JP2001518287A - アポトーシス関連化合物およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 配列番号１のアミノ酸配列：（Ａ）または少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を有する露出した抗原部位を含んでなるアポトーシス関連抗原化合物が開示される。さらに、医薬における該化合物の使用、Ｃ末端アミノ酸配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなるかかるペプチド化合物またはタンパク質断片のアミノ酸配列をコードする核酸配列、アンチセンス核酸配列、かかる核酸配列を含んでなるベクター、かかる抗原化合物を認識する抗体もしくは抗原結合ペプチド、ならびに医薬におけるその使用、配列番号１のアミノ酸配列またはＣ末端アミノ酸配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を含んでなるタンパク質断片の遊離を調節する薬剤、特に変性性疾患および癌の診断、あるいは治療効果のモニタリングにおいて生物学的材料のサンプルで細胞アポトーシスの発生を確認する方法、癌および変性性疾患などアポトーシスが伴う疾病を治療する方法、癌細胞を作出する方法、ならびに予防、治療もしくは診断用の担体としての使用などのかかる化合物に基づくいくつかの応用および使用が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、医薬、診断法、ならびにそれらの化合物を認識する抗体または抗原
結合ペプチドにプログラムされた細胞死すなわちアポトーシスと呼ばれるタイプ
の細胞死の検出、モニター、測定、および調節方法に有用なサイトケラチン１８
断片のようなアポトーシスに関連する抗原化合物、およびそれら化合物を認識す
る抗体または抗原結合ペプチドに関する。細胞アポトーシスの発生の確認はさら
に、治療処置の効果のモニターに使用され得る。

【０００２】

【発明の背景】

アポトーシスは植物および昆虫から脊椎動物まで、高等真核生物のあらゆる種
類で見られる(Kroemer G, Petit P, Zanzami N, Vayssiere J-L, Mignotte B:プ
ログラムされた細胞死の生化学 The FASEB Journal 9:1277-1287 (1995))。アポ
トーシスは一般に致命的に重大な現象である。アポトーシスの低下は先天異常、
癌および自己免疫疾患につながり、またアポトーシスの増強は変性性疾患、毒素
産生微生物による感染などの急性疾患および移植臓器の拒絶反応をもたらす。

【０００３】 従ってアポトーシス検出、モニター、測定および調節は記載の症状の診断およ
び治療処置における重要な因子である。

【０００４】 最近、Caulin C., et al (The Journal of Cell Biology, Vol 138, pp. 1379
-1394)はケラチン１８のキャスパス(caspase)切断および上皮細胞アポトーシス 中の中間径フィラメントの再構築を研究した。ケラチン１８はキャスパス−６、
−３および−７によってin vitroで切断され、３つのキャスパスに共通の切断部
位がＫ１８の保存されたＬ１−２リンカー領域に位置する配列ＶＥＶＤ／Ａであ
ったと述べられている。

【発明の説明】

【０００５】 ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）と反応する有用な新規の特異的抗体を
発見することを目的とする研究中に、すでに考慮中のことに加え、驚くべきこと
にモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（ＣＫ１８のアミノ酸配列の特定の部分でマウ
スを免疫化した後に得られる）は培養上皮細胞の初期のアポトーシス変異を認識
することがわかった。このＭＡｂはＭ３０と称せられた。

【０００６】 多数のアミノ酸（ａａ）配列の合成と検定をはじめとする詳細な解析によりＭ
Ａｂ Ｍ３０の特異的エピトープおよび結合部位がアミノ酸配列：ＥＤＦＮＬＧ
ＤＡＬＤからなることが明らかになった。この１０個のアミノ酸からなるペプチ
ド配列はヒトＣＫ１８の二次コイルから始まり、アミノ酸Ｎｏ．３８３−３９２
を表す。この特異的エピトープはアポトーシス中に遊離される新たなエピトープ
であり、完全なＣＫ１８分子では発現しない。ＣＫ１８の完全なアミノ酸はOshi
ma et al.(Oshima RG, Millan JL, and Ceccena G. (1986)によって発表されて いる。移植に先立ち、中間径フィラメントであるマウスおよびヒトケラチン１８
の比較が示された。区分３３：６１−６８。

【０００７】 本発明の種々の態様はｍＡｂ Ｍ３０、すなわちアミノ酸配列ＥＤＦＮＬＧＤ
ＡＬＤ、配列番号１： Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp 1 5 10 または配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列の最適結合
部位に基づいている。

【０００８】 初期には、アポトーシスに重要な部分は、ＤＡＬＤ（Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ）のすぐ後でのキャスパス酵素による切断に関連していると信じられて
いた。なぜなら、この配列はＣＫ１８に発生し、かつ、キャスパスはＤＸＸＤ（
ここでＸは定義されていないアミノ酸を表す）の後で切断することが知られてい
たからである。

【０００９】 しかしながら配列番号ＤＡＬＤは、ＣＫ１−８、ビメンチン、デスミン、種々
のアクチン、神経フィラメントおよびラミンのような他の中間径フィラメントに
は見られない。これらには以下の配列：それぞれＬＡＬＤ、ＭＡＬＤ、ＭＡＬＤ
、ＶＡＬＤ、ＭＡＬＤおよびＬＡＬＤが認められる。

【００１０】 ｍＡｂ Ｍ３０は心筋、巨核球、骨髄芽細胞、および胎児の神経組織（ＣＫ１
８を含んでいるとは知られていない）などの非上皮細胞におけるアポトーシスの
変異を認識するので、今般、Ｃ末端配列ＡＬＤを有するタンパク質断片が検出さ
れれば初期のアポトーシスを示すものと確信されている。

【００１１】 このように、本発明の１つの態様は、次に配列番号１： Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp 1 5 10 のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体と特異的に結合するアポトーシス関連抗
原化合物、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列または機能的に同等の配列を有
する露出した抗原部位を含んでなるアポトーシス関連抗原化合物に向けられる。

【００１２】 露出抗原部位または抗体結合部位の三次元構造は、抗体の相当する三次元構造
に特異的に結合する抗原化合物の結合部分の構造を決定する。従って本発明の抗
原化合物は、配列番号１、すなわちその配列自体または機能的に同等な配列、す
なわち少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなる機能において相同な
もの配列の構造に基づく化合物、例えば配列番号１の三次元構造が模倣されてい
る限り、先に明示されたアミノ酸に、他の分子部分、Ｄ型アミノ酸、非天然アミ
ノ酸および／または誘導体による１または数個のアミノ酸置換を有する化合物な
どを含んでなる。従って本発明の抗原化合物の共通の特徴は、次ぎに配列番号１
のアミノ酸に特異的に結合する抗体に特異的に結合することであり、すなわち、
抗原化合物は配列番号１のアミノ酸配列または少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を有する抗原部位を含んでなる。

【００１３】 完全なＣＫ１８分子は先に明示した隠れた配列を有しているのでその配列と特
異的に結合する抗体と反応せず、これにより認識はアポトーシス、すなわちＣＫ
１８分子が配列Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ ＡｓｐのＣ末端Ａｓｐの後ですでに切
断されているという場合に特異的なものとなると言える。

【００１４】 本発明のこの態様の好ましい具体例では、アポトーシス関連化合物はＣ末端ア
ミノ酸配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなるペプチドまたはタンパク質断片
である。このペプチドは配列番号１との相同体、伸長型または末端切断型であっ
てもよく、すなわち配列番号１のアミノ酸配列と同一の抗体に結合する、そのペ
プチドの能力が消失してしまわない限り、いくつかのアミノ酸置換、伸長、切断
および／または欠失を有する相同配列を持っていてもよい。

【００１５】 本発明のこの態様のもう１つの具体例では、本発明の抗原化合物は、Ｃ末端ア
ミノ酸配列Ｘａａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ（ここでＸａａはＡｓｐ Ｌｅｕ
ＭｅｔおよびＶａｌから選択される）を含んでなるペプチドまたはタンパク質断
片である。

【００１６】 本発明のペプチドの一例は、 配列番号１： Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp 1 5 10 のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。

【００１７】 もう１つの例としては、 配列番号２： Glu Asp Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser Asn Ser 1 5 10 15 Met Gln Thr 20 のアミノ酸配列（ＥＤＧＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤＳＳＮＳＭＱＴ）（すわなち、Ｎ
末端において３個、およびＣ末端において７個のアミノ酸で伸長した配列番号１
）を有するオリゴペプチドがある。

【００１８】 さらなる例としては、 配列番号３： Leu Glu Asp Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser 1 5 10 15 Asn Ser のアミノ酸配列（ＬＥＤＧＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤＳＳＮＳ）を有するオリゴペプ
チドはある。

【００１９】 配列番号２および３のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドが合成されてお
り、それらはＥＬＩＳＡにおいてｍＡｂ Ｍ３０と結合する［比活性：それぞれ
配列番号１では１００；配列番号２では１１；また配列番号３では８．３］。し
かしながら、ｍＡｂ Ｍ３０は、それらがＣ末端配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを
有する新規なエピトープを提示するまでＣＫ１８断片とは結合できないので、こ
れら２種のペプチドはアポトーシスに特異的なＣＫ１８の切断断片を表すとは考
えられない。

【００２０】 なおさらなるもう１つの例としては、 配列番号４： Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp 1 5 10 のアミノ酸配列（ＧＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ）を有するオリゴペプチドがある。

【００２１】 本明細書および請求の範囲では、抗原化合物の抗体への特異的結合、または抗
体のアミノ酸配列への特異的結合は、少なくとも１０^７リットル／モル、好まし
くは少なくとも１０^９リットル／モルの親和定数を要する。 本発明のこの態様の１つの具体例では、抗原化合物は担体および／または標識
と結合している。担体は、例えば、マイクロプレート、ビーズなどようなプラス
チック面；ビオチンのような有機分子；ウシ血清アルブミンのようなタンパク質
；ペプチドリンカー、ポリペプチド、例えば結果として生じる融合タンパク質で
あってもよい。

【００２２】 標識は、放射性同位元素、酵素、蛍光マーカーなどのような多様な種々の標識
から選択すればよい。

【００２３】 本発明のもう１つの態様は、医薬に使用される本発明の抗原化合物に向けられ
る。

【００２４】 本発明のこの態様の好ましい具体例では、本発明の抗原化合物は細胞アポトー
シスの阻害のための医薬の製造に使用される。

【００２５】 細胞アポトーシスの阻害は拒食症、エイズ、臓器移植、乾癬、およびアルツハ
イマー症のような変性性疾患の治療に望ましいと考えられる。 本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはタンパク質断片のアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離型または組換え核酸配列に
向けられる。

【００２６】 本発明の核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合
成ＤＮＡ）の形態のいずれかであってよい。ＤＮＡは二本鎖でも、一本鎖であっ
てもよい。ＤＮＡ配列が一本鎖である場合、それはコード配列（センス鎖）であ
っても非コード配列（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。本発明の核酸
配列は遺伝子コードによって、本発明により包含されるペプチドまたはタンパク
質断片のアミノ酸配列から設計される。

【００２７】 本発明の核酸配列は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドお
よびペプチドの製造に使用できる。本発明のこの態様の特殊な具体例では、核酸
配列は本発明の核酸配列に基づくアンチセンス配列であり、これは配列番号１の
コード部分の総てまたは少なくとも一部において、本発明のペプチドまたはタン
パク質断片をコードするセンス配列と相補的である。細胞内へ導入された際、ア
ンチセンス核酸配列はセンス鎖のによってコードされた遺伝子の発現を阻害する
ことができる。

【００２８】 本発明のこの態様はまた、本発明の核酸配列を含んでなるベクターを含む。か
かかるベクターは、本発明のペプチドまたはタンパク質断片の製造に、あるいは
おそらくは、in vivoまたはin vitroで標的細胞内で配列番号１のアミノ酸配列 を含んでなるタンパク質断片または少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ含ん
でなるその機能的同等体を一定量に調節することに使用され得る。本発明の好ま
しい具体例で、ベクターとはプラスミドである。

【００２９】 本発明のなおもう１つの態様は、本発明の抗原化合物を認識する抗体または抗
原結合ペプチドに向けられる。 本発明の抗体は、本発明の抗原化合物を認識するまたはそれと特異的に結合す
る、すなわち配列番号１のアミノ酸配列もしくは少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を認識するまたはそれと特異的に結合
するモノクローナル抗体または単一特異性ポリクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は当技術分野で十分に公知の免疫化法を用いて、または真核生物も
しくは原核生物起源の好適な宿主細胞を使用する組換え技術に基づく十分に巧緻
な方法によって作製可能である。

【００３０】 本発明の抗原化合物を認識する抗原結合ペプチドは、抗体の抗原結合部分、ま
たは配列番号１のアミノ酸配列もしくは少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ
を含んでなるその機能的同等体に少なくとも部分的に相当するアミノ酸配列を有
するが、反対の電荷を持つアミノ酸を有するタンパク質もしくはペプチドであっ
てもよい。かかる抗原結合ペプチドはアンタゴニストとして機能するであろう。

【００３１】 アゴニストの開発におては以下の指標が使用され得る： ０＝疎水性アミノ酸 ＋＝陽性アミノ酸 −＝陰性アミノ酸 ±＝中性アミノ酸 配列番号１： ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ −−０±０±−００− 対応するアンタゴニスト部位： ＋＋０±０±＋００＋ 例えば、 ＫＲＷＱＦＧＲＬＡＲ いくつかのアンタゴニスト候補が前記指針、特に＋位にＫおよびＲが用いられ
る変異体を用いて設計され得る。

【００３２】 本発明のこの態様の具体例では、抗体もしくは抗原結合ペプチドが担体および
／または標識と結合している。

【００３３】 担体は例えば、マイクロプレート、ビーズなどのようなプラスチック面；ビオ
チンのような有機分子；ウシ血清アルブミンのようなタンパク質；例えば融合タ
ンパク質を生じるペプチドリンカー、ポリペプチドであってもよい。

【００３４】 標識は放射性同位元素、酵素、蛍光マーカーなどのような多様な種々のタイプ
の標識から選択してよい。

【００３５】 本発明のさらなる態様は、医薬に用いられる本発明の抗体および抗原結合ペプ
チドに向けられる。

【００３６】 本発明のこの態様の好ましい具体例では、本発明の抗体もしくは抗原結合ペプ
チドは、特に先天異常、癌および自己免疫疾患などの症状、すなわち制御されな
いまたは過剰な細胞増殖に関する症状において、アポトーシスの刺激のための医
薬の製造に使用される。

【００３７】 本発明のもう１つの具体例では、製造された医薬は多くの変性性疾患、または
毒素産生微生物による感染もしくは虚血性再狭窄障害などの急性疾患、および移
植組織もしくは移植臓器の拒絶反応など、アポトーシスの増強が関与する疾病の
治療に望ましい。ここで、アポトーシスの医療制御が最も重要であると思われる
。

【００３８】 本発明のさらにもう１つの態様は、哺乳類の身体または培養細胞を含む生物学
的物質において、Ｃ末端アミノ酸配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなるタン
パク質断片の遊離を調節する薬剤に向けられる。

【００３９】 本発明のかかる薬剤の例としては、配列番号１の配列または特に配列番号１と
同一の抗体もしくは抗原結合ペプチドと結合する配列、すなわち少なくとも配列
Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を含んでなるタンパク
質の発現を阻害する（センス鎖）か、あるいは刺激する（アンチセンス鎖）かの
いずれかの本発明の配列、ならびに酵素、酵素アクチベーターおよび阻害剤があ
る。

【００４０】 本発明のなおもう１つの態様は、ヒトを含む哺乳類由来の臓器、組織または体
液のサンプルを含む生物学的サンプルにおいて、細胞アポトーシスの発生を確認
する方法に向けられ、ここではＣ末端アミノ酸配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含
んでなるタンパク質断片の発生が確認される。

【００４１】 本発明のこの態様の好ましい具体例では、かかる確認は本発明の抗体を用いる
免疫学的検定を用いて実施される。

【００４２】 本発明のもう１つの好ましい具体例では、細胞アポトーシスの発生率が求めら
れる。求められた細胞アポトーシス率は変性性疾患および癌のようなアポトーシ
スを伴う疾患の診断、ならびに治療効果のモニタリングに使用され得る。

【００４３】 この態様におけるサンプルの起源としては下記のものが挙げられる：in vivo またはin vitroのヒトもしくは動物身体いずれもの臓器、正常もしくは変異した
組織、標本および体液、例えば肝臓、肺、腎臓、心臓、脾臓、脳、内臓、リンパ
器官、骨髄、生殖器、骨格、筋肉、皮膚、感覚器官、腺、血液、血清、尿、腹水
、胸膜液、脳脊髄液、羊水、膿瘍液、洗液、穿刺、切片および本明細書における
細胞または体液起源のいずれかの調製物。

【００４４】 かかるタンパク質断片の確認は、体液サンプルにおいてＣ末端アミノ酸配列Ａ
ｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなるペプチド断片を検出、好ましくは定量できる
いずれかの技術によって行ってもよい。好ましくはかかるタンパク質断片は少な
くとも配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と同一の抗体もしくは抗原結
合ペプチドと特異的に結合する配列、すなわち少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を含んでなる。このような断片と特異的
に結合するモノクローナル抗体は種々の免疫学的検定で使用でき、所望により用
いられる実際の検定に応じて標識できる。

【００４５】 本発明のかかる方法の１つの具体例では、確認は免疫学的検定を用いて行われ
る。また、抗体部位を有する構造体および／または抗体の使用に適した検出系を
使用してもよい。本発明ので使用できる多くの免疫学的検定のうちのいくつかの
例として、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫検定法（ＲＩＡ
、ＩＲＭＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、化学発光酵素標識免疫測定法、発光
免疫検定法（ＬＩＡ）、解離増強経時分解蛍光免疫検定法(Dissociation enhanc
ement time-resolved fluoroimmunoassay)（ＤＥＬＦＩＡ）が挙げられる。この
検定は手動であっても自動であってもよい。

【００４６】 さらに本発明の態様は、患者において癌および変性性疾患などのアポトーシス
を伴う疾病の治療方法であって、細胞アポトーシスを調節する量の本発明の抗体
もしくは抗原結合ペプチドまたは本発明の抗原化合物を患者に投与することを含
んでなる方法に向けられる。

【００４７】 本発明のもう１つの態様は、癌細胞を作出する方法であって、細胞アポトーシ
スを阻害する量の本発明の抗原化合物を培養細胞または実験動物に投与すること
を含んでなる方法に向けられる。かかる培養細胞または実験動物は所望のポリペ
プチドもしくはタンパク質の生産、または抗癌剤の評価に使用できる。

【００４８】 本発明のさらなる態様は、本発明の抗体または抗原結合ペプチドを含んでなり
、予防、治療または診断に用いる担体に向けられる。本発明のかかる担体は、配
列番号１のようなＣ末端アミノ酸配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなる断片
、または少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配
列を発見する標的物質として機能し、それは種々の薬剤および／または予防、治
療または診断目的の標識と結合させてもよい。

【００４９】 以下、実験の説明および発明の具体例を参照して本発明をさらに説明するが、
これらは請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものではない。

【００５０】本発明のペプチドの合成 本発明のペプチドは、プロテアーゼによる精製タンパク質の制御下での分解ま
たは他の化学的方法など、公知のアミノ酸配列作製法のいずれによっても作出で
きる(Allen G., Sequencing of proteins and peptide, 1989, Elsevier Scienc
e Publishers B.V.)。化学合成は一般に液相でアミノ酸残基またはペプチド断片
を正しい順で互いに結合させることにより行い、所望のペプチドを作製する。も
う１つの通常の戦略としては、固相（樹脂）から始めて、そこにその配列の最後
のアミノ酸のＣ末端がそこに結合し、その終わりから２番目のアミノ酸のＣ末端
と最後のアミノ酸のＮ末端と結合しているというようにアミノ酸を互いに結合さ
せ、最後にこの固相から構築されたペプチドを遊離させること（いわゆる固相法
）である。

【００５１】 本発明を示すために作製されたオリゴペプチドは、酸ハンドル誘導体化したポ
リエチレンの支持体を用いるマルチピンペプチド合成法により合成された(Valer
io, R.M., Bray, A.M. and Maeji, N.J. (1994) Multiple peptide synthesis o
n acid-labile handle derivatized polyethylene supports. Int. J. Peptide
Protein Res. 44:158-165を参照)。かかる合成はヒドロキシエチレンメタクリレ
ートをグラフトし、トリフルオロ酢酸に不安定なリンクアミド形成ハンドルで機
能化した着脱可能なピン上で行った。ＮおよびＣの双方の末端が切断された一連
の配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤおよび他の配列を表すペプチドが合成された。これ
らのペプチドはテトラペプチドリンカー配列−ＳＧＳＧ−または−ＳＧＳＢ−（
Ｂ＝βアラニン）を用いてビオチンでキャップし、酵素結合免疫吸着検定法のお
いてストレプトアビジン被覆プレートに付着させた。

【００５２】 アミノ酸配列は純度に関して、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ）およびイオンスプレー質量分析法（ＩＳ−ＭＳ）によって確認した(Van
Dorsselear et al., (1990) Application of electrospray mass spectrometry
to characterization of recombinant proteins up to 44kDa. Biomed. Enviro
n. Mass Spectrom. 19:692-704を参照)。

【００５３】 イオンスペクトルは、酸性（トリフルオロ酢酸または酢酸）溶液からペプチド
を気化させることにより得られる陽イオンとして収集した。このイオン数に対す
る生の質量−荷電比のスペクトルから、分子量（ダルトン）に対する全イオン数
のパーセンテージを得た。ＩＳ−ＭＳ純度は標的ペプチドに帰すことができるイ
オン数であり、イオン総数のパーセンテージとして表した。

【００５４】マウスの免疫化 免疫化材料の調製 抗原精製のための出発材料はヒト結腸癌細胞系統ＷｉＤＲ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．
ＣＣＬ２１８）細胞培養培地の上清であった(Rydlander L, Ziegler E, Bergman
T, Schoberl E, Steiner G, Bergman A-C, Zetterberg M, Bjorklund P, Skern
T, Einarsson R and Jornvall H (1996): Molecular characterization of a t
issue-polypeptide-specific-antigen epitope and its relationship to human
cytokeratin 18. Eur. J. Biochem. 241:309-314)。第１の工程では５０％（質
量／容量）硫酸アンモニウムによる沈殿を用いた。次ぎに、１４ｍＭリン酸塩／
８５ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．５中、フェニルセファロースでの疎水性相
互作用クロマトグラフィーを行った。カラムを洗浄した後、疎水性タンパク質を
水で溶出し、画分を回収した。第３の工程は、８Ｍ尿素、０．１ＭＴｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．０中でのセファクリルＳ−３００排除クロマトグラフィーからな
った。第４の工程では、０．１ｍＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、８Ｍの尿素
で平衡化したＱセファロースを使用した。

【００５５】 ０．１２Ｍ ＮａＣｌで溶出した画分は約８８２精製されており、一方は１３
ｋＤ、他方は２２ｋＤの２種の有効成分を含んでいた。それらはサイトケラチン
１８のサブタイプと同定され、双方ともアミノ酸３９６で終わり、すなわち断片
はＣ末端アミノ酸配列ＡＬＤを含んでなるであった。

【００５６】免疫化の手順 ４個体のＢａｌｂＣマウスに１００μｌのフロイントの完全アジュバントを懸
濁させ、１０７μｇの第１のバッチの精製抗体を含有する１００μｌの平衡化生
理食塩水（ＰＢＳ）を１度、腹膜内（ｉ．ｐ．）注射した。３、６および９週間
後、このマウスにフロイントの完全アジュバントの代わりに追加量の抗原バッチ
で同じ注射を行った。最後の注射から８週間後、１００μｌＰＢＳ中アジュバン
トを含まない新たな抗原バッチ５３μｇを追加として静注し、さらに同量を腹膜
内に投与した。

【００５７】 リポペプチドアジュバント：（Ｐａｍ３ｃｙｓＳｅｒ（Ｌｙｓ）４，Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ１４２８ ７６４，ロット１３１２ ７０２４）と結合させた適当
量の合成ペプチドＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤによるＢａｌｂＣマウスの免疫化の結果
、合成オリゴペプチドに対するモノクローナル抗体を産生する免疫適格細胞が開
発されることとなる。

【００５８】ハイブリダイゼーション マウスの追加抗原注射から３日後、脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（細胞系
統：Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３，Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ）とハイブリダイズさせた
。得られた多数のハイブリドーマ培養物からの培地をウサギ抗マウス抗体と反応
させ（固相）、そこに免疫化抗原およびブロッキングマウスグロブリンを加えた
後、ＨＲＰ標識した、ＣＫ１８に対する検出抗体を加えた。

【００５９】 免疫組織化学的解析により、得られた雑種細胞系統（Ｎｏ．３０）により産生
された抗体の１つ培養細胞と反応し、活性もなく、また壊死もないことが観察さ
れた。供試細胞はＩＭＤＭ９０％＋１０％ウシ胎児血清＋２ｍｍのＬ−グルタミ
ンおよび１０μｇのゲンタマイシン中で増殖させたＨｅｒａ細胞（Ｇｅｙ １９
５２）、膀胱癌細胞系統Ｔ２４、乳腺細胞系統Ｔ４７ｄ、結腸癌細胞系統ＷｉＤ
ｒ ＣＣＬ２１８であった。予期しない観察から、免疫化学的および免疫組織化
学的技術による抗体特異性の詳細な研究を行うこととなった。Ｍ３０で示される
ＭＡｂはアポトーシス細胞および体液と特異的に反応することが明らかとなった
。

【００６０】免疫化学 ＭＡｂ Ｍ３０エピトープを化学的に同定するために、この目的のために特に
作製した多数の合成ペプチドに対してＭ３０を試験した。最適特異性エピトープ
はアミノ酸配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤからなることがわかった。この配列および
関連配列は表１に示されており、これはアミノ酸配列の、本発明のモノクローナ
ル抗体Ｍ３０との反応性を示している。

【００６１】

【表１】

【００６２】 表１から明らかなように、アミノ末端からＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤまでの配列の
段階的に短縮することで最大活性が得られた。他方の末端で最後のＤ（Ａｓｐ）
を除去するか、あるいは最後のＤにＳ（Ｓｅｒ）を付加した結果、活性は完全に
消失した。

【００６３】 ＤＡＬＤの最後のＤが必要なことは明らかであり、アポトーシスに必要な構造
に関して知られていることと、すなわち活性型キャスパス−３酵素は標的基質に
おけるＤＸＸＤパターンを認識するということとの関連性が認められるはずであ
る(Nicholson DW, Ali A, Thornberry NA, Vaillancourt JP, Ding CK, Gallant
M, Gareau Y, Griffin PR, Labelle M, Lazebnik YA, Munday NA, Raju SR, Sm
ulson ME, Yamin T-T, Yu VL, Miller DK, et al. (1995))。Identification an
d inhibition of ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Na
ture, 376:37-43)。さらに、キャスパス−６およびキャスパス−７の双方はＤＸ
ＸＤ配列を有する基質を切断できる(Talanian RV, Quinlan C, Trautz S, Hacke
t MC, Mankovich JA, Banach D, Ghayur T, Brady KD. Wong WW. (1997). Subst
rate specificities of caspase family protease. J. Biol. Chem. 272:9677-9
682)。これまで本明細書に記載の新たな配列は、アポトーシスを示すまでは知ら
れていなかった。

【００６４】 キャスパスサブファミリーのプロテアーゼが哺乳類のアポトーシスに関与して
いるということは、アポトーシス細胞におけるＤＸＸＤ−Ｘ切断活性およびプロ
酵素の活性化、ならびに特異的基質模倣ペプチド阻害剤による種々の系における
アポトーシスの阻害の観察に及ぶ証拠に従わせることにより支持される(Nobel S
. (1997). Thiol redox state in apoptosis: Physiological and toxicant mod
ulation. Dissertation, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden. ISBN 91
-628-2502-X)。

【００６５】免疫組織化学 現在、アポトーシスの検出するにはいくつかの方法があるが、サイトケラチン
１８の一部と既知のアミノ酸配列との定義された反応に基づくものはない。アポ
トーシス細胞を同定するのに最も広く用いられている方法としては、光学および
電子顕微鏡解析、フローサイトメトリー、アガロースゲル電気泳動、in situニ ック末端標識（ＩＳＥＬ）およびＴｄＴにより媒介されるｄＵＴＰニック末端標
識（ＴＵＮＥＬ）法がある。

【００６６】 予備知見を実証するために、またＭＡｂ Ｍ３０により認識されるエピトープ
の発現を適合させるために種々のアポトーシス系の結果を解析し、Ｍ３０免疫組
織化学と許容されるアポトーシスアッセイとを比較した。比較は、確立された形
態学的基準の次ぐ、例えば非小細胞肺癌系統ＭＲ６５を用い、アネキシン、ＴＵ
ＮＥＬおよびフローサイトメトリーアッセイを用いてなされた。共焦レーザー顕
微鏡解析により、アポトーシス細胞はＭＡｂ Ｍ３０とともにインキュベーショ
ンした後、細胞質の明るい免疫蛍光染色が示されるが、生細胞および壊死細胞は
陰性となることが明らかになった。

【００６７】 Ｍ３０エピトープの発現は、アポトーシス細胞の検出のためのその他の許容さ
れる染色法、すなわちアネキシンＶ、ＴｄＴにより媒介されるｄＵＴＰニック末
端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイと極めてよく相関していた。大多数のＭ３０陽性
細胞はＧ１ピーク下の「アポトーシス」にあった。Ｍ３０エピトープの発現は、
アネキシンＶ反応性または陽性ニック末端標識に先立つ初期にはアポトーシスカ
スケードに見られる。エピトープは生存能力のある上皮細胞では検出できなかっ
た。アミノ酸配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ

【００６８】 Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列からなるこのエピトープは、簡単な免
疫組織化学的技術を用いてサイトケラチンのレベルでアポトーシス細胞の定量を
可能にする。

【００６９】 アポトーシスの検出のために従来許容されていた方法の主な欠点は、時間がか
かり、比較的高価で、集中的な労力を要し、さらに必ずしもアポトーシス細胞に
特異的ではないということである。加えて、ＴＵＮＥＬアッセイおよびＩＳＥＬ
はアポトーシス中期および後期しか検出できない。

【００７０】 種々のアポトーシス誘導系の結果を解析し、Ｍ３０免疫組織化学および許容さ
れるアポトーシスアッセイを比較したところ、Ｍ３０はヒト起源の細胞系統およ
び通常得られる生検においては既存のアポトーシス検出アッセイより優れている
ことがわかった。Ｍ３０は初期段階のプロセスにあるアポトーシス細胞を特異的
に認識する。

【００７１】 Ｍ３０はアポトーシスの内在性の初期マーカー、すなわちＥＤＦＮＬＧＤＡＬ
Ｄ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列を認識するの
で、通常得られる新鮮な生検、またホルマリンで固定され、パラフィン包埋され
た組織切片にも適用できる。このことはＭ３０の利点の１つである。

【００７２】 Ｍ３０免疫反応性はまた、アネキシンＶ結合およびＤＮＡの断片化によって検
出され、ＴＵＮＥＬアッセイにより検出されるような膜の非対称性をもたらさず
に進行するので、これまで用いられてきた通常のアッセイに明らかな利点を与え
る。

【００７３】体液を反映するアポトーシス ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同
等な配列を含むアポトーシス産物が体内のアポトーシス細胞領域から血清、腹水
、胸膜水などのような体液中に遊離する場合、他の血清アッセイと同様に免疫反
応アッセイをＭＡｂ Ｍ３０とともに用いて血清および体液中の特異な産物の濃
度を検出および定量することができる。このように、増加したアポトーシスまた
は不十分なアポトーシスすなわち部位ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも
配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列と結合するＭＡｂ Ｍ３０のレベル
の上昇または低下により引き起こされる、あるいはそれに関連する疾病を識別す
ることができる。関連する臓器または組織由来の標本はより特異的な診断を与え
得る。

【００７４】配列番号１または機能的に同等な配列の診断上の使用 アポトーシスのプロセスは、誘導期、作動期、および分解期の３段階に分ける
ことができる。サイトケラチン１８の分解およびＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤを含む断
片の産生は極めて初期、いずれの公知のアポトーシスアッセイ法が陽性に転じる
かなり前に起こる。このことにより、アンタゴニスト医薬、すなわちＥＤＦＮＬ
ＧＤＡＬＤもしくは少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列に対
する特異的抗体、またＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤもしくは少なくとも配列ＡＬＤを含
んでなる機能的に同等な配列の産生をもたらす酵素の阻害剤または活性化剤を用
いて、ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的
に同等な配列の産生および機能を極めて初期に介在させることが可能となる。

【００７５】 Ｍ３０陽性標本の濃度および局在性の解析から得られた知見を用いることによ
り、アポトーシス（プログラムされた細胞死）のプロセスの増強および阻害が望
ましいかどうか、また標識されたまたは標識されていないＭ３０抗体、さらに標
識されたまたは標識されていないＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤもしくは少なくとも配列
ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列、ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、もしくはＫＲ
ＷＱＦＧＲＬＡＲなどのような少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等
な配列に対する標識されたまたは標識されていないアンタゴニストにより、ある
いはＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に
同等な配列を産生する酵素を阻害または増強することによりこのプロセスに影響
を与える試みをすべきかどうかがわかる。この選択は、モノクローナル抗体Ｍ３
０による、アポトーシスアミノ酸配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも
配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列の厳密な同定に基づくものである。

【配列表】

（１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称： Beki AB(Publ.) （Ｂ）所在地： Fredsforsstigen 22 （Ｃ）市： Bromma （Ｅ）国：スウェーデン （Ｆ）郵便番号(ZIP)：１６８ ６６ （Ｇ）電話番号：０８−２９０３７０ （ｉｉ）発明の名称：アポトーシス関連化合物およびその使用 （ｉｉｉ）配列の数：４ （ｉｖ）読み込み可能なコンピューター： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル （Ｃ）オペレーションシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリースＮｏ．１．０ バージョンＮｏ．１．３０（ＥＰＯ） （２）配列番号：１ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）仮説：なし （ｘｉ）配列：配列番号１ Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp 1 5 10 （２）配列番号：２ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）仮説：なし （ｘｉ）配列：配列番号２ Glu Asp Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser Asn Ser 1 5 10 15 Met Gln Thr 20 （２）配列番号：３ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１８アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）仮説：なし （ｘｉ）配列：配列番号３ Leu Glu Asp Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser 1 5 10 15 Asn Ser （２）配列番号：４ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）仮説：なし （ｘｉ）配列：配列番号４ Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp 1 5 10

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｐ 35/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ペテル、ブヨルクルンド スエーデン国ブロマ、ストラームカールス ベーゲン、82 (72)発明者 マリウス、ナップ オランダ国エービー、ベルグ、エン、テル ブリート、リークスウェーク、77 (72)発明者 フランス、シー．エス．ラメケルス オランダ国シービー、マーストリヒト、ア トスラーン、51 (72)発明者 ベルト、シュッテ オランダ国エイチエル、エイスデン、アヒ ター、デ、ランド、ハーグ、11 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA41 DA02 GA05 4C076 BB11 BB21 DD60A EE01A EE41A EE59 FF02 4C084 AA01 AA07 BA17 BA23 CA17 CA25 CA26 CA27 CA31 CA34 CA36 CA37 DC50 NA14 ZA162 ZA362 ZA892 ZB022 ZB262 ZB332 ZC202 4C085 AA14 AA26 BA07 BB11 CC21 EE06 FF20 GG06 4H045 AA10 AA11 AA30 BA15 BA16 DA76 DA86 EA28 EA51 FA30 FA33 FA72 GA25

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１： Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp 1 5 10 のアミノ酸配列、または少なくとも配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなる機
   能的に同等な配列、を有する露出した抗原部位を含んでなる、アポトーシス関連
   抗原化合物。
2. 【請求項２】 化合物がＣ末端アミノ酸配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなるペプチドま
   たはタンパク質断片である、請求項１記載の抗原化合物。
3. 【請求項３】 化合物がＣ末端アミノ酸配列Ｘａａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ（ここでＸａａ
   はＡｓｐ、Ｌｅｕ、ＭｅｔおよびＶａｌから選択される）を含んでなるペプチド
   またはタンパク質断片である、請求項２記載の抗原化合物。
4. 【請求項４】 ペプチドが、配列番号１： Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp 1 5 10 のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである、請求項２または３記載の抗原化
   合物。
5. 【請求項５】 ペプチドが、配列番号４： Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp 1 5 10 のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである、請求項２または３記載の抗原化
   合物。
6. 【請求項６】 担体および／または標識と結合した、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗
   原化合物。
7. 【請求項７】 医薬に使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原化合物。
8. 【請求項８】 細胞アポトーシスの阻害のための医薬の製造に使用される、請求項７記載の抗
   原化合物。
9. 【請求項９】 請求項２〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはタンパク質断片のアミノ
   酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離型または組換え核酸配
   列。
10. 【請求項１０】 請求項９記載のセンス核酸配列に基づく、アンチセンス核酸配列。
11. 【請求項１１】 請求項９または１０記載の核酸配列を含んでなる、ベクター。
12. 【請求項１２】 ベクターがプラスミドである、請求項１１記載のベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原化合物を認識する、抗体または抗原
    結合ペプチド。
14. 【請求項１４】 担体および／または標識と結合した、請求項１３記載の抗体または抗原結合ペ
    プチド。
15. 【請求項１５】 医薬に使用される、請求項１３または１４記載の抗体または抗原結合ペプチド
    。
16. 【請求項１６】 細胞アポトーシスの刺激のための医薬の製造に使用される、請求項１５記載の
    抗体または抗原結合ペプチド。
17. 【請求項１７】 哺乳類の身体または細胞培養を含む生物学的材料中において、Ｃ末端アミノ酸
    配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなるタンパク質断片の遊離を調節する薬剤
    。
18. 【請求項１８】 ヒトを含む哺乳類由来の器官、組織または体液のサンプルを含む生物学的サン
    プルにおいて、細胞アポトーシスの発生を確認する方法であって、Ｃ末端アミノ
    酸配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐを含んでなるタンパク質断片の発生を確認する、
    前記方法。
19. 【請求項１９】 請求項１３または１４記載の抗体を用いる免疫学的検定によって確認を行う、
    請求項１８記載の方法。
20. 【請求項２０】 細胞アポトーシスの発生率を確認する、請求項１８または１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 確認された細胞アポトーシス率が、変性性疾患および癌のようなアポトーシス
    を伴う疾病の診断および／または治療効果のモニターに使用される、請求項２０
    記載の方法。
22. 【請求項２２】 患者において癌および変性性疾患のようなアポトーシスを伴う疾病を治療する
    方法であって、細胞アポトーシスを調節する量の、請求項１３〜１６のいずれか
    一項に記載の抗体もしくは抗原結合ペプチド、または請求項１〜６のいずれか一
    項に記載の抗原化合物、を患者に投与することを含んでなる、前記方法。
23. 【請求項２３】 細胞アポトーシスを阻害する量の、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原
    化合物を細胞培養または実験動物へ投与することを含んでなる、癌細胞作出法。
24. 【請求項２４】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原化合物を認識する抗体または抗原結
    合ペプチドを含んでなる、予防、治療または診断用の担体。