ES2683628T3 - Método para la detección de infección por H. pylori - Google Patents

Abstract

Un método de detección de la infección por H. pylori en un sujeto, en el que el método comprende detectar en una muestra del sujeto una respuesta inmune contra FliD, en el que la respuesta inmune comprende un anticuerpo anti-FliD, en el que el método comprende hacer reaccionar la muestra con FliD o un fragmento de la misma, en el que el fragmento tiene una secuencia de aminoácidos que es lo suficientemente larga como para identificar el fragmento que es un fragmento de FliD y para excluir que el fragmento es un fragmento de una proteína o polipéptido diferente de FliD.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la deteccion de infeccion por H. pylori

La presente invencion se refiere a un metodo de deteccion de la infeccion por H. pylori y a un kit para usar en el metodo de deteccion de la infeccion por H. pylori.

Helicobacter pylori (H. pylori), una bacteria microaerofila, Gram-negativa y espiral esta colonizando aproximadamente la mitad de la poblacion mundial y se considera que es un patogeno gastrico humano espedfico (Michetti, et al., 1999). La mayona de las personas infectadas desarrollan gastritis cronica asintomatica. Sin embargo, en algunos sujetos, la infeccion causa gastritis cronica, ulceracion peptica y atrofia, y desempena un papel importante en el desarrollo de linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT), adenocarcinoma gastrico y linfoma no Hodgkin gastrico primario (Suganuma, et al., 2001).

La Organizacion Mundial de la Salud ha categorizado H. pylori como un carcinogeno de clase I (Goto, et al., 1999), y se ha demostrado evidencia directa de carcinogenesis en modelos animales (Honda, et al., 1998; T. Watanabe, et al., 1998). La erradicacion de H. pylori puede prevenir el cancer gastrico en humanos (Uemura, et al., 2001). Las estrategias de prueba y tratamiento se han considerado en poblaciones con alto riesgo de cancer gastrico (Yamaoka, et al., 1998). Sin embargo, este enfoque se ve obstaculizado por la falta de sistemas de evaluacion eficientes y asequibles, especialmente para los pafses de bajo nivel socioeconomico. En estos pafses, solo se aplican las pruebas serologicas, la mayona de las cuales tienen un rendimiento deficiente o no estan bien validadas. Para la serologfa de H. pylori, hay varios marcadores individuales espedficos conocidos y descritos. Estos factores se han aplicado en muchos enfoques de diagnostico, pero casi todos tienen limitaciones significativas que los hacen inadecuados para el diagnostico de H. pylori. Por ejemplo, la protema asociada a citotoxina (CagA) es una protema del H. pylori muy bien caracterizada. Se codifica en el cag-PAl (gen asociado a citotoxina de la isla de patogenicidad y se describe como una protema oncogenica (Franco, et al., 2005; Murata-Kamiya, et al., 2007). Esta protema tambien es un antfgeno altamente inmunogenico, por lo que es un marcador frecuentemente usado para las pruebas serologicas. La positividad de CagA se puede usar como un indicador de la virulencia de H. pylori porque los individuos infectados con cepas positivas para CagA tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades gastroduodenales. Sin embargo, no es apropiado como marcador unico, ya que solo un subgrupo de cepas de H. pylori es CagA positivo. Ademas, la positividad de CagA no es una caractenstica distintiva de la infeccion activa ya que los pacientes erradicados de H. pylori mantienen anticuerpos contra CagA durante muchos anos (Fusconi, et al., 1999). Por lo tanto, siempre se debe combinar con otros antfgenos apropiados en las pruebas serologicas para confirmar la positividad. Otra protema del H. pylori bien caracterizada es la citotoxina vacuolizante (VacA). Se informo que induda vacuolacion en celulas expuestas a sobrenadantes de H. pylori o protemas purificadas (Cover & Blaser, 1992). El gen de vacA codifica una protoxina de 140 kDa, en el que la secuencia senal amino terminal y el fragmento carboxi terminal se escinden proteolfticamente durante la secrecion, dando lugar a una protema activa con una masa molecular de 88 kDa que se anade a hexameros y forma un poro (Montecucco & de Bernard, 2003). Esta protema consiste en dos regiones diferentes. Una secuencia de senal (s1a, s1b, s2) y una region media (m1, m2), ambas con elevadas variaciones alelicas que parecen regular la actividad citotoxica (Atherton, et al., 1995). La alta diversidad de VacA hace que esta protema no sea adecuada para las pruebas serologicas.

Otra protema del H. pylori bien caracterizada, GroEL, pertenece a la familia de chaperonas moleculares, que se requieren para el plegamiento apropiado de muchas protemas bajo condiciones de estres (Dunn, et al., 1992). En diferentes estudios se demostro que esta protema esta altamente conservada entre diferentes cepas de H. pylori y que su seropositividad era incluso mayor que para CagA en pacientes infectados (Macchia, et al., 1993; Suerbaum, et al., 1994). Tambien, en estudios realizados por los presentes inventores, se observo que un estado serologico positivo para GroEL se encontraba con mayor frecuencia en pacientes alemanes con cancer gastrico en comparacion con controles emparejados (datos no publicados). Tambien, se sugiere que los anticuerpos contra GroEL pueden persistir por mas tiempo despues de la perdida de infeccion por H. pylori relacionada con la enfermedad. De este modo, GroEL puede ser un marcador apropiado de infeccion actual o pasada, y puede ser util para superar la subestimacion del riesgo de cancer gastrico relacionado con H. pylori debido a la eliminacion de la infeccion (Gao et al., 2009).

El documento WO 2004/094467 A2 da a conocer un metodo de diagnostico in vitro de infeccion por H. pylori mediante deteccion directa de antfgenos de H. pylori en el nivel de acido nucleico o protema.

El documento WO 98/27432 A1 se refiere a un metodo serologico para detectar infeccion por H. pylori usando al menos un antfgeno comun de tipo H. pylori y al menos un antfgeno de tipo I espedfico de H. pylori.

El documento WO 96/40893 A1 describe secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos relacionadas con H. pylori para aplicaciones de diagnostico y terapeuticas.

El problema que subyace a la presente invencion fue la provision de un metodo de deteccion de la infeccion por H. pylori con alta sensibilidad y/o alta especificidad. Otro problema que subyace a la presente invencion fue la provision de un ensayo que, en comparacion con los ensayos de la tecnica anterior, conduce a resultados menos falsos positivos y menos falsos negativos, particularmente en enfoques basados en la poblacion. Un problema adicional que subyace a la presente invencion fue proporcionar medios para llevar a cabo tales metodos y tales ensayos, respectivamente. Un

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problema adicional subyacente a la presente invencion fue la provision de un biomarcador para pacientes infectados con H. pylori, por lo que el biomarcador preferiblemente no muestra ninguna reactividad cruzada con otras bacterias y protemas, peptidos o moleculas de acido nucleico que codifiquen dichas protemas y peptidos en particular.

Estos y otros problemas subyacentes a la presente invencion se resuelven mediante el contenido de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas se pueden tomar de las reivindicaciones dependientes adjuntas. El alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.

Tambien se describen en este documento los siguientes puntos.

Punto 1: Un metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter y mas preferiblemente una infeccion por H. pylori en un sujeto, en el que el metodo comprende detectar en una muestra del sujeto una respuesta inmune contra FliD.

Punto 2: El metodo del punto 1, en el que, si se detecta una respuesta inmune contra FliD en la muestra del sujeto, el sujeto padece una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori, o el sujeto ha experimentado una infeccion por Helicobacter. Infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori, en el pasado.

Punto 3: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 2, en el que, si no se detecta respuesta inmune contra FliD en la muestra del sujeto, el sujeto no sufre una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori.

Punto 4: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 2, en el que, si no se detecta una respuesta inmune contra FliD en la muestra del sujeto, el sujeto ha experimentado una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori, en el pasado.

Punto 5: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que la respuesta inmune contra FliD es una respuesta de anticuerpos contra FliD, preferiblemente una respuesta de anticuerpos anti-FliD.

Punto 6: El metodo del punto 5, en el que la respuesta inmune contra FliD es una respuesta de anticuerpos contra FliD y en el que la respuesta del anticuerpo contra FliD comprende al menos un anticuerpo anti-FliD seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo IgG y un anticuerpo IgA.

Punto 7: El metodo del punto 5, en el que la respuesta inmune contra FliD es una respuesta de anticuerpos anti-FliD y en el que la respuesta del anticuerpo anti-FliD comprende al menos un anticuerpo anti-FliD seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo IgG y un anticuerpo IgA.

Punto 8: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 7, en el que el sujeto esta infectado con Helicobacter, preferiblemente H. pylori, que expresa FliD.

Punto 9: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el sujeto es diferente de un sujeto que esta inmunosuprimido, preferiblemente el sujeto es diferente de un sujeto que esta bajo terapia inmunosupresora.

Punto 10: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 9, en el que el metodo comprende ademas detectar uno o mas antfgenos de Helicobacter, preferiblemente de H. pylori.

Punto 11: El metodo del punto 10, en el que el uno o mas antfgenos de Helicobacter, preferiblemente H. pylori, se selecciona del grupo que comprende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 y HtrA.

Punto 12: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 11, en el que el metodo comprende hacer reaccionar la muestra con FliD o un fragmento de la misma.

Punto 13: El metodo del punto 13, en el que el metodo comprende hacer reaccionar la muestra con una FliD de longitud completa.

Punto 14: El metodo de uno cualquiera de los puntos 12 a 13, en el que la respuesta inmune contra FliD comprende al menos uno de un compuesto humoral capaz de interactuar con FliD y un compuesto celular capaz de interactuar con FliD, en el que el al menos un compuesto humoral y/o un compuesto celular interactua con FliD, preferiblemente el al menos un compuesto humoral y/o el compuesto celular que interactua con FliD forma un producto de interaccion con FliD.

Punto 15: El metodo del punto 14, en el que la respuesta inmune contra FliD es una respuesta de anticuerpos contra FliD y en el que la respuesta del anticuerpo contra FliD forma un producto de interaccion con FliD.

Punto 16: El metodo del punto 14, en el que la respuesta inmune contra FliD es una respuesta de anticuerpos anti-FliD y en el que la respuesta anti-FliD forma un producto de interaccion con FliD.

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Punto 17: El metodo del punto 14, en el que la respuesta immune contra FliD comprende al menos un anticuerpo anti- FliD y en el que el anticuerpo anti-FliD forma un producto de interaccion con FliD.

Punto 18: El metodo de uno cualquiera de los puntos 14 a 17, en el que se detecta el producto de interaccion.

Punto 19: El metodo del punto 18, en el que el producto de interaccion se detecta directamente.

Punto 20: El metodo del punto 18, en el que el producto de interaccion se detecta indirectamente.

Punto 21: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 20, en el que la deteccion se produce por medio de un ELISA o un inmunoensayo lineal.

Punto 22: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 20, en el que la deteccion se produce por medio de un ensayo de flujo lateral.

Punto 23: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 22, en el que la muestra se selecciona del grupo que comprende suero, plasma y sangre completa.

Punto 24: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 23, en el que el sujeto es un ser humano y la infeccion por Helicobacter es una infeccion por H. pylori.

Punto 25: El metodo del punto 24, en el que la FliD reaccionado con la muestra es FliD de H. pylori.

Punto 26: El metodo del punto 25, en el que FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 1.

Punto 27: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 23, en el que el sujeto es un cerdo y la infeccion por Helicobacter es la infeccion por Helicobacter suis.

Punto 28: El metodo del punto 27, en el que la FliD reaccionado con la muestra es FliD de H. suis.

Punto 29: El metodo del punto 28, en el que la FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 3.

Punto 30: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 23, en el que el sujeto es un gato y la infeccion por Helicobacter es infeccion por Helicobacter felis. Preferiblemente, el gato se selecciona del grupo que comprende gato domestico, gato montes, gato pequeno y gato grande.

Punto 31: El metodo del punto 30, en el que la FliD reaccionado con la muestra es FliD de H. felis.

Punto 32: El metodo del punto 31, en el que FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 5.

Punto 33: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 32, en el que la sensibilidad del metodo de deteccion de una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori en el hombre, es mas del 90% y/o del 97% o menos.

Punto 34: El metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 33, en el que la especificidad del metodo de deteccion de una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori en el hombre, es mas del 90% y/o 99% o menos.

Punto 35: Uso de una respuesta inmune contra FliD en un sujeto como biomarcador.

Punto 36: El uso del punto 35, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter.

Punto 37: El uso de uno cualquiera de los puntos 35 a 36, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter, en el que el sujeto es el hombre y el Helicobacter es H. pylori.

Punto 38: El uso de uno cualquiera de los puntos 35 a 36, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter, en el que el sujeto es un cerdo y el Helicobacter es H. suis.

Punto 39: El uso de uno cualquiera de los puntos 35 a 36, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter, en el que el sujeto es un gato y el Helicobacter es H. felis.

Punto 40: El uso segun uno cualquiera de los puntos 35 a 39, en el que el biomarcador es un biomarcador predictivo.

Punto 41: El uso segun uno cualquiera de los puntos 35 a 40, en el que la respuesta inmune es una respuesta de anticuerpos contra FliD.

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Punto 42: El uso segun uno cualquiera de los puntos 35 a 41, en el que la respuesta immune es una respuesta de anticuerpos anti-FliD contra FliD.

Punto 43: Un kit que comprende FliD o un fragmento de la misma y al menos un constituyente adicional.

Punto 44: El kit del punto 43, en el que el al menos un constituyente adicional se selecciona del grupo que comprende una solucion reguladora, una fase solida y un prospecto de instrucciones.

Punto 45: El kit de uno cualquiera de los puntos 43 a 44, en el que FliD es FliD de longitud completa.

Punto 46: El kit segun uno cualquiera de los puntos 43 a 44, en el que FliD comprende una secuencia de aminoacidos y en el que la secuencia de aminoacidos se selecciona del grupo que comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 5.

Punto 47: El kit segun uno cualquiera de los puntos 43 a 46, en el que el kit es apropiado para su uso o se usa en un metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter en un sujeto.

Punto 48: El kit segun el punto 47, en el que el kit es apropiado para su uso o se usa en un metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 34.

Punto 49: Un metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter y mas preferiblemente una infeccion por H. pylori en un sujeto, en el que el metodo comprende detectar FliD en una muestra del sujeto.

Punto 50: El metodo del punto 49, en el que, si se detecta FliD en la muestra del sujeto, el sujeto sufre una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori, o el sujeto ha experimentado una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori, en el pasado.

Punto 51: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 50, en el que, si no se detecta FliD en la muestra del sujeto, el sujeto no sufre una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori.

Punto 52: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 51, en el que, si no se detecta FliD en la muestra del sujeto, el sujeto ha experimentado una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori en el pasado.

Punto 53: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 52, en el que el sujeto esta infectado con Helicobacter, preferiblemente H. pylori, que expresa FliD.

Punto 54: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 53, en el que el metodo comprende ademas detectar uno o mas antfgenos de Helicobacter, preferiblemente de H. pylori.

Punto 55: El metodo del punto 54, en el que el uno o mas antfgenos de Helicobacter, preferiblemente H. pylori, se selecciona del grupo que comprende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 y HtrA.

Punto 56: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 55, en el que FliD es FliD de longitud completa o un fragmento de la misma.

Punto 57: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 56, en el que el metodo comprende hacer reaccionar la muestra con un agente que interactua, en el que el agente que interactua esta interactuando con FliD o un fragmento de la misma, preferiblemente el agente que interactua esta espedficamente interactuando con FliD o un fragmento de la misma.

Punto 58: El metodo del punto 57, en el que el agente que interactua esta interactuando con FliD de longitud completa o un fragmento de FliD.

Punto 59: El metodo de uno cualquiera de los puntos 57 a 58, en el que el agente de interaccion se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, un aptamero y un spiegelmero.

Punto 60: El metodo del punto 59, en el que el agente que interactua es un anticuerpo, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

Punto 61: El metodo de uno cualquiera de los puntos 56 a 60, en el que el agente que interactua y la FliD presente en la muestra forman un producto de interaccion.

Punto 62: El metodo del punto 61, en el que se detecta el producto de interaccion.

Punto 63: El metodo del punto 62, en el que el producto de interaccion se detecta directamente.

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Punto 64: El metodo del punto 62, en el que el producto de interaccion se detecta indirectamente.

Punto 65: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 64, en el que la deteccion se produce por medio de un ELISA o un inmunoensayo lineal.

Punto 66: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 63, en el que la deteccion se produce por medio de un ensayo de flujo lateral.

Punto 67: El metodo segun uno cualquiera de los puntos 49 a 56, en el que FliD se detecta por medio de espectroscopfa de masas.

Punto 68: Metodo segun el punto 67, en el que la espectroscopfa de masas se selecciona del grupo que comprende LC- ESI-MS/MS, MALDI-MS, MS en tandem, TOF/TOF, TOF-MS, TOF-MS/MS, MS triple cuadruplo, y MS/MS triple cuadruplo.

Punto 69: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 68, en el que el sujeto es un ser humano y la infeccion por Helicobacter es una infeccion por H. pylori.

Punto 70: El metodo del punto 69, en el que la FliD es de H. pylori.

Punto 71: El metodo del punto 70, en el que FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 1.

Punto 72: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 68, en el que el sujeto es un cerdo y la infeccion por Helicobacter es la infeccion por Helicobacter suis.

Punto 73: El metodo del punto 72, en el que FliD es de H. suis.

Punto 74: El metodo del punto 73, en el que FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 3.

Punto 75: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 68, en el que el sujeto es un gato y la infeccion por Helicobacter es la infeccion por Helicobacter felis.

Punto 76: El metodo del punto 75, en el que la FliD es de H. felis.

Punto 77: El metodo del punto 76, en el que FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 5.

Punto 78: El metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 77, en el que la muestra se selecciona del grupo que comprende heces, suero, plasma y sangre completa, preferiblemente la muestra es de heces.

Punto 79: Uso de FliD como biomarcador.

Punto 80: El uso del punto 79, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion de un sujeto con Helicobacter.

Punto 81: El uso de uno cualquiera de los puntos 79 a 80, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter, en el que el sujeto es el hombre y el Helicobacter es H. pylori.

Punto 82: El uso del punto 81, en el que FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 1.

Punto 83: El uso de uno cualquiera de los puntos 80 a 81, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter, en el que el sujeto es un cerdo y el Helicobacter es H. suis.

Punto 84: El uso del punto 83, en el que FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 3.

Punto 85: El uso de uno cualquiera de los puntos 80 a 81, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter, en el que el sujeto es un gato y el Helicobacter es H. felis. Punto 86: El uso del punto 85, en el que FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 5.

Punto 87: El uso segun uno cualquiera de los puntos 79 a 86, en el que el biomarcador es un biomarcador predictivo.

Punto 88: Un kit que comprende un agente de interaccion capaz de interactuar con FliD o un fragmento de la misma y al menos un constituyente adicional.

Punto 89: El kit del punto 88, en el que el al menos un constituyente adicional se selecciona del grupo que comprende una solucion reguladora, una fase solida y un prospecto de instrucciones.

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Punto 90: El kit del punto 89, en el que el agente de interaccion es capaz de interactuar espedficamente con FliD o un fragmento de la misma.

Punto 91: El kit de uno cualquiera de los puntos 88 a 90, en el que el agente que interactua se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, un aptamero y un spiegelmero.

Punto 92: El kit segun uno cualquiera de los puntos 88 a 91, en el que el kit es apropiado para su uso o se usa en un metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter en un sujeto.

Punto 93: El kit segun el punto 92, en el que el kit es apropiado para su uso o se usa en un metodo de uno cualquiera de los puntos 49 a 78.

Punto 94: Un metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter y mas preferiblemente una infeccion por H. pylori en un sujeto, en el que el metodo comprende detectar en una muestra del sujeto un acido nucleico que codifica FliD.

Punto 95: El metodo del punto 94, en el que el acido nucleico es un acido nucleico genomico que codifica FliD, preferiblemente ADN

Punto 96: El metodo del punto 94, en el que el acido nucleico es un ARNm que codifica FliD.

Punto 97: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 96, en el que, si se detecta un acido nucleico que codifica FliD en la muestra del sujeto, el sujeto sufre una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori, o el sujeto ha experimentado una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori, en el pasado.

Punto 98: El metodo de uno cualquiera del punto 94 a 97, en el que, si no se detecta acido nucleico que codifica FliD en la muestra del sujeto, el sujeto no sufre una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori.

Punto 99: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 98, en el que, si no se detecta acido nucleico que codifica FliD en la muestra del sujeto, el sujeto ha experimentado una infeccion por Helicobacter, preferiblemente una infeccion por H. pylori en el pasado.

Punto 100: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 99, en el que el sujeto esta infectado con Helicobacter, preferiblemente H. pylori, que expresa FliD.

Punto 101: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 100, en el que el metodo comprende ademas detectar uno o mas antigenos de Helicobacter, preferiblemente de H. pylori, y/o un acido nucleico que codifica uno o mas antfgenos de Helicobacter, preferiblemente de H. pylori.

Punto 102: El metodo del punto 101, en el que el uno o mas antigenos de Helicobacter, preferiblemente H. pylori, se selecciona del grupo que comprende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 y HtrA.

Punto 103: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 102, en el que FliD es FliD de longitud completa o un fragmento de la misma.

Punto 104: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 103, en el que el metodo comprende hacer reaccionar la muestra con un agente que interactua, en el que el agente que interactua esta interactuando con un acido nucleico que codifica FliD, preferiblemente el agente que interactua espedficamente interactua con un acido nucleico que codifica FliD.

Punto 105: El metodo del punto 104, en el que el agente de interaccion esta interactuando con un acido nucleico que codifica FliD de longitud completa o un fragmento de FliD.

Punto 106: El metodo de uno cualquiera de los puntos 104 a 105, en el que el agente que interactua se selecciona del grupo que comprende un cebador y una sonda.

Punto 107: El metodo de uno cualquiera de los puntos 104 a 106, en el que el agente de interaccion y el acido nucleico que codifica FliD presente en la muestra forman un producto de interaccion.

Punto 108: El metodo del punto 107, en el que se detecta el producto de interaccion.

Punto 109: El metodo del punto 108, en el que el producto de interaccion se detecta directamente.

Punto 110: El metodo del punto 108, en el que el producto de interaccion se detecta indirectamente.

Punto 111: El metodo segun uno cualquiera de los puntos 94 a 103, en el que una molecula de acido nucleico que codifica FliD se detecta por medio de espectroscopfa de masas, PCR o un ensayo de hibridacion.

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Punto 112: El metodo segun el punto 111, en el que la espectroscopfa de masas se selecciona del grupo que comprende LC-ESI-MS/MS, MAlDi-MS, MS en tandem, TOF/TOF, tOf-MS, TOF-MS/MS, MS triple cuadruplo, y MS/MS triple cuadruplo.

Punto 113: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 112, en el que el sujeto es un ser humano y la infeccion por Helicobacter es una infeccion por H. pylori.

Punto 114: El metodo del punto 113, en el que el acido nucleico que codifica FliD es de H. pylori.

Punto 115: El metodo del punto 114, en el que el acido nucleico que codifica FliD comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 2.

Punto 116: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 112, en el que el sujeto es un cerdo y la infeccion por Helicobacter es la infeccion por Helicobacter suis.

Punto 117: El metodo del punto 116, en el que el acido nucleico que codifica FliD es de H. suis.

Punto 118: El metodo del punto 117, en el que el acido nucleico que codifica FliD comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 4.

Punto 119: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 112, en el que el sujeto es un gato y la infeccion por Helicobacter es la infeccion por Helicobacter felis.

Punto 120: El metodo del punto 119, en el que el acido nucleico que codifica FliD es de H. felis.

Punto 121: El metodo del punto 120, en el que la FliD comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 6.

Punto 122: El metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 121, en el que la muestra se selecciona del grupo que comprende heces, suero, plasma y sangre completa, preferiblemente la muestra es de heces.

Punto 123: Uso de un acido nucleico que codifica FliD como biomarcador.

Punto 124: El uso del punto 123, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion de un sujeto con Helicobacter.

Punto 125: El uso de uno cualquiera de los puntos 123 a 124, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter, en el que el sujeto es el hombre y el Helicobacter es H. pylori.

Punto 126: El uso del punto 125, en el que el acido nucleico que codifica FliD comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 2.

Punto 127: El uso de uno cualquiera de los puntos 124 a 125, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter, en el que el sujeto es un cerdo y el Helicobacter es H. suis.

Punto 128: El uso del punto 127, en el que el acido nucleico que codifica FliD comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 4.

Punto 129: El uso de uno cualquiera de los puntos 124 a 125, en el que el biomarcador es un biomarcador para la infeccion del sujeto con Helicobacter, en el que el sujeto es un gato y el Helicobacter es H. felis.

Punto 130: El uso del punto 129, en el que el acido nucleico que codifica FliD comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 6.

Punto 131: El uso segun uno cualquiera de los puntos 123 a 130, en el que el biomarcador es un biomarcador predictivo.

Punto 132: Un kit que comprende un agente de interaccion capaz de interactuar con un acido nucleico que codifica FliD o un fragmento de la misma y al menos un constituyente adicional.

Punto 133: El kit del punto 132, en el que el al menos un constituyente adicional se selecciona del grupo que comprende una solucion reguladora, una fase solida y un prospecto de instrucciones.

Punto 134: El kit del punto 133, en el que el agente de interaccion es capaz de interactuar espedficamente con FliD o un fragmento de la misma.

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Punto 135: El kit de uno cualquiera de los puntos 132 a 134, en el que el agente de interaccion se selecciona del grupo que comprende un cebador y una sonda.

Punto 136: El kit segun uno cualquiera de los puntos 132 a 135, en el que el kit es apropiado para su uso o se usa en un metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter en un sujeto.

Punto 137: El kit segun el punto 136, en el que el kit es apropiado para su uso o se usa en un metodo de uno cualquiera de los puntos 94 a 122.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que FliD que es una protema tambien denominada "homologo de protema 2 asociada al gancho", es un marcador de infeccion con Helicobacter y H. pylori en particular. Los presentes inventores tambien han encontrado sorprendentemente que FliD y/o una respuesta inmune contra FliD pueden usarse ventajosamente como marcador en analisis serologicos y, de acuerdo con lo anterior, en cualquier metodo y ensayo, respectivamente, que se base en o utilice una muestra de un sujeto a analizar para infeccion por Helicobacter y H. pylori en particular, por lo que la muestra se selecciona preferiblemente del grupo que comprende una muestra de suero, una muestra de plasma, una muestra de sangre y una muestra de heces. Finalmente, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la infeccion de un sujeto con Helicobacter y H. pylori en particular se puede detectar basandose en FliD y/o un acido nucleico que codifica FliD, por lo que se usan FliD y/o el acido nucleico que codifica FliD, como el unico marcador. En otras palabras, una infeccion de un sujeto con Helicobacter y H. pylori en particular se puede diagnosticar basandose exclusivamente y, respectivamente, dependiendo de FliD y/o un acido nucleico que codifique para esta. Lo mismo es cierto para una respuesta inmune contra FliD desarrollada por un sujeto infectado con Helicobacter y H. pylori en particular: una infeccion de un sujeto con Helicobacter y H. pylori en particular se puede diagnosticar basandose exclusivamente y, respectivamente, depender de una respuesta inmune contra FliD, por lo que la respuesta inmune contra FliD fue generada por el sujeto Una ventaja adicional de la presente invencion es que la respuesta inmune contra FliD se puede determinar en una muestra que se obtiene por lo general por metodos no invasivos que contrasta con muchos metodos de deteccion de la tecnica anterior en los que la muestra debe tomarse mediante un metodo invasivo tal como una biopsia.

Se reconocera por un experto en el arte que la presente descripcion puede, en principio, aplicarse a la deteccion de cualquier infeccion de un sujeto con Helicobacter, siempre que tal Helicobacter codifique y/o exprese FliD. Tambien sera reconocido por una persona experta en el arte que, por lo general, una especie distinta de un sujeto tal como, por ejemplo, el hombre, sera infectado por una especie distinta de Helicobacter. En caso de que el sujeto sea el hombre, la especie de Helicobacter es H. pylori. En el caso de que el sujeto sea un cerdo, la especie de Helicobacter es H. suis. En caso de que el sujeto sea un gato, incluidos los grandes felinos, la especie de Helicobacter es H. felis. La memoria descriptiva actual se refiere particularmente a la deteccion de H. pylori en el hombre. Tal referencia a H. pylori y al hombre, sin embargo, se realiza unicamente por razones de claridad y, dado lo anterior, cualquier realizacion que se refiera a H. pylori y al hombre, se aplica igualmente a cualquier otro Helicobacter que exprese FliD, o un homologo del mismo, y cualquiera otra especie del sujeto. Preferiblemente, la otra especie del sujeto es cualquier mairnfero que padece o puede sufrir una infeccion con Helicobacter y un homologo de especie de H. pylori, por lo que dicho Helicobacter y especie homologa a H. pylori expresa FliD o un homologo del mismo.

Tambien se reconocera por una persona experta en el arte que para cada especie de Helicobacter por lo general existen diversas cepas. La secuencia de aminoacidos y la secuencia de acido nucleico de FliD de tales cepas de la especie Helicobacter por lo general muestran una identidad muy alta en terminos de secuencia de aminoacidos. Mas espedficamente, el analisis bioinformatico revelo que la secuencia de aminoacidos FliD esta presente y altamente conservada en todas las cepas de H. pylori (> 200). FliD tiene una homologfa del 97% en alrededor de 200 cepas de H. pylori que fueron analizadas por los presentes inventores. Curiosamente, a excepcion de algunas otras especies de Helicobacter no pylori con homologfa parcial, no hay otro organismo conocido con una homologfa genomica o proteomica significativa con FliD de H. pylori. La comparacion de la protema FliD de H. pylori muestra la alta conservacion de FliD en especies de Helicobacter, mientras que es distinta de la mayona de otras bacterias, asf como organismos eucarioticos. Este analisis junto con la alta prediccion de antigenicidad de esta protema proporciona el racional de hecho no hay reactividad cruzada.

Ademas, FliD se expresa de hecho por todas las cepas que infectan o que son capaces de infectar a un sujeto. Esto explica por que FliD es un marcador de hecho para cada cepa de H. pylori y, respectivamente, cada cepa de la especie de Helicobacter que infecta las especies respectivas. En otras palabras, casi todos los pacientes con H. pylori positivo muestran una respuesta inmune contra FliD.

La protema del H. pylori FliD es un elemento esencial en el ensamblaje de los flagelos funcionales y una cepa mutante FliD es completamente no movil. La flagelina desempena un papel central en la motilidad bacteriana y es necesaria para la colonizacion y la persistencia de la infeccion por H. pylori (Eaton, et al., 1996). La motilidad de H. pylori es un factor virulento en la patogenia de la lesion de la mucosa gastrica (S. Watanabe, et al., 1997). El gen H. pylori FliD codifica una protema de 76 kDa (Kim, et al., 1999). El operon FliD de H. pylori consiste en los genes FlaG, FliD y FliS, en el orden indicado, bajo el control de un promotor dependiente de Sigma (28). Se puede encontrar una entrada para FliD de H. pylori en los bancos de datos UniProtKB/Swiss-Prot como P96786.4 que proporciona, entre otros, la secuencia de aminoacidos de la misma y mutaciones de FliD como se encuentran en diversas cepas de H. pylori.

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El metodo de la invencion para detectar infeccion por H. pylori en un sujeto tambien se puede caracterizar de manera que comprenda la etapa de determinar si una muestra del sujeto contiene una respuesta inmune contra FliD. Si la muestra del contenido contiene una respuesta de anticuerpos contra FliD, el sujeto padece una infeccion por H. pylori o ha experimentado una infeccion por H. pylori en el pasado.

El metodo de la invencion para detectar una infeccion por H. pylori en un sujeto tambien se puede aplicar a un sujeto del que se desconoce si padece una infeccion por H. pylori, o si tal sujeto ha experimentado una H. infeccion por pylori. Hasta ahora, la presente divulgacion se relaciona en un aspecto adicional con los metodos para determinar si un sujeto padece una infeccion por Helicobacter, preferiblemente infeccion por H. pylori, o ha experimentado una infeccion por Helicobacter, preferiblemente infeccion por H. pylori en el pasado.

Como se usa preferiblemente en este documento, la expresion "en el pasado" se refiere a un punto en el tiempo que es anterior al punto en el tiempo cuando una muestra ha sido o es tomada de un sujeto, por lo que dicha muestra es una muestra usada en conexion con los diversos aspectos y/o las diversas realizaciones de la presente invencion y en particular en la deteccion de H. pylori y/o infeccion por H. pylori en un sujeto y en el diagnostico de H. pylori y/o infeccion por H. pylori en un sujeto.

En relacion con los diversos aspectos de la presente invencion y el metodo de la invencion en particular, un experto en el arte reconocera que la respuesta inmune y la respuesta de anticuerpos anti-FliD generada por el sujeto infectado por H. pylori persiste durante algunos anos. La prevalencia de dicha respuesta de anticuerpos anti-FliD es por lo general de aproximadamente 50% despues de 1 a 5 anos despues de la erradicacion de H. pylori, aproximadamente 50% despues de 6 a 10 anos despues de la erradicacion de H. pylori, aproximadamente 25% despues de 11 a 15 anos despues de la erradicacion de H. pylori y aproximadamente el 25% despues de 16 a 20 anos despues de la erradicacion de H. pylori. A la luz de esto, un sujeto que se diagnostica como H. pylori positivo puede ser un sujeto que en realidad esta sufriendo una infeccion por H. pylori en el momento en que se tomo la muestra, o un sujeto que habfa sido infectado por H. pylori en el pasado con la respuesta inmune anti-FliD aun prevalece.

En la medida en que la respuesta inmune contra FliD es una respuesta de anticuerpos contra FliD y mas espedficamente una respuesta de anticuerpos anti-FliD, los anticuerpos anti-FliD son por lo general IgG o IgA. Esta especificidad de clase se puede usar en la deteccion de anticuerpos anti-FliD al usar, como anticuerpos de deteccion o anticuerpos de captura, anticuerpos anti-IgG y/o anti-IgA. En la realizacion en la que el sujeto es un hombre, los anticuerpos de deteccion y los anticuerpos de captura son preferiblemente IgG anti-humana y/o IgA anti-humana.

En relacion con los diversos aspectos de la presente invencion y el metodo de la invencion en particular, los metodos pueden comprender adicionalmente, en una realizacion, la deteccion de uno o mas antfgenos de Helicobacter o un acido nucleico que codifica dichos antfgenos de Helicobacter. En una realizacion, tales antfgenos de Helicobacter son antfgenos de H. pylori. En una realizacion adicional, los antfgenos se seleccionan del grupo que comprende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 y HtrA que son todos conocidos en la tecnica, y se describen, por ejemplo, en Yakoob J et al. (Yakoob J et al., Gut and Liver, Vol. 4, No. 3, September2010, pp. 345-350), Sabarth N et al. (Sabarth N et al., Infection and Immunity, Nov. 2002, p. 6499-6503), Gao L. et al. (Gao L. et al., Cancer Res 2009; 69: (15). August 1, 2009, p. 6164 - 6170), Yamaoka Y (Yamaoka Y, J Med Microbiol. 2008 May; 57 (Pt5): 545-553), Miehlke S et al. (Miehlke S et al., Int. J. Cancer: 87, 322-327 (2000)), y Atherton JC et al. (Atherton JC et al., Current Microbiology, Vol. 39(1999), pp 211-218). Una secuencia de aminoacidos de CagA se describe en este documento como SEQ ID NO: 7, una secuencia de nucleotidos de CagA se describe en este documento como SEQ ID NO: 8, una secuencia de aminoacidos de VacA se describe en este documento como SEQ ID NO: 9, una secuencia de nucleotidos de VacA se describe en el presente documento como SEQ ID NO: 10, una secuencia de aminoacidos de GroEL se describe en este documento como SEQ ID NO: 11, una secuencia de nucleotidos de GroEL se describe en este documento como SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoacidos de Hp0231 se describe en este documento como SEQ ID NO: 13, una secuencia de nucleotidos de Hp0231 se describe en este documento como SEQ ID NO: 14, una secuencia de aminoacidos de JHp0940 se describe en este documento como SEQ ID NO: 15, una secuencia de nucleotidos de JHp0940 se describe en este documento como SEQ ID NO: 16, una secuencia de aminoacidos de HtrA se describe en este documento como SEQ ID NO: 17, y una secuencia de nucleotidos de HtrA se describe en este documento como SEQ ID NO: 18.

En una realizacion del metodo de la invencion en el que se detecta una infeccion por H. pylori en un sujeto al detectar en una muestra del sujeto una respuesta inmune contra FliD y en particular un anticuerpo anti-FliD en la muestra, la muestra y FliD se hacen reaccionar. En una realizacion, la muestra se anade a FliD. Preferiblemente, FliD esta unido a una fase solida en dicho metodo. Tambien esta dentro de la presente invencion que FliD se anade a la muestra. Preferiblemente, se anade FliD como una solucion, mas preferiblemente como una solucion acuosa tal como una solucion regulada. En una realizacion preferida, FliD se hace reaccionar con la muestra estando FliD unido a una fase solida. Un experto en el arte reconocera que FliD y la muestra se hacen reaccionar en condiciones tales que, si la muestra contiene una respuesta inmune contra FliD y anticuerpos anti-FliD en particular, se forma un producto de interaccion. Preferiblemente, tal producto de interaccion es un complejo de FliD y un anticuerpo anti-FliD contenido en la muestra.

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El producto de interaccion formado de este modo se puede detectar directa o indirectamente. En la realizacion en la que el producto de interaccion se detecta directamente, la FliD que reacciono con la muestra comprende un marcador que permite la deteccion de FliD, particularmente cuando interactua con un anticuerpo anti-FliD. Los marcadores de este tipo son conocidos para los expertos en el arte y abarcan radiomarcadores, marcadores de fluorescencia, colorantes, nanopartmulas como oro y enzimas tales como peroxidasa de rabano picante. Otros marcadores son los descritos en este documento en relacion con el marcado de anticuerpos. En la realizacion en la que el producto de interaccion se detecta indirectamente, el producto de interaccion se hace reaccionar posteriormente con un agente de deteccion, por lo que el agente de deteccion se une espedficamente al producto de interaccion. Tal agente de deteccion puede ser un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo anti-IgG o anti-IgA. El propio agente de deteccion por lo general comprende un marcador que permite la deteccion del agente de deteccion, preferiblemente cuando el agente de deteccion esta espedficamente unido al producto de interaccion.

En las realizaciones preferidas del metodo de la invencion, el producto de interaccion se detecta por medio de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo que son conocidos para una persona experta en el arte (Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998). El ELISA puede ser un ELISA indirecto, un ELISA sandwich, un ELISA competitivo o un ELISA no competitivo.

En una realizacion preferida alternativa del metodo de la invencion, el producto de interaccion se detecta por medio de una prueba de flujo lateral que tambien se conoce como ensayos inmunocromatograficos de flujo lateral que se describen, por ejemplo, en el documento US 6,485,982. Tal prueba de flujo lateral es, en una realizacion, usada en cualquier metodo de la invencion en el que se detecta cualquiera un anticuerpo anti-FliD y, respectivamente, anticuerpos anti-FliD en una muestra de un sujeto. La prueba de flujo lateral se describira con fines ilustrativos para la realizacion del metodo de la invencion en el que se detectan anticuerpos anti-FliD en una muestra de un sujeto, en el que el sujeto es el hombre.

La tecnologfa se basa en una serie de lechos capilares, tales como trozos de papel poroso o polfmero. Cada uno de estos componentes tiene la capacidad de transportar fluido, por ejemplo, suero, plasma o sangre, precipitadamente. La almohadilla de muestra actua como una esponja y contiene un exceso de lfquido de muestra. Cuando la almohadilla de muestra esta saturada, el fluido se mueve a la almohadilla conjugada en la que se encuentran las nanopartmulas, preferiblemente nanopartfculas de oro, conjugadas con anticuerpo antihumano. Cuando el fluido de muestra migra a este elemento, disuelve las partmulas y, en una reaccion combinada, la muestra y la mezcla conjugada fluyen a traves de la estructura porosa. De esta forma, el anticuerpo inmovilizado en la superficie de las nanopartfculas se une a la IgG humana existente en la muestra mientras migra mas a traves de la siguiente matriz capilar. En este elemento que es por lo general una membrana hidrofoba como antfgenos de nitrocelulosa, asf como un control (por ejemplo, IgG humana) se inmovilizan como lmeas de prueba o de control. Una vez que la IgG humana que ahora esta unida a las partmulas del conjugado alcanza estas lmeas, el antfgeno inmovilizado en la membrana capturara espedficamente el complejo de anticuerpos. Despues de un tiempo, mas y mas partmulas se acumulan en un sitio de antfgeno y aparece una banda de color simplemente detectable. En una realizacion, solo hay un antfgeno, a saber, FliD. En otra realizacion, ademas de FliD, hay uno o mas antfgenos. Preferiblemente, el uno o mas antfgenos se seleccionan del grupo que comprende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 y HtrA.

En realizacion preferida alternativa adicional del metodo de la invencion, el producto de interaccion se detecta por medio de un ensayo lineal. Tal ensayo lineal comprende por lo general una pluralidad de tiras. En dichas tiras, FliD recombinante altamente purificada se fija en las tiras. Tales tiras estan hechas preferiblemente de membrana de nitrocelulosa. Las tiras se incuban con la muestra, preferiblemente con una muestra diluida de suero o plasma, y los anticuerpos anti-FliD se unen a FliD, en caso de que FliD se inmovilice para detectar anticuerpos anti-FliD en la muestra, en las tiras de prueba. En una segunda etapa, las tiras se incuban con anticuerpos inmunoglobulina anti- humana (IgG e IgA), que se acoplan a la peroxidasa de rabano picante. Los anticuerpos espedficamente unidos se detectan con una reaccion de tincion catalizada por la peroxidasa. Si se ha producido una reaccion antfgeno-anticuerpo formando un producto de interaccion, aparecera una banda oscura en la tira en el punto correspondiente. En una realizacion, las bandas de control en el extremo superior de las tiras de prueba son:

a) La banda de control de reaccion bajo el numero de tira, que debe mostrar una reaccion para cada muestra.

b) Las bandas de control del conjugado (IgG, IgA) se usan para verificar la clase de anticuerpos detectados. Si, por ejemplo, se usa la tira de prueba para la deteccion de anticuerpos IgG, el conjugado IgG mostrara una banda clara.

c) "Control de corte": la intensidad de esta banda permite la evaluacion de la reactividad de las bandas de antfgenos individuales.

Un ensayo que tiene este tipo de diseno, con antfgenos diferentes de FliD, esta disponible basicamente en Mikrogen GmbH, Neuried, Alemania, como "recomLine Helicobacter IgG" o "recomLine Helicobacter IgA" (Ref:
http://www.mikrogen.de/uploads/tx_oemikrogentables/dokumente/GARLHP001EN.pdf).

Tambien se describe en este documento un metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter y mas preferiblemente una infeccion por H. pylori en un sujeto, en el que el metodo comprende detectar en una muestra del sujeto FliD, FliD se

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detecta por medio de espectrometna de masas que es, por ejemplo, descrito en Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998.

En metodos donde FliD se detecta en una muestra del sujeto, el agente de interaccion que forma junto con FliD el producto de interaccion es preferiblemente uno seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo, un aptamero y un spiegelmero. La generacion de tal agente de interaccion esta dentro de las habilidades de una persona del arte.

La generacion de un anticuerpo que se une y mas espedficamente se une a FliD, es conocida para el experto en el arte y, por ejemplo, se describe en Harlow, E., and Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Preferiblemente, se pueden usar anticuerpos monoclonales que se pueden fabricar segun el protocolo de Cesar and Milstein y otros desarrollos basados en los mismos. Los anticuerpos como se usan en este documento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos o derivados tales como fragmentos Fab, fragmentos Fc y anticuerpos monocatenarios, siempre que sean apropiados y capaces de unirse a FliD. Ademas de anticuerpos monoclonales tambien se pueden usar y/o generar anticuerpos policlonales. La generacion de anticuerpos policlonales tambien es conocida para los expertos en el arte y, por ejemplo, se describe en Harlow, E., and Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

Los anticuerpos que se pueden usar pueden tener uno o varios marcadores o etiquetas. Tales marcadores o etiquetas pueden ser utiles para detectar el anticuerpo. Preferiblemente, los marcadores y etiquetas se seleccionan del grupo que comprende avidina, estreptavidina, biotina, oro, enzimas como HRP y fluorescema y se usan, por ejemplo, en metodos de ELISA. Estos y otros marcadores, asf como los metodos son, por ejemplo, descrito en Harlow, E., and Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

Los aptameros son acidos D-nucleicos que son ya sea monocatenarios o bicatenarios y que interactuan espedficamente con una molecula diana tal como FliD. La fabricacion o seleccion de aptameros es, por ejemplo, descrito en la Patente Europea EP 0 533 838. Basicamente se realizan las siguientes etapas. Primero, una mezcla de acidos nucleicos, esto es, potenciales aptameros, se proporciona por lo que cada acido nucleico por lo general comprende un segmento de varios, preferiblemente al menos ocho nucleotidos aleatorizados subsiguientes. Posteriormente, esta mezcla se pone en contacto con la molecula diana mediante la cual el (los) acido (s) nucleico (s) se unen a la molecula diana, tal como se basa en una afinidad incrementada hacia la diana o con una fuerza mayor a la mezcla candidata. El (los) acido (s) nucleico (s) de union se separa (n) posteriormente del resto de la mezcla. Opcionalmente, el (los) acido (s) nucleico (es) obtenido (s) de este modo se amplifican usando, por ejemplo, reaccion en cadena de la polimerasa. Estas etapas se pueden repetir varias veces dando al final una mezcla que tiene una proporcion incrementada de acidos nucleicos que se une espedficamente a la diana a partir del cual el acido nucleico de union final se selecciona entonces opcionalmente. Estos acidos nucleicos que se unen espedficamente se denominan aptameros. Es obvio que, en cualquier etapa del metodo para la generacion o identificacion de los aptameros, se pueden tomar muestras de la mezcla de acidos nucleicos individuales para determinar la secuencia de las mismas usando tecnicas estandar. Los aptameros se pueden estabilizar tal como, por ejemplo, introduciendo grupos qrnmicos definidos que son conocidos para los expertos en el arte de generacion de aptameros. Tal modificacion puede residir, por ejemplo, en la introduccion de un grupo amino en la posicion 2' de la unidad estructural de azucar de los nucleotidos.

La generacion o fabricacion de spiegelmeros que se unen y se unen mas particularmente espedficamente a FliD como molecula diana se basa en un principio similar. La fabricacion de spiegelmeros se describe en la solicitud de patente internacional WO 98/08856. Los spiegelmeros son acidos L-nucleicos, lo que significa que estan compuestos de L- nucleotidos en lugar de D-nucleotidos como lo son los aptameros. Los spiegelmeros se caracterizan por el hecho de que tienen una estabilidad muy alta en el sistema biologico y, comparables a los aptameros, interactuan espedficamente con la molecula diana contra la que estan dirigidos. Con el fin de generar spiegelmeros, se crea una poblacion heterogenea de acidos D-nucleicos y esta poblacion se pone en contacto con el antfpoda optico de la molecula diana, en el presente caso por ejemplo con el D-enantiomero del enantiomero L natural de FliD. Posteriormente, esos acidos D-nucleicos se separan y no interactuan con la antfpoda optica de la molecula diana. Sin embargo, aquellos acidos D- nucleicos que interactuan con el antfpoda optico de la molecula diana se separan, opcionalmente se determinan y/o se secuencian y posteriormente los acidos L-nucleicos correspondientes se sintetizan basandose en la informacion de la secuencia de acido nucleico obtenida de los acidos D-nucleicos. Estos acidos L-nucleicos que son identicos en terminos de secuencia con los acidos D-nucleicos antes mencionados que interaccionan con el antfpoda optico de la molecula diana, interactuaran espedficamente con la molecula diana natural en lugar de con el antfpoda optico de la misma. De forma similar al metodo para la generacion de aptameros, tambien es posible repetir varias etapas varias veces y de este modo enriquecer esos acidos nucleicos que interactuan espedficamente con la antfpoda optica de la molecula objetivo.

En el metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter y mas preferiblemente una infeccion por H. pylori en un sujeto, en el que el metodo comprende detectar en una muestra del sujeto un acido nucleico que codifica FliD, el agente que interactua se selecciona del grupo que comprende un cebador y una sonda. Dadas las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de FliD descritas en este documento, esta dentro de las habilidades de una persona de la tecnica disenar y preparar dicho cebador y sonda (vease, por ejemplo, Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum

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Akademischer Verlag Heidelberg, 1998). Tal agente de interaccion puede ser etiquetado. Los diversos marcadores y formas de marcar el agente de interaccion son conocidas por una persona experta en el arte. En una realizacion, los marcadores son los mismos que los descritos anteriormente en relacion con los anticuerpos.

El producto de interaccion que comprende una molecula de acido nucleico que codifica FliD o un fragmento de la misma y un agente de interaccion se puede detectar por medios conocidos para una persona experta en el arte y, por ejemplo, descrito en Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998.

En una realizacion del metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter y mas preferiblemente una infeccion por H. pylori en un sujeto, en el que el metodo comprende detectar en una muestra del sujeto un acido nucleico que codifica FliD, el acido nucleico que codifica FliD es detectado por medio de espectrometna de masas que es, por ejemplo, descrito en Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998.

En una realizacion del metodo de deteccion de la infeccion por Helicobacter y mas preferiblemente una infeccion por H. pylori en un sujeto, en el que el metodo comprende detectar en una muestra del sujeto un acido nucleico que codifica FliD, el acido nucleico que codifica FliD es detectado por medio de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) en sus diferentes formas que, por ejemplo, se describen en Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998. Alternativamente, el acido nucleico que codifica FliD es detectado por un ensayo de hibridacion como, por ejemplo, se describe en Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998.

En aquellos aspectos de la divulgacion que estan relacionados con biomarcador, se reconocera que la respuesta inmune contra FliD como se define en este documento, FliD y un acido nucleico que codifica FliD cada uno actuan como un biomarcador predictivo como la presencia de dicha respuesta inmune contra FliD como se define en este documento, FliD y/o acido nucleico que codifica FliD se correlaciona con histologfa e inflamacion en pacientes no tratados.

Se reconocera por un experto en el arte que, dada la divulgacion proporcionada en este documento, el diseno particular del kit de la invencion esta dentro de las habilidades comunes de una persona experta en el arte. En una realizacion, el kit es un kit listo para usar.

Tambien se describe en este documento el uso de los agentes que interactuan como se describe en este documento para la deteccion de FliD como se describe en este documento.

Como se usa preferiblemente en este documento, una muestra es una muestra obtenida inmediatamente de uno o del sujeto, o una muestra que se ha procesado antes de usarse en conexion con la invencion y en particular con el metodo de la invencion.

En una realizacion de los diversos aspectos y realizaciones de la invencion, el sujeto es un sujeto que se supone que padece o se sospecha que padece una infeccion por H. pylori.

En una realizacion, la infeccion por Helicobacter es infeccion con Helicobacter o una infeccion supuesta o sospechada con Helicobacter.

En una realizacion de cualquier aspecto de la presente invencion donde un primer compuesto interactua espedficamente con o se une espedficamente a un segundo compuesto, la interaccion o union entre dicho primer compuesto y dicho segundo compuesto se caracteriza por una KD de 1 |iM o menos, mas preferiblemente una Kd de 0.25 |iM o menos y mas preferiblemente una Kd de 0.1 o menos.

Un experto en el arte entendera que cuando se detecta FliD, FliD puede estar presente ya sea como una FliD de longitud completa o un fragmento de FliD o un fragmento de FliD de longitud completa. Como se usa preferiblemente en este documento, una FliD de longitud completa es una FliD producido por Helicobacter que es activo como factor de virulencia. En una realizacion, una FliD de longitud completa es preferiblemente una FliD como el producido por Helicobacter. Un fragmento de FliD de longitud completa es un fragmento cuya secuencia de aminoacidos es mas corta que la secuencia de aminoacidos de FliD de longitud completa, por lo que el fragmento de FliD todavfa esta activo como factor de virulencia. Un fragmento de FliD es preferiblemente un fragmento de FliD, preferiblemente de FliD de longitud completa, por lo que el fragmento tiene una secuencia de aminoacidos que es lo suficientemente larga como para permitir que una persona experta en el arte identifique el fragmento como un fragmento de FliD y FliD de longitud completa en particular y para excluir que el fragmento sea un fragmento de una protema o polipeptido diferente de FliD y FliD de longitud completa en particular. En una realizacion preferida, FliD de longitud completa comprende una secuencia de aminoacidos segun la SEQ ID NO: 1.

Las mismas consideraciones y definiciones se aplican igualmente a un acido nucleico que codifica FliD. De acuerdo con esto, un experto en el arte entendera que cuando se detecta un acido nucleico que codifica FliD, puede estar presente un acido nucleico que codifica FliD ya sea como un acido nucleico que codifica una FliD de longitud completa o un acido nucleico acido que codifica el fragmento de FliD o un acido nucleico que codifica el fragmento de FliD de longitud completa. Como se usa preferiblemente en este documento, una FliD de longitud completa es una FliD producido por

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Helicobacter que es activo como factor de virulencia. En una realizacion, una FliD de longitud completa es preferiblemente una FliD como el producido por Helicobacter. Un fragmento de FliD de longitud completa es un fragmento cuya secuencia de aminoacidos es mas corta que la secuencia de aminoacidos de FliD de longitud completa, por lo que el fragmento de FliD todavfa esta activo como factor de virulencia. Un fragmento de FliD es preferiblemente un fragmento de FliD, preferiblemente de FliD de longitud completa, por lo que el fragmento tiene una secuencia de aminoacidos que es lo suficientemente larga como para permitir que una persona experta en el arte identifique el fragmento como un fragmento de FliD y FliD de longitud completa en particular y para excluir que el fragmento sea un fragmento de una protema o polipeptido diferente de FliD y FliD de longitud completa en particular. En una realizacion preferida, el acido nucleico que codifica una FliD de longitud completa comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 2.

Un fragmento de un acido nucleico que codifica FliD es preferiblemente un fragmento de un acido nucleico que codifica FliD, preferiblemente para FliD de longitud completa, por lo que el fragmento del acido nucleico tiene una secuencia de nucleotidos que es lo suficientemente larga como para permitir que un experto en el arte identifique el fragmento que es un fragmento de un acido nucleico que codifica FliD y FliD de longitud completa en particular y para excluir que el fragmento del acido nucleico sea un fragmento de un acido nucleico que codifica una protema o polipeptido diferente de FliD y FliD de longitud completa en particular.

Tambien se entendera por una persona experta en el arte que en aquellas realizaciones del metodo de la invencion donde se detecta una respuesta inmune contra FliD como se define en este documento, FliD que se hace reaccionar con la respuesta inmune contra FliD como se define en este documento memoria descriptiva, puede ser FliD como se produce por la especie de Helicobacter que infecta al sujeto o presumiblemente infecta al sujeto, puede ser una FliD de longitud completa como se define en este documento o puede ser un fragmento de FliD como se define en este documento. Ademas, un fragmento de FliD es, en una realizacion, un fragmento de FliD que tiene una secuencia de aminoacidos mas corta que FliD, en el que el fragmento se puede usar en dichas realizaciones del metodo de la invencion, al tiempo que permite la interaccion espedfica con o la deteccion espedfica de la respuesta inmune contra FliD como se define en este documento.

Un cebador dirigido a un acido nucleico que codifica FliD como se describe en este documento es uno seleccionado del grupo que comprende un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 21, un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 22, un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 23, un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 24, un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 25, un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 26, un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 27 y un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 28. Preferiblemente, el cebador es una combinacion de al menos dos cebadores, por lo que

un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 21 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 22; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que

comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 21 y un segundo cebador de los al menos dos

cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 24; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la sEq ID NO: 21 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 26; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de

nucleotidos segun la SEQ ID NO: 21 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que

comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 28; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 23 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 22; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 23 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 24; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 23 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 26; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 23 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 28; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 25 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 22; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que

comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 25 y un segundo cebador de los al menos dos

cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 24; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la sEq ID NO: 25 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 26; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de

nucleotidos segun la SEQ ID NO: 25 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que

comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 28; un primer cebador de los al menos dos cebadores

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es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 27 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 22; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 27 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 24; un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 27 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 26; o un primer cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 27 y un segundo cebador de los al menos dos cebadores es un cebador que comprende una secuencia de nucleotidos segun la SEQ ID NO: 28.

Las diversas SEQ ID NO: a las que se hace referencia en este documento, el compuesto representado por dichas SEQ ID NO:, los organismos de los que se tomaron dichas secuencias y, en algunos casos, una indicacion de la entrada correspondiente de la secuencia en los bancos de datos publicamente disponibles se resume en la siguiente tabla 1:

Tabla 1:

La SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoacidos de FliD expresada por H. pylori que corresponde a la entrada del GenBank ACI27464.1.

La SEQ ID NO:2 es la secuencia de nucleotidos (ADNc) de FliD expresada por H. pylori que corresponde a la entrada del GenBank CP001173.1.

La SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoacidos de FliD expresada por H. suis que corresponde a la secuencia de referencia NCBI WP_006563874.1.

La SEQ ID NO:4 es la secuencia de nucleotidos (ADNc) de FliD expresada por H. suis que corresponde a la entrada del GenBank ADGY01000008.1.

La SEQ ID NO:5 es la secuencia de aminoacidos de FliD expresada por H. felis que corresponde a la secuencia de referencia NCBI YP_004073770.1.

La SEQ ID NO:6 es la secuencia de nucleotidos (ADNc) de FliD expresada por H. felis que corresponde a la entrada del GenBank FQ670179.2.

La SEQ ID NO:7 es la secuencia de aminoacidos de CagA de H. pylori G27 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI YP_002266135.1.

La SEQ ID NO:8 es la secuencia de nucleotidos (ADNc) de CagA de H. pylori G27 que corresponde a la entrada del GenBank JQ318032.1.

La SEQ ID NO:9 es la secuencia de aminoacidos de VacA de H. pylori G27 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI YP_002266461.1.

La SEQ ID NO:10 es la secuencia de acidos nucleicos (ADNc) de VacA de H. pylori G27 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI NC_011333.1.

La SEQ ID NO:11 es la secuencia de aminoacidos de GroEL de H. pylori G27 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI YP_002265651.1.

La SEQ ID NO:12 es la secuencia de nucleotidos (ADNc) de GroEL de H. pylori G27 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI NC_011333.1.

La SEQ ID NO:13 es la secuencia de aminoacidos de Hp0231 de H. pylori 26695 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI NP_207029.1.

La SEQ ID NO:14 es la secuencia de nucleotidos (ADNc) de Hp0231 de H. pylori 26695 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI NC_000915.1.

La SEQ ID NO:15 es la secuencia de aminoacidos de JHp0940 de H. pylori J99 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI NP_223657.1.

La SEQ ID NO:16 es la secuencia de nucleotidos (ADNc) de JHp0940 de H. pylori J99 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI NC 000921.1.

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La SEQ ID NO:17 es la secuencia de aminoacidos de HtrA de H. pylori G27 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI YP_002266040.1.

La SEQ ID NO:18 es la secuencia de nucleotidos (ADNc) de HtrA de H. pylori G27 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI NC_011333.1.

La SEQ ID NO: 19 es un cebador usado en la clonacion del gen de FliD a partir de H. pylori.

La SEQ ID NO: 20 es un cebador usado en la clonacion del gen de FliD a partir de H. pylori.

La SEQ ID NO: 21 es un cebador hacia adelante usado en PCR1 del ejemplo 9.

La SEQ ID NO: 22 es un cebador reverso usado en PCR1 del ejemplo 9.

La SEQ ID NO: 23 es un cebador hacia adelante usado en PCR2 del ejemplo 9.

La SEQ ID NO: 24 es un cebador reverso usado en PCR2 del ejemplo 9.

La SEQ ID NO: 25 es un cebador hacia adelante usado en PCR3 del ejemplo 9.

La SEQ ID NO: 26 es un cebador reverso usado en PCR3 del ejemplo 9.

La SEQ ID NO: 27 es un cebador hacia adelante usado en PCR4 del ejemplo 9.

La SEQ ID NO: 28 es un cebador reverso usado en PCR4 del ejemplo 9.

Se entendera por un experto en el arte que en caso de que la secuencia de nucleotidos sea una secuencia de ADN y una secuencia de ADNc en particular, tambien se describe en este documento una secuencia de ARN que difiere de tal secuencia de ADN y secuencia de ADNc solo en la medida en que el resto de azucar sea un ribonucleotido en lugar de un desoxirribonucleotido.

La presente invencion se ilustra ahora adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos que no estan destinados a limitar el alcance de la proteccion. A partir de dichas figuras y ejemplos, se pueden tomar otras caractensticas, realizaciones y ventajas, en las que

La figura 1 muestra una realizacion de un ensayo lineal usado en el metodo de la invencion para detectar anticuerpos anti-FliD en muestras de suero de 20 pacientes humanos diagnosticados histologicamente como positivos para H. pylori;

La figura 2 muestra una realizacion de un ensayo de flujo lateral que se puede usar en el metodo de la presente invencion para detectar anticuerpos anti-FliD en una muestra tal como una muestra de sangre completa de un sujeto humano, por lo que la figura 2A ilustra el diseno esquematico del ensayo, y la figura 2B representa un resultado del ensayo;

La figura 3 es un diagrama que indica la prevalencia de una respuesta anti-FliD en muestras del hombre como una funcion de anos despues de la erradicacion de H. pylori;

La figura 4 muestra curvas ROC para FliD en comparacion con dos antfgenos bien conocidos;

La figura 5 muestra el resultado de un analisis de transferencia de Western que detecta FliD a diversas concentraciones usando suero anti-FliD de raton, pero no Tig o gGT;

La figura 6 muestra una serie de transferencias de Southern usando la reaccion en cadena de la polimerasa 1 (PCR1), reaccion en cadena de la polimerasa 2 (PCR2), reaccion en cadena de la polimerasa 3 (PCR3) o reaccion en cadena de la polimerasa 4 (PCR4) para la deteccion del ADN genomico presente en muestras representativas de pacientes que han sido diagnosticados como positivos para H. pylori;

La figura 7 muestra el resultado de un analisis de transferencia de Western representativo realizado usando lisados de protema completa del H. pylori cultivado; y

La figura 8 muestra el resultado de dos analisis de transferencia de Western para determinar si FliD se expreso por los microorganismos indicados debajo de cada una de las transferencias de Western.

Ejemplo 1: clonacion del gen FliD de H. pylori

Todas las manipulaciones de ADN se realizaron en condiciones estandar como se describe por Sambrook et al. (Sambrook, et al., 1989). En resumen, el gen FliD se amplifico por PCR usando ADN genomico de la cepa J99 de H.

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pylori como plantilla. Los siguientes oligonucleotidos se usaron como cebadores: 5'- CAT ATG GCA ATA GGT TCA TTA A-3' (SEQ ID NO: 19) y 5'- CTC GAG ATT CTT TTT AGC CGC TGC-3' (SEQ ID NO: 20). Usando este enfoque, se introdujo un sitio Ndel en el extremo 5' de los cebadores directos y un sitio Xhol en el extremo 5' de los cebadores inversos. Despues de la amplificacion por PCR, el producto (2058 pb) se ligo en el vector de clonacion pTZ57R/T (InsTAclone™ PCR Cloning Kit, MBI Fermentas, Lithuania). Posteriormente, el inserto se confirmo mediante PCR y secuenciacion, y se clono en un vector de expresion de PET-28a (+) (Qiagen, EE. UU.) usando enzimas de restriccion Ndel y Xhol.

Ejemplo 2: expresion, purificacion y reconocimiento de FliD recombinante

Las celulas competentes de E. coli BL21 (Qiagen, EE.UU.) se transformaron con pET-28a(+)-fliD y se inocularon en caldo LB con antibiotico (kanamicina, 50 |ig/ml). La expresion se indujo mediante la adicion de 1 mmol/l de isopropil p-D- 1-tiogalactopiranosido (IPTG) a una densidad optica (OD600) de 0.6. Despues de 4 horas, las celulas se recogieron y el analisis de protemas del lisado completo se llevo a cabo mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio- poliacrilamida (SDS-PAGE). Las protemas etiquetadas con histidina soluble se purificaron usando cromatograffa de afinidad (HisTrap crudo, GE Healthcare). Como segunda etapa de pulido y para intercambio de solucion reguladora, se realizo una cromatograffa de exclusion por tamano (Superdex 75, gE Healthcare). Las fracciones relevantes se recogieron y se concentraron con un dispositivo de filtro centfffugo (Millipore) con un corte de 10 kDa y se almacenaron a -80 °C. La protema recombinante purificada se evaluo mediante transferencia de Western usando un anticuerpo anti- His Tag-HRp y tambien un anticuerpo anti-H pylori-HRP de raton. (Pierce, Rockford, EE. UU.) y detectado por el sistema ECL (GE Healthcare, Uppsala, Suecia).

La amplificacion del gen FliD del ADN de la cepa J99 de H. pylori revelo un unico producto de PCR de 2.05 kb (datos no mostrados) que se confirmo mediante secuenciacion y se ligo en el vector de expresion pET-28a(+). Despues de la transformacion en la cepa de expresion de E. coli BL21 DE3 y la induccion con IPTG, se pudo observar una unica banda clara en la transferencia de Western usando un antisuero anti-H pylori policlonal comercial. La protema se purifico como se describe en materiales y metodos hasta > 90% de pureza (datos no mostrados) y se confirmo de nuevo mediante transferencia Western (datos no mostrados).

Ejemplo 3: Produccion y purificacion de anticuerpo espedfico para rFliD

Se inmunizo un conejo blanco de Nueva Zelanda maduro con protema purificada segun el protocolo de Hay et al. con ligeras modificaciones (Hay, et al., 2002). En resumen, la inmunizacion se llevo a cabo por inyeccion i.m. de 250 |ig de protema recombinante purificada (0.5 ml) con el mismo volumen (0.5 ml) de adyuvante completo de Freund. Para las inmunizaciones de recuerdo, el conejo se reforzo con 125 |ig de protema purificada preparada en el mismo volumen (0.5 ml) de adyuvante incompleto de Freund 4, 6, 8 y 10 semanas despues. Como control negativo, se tomo una muestra de suero antes de la inmunizacion. Finalmente, dos semanas despues de la ultima inmunizacion, se recogio sangre y se separo el suero. El anticuerpo IgG policlonal se purifico por cromatograffa de afinidad con sefarosa-4B usando columnas conjugadas con rFliD preparadas segun el protocolo del fabricante (Pharmacia, 1988). La expresion de FliD de H. pylori (J99) se detecto mediante transferencia de Western usando sobrenadante ultrasonico a la concentracion de protema de 50 |ig /ml. El anticuerpo IgG policlonal de conejo producido contra la protema rFliD se uso como el primer anticuerpo (dilucion 1: 5000), anticuerpo ovino marcado con HRP contra IgG de conejo (Avicenna Research Institute, Teheran, Iran) como el segundo anticuerpo (dilucion 1: 3000) y el sistema ECL se uso para la deteccion (Chen, et al., 2001).

Ademas, para probar la antigenicidad de la FliD recombinante y para compararla con la protema nativa, se produjo antisuero policlonal de conejo. Los fftulos de anticuerpos ya se determinaron despues de la tercera inmunizacion y alcanzaron niveles elevados despues del cuarto refuerzo, lo que confirma la buena inmunogenicidad de FliD. El antisuero de conejo fue capaz de reconocer la rFliD y la FliD purificadas en el lisado de H. pylori (datos no mostrados).

Ejemplo 4: Desarrollo de un ELISA

Se recubrieron placas de ELISA con 100 |il de protema rFliD a una concentracion de 1 |ig/ml en PBS y se incubaron durante la noche a 4 °C. Los pozos revestidos se bloquearon con solucion salina regulada con fosfato (PBS) que contema albumina de suero bovino al 2.5% (BSA, Sigma) durante dos horas a 37 °C. Todas las muestras serologicas positivas y negativas a H. pylori usadas en este estudio se cribaron de anticuerpos contra FliD usando una dilucion optima del suero de los pacientes (dilucion 1:100) como el primer anticuerpo, IgG antihumana conjugada con HRP (Promega, Mannheim, Alemania) (dilucion 1:100) como el anticuerpo secundario y TMB (3,3', 5,5'-tetra metil bencidina) como sustrato. Ademas, los pozos se dejaron sin revestir como control para cada suero. El resultado de ELISA para la muestra de suero de un paciente se considero positivo si su valor OD450 era superior a la media mas 3 SD de muestras de suero negativas (Chen, et al., 2001).

Ejemplo 5: Desarrollo de un ensayo lineal FliD

Se preparo un inmunoensayo lineal basado en protemas recombinantes de H. pylori inmovilizadas en nitrocelulosa. A diferencia de ELISA, el principio de la prueba permite la identificacion de anticuerpos espedficos contra diversos antigenos de H. pylori mediante la aplicacion por separado de diferentes antfgenos individuales.

rFliD se inmovilizo en tiras de membrana de nitrocelulosa junto con otros antigenos de H. pylori recombinantes 5 altamente purificados (CagA, VacA, GroEL, UreA (ureasa A), HcpC (protema C rica en cistema) (Mittel et al., 2003) y gGT (gamma glutamil transferasa). Las condiciones de lmea apropiadas para rFliD se determinaron empmcamente con una seleccion de muestras de suero estandar de una poblacion de estudio descrita previamente que comprende 20 muestras definidas H. pylori histologicamente positivas y 20 muestras definidas como negativas histologicamente para H. pylori. La concentracion de antigeno optima y la eleccion ideal de aditivos como detergente, ditiotreitol y NaCl se 10 ajustaron para cada antigeno mediante ciclos repetidos de revestimiento y cribado. Las condiciones con la mejor presentacion de epttopos de antfgeno y union optima a la membrana, observables por una apariencia de banda perfecta y la mejor discriminacion de muestras negativas y positivas, se seleccionaron para las especificaciones ideales del producto de los primeros lotes. Se anadieron bandas de control en el extremo superior de la tira que comprende anticuerpos de IgG/IgM/IgA anti-humano de conejo como controles de incubacion e IgG humana, anticuerpos IgM o IgA 15 como control conjugado, asf como un control de corte que permite la evaluacion de la reactividad de las bandas de antfgenos individuales.

Despues del escaneo y el analisis densitometrico de las intensidades de la banda, el control se uso como referencia interna para calcular las relaciones para cada banda. Por lo general, las bandas de control de corte se califican entre 20 y 30, mientras que las bandas positivas fuertes pueden obtener hasta 600 puntos. Cada banda que califica por encima 20 del control individual de cada banda se considera positiva (proporcion > 1).

El ensayo lineal respectivo se representa en la figura 1

Ejemplo 6: Prototipo de un ensayo de flujo lateral para el diagnostico de H. pylori

Usando los materiales definidos anteriormente, se desarrollo un ensayo de flujo lateral basado en los principios descritos en este documento relacionados con el diseno de un ensayo de flujo lateral.

25 El prototipo de tal ensayo de flujo lateral se representa en la figura 2, por lo que la figura 2A ilustra el diseno esquematico del ensayo, y la figura 2B representa el resultado de un analisis de una muestra obtenida de un ser humano usando el ensayo., en el que se detectaron los anticuerpos anti-FliD.

Como se puede deducir de la figura 2A, el ensayo utilizo nanopartfculas de oro recubiertas con anti-hlgG. rFliD, asf como tambien CagA recombinante estaban presentes como antfgenos. hIgG tambien se inmovilizo sirviendo como 30 control. La estructura porosa estaba formada por nitrocelulosa. La banda de control indico que el sistema funciona correctamente. La banda FliD indico que el paciente tema una infeccion activa o recientemente tratada. La banda CagA, en caso de infeccion activa (+ banda FliD), indica que esta infeccion debe ser tratada.

Ejemplo 7: analisis de muestras a partir de un hombre

Un total de seiscientos dieciocho (618) pacientes humanos (308 hombres, 310 mujeres) se inscribieron en el estudio. 35 Despues de recibir una explicacion del proposito del estudio, se obtuvo el consentimiento informado de cada paciente y se tomo una muestra de sangre en el momento de la endoscopia, antes de iniciar cualquier terapia. Los sueros se separaron y almacenaron a -20 °C. El diagnostico de infeccion se baso en la histopatologfa como patron de oro. Los pacientes se consideraron positivos a H. pylori cuando los resultados de la histopatologfa fueron positivos. Todos los pacientes se cribaron mediante el ensayo lineal de FliD, y se analizo un subconjunto de 246 sueros mediante FliD 40 ELISA como se describio anteriormente y mediante ensayo lineal como se describio anteriormente.

La tabla 2 muestra los resultados de usar dicho FliD ELISA. Mas espedficamente, la tabla 2 muestra la respuesta serologica FliD en ELISA que compara pacientes humanos positivos y negativos a H. pylori.

Histologfa Total

Negativo

Positivo

ELISA

Negativo 73 8 81

Positivo

3 162 165

Total

76 170 246

5

10

15

20

25

30

35

La tabla 3 muestra los resultados de usar dicho ensayo lineal para un subgrupo del grupo de pacientes. Mas espedficamente, la tabla 3 muestra la respuesta serologica FliD en el ensayo lineal que compara pacientes positivos y

negativos a H. pylori.

Histologfa Total

Negativo

Positivo

Ensayo de lmea Negativo Positivo

76 14 90

0

156 156

Total

76 170 246

Usando la FliD ELISA, entre 170 muestras positivas informadas, se detectaron 165 muestras positivas, mientras que entre 76 muestras informadas se reconfirmaron negativas 73 como negativas mediante ELISA (Tabla 2). En conjunto, la aplicacion de FliD en el diagnostico de infeccion por H. pylori basado en ELISA tiene una especificidad del 96% y una sensibilidad del 97%. Curiosamente, los cinco casos que fueron negativos para ELISA tambien tuvieron puntuaciones bajas, pero apenas positivas en la lmea de transferencia que se encontraban justo por encima del punto de corte (proporciones que van desde 1.2 a 2.2). Uno de estos tambien se considero H. pylori negativo por transferencia de lmea, mientras que los otros cuatro fueron positivos de transferencia de lmea, reaccionando con varios otros antigenos (datos no mostrados). Es importante tener en cuenta que solo una muestra fue negativa en ambas pruebas.

El grupo completo de 618 pacientes humanos (parte del cual se habfa cribado mediante ELISA) se analizo usando el ensayo lineal en cuanto a la respuesta de anticuerpos contra FliD. una alta sensibilidad del 97.4%, con 310 de 318 pacientes evaluados como positivos en histopatologfa por ensayo lineal, mientras que el ensayo lineal alcanza una especificidad del 99% (Tabla 2). Los resultados de los pacientes en los que se obtuvieron resultados discrepantes, fueron cuidadosamente examinados. 8 sueros fueron negativos para FliD en el ensayo lineal, pero mostraron reactividad con otros antfgenos, lo que indica que, en este documento, de hecho, FliD no se reconocio como antfgeno. Dentro de estas 8 muestras, una no tema reactividad contra la banda FliD en absoluto. Siete teman una reactividad debil que estaba apenas por debajo del punto de corte (proporciones entre 0.6 y 0.95), y cuatro de ellos teman reactividades debiles contra todos los otros antfgenos reconocidos en general (no se muestra). Las tres muestras en las que FliD dio un resultado "falso positivo" tambien mostraron reactividades con otras bandas. Todas estas bandas, incluida FliD, eran relativamente debiles, pero estaban claramente por encima del lfmite.

A partir de dichas muestras, se determino la prevalencia de una respuesta de anticuerpos anti-FliD en funcion de anos despues de la erradicacion. El resultado se muestra en la figura 3. Como se puede deducir de la figura 3, todavfa hay una prevalencia de una respuesta de anticuerpos anti-FliD de aproximadamente el 25% despues de 16 a 20 anos despues de la erradicacion de H. pylori.

A partir de dichas muestras, las curvas de caractensticas de funcionamiento del receptor (ROC) se prepararon para FliD, CagA y UreA. El resultado se muestra en la figura 4. A partir de dicha figura 4, es evidente que FliD es ventajoso con respecto a los dos antfgenos de la tecnica anterior usados en la deteccion de la infeccion por H. pylori.

Ejemplo 8: analisis bioinformatico de secuencias FliD

Usando herramientas bioinformaticas, la protema FliD de la cepa H. pylori G27 se comparo ampliamente con otros organismos, principalmente procariotas. Este analisis muestra mas del 97% de homologfa entre mas de 200 cepas de H. pylori.

Los resultados se muestran en la tabla 4.

Entrada

Nombre de la entrada Nombres de las protemas Organismo Longitud Identidad Puntuacion

B5Z7B5

B5Z7B5_HELPG Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori (cepa G27) 685 100.0% 3412

J0KLR1

J0KLR1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-27 685 99.0% 3383

I9RP80

I9RP80_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Hp A-20 685 99.0% 3381

J0MV71

J0MV71_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp A-27 685 99.0% 3379

J0DL62

J0DL62_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Hp H-11 685 99.0% 3375

J0A5P7

J0A5P7_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Hp A-9 685 98.0% 3372

J0IU02

J0IU02_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori NQ4228 685 99.0% 3371

K2L7H4

K2L7H4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori R036d 685 98.0% 3370

J0TQK4

J0TQK4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-30 685 99.0% 3369

M7RTJ4

M7RTJ4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori UMB_G1 685 98.0% 3367

K2L537

K2L537 _HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori R055a 685 99.0% 3367

J0SAM4

J0SAM4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-15b 685 99.0% 3367

J0M138

J0M138_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-45 685 99.0% 3367

I9WVW7

I9WVW7_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Hp P-15 685 99.0% 3367

K2KUE2

K2KUE2_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori R030b 685 99.0% 3365

I0EHS2

I0EHS2_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori PeCan18 685 98.0% 3365

H8H4E1

H8H4E1_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori ELS37 685 98.0% 3362

K2LNG6

K2LNG6_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori R038b 685 98.0% 3361

D0IS88

D0IS88_HELP1 Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori (cepa 51) 685 98.0% 3360

N4T9B5

N4T9B5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa Helicobacter pylori Hp 685 98.0% 3359

2 A-11

E1PZL2

E1PZL2_HELPM Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa SJM180) 685 98.0% 3358

J0IVU8

J0IVU8_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori NQ4099 685 98.0% 3358

J0FGE4

J0FGE4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-16 685 98.0% 3358

Q1CTB8

Q1CTB8_HELPH Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori (cepa HPAG1) 685 98.0% 3357

E8QPN8

E8QPN8_HELPR Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa Lithuania75) 685 98.0% 3355

K2KUX6

K2KUX6_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori R32b 685 98.0% 3355

K2KMU9

K2KMU9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori R037c 685 98.0% 3355

J0HQJ3

J0HQJ3_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori CPY1124 685 98.0% 3355

I9XF52

I9XF52_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-74 685 98.0% 3355

I9U4H5

I9U4H5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp A-26 685 98.0% 3355

D7FEA9

D7FEA9_HELP3 Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori (cepa B8) 685 98.0% 3354

I9US75

I9US75_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-9 685 98.0% 3354

B9XZK1

B9XZK1_HELPX Protema no caracterizada putativa Helicobacter pylori B128 685 98.0% 3354

J0J9Q0

J0J9Q0_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori NQ4076 685 98.0% 3353

I9QZB4

I9QZB4_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori NQ4110 685 98.0% 3353

G2M3P3

G2M3P3_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Puno120 685 98.0% 3352

E1QBB7

E1QBB7_HELPC Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa Cuz20) 685 98.0% 3351

J0LRM5

J0LRM5_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Hp H-43 685 98.0% 3351

E6NRT1

E6NRT1_HELPQ Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa F57) 685 98.0% 3350

M3MVK5

M3MVK5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM114Ai 685 98.0% 3350

K2KRX5

K2KRX5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori R018c 685 98.0% 3350

K2KFQ1

K2KFQ1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori R056a 685 98.0% 3350

J0IGN4

J0IGN4_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori NQ4216 685 98.0% 3349

E6S1Q8

E6S1Q8_HELPF Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori (cepa 35A) 685 98.0% 3348

I9YJR2

I9YJR2_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-13b 685 98.0% 3348

I9WT57

I9WT57_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-13 685 98.0% 3348

I9U161

I9U161_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Hp A-14 685 98.0% 3348

B6JLY6

B6JLY6_HELP2 Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori (cepa P12) 685 98.0% 3347

K2K5F9

K2K5F9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori R046Wa 685 98.0% 3347

I9XUJ1

I9XUJ1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori CPY1313 685 98.0% 3347

I9PV13

I9PV13_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori CPY6311 685 98.0% 3347

I9PLR1

I9PLR1_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori CPY6261 685 98.0% 3347

L8VWS3

L8VWS3 HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori A45 685 98.0% 3346

K7Y5K8

K7Y5K8 HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Aklavik117 685 98.0% 3346

J0T145

J0T145_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp M2 685 98.0% 3346

I9T4Z9

I9T4Z9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa Helicobacter pylori Hp H-44 685 98.0% 3346

E8QFQ7

E8QFQ7_HELP7 Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa India7) 685 98.0% 3345

C7BX84

C7BX84_HELPB Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 FliD Helicobacter pylori (cepa B38) 685 98.0% 3345

I9W7Z2

I9W7Z2_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-2 685 98.0% 3345

I0ZBA9

I0ZBA9_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori P79 685 98.0% 3345

F4D5I7

F4D5I7_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori 83 685 98.0% 3345

B9XUM1

B9XUM1_HELPX Protema no caracterizada putativa Helicobacter pylori 9810 685 98.0% 3345

P96786

FLID_HELPY Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 (HAP2) (Protema cap filamento)(Protema cap flagelar) Helicobacter pylori (cepa ATCC 700392 /26695) (Campylobacter pylori) 685 98.0% 3345

M3SDI9

M3SDI9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAMchJs106B 685 98.0% 3344

I9XAU3

I9XAU3_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Hp P-23 685 98.0% 3344

I9PTN1

I9PTN1_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori CPY6271 685 98.0% 3344

G2M8C7

G2M8C7_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Punol35 685 98.0% 3344

E1Q6P5

E1Q6P5_HELPP Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa PeCan4) 685 98.0% 3343

M3KWT6

M3KWT6_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM119Bi 685 98.0% 3343

I0ZGY9

I0ZGY9_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori NCTC 11637 = CCUG 17874 685 98.0% 3343

I2DFT2

I2DFT2_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori XZ274 685 98.0% 3342

E6NKD5

E6NKD5_HELPL Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa F32) 685 98.0% 3341

E6NIS5

E6NIS5_HELPK Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa F30) 685 98.0% 3341

I9ZP80

I9ZP80_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa Helicobacter pylori NQ4161 685 98.0% 3341

2

I9RRM1

I9RRM1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp A-17 685 98.0% 3341

J0A0N9

J0A0N9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp P-26 685 97.0% 3340

I9QGH5

I9QGH5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori NQ4053 685 98.0% 3340

D6XPZ1

D6XPZ1_HELPV Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori (cepa v225d) 685 98.0% 3339

M5YZL4

M5YZL4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAMchJs124i 685 97.0% 3339

M5YMA1

M5YMA1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAMchJs114i 685 97.0% 3339

M4ZNA5

M4ZNA5_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori OK310 685 97.0% 3339

M3NNS0

M3NNS0_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM246Ai 685 97.0% 3339

M3MBN7

M3MBN7_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM105Ai 685 97.0% 3339

I9S784

I9S784_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Hp H-28 685 98.0% 3339

I0E4K1

I0E4K1_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Shi417 685 98.0% 3339

J0P747

J0P747_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp H-23 685 97.0% 3338

J0N2H0

J0N2H0_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp H-4 685 97.0% 3338

I0ED42

I0ED42_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Shi112 685 98.0% 3338

M7SSG1

M7SSG1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori CPY1662 685 97.0% 3337

M5Y955

M5Y955_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAMchJs117Ai 685 97.0% 3337

M4ZKA3

M4ZKA3_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori OK113 685 98.0% 3337

M3LA33

M3LA33_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa Helicobacter pylori GAM231Ai 685 97.0% 3337

2

I9Z0G2

I9Z0G2_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-28b 685 97.0% 3337

I9S3M7

I9S3M7_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-24 685 98.0% 3337

I0EWG9

I0EWG9_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori HUP-B 14 685 97.0% 3337

M3PSG4

M3PSG4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM96Ai 685 97.0% 3336

J0U8I3

J0U8I3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-3b 685 97.0% 3336

J0RUS2

J0RUS2_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-5b 685 97.0% 3336

J0Q0D5

J0Q0D5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-4 685 97.0% 3336

J0PSB5

J0PSB5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-3 685 97.0% 3336

I9Y932

I9Y932_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-4c 685 97.0% 3336

I9XWQ4

I9XWQ4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-4d 685 97.0% 3336

E6NDJ6

E6NDJ6_HELPI Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa F16) 685 97.0% 3334

M3QDF1

M3QDF1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM80Ai 685 97.0% 3334

M3Q5B9

M3Q5B9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM42Ai 685 97.0% 3334

M3P646

M3P646_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM245Ai 685 97.0% 3334

M3LV71

M3LV71_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM112Ai 685 97.0% 3334

M3L655

M3L655_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM101Biv 685 97.0% 3334

E1S8R1

E1S8R1_HELP9 Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori (cepa 908) 685 97.0% 3333

E1PVI4

E1PVI4_HELPT Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa Sat464) 685 98.0% 3333

D0JZC3

D0JZC3_HELP5 Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa 52) 685 97.0% 3333

M3RS44

M3RS44_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP116Bi 685 97.0% 3333

M3R005

M3R005_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM264Ai 685 97.0% 3333

M3MJ19

M3MJ19_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM103Bi 685 97.0% 3333

J0I156

J0I156_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori CPY3281 685 98.0% 3333

J0AJS5

J0AJS5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp H-16 685 97.0% 3333

I0E947

I0E947_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Shi169 685 98.0% 3333

F2JET0

F2JET0_HELP9 Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori 2018 685 97.0% 3333

F2JAT7

F2JAT7_HELP9 Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori 2017 685 97.0% 3333

Q9ZL91

FLID_HELPJ Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 (HAP2) (Protema cap filamento)(Protema cap flagelar) Helicobacter pylori (cepa J99) (Campylobacter pylori J99) 685 97.0% 3333

M3NID0

M3NID0_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM270ASi 685 97.0% 3332

J0DCU5

J0DCU5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-6 685 97.0% 3332

I9V408

I9V408_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Hp H-10 685 97.0% 3332

J0U3G8

J0U3G8_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-62 685 97.0% 3331

I9SL37

I9SL37_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp H-29 685 97.0% 3331

E8QM56

E8QM56_HELP4 Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa Gambia94/24) 685 97.0% 3330

M5YNV6

M5YNV6_HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3330

gancho flagelar putativa

2 GAMchJsl36i

M3TQ89

M3TQ89_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP260Bi 685 97.0% 3330

M3QIV4

M3QIV4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM260Bi 685 97.0% 3330

M3Q2L5

M3Q2L5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM263BFi 685 97.0% 3330

M3M583

M3M583_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM115Ai 685 97.0% 3330

JOSFX5

J0SFX5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-25c 685 97.0% 3330

J0HGQ0

J0HGQ0_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-25d 685 97.0% 3330

I9X9I1

I9X9I1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-25 685 97.0% 3330

I9VCT9

I9VCT9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp H-19 685 97.0% 3330

M3S7G6

M3S7G6_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM83T 685 97.0% 3329

M3PEV1

M3PEV1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM244Ai 685 97.0% 3329

M3P9F3

M3P9F3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM83Bi 685 97.0% 3329

M3NFC4

M3NFC4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM118Bi 685 97.0% 3329

K8GY42

K8GY42_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM100Ai 685 97.0% 3329

J0UFU9

J0UFU9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp M9 685 97.0% 3329

J0T5P3

J0T5P3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp M4 685 97.0% 3329

J0REL3

J0REL3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-24c 685 97.0% 3329

J0I743

J01743_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp M5 685 97.0% 3329

J0I1J2

J0I1J2_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp M3 685 97.0% 3329

J0HJK5

J0HJK5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp M1 685 97.0% 3329

I9ZYP3

I9ZYP3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp M6 685 97.0% 3329

I9XJ16

I9XJ16_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-24b 685 97.0% 3329

M3UI84

M3UI84_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP260BFii 685 97.0% 3328

M3U8F0

M3U8F0_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP250BSi 685 97.0% 3328

M3T9M6

M3T9M6_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP250ASi 685 97.0% 3328

M3T443

M3T443_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP250ASii 685 97.0% 3328

M3T0U7

M3T0U7_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP250AFiV 685 97.0% 3328

M3SWF6

M3SWF6_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP250BFiV 685 97.0% 3328

M3SP57

M3SP57_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP250AFiii 685 97.0% 3328

M3S6F4

M3S6F4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP250BFiii 685 97.0% 3328

M3R7T2

M3R7T2_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP250AFii 685 97.0% 3328

M3QV83

M3QV83_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM260BSi 685 97.0% 3328

M3QS41

M3QS41_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP250BFii 685 97.0% 3328

M3QQ64

M3QQ64 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3328

gancho flagelar putativa 2 HP250BFi

M3Q6I7

M3Q6I7 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3328

gancho flagelar putativa 2 GAM250T

M3NV58

M3NV58 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3328

gancho flagelar putativa 2 GAM252Bi

M3NKC5

M3NKC5 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3328

gancho flagelar putativa 2 GAM252T

M3LZX8

M3LZX8 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3328

gancho flagelar putativa 2 GAM250AFi

J0CLQ3

J0CLQ3 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori Hp 685 97.0% 3328

gancho flagelar putativa 2 A-16

I9XTZ6

I9XTZ6 HELPX Protema capsular Helicobacter pylori 685 98.0% 3328

flagelar CPY1962

B2UT80

B2UT80 HELPS Protema capsular Helicobacter pylori 685 97.0% 3327

flagelar (cepa Shi470)

M7SW73

M7SW73 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori Hp 685 97.0% 3327

gancho flagelar putativa 2 H-1

M3P129

M3P129 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3327

gancho flagelar putativa 2 GAM254Ai

I9P985

I9P985 HELPX Protema capsular Helicobacter pylori 685 97.0% 3326

flagelar CPY6081

K7YA88

K7YA88 HELPX Protema capsular Helicobacter pylori 685 97.0% 3325

flagelar Aklavik86

M3RIK8

M3RIK8 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3324

gancho flagelar putativa 2 GAM93Bi

J0M8U8

J0M8U8 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori Hp 685 97.0% 3324

gancho flagelar putativa 2 A-6

M3NGP1

M3NGP1 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3323

gancho flagelar putativa 2 GAM265BSii

M3KZM7

M3KZM7 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3323

gancho flagelar putativa 2 GAM120Ai

M3PUQ6

M3PUQ6 HELPX Protema asociada al Helicobacter pylori 685 97.0% 3322

gancho flagelar putativa 2 GAM249T

M3PCL7

M3PCL7_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM239Bi 685 97.0% 3322

M3NM23

M3NM23_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM121Aii 685 97.0% 3322

J0IWR3

J0IWR3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori NQ4200 685 97.0% 3322

J0PFP0

J0PFP0_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-1 685 97.0% 3321

I9XPS7

I9XPS7_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-1b 685 97.0% 3321

J0N254

J0N254_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-3 685 97.0% 3320

M3U8B7

M3U8B7_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP260AFii 685 97.0% 3319

M3U287

M3U287_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP260AFi 685 97.0% 3319

M3RLI9

M3RLI9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori HP260ASii 685 97.0% 3319

M3Q751

M3Q751_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM268Bii 685 97.0% 3319

M3P4U3

M3P4U3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM260ASi 685 97.0% 3319

M3LLE6

M3LLE6_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM201Ai 685 97.0% 3318

J0JT98

J0JT98_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp A-5 680 98.0% 3318

I9SDQ6

I9SDQ6_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-30 677 97.0% 3314

J0BNB3

J0BNB3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp H-42 680 97.0% 3311

G2MEG6

G2MEG6_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori SNT49 685 97.0% 3311

J0UBP3

J0UBP3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa Helicobacter pylori Hp P-2b 677 97.0% 3308

2

I9QNB9

I9QNB9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori NQ4044 685 96.0% 3302

I9ZZM5

I9ZZM5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp A-4 677 97.0% 3300

M7SHH3

M7SHH3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori CCHI 33 677 97.0% 3297

I9TJA1

I9TJA1_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp A-8 677 97.0% 3297

M3NMW 6

M3NMW6_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori GAM210Bi 685 96.0% 3296

I9YL06

I9YL06_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-11b 677 97.0% 3293

I9WS67

I9WS67_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-11 677 97.0% 3293

J0PC82

J0PC82_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp H-34 677 97.0% 3292

I9VJH4

I9VJH4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp H-21 677 97.0% 3292

J0PV65

J0PV65_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-8 677 97.0% 3291

I9YHM9

I9YHM9_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-8b 677 97.0% 3291

J0TUW0

J0TUW0_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp P-41 677 97.0% 3289

J0NSR5

J0NSR5_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-18 677 97.0% 3289

J0BAE3

J0BAE3_HELPX Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter pylori Hp H-36 677 97.0% 3289

J0LI78

J0LI78_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter pylori Hp H-41 677 96.0% 3278

E8QRV3

E8QRV3_HELPW Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa SouthAfrica7) 685 95.0% 3264

Q17Y06

Q17Y06_HELAH Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter acinonychis (cepa 685 94.0% 3249

Sheeba)

K4NRS2

K4NRS2_HELPY Protema capsular flagelar Helicobacter pylori (cepa ATCC 700392 /26695) (Campylobacter pylori) 674 97.0% 3190

K4NL36

K4NL36_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Rif2 674 97.0% 3190

K4NJJ9

K4NJJ9_HELPX Protema capsular flagelar Helicobacter pylori Rif1 674 97.0% 3190

M3QVV4

M3QVV4_HELPX Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 (Fragmento) Helicobacter pylori GAM71Ai 647 97.0% 3146

I0ETW0

I0ETW0_HELCM Protema capsular flagelar Helicobacter cetorum (cepa ATCC BAA-540 / MIT 99-5656) 685 88.0% 3065

I0EMR1

I0EMR1_HELC0 Protema capsular flagelar Helicobacter cetorum (cepa ATCC BAA-429 / MIT 00-7128) 685 81.0% 2861

E7ADC3

E7ADC3_HELFC Protema asociada al gancho flagelar Helicobacter felis (cepa ATCC 49179 / NCTC 12436/CS1) 684 63.0% 2190

E7FYJ6

E7FYJ6_9HELI Protema capsular flagelar Helicobacter suis HS1 689 61.0% 2158

F8KTH3

F8KTH3_HELBC Protema asociada al gancho flagelar FliD Helicobacter bizzozeronii (cepa CIII-1) 694 59.0% 2091

K4RHP3

K4RHP3_HELHE Protema asociada al gancho flagelar FliD Helicobacter heilmannii ASB1.4 691 58.0% 2073

D3UGM5

D3UGM5_HELM1 Protema asociada al gancho flagelar putativa Helicobacter mustelae (cepa ATCC 43772 / LMG 18044/NCTC 12198/12198) (Campylobacter mustelae) 674 52.0% 1778

Q7VI19

Q7VI19JHEUHP Protema capsular del filamento flagelar FliD Helicobacter hepaticus (cepa ATCC 51449 / 3B1) 682 51.0% 1698

I2FDC5

I2FDC5_HELCP Protema capsular flagelar Helicobacter cinaedi (cepa PAGU611) 682 51.0% 1690

17GZJ0

I7GZJ0_9HELI Protema capsular flagelar Helicobacter cinaedi ATCC BAA-847 682 51.0% 1689

E4VHL6

E4VHL6_9HELI Protema gancho flagelar 2 Helicobacter cinaedi CCUG 18818 682 51.0% 1689

N2BQN7

N2BQN7_9HELI Protema no caracterizada Helicobacter bilis WiWa 679 45.0% 1589

C3XDT1

C3XDT1_9HELI Protema capsular flagelar Helicobacter bilis ATCC 43879 679 45.0% 1583

Q7MAM3

Q7MAM3 WOLS U Protema asociada al gancho flagelar 2 Wolinella succinogenes (cepa ATCC 29543/DSM 1740/LMG 7466 / NCTC 11488/FDC 602W) (Vibrio succinogenes) 682 45.0% 1479

C5EXF0

C5EXF0_9HELI Protema gancho flagelar 2 Helicobacter pullorum MIT 98-5489 685 39.0% 1272

C5ZWT4

C5ZWT4_9HELI Protema asociada al gancho flagelar (Protema gancho flagelar 2) Helicobacter canadensis MIT 985491 689 39.0% 1262

H5VEC0

H5VEC0_HELBI Protema asociada al gancho flagelar FliD Helicobacter bizzozeronii CCUG 35545 458 53.0% 1185

C3XLS4

C3XLS4_9HELI Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Helicobacter winghamensis ATCC BAA-430 689 37.0% 1175

H5VEC1

H5VEC1_HELBI Protema asociada al gancho flagelar FliD Helicobacter bizzozeronii CCUG 35545 231 66.0% 807

H8CS11

H8CS11_CAMJU Protema capsular flagelar Campylobacter jejuni subsp. jejuni LMG 9872 645 27.0% 474

B9KGA6

B9KGA6_CAMLR Protema cap del filamento flagelar FliD Campylobacter lari (cepa RM2100 / D67/ATCC BAA-1060) 766 26.0% 471

C6RGG2

C6RGG2_9PROT Transportador de eflujo multifarmaco tipo SMR Campylobacter showae RM3277 577 29.0% 465

D2MX77

D2MX77_CAMJU Protema asociada al gancho flagelar Campylobacter jejuni subsp. jejuni 414 642 28.0% 461

M3I083

M3I083_9PROT Protema capsular flagelar Campylobacter showae CC57C 577 28.0% 457

H7SA14

H7SA14_CAMCO Protema capsular flagelar Campylobacter coli 84-2 644 26.0% 452

D2MS44

D2MS44_CAMJU Protema asociada al gancho flagelar FliD Campylobacter jejuni subsp. jejuni 1336 647 26.0% 451

H7XBH0

H7XBH0_CAMJU Protema capsular flagelar Campylobacter jejuni subsp. jejuni LMG 23216 648 26.0% 451

H7YRN9

H7YRN9_CAMJU Protema capsular flagelar Campylobacter jejuni subsp. jejuni LMG 23357 648 27.0% 449

Q30U48

Q30U48SULDN Protema del tipo protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Sulfurimonas denitrificans (cepa ATCC 33889/DSM 1251) (Thiomicrospira denitrificans (cepa ATCC 33889/DSM 462 31.0% 441

5

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20

25

1251))

H8BWB9

H8BWB9_CAMJU Protema capsular flagelar Campylobacter jejuni subsp. jejuni 1213 642 27.0% 447

H8AWN7

H8AWN7_CAMJU Protema capsular flagelar Campylobacter jejuni subsp. jejuni 1997-11 643 26.0% 447

A3ZDR2

A3ZDR2_CAMJU Protema asociada al gancho flagelar FliD Campylobacter jejuni subsp. jejuni HB93-13 643 26.0% 447

A7H4J4

A7H4J4_CAMJD Protema asociada al gancho flagelar FliD Campylobacter jejuni subsp. doylei (cepa ATCC BAA-1458 / RM4099/269.97) 646 26.0% 447

A3YRI3

A3YRD_CAMJU Protema asociada al gancho flagelar FliD Campylobacter jejuni subsp. jejuni 260.94 642 25.0% 442

H7WEH0

H7WEH0 CAMC O Protema capsular flagelar Campylobacter coli H8 637 26.0% 441

E1PLQ8

E1PLQ8_CAMJM Protema asociada al gancho flagelar putativa 2 Campylobacter jejuni subsp. jejuni serotype HS21 (cepa M1 /99/308) 643 27.0% 441

Ejemplo 9: Presencia y expresion de FliD en H. pylori Muestras

Se inscribieron 81 aislados de H. pylori de pacientes humanos en el estudio. Las muestras fueron diagnosticadas como positivas por cultivo bacteriano convencional en placas selectivas. En tales pruebas, se cultivaron bacterias en placas de agar con sangre Wilkins-Chalgren en condiciones microaerobias (10% de CO2, 5% de O2, 8.5% de N2 y 37 °C) durante 36 horas, y la positividad para oxidasa, catalasa y ureasa fue confirmada por pruebas bioqmmicas Una parte de las bacterias cultivadas se uso para el aislamiento de ADN y el resto se aplico para la preparacion de lisado de protemas para el analisis de transferencia de Western.

Suero policlonal anti-FliD de raton

Se inmunizaron tres ratones C57BL6 3 veces (semanalmente) con 30 mg de H. pylori FliD recombinante como antfgeno y 10 |ig de CT (toxina del colera) como adyuvante se resuspendio en PBS. Una semana despues del ultimo refuerzo de inmunizacion, los ratones se sangraron y los sueros se combinaron. La antigenicidad y la especificidad de los sueros reunidos se probaron en un analisis de transferencia de Western.

Analisis de transferencia de Western

Para establecer las condiciones optimas del ensayo, se generaron y purificaron diferentes concentraciones de la protema FliD recombinante, asf como de otras protemas de control recombinantes (Tig (factor desencadenante (Tomb et al., 1997)) y gGT) en las mismas condiciones, se aplicaron en geles de SDS al 8%. Despues de la transferencia de las protemas en la membrana de nitrocelulosa (Whatman/GE Healthcare, Freiburg, Alemania), las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5% durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche con diferentes diluciones de los antisueros como anticuerpos primarios. Despues de la incubacion de las membranas con IgG anti-raton marcada con HRP, las bandas se detectaron mediante la adicion de reactivos de deteccion de transferencia Western ECL.

Los resultados se muestran en la figura 5, por lo que en el lado derecho del gel de SDS representado se indica el antfgeno y su cantidad aplicada a los carriles individuales. Se uso una dilucion optima (1: 2000) de suero de anti raton.

Analisis de PCR de la presencia del ORF de FliD en el genoma de H. pylori

Se disenaron cuatro PCR basadas en la secuencia de ADN de la FliD como sujeto a SEQ ID NO: 2. La especificidad de cada par de cebadores como se indica en la tabla 5 se confirmo mediante analisis de blast contra todas las secuencias

5

10

15

20

25

30

de nucleotidos bacterianas del banco de genes. Las PCR se establecieron usando ADN de H. pylori como control positivo y ADN genomico de otros 10 microorganismos como controles negativos. Las PCR se realizaron usando la mezcla maestra de GoTaq polimerasa (Promega), la temperatura de apareamiento de 56 °C y el tiempo de extension de 30 segundos.

Tabla 5: Cebadores usados por analisis de PCR.

Cebador hacia adelante Cebador reverso Longitud del amplicon (bp)

PCR1

AGC TCA TTA GGG CTT GGC AG (SEQ ID NO: 21) GCT CGC GCT CAA CGC ATC (SEQ ID NO: 22) 246

PCR2

ATC ACG GAC GCT ACC AAT GG (SEQ ID NO: 23) AGG GAC TTC ATG CAT GCT CC (SEQ ID NO: 24) 288

PCR3

CAC AGA CGC TAT CAT TCA AGC (SEQ ID NO: 25) CCC GCT GAT CAC ATC ATT GAC (SEQ ID NO: 26) 300

PCR4

CGC TAA CCT CAT AGA TGG AGG (SEQ ID NO: 27) TAA GGG GCA A AG CGC TCC G (SEQ TD NO: 28) 150

Resultados

El ORF de la FliD se presenta en todos los aislados de pacientes con H. pylori (bacterias cultivadas aisladas de biopsias de pacientes). La presencia del ORF de la FliD podna confirmarse con las cuatro PCR usadas para este ensayo. PCR1, PCR2 y PCR3 realizadas por ADN aislado de 81 muestras de H. pylori fueron positivas en general. Mientras que la PCR4 fue positiva para 79 muestras (Fig. 6). La especificidad del ensayo se confirmo aplicando ADN aislado de P. aeruginosa (ATCC 27813), Klebsiella oxytoca (ATCC 700324), Candida albicans (ATCC 90028), Entrococcus faecalis (ATCC 29292), Strep. Group A (ATCC 19615), S. thyphimurium (ATCC 13311), S. aureus (ATCC 25923), S. epidermidis (ATCC 18228), H. influensae (ATCC 49247) y E. coli (ATCC 25922).

Como se puede deducir de la figura 6 que representa los resultados de un analisis PCR representativo realizado usando ADN genomico aislado de H. pylori cultivado aislado de biopsias de pacientes, se presenta el ORF (marco de lectura abierto) de FliD en casi todos los aislados de H. pylori. De este modo, los resultados de PCR confirman la presencia de la FliD en el ADN genomico. En la figura 6, los numeros arriba de los carriles indican el numero de muestra interno.

En cuanto a la deteccion de la protema FliD en muestras de pacientes que han sido diagnosticados como positivos para H. pylori, la protema FliD es detectable en el 97.5% de las muestras. Usando el analisis de transferencia de Western se pudo demostrar que la expresion de la protema FliD es detectable en 79 de los 81 lisados de protemas de H. pylori. Los resultados se muestran en la figura 7. En la figura 7, los numeros anteriores a los carriles indican el numero de muestra interno.

La especificidad del ensayo se confirmo mediante resultados negativos cuando se analizaron los lisados de protemas de otros microorganismos mediante analisis de transferencia Western. Los resultados de los mismos estan indicados en la figura 8. Como se puede tomar de la figura 8 aparte de FliD recombinante con etiqueta de estreptavidina (carriles 2 de ambas transferencias de Western) y lisados de protema sin etiqueta de estreptavidina (carriles 3 de ambas transferencias de Western) de P. aeruginosa (ATCC 27813) (transferencia western izquierda, carril 4), Klebsiella oxytoca (ATCC 700324) (transferencia western izquierda, carril 5), Candida albicans (ATCc 90024) (transferencia western izquierda, carril 6), Enterococcus faecalis (ATCC 29292) (transferencia western izquierda, carril 7), Streptococcus Gupo A (ATCC 19615) (transferencia western izquierda, carril 8), S. thyphimurium (ATCC 13311) (transferencia western derecha, carril 4), S. aureus (ATCC 25923) (transferencia western derecha, carril 5), S. epidermidis (ATCC 18228)

5

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45

(transferencia western derecha, carril 6), H. influensae (ATCC 49247) (transferencia western derecha, carril 7) y E. coli (ATCC 25922) (transferencia western derecha, carril 8).

En la presente memoria descriptiva se hace referencia a diversos documentos de la tecnica anterior cuya referencia completa se lee a continuacion.

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Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   1. Un metodo de deteccion de la infeccion por H. pylori en un sujeto, en el que el metodo comprende detectar en una muestra del sujeto una respuesta inmune contra FliD, en el que la respuesta inmune comprende un anticuerpo anti-FliD,

   en el que el metodo comprende hacer reaccionar la muestra con FliD o un fragmento de la misma, en el que el fragmento tiene una secuencia de aminoacidos que es lo suficientemente larga como para identificar el fragmento que es un fragmento de FliD y para excluir que el fragmento es un fragmento de una protema o polipeptido diferente de FliD.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el metodo comprende hacer reaccionar la muestra con FliD de longitud completa o un fragmento de la misma, en el que el fragmento es un fragmento cuya secuencia de aminoacidos es mas corta que la secuencia de aminoacidos de FliD de longitud completa, por lo que el fragmento aun esta activo como factor de virulencia.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo anti-FliD es un anticuerpo IgG y/o un anticuerpo IgA.
4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la deteccion se produce por medio de un ELISA, un ensayo de flujo lateral o un ensayo lineal.
5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el metodo comprende ademas detectar uno o mas antfgenos de Helicobacter, preferiblemente de H. pylori, en el que uno o mas antfgenos se selecciona (n) del grupo que consiste en CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 y HtrA.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en suero sangumeo, plasma sangumeo, sangre completa y heces.
7. 7. Uso de un kit que comprende FliD o un fragmento de la misma y al menos un constituyente adicional, en un metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

   en el que el fragmento tiene una secuencia de aminoacidos que es lo suficientemente larga como para identificar el fragmento que es un fragmento de FliD y excluir que el fragmento es un fragmento de una protema o polipeptido diferente de FliD, y en el que el al menos un constituyente adicional se selecciona del grupo que consiste en una solucion reguladora, una fase solida y un prospecto de instrucciones.
8. 8. El uso de la reivindicacion 7, en el que el kit comprende FliD de longitud completa o un fragmento de la misma, en el que el fragmento es un fragmento cuya secuencia de aminoacidos es mas corta que la secuencia de aminoacidos de FliD de longitud completa, por lo que el fragmento todavfa esta activo como factor de virulencia
9. 9. Un kit apropiado para su uso en un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho kit FliD de longitud completa o un fragmento de la misma y al menos un constituyente adicional,

   en el que el fragmento es un fragmento cuya secuencia de aminoacidos es mas corta que la secuencia de aminoacidos de FliD de longitud completa, por lo que el fragmento todavfa esta activo como factor de virulencia,

   y en el que el al menos un constituyente adicional se selecciona del grupo que consiste en una solucion reguladora, una fase solida y un prospecto de instrucciones.

   imagen1

   00

   00

   Sangre completa

   imagen2

   Almohadilla de muestra

   Almohadilla <x-hlgG-°ro Antlgeno (rFIID) Antlgeno (rCagA) Control (hlgG) Nitrocelulosa

   Almohadilla de absorcion

   Fig. 2B

   imagen3

   <£)

   o

   imagen4

   imagen5

   imagen6

   imagen7

   1.

   Marcador de proteina (KD) 1, Marcador de proteina (KD)

10. 2.

    Pec. FHD (v/, strep.tag) 2. Rec. F)iD (w. strep.togl

11. 3.

    Pee. FHD 3. Pec. FHD

12. 4.

    P.aerugifi WO (ATCC27813) 4. S.tbyphimwium (ATCC 13311)

    S,

    Ktebsietfo wytoca (ATCC 7Q0324) 5, S.puretis (ATCC 25923}

13. 6.

    Candida olbicons (ATCC 90028) 6. 5 epidermidis (ATCC 18228)

14. 7.

    int’ococcui faecalts (ATCC29292) 7, H.influensae (ATCC 49247)

    £

    Strep. GrupoA (ATCC 19615) 3. e.coli (ATCC 25922)

    P.

    Ft. Pylori pot. Ctrl 9. H. Pylori pcs. Ctrl.

    JO. R Pytorf pt>s, Ctrl

    10. W, Pyloripos. Cirt.

    Fig. 8