.和Lane,D.,″Antibodies:ALaboratoryManual,″ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY,(1988)中进行了描述。优选地,关于本发明可使用单克隆抗体,其可根据Cesar和Milstein的方案以及基于其的进一步发展来制备。如本文所使用的抗体包括但不限于完全抗体,抗体片段或衍生物如Fab片段、Fc片段以及单链抗体,只要其合适且能够与FliD结合。除单克隆抗体之外也可使用和/或产生多克隆抗体。多克隆抗体的产生对于本领域技术人员也是已知的,并且例如在Harlow,E.和Lane,D.,″Antibodies:ALaboratoryManual,″ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY,(1988)中进行了描述。
可根据本发明使用的抗体可具有一个或数个标志物或标记。所述标志物或标记可用于检测抗体。优选地,所述标志物和标记选自包括以下的组并用于例如ELISA方法中:抗生素蛋白、链霉亲和素、生物素、金、酶(如HRP)和荧光素。这些和另外的标志物以及方法例如在Harlow,E.和Lane,D.,″Antibodies:ALaboratoryManual,″ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY,(1988)中进行了描述。
适配体是这样的D-核酸,其是单链或双链的并且其与靶分子(例如,在本发明中为FliD)特异性相互作用。适配体的制备或选择例如在欧洲专利EP0533838中进行了描述。基本上实现以下步骤。首先,提供核酸(即,潜在适配体)的混合物,其中每种核酸通常包含数个,优选至少八个随后随机化的核苷酸的区段。随后使该混合物与靶分子相接触,由此核酸结合靶分子,例如基于与候选物混合物相比,对靶标增加的亲和力或者与其更大的力。随后使结合核酸与混合物的剩余部分分离。任选地,使用例如聚合酶链式反应扩增由此获得的核酸。这些步骤可重复数次,最终得到具有增加比例的与靶标特异性结合之核酸的混合物,然后任选地从其中选择最终结合的核酸。这些特异性结合的核酸被称为适配体。明显看到,在用于产生或鉴定适配体的方法的任意阶段,可获取单个核酸的混合物的样品以使用标准技术确定其序列。可稳定适配体在本发明的范围内,例如,通过引入产生适配体领域技术人员已知的限定化学基团来稳定适配体。这样的修饰可例如在于在核苷酸的糖部分2’位处引入氨基。
与作为靶分子的FliD结合并且更特别地与其特异性结合的spiegelmer的产生或制备基于类似的原则。Spiegelmer的制备在国际专利申请WO98/08856中进行了描述。Spiegelmer是L-核酸,意指其由L-核苷酸而不是如适配体的D-核苷酸构成。Spiegelmer的特征在于这样的事实:其在生物系统中具有非常高的稳定性,并且与适配体相当地与其所针对的靶分子特异性相互作用。出于产生spiegelmer的目的,产生了D-核酸的异源群并且使该群与靶分子的光学对映体相接触,在这种情况下,例如与FliD之天然L-对映异构体的D-对映异构体相接触。随后,分离未与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸。但是,分离与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸,任选地测定和/或测序,随后基于由D-核酸获得的核酸序列信息合成对应的L-核酸。就序列而言,与上述和靶分子之光学对映体相互作用的D-核酸相同的这些L-核酸将与天然靶分子而非其光学对映体特异性相互作用。与用于产生适配体的方法类似,也可将多个步骤重复数次并因此富集那些与靶分子之光学对映体特异性相互作用的核酸。
在用于在对象中检测螺杆菌感染并且更优选幽门螺杆菌感染的本发明方法的一些实施方案中,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测编码FliD的核酸,相互作用剂选自包括引物和探针的组。考虑到本文所公开的FliD的核苷酸和氨基酸序列,本领域技术人员可以设计并制备这样的引物和探针(参见例如,LottspeichF.和ZorbasH(编),Bioanalytik,SpektrumAkademischerVerlagHeidelberg,1998)。这种相互作用剂可以被标记。多种标记和如何标记相互作用剂的方式对于本领域技术人员是已知的。在一个实施方案中,标记与以上关于抗体所概括的相同。
包含编码FliD或其片段之核酸分子和相互作用剂的相互作用产物可以通过本领域技术人员已知的手段来检测,并且例如在LottspeichF.和ZorbasH(编),Bioanalytik,SpektrumAkademischerVerlagHeidelberg,1998中进行了描述。
在用于在对象中检测螺杆菌感染并且更优选幽门螺杆菌感染的本发明方法的一个实施方案中,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测编码FliD的核酸,编码FliD的核酸通过例如在以下文献中描述的质谱法来检测:LottspeichF.和ZorbasH(编),Bioanalytik,SpektrumAkademischerVerlagHeidelberg,1998。
在用于在对象中检测螺杆菌感染并且更优选幽门螺杆菌感染的本发明方法的一个实施方案中,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测编码FliD的核酸,所述编码FliD的核酸通过例如在以下文献中描述的不同形式的聚合酶链式反应(PCR)来检测:LottspeichF.和ZorbasH(编),Bioanalytik,SpektrumAkademischerVerlagHeidelberg,1998。替代地,编码FliD的核酸通过例如在以下文献中描述的杂交测定来检测:LottspeichF.和ZorbasH(编),Bioanalytik,SpektrumAkademischerVerlagHeidelberg,1998。
在本发明中关于生物标志物的那些方面中,应知道,如本文所限定的针对FliD的免疫应答、FliD和编码FliD的核酸的存在与未治疗患者中的组织学和炎症相关时,所述如本文所限定的针对FliD的免疫应答、FliD和编码FliD的核酸各自充当预测性生物标志物。
本领域技术人员应知道,考虑到本文提供的公开内容,本发明试剂盒的特定设计也在本领域普通技术人员的能力范围内。在一个实施方案中,试剂盒是即用试剂盒。
在本发明的另一个方面,本发明涉及如本文所公开的相互作用剂用于检测如本文所公开的FliD的用途。
如本文优选使用的样品是如从对象直接获得的样品,或者在用于本发明且特别是本发明的方法之前已进行处理的样品。
在本发明多个方面的一个实施方案中和另一些实施方案中,所述对象是假定患有或怀疑患有幽门螺杆菌感染的对象。
在一个实施方案中,螺杆菌感染是感染有螺杆菌或者假定或怀疑感染有螺杆菌。
在本发明任何方面的一个实施方案中,其中第一化合物与第二化合物特异性地相互作用或特异性地结合,所述第一化合物和所述第二化合物之间相互作用或结合的特征在于具有1μM或更小的KD,优选0.25μM或更小的KD,且更优选0.1或更小的KD。
本领域技术人员将理解,在其中检测FliD的那些实施方案中,FliD可作为全长FliD或FliD的片段或全长FliD的片段而存在。如本文优选使用的全长FliD是由作为毒力因子发挥作用的螺杆菌产生的FliD。在一个实施方案中,全长FliD优选由螺杆菌产生的FliD。全长FliD的片段是其氨基酸序列比全长FliD的氨基酸序列短的片段,其中FliD的片段仍然作为毒力因子发挥作用。FliD的片段优选FliD的片段,优选全长FliD的片段,其中所述片段具有足够长的氨基酸序列以使得本领域技术人员能鉴定所述片段是FliD(特别是全长FliD)的片段并排除所述片段是与FliD(特别是全长FliD)不同的蛋白质或多肽的片段。在一个优选的实施方案中,全长FliD包含根据SEQIDNO:1的氨基酸序列。
相同的考虑和定义同样适用于编码FliD的核酸。据此,本领域技术人员将理解,在其中检测编码FliD的核酸的那些实施方案中,编码FliD的核酸可作为编码全长FliD的核酸或编码FliD片段的核酸或编码全长FliD片段的核酸而存在。如本文优选使用的全长FliD是由作为毒力因子发挥作用的螺杆菌产生的FliD。在一个实施方案中,全长FliD优选由螺杆菌产生的FliD。全长FliD的片段是其氨基酸序列比全长FliD的氨基酸序列短的片段,其中FliD的片段仍然作为毒力因子发挥作用。FliD的片段优选FliD的片段,优选全长FliD的片段,其中所述片段具有足够长的氨基酸序列以使得本领域技术人员能鉴定所述片段是FliD(特别是全长FliD)的片段并排除所述片段是与FliD(特别是全长FliD)不同的蛋白质或多肽的片段。在一个优选的实施方案中,编码全长FliD的核酸包含根据SEQIDNO:2的核苷酸序列。
编码FliD的核酸的片段优选编码FliD,优选编码全长FliD的核酸的片段,其中所述核酸的片段具有足够长的核苷酸序列以使得本领域技术人员能鉴定所述片段是编码FliD(特别是全长FliD)的核酸的片段并排除所述核酸的片段是编码与FliD(特别是全长FliD)不同的蛋白质或多肽的核酸的片段。
本领域技术人员还将理解,在其中检测如本文所定义的针对FliD之免疫应答的本发明方法的那些实施方案中,与如本文所定义的针对FliD的免疫应答发生反应的FliD,可以是由感染对象或推测感染对象的螺杆菌物种产生的FliD,可以是如本文所定义的全长FliD或如本文所定义的FliD的片段。此外,在一个实施方案中,FliD的片段是比FliD具有更短氨基酸序列的FliD的片段,其中所述片段可用于本发明方法的所述实施方案中,同时使得与如本文所定义的针对FliD之免疫应答特异性地相互作用或特异性地检测如本文所定义的针对FliD的免疫应答。
如在本发明的多个方面和/或本发明的多个实施方案中使用的靶向编码FliD之核酸的与本发明相关的引物是选自包括以下组中的一种:包含根据SEQIDNO:21的核苷酸序列的引物、包含根据SEQIDNO:22的核苷酸序列的引物、包含根据SEQIDNO:23的核苷酸序列的引物、包含根据SEQIDNO:24的核苷酸序列的引物、包含根据SEQIDNO:25的核苷酸序列的引物、包含根据SEQIDNO:26的核苷酸序列的引物、包含根据SEQIDNO:27的核苷酸序列的引物和包含根据SEQIDNO:28的核苷酸序列的引物。优选地,所述引物是至少两种引物的组合,其中:
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:21的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:22的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:21的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:24的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:21的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:26的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:21的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:28的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:23的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:22的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:23的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:24的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:23的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:26的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:23的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:28的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:25的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:22的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:25的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:24的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:25的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:26的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:25的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:28的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:27的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:22的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:27的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:24的核苷酸序列的引物;
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:27的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:26的核苷酸序列的引物;或者
所述至少两种引物的第一引物是包含根据SEQIDNO:27的核苷酸序列的引物,而所述至少两种引物的第二引物是包含根据SEQIDNO:28的核苷酸序列的引物。
本文所提到的多个序列(SEQIDNo:)、所述SEQINNO:代表的化合物、获取所述序列的生物体,以及在一些情况下,将在公众可获得的数据库中所述序列对应条目的指示总结于下表1中:
表1:
SEQIDNO:1是由幽门螺杆菌表达的FliD的氨基酸序列,其对应于GenBank条目ACI27464.1。
SEQIDNO:2是由幽门螺杆菌表达的FliD的核苷酸序列(cDNA),其对应于Genbank条目CP00l173.1。
SEQIDNO:3是由猪螺杆菌表达的FliD的氨基酸序列,其对应于NCBI参考序列WP_006563874.1。
SEQIDNO:4是由猪螺杆菌表达的FliD的核苷酸序列(cDNA),其对应于GenBank条目ADGY01000008.1。
SEQIDNO:5是由猫螺杆菌表达的FliD的氨基酸序列,其对应于NCBI参考序列YP_004073770.1。
SEQIDNO:6是由猫螺杆菌表达的FliD的核苷酸序列(cDNA),其对应于GenBank条目FQ670179.2。
SEQIDNO:7是幽门螺杆菌G27的CagA的氨基酸序列,其对应于NCBI参考序列YP_002266135.1。
SEQIDNO:8是幽门螺杆菌G27的CagA的核苷酸序列(cDNA),其对应于GenBank条目JQ318032.1。
SEQIDNO:9是幽门螺杆菌G27的VacA的氨基酸序列,其对应于NCBI参考序列YP_002266461.1。
SEQIDNO:10是幽门螺杆菌G27的VacA的核苷酸序列(cDNA),其对应于NCBI参考序列NC_011333.1。
SEQIDNO:11是幽门螺杆菌G27的GroEL的氨基酸序列,其对应于NCBI参考序列YP_002265651.1。
SEQIDNO:12是幽门螺杆菌G27的GroEL的核苷酸序列(cDNA),其对应于NCBI参考序列NC_011333.1。
SEQIDNO:13是幽门螺杆菌26695的Hp0231的氨基酸序列,其对应于NCBI参考序列NP_207029.1。
SEQIDNO:14是幽门螺杆菌26695的Hp0231的核苷酸序列(cDNA),其对应于NCBI参考序列NC_000915.1。
SEQIDNO:15是幽门螺杆菌J99的JHp0940的氨基酸序列,其对应于NCBI参考序列NP_223657.1。
SEQIDNO:16是幽门螺杆菌J99的JHp0940的核苷酸序列(cDNA),其对应于NCBI参考序列NC_000921.1。
SEQIDNO:17是幽门螺杆菌G27的HtrA的氨基酸序列,其对应于NCBI参考序列YP_002266040.1。
SEQIDNO:18是幽门螺杆菌G27的HtrA的核苷酸序列(cDNA),其对应于NCBI参考序列NC_011333.1。
SEQIDNO:19是从幽门螺杆菌中克隆FliD基因所使用的引物。
SEQIDNO:20是从幽门螺杆菌中克隆FliD基因所使用的引物。
SEQIDNO:21是在实施例9的PCR1中使用的正向引物。
SEQIDNO:22是在实施例9的PCR1中使用的反向引物。
SEQIDNO:23是在实施例9的PCR2中使用的正向引物。
SEQIDNO:24是在实施例9的PCR2中使用的反向引物。
SEQIDNO:25是在实施例9的PCR3中使用的正向引物。
SEQIDNO:26是在实施例9的PCR3中使用的反向引物。
SEQIDNO:27是在实施例9的PCR4中使用的正向引物。
SEQIDNO:28是在实施例9的PCR4中使用的反向引物。
本领域技术人员将理解,在核苷酸序列是DNA序列且特别是cDNA序列的情况下,本文还公开了RNA序列,其与这样的DNA序列和cDNA序列的不同仅在于糖部分是核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸。
现在通过以下附图和实施例进一步说明本发明,其并不旨在限制保护的范围。从所述附图和实施例中可获得另外的特征、实施方案和优点,其中:
图1示出了在本发明方法中使用的线测定的一个实施方案,其用于检测来自组织学上诊断为幽门螺杆菌阳性之20个人患者血清样品中的抗FliD抗体;
图2示出了可用于本发明方法的侧向流测定的一个实施方案,其用于检测样品(例如来自人对象的全血样品)中的抗FliD抗体,其中图2A示出了所述测定的示意性设计,而图2B描述了所述测定的结果;
图3是表示来自人的样品中抗FliD应答的发生率作为幽门螺杆菌根除后年数之函数的图。
图4示出了FliD与两种已知抗原相比的ROC曲线;
图5示出了使用小鼠抗FliD血清在不同浓度下检测FliD(而不是Tig或gGT)的Western印迹分析的结果;
图6示出了使用聚合酶链式反应1(PCR1)、聚合酶链式反应2(PCR2)、聚合酶链式反应3(PCR3)或聚合酶链式反应4(PCR4)用于检测存在于来自已诊断为幽门螺杆菌阳性的患者之代表性样品中的基因组DNA的一系列Southern印迹;
图7示出了使用培养的幽门螺杆菌的全蛋白裂解物进行的代表性Western印迹分析的结果;和
图8示出了用于确定FliD是否由每个Western印迹下方所示的微生物表达的两个Western印迹分析的结果。
实施例1:幽门螺杆菌FliD基因的克隆
如由Sambrook等(Sambrook等,1989)描述的,在标准条件下进行所有的DNA操作。简言之,使用来自幽门螺杆菌菌株J99的基因组DNA作为模板通过PCR来扩增FliD基因。使用以下寡核苷酸作为引物:5′-CATATGGCAATAGGTTCATTAA-3′(SEQIDNO:19)和5′-CTCGAGATTCTTTTTAGCCGCTGC-3′(SEQIDNO:20)。使用这种方法在正向引物的5′端引入NdeI位点,并且在反向引物的5′端引入XhoI位点。PCR扩增后,将产物(2058bp)连接到DTZ57R/T克隆载体(InsTAcloneTMPCR克隆试剂盒,MBIFermentas,Lithuania)中。随后,通过PCR和测序确认插入片段,并使用NdeI和XhoI限制性酶将其克隆到PET-28a(+)表达载体(Qiagen,USA)中。
实施例2:重组FliD的表达、纯化和识别
用pET-28a(+)-fliD转化大肠杆菌BL21(Qiagen,USA)感受态细胞并接种于具有抗生素(卡那霉素,50μg/ml)的LB培养液中。通过添加0.6光密度(OD600)的1mmol/L的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。4小时后收获细胞并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行全裂解物的蛋白质分析。使用亲和色谱法(HisTrapcrude,GEHealthcare)纯化可溶性带组氨酸标签的蛋白质。作为第二净化(polishing)步骤以及用于缓冲液交换,进行尺寸排阻色谱法(Superdex75,GEHelthcare)。收集相关级分并用10kDa截断的离心过滤装置(Millipore)浓缩并储存在-80℃。使用抗His标签-HRP抗体和小鼠抗幽门螺杆菌HRP抗体(Pierce,Rockford,USA)通过Western印迹评估纯化的重组蛋白质并通过ECL系统(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)进行检测。
从幽门螺杆菌菌株J99DNA扩增FliD基因揭示了通过测序确认并连接到表达载体pET-28a(+)中的2.05kb的单一PCR产物(数据未示出)。在转化到大肠杆菌表达菌株BL21DE3中并用IPTG诱导后,使用商业化的多克隆抗幽门螺杆菌抗血清在Western印迹上可观察到清楚的单一带。如在材料和方法中所述将蛋白质纯化至>90%的纯度(数据未示出),并通过Western印迹再次确认(数据未示出)。
实施例3:rFliD特异性抗体的产生和纯化
根据略微进行了修改的Hay等(Hay等,2002)的方案,用经纯化的蛋白质免疫成熟的白色新西兰兔(NewZealandrabbit)。简言之,通过肌内注射(i.m.)250μg经纯化的重组蛋白质(0.5ml)与相同体积(0.5ml)的弗氏完全佐剂进行免疫。对于唤起免疫(recallimmunization),在4、6、8和10周后,用在相同体积(0.5ml)的弗氏不完全佐剂中制备的125μg经纯化的蛋白质加强兔子。在免疫之前采集血清样品作为阴性对照。最后,在最后一次免疫之后两周,收集血液并分离血清。根据制造商的方案(Pharmacia,1988)使用制备的rFliD缀合柱通过sepharose-4B亲和色谱法来纯化多克隆IgG抗体。使用蛋白质浓度为50μg/ml的超声上清液通过Western印迹来检测幽门螺杆菌(J99)的FliD表达。针对rFliD蛋白产生的兔多克隆IgG抗体用作一抗(1∶5000稀释),针对兔IgG的HRP标记的绵羊抗体(AvicennaResearchInstitute,Tehran,Iran)作为二抗(1∶3000稀释)以及使用ECL系统进行检测(Chen等,2001)。
此外,为了测试重组FliD的抗原性并使其与天然蛋白质进行比较,产生了兔多克隆抗血清。在第三次免疫后已经确定了抗体效价,并且在第四次加强后抗体效价达到高水平,这证实了FliD的良好免疫原性。兔抗血清能够识别幽门螺杆菌裂解物中经纯化的rFliD和FliD(数据未示出)。
实施例4:ELISA的开发
用在PBS中1μg/ml浓度的100μlFliD蛋白包被ELISA板,并在4℃下孵育过夜。在37℃下,用含有2.5%牛血清白蛋白(BSA,Sigma)的磷酸缓冲盐水(PBS)将包被的孔封闭两小时。通过使用患者血清的最佳稀释液(1∶100稀释)作为一抗、HRP-缀合的抗人IgG(Promega,Mannheim,Germany)(1∶100稀释)作为二抗以及TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)作为底物,对在该研究中使用的所有幽门螺杆菌阳性和阴性血清学样品针对FliD的抗体进行了筛选。此外,对于每种血清,将孔不进行包作为对照。如果其OD450值超过阴性血清样品的平均值加3SD,则认为患者血清样品的ELISA结果是阳性的(Chen等,2001)。
实施例5:FliD线测定的开发
准备基于固定在硝酸纤维素上的重组幽门螺杆菌蛋白的线免疫测定。与ELISA相比,该测试原理使得通过分别应用不同的单抗原就能针对幽门螺杆菌的多种抗原鉴定特异性抗体。
rFliD与另一些高度纯化的重组幽门螺杆菌抗原(CagA、VacA、GroEL、UreA(脲酶A)、HcpC(富含半胱氨酸的蛋白C)(Mittel等,2003)和gGT(γ-谷氨酰转移酶)一起固定在硝酸纤维素膜条带上。使用从先前所述包含20种定义的幽门螺杆菌组织学阳性样品和20种定义的幽门螺杆菌组织学阴性样品的研究群体中选择的标准血清样品,凭经验确定用于rFlliD的合适的线条件。对于每种抗原,通过排列(line)和筛选的重复循环来调整最佳的抗原浓度以及理想地选择添加剂(如去污剂、二硫苏糖醇和NaCl)。为第一批次(lot)的理想产物规格选择最佳呈现抗原表位和与膜最佳结合,通过完美的带外观可观察的,以及最佳分辨阴性和阳性样品的条件。在包含兔抗人IgG/IgM/IgA抗体的条带上端添加对照带作为孵育对照,人IgG、IgM或IgA抗体作为缀合对照以及允许评估单个抗原带之反应性的截断对照(cutoffcontrol)。
带强度的扫描和光密度分析后,使用对照作为内部参照来计算每个带的比率。通常,截断对照带的得分为20至30,而强的阳性带的得分可高达600分。认为得分高于各条带单独对照的每个带是阳性的(比率>1)。
在图1中描述了各自的线测定。
实施例6:用于诊断幽门螺杆菌的侧向流测定的原型(prototype)
使用以上限定的材料,基于本文所公开的与设计侧向流测定相关的原理而开发侧向流测定。
在图2中描述了这种侧向流测定的原型,其中图2A举例说明了所述测定的示意设计,并且图2B描述了从使用所述测定的人获得的样品的分析结果,其中检测了抗FliD抗体。
如可从图2A中看出,所述测定使用了抗hIgG涂布的金纳米颗粒。rFliD以及重组CagA作为抗原存在。hIgG也被固定来充当对照。通过硝酸纤维素形成多孔结构。对照带表明该系统正常工作。FliD带表明患者具有活性感染或新治疗的感染。在活性感染(+FliD带)的情况下,CagA带表示这种感染必须要被治疗。
实施例7:来自人的样品的分析
总共有618个人患者(男308,女310)参与了该研究。在接受了该研究目的的解释后,从每个患者获得了知情同意书并在开始任何治疗之前的内窥镜检查时采集血液样品。分离血清并储存在-20℃。感染的诊断基于作为金标准(goldstandard)的组织病理学。当组织病理学的结果是阳性时,则认为患者是幽门螺杆菌阳性的。通过FliD线测定对所有患者进行了筛选,并且通过如上所述的FliDELISA和如上所述的线测定对246个血清的亚组进行了测试。
表2示出了使用所述FliDELISA的结果。更具体地,表2示出了在比较幽门螺杆菌阴性和阳性人类患者的ELISA中的FliD血清学应答。
表3示出了对患者组的亚组使用所述线测定的结果。更具体地,表3示出了在比较幽门螺杆菌阴性和阳性患者的线测定中的FliD血清学应答。
使用FliDELISA在170个报道阳性的样品中检测到165个阳性样品,而通过ELISA在76个报道阴性的样品中再确认了73个为阴性(表2)。总之,在基于ELISA诊断幽门螺杆菌感染中应用FliD具有96%的特异性和97%的敏感性。有趣的是,ELISA阴性的这五种情况在线印迹中同样具有低的且几乎没有正的分数,其仅高于截断值(比率为1.2至2.2)。通过线印迹认为其中之一是幽门螺杆菌阴性的,而其他四个均为线印迹阳性的,与其他几种抗原进行反应(数据未示出)。非常值得注意的是,通过这两项测试仅有一个样品是阴性的。
关于针对FliD的抗体应答,使用线测定对618个人患者(其中一部分已通过ELISA进行了筛选)的整个组进行分析。通过线测定将318个患者中的310个以组织病理学阳性评估为阳性(97.4%的高敏感性),而线测定达到99%的特异性(表2)。仔细地检查了来自得到不一致结果之患者的结果。在线测定中8个血清对FliD为阴性,但是示出了与其他抗原的反应性,这表明此处FliD确实未被作为抗原识别。这8个样品中,一个对FliD带没有任何反应性。7个有弱的反应性,这几乎不低于截断值(比率为0.6至0.95),并且这些中的四个一般对所有其他识别的抗原具有弱反应性(未示出)。其中FliD给出“假阳性”结果的所有三个样品也示出与其他带的反应性。所有这些包含FliD的带相对较弱,但明显高于截断值。
从所述样品,将抗FliD抗体应答的发生率确定为根除后年数的函数。结果示于图3中。如可从图3中看出,在根除幽门螺杆菌后16至20年后仍有约25%的抗FliD抗体应答的发生率。
从上述样品中,已经对FliD、CagA和UreA准备了接受者操作特征(receiveroperatingcharacteristics)(ROC)曲线。结果示于图4中。从所述图4中明显的是在用于检测幽门螺杆菌感染方面,FliD比现有技术的两种抗原更有利。
实施例8:FliD序列的生物信息学分析
使用生物信息学工具,将幽门螺杆菌G27菌株的FliD蛋白与其他生物体(主要是原核生物)进行了广泛地比较。该分析示出在超过200个幽门螺杆菌菌株之间有高于97%的同源性。
结果示于表4中。
实施例9:在幽门螺杆菌中FliD的存在和表达
样品
对来自人患者的81个幽门螺杆菌分离物进行了该研究。在选择性板上通过常规的细菌培养将样品诊断为阳性。在这样的测试中,使细菌在微好氧条件(10%CO2、5%O2、8.5%N2以及37℃)下在Wilkins-Chalgren血琼脂板上生长36小时,并通过生化测试来证实其对氧化酶、过氧化氢酶和脲酶为阳性。培养的细菌的一部分用于DNA分离,其余用于制备Western印迹分析的蛋白质裂解物。
多克隆小鼠抗-FliD血清
将3个C57BL6小鼠用重悬于PBS中的30μg重组幽门螺杆菌FliD作为抗原和10μgCT(霍乱毒素)作为佐剂免疫3次(每周)。最后一次加强免疫后一周,将小鼠放血并合并血清。在western印迹分析中测试合并血清的抗原性和特异性。
Western印迹分析
为了建立该测定的最佳条件,在8%SDS凝胶上施加于相同条件下产生并纯化的不同浓度的重组FliD蛋白以及其他重组对照蛋白(Tig(触发因子(Tomb等,1997))和gGT)。在使蛋白质在硝酸纤维素膜(Whatman/GEHealthcare,Freiburg,Germany)上进行印迹后,将膜在5%的脱脂牛奶中于室温下封闭1小时并用抗血清的不同稀释液作为一抗将其孵育过夜。用HRP标记的抗小鼠IgG孵育膜后,通过添加ECLWestern印迹检测试剂可检测带。
结果示于图5中,其中在所示SDS凝胶的右侧指示了向单个泳道施加的抗原及其量。使用小鼠抗血清的最佳稀释液(1∶2000)。
幽门螺杆菌基因组中存在之FliD的ORF的PCR分析
基于根据SEQIDNO:2之FliD的DNA序列来设计四个PCR。通过针对genebank之全部细菌的核苷酸序列的blast分析确认如表5所示的每对引物的特异性。使用幽门螺杆菌DNA作为阳性对照并使用10个其他微生物的基因组DNA作为阴性对照建立PCR。使用GoTaq聚合酶mastermix(Promega)进行PCR,退火温度56℃,延伸时间30秒。
表5:用于PCR分析的引物。
结果
FliD的ORF存在于所有幽门螺杆菌患者分离物(从患者组织活检物中分离的经培养细菌)中。可通过用于该测定的所有四个PCR来确认FliD之ORF的存在。由从81个幽门螺杆菌样品中分离的DNA进行的PCR1、PCR2和PCR3全部是阳性的。而PCR4对79个样品呈阳性(图6)。通过使用分离自以下的DNA来证实所述测定的特异性:铜绿假单胞菌(P.aeroginosa,ATCC27813)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca,ATCC700324)、白色念珠菌(Candidaalbicans,ATCC90028)、粪肠球菌(Entrococcusfaecalis,ATCC29292)、A群链球菌(Strep.GroupA,ATCC19615)、鼠伤寒沙门氏菌(S.thyphimurium,ATCC13311)、金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC25923)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis,ATCC18228)、流感嗜血杆菌(H.influensae,ATCC49247)和大肠杆菌(E.coli,ATCC25922)。
如可从描述使用分离自经培养的幽门螺杆菌(其分离自患者组织活检物)的基因组DNA进行的代表性PCR分析之结果的图6中看出,FliD的ORF(开放阅读框)在几乎所有的幽门螺杆菌分离物中均存在。因此,PCR结果证实了在基因组DNA中存在FliD。在图6中,泳道上方的数字表示内部样品号。
至于检测已被诊断为幽门螺杆菌阳性的患者之样品中的FliD蛋白,FliD蛋白在97.5%的样品中是可检测的。使用Western印迹分析可以证明,FliD蛋白的表达在81个幽门螺杆菌蛋白质裂解物的79个中是可检测的。结果示于图7中。在图7中,泳道上方的数字表示内部样品号。
当通过Western印迹分析来自其他微生物的蛋白质裂解物时,通过阴性结果证实该测定的特异性。其结果示于图8中。如从图8可以看出,除了具有链霉亲和素标签的重组FliD(2个Western印迹的泳道2)和不具有链霉亲和素标签的重组FliD(2个Western印迹的泳道3)之外,蛋白质裂解物来自铜绿假单胞菌(ATCC27813)(左侧Western印迹,泳道4)、产酸克雷伯氏菌(ATCC700324)(左侧Western印迹,泳道5)、白色念珠菌(ATCC90024)(左侧Western印迹,泳道6)、粪肠球菌(ATCC29292)(左侧Western印迹,泳道7)、A群链球菌(StreptococcusGroupA,ATCC19615)(左侧Western印迹,泳道8)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC13311)(右侧Western印迹,泳道4)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)(右侧Western印迹,泳道5)、表皮葡萄球菌(ATCC18228)(右侧Western印迹,泳道6)、流感嗜血杆菌(ATCC49247)(右侧Western印迹,泳道7)和大肠杆菌(ATCC25922)(右侧Western印迹,泳道8)。
在本说明书中提到了现有技术的多个文件,其完整引用如下所述且其通过引用并入。
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在本说明书中所公开的本发明的特征、序列表、权利要求书和/或附图可以单独地和以其任何组合的形式两者成为用于以本发明的多种形式实现本发明的材料。
Claims (15)
1.用于在对象中检测幽门螺杆菌(H.pylori)感染的方法,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测针对FliD的免疫应答,其中所述免疫应答包括抗FliD抗体。
2.权利要求2所述的方法,其中所述抗FliD抗体是IgG抗体和/或IgA抗体。
3.权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述检测通过ELISA、侧向流测定或线测定进行。
4.对象中针对FliD的免疫应答作为生物标志物的用途,其中所述生物标志物是所述对象感染幽门螺杆菌的生物标志物并且其中所述针对FliD的免疫应答包括抗FliD抗体。
5.试剂盒在根据权利要求1至3中任一项所述的方法中的用途,所述试剂盒包含FliD或其片段和至少一种另外的构成要素。
6.用于在对象中检测幽门螺杆菌感染的方法,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测FliD或其片段。
7.权利要求6所述的方法,其中所述检测通过ELISA、线免疫测定、侧向流测定或质谱法进行。
8.FliD作为生物标志物的用途,其中所述生物标志物是对象感染幽门螺杆菌的生物标志物。
9.试剂盒在根据权利要求6至7中任一项所述的方法中的用途,所述试剂盒包含能够与FliD或其片段相互作用的相互作用剂以及至少一种另外的构成要素。
10.用于在对象中检测幽门螺杆菌感染的方法,其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测编码FliD或其片段的核酸。
11.权利要求10所述的方法,其中通过质谱法、杂交测定或PCR来检测所述编码FliD的核酸分子。
12.编码FliD的核酸作为生物标志物的用途,其中所述生物标志物是对象感染幽门螺杆菌的生物标志物。
13.试剂盒在权利要求10至11中任一项所述的方法中的用途,所述试剂盒包含能够与编码FliD或其片段的核酸相互作用的相互作用剂以及至少一种另外的构成要素。
14.权利要求1至3、6至7和10至11中任一项所述的方法,其中所述方法还包括检测螺杆菌(Helicobacter),优选幽门螺杆菌的一种或更多种抗原,其中所述一种或更多种抗原选自包括CagA、VacA、GroEL、Hp0231、JHp0940和HtrA的组。
15.权利要求1至3、6至7、10至11和14中任一项所述的方法,其中所述样品选自血清、血浆、全血和粪便。
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