FI112544B

FI112544B - Menetelmä varhais- ja myöhäisvaiheen Lymen borrelioosin diagnosoimiseksi

Info

Publication number: FI112544B
Application number: FI20012310A
Authority: FI
Inventors: Tero Heikkilae; Pekka Lahdenne; Ilkka Seppaelae; Harri Saxen
Original assignee: Bortech Oy
Priority date: 2001-11-26
Filing date: 2001-11-26
Publication date: 2003-12-15
Also published as: AU2002349059A1; WO2003046561A1; FI20012310A; US20060034862A1; EP1448989A1; CA2468332A1; FI20012310A0

Description

11 / ί;41

Menetelmä varhais- ja myöhäisvaiheen Lymen borrelioosin diagnosoimiseksi Keksinnön ala 5 Keksintö koskee menetelmää Borrelia burgdorferi sensu lato -infektion tai Borrelia-lajia vastaan muodostuvien vasta-aineiden toteamiseksi epäillyn infektoituneen tai rokotetun ihmisen tai muun nisäkkään ruumiin nesteestä, diagnoosipakkausta, joka on käyttökelpoinen mainitussa menetelmässä, sekä immuunimääritysmenetelmää varhaisvaiheen ja myöhäisvaiheen Lymen borrelioosin (LB) diagnosoimiseksi. Keksinnön mukaisille menetelmil-10 le on tunnusomaista, että antigeeneinä käytetään yhdistelmä-BBK32-proteiineja, muita immunogeenisia borrelian proteiineja, ja/tai näiden fragmentteja.

Keksinnön taustaa 15 LB on punkin levittämä, Borrelia burgdorferin aiheuttama spirokeettainfektiotauti, jolle ovat tunnusomaisia moniasteiset ihon, nivelten, neurologiset ja sydämen oireet [1], LB:n diagnoosi perustuu potilaiden kliiniseen arviointiin, mutta B. burgdorferi -infektion osoittamisen vahvistamiseen käytetään usein serologisia määrityksiä, yleisimmin ELISA- (enzyme-linked immunosorbent assay) ja Western blotting (WB) -määrityksiä. Nykyisissä 20 rutiininomaisissa LB:n serodiagnostisissa testeissä pääasiallisesti käytetyt antigeenit ovat . *, borrelian flagelliiniproteiini tai in vitro -viljeltyjen mikrobien kokosolulysaatti (WCL, . .: whole-cell lysate). Yhdysvaltojen Centers for Disease Control on suositellut positiivisille : v. tai rajatapaustuloksille kaksivaiheista lähestymistapaa, jossa ELISA varmistetaan ko- :' - · kosolulysaatin Western blottauksella [2]. Erityisesti Euroopassa tämän menettelytavan 25 käyttökelpoisuus on pysynyt kyseenalaisena [3], mikä johtuu pääasiassa siitä, että on ole- ; ; massa kolme ihmisen LB:tä aiheuttavaa B. burgdorferi sensu lato lajia, B. burgdorferi sen su stricto, B. afzeliija B. garinii [4], Näiden ongelmien yhtenä pääsyynä on antigeeninen ; : diversiteetti, mikä johtuu sekvensseissä ja immunogeenisten proteiinien ilmentymisessä •, ,: esiintyvistä variaatioista näillä eri borrelialajeilla [3, 5], Useat muut hankaluudet mutkista- I 30 vat nykyistä LB-serologiaa. LB-potilailla, joilla esiintyy varhaisvaiheen oireita, joita ovat : ’ ‘ ’; esimerkiksi vaeltava punoitus eli erythema migrans (EM) ja kasvohalvaus, vasta- : t ainevasteet nykyisiä antigeenejä vastaan saattavat olla heikkoja tai ne tulevat esiin viiveellä : [6], Näin ollen varhaisvaiheen LB:n serologinen varmistus on ongelmallista nykyisten se- rodiagnostisten määritysten herkkyysongelmien vuoksi. Jopa myöhäisvaiheen LB:ssä 5-10 A i' "" /1 /.

2 I

%:lla potilaista vasta-ainetasot eivät välttämättä kohoa [7]. Kolmanneksi virusinfektiot aiheuttavat vääriä positiivisia useissa LB-testeissä IgM-vasta-aineille [8]. Lisäksi osalla potilaista vasta-ainetasot saattavat pysyä korkeina pitkiä aikoja onnistuneen LB-hoidon jälkeen.

5

Myös horrehan proteiinien ilmentyminen vaihtelee Borrelian elinkierron eri vaiheissa puutiaisissa ja nisäkäsisännissä. Useiden geenien, esimerkiksi bbk32:n, bbk50:n, vA:n ja os-pZs/F-homologien [9-11], on osoitettu ilmentyvän selektiivisesti in vivo. Lisäksi bbk32\n ilmentyminen voidaan todeta spirokeetoissa puutiaisen ruokaillessa jopa ennen isäntään 10 siirtymistä, mutta ei puutiaisissa, jotka eivät ole ruokailleet [12]. Näin ollen voidaan esittää hypoteesi, että jos BBK32-proteiini olisi immunogeeninen, se saattaisi olla käyttökelpoinen serodiagnostinen antigeeni varhaisvaiheen LB:lle. Kahdessa aikaisemmassa tutkimuksessa BBK32:ta vastaan muodostuneita vasta-aineita havaittiin niiden B. burgdorferi sensu stricto -infektoituneiden hiirten ja ihmispotilaiden seerumeista, jotka sairastivat levinnyttä 15 LB:tä [9, 13]. Toistaiseksi BBK32-proteiinien antigeenisiä ominaisuuksia muissa B. burgdorferi sensu lato -lajeissa ei tunneta.

ELISA-määritysten suorituskykyä ovat parantaneet B. burgdorferin spesifisten yhdistel-mäproteiinien käyttö, joita ovat esimerkiksi solun ulkopinnan A-proteiini (OspA, outer 20 surface protein A), OspB, OspC, OspE, OspF, P22, P39, P100, VlsE ja flagelliini [14-16]. Eri B. burgdorferi -alalajien infektoimien potilaiden immuunivasteet vaihtelevat kuitenkin suuresti, ja eräät antigeenit eivät välttämättä aina ilmene isännissä tai niitä ei tunnisteta immunologisesti. Siten herkkyys yksittäisillä yhdistelmäantigeeneillä on toistaiseksi edel-! leen riittämätöntä. Toinen lähestymistapa LB:n serodiagnostiikan parantamiseksi on ollut 25 tietyistä borrelian proteiineista peräisin olevien peptidien käyttö antigeeneinä, ja tällaisia ovat esimerkiksi C-terminaalinen dekapeptidi OspC:stä [17] ja peptidi, joka vastaa VlsE-proteiinin keskeistä muuttumatonta aluetta, muuttumatonta aluetta 6, IR 6 (invariable region 6) [18]. Aivan äskettäin serodiagnostisiksi antigeeneiksi on ehdotettu myös kimeerisiä proteiineja, jotka sisältävät OspA:n, OspB:n, OspC:n, flagelliinin ja p93:n epitooppeja ’ 30 [19].

' Kirjallisuudessa BBK32-proteiinia on kutsuttu myös P35:ksi [9, 13, 20] ja 47 kilodaltonin fibronektiinin sitojaproteiiniksi [21].

3 11.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Keksijöiden tarkoituksena oli testata borrelian proteiinin BBK32 antigeeninen kykyjä kehittää luotettava immuunimääritysmenetelmä varhaisvaiheen ja levinneen LB:n serodiag-5 nostiikkaan. Ihmisen LB:tä aiheuttavien kaikkien patogeenisten borrelialajien kattamiseksi keksijät sekvensoivat ja kloonasivat bbk32:n kahdeksasta isolaatista, jotka oli eristetty kolmesta patogeenisestä borrelialajista, B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii ja B. garinii. BBK32-proteiinien aminohapposekvenssien samankaltaisuus B. burgdorferi sensu stricton, B. afzeliin ja B. garinin välillä oli 71-100 %. Kukin variantti-BBK32-yhdistelmäproteiini 10 testattiin LB-serologiassa käyttämällä seeruminäytteitä, jotka olivat peräisin sekä varhaisvaiheen että myöhäisvaiheen LB:tä sairastavista potilaista. IgG:n Western blottauksessa (WB) tai ELISA-määrityksessä (enzyme-linked immunosorbent assay) 23 ilta erythema migransia (EM) sairastavalta potilaalta saaduista akuutti- ja toipumisvaiheen näytteistä 74 % ja 100 % oli positiivisia B. afzeliista peräisin olevalle yhdistelmä-BBK32-proteiinille.

15 Levinneen LB:n serologiassa kolme variantti-BBK32-antigeeniä reagoivat ristiin. Yhteensä IgG-ELISAn herkkyys ylsi 100 %:iin. Tulokset osoittavat, että BBK32-proteiinit ovat käyttökelpoisia serodiagnostisia antigeenejä LB:n varhaisvaiheessa ja levinneessä vaiheessa, mutta jotta kaikki relevantit borrelialajit tulevat katetuiksi, variantti-BBK32-proteiineja tai niiden fragmentteja tulisi käyttää LB:n immuunimäärityksessä rinnakkain tai yhdistet-,,, 20 tynä.

, Näin ollen keksinnön kohteena on aikaansaada uusi menetelmä Borrelia burgdorferi sensu . lato -infektion tai Borrelia-lajia vastaan muodostuvien vasta-aineiden toteamiseksi epäillyn J infektoituneen tai rokotetun ihmisen tai muun nisäkkään ruumiin nesteestä, jossa menetel- 25 mässä yhdistelmä-BBK32-proteiineja tai niiden fragmentteja, jotka sisältävät antigeenisiä epitooppeja yhdestä tai useammasta Borrelia-lajista, käytetään antigeeneinä immuunimäärityksessä.

Keksinnön ja tämän selityksen piirissä "fragmentilla" tarkoitetaan geenitekniikalla tuotet-30 tua fragmenttia, joka sisältää kyseis(t)en immunogeenis(t)en proteiini(e)n antigeenisiä epitooppeja.

Keksinnön mukaisessa edullisessa suoritustavassa immuunimäärityksessä käytetään antigeeneinä yhdistelmä-BBK32-proteiineja tai niiden fragmentteja yhdessä minkä tahansa 4 112:-44 muiden sellaisten immunogeenisten proteiinien tai niiden fragmenttien kanssa, jotka ovat peräisin yhdestä tai useammasta Borrelia-lajista. Esimerkkejä muista immunogeenisista borrelian proteiineista, joita keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää, ovat näihin rajoittumatta solun ulkopinnan A-proteiini, (OspA, outer surface protein A), OspB, 5 OspC, OspE, OspF, P22, P39, PI00, VlsE, DbpA ja/tai flagelliini, edullisesti DbpA.

Edullisesti yhdistelmä-BBK32-proteiinit, valinnaiset muut immunogeeniset proteiinit, tai näiden fragmentit ovat peräisin vähintään kahdesta Borrelia-lajista, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu lajeista B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii ja B. garinii, edullisem-10 min kaikista kolmesta edellä mainitusta Borrelia-lajista.

Alan asiantuntijoille on selvää, että keksinnön mukaisessa menetelmässä antigeeneinä voidaan käyttää borrelian proteiinien tai niiden fragmenttien asemesta tai yhdessä niiden kanssa myös peptidejä tai polypeptidejä (joita kutsutaan tässä peptideiksi), so. lyhyempiä ami-15 nohappopätkiä, jotka sisältävät vähintään kaksi, tavallisesti useampia aminohappoja. Mahdollista on myös tehdä yhdistelmä useista fragmenteista tai peptideistä, jotka ovat peräisin eri immunogeenisistä borrelian proteiineista, ja käyttää niitä antigeeneinä.

Yhdistelmä-BBK32-proteiineja, valinnaisia muita immunogeenisiä proteiineja tai niiden 20 fragmentteja käytetään antigeeneinä joko rinnakkain tai yhdistelmänä immuunimäärityk-sessä. Kun yhdistelmä-BBK32-proteiineja käytetään "rinnakkaisina" antigeeneinä, vasta-aineet mitataan erikseen eri Borrelia-lajeista peräisin olevia yhdistelmä-BBK32-antigeenejä vastaan samassa määrityksessä. On myös mahdollista yhdistää yhdistelmä-BBK32, muita immunogeenisiä borrelia-antigeenejä tai niiden fragmentteja eri Borrelia-• s 25 lajeista ja mitata vasta-aineet "yhdistettyä" BBK32-antigeeniä vastaan. Esimerkiksi rinnakkaisessa määrityksessä samassa määrityksessä käytetään edullisesti kolmea yhdistelmä-BBK32-proteiiniantigeeniä kolmesta Borrelia-lajista. Yhdistetyssä määrityksessä edullisesti kolme yhdistelmä-BBK32-proteiinia kolmesta Borrelia-lajista yhdistetään yhdistetyn BBK32-proteiiniantigeenin muodostamiseksi.

’ / 30

Keksinnön piirissä "immuunimäärityksen" tarkoitetaan pitävän sisällään kaikki alan asian-’ tuntijoiden tuntemat immuunimääritysmenetelmät.

5 112:-44

Keksinnön mukainen menetelmä Borrelia burgdorferi sensu lato -infektion tai Borrelia-lajia vastaan muodostuvien vasta-aineiden toteamiseksi epäillyn infektoituneen tai rokotetun ihmisen tai muun nisäkkään ruumiin nesteestä sisältää edullisesti vaiheet: a) ruumiin neste saatetaan yhteyteen yhdestä tai useammasta Borrelia-lajista peräisin ole-5 vien yhdistelmä-BBK32-proteiinien, valinnaisten muiden immunogeenisten proteiinien tai niiden fragmenttien kanssa olosuhteissa, jotka tehokkaasti mahdollistavat antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostumisen; ja b) todetaan muodostuneet kompleksit.

10 Ruumiin neste on edullisesti seerumi-, plasma-, kokoveri-, aivo-selkäydinneste- tai nivel-nestenäytettä.

Olosuhteet, jotka tehokkaasti mahdollistavat antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostumisen samoin kuin keinot muodostuneiden kompleksien toteamiseksi valitaan määritykses-15 sä käytettävien vasta-aineiden ja muiden reagenssien mukaan, ja ne ovat alan asiantuntijalle tunnettuja.

Vielä keksinnön kohteena on aikaansaada diagnoosipakkaus, joka on käyttökelpoinen Borrelia burgdorferi sensu lato -infektion tai Borrelia-lajia vastaan muodostuvien vasta-20 aineiden toteamiseen epäillyn infektoituneen tai rokotetun ihmisen tai muun nisäkkään ruumiin nesteestä, mainittu pakkaus sisältää sopivassa säiliössä ,, . a) yhdestä tai useammasta Borrelia-lajista peräisin olevia yhdistelmä-BBK32-proteiineja, i * ’, '. valinnaisia muita immunogeenisiä proteiineja, tai näiden fragmentteja ja toteamisen mah- ' j dollistavaa leimaa tai merkkiainetta, joka on yhdistetty mainittuihin proteiineihin ja/tai , ·. _ 25 niiden fragmentteihin, tai • * * ( . φ b) yhdestä tai useammasta Borrelia-lajista peräisin olevia yhdistelmä-BBK32-protenneja, ; V, valinnaisia muita immunogeenisiä proteiineja, tai näiden fragmentteja ja toista vasta- ,'1 ·. ainetta, joka on liitetty mihin tahansa toteamisen mahdollistavaan leimaan tai merkkiainee- , ', seen.

1 ' * ‘':,' 3o

Toteamisen mahdollistavat leimat tai merkkiaineet sekä menetelmät, joilla ne liitetään an-

> I

' · ‘ tigeeneihin tai toisiin vasta-aineisiin, on kuvattu hyvin kirjallisuudessa ja ne ovat myös ' ' tuttuja immuunimääritysalan asiantuntijoille.

1 ' ' / / 6 ' f

Vielä keksinnön kohteena on immuunimääritysmenetelmä varhaisvaiheen ja myöhäisvaiheen Lymen borrelioosin diagnosoimiseksi, jossa menetelmässä: a) ihmisestä tai muusta nisäkkäästä saatu ruumiin neste saatetaan yhteyteen yhdestä tai useammasta Borrelia-\a]\sXa peräisin olevien yhdistelmä-BBK32-proteiinien, valinnaisten 5 muiden immunogeenisten proteiinien, tai näiden fragmenttien kanssa olosuhteissa, jotka tehokkaasti mahdollistavat antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostumisen; ja b) todetaan muodostuneet kompleksit.

Vielä eräänä keksinnön kohteena on aikaansaada uusi menetelmä Borrelia burgdorferi 10 sensu lato -infektion tai Borrelia-lajia vastaan muodostuvien vasta-aineiden toteamiseksi epäillyn infektoituneen tai rokotetun ihmisen tai muun nisäkkään ruumiin nesteestä, jossa menetelmässä yhdistelmä-BBK32-proteiineja ja yhdistelmä-dekoriininsitojaproteiinia A (DbpA, decorin binding protein A) vähintään kahdesta, edullisesti kolmesta Borrelia-lajista käytetään yhdessä antigeeneinä immuunimäärityksessä. Dekoriinin sitojaproteiini A 15 on borrelian ulkopinnan proteiini, jonka on ehdotettu toimivan LB:n lajispesifisenä sero-diagnostisena antigeeninä samanaikaisesti vireillä olevassa hakemuksessa. Keksinnön mukaisessa edullisessa suoritustavassa yhdistelmä-BBK32-proteiinit ja yhdistelmä-DbpA:t ovat peräisin lajeista B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii ja B. garinii.

20 BBK32-proteiinin vasta-aineet näyttävät ilmaantuvan hyvin varhain ihmisen LB:ssä.

t * ' * > Akuutin vaiheen EM-potilaista 74 %:lla voitiin todeta IgG-vasta-aineita BBK32:ta vastaan ELISAlla ja/tai WB:llä. Seurannan aikana onnistuneen antibioottihoidon jälkeen kaikki 1, , potilaat olivat anti-BBK32-vasta-ainepositiivisia. Äskettäin suoritettu tutkimus raportoi bbk32:n kloonauksen B. burgdorferi sensu stricto -isolaatista ja siinä osoitettiin varhaiset t 25 vasta-ainevasteet yhdistelmä-BBK32-proteiinia vastaan kokeellisessa hiiren borrelioosissa [9]. Myös käänteistranskriptaasi-PCR-tutkimukset ovat osoittaneet bbk32-ilmentymisen kolmen potilaan EM-leesioista, mikä osoittaa sen, että ihmisen Lymen borrelioosissa bbk32 ilmenee varhain [20], Aikaisemmin ei ole kuitenkaan tutkittu BBK32:ta vastaan muodostuvia vasta-ainevasteita potilailla, joilla on varhainen paikallinen EM.

30

Nykyisellä LB-serologialla, joka perustuu pääasiassa flagelliinin käyttöön antigeeninä, * ' IgM- ja IgG-vasta-aineita ei voida todeta ELISAlla eikä immunoblottausmäärityksillä en nen kuin sairauden puhkeamisesta on kulunut 2-4 tai 6-8 viikkoa [6]. Paikallisen varhaisvaiheen LB:n aikana IgM-ELISAn herkkyys ylittää harvoin 50 % [6,22-24]. Sellaisten

1 V

7 ! ί . * potilaiden tutkimus, joiden EM oli viljelyllä varmistettu, osoitti, että positiivinen serologia diagnoosihetkellä ja serokonversion nopeus (rate of seroconversion) korreloivat suoraan sairauden keston kanssa [25]. Jos EM-leesio oli ilmaantunut alle 7 päivää ennen näytteenottoa, vain 10 %:lla potilaista esiintyi vasta-aineita ELISAssa, kun taas niillä potilailla,

5 joiden EM oli ilmaantunut 7-14 päivää aikaisemmin, 58 %:lla voitiin todeta vasta-aineita. Myös äskettäin suoritetussa tutkimuksessa, jossa raportoitiin anti-BBK32-vasta-aineista levinneessä LB:ssä, osoitettiin IgG-BBK32-vasta-aineita 84 %:lla potilaista, joilla oli EM

[13]. Kuitenkin näillä potilailla EM-leesio oli ollut 2 viikosta 3 kuukauteen sairauden puhkeamisen jälkeen, mikä viittaa LB:n leviämiseen. Käsillä olevassa Saijassa EM-leesion 10 ilmaantumisaikaa ei voitu täsmällisesti määrittää. Kuitenkin koska flagelliinia kohtaan muodostuvan seropositiivisuuden osuus oli alhainen EM:n diagnoosihetkellä (17-26 %), ja koska väestöllä on hyvä tietämys LBrstä alueilla, joissa LB:tä esiintyy endeemisenä Suomessa, voidaan olettaa, että useimmissa tapauksissa EM-leesiot edustivat varhaisvaiheen sairautta. Siitä syystä nämä tulokset viittaavat siihen, että IgG-vasta-aineiden määritys, 15 vaikkakaan ei IgM-vasta-aineiden määritys, BBK32-proteiineja vastaan tarjoaa huomattavan parannuksen varhaisvaiheen LB:n serodiagnostiikkaan. BBK32-proteiinia kohtaan muodostuva vasta-ainevaste näyttää myös edeltävän humoraalista vastetta in vitro -kasvatettuja mikrobeja vastaan (kokosolulysaatti, WCL), jotka eivät välttämättä syntetisoi tätä in vivo -ilmentyvää proteiinia [9, 21].

20

Vain muutamissa tutkimuksissa on arvioitu BBK32-proteiinin antigeenisiä ominaisuuksia. Näissä tutkimuksissa BBK32-proteiinit olivat peräisin amerikkalaisista B. burgdorferi sen-; su stricto -kannoista [13,20], Keksinnön edullisessa suoritustavassa LB:n serodiagnostii- kassa käytetään variantti-yhdistelmäproteiineja, jotka ovat peräisin kolmesta patogeenises-. , 25 ta borrelialajista, B. burgdorferi sensu stricto, B. afzeliija. B. garinii. Paikallisesta B. afzelii -isolaatista peräisin oleva yhdistelmä-BBK32 näytti olevan ylivoimainen muihin yhdistel-v. mä-BBK32-proteiineihin verrattuna EM:n diagnosointiin. Tämä havainto sopii yhteen EM- : ihokoepaloista tehdyn PCR:n tulosten kanssa, joissa suurin osa infektoineista lajeista osoit tautui B. afzeliiksi. Nämä havainnot sopivat yhteen myös kahden viimeaikaisen eurooppa-30 laisen tutkimuksen kanssa, joissa yli 90 % EM-leesioista saaduista Zto/re/rär-isolaateista oli B. afzeliita, alle 10 % oli B. gariniita eikä yhtään B. burgdorferi sensu stricto -kantaa [26, 27]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että variantti-BBK32-proteiinit ovat edullisia monenlaisissa epidemiologisissa tilanteissa varhaisvaiheen paikallisen EM:n serodiagnostiikkaan.

8 11'--

Vaikka EM-potilaan seerumien immunoreaktiivisuus variantti-BBK32-proteiineja vastaan vaihteli, kolme yhdistelmä-BBK32-antigeeniä reagoi ristiin levinneen LB:n serologiassa. Lisäksi serologisten vasteiden voimakkuudet variantti-BBK32-proteiineja vastaan, mikä määritettiin OD-arvoilla ELISAssa, korreloivat hyvin. Siitä syystä nämä tulokset osoitta-5 vat, että variantti-BBK32-proteiineilla saattaa olla sekä spesifisiä että yleisiä antigeenisiä epitooppeja. Eurooppalaisissa epidemiologisissa tutkimuksissa vallitsevimmat Borrelia-lajit ovat olleet B. afzelii ja B. garinii [28], B. burgdorferi sensu stricto on esiintynyt harvinaisesta erityisesti Skandinaviassa [27, 29]. Eurooppalaisten neuroborrelioositapausten aivo-selkäydinnäytteistä useimmiten eristetty laji on ollut B. garinii [30]. Se hypoteesi, että 10 epitooppispesifisyys vaihtelee varhaisvaiheen ja myöhäisvaiheen LB:ssä käy yksiin B. burgdorferi sensu laton kahdeksan suomalaisen isolaatin BBK32-sekvenssien analyysin kanssa, jossa analyysissä osoitettiin yli 90 %:n samankaltaisuus B. burgdorferi sensu stric-ton ja B. gariniin sekvenssien välillä. Sitä vastoin B. a/ze/zz-kantojen ja muiden lajien BBK32-sekvenssien välinen samankaltaisuus oli noin 70 %.

15

Levinneen LB:n serodiagnostiikassa BBK32-antigeenia on arvioitu vain rajallisessa potilasmäärässä toistaiseksi [9,13]. Fikrig ym. [9] raportoivat korkeita IgG-vasta-aineita BBK32:ta vastaan 3 potilaalla 3:sta, joilla oli neuroborrelioosi, ja 3 potilaalla 7:stä, joilla oli Lymen artriitti.

20 ’ , Akin ym. [13] osoittivat IgG-vasteet BBK32:ta vastaan 83-92 %:lla 25:stä Lymen artriitti- .. potilaasta. Keksinnön edullinen suoritustapa, jossa antigeeneinä käytetään kolmea variant- ‘. ti-BBK32-proteiinia, parantaa ELISAn herkkyyden 100 %:iin asti. Neuroborrelioosin sero- ' · diagnostiikassa kaikki tapaukset yhtä lukuun ottamatta olisi todettu BBK32-antigeenin 25 alkuperästä huolimatta. Sen sijaan, erityisesti Lymen artriitin ELISAssa yksittäisen * * BBK32-antigeenin käyttö olisi jättänyt herkkyyden 80-90 %:iin. Satunnaiset ristiriidat : WB:n ja ELISAn tulosten välillä saattavat johtua eroavuuksista antigeenin ja/tai antigeeni- vasta-ainekompleksin muodostumisen orientaatiossa.

30 Yhteenvetona keksijät ovat osoittaneet, että BBK32-proteiinit ovat käyttökelpoisia antigeeneinä sekä varhaisvaiheen että myöhäisvaiheen LB:n serologiassa. B. afzeliista peräisin oleva BBK32 osoittautui herkäksi EM:n antigeeniksi jo diagnoosihetkellä. Infektion etenemisen aikana herkkyys lisääntyi niin, että se oli jopa 100 % EM-potilaiden toipilasajan näytteissä. On selvää, että variantti-BBK32-proteiineja tulisi käyttää joko rinnakkain tai 9 11 1. Γ /? ; yhdistettynä LB:n immuunimäärityksessä kaikkien sellaisten relevanttien borrelialajien kattamiseksi, joiden vallitsevuus vaihtelee alueellisesti Euroopassa.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä sitä kuitenkaan rajoittamatta.

5

Esimerkit

Bakteerikannat. Suomalaiset borreliakannat saatiin Kansanterveyslaitokselta Turusta. B. burgdorferi sensu stricto -kanta ia (johon viitataan tässä lyhenteellä Bbia) eristettiin suo-10 malaisen neuroborrelioosia sairastavan potilaan aivo-selkäydinnesteestä. B. afzeliin kannoista A91 ja 1082 (viitataan tässä lyhenteillä BaA91 ja Bal082) eristettiin erythema mig-ransia (EM) sairastavien suomalaisten potilaiden ihokoepaloista, ja 570 ja 600 (viitataan tässä lyhenteillä Ba570 ja Ba600) eristettiin puutiaisista. B. garinii -kannat 40,46 ja 50 (viitataan lyhenteillä Bg40, Bg46 ja vastaavasti Bg50) eristettiin EM:ää sairastavien suo-15 malaisten potilaiden ihokoepaloista. Viljeltyjen positiivisten Borrelioiden genotyypit varmistettiin sekvensoimalla flagelliinigeenin fragmentti [29]. Borreliaeta viljeltiin BSK-H-(Barbour-Stoenner-Kelly) -elatusaineessa (Sigma, Yhdysvallat) 33 °C:ssa 5-prosenttisessa ecussa. B. afzelii -kantaa SK1 käytettiin in-house ELISA-määrityksessä borrelian ko-kosolulysaattia vastaan muodostuvien vasta-aineiden toteamiseksi. Escherichia coli 20 -isäntäsolut yhdistelmäproteiinien kloonaukseen ja ilmentämiseen olivat INFaF-soluja (In-vitrogen, Alankomaat) ja vastaavasti BL21 -soluja (Amersham Pharmacia Biotech, Ruotsi).

, DNA:npuhdistus. Borrelian genominen DNA puhdistettiin Dneasy Tissue Kit . -pakkauksella (Qiagen, Saksa). Puhdistettua DNA:ta käytettiin PCR- ja kloonauskokeissa.

25 Plasmidi-DNA puhdistettiin QIAprep-spin plasmid -pakkauksella (Qiagen, Yhdysvallat).

PCR ja DNA-sekvensointi. PCR:ään perustuvaa lähestymistapaa käytettiin monistamaan ja . sekvensoimaan bbk32-alleelit B. burgdorferi sensu laton kahdeksasta eri isolaatista. Aluk- keet bbk32:n sekvensointiin suunniteltiin julkaistujen 6MJ2-sekvenssien perusteella (tau-30 lukko 1). Useita alukepareja suunniteltiin ja testattiin sen varmistamiseksi, että saatiin bbk32\n koko koodaussekvenssi. Mahdollisten Taq-polymeraasin aiheuttamien virheiden poistamiseksi kaksi juostetta jokaisesta bbk32:sta sekvensoitiin toisistaan riippumatta vähintään kahdesti. Jokaiselle kannalle valittiin analysoiduista sekvensseistä ilmentymisaluk-keet, jotka koodasivat BBK32-proteiinin kypsää osaa posttranslaation asylaatiokohdan 1 ί - r /! ·: ίο I ι«. · kysteiinin jälkeen. Jokaisen borreliakannan kohdalla bbk32-sekvenssit muodostettiin B. burgdorferin genomisen DNA:n PCR-monistuksella. Käytettiin noin 1 ng templaatti-DNA:ta standardeissa PCR-olosuhteissa: 30 sykliä ohjelmalla denaturointi 94 °C 1 minuutin ajan, emäspariutuminen 50 °C 1 minuutin ajan ja alukkeenpidennys 72 °C 1 minuutin ja 5 30 sekunnin ajan käyttämällä AmpliTaqGold DNA-polymeraasia (Perkin Elmer, Yhdys vallat). PCR:llä monistetut täysipituiset tai osittaiset bbk32:t kloonattiin pCR 2.1-TOPO-vektoriin (Invitrogen, Alankomaat) sekvensointia varten. DNA-sekvensointi suoritettiin Haartman-instituutin, Helsingin yliopisto tiloissa DyePrimer (T7, M13Rev) syklisekven-sointipakkauksella (Applied Biosystems Inc., Yhdysvallat). Sekvensointireaktiot ajettiin ja 10 analysoitiin automaattisella sekvensointilaitteella mallilla 373A (Applied Biosystems Inc., Yhdysvallat). DNA-ja proteiinisekvenssit analysoitiin Lasergene-ohjelmistolla (DNAS-TAR, Yhdysvallat).

'»rt ! 1 Λ ' . ν- /> i \ ί / ;' ' *; n ' .......

TAULUKKO 1. Alukkeet, joita käytettiin bbk32-geenien PCR-monistukseen

Nro Laji Aluke 5-3' Sijainti Lähde ϊ B. burgdorferi CAC CCT CTT GAT AGC ACT TA -203 - -184 B31(AF000788) 2 sensustricto CTT TAA AGG AGA GAA AGC ATG -18-3 Bbia(AF472532) 3 CCG GAT CCG ATT TAT TCA TAA GAT ATG AAA T 60-82 Bbia 4 GCA ATC TGA GAC TAG AAA AG 329-348 Bbia 5 TGC AGT CTT TAC ACT TAC TT 879-860 Bbia 6 CCC TCG AGA TT A GTA CCA AAC GCC ATT 1084-1065 Bbia 7 ACA TAT TAT GTA GCC TGT TTT A 1122-1101 B31 2 B. earinii CTT TAA AGG AGA GAA AGC ATG rfkä Bbia 3 CCG GAT CCG ATT TAT TCA TAA GAT ATG AAA T 60-82 Bg40(AF472529) 4 GCA ATC TGA GAC TAG AAA AG 329-348 Bg40 5 TGC AGT CTT TAC ACT TAC TT 879-860 Bg40 8 CCC TCG AGA GTA CCA AAT GCC ATT CT 1084-1064 Bg40 7 ACA TAT TAT GTA GCC TGT TTT A 1122-1101 B31 2 B. afzelii CTT TAA AGG AGA GAA AGC ATG -ΠΓ3 Bbia 9 CCG GAT CCG ATT TAT TCA TAA GAG ATG AAA T 57-79 BaA91(AF472525) 10 TGA GCA TAA AAG GAT GCT TC 369-387 BaA91 11 GCA GTC CTT GCA CTC ACT 855-838 BaA91 12 CCC TCG AGC AAA GAT TAG TAC CAA ACA C 1065-1046 BaA91 7 ACA TAT TAT GTA GCC TGT TTT A 1122-1101 B31 5 Restriktioentsyymikohdat BamHIrlle ja XhoI:lle ilmentymisalukkeissa on alleviivattu.

Alukkeita 2 ja 7 käytettiin kaikissa kannoissa.

Alukkeita 3, 4 ja 5 käytettiin sekä B. burgdorferi sensu stricton että B. gariniin PCR-monistuksissa. 1

Yhdistelmä-BBK32:n kloonaus ja ilmentyminen. Yhdistelmä-BBK32:n (rBBK32) ilmen- * 10 tämiseksi muodostettiin glutationi-S-transferaasi- (GST) -fuusioproteiinikonstruktit.

. ‘ BBK32:n kypsää osaa koodaava PCR.llä monistettu DNA kloonattiin pCR 2.1 -TOPO- plasmidiin (Invitrogen, Alankomaat). Yhdistelmäplasmidi puhdistettiin ja pilkottiin Bam-HI- ja Xhol-restriktioentsyymeillä. Sitten pilkottu bbk32 liitettiin samalla tavalla pilkottuun pGEX-4T-1 -ilmentämisplasmidiin (Amersham Pharmacia Biotech, Ruotsi) ja transformoi-: 15 tiinii. coli BL21 -isäntäsoluihin. Yhdistelmä-GST-BBK32-proteiinin ilmentyminen suori- · tettiin valmistajan (Amersham Pharmacia Biotech, Ruotsi) ohjeiden mukaisesti. GST- ; rBBK32-fuusioproteiinin ilmentyminen ja puhtaus varmistettiin natriumdodekyylisulfaatti- : polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE).

1-·: , h t

Western blot -analyysi. GST-rBBK32:t Bbia:sta, BaA91:stä ja Bg40:stä (kutsutaan tässä nimillä rBBK32Bbia, rBBK32BaA9i tai vastaavasti rBBK32Bg4o) fraktioitiin 10-prosenttisella SDS-PAGElla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (BioRad, 0,2 μιη:η huokoskoko, Yhdysvallat) puolikuivalla siirrolla käyttämällä 40 mM glysiini - 50 mM Tris (pH 9,0) - 0,375 % 5 (w/v) SDS - 20 % (v/v) metanolipuskuria. Yhtä suuret määrät jokaista GST-rBBK32:ta käytettiin yhteen 7 cm leveään nitroselluloosakalvoon. Kahden millimetrin suikaleet nitro-selluloosakalvoista upotettiin 0,1 % Tween 20:een, 0,9 % NaCl. Seeruminäytteet laimennettiin 0,1 % Tween 20:een, 0,9 % NaCl, 0,1 g/1 rasvatonta lehmänmaitojauhetta (Valio, Suomi). Näytteitä inkuboitiin 1:100-laimennoksena 2 tunnin ajan. Neljän puskurilla suori-10 tetun huuhtelun jälkeen Western blotteja inkuboitiin alkaliseen fosfataasiin konjugoidulla kanin anti-ihmis-IgG:llä (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., Yhdysvallat) suhteessa 1:5000 2 tunnin ajan. Pesun jälkeen vyöhykkeet visualisoitiin 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaattinitro-sini-tetratsoliumilla (Sigma Chemical Co., Yhdysvallat). Reaktio päätettiin 10-15 minuuttia myöhemmin pesemällä tislatulla vedellä. WB-tulokset analysoi-15 tiin ohjelmistolla MacBAS 2.5 (Fuji, Japani) ja positiivisuuden raja IgG WB-tulokselle määriteltiin terveiden verenluovuttajien arvojen keskiarvona + 3 keskihajonta (SD, standard deviation). GST:n toteamiseen käytettiin monoklonaalisia anti-GST-vasta-aineita (Sigma, Yhdysvallat).

20 ELISA. ELISA-analyysit anti-flagelliinivasta-aineille tehtiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti sanottuna IgG-vasta-aineet B. burgdorferia vastaan mitattiin kaupallisella flagelliiniin perustuvalla ELISA-pakkauksella (Dako, Tanska), joka oli modifioitu vasta- . aineiden titrauksella. Seerumit laimennettiin sarjassa kolmessa vaiheessa testiin ja ne pan- | tiin levyille yli yön inkubointiin. Sitoutuneet vasta-aineet todettiin biotiinilla leimatulla *. 25 vuohen anti-ihmis-IgG:llä (Zymed, Yhdysvallat). Lopputiitteri saatiin optisen tiheyden * tasolla, joka määritettiin pakkauksen tarjoamalla positiivisella kontrollilla. Tiitteriraja posi-. tiiviselle IgG-vasta-ainetasolle oli 500. Positiivisen kontrollin kontrollimateriaali vastasi sellaisen vertailuväestön keskiarvoa + 3 SD tason kanssa, joka asuu Keski-Suomessa, jossa LB:n yleisyys on alhainen [31].

30

Anti-BBK32-vasta-aineita mittaavia ELISA-määrityksiä varten mikrotitterilevyn kuopat päällystettiin 100 piillä (2 pg/ml) variantti-BBK32-yhdistelmäproteiineja yli yön. Pesun jälkeen kuoppiin lisättiin 100 μΐ laimennettuja seeruminäytteitä ja inkuboitiin yli yön. Seeruminäytteet laimennettiin 1:10 (EM) tai 1:100 (neuroborrelioosi ja Lymen artriitti) 5 A f- >' 13 1 »'· '-:i: mg/ml naudan seerumin albumiinissa (BSA) 0,155 M NaCl - 0,04 % Tween 20 -puskurissa (BSA-NaCl-Tween). Pesun jälkeen kuoppia inkuboitiin alkaliseen fosfataasiin konju-goidulla kanin anti-ihmis-IgG:llä tai -IgM:llä (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., Yhdysvallat) 1:5000 BSA-NaCl-Tweenissä 2 tunnin ajan. Reaktiot visualisoitiin 4-5 nitrofenyylifosfaatilla (Boehringen Mannheim GmbH, Saksa) 1 mg/ml dietanolamiinipus-kurissa pH 10,0. Optisen tiheyden (OD) mittaukset suoritettiin 10-20 minuutin kuluttua aallonpituudella 405 nm käyttämällä Multiscan-fotometriä (Thermo Labsystems, Suomi).

Näytteet. Serologisiin analyyseihin kerättiin ihmisen seeruminäytteitä potilailta, joilla oli 10 viljely- tai PCR-positiivinen EM, neuroborrelioosi (NB) ja Lymen artriitti (LA). Näytteet kerättiin EM-potilaista diagnosoinnin aikana (akuutti vaihe) ja 1-3 kuukautta hoidon jälkeen (toipilasvaihe). Kahdestakymmenestäkolmesta EM:ää sairastavasta potilaasta PCR-analyysillä suoritettu genotyypitys [29] osoitti B. afzeliin 17:ssä ja B. gariniin 4:ssä iho-koepalassa. Kahdessa koepalassa genotyypitystä ei voitu tehdä. Levinnyttä LB:tä sairasta-15 villa potilailla kliiniset ilmentymismuodot sopivat yhteen LB:n CDC-kriteerien kanssa [32]. Kliininen diagnoosi varmistettiin ELISAssa osoittamalla seerumin vasta-aineet (ja aivoselkäydinnesteen anti-flagelliini-vasta-aineetNB-potilaissa) flagelliinia ja B. burgdor-ferin kokosolulysaattia (WCL) vastaan. Kontrolleina käytettiin seeruminäytteitä potilaista, joilla oli syfilis, Epstein-Barrin virus (EBV) -infektio, systeeminen lupus erythematosus 20 (SLE), positiivisuus reumatekijälle (rheumatoid factor, RF) tai positiivisuus anti-streptolysiinille (ASO), sekä seerumeita terveiltä verenluovuttajilta.

: Nukleotidisekvenssin talletusnumerot. bbk32:n nukleotidisekvenssit talletettiin talletuslai- ; tokseen GenBank talletusnumeroilla AF472525 (B. afzelii A91), AF472527 (B. afzelii 25 1082), AF472526 (B. afzelii 570), AF472528 {B. afzelii 600), AF472529 (B. garinii 40), AF472530 (B. garinii 46), AF472531 (B. garinii 50), ja AF472532 (B. burgdorferi sensu stricto ia).

Tilastolliset analyysit. Standardiin tilastolliseen laskentaan käytettiin Microsoft Excel 2000 30 -ohjelmaa (Microsoft, Yhdysvallat).

14 * s. > a t I ! / '· ;

Tulokset BBK32:n sekvenssianalyysi suomalaisissa borreliaisolaateissa. BBK32BaA9im, ΒΒΚ32β3ΐ082:η, ΒΒΚ32β357ο:η, ΒΒΚ32β26οο·η, ΒΒΚ32βε4ο:η, BBK32Bg46m, BBK32Bg5o:n, 5 ja BBK32Bbia:n johdetut aminohapposekvenssit sisälsivät 352-360 tähdettä. Kaikkien BBK32-proteiinien sekvensseissä paljastui 18-19 tähteen hydrofobinen johtosekvenssi ja fenyylialaniini-X-Y-kysteiinimotiivi, mikä vastaa lipoproteiinia. Borrelian lipoproteiineille ominaisesti suurempi osa BBK32-proteiinin kypsästä osasta oli hydrofiilinen (aineistoa ei esitetä). BBK32-johtosekvenssit olivat identtiset B. garinii -kannoissa ja B. burgdorferi 10 sensu stricto -kannassa, mutta ne erosivat kolmen aminohapon osalta identtisten B. afzelii -kantojen johtosekvensseistä. BBK32-proteiinien johdettujen aminohapposekvenssien la-jienvälinen samankaltaisuus vaihteli 71 %:sta 95 %:iin (kuva 1). Aminohapposekvenssien eroavaisuudet jakautuivat tasaisesti sekvenssille. BBK32:n aminohapposekvenssien samankaltaisuus borrelian alalajeissa vaihteli 94 %:sta 100 %:iin. Kypsien BBK32-15 proteiinien laskennallinen molekyylipaino (ilman putatiivista lipidin asylaatiota) vaihteli välillä 38,7-39,5 kDa.

B. afzelii -kantojen BBK32:n sekvenssianalyysi. Keksijät sekvensoivat bbk32:n kahdesta ihmis- (BaA91 ja Bal082) ja kahdesta puutiaisisolaatista (Ba570 ja Ba600). Johdettujen 20 aminohapposekvenssien samankaltaisuus oli 99-100 %. Kahden ihmisen B. afzelii ‘ * · ' -isolaatin BBK32-sekvenssit olivat identtiset. GenBankissa tehdyssä haussa löydettiin yksi bbk32-sekvenssi B. afzeliilta. ACAl-kannan (AF213179) BBK32-sekvenssi on vain osit-', , täinen ja se vastaa BBK32BaA9i:n johdetun sekvenssin aminohappoasemien 34-336 välistä ' I sekvenssiä. Neljän tutkitun B. afzeliin BBK32-sekvenssien yhteensopivilla alueilla ja osit- f > 25 täisellä BBK32ACAi-sekvenssillä oli 99-100 %:n samankaltaisuus.

* B. garinii -kantojen BBK32:n sekvenssianalyysi. BBK32Bg4o:n ja BBK32Bg5om johdetut aminohapposekvenssit olivat identtiset ja BBK32Bg46 oli niiden kanssa 94-prosenttisesti samanlainen. GenBankissa tehdyssä haussa löydettiin yksi osittainen 6M32-sekvenssi B.

' , ‘ 30 garinii -kannasta Ip90 (AF213178). Tämä sekvenssi sopi yhteen BBK32Bg4o:n aminohap potähteiden 35-343 välisen sekvenssin kanssa, mutta BBK32iP9o:n sekvenssissä havaittiin : ’ kuuden aminohapon deleetio asemista 201 -206. Sekvenssin samankaltaisuus tässä tutki- ’ '· muksessa B. garinii -kannoista peräisin olevien BBK32-sekvenssin vastaavien alueiden ja osittaisen BBK32iP9o:n sekvenssin kanssa oli 92-93 %.

15 .-1 t‘ * } i B. burgdorferi sensu stricto -kantojen BBK32:n sekvenssianalyysi. Paikallisen Bbia-kannan />M52-sekvenssiä verrattiin kahden GenBankissa julkaistun sekvenssin kanssa. B31-kannan (AE000788) />MJ2-sekvenssi oli kokonainen ja N40-kannalla (U82107) oli osittai-5 nen sekvenssi, josta puuttuivat ensimmäiset 86 aminohappoa. BBK32- aminohapposekvenssit Bbia:sta ja B31:stä olivat 96 %:isesti samanlaisia. Bbia:n, B31:n ja N40:n BBK32-sekvenssien vastaavien alueiden samankaltaisuus oli 91-94 %. BBK32b3i-sekvenssissä oli kuuden aminohapon deleetio BBK32Bbiam asemissa 201-206. Samalla alueella kolme tyrosiinitähdettä oli poistunut BBK32N4o-sekvenssistä.

10

Western blot -analyysi. IgG:n Western blot -analyyseissä, joissa käytettiin rBBK32-proteiineja B. afzeliista (BaA91) antigeeninä sellaisten seeruminäytteiden kanssa, jotka olivat potilaista, joilla oli viljely- tai PCR-positiivinen EM, 10/15 (67 %) akuutissa vaiheessa ja 15/15 (100 %) toipilasvaiheen aikana olivat positiivisia (kuva 2). Antigeenillä 15 rBBK32Bg4o 4/15 ja 8/15 ja antigeenillä rBBK32Bbia 7/15 ja 3/15 olivat positiivisia akuutissa ja vastaavasti toipilasvaiheessa. Kymmenestä kontrollipotilaasta (viidellä oli syfilis ja viisi oli terveitä verenluovuttajia) yhdellä syfilispotilaalla oli heikko vasta-ainevaste rBBK32BaA9i-proteiinia vastaan (aineistoa ei esitetä). ELISA-määrityksessä (Dako, Tanska) 6/15 potilaasta oli IgG- tai IgM-anti-flagelliini-vasta-aineita akuutissa ja toipilasvai-20 heessa (kuva 2). Yhdellä potilaalla oli IgM-vasta-aineita in-house-ELISAssa (antigeeninä kokosolulysaatti (WCL)).

: Toisessa WB-kokeessa seeruminäytteistä, jotka olivat 10 potilaasta, joilla oli NB, ja 10:stä, ; joilla oli LA, analysoitiin anti-BBK32-IgG-vasta-aineiden esiintyminen. Kaikki 20 potilas- 25 ta, joilla oli levinnyt LB, reagoivat positiivisesti kolmen rBBK32-proteiinin kanssa, mikä määritettiin MacBAS-ohjelmalla, käyttämällä positiivisuuden rajana terveiden veren-: luovuttajien keskiarvoa + 3 SD (taulukko 2). Seeruminäytteiden immunoreaktiivisuudessa eri rBBK32-proteiineja vastaan havaittiin vähäisiä eroja. Spesifisesti neljässä seeruminäytteessä rBBK32BaA9i-proteiinia vastaan havaittiin heikommat reaktiivisuudet kuin muita 30 rBBK32-proteiineja vastaan (aineistoa ei esitetä). Muutama kontrollinäyte oli heikosti positiivinen (taulukko 2). Yksikään potilas- tai kontrolliseerumi ei tunnistanut puhdasta GST:tä (aineistoa ei esitetä).

Λ '> <' / <· 16 ' 1 · TAULUKKO 2. LB-potilaiden ja kontrollien IgG-Westem blot -reaktiivisuus sellaisia yh-distelmä-BBK32-proteiineja vastaan, jotka olivat peräisin B. afzeliista (BaA91), B. ga-riniista (Bg40) ja B. burgdorferi sensu strictosta (Bbia). WB-vyöhykkeiden voimakkuudet 5 analysoitiin MacBas 2.5 -ohjelmistolla.

Potilas/kontrolli- Positiivisten näytteiden lukumäärä/näytteiden lukumäärä ryhmä yhdistelmä-BBK32

BaA91 Bg40 Bbia

Neuroborrelioosi 10/10 10/10 10/10

Lymen artriitti 10/10 10/10 10/10

Syfilis 1/5 0/5 2/5 RF*-positiivinen 0/5 0/5 1/5

Verenluovuttajat 0/5 0/5 0/5 *RF, reumatekijä (rheumatoid factor) 10 ELISA. LB-potilaiden ja kontrollien seeruminäytteet testattiin IgG-ELISAlla käyttämällä kaikkia kolmea rBBK32-proteiinia yksitellen antigeeneinä. NB:tä sairastavilla potilailla 14/14,13/14 ja 14/14 näytteestä oli positiivisia, kun antigeeneinä käytettiin rBBK32BaA9i-proteiinia, rBBK32Bg40-proteiinia ja vastaavasti rBBK32Bbia-proteiinia. LA:ta sairastavien . . potilaiden seeruminäytteillä nämä luvut olivat 12/15,11/15 ja vastaavasti 14/15. Yhteensä · 15 14 näytettä 14 näytteestä (100 %) NB-potilaista ja 15 15: stä (100 %) LA:ta sairastavan • potilaan näytteestä oli positiivisia yhdelle tai useammalle rBBK32-proteiinille (kuva 3).

; NB-potilaiden ELISA OD -arvot korreloivat hyvin antigeeneinä käytettävien variantti- BBK32-proteiinien kesken, korrelaatiokertoimet olivat 0,91, 0,78 ja 0,83 BBK32:n välillä BaA91:stä ja Bg40:stä, BaA91:stä ja Bbia:sta sekä vastaavasti Bg40:stä ja Bbia:sta. LA-20 potilailla vastaavat korrelaatiokertoimet olivat 0,89, 0,90 ja 0,93.

EM-potilaista saadut seeruminäytteet analysoitiin sekä IgG- että IgM-ELISAlla. IgG-ELISAssa käyttämällä antigeeninä rBBK32BaA9i-proteiinia 17/23 (74 %) akuuttivaiheessa : otetusta näytteestä ja 15/23 (65 %) toipilasvaiheen aikana otetusta näytteestä oli positiivisia 25 (kuva 4). Toisaalta, kun antigeeneinä käytettiin rBBK32Bg4o-proteiinia ja rBBK32Bbia- proteiinia, 6/23 (26 %) ja 5/23 (22 %) akuutin vaiheen näytteestä ja vastaavasti 7/23 (30 %) A t- / 17 S ' ja 4/23 (17 %) toipilasvaiheen näytteestä oli positiivisia. Kontrollinäytteistä 2/10 syfilispo-tilaasta, 2/8 RF-positiivisesta, 4/10 EBV-positiivisista ja 2/20 terveen verenluovuttajan näytteestä oli matalat positiiviset OD-arvot. IgM-ELISAssa, joka tehtiin EM-potilaiden näytteillä, 4-13 % akuutin tai toipilasvaiheen näytteistä oli positiivisia riippuen käytetystä 5 rBBK32-antigeenistä.

Suoritetuissa ELISA-testeissä 6/23 (26 %) potilaasta oli anti-flagelliini-IgG-vasta-aineita joko akuuteissa tai toipilasvaiheen näytteissä. Anti-flagelliini-IgM-ELISA-määrityksissä 4/23 (17 %) oli positiivisia.

10

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuva 1. Suomalaisten B. burgdorferi sensu stricton (Bbia), B. gariniin (Bg40, Bg46 ja Bg50) ja 5. qfzeliin (BaA91, Bal082, Ba570 ja Ba600) isolaatin BBK32:n johdettujen 15 aminohapposekvenssien samankaltaisuudet. Samankaltaisuudet (%) laskettiin kokonaisten proteiinien sekvensseistä, mukaan lukien johtopeptidit, monen sekvenssin rinnakkain asettelu -menetelmällä, Jotun Hein -menetelmä, Lasergene-ohjelmisto.

Kuva 2. BBK32:n herkkyyden arviointi Western blot IgG-analyysissä (WB) varhaisvai-20 heen Lymen borrelioosin serodiagnoosiin. Seeruminäytteet kerättiin viljely- tai PCR-'. positiivisista potilaista, joilla oli erythema migrans diagnosoitaessa (akuutti vaihe), ja 1 -3 kuukautta antibioottihoidon jälkeen (toipilasvaihe). Immunoreaktiivisuus määritettiin den-; sitometrillä MacBas 2.5 -ohjelmistolla. Positiivisuuden raja WB:lle määritettiin 5 terveen ,,: verenluovuttajan keskiarvona plus 3 SD. IgM- ja IgG-anti-flagelliini-ELISAssa (Dako, *. 25 Tanska) positiivisuuden raja perustui terveiden kontrollien keskiarvo-OD:hen plus 3 SD.

Ba= B. afzelii·, Bg= B. garinii\ ND= ei suoritettu. +,- = positiivinen tai negatiivinen WB tai |' ': vastaavasti ELISA osoitetulla menetelmällä.

Kuva 3. IgG-ELISA-OD-arvot käyttämällä antigeeninä yhdistelmä-BBK32:ta B. afzeliista , 30 (A-kuva), B. gariniista (B-kuva) ja B. burgdorferi sensu strictosta (Bbia, C-kuva) seerumi- näytteillä, jotka olivat neuroborrelioosia (NB) sairastavilta potilailta tai Lymen artriittia (LA) sairastavilta potilailta. Kontrollinäytteet olivat potilaista, joilla oli syfilis (SY), systeeminen lupus erythematosus (SLE), Epstein-Barrin virus (EBV) -infektio, positiivinen reumatekijä (RF+), positiivisuus anti-streptolysiinille (ASO), sekä näytteitä terveiltä veren- 18 Λ Λ k’' /· 1 I /' : luovuttajilta (BD, blood donors). Positiivisuuden raja (BD-näytteiden keskiarvo + 3 SD) osoitetaan viivalla.

Kuva 4. IgG-ELISA-OD-arvot käyttämällä antigeeninä yhdistelmä-BBK32:ta B. afzeliista 5 (A-kuva), B. gariniista (B-kuva) ja B. burgdorferi sensu strictosta (Bbia, C-kuva) seerumi-näytteillä, jotka olivat erythema migrans -potilaista akuutissa (EM I) ja toipilasvaiheessa (EM II). Kontrollinäytteet olivat potilaista, joilla oli syfilis (SY), Epstein-Barrin virus (EBV) -infektio, positiivinen reumatekijä (RF+), sekä näytteet terveiltä verenluovuttajilta (BD, blood donors). Positiivisuuden raja (BD-näytteiden keskiarvo + 3 SD) osoitetaan vii-10 valla.

Viitteet 1. Steere A.C. Lyme disease. N. Engl. J. Med. 1989; 321: 586-596.

15 2. Johnsson B.J.B., Robbins, Bailey R.E., et ai. Serodiagnosis of Lyme disease: accuracy of a two-step approach using a flagella-based ELISA and immunoblotting. J. Infect. Dis. 1996; 174: 346-353.

20 3. Robertson, J., Guy, E., Andrews, N., et al. A European multicenter study of im munoblotting in serodiagnosis of Lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 2097-2102.

; 4. Baranton, G., Postic, D., Saint Girons, 1., et al. Delineation of Borrelia burgdorferi 25 sensu stricto, Borrelia garinii sp. Nov., and group VS461 associated with Lyme borrelio-1 sis. Int. J. Syst. Bacteriol. 1992; 42: 378-383.

. 5. Roessler, D., Hauser, U., Wilske, B. Heterogeneity of BmpA (P39) among European : isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato and influence of interspecies variability on se- ": SO rodiagnosis. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 2752-2758.

6. Mitchell, P.D., Reed, K.D., Aspeslet, T.L., Vandermause, M.F., Melski, J.W. Comparison of four immunoserologic assays for detection of antibodies to Borrelia burgdorferi in j' . patients with culture-positive erythema migrans. J. Clin. Microbiol. 1994; 32: 1958-1962.

:. ' 35 ’ · 7. Oksi, J, Uksila, J, Marjamäki, M. et al. Antibodies against whole sonicated Borrelia burgdorferi spirochetes, 41-kilodalton flagellin, and P39 protein in patients with PCR- or culture-proven late Lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol. 1995; 33: 2260-2264.

40 8. Brown, S.L., Hansen, S.L., Langone, J.J. Role of serology in the diagnosis of Lyme dis ease. JAMA 1999; 282: 62-66.

9. Fikrig, E., Barthold, S.W., Sun, W., et al. Borrelia burgdorferi P35 and P37 proteins, expressed in vivo, elicit protective immunity. Immunity 1997; 6: 531-539.

19 11 >. ΰ 4 * 10. Zhang, J.R., Hardman, J.M., Barbour, A.G., Norris, SJ. Antigenic variation in Lyme disease borreliae by promiscuous recombinant VMP-like sequence cassettes. Cell 1997; 89: 275-285.

5 11. Hefty, P.S., Jolliff, S.E., Caimano, M., et al. Regulation of OspE-related, OspF-related, and Elp lipoproteins of Borrelia burgdorferi strain 297 by mammalian host-specific signals. Infect. Immun. 2001; 69:3618-3627.

10 12. Fikrig, E., Feng, W., Barthold, S.W., Telford III S.R., Flavell, R.A. Arthropod- and host-specific Borrelia burgdorferi bbk32 expression and the inhibition of spirochete transmission. J. Immunol. 2000; 164:5344-5351.

13. Akin, E., McHugh, G.L., Flavell, R.A., Fikrig, E., Steere, A.C. The immunoglobulin 15 (IgG) antibody response to OspA and OspB correlates with severe and prolonged Lyme arthritis and the IgG response to P35 correlates with mild and brief arthritis. Infect. Immun. 1999; 67:173-181.

14. Magnarelli, L.A., Ijdo, J.W., Padula, S.J., et al. Serologic diagnosis of Lyme borreliosis by using enzyme-linked immunosorbent assays with recombinant antigens. J. Clin. Micro- 20 biol. 2000; 38: 1735-1739.

15. Rauer, S., Spohn, N., Rasiah, C. et al. Enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant OspC and the internal 14-kDa flagellin fragment for serodiagnosis of early Lyme disease. J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 857-861.

25 16. Lawrenz, M.B., Hardham, J.M., Owens, R.T., et al. Human antibody responses to VlsE antigenic variation protein of Borrelia burgdorferi. J. Clin. Microbiol. 1999; 37: 3997-4004.

30 17. Mathiesen, M.J., Christiansen, M., Hansen, K., et al. Peptide-based OspC enzyme- ‘, linked immunosorbent assay for serodiagnosis of Lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol, ί 1998;36:3474-3479.

18. Liang, F.T., Steere, A.C., Marques, A.R., et al. Sensitive and specific serodiagnosis of ': 35 Lyme disease by enzyme-linked immunosorbent assay with a peptide based on an immu- • *: nodominant conserved region of Borrelia burgdorferi VlsE. J. Clin. Microbiol. 1999; 37: 3990-3996.

I · 19. Gomes-Solecki, M.J., Wormser, G.P., Persing, D.H., et al. A first-tier rapid assay for 40 the serodiagnosis of Borrelia burgdorferi infection. Arch. Intern. Med. 2001; 161: 2015- 2020.

» * , ', 20. Fikrig, E., Feng, W., Aversa, J., Schoen, R.T., Flavell, R.A. Differential expression of ! : : Borrelia burgdorferi genes during erythema migrans and Lyme arthritis. J. Inf. Dis. 1998; 45 178:1198-1201.

: ‘ : 21. Probert, W.S., Johnson, B.J. Identification of a 47 kDa fibronectin-binding protein ex- , : pressed by Borrelia burgdorferi isolate B31. Mol. Microbiol. 1998; 30: 1003-1015.

1Λ ·" Γ* /: t'· 1,.. c Λ:· 22. Engström, S.M., Shoop, E., Johnson, R.C. Immunoblot interpretation criteria for se-rodiagnosis of early Lyme disease. J. Clin. Microbiol. 1995; 33: 419-427.

23. Aguero-Rosenfeld, M.E., Nowakowski, J., McKenna, D.F., Carbonaro, C.A., Wormser, 5 G.P. Serodiagnosis in early Lyme disease. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 3090-3095.

24. Grodzicki, R.L., Steere, A.C. Comparison of immunoblotting and indirect enzyme-linked immunosorbent assay using different antigen preparations for diagnosing early Lyme disease. J. Inf. Dis. 1988; 157: 790-797.

10 25. Aguero-Rosenfeld, M.E., Nowakowski, J., Bittker, S., Cooper, D., Nadelman R.B., Wormser, G.P. Evolution of the serologic response to Borrelia burgdorferi in treated patients with culture-confirmed erythema migrans. J. Clin. Microbiol. 1996; 34: 1-19.

15 26. Amez, M., Ruzic-Sabljic, E., Ahcan, J., Radsel-Medvescek, A., Pleterski-Rigler, D.,

Strle F. Isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato from blood of children with solitary erythema migrans. Pediatr. Infect. Dis. J. 2001; 20: 251-255.

27. Omstein, K., Berglund, J., Nilsson, I., Norrby, R., Bergström, S. Characterization of Lyme borreliosis isolates from patients with erythema migrans and neuroborreliosis in 20 southern Sweden. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 1294-1298.

28. Wang, G., van Dam, A.P., Schwartz, I., Dankert, J. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 1999; 12: 633-653.

25 29. Junttila, J., Peltomaa, M., Soini, H., Marjamäki, M., Viljanen, M.K. Prevalence of Borrelia burgdorferi in Ixodes ricinus ticks in urban recreational areas of Helsinki. J. Clin. Microbiol. 1999; 37: 1361-1365.

. 30 30. Hubalek, Z., Halouzka, J. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 1997; 13: 951-957.

; 31. Seppälä, I.J.T., Kroneld, R., Schauman, K., Forsen, K.O., Lassenius, R. Diagnosis of . . Lyme borreliosis: non-specific serological reactions with Borrelia burgdorferi sonicate ' · ·’ 35 antigen caused by IgG2 antibodies. J. Med. Microbiol. 1994; 40: 293-302.

. . 32. Wharton, M., Chorba, T.L., Vogt, R.L., Morse, D.L., Buehler, J.W. Case definitions for '*· ’ public health surveillance. Morbid Mortal Weekly Report. 1990; 39: 19-21.

Claims

11V. π £ ^ 21 1

1. Menetelmä Borrelia burgdorferi sensu lato -infektion tai Borrelia-lajia vastaan muodostuvien vasta-aineiden toteamiseksi epäillyn infektoituneen tai rokotetun ihmisen tai muun 5 nisäkkään ruumiin nesteestä, tunnettu siitä, että immuunimäärityksessä käytetään antigeeneinä vähintään kahdesta Borrelia-lajista, jotka ovat tyhmästä B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii ja B. garinii, peräisin olevia yhdistelmä-BBK32-proteiineja tai niiden fragmentteja.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä varhaisvaiheen ja myöhäisvaiheen Lymen borrelioosin serodiagnosointiin.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä erythema migransin serodiagnosointiin.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeneinä käytetään yhdistelmä-BBK32-proteiineja tai niiden fragmentteja ja yhtä tai useampaa mitä tahansa muuta immunogeenista proteiinia tai niiden fragmentteja.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeneinä käytetään 20 yhdistelmä-BBK32-proteiineja tai niiden fragmentteja ja yhdistelmä- dekoriininsitojaproteiinia A (DbpA) tai sen fragmentteja.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, jossa yhdistelmä-BBK32- ,,; proteiinit, valinnaiset muut immunogeeniset proteiinit, tai niiden fragmentit ovat peräisin , - · , 25 lajeista B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii ja B. garinii.

:'. ’. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, jossa yhdistelmä-BBK32-proteiineja, va- :" . linnaisia muita immunogeenisiä proteiineja, tai niiden fragmentteja käytetään antigeeneinä joko rinnakkain tai yhdistelmänä immuunimäärityksessä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, jossa yhdistelmä-BBK32-proteiineja käytetään yhdessä borrelian peptidien, valinnaisten muiden immunogeenisten proteiinien, tai niiden fragmenttien kanssa. :: ' 30 11 r & -· 22 ' 1 ' ''

9. Jonkin edellä mainituista patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, jossa: a) ruumiin neste saatetaan yhteyteen vähintään kahdesta Borrelia-lajisia, jotka ovat ryhmästä B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii ja B. garinii, peräisin olevien yhdistelmä-BBK32-proteiinien, valinnaisten muiden immunogeenisten proteiinien, tai niiden frag- 5 menttien kanssa olosuhteissa, jotka tehokkaasti mahdollistavat antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostumisen; ja b) todetaan muodostuneet kompleksit.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ruumiin neste on see-10 rumi-, plasma-, kokoveri-, aivo-selkäydinneste- tai nivelnestenäytettä.

11. Diagnoosipakkaus, joka on käyttökelpoinen Borrelia burgdorferi sensu lato -infektion tai Borrelia-lajia vastaan muodostuvien vasta-aineiden toteamiseen epäillyn infektoituneen tai rokotetun ihmisen tai muun nisäkkään ruumiin nesteestä, ja joka pakkaus sisältää sopi- 15 vassa säiliössä a) kahdesta tai kolmesta Borrelia-lajista, jotka ovat ryhmästä B. burgdorferi sensu stricto, B. afzeliija B. garinii, peräisin olevia yhdistelmä-BBK32-proteiineja tai niiden fragmentteja ja valinnaisesti muita immunogeenisiä proteiineja tai niiden fragmentteja ja toteamisen mahdollistavaa leimaa tai merkkiainetta, joka on yhdistetty mainittuihin proteiineihin ja/tai 20 niiden fragmentteihin, tai * · . b) kahdesta tai kolmesta Borrelia-lajista, jotka ovat ryhmästä B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii ja B. garinii, peräisin olevia yhdistelmä-BBK32-proteiineja tai niiden fragmentte-; ja ja valinnaisesti muita immunogeenisiä proteiineja tai niiden fragmentteja ja toista vasta- . .: ainetta, joka on liitetty mihin tahansa toteamisen mahdollistavaan leimaan tai merkkiainee- . ‘ 1. 25 seen. • I • ‘ .

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen diagnoosipakkaus, joka sisältää yhdistelmä- : ’ ’ : dekoriininsitojaproteiinia A (DbpA). . · · , 30

13. Immuunimääritysmenetelmä varhaisvaiheen ja myöhäisvaiheen Lymen borrelioosin diagnosoimiseksi, jossa määrityksessä: 1, . a) ruumiin neste saatetaan yhteyteen vähintään kahdesta Borrelia-lajista, jotka ovat ryh mästä B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii ja B. garinii, peräisin olevien yhdistelmä-BBK32-proteiinien tai niiden fragmenttien ja valinnaisesti muiden immunogeenisten prote- Λ ' . " t- ί’ 23 i ί .. " ; iinien tai niiden fragmenttien kanssa olosuhteissa, jotka tehokkaasti mahdollistavat anti-geeni-vasta-ainekompleksien muodostumisen; ja b) todetaan muodostuneet kompleksit.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen immuunimääritysmenetelmä, jossa käytetään anti geeneinä yhdistelmä-BBK32-proteiineja ja yhdistelmä-dekoriininsitojaproteiinia A (DbpA). 10