RS57773B1

RS57773B1 - Postupak za detekciju h. pylori infekcije

Info

Publication number: RS57773B1
Application number: RS20180951A
Authority: RS
Inventors: Markus Gerhard; Behnam Kalali; Luca Formichella; Mohammad Khalife-Gholi
Original assignee: Univ Muenchen Tech
Priority date: 2013-08-13
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2018-12-31
Also published as: EA201690151A1; EP3033623B1; JP6461151B2; ES2683628T3; LT3033623T; SI3033623T1; CY1121282T1; CA2920417C; MX367105B; US10018628B2; EP3033623A2; US20160195528A1; KR20160043984A; EA032330B1; CN105452864B; PL3033623T3; WO2015022075A2; AU2014308141B2; KR102218839B1; HRP20181280T1

Description

Opis pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za detekciju H. pylori infekcije i na kit za primenu u postupku za detekciju H. pylori infekcije.

[0002] Helicobacter pylori (H. pylori), mikroaerofilna, Gram-negativna i spiralna bakterija kolonizuje približno polovinu svetske populacije i smatra se želudačnim patogenom specifičnim za ljude (Michetti, et al., 1999). Većina inficiranih pojedinaca razvija asimptomatski hronični gastritis. Međutim, kod nekih subjekata infekcija izaziva hronični gastritis, peptičku ulceraciju i atrofiju, i igra važnu ulogu u razvoju limfoma limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom, odn. sluzokožom (engl. mucosaassociated lymphoid tissue, skr. MALT), želudačnog adenokarcinoma i primarnog želudačnog ne-Hodžkinovog limfoma (Suganuma, et al., 2001).

[0003] Svetska zdravstvena organizacija je kategorizovala H. pylori kao karcinogen klase I (Goto, et al., 1999), a direktni dokaz karcinogeneze je pokazan na životinjskim modelima (Honda, et al., 1998; T. Watanabe, et al., 1998). Eliminacija H. pylori može sprečiti kancer želuca kod ljudi (Uemura, et al., 2001). Razmatrane su strategije za testiranje & lečenje u populacijama sa visokim rizikom od kancera želuca (Yamaoka, et al., 1998). Međutim, takav pristup sputava nedostatak efikasnih i dostupnih sistema za skrining, a naročito za zemlje sa nižim socioekonomskim statusom. U ovim zemljama su primenljivi samo serološki testovi, od kojih većinu odlikuju slabe performanse ili pak nisu dobro validirani. Za serologiju H. pylori je poznato i opisano nekoliko specifičnih pojedinačnih markera. Ovi faktori se primenjuju u mnogim dijagnostičkim pristupima, ali skoro svi oni imaju značajna ograničenja koja ih čine nepodesnim za dijagnostiku H. pylori. Na primer, protein povezan sa citotoksinom (engl. cytotoxin-associated protein, skr. CagA) je veoma dobro karakterisani H. pylori protein. On je kodiran na cag-PAI (genom povezanim sa citotoksinom ostrva patogenosti, engl. cytotoxin associated gene Pathogenicity Island) i opisan je kao onkogeni protein (Franco, et al., 2005; Murata-Kamiya, et al., 2007). Ovaj protein je takođe veoma imunogeni antigen, zbog čega se često koristi kao marker za serološke testove. CagA pozitivnost se može primeniti kao indikator virulencije H. pylori, jer su pojedinci inficirani sa CagA pozitivnim sojevima pod većim rizikom od razvoja gastroduodenalnih bolesti. Međutim, on nije podesan kao jedini marker, pošto je samo jedna podgrupa sojeva H. pylori CagA pozitivna. Pored toga, CagA pozitivnost nije naznaka aktivne infekcije pošto pacijenti sa eliminisanom H. pylori zadržavaju antitela protiv CagA tokom više godina (Fusconi, et al., 1999). Zbog toga bi uvek trebao da bude kombinovan sa drugim podesnim antigenima u serološkim testovima da bi se pozitivnost potvrdila. Drugi dobro karakterisani H. pylori protein je vakuolizujući citotoksin (VacA). Otkriveno je da on indukuje vakuolizaciju u ćelijama izloženim supernatantima H. pylori ili prečišćenom proteinu (Cover & Blaser, 1992). VacA gen kodira pro-toksin od 140 kDa, gde se aminoterminalna signalna sekvenca i karboksi-terminalni fragment proteolitički odvajaju tokom sekrecije, što dovodi do aktivnog proteina sa molekulskom masom od 88 kDa koji se skuplja u heksamere i obrazuje poru (Montecucco & de Bernard, 2003). Ovaj protein se sastoji od dva različita regiona. Signalna sekvenca (s1a, s1b, s2) i srednji region (m1, m2), oba sa velikim alelnim varijacijama koje izgleda regulišu citotoksičnu aktivnost (Atherton, et al., 1995). Veliki diverzitet VacA čini ovaj protein nepodesnim za serološko testiranje.

[0004] Sledeći dobro karakterisani H. pylori protein, GroEL, pripada porodici molekulskih šaperona, koji su potrebni za adekvatno savijanje mnogih proteina pod stresnim uslovima (Dunn, et al., 1992). U različitim studijama je pokazano da je ovaj protein izuzetno očuvan među različitim sojevima H. pylori i da je njegova seropozitivnost čak veća nego za CagA kod inficiranih pacijenata (Macchia, et al., 1993; Suerbaum, et al., 1994). Takođe, u studijama koje su sproveli aktuelni pronalazači uočeno je da je pozitivni serostatus za GroEL bio češće pronalažen kod nemačkih pacijenata sa kancerom želuca u poređenju sa odgovarajućim kontrolama (neobjavljeni podaci). Takođe je sugerisano da bi antitela protiv GroEL mogla da se zadrže duže posle nestanka bolesti povezane sa H. pylori infekcijom. Shodno tome, GroEL može biti podesan marker aktuelne ili ranije infekcije, i može biti koristan za prevazilaženje potcenjenog rizika od kancera želuca povezanog sa H. pylori zbog klirensa infekcije (Gao et al., 2009).

[0005] WO 2004/094467 A2 opisuje postupak in vitro dijagnoze H. pylori infekcije direktnom detekcijom antigena H. pylori na nivou nukleinske kiseline ili proteina.

[0006] WO 98/27432 A1 se odnosi na serološki postupak detekcije H. pylori infekcije uz korišćenje najmanje jednog tipa antigena uobičajenog za H. pylori i najmanje jednog antigena H. pylori specifičnog za tip I.

[0007] WO 96/40893 A1 opisuje sekvence nukleinske kiseline i aminokiseline koje se odnose na H. pylori za dijagnostičke i terapeutske primene.

[0008] Problem na kome je zasnovan predmetni pronalazak je bio realizacija postupka za detekciju H. pylori infekcije visoke senzitivnosti i/ili visoke specifičnosti. Drugi problem na kome je zasnovan predmetni pronalazak je bio realizacija testa koji, u poređenju sa testovima iz stanja tehnike, dovodi do manje lažno pozitivnih i manje lažno negativnih rezultata, a naročito u pristupima baziranim na populaciji. Sledeći problem na kome je bio zasnovan predmetni pronalazak je realizacija sredstava za izvođenje takvih postupaka i takvih testova, respektivno. Jedan drugi problem na kome je zasnovan predmetni pronalazak je bio realizacija biomarkera za pacijente inficirane sa H. pylori, pri čemu biomarker prvenstveno ne ispoljava nikakvu unakrsnu reaktivnost sa drugim bakterijama i bilo kakvim proteinima, peptidima ili naročito molekulima nukleinskih kiselina koje kodiraju takve proteine i peptide.

[0009] Ovaj i drugi problemi na kojima je zasnovan predmetni pronalazak su rešeni predmetom priloženih nezavisnih zahteva. Poželjni primeri izvođenja mogu se izvesti iz priloženih zavisnih zahteva. Obim predmetnog pronalaska je definisan priloženim patentnim zahtevima.

[0010] Ovde su takođe otkriveni sledeći aspekti.

[0011] Aspekt 1:Postupak za detekciju Helicobacter infekcije, a preciznije H. pylori infekcije kod subjekta, pri čemu postupak sadrži detekciju u uzorku subjekta imune reakcije protiv FliD.

[0012] Aspekt 2: Postupak prema aspektu 1, pri čemu ako se detektuje imuna reakcija protiv FliD u uzorku subjekta, onda subjekt boluje od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, ili je subjekt bolovao od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, u prošlosti.

[0013] Aspekt 3: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 2, pri čemu ako se ne detektuje imuna reakcija protiv FliD u uzorku subjekta, onda subjekt ne boluje od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije.

[0014] Aspekt 4: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 2, pri čemu ako se ne detektuje imuna reakcija protiv FliD u uzorku subjekta, subjekt je bolovao od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, u prošlosti.

[0015] Aspekt 5: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 4, pri čemu je imuna reakcija protiv FliD reakcija antitela protiv FliD, a prvenstveno reakcija anti-FliD antitela.

[0016] Aspekt 6: Postupak prema aspektu 5, pri čemu je imuna reakcija protiv FliD reakcija antitela protiv FliD i pri čemu reakcija antitela protiv FliD sadrži najmanje jedno anti-FliD antitelo izabrano iz grupe koja sadrži IgG antitelo i IgA antitelo.

[0017] Aspekt 7: Postupak prema aspektu 5, pri čemu je imuna reakcija protiv FliD reakcija anti-FliD antitela i pri čemu reakcija anti-FliD antitela sadrži najmanje jedno anti-FliD antitelo izabrano iz grupe koja sadrži IgG antitelo i IgA antitelo.

[0018] Aspekt 8: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 7, pri čemu je subjekt inficiran sa Helicobacterom, a prvenstveno sa H. pylori, koji izražava FliD.

[0019] Aspekt 9: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 8, pri čemu je subjekt različit od subjekta koji je imunosupresiran, a prvenstveno je subjekt različit od subjekta koji je pod imunosupresivnom terapijom.

[0020] Aspekt 10: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 9, pri čemu postupak dalje sadrži detekciju jednog ili više antigena Helicobactera, a prvenstveno H. pylori.

[0021] Aspekt 11: Postupak prema aspektu 10, pri čemu su jedan ili više antigena Helicobactera, a prvenstveno H. pylori, izabrani iz grupe koja sadrži CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 i HtrA.

[0022] Aspekt 12: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 11, pri čemu postupak sadrži reakciju uzorka sa FliD ili njegovim fragmentom.

[0023] Aspekt 13: Postupak prema aspektu 13, pri čemu postupak sadrži reakciju uzorka sa FliD cele dužine.

[0024] Aspekt 14: Postupak prema bilo kom od aspekata 12 do 13, pri čemu imuna reakcija protiv FliD sadrži najmanje jedno humoralno jedinjenje koje može da sadejstvuje sa FliD i celularno jedinjenje koje može da sadejstvuje sa FliD, pri čemu najmanje jedno humoralno jedinjenje i/ili celularno jedinjenje sadejstvuje sa FliD, a prvenstveno najmanje jedno humoralno jedinjenje i/ili celularno jedinjenje koje sadejstvuje sa FliD obrazuje proizvod interakcije sa FliD.

[0025] Aspekt 15: Postupak prema aspektu 14, pri čemu je imuna reakcija protiv FliD reakcija antitela protiv FliD i pri čemu reakcija antitela protiv FliD obrazuje proizvod interakcije sa FliD.

[0026] Aspekt 16: Postupak prema aspektu 14, pri čemu je imuna reakcija protiv FliD reakcija anti-FliD antitela i pri čemu anti-FliD reakcija obrazuje proizvod interakcije sa FliD.

[0027] Aspekt 17: Postupak prema aspektu 14, pri čemu imuna reakcija protiv FliD sadrži najmanje jedno anti-FliD antitelo i pri čemu anti-FliD antitelo obrazuje proizvod interakcije sa FliD.

[0028] Aspekt 18: Postupak prema bilo kom od aspekata 14 do 17, pri čemu se detektuje proizvod interakcije.

[0029] Aspekt 19: Postupak prema aspektu 18, pri čemu se proizvod interakcije direktno detektuje.

[0030] Aspekt 20: Postupak prema aspektu 18, pri čemu se proizvod interakcije indirektno detektuje.

[0031] Aspekt 21: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 20, pri čemu se detekcija izvodi pomoću ELISE ili linijskog imunotesta.

[0032] Aspekt 22: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 20, pri čemu se detekcija izvodi pomoću testa sa bočnim protokom.

[0033] Aspekt 23: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 22, pri čemu je uzorak izabran iz grupe koja sadrži serum, plazmu i celu krv.

[0034] Aspekt 24: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 23, pri čemu je subjekt ljudsko biće i Helicobacter infekcija je H. pylori infekcija.

[0035] Aspekt 25: Postupak prema aspektu 24, pri čemu je FliD koji reaguje sa uzorkom FliD iz H. pylori.

[0036] Aspekt 26: Postupak prema aspektu 25, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1.

[0037] Aspekt 27: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 23, pri čemu je subjekt svinja i Helicobacter infekcija je Helicobacter suis infekcija.

[0038] Aspekt 28: Postupak prema aspektu 27, pri čemu je FliD koji reaguje sa uzorkom FliD iz H. suis.

[0039] Aspekt 29: Postupak prema aspektu 28, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 3.

[0040] Aspekt 30: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 23, pri čemu je subjekt mačka i Helicobacter infekcija je Helicobacter felis infekcija. Prvenstveno je mačka izabrana iz grupe koja sadrži domaću mačku, divlju mačku, malu mačku i veliku mačku.

[0041] Aspekt 31: Postupak prema aspektu 30, pri čemu je FliD koji reaguje sa uzorkom FliD iz H. felis.

[0042] Aspekt 32: Postupak prema aspektu 31, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5.

[0043] Aspekt 33: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 32, pri čemu je senzitivnost postupka za detekciju Helicobacter infekcije, a prvenstveno H. pylori infekcije kod čoveka, veća od 90 % i/ili 97% ili je manja.

[0044] Aspekt 34: Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 33, pri čemu je specifičnost postupka za detekciju Helicobacter infekcije, a prvenstveno H. pylori infekcija kod čoveka, veća od 90 % i/ili 99% ili je manja.

[0045] Aspekt 35: Primena imune reakcije protiv FliD kod subjekta kao biomarkera.

[0046] Aspekt 36: Primena prema aspektu 35, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom.

[0047] Aspekt 37: Primena prema bilo kom od aspekata 35 do 36, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom, pri čemu je subjekt čovek i Helicobacter je H. pylori.

[0048] Aspekt 38: Primena prema bilo kom od aspekata 35 do 36, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom, pri čemu je subjekt svinja i Helicobacter je H. suis.

[0049] Aspekt 39: Primena prema bilo kom od aspekata 35 do 36, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom, pri čemu je subjekt mačka i Helicobacter je H.felis.

[0050] Aspekt 40: Primena prema bilo kom od aspekata 35 do 39, pri čemu biomarker predstavlja prediktivni biomarker.

[0051] Aspekt 41: Primena prema bilo kom od aspekata 35 do 40, pri čemu imuna reakcija predstavlja reakciju antitela protiv FliD.

[0052] Aspekt 42: Primena prema bilo kom od aspekata 35 do 41, pri čemu imuna reakcija predstavlja reakciju anti-FliD antitela protiv FliD.

[0053] Aspekt 43: Kit koji sadrži FliD ili njegov fragment i najmanje jedan drugi konstituent.

[0054] Aspekt 44: Kit prema aspektu 43, pri čemu je najmanje jedan drugi konstituent izabran iz grupe koja sadrži pufer, čvrstu fazu i uputstvo za upotrebu.

[0055] Aspekt 45: Kit prema bilo kom od aspekata 43 do 44, pri čemu FliD predstavlja FliD cele dužine.

[0056] Aspekt 46: Kit prema bilo kom od aspekata 43 do 44, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu i pri čemu je aminokiselinska sekvenca izabrana iz grupe koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1, aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 3 i aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5.

[0057] Aspekt 47: Kit prema bilo kom od aspekata 43 do 46, pri čemu je kit podesan za primenu ili je namenjen za primenu u postupku za detekciju Helicobacter infekcije kod subjekta.

[0058] Aspekt 48: Kit prema aspektu 47, pri čemu je kit podesan za primenu ili je namenjen za primenu u postupku prema bilo kom od aspekata 1 do 34.

[0059] Aspekt 49: Postupak za detekciju Helicobacter infekcije, a još poželjnije H. pylori infekcije kod subjekta, pri čemu postupak sadrži detekciju FliD u uzorku subjekta.

[0060] Aspekt 50: Postupak prema aspektu 49, pri čemu ako se detektuje FliD u uzorku subjekta, onda subjekt boluje od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, ili je subjekt bolovao od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, u prošlosti.

[0061] Aspekt 51: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 50, pri čemu ako FliD nije detektovan u uzorku subjekta, onda subjekt ne boluje od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije.

[0062] Aspekt 52: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 51, pri čemu ako FliD nije detektovan u uzorku subjekta, onda je subjekt bolovao od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, u prošlosti.

[0063] Aspekt 53: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 52, pri čemu je subjekt inficiran sa Helicobacterom, a prvenstveno sa H. pylori, koji izražava FliD.

[0064] Aspekt 54: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 53, pri čemu postupak dalje sadrži detekciju jednog ili više antigena Helicobactera, a prvenstveno H. pylori.

[0065] Aspekt 55: Postupak prema aspektu 54, pri čemu su jedan ili više antigena Helicobactera, a prvenstveno H. pylori, izabrani iz grupe koja sadrži CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 i HtrA.

[0066] Aspekt 56: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 55, pri čemu FliD predstavlja FliD cele dužine ili njegov fragment.

[0067] Aspekt 57: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 56, pri čemu postupak sadrži reakciju uzorka sa sadejstvujućim agensom, pri čemu sadejstvujući agens sadejstvuje sa FliD ili njegovim fragmentom, a prvenstveno sadejstvujući agens specifično sadejstvuje sa FliD ili njegovim fragmentom.

[0068] Aspekt 58: Postupak prema aspektu 57, pri čemu sadejstvujući agens sadejstvuje sa FliD cele dužine ili fragmentom FliD.

[0069] Aspekt 59: Postupak prema bilo kom od aspekata 57 do 58, pri čemu je sadejstvujući agens izabran iz grupe koja sadrži antitelo, aptamer i špiglmer.

[0070] Aspekt 60: Postupak prema aspektu 59, pri čemu je sadejstvujući agens antitelo, pri čemu je antitelo monoklonsko antitelo ili poliklonsko antitelo.

[0071] Aspekt 61: Postupak prema bilo kom od aspekata 56 do 60, pri čemu sadejstvujući agens i FliD koji su prisutni u uzorku formiraju proizvod interakcije.

[0072] Aspekt 62: Postupak prema aspektu 61, pri čemu se detektuje proizvod interakcije.

[0073] Aspekt 63: Postupak prema aspektu 62, pri čemu se proizvod interakcije detektuje direktno.

[0074] Aspekt 64: Postupak prema aspektu 62, pri čemu se proizvod interakcije detektuje indirektno.

[0075] Aspekt 65: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 64, pri čemu se detekcija izvodi pomoću ELISE ili linijskog imunotesta.

[0076] Aspekt 66: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 63, pri čemu se detekcija izvodi pomoću testa sa bočnim protokom.

[0077] Aspekt 67: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 56, pri čemu se FliD detektuje pomoću masene spektroskopije.

[0078] Aspekt 68: Postupak prema aspektu 67, pri čemu je masena spektroskopija izabrana iz grupe koja sadrži LC-ESI-MS/MS, MALDI-MS, tandem MS, TOF/TOF, TOF-MS, TOF-MS/MS, tripl kvadrupolnu MS, i tripl kvadrupolnu MS/MS.

[0079] Aspekt 69: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 68, pri čemu je subjekt ljudsko biće i Helicobacter infekcija je H. pylori infekcija.

[0080] Aspekt 70: Postupak prema aspektu 69, pri čemu je FliD iz H. pylori.

[0081] Aspekt 71: Postupak prema aspektu 70, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1.

[0082] Aspekt 72: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 68, pri čemu je subjekt svinja i Helicobacter infekcija je Helicobacter suis infekcija.

[0083] Aspekt 73: Postupak prema aspektu 72, pri čemu je FliD iz H. suis.

[0084] Aspekt 74: Postupak prema aspektu 73, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 3.

[0085] Aspekt 75: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 68, pri čemu je subjekt mačka i Helicobacter infekcija je Helicobacter felis infekcija.

[0086] Aspekt 76: Postupak prema aspektu 75, pri čemu je FliD od H. felis.

[0087] Aspekt 77: Postupak prema aspektu 76, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5.

[0088] Aspekt 78: Postupak prema bilo kom od aspekata 49 do 77, pri čemu je uzorak izabran iz grupe koja sadrži stolicu, serum, plazmu i celu krv, a prvenstveno je uzorak stolica.

[0089] Aspekt 79: Primena FliD kao biomarkera.

[0090] Aspekt 80: Primena prema aspektu 79, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom.

[0091] Aspekt 81: Primena prema bilo kom od aspekata 79 do 80, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom, pri čemu je subjekt čovek i Helicobacter je H. pylori.

[0092] Aspekt 82: Primena prema aspektu 81, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1.

[0093] Aspekt 83: Primena prema bilo kom od aspekata 80 do 81, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom, pri čemu je subjekt svinja i Helicobacter je H. suis.

[0094] Aspekt 84: Primena prema aspektu 83, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 3.

[0095] Aspekt 85: Primena prema bilo kom od aspekata 80 do 81, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom, pri čemu je subjekt mačka i Helicobacter je H.felis. Aspekt 86: Primena prema aspektu 85, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5.

[0096] Aspekt 87: Primena prema bilo kom od aspekata 79 do 86, pri čemu biomarker predstavlja prediktivni biomarker.

[0097] Aspekt 88: Kit koji sadrži sadejstvujući agens koji može da sadejstvuje sa FliD ili njegovim fragmentom i najmanje jedan drugi konstituent.

[0098] Aspekt 89: Kit prema aspektu 88, pri čemu je najmanje jedan drugi konstituent izabran iz grupe koja sadrži pufer, čvrstu fazu i uputstvo za upotrebu.

[0099] Aspekt 90: Kit prema aspektu 89, pri čemu sadejstvujući agens može da specifično sadejstvuje sa FliD ili njegovim fragmentom.

[0100] Aspekt 91: Kit prema bilo kom od aspekata 88 do 90, pri čemu je sadejstvujući agens izabran iz grupe koja sadrži antitelo, aptamer i špiglmer.

[0101] Aspekt 92: Kit prema bilo kom od aspekata 88 do 91, pri čemu je kit podesan za primenu ili je namenjen za primenu u postupku za detekciju Helicobacter infekcije kod subjekta.

[0102] Aspekt 93: Kit prema aspektu 92, pri čemu je kit podesan za primenu ili je namenjen za primenu u postupku prema bilo kom od aspekata 49 do 78.

[0103] Aspekt 94: Postupak za detekciju Helicobacter infekcije, a još poželjnije H. pylori infekcije kod subjekta, pri čemu postupak sadrži detekciju nukleinske kiseline koja kodira FliD u uzorku subjekta.

[0104] Aspekt 95: Postupak prema aspektu 94, pri čemu je nukleinska kiselina genomska nukleinska kiselina koja kodira FliD, a prvenstveno DNK.

[0105] Aspekt 96: Postupak prema aspektu 94, pri čemu je nukleinska kiselina iRNK koja kodira FliD.

[0106] Aspekt 97: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 96, pri čemu ako se nukleinska kiselina koja kodira FliD detektuje u uzorku subjekta, onda subjekt boluje od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, ili je subjekt bolovao od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, u prošlosti.

[0107] Aspekt 98: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 97, pri čemu ako se nukleinska kiselina koja kodira FliD ne detektuje u uzorku subjekta, onda subjekt ne boluje od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije.

[0108] Aspekt 99: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 98, pri čemu ako se nukleinska kiselina koja kodira FliD ne detektuje u uzorku subjekta, onda je subjekt bolovao od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, u prošlosti.

[0109] Aspekt 100: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 99, pri čemu je subjekt inficiran sa Helicobacterom, a prvenstveno sa H. pylori, koji izražava FliD.

[0110] Aspekt 101: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 100, pri čemu postupak dalje sadrži detekciju jednog ili više antigena Helicobactera, a prvenstveno H. pylori, i/ili nukleinske kiseline koja kodira jedan ili više antigena Helicobactera, a prvenstveno H. pylori.

[0111] Aspekt 102: Postupak prema aspektu 101, pri čemu su jedan ili više antigena Helicobactera, a prvenstveno H. pylori, izabrani iz grupe koja sadrži CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 i HtrA.

[0112] Aspekt 103: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 102, pri čemu FliD predstavlja FliD cele dužine ili njegov fragment.

[0113] Aspekt 104: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 103, pri čemu postupak sadrži reakciju uzorka sa sadejstvujućim agensom, pri čemu sadejstvujući agens sadejstvuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira FliD, a prvenstveno sadejstvujući agens specifično sadejstvuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira FliD.

[0114] Aspekt 105: Postupak prema aspektu 104, pri čemu sadejstvujući agens sadejstvuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira FliD cele dužine ili fragment FilD.

[0115] Aspekt 106: Postupak prema bilo kom od aspekata 104 do 105, pri čemu je sadejstvujući agens izabran iz grupe koja sadrži prajmer i probu.

[0116] Aspekt 107: Postupak prema bilo kom od aspekata 104 do 106, pri čemu sadejstvujući agens i nukleinska kiselina koja kodira FliD koji su prisutni u uzorku formiraju proizvod interakcije.

[0117] Aspekt 108: Postupak prema aspektu 107, pri čemu se detektuje proizvod interakcije.

[0118] Aspekt 109: Postupak prema aspektu 108, pri čemu se proizvod interakcije detektuje direktno.

[0119] Aspekt 110: Postupak prema aspektu 108, pri čemu se proizvod interakcije detektuje indirektno.

[0120] Aspekt 111: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 103, pri čemu se molekul nukleinske kiseline koji kodira FliD detektuje pomoću masene spektroskopije, PCR ili hibridizacionog testa.

[0121] Aspekt 112: Postupak prema aspektu 111, pri čemu je masena spektroskopija izabrana iz grupe koja sadrži LC-ESI-MS/MS, MALDI-MS, tandem MS, TOF/TOF, TOF-MS, TOF-MS/MS, tripl kvadrupolnu MS, i tripl kvadrupolnu MS/MS.

[0122] Aspekt 113: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 112, pri čemu je subjekt ljudsko biće i Helicobacter infekcija je H. pylori infekcija.

[0123] Aspekt 114: Postupak prema aspektu 113, pri čemu je nukleinska kiselina koja kodira FliD iz H. pylori.

[0124] Aspekt 115: Postupak prema aspektu 114, pri čemu nukleinska kiselina koja kodira FliD sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 2.

[0125] Aspekt 116: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 112, pri čemu je subjekt svinja i Helicobacter infekcija je Helicobacter suis infekcija.

[0126] Aspekt 117: Postupak prema aspektu 116, pri čemu je nukleinska kiselina koja kodira FliD iz H. suis.

[0127] Aspekt 118: Postupak prema aspektu 117, pri čemu nukleinska kiselina koja kodira FliD sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 4.

[0128] Aspekt 119: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 112, pri čemu je subjekt mačka i Helicobacter infekcija je Helicobacter felis infekcija.

[0129] Aspekt 120: Postupak prema aspektu 119, pri čemu je nukleinska kiselina koja kodira FliD iz H. felis.

[0130] Aspekt 121: Postupak prema aspektu 120, pri čemu FliD sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 6.

[0131] Aspekt 122: Postupak prema bilo kom od aspekata 94 do 121, pri čemu je uzorak izabran iz grupe koja sadrži stolicu, serum, plazmu i celu krv, a prvenstveno je uzorak stolica.

[0132] Aspekt 123: Primena nukleinske kiseline koja kodira FliD kao biomarkera.

[0133] Aspekt 124: Primena prema aspektu 123, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom.

[0134] Aspekt 125: Primena prema bilo kom od aspekata 123 do 124, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom, pri čemu je subjekt čovek i Helicobacter je H. pylori.

[0135] Aspekt 126: Primena prema aspektu 125, pri čemu nukleinska kiselina koja kodira FliD sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 2.

[0136] Aspekt 127: Primena prema bilo kom od aspekata 124 do 125, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom, pri čemu je subjekt svinja i Helicobacter je H. suis.

[0137] Aspekt 128: Primena prema aspektu 127, pri čemu nukleinska kiselina koja kodira FliD sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 4.

[0138] Aspekt 129: Primena prema bilo kom od aspekata 124 do 125, pri čemu biomarker predstavlja biomarker za infekciju subjekta sa Helicobacterom, pri čemu je subjekt mačka i Helicobacter je H. felis.

[0139] Aspekt 130: Primena prema aspektu 129, pri čemu nukleinska kiselina koja kodira FliD sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 6.

[0140] Aspekt 131: Primena prema bilo kom od aspekata 123 do 130, pri čemu biomarker predstavlja prediktivni biomarker.

[0141] Aspekt 132: Kit koji sadrži sadejstvujući agens koji može da sadejstvuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira FliD ili njegov fragment i najmanje jedan drugi konstituent.

[0142] Aspekt 133: Kit prema aspektu 132, pri čemu je najmanje jedan drugi konstituent izabran iz grupe koja sadrži pufer, čvrstu fazu i uputstvo za upotrebu.

[0143] Aspekt 134: Kit prema aspektu 133, pri čemu sadejstvujući agens može da specifično sadejstvuje sa FliD ili njegovim fragmentom.

[0144] Aspekt 135: Kit prema bilo kom od aspekata 132 do 134, pri čemu je sadejstvujući agens izabran iz grupe koja sadrži prajmer i probu.

[0145] Aspekt 136: Kit prema bilo kom od aspekata 132 do 135, pri čemu je kit podesan za primenu ili je namenjen za primenu u postupku za detekciju Helicobacter infekcije kod subjekta.

[0146] Aspekt 137: Kit prema aspektu 136, pri čemu je kit podesan za primenu ili je namenjen za primenu u postupku prema bilo kom od aspekata 94 do 122.

[0147] Aktuelni pronalazači su kao iznenađujuće otkrili da je FliD, koji je protein koji je takođe poznat kao "homolog proteina 2 povezanog sa kukom", marker za infekciju sa Helicobacterom, a naročito sa H. pylori. Aktuelni pronalazači su takođe kao iznenađujuće otkrili da se FliD i/ili imuna reakcija protiv FliD prvenstveno mogu primeniti kao marker u serološkoj analizi i, shodno tome, u bilo kom postupku i testu, respektivno koji je baziran na uzorku subjekta koji treba da bude testiran na Helicobacter, a naročito sa H. pylori infekciju ili se upotrebljava na njemu, pri čemu je uzorak prvenstveno izabran iz grupe koja sadrži uzorak seruma, uzorak plazme, uzorak krvi i uzorak stolice. Konačno, aktuelni pronalazači su kao iznenađujuće otkrili da se infekcija subjekta sa Helicobacter, a naročito H. pylori može detektovati na osnovu FliD i/ili nukleinske kiseline koja kodira FliD, pri čemu se FliD i/ili nukleinska kiselina koja kodira FliD upotrebljavaju kao jedini marker. Drugim rečima, infekcija subjekta sa Helicobacterom, a naročito sa H. pylori se može dijagnostikovati samo na bazi i, respektivno, na osnovu FliD i/ili nukleinske kiseline koja ga kodira. Isto važi za imunu reakciju protiv FliD razvijenu od strane subjekta inficiranog sa Helicobacterom, a naročito sa H. pylori: infekcija subjekta sa Helicobacterom, a naročito sa H. pylori se može dijagnostikovati samo na bazi i, respektivno, na osnovu imune reakcije protiv FliD, pri čemu je imunu reakciju protiv FliD generisao subjekt. Sledeća prednost predmetnog pronalaska je ta što se imuna reakcija protiv FliD može odrediti u uzorku koji se obično dobija neinvazivnim postupcima, što je u suprotnosti sa mnogim postupcima detekcije iz stanja tehnike, gde je uzorak morao da bude uzet invazivnim postupkom, kao što je biopsija.

[0148] Stručnjaku iz odgovarajuće oblasti će biti jasno da predmetno otkrivanje u principu može biti primenjeno na detekciju bilo koje infekcije subjekta sa Helicobacterom sve dok kao takva kodira Helicobacter i/ili izražava FliD. Stručnjaku iz odgovarajuće oblasti će takođe biti jasno da će obično specifične vrste subjekata, kao što je, npr. čovek, biti inficirane specifičnim vrstama Helicobactera. U slučaju da je subjekt čovek, vrsta Helicobactera je H. pylori. U slučaju da je subjekt svinja, vrsta Helicobactera je H. suis. U slučaju da je subjekt mačka, uključujući velike mačke, vrsta Helicobactera je H. felis. Aktuelni opis se posebno odnosi na detekciju H. pylori kod čoveka. Takav poziv na H. pylori i čoveka, međutim, vrši se isključivo iz razloga jasnoće i datih gore, a bilo koji primer izvođenja koji se odnosi na H. pylori i čoveka, isto tako važi za bilo koji drugi Helicobacter koji izražava FliD, ili njegov homolog, i bilo koju drugu vrstu subjekta. Prvenstveno je druga vrsta subjekta bilo koji sisar koji boluje ili može bolovati od infekcije sa Helicobacterom i vrste homologe sa H. pylori, pri čemu takav Helicobacter i vrste homologe sa H. pylori izražavaju FliD ili njegov homolog.

[0149] Stručnjaku iz odgovarajuće oblasti je takođe razumljivo da za svaku vrstu Helicobactera obično postoje različiti sojevi. Aminokiselinska sekvenca i sekvenca nukleinske kiseline FliD takvih sojeva vrsta Helicobactera obično pokazuju veoma visoki identitet u pogledu aminokiselinske sekvence. Još preciznije, bioinformatička analiza je otkrila da je FliD aminokiselinska sekvenca prisutna i izuzetno očuvana u svim (>200) H. pylori sojevima. FliD ima homologiju od 97% u oko 200 H. pylori sojeva koji su bili analizirani od strane aktuelnih pronalazača. Interesantno, izuzev jedne druge vrste Helicobactera koja nije pylori sa parcijalnom homologijom, nema nijednog drugog poznatog organizma sa značajnom genomskom ili proteomskom homologijom sa FliD H. pylori. Poređenje FliD proteina H. pylori pokazuje izuzetnu očuvanost FliD u vrstama Helicobactera, pri čemu je on različit od većine drugih bakterija, kao i eukariotskih organizama. Ova analiza zajedno sa predviđanjem visoke antigenosti ovog proteina obezbeđuje osnovu za faktičko nepostojanje unakrsne reaktivnosti.

[0150] Pored toga, FliD izražavaju praktično svi sojevi koji inficiraju ili su sposobni da inficiraju subjekta. Ovo objašnjava zašto je FliD marker za praktično svaki soj H. pylori i, respektivno, svaki soj Helicobacter vrste koji inficira odgovarajuću vrstu subjekta. Drugim rečima, skoro svi H. pylori pozitivni pacijenti ispoljavaju imunu reakciju protiv FliD.

[0151] H. pylori FliD protein je esencijalni element u sklopu funkcionalnog biča, a FliD mutantni soj je kompletno nepokretan. Flagelin igra centralnu ulogu u bakterijskoj pokretljivosti i neophodan je za kolonizaciju i istrajnost H. pylori infekcije (Eaton, et al., 1996). Pokretljivost H. pylori je virulentni faktor u patogenezi povreda želudačne sluzokože (S. Watanabe, et al., 1997). H. pylori FliD gen kodira protein od 76-kDa (Kim, et al., 1999). FliD operon H. pylori sastoji se od FlaG, FliD, i FliS gena, po navedenom redosledu, pod kontrolom promotera zavisnog od sigma (28). Unos FliD od H. pylori se može naći u bazama podataka UniProtKB/Swiss-Prot kao P96786.4 obezbeđujući, između ostalog, njenu aminokiselinsku sekvencu i mutacije FliD koje su pronađene u različitim sojevima H. pylori.

[0152] Postupak prema pronalasku za detekciju H. pylori infekcije kod subjekta takođe može biti karakterisan tako što sadrži korak određivanja da li uzorak subjekta sadrži imunu reakciju protiv FliD. Ako uzorak subjekta sadrži reakciju antitela protiv FliD, onda subjekt boluje od H. pylori infekcije ili je bolovao od H. pylori infekcije u prošlosti.

[0153] Postupak prema pronalasku za detekciju H. pylori infekcije kod subjekta se takođe može primeniti na subjekta za koga je nepoznato da boluje od H. pylori infekcije, ili da li je takav subjekt imao H. pylori infekciju. Shodno tome, predmetno otkrivanje se dalje odnosi na postupke za određivanje da li subjekt boluje od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije, ili je bolovao od Helicobacter infekcije, a prvenstveno od H. pylori infekcije u prošlosti.

[0154] Kada se ovde prvenstveno koristi, izraz "u prošlosti" se odnosi na vremenski trenutak pre vremenskog trenutka u kome je uzorak bio uzet ili se uzima od subjekta, pri čemu je uzorak takav uzorak koji se upotrebljava u vezi sa različitim aspektima i/ili različitim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, a naročito u detekciji H. pylori i/ili H. pylori infekcije kod subjekta i u dijagnostici H. pylori i/ili H. pylori infekcije kod subjekta.

[0155] U vezi različitih aspekata predmetnog pronalaska, a naročito postupka prema pronalasku, stručnjaku iz odgovarajuće oblasti će biti očigledno da imuna reakcija i reakcija anti-FliD antitela generisana od strane subjekta inficiranog sa H.pylori traje tokom više godina. Prevalencija takve reakcije anti-FliD antitela je obično oko 50 % posle 1 do 5 godina posle eliminacije H. pylori, oko 50 % posle 6 do 10 godina posle eliminacije H. pylori, oko 25 % posle 11 do 15 godina posle eliminacije H. pylori i oko 25 % posle 16 do 20 godina posle eliminacije H. pylori. U svetlosti ovoga, subjekt koji je dijagnostikovan kao H. pylori pozitivan može biti subjekt koji trenutno boluje od H. pylori infekcije u vreme kada je uzorak bio uzet, ili subjekt koji je imao H. pylori infekciju u prošlosti sa anti-FliD imunom reakcijom koja još uvek preovlađuje.

[0156] Do mere do koje je imuna reakcija protiv FliD reakcija antitela protiv FliD, a još preciznije reakcija anti-FliD antitela, anti-FliD antitela su obično IgG ili IgA. Ova klasa specifičnosti se može upotrebiti u detekciji anti-FliD antitela korišćenjem anti-IgG i/ili anti-IgA antitela, tako što se antitela detektuju ili hvataju. U primeru izvođenja gde je subjekt čovek, detektovana antitela i uhvaćena antitela su prvenstveno antihumani IgG i/ili anti-humani IgA.

[0157] U vezi različitih aspekata predmetnog pronalaska, a naročito postupka prema pronalasku, postupci mogu, u jednom primeru izvođenja, dodatno sadržati detekciju jednog ili više Helicobacter antigena ili nukleinske kiseline koja kodira takve Helicobacter antigene. U jednom primeru izvođenja, takvi Helicobacter antigeni su H. pylori antigeni. U sledećem primeru izvođenja, antigeni su izabrani iz grupe koja sadrži CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 i HtrA, koji su svi poznati iz odgovarajuće oblasti i opisani su, na primer, u Yakoob J et al. (Yakoob J et al., Gut and Liver, tom 4, br.3, septembar 2010, str.345-350), Sabarth N et al. (Sabarth N et al., Infection and Immunity, nov.2002, str.6499-6503), Gao L. et al. (Gao L. et al., Cancer Res 2009; 69: (15).1. avgust 2009, str.6164 - 6170), Yamaoka Y (Yamaoka Y, J Med Microbiol.2008 maj; 57 (Pt5): 545-553), Miehlke S et al. (Miehlke S et al., Int. J. Cancer: 87, 322-327 (2000)), i Atherton JC et al. (Atherton JC et al., Current Microbiology, tom 39(1999), str.211-218). Aminokiselinska sekvenca CagA je ovde opisana kao SEQ ID NO: 7, nukleotidna sekvenca CagA je ovde opisana kao SEQ ID NO:8, aminokiselinska sekvenca VacA je ovde opisana kao SEQ ID NO: 9, nukleotidna sekvenca VacA je ovde opisana kao SEQ ID NO:10, aminokiselinska sekvenca GroEL je ovde opisana kao SEQ ID NO: 11, nukleotidna sekvenca GroEL je ovde opisana kao SEQ ID NO:12, aminokiselinska sekvenca Hp0231 je ovde opisana kao SEQ ID NO:13, nukleotidna sekvenca Hp0231 je ovde opisana kao SEQ ID NO:14, aminokiselinska sekvenca JHp0940 je ovde opisana kao SEQ ID NO: 15, nukleotidna sekvenca JHp0940 je ovde opisana kao SEQ ID NO: 16, aminokiselinska sekvenca HtrA je ovde opisana kao SEQ ID NO:17, i nukleotidna sekvenca HtrA je ovde opisana kao SEQ ID NO:18.

[0158] U jednom primeru izvođenja postupka prema pronalasku gde se H. pylori infekcija kod subjekta detektuje detekcijom u uzorku subjekta imune reakcije protiv FliD, a naročito anti-FliD antitela u uzorku, reaguju uzorak i FliD. U jednom primeru izvođenja, uzorak se dodaje FliD. U takvom postupku FliD se prvenstveno vezuje za čvrstu fazu. Takođe je u okviru predmetnog pronalaska to da se FliD dodaje uzorku. Prvenstveno se FliD dodaje kao rastvor, a još poželjnije kao vodeni rastvor, kao što je puferovani rastvor. U poželjnom primeru izvođenja, FliD reaguje sa uzorkom sa FliD koji je vezan za čvrstu fazu. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti će potvrditi da FliD i uzorak reaguju pod uslovima takvim da, ako uzorak naročito sadrži imunu reakciju protiv FliD i anti-FliD antitela, onda se formira proizvod interakcije.

Prvenstveno je takav proizvod interakcije kompleks FliD i anti-FliD antitela sadržanog u uzorku.

[0159] Tako formiran proizvod interakcije može biti detektovan bilo direktno ili indirektno. U primeru izvođenja gde se proizvod interakcije detektuje direktno, FliD koji reaguje sa uzorkom sadrži labelu koja omogućava detekciju FliD, a naročito kada sadejstvuje sa anti-FliD antitelom. Labele ovog tipa su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti i obuhvataju radiolabele, fluorescentne labele, boje, nanočestice, kao što je zlato, i enzime, kao što je ren peroksidaza. Druge labele su one koje su ovde opisane u vezi sa obeležavanjem antitela. U primeru izvođenja gde se proizvod interakcije detektuje indirektno, proizvod interakcije zatim reaguje sa agensom za detekciju, pri čemu se agens za detekciju specifično vezuje za proizvod interakcije. Takav agens za detekciju može biti antitelo, a prvenstveno anti-IgG ili anti-IgA antitelo. Sam agens za detekciju obično sadrži labelu koja omogućava detekciju agensa za detekciju, a prvenstveno kada se agens za detekciju specifično vezuje za proizvod interakcije.

[0160] U poželjnim primerima izvođenja postupka prema pronalasku proizvod interakcije se detektuje pomoću enzimski povezanog imunosorbentnog testa (ELISA) ili radioimunog testa koji su poznati stručnjaku iz odgovarajuće oblasti (Lottspeich F. i Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998).

ELISA može biti indirektna ELISA, sendvič ELISA, kompetitivna ELISA ili nekompetitivna ELISA.

[0161] U varijantnom poželjnom primeru izvođenja postupka prema pronalasku proizvod interakcije se detektuje pomoću testa sa bočnim protokom, koji je takođe poznat kao imunohromatografski testovi sa bočnim protokom, a koji su opisani, na primer, u US 6,485,982. Takav test sa bočnim protokom se u jednom primeru izvođenja upotrebljava u bilo kom postupku prema pronalasku gde je anti-FliD antitelo i, respektivno, anti-FliD antitela se detektuju u uzorku od subjekta. Test sa bočnim protokom će biti opisan za ilustrativne svrhe kao primer izvođenja postupka prema pronalasku gde se detektuju anti-FliD antitela u uzorku od subjekta, pri čemu je subjekt čovek.

[0162] Tehnologija je bazirana na nizu kapilarnih slojeva, kao što su komadi poroznog papira ili polimer. Svaka od ovih komponenti ima sposobnost da transportuje fluid, npr. serum, plazmu ili krv, taloženjem. Sloj uzorka deluje kao sunđer i drži višak fluida uzorka. Kada je sloj uzorka zasićen, onda se fluid pomera do sloja konjugata u kome su locirane nanočestice, a prvenstveno nanočestice zlata, konjugovane sa anti-humanim antitelom. Kada fluid uzorka migrira u ovaj element, on rastvara čestice i u jednoj kombinovanoj reakciji, smeša uzorka i konjugata teku kroz poroznu strukturu. Na ovaj način se antitelo imobilizovano na površini nanočestica vezuje za humani IgG koji postoji u uzorku dok migrira dalje kroz sledeću kapilarnu matricu. Na ovom elementu, koji je obično hidrofobna membrana, kao što je nitroceluloza, antigeni, kao i kontrola (npr. humani IgG) su imobilizovani kao testirane ili kontrolne linije. Kada humani IgG koji je sada vezan za čestice konjugata dostigne ove linije, antigen imobilizovan na membrani će specifično zadržavati kompleks antitela. Posle nekog vremena, sve više čestica će se akumulirati na mestu antigena i pojaviće se obojena linija koja se može lako detektovati. U jednom primeru izvođenja postoji samo jedan antigen, odnosno FliD. U sledećem primeru izvođenja pored FliD, postoji jedan ili više antigena.

Prvenstveno su jedan ili više antigena izabrani iz grupe koja sadrži CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 i HtrA.

[0163] U sledećoj varijanti poželjnog primera izvođenja postupka prema pronalasku proizvod interakcije se detektuje pomoću linijskog testa. Takav linijski test obično sadrži mnoštvo traka. Na pomenutim trakama se visoko prečišćeni rekombinantni FliD fiksira na trake. Takve trake su prvenstveno napravljene od nitrocelulozne membrane. Trake se inkubiraju sa uzorkom, a prvenstveno sa razređenim uzorkom seruma ili plazme, a anti-FliD antitela se vezuju za FliD, u slučaju da je FliD imobilizovan radi detekcije anti-FliD antitela u uzorku, na testnim trakama. U drugom koraku, trake se inkubiraju sa anti-humanim imunoglobulinskim antitelima (IgG i IgA), koja su kuplovana sa ren peroksidazom. Specifično vezana antitela se detektuju sa reakcijom bojenja katalizovanom peroksidazom. Ako se odvija reakcija antigenantitelo kojom se formira proizvod interakcije, pojaviće se tamna linija na traci na odgovarajućem mestu. U jednom primeru izvođenja kontrolne linije na gornjem kraju testnih traka su:

a) Reakciona kontrolna linija ispod broja trake, koja mora da pokaže reakciju za svaki uzorak.

b) Konjugatne kontrolne linije (IgG, IgA) se upotrebljavaju za proveru klase detektovanog antitela. Ako se, na primer, upotrebljava testna traka za detekciju IgG antitela, IgG konjugat će pokazati jasnu liniju.

c) "Odsecajuća kontrola ": intenzitet ove linije omogućava ocenjivanje/određivanje reaktivnosti linija pojedinačnih antigena.

[0164] Test koji ima ovu vrstu dizajna, sa antigenima različitim od FliD, u suštini se može nabaviti od firme Mikrogen GmbH, Nojrid, Nemačka, kao "recomLine Helicobacter IgG" ili "recomLine Helicobacter IgA" (Ref: http://www.mikrogen.de/uploads/tx_oemikrogentables/dokumente/GARLHP001EN.p df).

[0165] Ovde je takođe otkriven postupak za detekciju Helicobacter infekcije, a još poželjnije H. pylori infekcije kod subjekta, pri čemu postupak sadrži detekciju u uzorku subjekta FliD, a FliD se detektuje pomoću masene spektrometrije, koja je opisana npr. u Lottspeich F. i Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998.

[0166] U postupcima gde se FliD detektuje u uzorku subjekta, sadejstvujući agens koji formira zajedno sa FliD proizvod interakcije je prvenstveno onaj koji je izabran iz grupe koja sadrži antitelo, aptamer i špiglmer. Generisanje takvog sadejstvujućeg agensa se nalazi u okviru sposobnosti stručnjaka iz odgovarajuće oblasti.

[0167] Generisanje antitela koje vezuje, a još poželjnije koje specifično vezuje FliD, poznato je stručnjaku iz odgovarajuće oblasti i, na primer, opisano je u Harlow, E., i Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,(1988). Prvenstveno se mogu koristiti monoklonska antitela koja mogu biti proizvedena prema protokolu Cezara i Milštajna i daljim usavršavanjima baziranim na njemu. Antitela kada se ovde koriste, obuhvataju, ali nisu ograničena na kompletna antitela, fragmente ili derivate antitela, kao što su Fab fragmenti, Fc fragmenti i jednolančana antitela, sve dok su podesna i mogu da se vezuju za FliD. Pored monoklonskih antitela takođe mogu da se upotrebe i/ili generišu poliklonska antitela. Generisanje poliklonskog antitela je takođe poznato stručnjaku iz odgovarajuće oblasti i, na primer, opisano je u Harlow, E., i Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

[0168] Antitela koja se mogu upotrebiti mogu imati jedan ili nekoliko markera ili labela. Takvi markeri ili labele mogu biti korisni za detekciju antitela. Prvenstveni markeri i labele su izabrani iz grupe koja sadrži avidin, streptavidin, biotin, zlato, enzime, kao što su HRP i fluorescein i upotrebljavaju se npr. u ELISA postupcima. Ovi i drugi markeri, kao i postupci su opisani npr. u Harlow, E., i Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,(1988).

[0169] Aptameri su D-nukleinske kiseline koje su jednolančane ili dvolančane i koje specifično sadejstvuju sa ciljnim molekulom kao što je FliD. Proizvodnja ili selekcija aptamera je opisana npr.u evropskom patentu EP 0533838. U suštini se realizuju sledeći koraci. Prvo se priprema smeša nukleinskih kiselina tj. potencijalnih aptamera, pri čemu svaka nukleinska kiselina obično sadrži segment od nekoliko, a prvenstveno od najmanje osam uzastopnih slučajnih nukleotida. Ova smeša se zatim dovodi u kontakt sa ciljnim molekulom, pri čemu se nukleinska kiselina, odnosno kiseline vezuju za ciljni molekul, na primer, na bazi povećanog afiniteta prema cilju ili većom silom za njega, u poređenju sa kandidatskom smešom.

Vezivane nukleinske kiseline, odnosno kiselina se zatim izdvajaju od ostatka smeše. Opciono, ovako dobijena nukleinska kiselina, odnosno kiseline se amplifikuju korišćenjem npr. lančane reakcije polimeraze. Ovi koraci se mogu ponoviti nekoliko puta dajući na kraju smešu koja ima povećani udeo nukleinskih kiselina koje se specifično vezuju za cilj, od kojih se onda opciono bira finalna vezujuća nukleinska kiselina. Ova specifično vezujuća nukleinska kiselina, odnosno kiseline se nazivaju aptamerima. Očigledno je da se u bilo kojoj fazi postupka za generisanje ili identifikaciju aptamera uzorci smeše pojedinačnih nukleinskih kiselina mogu uzeti da bi se odredila njihova sekvenca korišćenjem standardnih tehnika. Aptameri se mogu stabilizovati, kao npr. uvođenjem definisanih hemijskih grupa koje su poznate stručnjaku iz odgovarajuće oblasti za generisanje aptamera. Takva modifikacija se može ogledati, na primer, u uvođenju amino grupe na 2’-poziciji šećernog radikala nukleotida.

[0170] Generisanje ili proizvodnja špiglmera koji se vezuju za, a preciznije koji se specifično vezuju za FliD kao ciljni molekul je bazirano na sličnom principu.

Proizvodnja špiglmera je opisana u međunarodnoj prijavi patenta WO 98/08856. Špiglmeri su L-nukleinske kiseline, što znači da se oni sastoje od L-nukleotida umesto od D-nukleotida kao aptameri. Špiglmeri su karakterisani činjenicom da oni imaju veoma visoku stabilnost u biološkom sistemu i, u poređenju sa aptamerima, specifično sadejstvuju sa ciljnim molekulom protiv koga su usmereni. Za svrhe generisanja špiglmera, kreira se heterogena populacija D-nukleinskih kiselina, pa se ova populacija dovodi u kontakt sa optičkim antipodom ciljnog molekula, u konkretnom slučaju, na primer, sa D-enantiomerom prirodnog L-enantiomera FliD. Posle toga se izdvajaju one D-nukleinske kiseline koje ne sadejstvuju sa optičkim antipodom ciljnog molekula. Međutim, one D-nukleinske kiseline koje sadejstvuju sa optičkim antipodom ciljnog molekula se izdvajaju, opciono se determinišu i/ili sekvenciraju, a zatim se sintetizuju odgovarajuće L-nukleinske kiseline na osnovu informacija o sekvenci nukleinske kiseline dobijenoj od D-nukleinske kiseline. Ove L-nukleinske kiseline koje su identične u pogledu sekvence sa gore navedenim D-nukleinskim kiselinama sadejstvuju sa optičkim antipodom ciljnog molekula, specifično će sadejstvovati sa prirodnim ciljnim molekulom umesto sa njegovim optičkim antipodom. Slično postupku za generisanje aptamera, takođe je moguće ponoviti različite korake nekoliko puta i shodno tome obogatiti one nukleinske kiseline koje specifično sadejstvuju sa optičkim antipodom ciljnog molekula.

[0171] U postupku za detekciju Helicobacter infekcije, a još poželjnije H. pylori infekcije kod subjekta, pri čemu postupak sadrži detekciju u uzorku subjekta nukleinske kiseline koja kodira FliD, sadejstvujući agens je izabran iz grupe koja sadrži prajmer i probu. Sa ovde otkrivenim nukleotidnim i aminokiselinskim sekvencama FliD, u okviru sposobnosti stručnjaka iz odgovarajuće oblasti je da dizajnira i pripremi takav prajmer i probu (vidi, na primer, Lottspeich F. i Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998). Takav sadejstvujući agens može biti obeležen. Različiti markeri i načini za obeležavanje sadejstvujućeg agensa su poznati stručnjaku iz odgovarajuće oblasti. U jednom primeru izvođenja markeri su isti kao što je gore navedeno u vezi antitela.

[0172] Proizvod interakcije koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira FliD ili njegov fragment i sadejstvujući agens se mogu detektovati pomoću sredstava koja su poznata stručnjaku iz odgovarajuće oblasti i, na primer, opisana su u Lottspeich F. i Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998.

[0173] U jednom primeru izvođenja postupka za detekciju Helicobacter infekcije, a još poželjnije H. pylori infekcije kod subjekta, pri čemu postupak sadrži detekciju u uzorku subjekta nukleinske kiseline koja kodira FliD, nukleinska kiselina koja kodira FliD se detektuje masenom spektrometrijom, koja je opisana npr. u Lottspeich F. i Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998.

[0174] U jednom primeru izvođenja postupka za detekciju Helicobacter infekcije, a još poželjnije H. pylori infekcije kod subjekta, pri čemu postupak sadrži detekciju u uzorku subjekta nukleinske kiseline koja kodira FliD, nukleinska kiselina koja kodira FliD se detektuje pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) u njenim različitim oblicima, koji su opisani npr. u Lottspeich F. i Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998. Alternativno tome, nukleinska kiselina koja kodira FliD se detektuje hibridizacionim testom, npr. kao što je opisano u Lottspeich F. i Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998.

[0175] U onim aspektima otkrivanja koji se odnose na biomarker, biće potvrđeno da imuna reakcija protiv FliD kao što je ovde definisano, FliD i nukleinska kiselina koja kodira FliD, svaki od njih deluje kao prediktivni biomarker pošto je prisustvo pomenute imune reakcije protiv FliD kao što je ovde definisano, FliD i/ili nukleinske kiseline koja kodira FliD u korelaciji sa histologijom i zapaljenjem kod nelečenih pacijenata.

[0176] Stručnjak iz odgovarajuće oblasti će potvrditi da se na osnovu ovde datog otkrivanja specifični dizajn kita prema pronalasku nalazi u okviru uobičajenih sposobnosti stručnjaka iz odgovarajuće oblasti. U jednom primeru izvođenja, kit je kit koji je spreman za upotrebu.

[0177] Ovde je takođe otkrivena primena sadejstvujućih agenasa koji su ovde opisani za detekciju FliD kao što je ovde opisano.

[0178] Kada se ovde prvenstveno upotrebljava, uzorak je uzorak kakav se neposredno dobija iz ili od subjekta, ili uzorak koji je bio tretiran pre nego što bude upotrebljen u vezi pronalaska, a naročito postupka prema pronalasku.

[0179] U jednom primeru izvođenja različitih aspekata i primera izvođenja pronalaska subjekt je subjekt za koga se pretpostavlja da boluje ili se pretpostavljalo da boluje od H. pylori infekcije.

[0180] U jednom primeru izvođenja Helicobacter infekcija je infekcija sa Helicobacterom ili pretpostavljena ili suspektna infekcija sa Helicobacterom.

[0181] U jednom primeru izvođenja bilo kog aspekta predmetnog pronalaska gde prvo jedinjenje specifično sadejstvuje sa drugim jedinjenjem ili se specifično vezuje za njeg, sadejstvo ili vezivanje između pomenutog prvog jedinjenja i pomenutog drugog jedinjenja je karakterisano sa KD od 1 μM ili manjom, a prvenstveno sa K<D>od 0.25 μM ili manjom i još poželjnije sa KD od 0.1 ili manjom.

[0182] Stručnjak iz odgovarajuće oblasti podrazumeva da tamo gde je detektovan FliD, FliD može biti prisutan bilo kao FliD cele dužine ili kao fragment FliD ili kao fragment FliD cele dužine. Kada se ovde prvenstveno koristi, FliD cele dužine je FliD koji proizvede Helicobacter, a koji je aktivan kao virulentni faktor. U jednom primeru izvođenja FliD cele dužine je prvenstveno FliD koji proizvede Helicobacter. Fragment FliD cele dužine je fragment aminokiselinske sekvence koji je kraći od aminokiselinske sekvence FliD cele dužine, pri čemu je fragment FliD još uvek aktivan kao virulentni faktor. Fragment FliD je prvenstveno fragment FliD, a prvenstveno FliD cele dužine, pri čemu fragment ima aminokiselinsku sekvencu koja je dovoljno dugačka da omogući stručnjaku iz odgovarajuće oblasti da identifikuje taj fragment kao fragment FliD, a naročito FliD cele dužine i da isključi da je taj fragment fragment proteina ili polipeptida različit od FliD, a naročito FliD cele dužine. U poželjnom primeru izvođenja FliD cele dužine sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1.

[0183] Ista razmatranja i definicije podjednako se primenjuju na nukleinsku kiselinu koja kodira FliD. U skladu sa time, stručnjak iz odgovarajuće oblasti podrazumeva da tamo gde je detektovana nukleinska kiselina koja kodira FliD, može biti prisutna nukleinska kiselina koja kodira FliD bilo kao nukleinska kiselina koja kodira FliD cele dužine ili kao nukleinska kiselina koja kodira fragment FliD ili kao nukleinska kiselina koja kodira fragment FliD cele dužine. Ovde se prvenstveno upotrebljava kao FliD cele dužine FliD proizveden od strane Helicobactera koji je aktivan kao virulentni faktor. U jednom primeru izvođenja FliD cele dužine je prvenstveno FliD proizveden od strane Helicobactera. Fragment FliD cele dužine je fragment aminokiselinske sekvence koji je kraći od aminokiselinske sekvence FliD cele dužine, pri čemu je fragment FliD još uvek aktivan kao virulentni faktor. Fragment FliD je prvenstveno fragment FliD, a prvenstveno je FliD cele dužine, pri čemu fragment ima aminokiselinsku sekvencu koja je dovoljno dugačka tako da omogući stručnjaku iz odgovarajuće oblasti da identifikuje fragment koji je fragment FliD, a naročito FliD cele dužine i da isključi fragment koji je fragment proteina ili polipeptida različitog od FliD, a naročito FliD cele dužine. U poželjnom primeru izvođenja nukleinska kiselina koja kodira FliD cele dužine sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO:2.

[0184] Fragment nukleinske kiseline koja kodira FliD je prvenstveno fragment nukleinske kiseline koja kodira FliD, a prvenstveno FliD cele dužine, pri čemu fragment nukleinske kiseline ima nukleotidnu sekvencu koja je dovoljno dugačka tako da omogući stručnjaku iz odgovarajuće oblasti da identifikuje fragment kao fragment nukleinske kiseline koja kodira FliD, a naročito FliD cele dužine i da isključi fragment nukleinske kiseline kao fragment nukleinske kiseline koja kodira protein ili polipeptid različit od FliD, a naročito FliD cele dužine.

[0185] Takođe će stručnjak iz odgovarajuće oblasti podrazumevati da u onim primerima izvođenja postupka prema pronalasku gde je detektovana imuna reakcija protiv FliD kao što je ovde definisano, FliD koji reaguje imunom reakcijom protiv FliD kao što je ovde definisano, može biti FliD proizveden od strane Helicobacter vrste koja je inficirala subjekta ili za koju se pretpostavlja da je inficirala subjekta, može biti FliD cele dužine kao što je ovde definisano ili može biti fragment FliD kao što je ovde definisano. Pored toga, fragment FliD je, u jednom primeru izvođenja, fragment FliD koji ima kraću aminokiselinsku sekvencu od FliD, pri čemu se fragment može upotrebiti u pomenutim primerima izvođenja postupka prema pronalasku, dok omogućava specifično sadejstvo sa ili specifičnu detekciju imune reakcije protiv FliD kao što je ovde definisano.

[0186] Prajmer koji cilja nukleinsku kiselinu koja kodira FliD kao što je ovde opisano je jedan koji je izabran iz grupe koja sadrži prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 21, prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 22, prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 23, prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 24, prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 25, prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 26, prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 27 i prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 28.

Prvenstveno, prajmer je kombinacija najmanje dva prajmera, pri čemu

prvi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 21 i

drugi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 22;

drugi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 24;

drugi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 26;

drugi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 28;

prvi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 23 i

prvi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 25 i

prvi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 27 i

drugi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 26; ili

drugi prajmer od najmanje dva prajmera je prajmer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema SEQ ID NO: 28.

[0187] Različite SEQ ID NOs: na koje se ovde vrši poziv, jedinjenje predstavljeno pomenutim SEQ ID NOs:, organizmi iz kojih su pomenute sekvence bile uzete i, u nekim slučajevima, naznaka odgovarajućeg unosa sekvence u javno dostupne baze podataka su sumirani u sledećoj Tabeli 1 :

Tabela 1:

SEQ ID NO:1 je aminokiselinska sekvenca FliD koju izražava H. pylori koja odgovara GenBank unosu ACI27464.1.

SEQ ID NO:2 je nukleotidna sekvenca (kDNK) FliD koju izražava H. pylori koja odgovara GenBank unosu CP001173.1.

SEQ ID NO:3 je aminokiselinska sekvenca FliD koju izražava H. suis koja odgovara NCBI Referentnoj Sekvenci WP_006563874.1.

SEQ ID NO:4 je nukleotidna sekvenca (kDNK) FliD koju izražava H. suis koja odgovara GenBank unosu ADGY01000008.1.

SEQ ID NO:5 je aminokiselinska sekvenca FliD koju izražava H. felis koja odgovara NCBI Referentnoj Sekvenci YP_004073770.1.

SEQ ID NO:6 je nukleotidna sekvenca (kDNK) FliD koju izražava H. felis koja odgovara GenBank unosu FQ670179.2.

SEQ ID NO:7 je aminokiselinska sekvenca CagA H. pylori G27 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci YP_002266135.1.

SEQ ID NO:8 je nukleotidna sekvenca (kDNK) CagA H. pylori G27 koja odgovara GenBank unosu JQ318032.1.

SEQ ID NO:9 je aminokiselinska sekvenca VacA H. pylori G27 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci YP_002266461.1.

SEQ ID NO:10 je sekvenca nukleinske kiseline (kDNK) VacA H. pylori G27 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci NC_011333.1.

SEQ ID NO:11 je aminokiselinska sekvenca GroEL H. pylori G27 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci YP_002265651.1.

SEQ ID NO:12 je nukleotidna sekvenca (kDNK) GroEL H. pylori G27 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci NC_011333.1.

SEQ ID NO:13 je aminokiselinska sekvenca Hp0231 H. pylori 26695 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci NP_207029.1.

SEQ ID NO:14 je nukleotidna sekvenca (kDNK) Hp0231 H. pylori 26695 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci NC_000915.1.

SEQ ID NO:15 je aminokiselinska sekvenca JHp0940 H. pylori J99 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci NP_223657.1.

SEQ ID NO:16 je nukleotidna sekvenca (kDNK) JHp0940 H. pylori J99 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci NC_000921.1.

SEQ ID NO:17 je aminokiselinska sekvenca HtrA H. pylori G27 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci YP_002266040.1.

SEQ ID NO:18 je nukleotidna sekvenca (kDNK) HtrA H. pylori G27 koja odgovara NCBI referentnoj sekvenci NC_011333.1.

SEQ ID NO: 19 je prajmer upotrebljen u kloniranju FliD gena iz H. pylori.

SEQ ID NO: 20 je prajmer upotrebljen u kloniranju FliD gena iz H. pylori.

SEQ ID NO: 21 je direktni prajmer upotrebljen u PCR1 u Primeru 9.

SEQ ID NO: 22 je reverzni prajmer upotrebljen u PCR1 u Primeru 9.

SEQ ID NO: 23 je direktni prajmer upotrebljen u PCR2 u Primeru 9.

SEQ ID NO: 24 je reverzni prajmer upotrebljen u PCR2 u Primeru 9.

SEQ ID NO: 25 je direktni prajmer upotrebljen u PCR3 u Primeru 9.

SEQ ID NO: 26 je reverzni prajmer upotrebljen u PCR3 u Primeru 9.

SEQ ID NO: 27 je direktni prajmer upotrebljen u PCR4 u Primeru 9.

SEQ ID NO: 28 je reverzni prajmer upotrebljen u PCR4 u Primeru 9.

[0188] Stručnjak iz odgovarajuće oblasti će podrazumevati da je u slučaju nukleotidne sekvence pored DNK sekvence, a naročito kDNK sekvence, ovde takođe otkrivena RNK sekvenca koja se razlikuje od takve DNK sekvence i kDNK sekvence samo po tome što je šećerna grupa ribonukleotid umesto deoksiribonukleotida.

[0189] Predmetni pronalazak je sada dalje ilustrovan sledećim slikama nacrta i primerima koji nemaju svrhu ograničavanja obima zaštite. Sa pomenutih slika nacrta i primera mogu se preuzeti druge karakteristike, primeri izvođenja i prednosti, pri čemu

Fig. 1 prikazuje primer izvođenja linijskog testa upotrebljenog u postupku prema pronalasku za detekciju anti-FliD antitela u uzorku seruma od 20 humanih pacijenata koji su histološki dijagnostikovani kao H. pylori pozitivni;

Fig. 2 prikazuje primer izvođenja testa sa bočnim protokom koji se može primeniti u postupku prema predmetnom pronalasku za detekciju anti-FliD antitela u uzorku kao što je uzorak cele krvi humanog subjekta, pri čemu Fig.2A šematski ilustruje dizajn testa, a Fig.2B prikazuje rezultat testa;

Fig. 3 je dijagram koji prikazuje prevalenciju anti-FliD reakcija u uzorcima ljudi u funkciji broja godina proteklih od eliminacije H. pylori;

Fig. 4 prikazuje ROC krive za FliD u poređenju sa dva dobro poznata antigena;

Fig. 5 prikazuje rezultat Vestern blot analize za detekciju FliD za različite koncentracije korišćenjem mišijeg anti-FliD seruma, ali ne Tig ili gGT;

Fig. 6 prikazuje niz Sadern blotova uz korišćenje lančane reakcije polimeraze 1 (PCR1), lančane reakcije polimeraze 2 (PCR2), lančane reakcije polimeraze 3 (PCR3) ili lančane reakcije polimeraze 4 (PCR4) za detekciju genomske DNK prisutne u reprezentativnim uzorcima od pacijenata koji su bili dijagnostikovani kao H. pylori-pozitivni;

Fig. 7 prikazuje rezultat reprezentativne Vestern blot analize izvedene uz korišćenje lizata celog proteina kultivisane H. pylori; i

Fig. 8 prikazuje rezultat dve Vestern blot analize za određivanje da li je FliD bio izražen od strane mikroorganizama navedenih ispod svakog od Vestern blotova.

Primer 1: Kloniranje H. pylori FliD Gena

[0190] Sve DNK manipulacije su bile izvedene pod standardnim uslovima, kao što su opisali Sambrook et al. (Sambrook, et al., 1989). Ukratko, FliD gen je bio amplifikovan pomoću PCR uz korišćenje genomske DNK H. pylori soja J99 kao matrice. Sledeći oligonukleotidi su bili korišćeni kao prajmeri: 5’- CAT ATG GCA ATA GGT TCA TTA A-3’ (SEQ ID NO: 19) i 5’-CTC GAG ATT CTT TTT AGC CGC TGC-3’ (SEQ ID NO: 20). Korišćenjem ovog pristupa bilo je uvedeno Ndel mesto na 5’-kraj direktnih prajmera i Xhol mesto na 5’-kraj reverznih prajmera. Posle PCR amplifikacije, proizvod (2058 bp) je bio ligatiran u pTZ57R/T vektoru za kloniranje (InsTAclone™ PCR Cloning Kit, MBI Fermentas, Litvanija). Posle toga, insert je bio potvrđen pomoću PCR i sekvenciranja, pa je bio kloniran u PET-28a(+) vektor za ekspresiju (Qiagen, SAD) uz korišćenje Ndel i Xhol restrikcionih enzima.

Primer 2: Ekspresija, prečišćavanje i prepoznavanje rekombinantnog FliD

[0191] E. coli BL21 (Qiagen, SAD) kompetentne ćelije su bile transformisane sa pET-28a(+)-fliD, pa su inokulisane u LB bujonu sa antibiotikom (kanamicin, 50μg/ml). Ekspresija je bila indukovana dodavanjem 1 mmol/L izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) sa optičkom gustinom (OD600) od 0.6. Posle 4 sata ćelije su bile sakupljene, pa je bila izvršena proteinska analiza celog lizata pomoću elektroforeze na natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE).

Rastvorljivi histidinom označeni proteini su bili prečišćeni uz korišćenje afinitetne hromatografije (HisTrap crude, GE Healthcare). Kao drugi korak doterivanja i radi izmene pufera, bila je izvedena gel hromatografija (Superdex 75, GE Healthcare). Relevantne frakcije su bile sakupljene, a zatim su koncentrovane pomoću centrifugalnog filterskog uređaja (Millipore) sa odsecanjem (odn. granicom, engl. cut off) od 10 kDa, pa su čuvane na - 80°C. Prečišćeni rekombinantni protein je bio evaluiran pomoću Vestern blota uz korišćenje anti-His Tag-HRP antitela, a takođe i mišijeg anti-H. pylori-HRP antitela (Pierce, Rokford, SAD) i onda je detektovan pomoću ECL sistema (GE Healthcare, Upsala, Švedska).

[0192] Amplifikacija FliD gena H. pylori soja J99 DNK otkrila je samo jedan PCR proizvod od 2.05 kb (podaci nisu prikazani) koji je bio potvrđen sekvenciranjem i ligatiran je u vektor za ekspresiju pET-28a(+). Posle transformacije u E. coli ekspresioni soj BL21 DE3 i indukcije sa IPTG, mogla je biti uočena samo jedna jasna traka na Vestern blotu korišćenjem komercijalnog poliklonskog anti-H. pylori antiseruma. Protein je bio prečišćen kao što je opisano u Materijali i postupci do >90% čistoće (podaci nisu prikazani) i ponovo je potvrđen pomoću Vestern blota (podaci nisu prikazani).

Primer 3: Proizvodnja i prečišćavanje rFliD specifičnog antitela

[0193] Odrasli beli novozelandski zec je bio imunizovan prečišćenim proteinom prema protokolu autora Hay et al. uz male modifikacije (Hay, et al., 2002). Ukratko, imunizacija je bila izvršena i.m. injekcijom sa 250 μg prečišćenog rekombinantnog proteina (0.5 ml) sa istom zapreminom (0.5 ml) Frojndovog kompletnog adjuvansa. Radi održavanja imunizacije, zecu je bilo dato pojačanje od po 125 μg prečišćenog proteina pripremljenog u istoj zapremini (0.5 ml) Frojndovog nekompletnog adjuvansa 4, 6, 8 i 10 nedelja kasnije. Kao negativna kontrola bio je uzet uzorak seruma pre imunizacije. Konačno, dve nedelje posle poslednje imunizacije, bila je uzeta krv i izdvojeni su serumi. Poliklonsko IgG antitelo je bilo prečišćeno pomoću sefaroza-4B afinitetne hromatografije uz korišćenje rFliD konjugovanih kolona pripremljenih prema protokolu proizvođača (Pharmacia, 1988). FliD ekspresija H. pylori (J99) je bila detektovana pomoću Vestern blota uz korišćenje ultrazvučnog supernatanta sa koncentracijom proteina od 50 μg/ml. Zečije poliklonsko IgG antitelo koje se pojavilo kao reakcija protiv rFliD proteina je bilo upotrebljeno kao prvo antitelo (1:5000 razređenje), HRP-markirajuće ovčije antitelo protiv zečijeg IgG (Avicenna Research Institute, Teheran, Iran) kao drugo antitelo (1:3000 razređenje) i ECL sistem su bili upotrebljeni za detekciju (Chen, et al., 2001).

[0194] Pored toga, da bi se testirala antigenost rekombinantnog FliD i da bi se uporedila sa prirodnim proteinom, bio je proizveden zečiji poliklonski antiserum. Titri antitela su bili određeni već posle treće imunizacije i dostigli su visoke nivoe posle četvrtog pojačanja, što je potvrdilo dobru imunogenost FliD. Zečiji antiserum je mogao da prepozna prečišćeni rFliD i FliD u H. pylori lizatu (podaci nisu prikazani).

Primer 4: Razvijanje ELISE

[0195] ELISA ploče su bile obložene sa 100 μl rFliD proteina u koncentraciji od 1 μg/ml u PBS, pa su inkubirane preko noći na 4°C. Obloženi bunarčići su bili blokirani fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS) koji je sadržao 2.5% goveđeg serumskog albumina (BSA, Sigma) tokom dva sata na 37°C. Svi H. pylori pozitivni i negativni serološki uzorci upotrebljeni u ovoj studiji su bili podvrgnuti skriningu za antitela protiv FliD korišćenjem optimalnog razređivanja pacijentovih seruma (1:100 razređenje) i to kao prvo antitelo, HRP-konjugovani anti-humani IgG (Promega, Manhajm, Nemačka) (1:100 razređenje) kao sekundarno antitelo i TMB (3,3’,5,5’-tetra metil benzidin) kao supstrat. Pored toga, bili su ostavljeni bunarčići bez prevlake kao kontrola za svaki serum. Rezultat ELISE za uzorak pacijentovog seruma je bio smatran pozitivnim ako je njegova OD450 vrednost bila iznad srednje vrednosti plus 3 SD od negativnih uzoraka seruma (Chen, et al., 2001).

Primer 5: Razvijanje FliD linijskog testa

[0196] Bio je pripremljen linijski imunotest baziran na rekombinantnim H. pylori proteinima imobilizovanim na nitrocelulozi. Za razliku od ELISE, princip testiranja omogućava identifikaciju specifičnih antitela protiv različitih antigena H. pylori putem odvojene primene različitih pojedinačnih antigena.

[0197] rFliD je bio imobilizovan na trakama sa nitroceluloznim membranama zajedno sa drugim visoko prečišćenim rekombinantnim H. pylori antigenima (CagA, VacA, GroEL, UreA (ureaza A), HcpC (cisteinom bogati protein C) (Mittel et al., 2003) i gGT (gama glutamil transferaza). Odgovarajući linijski uslovi za rFliD su bili određeni empirijski, selekcijom standardnih uzoraka seruma iz prethodno opisane studije populacije koja je sadržala 20 definisanih H. pylori histološki pozitivnih uzoraka i 20 definisanih H. pylori histološki negativnih uzoraka. Optimalna koncentracija antigena i idealni izbor aditiva kao što su deterdžent, ditiotreitol, i NaCl je bio podešen za svaki antigen ponovljenim ciklusima oblaganja i skrininga. Uslovi sa najboljom prezentacijom epitopa antigena i optimalnim vezivanjem za membranu, koji se mogu uočiti na osnovu savršenog izgleda trake i najbolje diskriminacije negativnih i pozitivnih uzoraka, bili su izabrani za idealne specifikacije proizvoda prvih šarži. Na gornji kraj trake su bile dodate kontrolne linije, a sadržale su zečija anti-humana IgG/IgM/IgA antitela kao inkubacione kontrole i humana IgG, IgM ili IgA antitela kao konjugatnu kontrolu, kao i kontrolu odsecanja koja omogućava ocenu reaktivnosti pojedinačnih traka antigena.

[0198] Posle skeniranja i denzitometrijske analize intenziteta traka, bila je upotrebljena kontrola kao interna referenca za izračunavanje odnosa za svaku traku. Obično su odsecanja kontrolnih traka bila procenjena na između 20 i 30, dok su jako pozitivne trake bile ocenjene sa do 600 poena. Ocenjivanje svake trake iznad pojedinačne kontrole svake trake je smatrano pozitivnim (odnos >1).

[0199] Odgovarajući linijski test je prikazan na Fig.1

Primer 6: Prototip testa sa bočnim protokom za dijagnozu H. pylori

[0200] Korišćenjem gore definisanih materijala bio je razvijen test sa bočnim protokom na bazi ovde otkrivenih principa koji se odnose na dizajn testa sa bočnim protokom.

[0201] Prototip takvog testa sa bočnim protokom je prikazan na Fig.2, pri čemu Fig. 2A ilustruje šematski dizajn testa, a Fig.2B prikazuje rezultat analize uzorka dobijenog od ljudskog bića korišćenjem testa, pri čemu su bila detektovana anti-FliD antitela.

[0202] Kao što se može videti sa Fig.2A, u testu su upotrebljene anti-hlgG zlatom obložene nanočestice. rFliD, kao i rekombinantni CagA su bili prisutni kao antigeni. hIgG koji je takođe bio imobilizovan služio je kao kontrola. Porozna struktura je bila formirana nitrocelulozom. Kontrolna traka je ukazivala da sistem radi ispravno. FliD traka je ukazivala da je pacijent imao aktivnu ili nedavno lečenu infekciju. CagA traka, u slučaju aktivne infekcije (+FliD traka), ukazuje da se ova infekcija mora lečiti.

Primer 7: Analiza uzoraka čoveka

[0203] Ukupno šest stotina i osamnaest (618) humanih pacijenata (308 muškaraca, 310 žena) bilo je uključeno u studiju. Posle dobijanja objašnjenja svrhe studije, bila je dobijena saglasnost o informisanosti od svakog pacijenta, pa je uzet uzorak krvi u vreme endoskopije, pre nego što je započela bilo kakva terapija. Serumi su bili izdvojeni, pa su čuvani na -20°C. Dijagnoza infekcije bila je zasnovana na histopatologiji kao zlatnom standardu. Pacijenti su bili smatrani H. pylori pozitivnim kada su rezultati histopatologije bili pozitivni. Svi pacijenti su bili podvrgnuti skriningu pomoću FliD linijskog testa, a podskup od 246 seruma je bio testiran pomoću FliD ELISE kao što je gore opisano i pomoću linijskog testa kao što je gore opisano.

Tabela 2 prikazuje rezultate korišćenja pomenute FliD ELISE. Preciznije, Tabela 2 prikazuje FliD serološku reakciju u ELISI upoređivanjem H. pylori negativnih i pozitivnih humanih pacijenata.

Tabela 3 prikazuje rezultate korišćenja pomenutog linijskog testa za podgrupu grupe pacijenata. Preciznije, Tabela 3 prikazuje FliD serološku reakciju u linijskom testu upoređivanjem H. pylori negativnih i pozitivnih humanih pacijenata.

[0204] Korišćenjem FliD ELISE, od 170 pozitivno navedenih uzoraka, bilo je detektovano 165 pozitivnih uzoraka, dok je od 76 negativno navedenih uzoraka, 73 bilo ponovo potvrđeno kao negativno pomoću ELISE (Tabela 2). Skupa posmatrano, primena FliD u dijagnozi H. pylori infekcije na bazi ELISE ima specifičnost od 96% i senzitivnost od 97%. Interesantno je da su pet slučajeva u kojima je ELISA bila negativna takođe imali niske, ali blago pozitivne ocene u linijskom blotu neposredno iznad odsecanja (odnosi se nalaze u rasponu od 1.2 do 2.2). Jedan od njih je takođe bio smatran H. pylori negativnim na osnovu linijskog blota, dok su druga četiri imala pozitivan linijski blot, reagujući sa nekoliko drugih antigena (podaci nisu prikazani). Važno je naglasiti da je samo jedan uzorak bio negativan u oba testa.

[0205] Cela grupa od 618 humanih pacijenata (od kojih je deo bio podvrgnut skriningu pomoću ELISE) bila je analizirana uz korišćenje linijskog testa kao reakcija antitela protiv FliD. Visoka senzitivnost od 97,4% za 310 od 318 pacijenata koji su bili ocenjeni pozitivno u histopatologiji bila je pozitivna u linijskom testu, dok je linijski test dostigao specifičnost od 99% (Tabela 2). Rezultati pacijenata kod kojih su bili dobijeni protivrečni rezultati, bili su pažljivo ispitani.8 seruma je bilo negativno za FliD u linijskom testu, ali je ispoljilo reaktivnost sa drugim antigenima, što ukazuje da ovde zaista FliD nije bio prepoznat kao antigen. U okviru ovih 8 uzoraka, jedan uopšte nije imao nikakvu reaktivnost protiv FliD trake. Sedam je imalo slabu reaktivnost koja je bio jedan ispod odsecanja (odnosi između 0,6 i 0,95), a četiri od ovih je imalo slabe reaktivnosti protiv svih drugih priznatih antigena generalno (nije prikazano). Sva tri uzorka u kojima je FliD dao "lažno pozitivni" rezultat su pokazala reaktivnosti i sa drugim trakama. Sve ove trake, uključujući FliD, bile su relativno slabe, ali jasno iznad odsecanja.

[0206] Na osnovu pomenutih uzoraka bila je određena prevalencija reakcije anti-FliD antitela kao funkcija godina posle eliminacije. Rezultat je prikazan na Fig.3. Kao što se može videti sa Fig.3, još uvek postoji prevalencija reakcije anti-FliD antitela od oko 25 % posle 16 do 20 godina od eliminacije H. pylori.

[0207] Na osnovu pomenutih uzoraka bile su pripremljene ROC (engl. receiver operating characteristics) krive za FliD, CagA i UreA. Rezultat je prikazan na Fig.4. Sa pomenute Fig.4 je očigledno da je FliD podesniji u odnosu na dva antigena iz stanja tehnike koja su upotrebljena u detekciji H. pylori infekcije.

Primer 8: Bioinformatička analiza FliD sekvenci

[0208] Korišćenjem bioinformatičkih alata, FliD protein H. pylori G27 soja je bio široko upoređen sa drugim organizmima, uglavnom prokariotama. Ova analiza pokazuje više od 97% homologije između više od 200 H. sojeva.

[0209] Rezultati su prikazani u Tabeli 4.

Primer 9: Prisustvo i ekspresija FliD u H. pylori

Uzorci

[0210] 81 H. pylori izolat od humanih pacijenata je bio uključen u studiju. Uzorci su bili dijagnostikovani pozitivno uobičajenom bakterijskom kultivacijom na selektivnim pločama. U takvom testiranju, bakterije su bile gajene na Wilkins-Chalgren pločicama sa krvlju i agarom pod mikroaerobnim uslovima (10% CO2, 5% O2, 8.5% N2, i 37°C) tokom 36 sati, a pozitivnost za oksidazu, katalazu i ureazu je bila potvrđena biohemijskim testiranjem. Deo kultivisanih bakterija je bio upotrebljen za izolaciju DNK, a ostatak je bio primenjen za pripremanje proteinskog lizata za Vestern blot analizu.

Poliklonski mišiji anti - FliD serumi

[0211] Tri C57BL6 miša su bila imunizovana 3 puta (nedeljno) sa 30μg rekombinantnog H. pylori FliD kao antigenom i 10μg CT (kolera toksin) kao adjuvansom re-suspendovanim u PBS. Jednu nedelju posle poslednjeg pojačanja imunizacije, miševima je uzeta krv i sakupljeni su serumi. Antigenost i specifičnost sakupljenih seruma bila je testirana Vestern blot analizom.

Vestern blot analiza

[0212] Da bi se uspostavili optimalni uslovi za test, bile su generisane različite koncentracije rekombinantnog FliD proteina, kao i drugih rekombinantnih kontrolnih proteina (Tig (Trigger factor (Tomb et al., 1997)) i gGT), pa su prečišćene pod istim uslovima, te su bile nanete na 8% SDS gelove. Posle blotiranja proteina na nitroceluloznoj membrani (Whatman/GE Healthcare, Frajburg, Nemačka), membrane su bile blokirane u 5% obranog mleka tokom 1 h na sobnoj temperaturi, pa su inkubirane preko noći sa različitim razređenjima anti-seruma kao primarnim antitelima. Posle inkubacije membrana sa HRP-obeleženim anti-mišijim IgG, mogle su biti detektovane trake dodavanjem ECL Vestern Bloting Detekcionih reagenasa.

[0213] Rezultati su prikazani na Fig.5, pri čemu je na desnoj strani prikazan SDS gel antigen i naznačena je njegova količina naneta na pojedinačne trake. Bilo je upotrebljeno optimalno razređenje (1:2000) mišijeg anti seruma.

PCR analiza prisustva FliD-ovog ORF u genomu H. pylori

[0214] Bile su dizajnirane četiri PCRs na bazi DNK sekvence FliD kao subjekta SEQ ID NO: 2. Specifičnost svakog para prajmera navedenih u Tabeli 5 je bila potvrđena blast analizom protiv svih bakterijskih nukleotidnih sekvenci banke gena. PCRs su bile uspostavljene uz korišćenje DNK H. pylori kao pozitivne kontrole i genomske DNK od 10 drugih mikroorganizama kao negativnih kontrola. PCRs su bile izvršene uz korišćenje GoTaq polimerazne master smeše (Promega), uz temperaturu anelacije od 56°C i vreme produžetka od 30 sekundi.

Tabela 5: Prajmeri upotrebljeni za PCR analizu.

Rezultati

[0215] ORF FliD je bio prisutan u izolatima svih pacijenata sa H. pylori (kultivisane bakterije izolovane iz biopsija pacijenata). Prisustvo ORF FliD moglo je biti potvrđeno pomoću sve četiri PCRs upotrebljene za ovaj test. PCR1, PCR2 i PCR3 izvršenih pomoću izolovane DNK iz 81 H. pylori uzoraka su bile u celini pozitivne. Dok je PCR4 bila pozitivna za 79 uzoraka (Fig.6). Specifičnost testa je bila potvrđena primenom DNK izolovane iz P. aeruginosa (ATCC 27813), Klebsiella oxytoca (ATCC 700324), Candida albicans (ATCC 90028), Entrococcus faecalis (ATCC 29292), Strep. Group A (ATCC 19615), S.thyphimurium (ATCC 13311), S.aureus (ATCC 25923), S.epidermidis (ATCC 18228), H.influensae (ATCC 49247) i E.coli (ATCC 25922).

[0216] Kao što se može videti sa Fig.6 koja prikazuje rezultate reprezentativne PCR analize izvršene korišćenjem genomske DNK izolovane iz kultivisane H. pylori izolovane iz biopsija pacijenata, FliD-ov ORF (otvoreni ram za čitanje, engl. open reading frame) je bio prisutan u skoro svim H. pylori izolatima. Shodno tome, PCR rezultati potvrđuju prisustvo FliD u genomskoj DNK. Na Fig.6, brojevi iznad traka pokazuju interni broj uzorka.

[0217] Pošto je detekcija FliD proteina u uzorcima iz pacijenata koji su bili dijagnostikovani kao H. pylori-pozitivni, FliD protein je mogao biti detektovan u 97.5% uzoraka. Uz korišćenje Vestern blot analize moglo je biti pokazano da je ekspresija FliD proteina detektabilna u 79 od 81 H.pylori proteinskih lizata. Rezultati su prikazani na Fig.7. Na Fig.7 brojevi iznad traka pokazuju interni broj uzorka.

[0218] Specifičnost testa je bila potvrđena pomoću negativnih rezultata kada su proteinski lizati od drugih mikroorganizama bili analizirani pomoću Vestern blot analize. Njihovi rezultati su prikazani na Fig.8. Kao što se može videti sa Fig.8, pored rekombinantnog FliD sa streptavidinskim tagom (trake 2 od oba Vestern Blota) i bez streptavidinskog taga (trake 3 od oba Vestern blota) tu su i proteinski lizati od P. aeruginosa (ATCC 27813) (levo Vestern blot, traka 4), Klebsiella oxytoca (ATCC 700324) (levo Vestern blot, traka 5), Candida albicans (ATCC 90024) (levo Vestern blot, traka 6), Enterococcus faecalis (ATCC 29292) (levo Vestern blot, traka 7), Streptococcus Group A (ATCC 19615) (levo Vestern blot, traka 8), S. thyphimurium (ATCC 13311) (desno Vestern blot, traka 4), S. aureus (ATCC 25923) (desno Vestern blot, traka 5), S. epidermidis (ATCC 18228) (desno Vestern blot, traka 6), H. influensae (ATCC 49247) (desno Vestern blot, traka 7), i E. coli (ATCC 25922) (desno Vestern blot, traka 8).

[0219] U aktuelnom opisu se vrši poziv na različite dokumente iz stanja tehnike, pri čemu je njihova kompletna lista referenci kao što sledi:

Arnold, I. C., Hitzler, I., & Muller, A. (2012). The Immunomodulatory Properties of Helicobacter pylori Confer Protection Against Allergic and Chronic Inflammatory Disorders. Front Cell Infect Microbiol, 2, 10.

Atherton, J. C., Cao, P., Peek, R. M., Jr., Tummuru, M. K., Blaser, M. J., & Cover, T. L. (1995). Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J Biol Chem, 270(30), 17771-17777.

Chen, Y., Wang, J., & Shi, L. (2001). [In vitro study of the biological activities and immunogenicity of recombinant adhesin of Heliobacter pylori rHpaA]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 81(5), 276-279.

Cover, T. L., & Blaser, M. J. (1992). Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori. J Biol Chem, 267(15), 10570-10575. Dunn, B. E., Roop, R. M., 2nd, Sung, C. C., Sharma, S. A., Perez-Perez, G. I., & Blaser, M. J. (1992). Identification and purification of a cpn60 heat shock protein homolog from Helicobacter pylori. Infect Immun, 60(5), 1946-1951.

Eaton, K. A., Suerbaum, S., Josenhans, C., & Krakowka, S. (1996). Colonization of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori deficient in two flagellin genes. Infect Immun, 64(7), 2445-2448.

Franco, A. T., Israel, D. A., Washington, M. K., Krishna, U., Fox, J. G., Rogers, A. B., et al. (2005). Activation of beta-catenin by carcinogenic Helicobacter pylori. Proc Natl Acad Sci U S A,102(30), 10646-10651.

Fusconi, M., Vaira, D., Menegatti, M., Farinelli, S., Figura, N., Holton, J., et al. (1999). Anti-CagA reactivity in Helicobacter pylori-negative subjects: a comparison of three different methods. Dig Dis Sci, 44(8), 1691-1695.

Gao, L., Michel, A., Weck, M. N., Arndt, V., Pawlita, M., & Brenner, H. (2009). Helicobacter pylori infection and gastric cancer risk: evaluation of 15 H. pylori proteins determined by novel multiplex serology. Cancer Res, 69(15), 6164-6170. Goto, T., Nishizono, A., Fujioka, T., Ikewaki, J., Mifune, K., & Nasu, M. (1999). Local secretory immunoglobulin A and postimmunization gastritis correlate with protection against Helicobacter pylori infection after oral vaccination of mice. Infect Immun, 67(5), 2531-2539.

Hay, F. C., Westwood, O. M. R., Nelson, P. N., & Hudson, L. (2002). Practical immunology: Wiley-Blackwell.

Honda, S., Fujioka, T., Tokieda, M., Satoh, R., Nishizono, A., & Nasu, M. (1998). Development of Helicobacter pylori-induced gastric carcinoma in Mongolian gerbils. Cancer Res, 58(19), 4255-4259.

Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., & Yum, J. S. (1999). Molecular cloning and characterization of the Helicobacter pylori fliD gene, an essential factor in flagellar structure and motility. J Bacteriol, 181(22), 6969-6976.

Mittel P. R. E., Luethy L., Reinhardt C., Joller H. (2003). Detection of high titers of antibody against Helicobacter cysteine-rich proteins A, B, C, and E in Helicobacter pylori-infected individuals. Clin. Diagn. Lab. Immunol.10:542-545. Macchia, G., Massone, A., Burroni, D., Covacci, A., Censini, S., & Rappuoli, R. (1993). The Hsp60 protein of Helicobacter pylori: structure and immune response in patients with gastroduodenal diseases. Mol Microbiol, 9(3), 645-652.

Michetti, P., Kreiss, C., Kotloff, K. L., Porta, N., Blanco, J. L., Bachmann, D., et al. (1999). Oral immunization with urease and Escherichia coli heat-labile enterotoxin is safe and immunogenic in Helicobacter pylori-infected adults.

Gastroenterology, 116(4), 804-812.

Montecucco, C., & de Bernard, M. (2003). Molecular and cellular mechanisms of action of the vacuolating cytotoxin (VacA) and neutrophil-activating protein (HP-NAP) virulence factors of Helicobacter pylori. Microbes Infect, 5(8), 715-721. Murata-Kamiya, N., Kurashima, Y., Teishikata, Y., Yamahashi, Y., Saito, Y., Higashi, H., et al. (2007). Helicobacter pylori CagA interacts with E-cadherin and deregulates the beta-catenin signal that promotes intestinal transdifferentiation in gastric epithelial cells. Oncogene, 26(32), 4617-4626.

Oertli, M., Sundquist, M., Hitzler, I., Engler, D. B., Arnold, I. C., Reuter, S., et al. (2012). DC-derived IL- 18 drives Treg differentiation, murine Helicobacter pylorispecific immune tolerance, and asthma protection. J Clin Invest, 122(3), 1082-1096.

Opazo, P., Muller, I., Rollan, A., Valenzuela, P., Yudelevich, A., Garcia-de la Guarda, R., et al. (1999). Serological response to Helicobacter pylori recombinant antigens in Chilean infected patients with duodenal ulcer, non-ulcer dyspepsia and gastric cancer. APMIS, 107(12), 1069-1078.

Pharmacia. (1988). Affinity chromatography LKB Biotechnology Uppsala,

Sweden.

Sambrook, J., Fritsch, E., & Maniatis, T. (1989). Moleculer Cloning: A Laboratory Manuel, Book 1: New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Suerbaum, S., Thiberge, J. M., Kansau, I., Ferrero, R. L., & Labigne, A. (1994). Helicobacter pylori hspA-hspB heatshock gene cluster: nucleotide sequence, expression, putative function and immunogenicity. Mol Microbiol, 14(5), 959-974. Suganuma, M., Kurusu, M., Okabe, S., Sueoka, N., Yoshida, M., Wakatsuki, Y., et al. (2001). Helicobacter pylori membrane protein 1: a new carcinogenic factor of Helicobacter pylori. Cancer Res, 61(17), 6356-6359.

Tomb J. F., et al.1997. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori.Nature, 7; 388(6642):539-47.

Uemura, N., Okamoto, S., Yamamoto, S., Matsumura, N., Yamaguchi, S., Yamakido, M., et al. (2001). Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer. N Engl J Med, 345(11), 784- 789.

Urita, Y., Hike, K., Torii, N., Kikuchi, Y., Kurakata, H., Kanda, E., et al. (2004). Comparison of serum IgA and IgG antibodies for detecting Helicobacter pylori infection. Intern Med, 43(7), 548-552.

Watanabe, S., Takagi, A., Tada, U., Kabir, A. M., Koga, Y., Kamiya, S., et al. (1997). Cytotoxicity and motility of Helicobacter pylori. J Clin Gastroenterol, 25 Suppl 1, S169-171.

Watanabe, T., Tada, M., Nagai, H., Sasaki, S., & Nakao, M. (1998). Helicobacter pylori infection induces gastric cancer in mongolian gerbils. Gastroenterology, 115(3), 642-648.

Yamaoka, Y., Kodama, T., Kita, M., Imanishi, J., Kashima, K., & Graham, D. Y. (1998). Relationship of vacA genotypes of Helicobacter pylori to cagA status, cytotoxin production, and clinical outcome. Helicobacter, 3(4), 241-253.

Yan, J., Liang, S. H., Mao, Y. F., Li, L. W., & Li, S. P. (2003). Construction of expression systems for flaA and flaB genes of Helicobacter pylori and determination of immunoreactivity and antigenicity of recombinant proteins. World J Gastroenterol, 9(10), 2240-2250.

Yan, J., & Mao, Y. F. (2004). Construction of a prokaryotic expression system of vacA gene and detection of vacA gene, VacA protein in Helicobacter pylori isolates and ant-VacA antibody in patients’ sera. World J Gastroenterol, 10(7), 985-990.

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za detekciju H. pylori infekcija kod subjekta, pri čemu postupak sadrži detekciju imune reakcije protiv FliD u uzorku subjekta, pri čemu imuna reakcija sadrži anti-FliD antitelo, pri čemu postupak sadrži reakciju uzorka sa FliD ili njegovog fragmenta, pri čemu fragment ima aminokiselinsku sekvencu koja je dovoljno dugačka da se može identifikovati da fragment predstavlja fragment FliD i da se isključi da fragment predstavlja fragment proteina ili polipeptida različitog od FliD.

2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu postupak sadrži reakciju uzorka sa FliD cele dužine ili njegovim fragmentom, pri čemu fragment predstavlja fragment aminokiselinske sekvence koji je kraći od aminokiselinske sekvence FliD cele dužine, pri čemu je fragment još aktivan kao virulentni faktor.

3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je anti-FliD antitelo IgG antitelo i/ili IgA antitelo.

4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu se detekcija izvodi pomoću ELISE, testa sa bočnim protokom ili linijskog testa.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu postupak dalje sadrži detekciju jednog ili više antigena Helicobactera, a prvenstveno H. pylori, pri čemu su jedan ili više antigena izabrani iz grupe koja se sastoji od CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 i HtrA.

6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvnog seruma, krvne plazme, cele krvi i stolice.

7. Primena kita koji sadrži FliD ili njegov fragment i najmanje jedan drugi konstituent, u postupku prema bilo kom od zahteva 1 do 6,

pri čemu fragment ima aminokiselinsku sekvencu koja je dovoljno dugačka da se identifikuje da fragment predstavlja fragment FliD i da se isključi da fragment predstavlja fragment proteina ili polipeptida različitog od FliD, i pri čemu je najmanje jedan drugi konstituent izabran iz grupe koja se sastoji od pufera, čvrste faze i uputstva za upotrebu.

8. Primena prema zahtevu 7, pri čemu kit sadrži FliD cele dužine ili njegov fragment, pri čemu fragment predstavlja fragment aminokiselinske sekvence koji je kraći od aminokiselinske sekvence FliD cele dužine, pri čemu je fragment još aktivan kao virulentni faktor.

9. Kit podesan za primenu u postupku prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu pomenuti kit sadrži FliD cele dužine ili njegov fragment i najmanje jedan drugi konstituent,

pri čemu fragment predstavlja fragment aminokiselinske sekvence koji je kraći od aminokiselinske sekvence FliD cele dužine, pri čemu je fragment još aktivan kao virulentni faktor, i

pri čemu je najmanje jedan drugi konstituent izabran iz grupe koja se sastoji od pufera, čvrste faze i uputstva za upotrebu.