ES2346483T3 - Metodo para diagnosticar enfermedades cardiovasculares. - Google Patents
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Abstract
El método para diagnosticar una enfermedad cardiovascular en un individuo comprendiendo las etapas de: - proporcionar una muestra sanguínea de un individuo, - determinar la cantidad de fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa en dicha muestra, - comparar la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en dicha muestra con la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa presentes en un control de referencia de al menos un individuo que no padece una enfermedad cardiovascular y - diagnosticar una enfermedad cardiovascular si la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en la muestra está aumentada en comparación con la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en el control de referencia.
Description
\global\parskip0.880000\baselineskip
Método para diagnosticar enfermedades
cardiovasculares.
La presente invención se refiere a un método
para diagnosticar una enfermedad cardiovascular.
De acuerdo con la Organización Mundial de la
Salud (OMS; Ginebra) las enfermedades cardiovasculares son la causa
de más de 15 millones de muertes en el mundo cada año. Explican el
50% de todas las muertes en varios países desarrollados y más del
50% en África y en el Oeste y Sudeste Asiático. También son la causa
principal de muerte en adultos. Además, muchos incidentes
cardiovasculares no son necesariamente letales, pero pueden afectar
a la capa-
cidad de vivir una vida diaria normal, lo que da como resultado enormes costes de asistencia sanitaria para la sociedad.
cidad de vivir una vida diaria normal, lo que da como resultado enormes costes de asistencia sanitaria para la sociedad.
Debido a la mejora en las medicaciones agudas y
crónicas y los procedimientos quirúrgicos, así como los cambios en
el estilo de vida y en la alimentación, ha habido unos descensos
significativos en la mortalidad total de las enfermedades
cardiovasculares durante las últimas décadas. A pesar de ello,
debido a estas altas incidencias y tasas de mortalidad, las
enfermedades cardiovasculares son objeto de enormes inversiones por
parte de tanto industrias biotecnológicas como farmacéuticas.
Sin embargo, un tratamiento y una prevención
eficaces de las enfermedades cardiovasculares no sólo implica la
administración de los medicamentos adecuados si no que también
necesita herramientas de diagnóstico fiables. Por lo tanto, es de
gran importancia, la identificación y el uso de marcadores
moleculares de enfermedades cardiovasculares para el diagnóstico y
la prevención precoces. Por ejemplo, las troponinas cardiacas las
liberan de manera selectiva los miocardiocitos dañados. La
especifidad de este acontecimiento es suficientemente alta para
producir mejoras en el diagnóstico de trastornos isquémicos
cardiacos agudos. Además permite al médico predecir el riesgo y los
escenarios de resultados para los pacientes de manera más
fiable.
Además, la búsqueda de marcadores biológicos
indicativos de la formación de aterosclerosis, de su progreso y
desestabilización es de gran importancia en los entornos clínicos de
síndromes coronarios agudos y otras entidades clínicas relacionadas
con acontecimientos isquémicos, por ejemplo el accidente
cerebro-vascular.
A día de hoy, múltiples líneas de evidencia
sugieren que la aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria
crónica e implica componentes del sistema inmune en la aterogénesis.
Recientemente, el trabajo de investigación identificó la
participación del potente mediador inmune CD40 y su equivalente el
ligando de CD40 (CD40L o CD154) de estar implicados en la
inflamación. Previamente, se sugirió que los marcadores de la
inflamación general tales como la proteína C reactiva de alta
sensibilidad (hsCRP) y la interleucina-6, así como
el amiloide del suero, estaban relacionados con resultados adversos
en pacientes con enfermedad coronaria.
Bancher-Todesca et al
(Hypertens in Pregnancy. (2001): 89-98) describe la
sobreexpresión de CK-18 en mujeres que padecen
hipertensión inducida por el embarazo (HIE).
En el documento WO 99/16789 se describen los
compuestos antigénicos relacionados con la apoptosis.
En Nikkari Seppo T et al (Atherosclerosis
(98) 1993: 11-16) se describen los autoanticuerpos
en enfermedades coronarias por lo que los Autores de dichos
estudios especulan sobre la asociación entre la unión de
Anticuerpos, entre otros a CK-18 y las enfermedades
coronarias.
En Adlbrecht C et al (Europ. J. Clin.
Invest. 37 (2007): 372-380) se analizan los niveles
elevados de la enzima conversora de interleucina \beta y la
citoqueratina 18 escindidos por caspasa en el infarto agudo de
miocardio.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar métodos para diagnosticar enfermedades cardiovasculares
en un individuo. También se describe un método para distinguir la
angina de pecho estable de la inestable y medios para el
tratamiento de enfermedades cardiovasculares, en particular
enfermedades asociadas con la trombosis.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
un método para diagnosticar una enfermedad cardiovascular en un
individuo, comprendiendo las etapas de:
- -
- proporcionar una muestra sanguínea de un individuo,
- -
- determinar la cantidad de fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa en dicha muestra,
- -
- comparar la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en dicha muestra con la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa presentes en un control de referencia de al menos un individuo que no padece una enfermedad cardiovascular y
- -
- diagnosticar una enfermedad cardiovascular si la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en la muestra está aumentada en comparación con la cantidad de los fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en el control de referencia.
Además, se descubrió que la cantidad de
CK-18 o fragmentos de la misma y de precursor de
IL-\beta en una muestra de un individuo que
padecía o que se sospechaba que padecía una enfermedad
cardiovascular en comparación con una muestra de un individuo sano
indica una enfermedad cardiovascular. La cantidad de
CK-18 o fragmentos de la misma y de precursor de
IL-1\beta en una muestra de un individuo que
padece una enfermedad cardiovascular está aumentada y disminuida,
respectivamente, en comparación con la cantidad de dichos marcadores
en una muestra obtenida de un individuo sano que no padece una
enfermedad cardiovascular.
La inflamación local y sistémica desempeña una
función principal en las enfermedades cardiovasculares, en
particular en síndromes coronarios agudos (SCA), incluyendo la
angina inestable (AI) y el infarto agudo de miocardio (IAM).
Distintos datos indican que la apoptosis es un acontecimiento clave
durante el desarrollo y el progreso de la placa aterosclerótica.
Aunque se ha demostrado claramente que el IAM ocurre como un
resultado directo de la necrosis miocítica inducida por isquemia,
se ha descrito la apoptosis como una entidad importante que
contribuye después de la oclusión de la arteria coronaria.
Mecánicamente, la formación de trombos después de la ruptura de la
placa supone la oclusión de los vasos en el IAM y contribuye a un
flujo comprometido en la AI. La intervención coronaria percutánea
urgente (ICP) es la opción de tecnología punta para el tratamiento
de pacientes con SCA y se asocia con tasas de reperfusión más altas
y mejor resultado que la terapia trombolítica. Sin embargo, la ICP
conlleva el riesgo de movilizar material trombótico y trombogénico,
produciendo embolización distal y daño microcirculatorio, que puede
limitar la recuperación miocárdica.
Se introdujeron varios dispositivos de
trombectomía en el área clínica para permitir la fragmentación y
eliminación de material trombótico intracoronario en el entorno del
IAM. En prospectiva, los ensayos aleatorizados, por ejemplo el
dispositivo de trombectomía X-sizer se ha mostrado
que mejora el flujo epicardiaco y la resolución del segmento ST.
Sin embargo, no se podría demostrar la mejora de la supervivencia o
una mejor recuperación miocardiaca en estos estudios. A pesar del
efecto de la trombectomía aguda en la supervivencia, no se probaron
la función ventricular y la mejora de la calidad de vida en grandes
ensayos multicéntricos hasta el día de hoy, la técnica ofrece la
posibilidad de recoger muestras sanguíneas del sitio de la trombosis
arterial aguda en la arteria coronaria para permitir la
investigación de proteínas que se sabe que están asociadas con la
inflamación y apoptosis.
La apoptosis se refiere a las alteraciones
morfológicas que exhiben las células que están muriendo
"activamente" que incluyen la retracción celular, la
vesiculización de la membrana, la condensación de la cromatina y la
fragmentación del ADN. La muerte celular apoptótica puede ser el
resultado de la activación controlada del desarrollo de programas
de ejecución endógenos o de la transducción de señales de muerte
activadas por una gran variedad de estímulos exógenos. Una vía
principal necesita la activación del receptor de la enzima
conversora de interleucina 1\beta (ECI) y una familia de
proteasas de cisteína de tipo proteína 32, homólogas al producto
génico del gen de muerte celular ced-3 de
Caenorhabditis elegans. Otras proteínas que se conoce que
están asociadas con la inflamación y la apoptosis incluyen
IL-1\beta y el precursor de
IL-1\beta (IL-1\betap),
TNF-\alpha y TNF-R1/CD120a, CD95 y
CD95L/CD178, CD40 y CD40L/CD154. Además, los pacientes con AI
muestran concentraciones aumentadas de componentes solubles
desprendidos de la membrana, procedentes de células CD3+ activadas,
macrófagos y células endoteliales, lo que indica una renovación
apoptótica periférica intravascular aumentada. Se indicó que estas
partículas que se desprenden de la membrana habían aumentado la
capacidad procoagulativa. Además, se descubrió que pacientes con
enfermedad cardiaca isquémica desarrollan anticuerpos contra la
citoqueratina 18 (CK-18) o fragmentos de la misma,
un producto del citoesqueleto que se presenta en las células
endoteliales y la microvasculatura cardiaca que están
experimentando apoptosis.
Se ha descrito en publicaciones que todos estos
marcadores son pronosticadores positivos de la enfermedad coronaria
y se describió que los p-valores estaban en un
intervalo de 0,04-0,05.
El término "control de referencia", como se
usa en este documento, significa una muestra de preferiblemente la
misma fuente (por ejemplo sangre, suero, etc.) que se obtiene de al
menos un individuo sano para compararse con la muestra del
individuo a analizar. Para recoger resultados comparables el control
de referencia, así como la muestra del individuo, deben obtenerse,
manipularse y tratarse de la misma forma. El número de individuos
sanos para obtener un valor de control de referencia puede ser al
menos 1, preferiblemente al menos 2, más preferiblemente al menos
5, aún más preferiblemente al menos 10, en particular al menos 20.
Sin embargo, también se pueden obtener valores de al menos 100,
1000 ó 10000 individuos.
"Cantidad" y el término que se usa como su
sinónimo "nivel", como se usa en el contexto de la presente
invención significa la concentración de un marcador presente en una
muestra.
Las expresiones "la cantidad está aumenta en
comparación con" y "la cantidad está disminuida en comparación
con", como se usa en este documento, significan que la cantidad
determinada en la muestra a analizar diverge con significancia
estadística del valor control o "normal" (= sano), por ejemplo
al menos el 30%, preferiblemente al menos el 50%, más
preferiblemente al menos el 100%, aún más preferiblemente al menos
el 200%, de la cantidad del control de referencia. Como se usa en
el presente documento, el término "CK-18 o
fragmentos de la misma" se refiere a CK-18 y los
fragmentos específicos de la misma que se obtienen por ejemplo
mediante la escisión mediada por caspasa de la citoqueratina 18 en
células apoptóticas y que se liberan a partir de células (véase,
por ejemplo Kramer G et al. Cancer Res. (2004)
64:1751-1756). Los fragmentos específicos son
aquellos que se reconocen específicamente como productos de la
degradación de CK-18 que se producen mediante
procesos fisiológicos o patológicos dentro del cuerpo humano. Los
fragmentos específicos de CK-18 también se pueden
producir in vitro por ejemplo mediante el tratamiento por
proteasas o químico de CK-18 o (mediante una
fragmentación mayor de) mediante fragmentos generados
fisiológicamente-patológicamente. Estos fragmentos
de CK-18 deben -en cualquier caso- ser específicos
de CK-18 (es decir identificarse de manera no
ambigua como fragmentos de CK-18) y deberían tener
al menos 8 residuos de aminoácidos de longitud, preferiblemente al
menos 10 aminoácidos de longitud, especialmente al menos 15
aminoácidos de longitud. Estos fragmentos deberían tener (o
seleccionarse para tener) una secuencia de aminoácidos
característica (única) para que se reconozcan específicamente. Los
fragmentos preferidos de CK-18 tienen una longitud
de 50 a 400 residuos de aminoácidos, preferiblemente de 100 a 350
residuos de aminoácidos, especialmente de 150 a 300 residuos de
aminoácidos. La CK-18 o los fragmentos de la misma
pueden detectarse mediante anticuerpos específicos policlonales o
monoclonales (que no reconocen o reaccionan de manera cruzada con
otras proteínas, tales como otras citoqueratinas). Un número
significativo de estos anticuerpos
anti-CK-18 que reconocen
específicamente CK-18 o fragmentos de la misma está
disponible en el mercado. Un ejemplo de dichos anticuerpos es el
anticuerpo MB30 que reconoce la secuencia EDFNLGDALD en un
fragmento de CK-18 escindido por caspasa que tiene
un sitio de escisión después de DALD (Documento EP 1 019 438 A).
Este anticuerpo es incluso específico para este fragmento y no
reconoce la CK-18 no escindida. Por consiguiente,
los medios de detección (por ejemplo anticuerpos) que no son sólo
específicos de CK-18, sino que también son
específicos para ciertos fragmentos de CK-18 son
medios preferidos para detectar fragmentos de CK-18
de acuerdo con la presente invención. Los fragmentos de
CK-18 escindidos por caspasa son fragmentos de
CK-18 específicamente preferidos de acuerdo con la
presente invención.
De acuerdo con la presente invención un
"individuo que no padece una enfermedad cardiovascular"
significa un individuo cuyos niveles de CK-18 (o
fragmentos de la misma), precursor de IL-1\beta
y/o caspasa-1 (ECI) se asemejan a aquellos de un
individuo sano.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención la enfermedad cardiovascular es aterosclerosis,
una enfermedad coronaria, un síntoma coronario agudo,
preferiblemente angina de pecho inestable o infarto agudo de
miocardio, angina de pecho estable, accidente cerebro vascular,
preferiblemente accidente cerebro vascular isquémico,
arteriosclerosis o reestenosis asociadas a enfermedad inflamatoria o
autoinmune.
El término "enfermedad cardiovascular" como
se usa en este documento se refiere a cualquier enfermedad o
trastorno que afecte al sistema vascular, incluyendo los vasos
cardiacos y sanguíneos. Una enfermedad o trastorno vascular incluye
cualquier enfermedad o trastorno caracterizados por una disfunción
vascular, incluyendo, por ejemplo, estenosis intravascular
(estrechamiento) u oclusión (bloqueo), debido al desarrollo de la
placa aterosclerótica y enfermedades y trastornos que son el
resultado de esto. Las enfermedades cardiovasculares particularmente
preferidas se seleccionan del grupo que consiste en aterosclerosis,
una enfermedad coronaria, un síntoma coronario agudo,
preferiblemente angina de pecho inestable o infarto agudo de
miocardio, angina de pecho estable, accidente cerebro vascular,
preferiblemente accidente cerebro vascular isquémico,
arteriosclerosis o reestenosis asociadas a enfermedad inflamatoria
o autoinmune.
La cantidad de caspasa-1 (ECI)
en la muestra puede determinarse adicionalmente, comparase con la
cantidad de ECI presente en control de referencia y diagnosticarse
a una enfermedad cardiovascular si la cantidad de ECI en la muestra
está aumentada en comparación con la cantidad de ECI en el control
de referencia.
La determinación de la cantidad de ECI en una
muestra en combinación con la determinación de las cantidades de
CK-18 o fragmentos de la misma y/o el precursor de
IL-1\beta permite un diagnóstico aún más
preciso.
La citoqueratina 18 también puede usarse en un
método para distinguir entre la angina de pecho estable e inestable
o para diagnosticar la angina de pecho estable o inestable o para la
evaluación del riesgo de reestenosis después de la intervención
coronaria percutánea en un individuo comprendiendo las etapas
de:
- -
- proporcionar una muestra de un individuo,
- -
- determinar la cantidad de citoqueratina 18 o fragmentos de la misma (CK- 18 o fragmentos de la misma) y/o precursor de interleucina-1\beta (precursor IL-1\beta) en dicha muestra,
- -
- comparar la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma y/o precursor de IL-1\beta en dicha muestra con la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma y/o precursor de IL-1\beta presentes en al menos un control de referencia de al menos un individuo que padece una angina de pecho estable o inestable,
- -
- diagnosticar la angina de pecho estable si la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma en la muestra está disminuida y la cantidad de precursor de IL-1\beta en la muestra está aumentada en comparación con la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma y/o precursor de IL-1\beta en el control de referencia de al menos un individuo que padece una angina de pecho inestable (también es posible diagnosticar una angina de pecho estable cuando las cantidades determinadas de marcador se comparan con los niveles en un individuo que padece una angina de pecho estable).
La angina de pecho es el resultado de una
isquemia de miocardio, que se produce por un desequilibrio entre el
suministro y la demanda de oxígeno del miocardio. Específicamente,
la demanda excede el suministro debido al suministro sanguíneo
inadecuado. El corazón supone un pequeño porcentaje del peso
corporal total, pero es responsable del 7% del consumo de oxígeno
del cuerpo. El metabolismo del tejido cardiaco es altamente aeróbico
y tiene una reserva muy pequeña para compensar el suministro
sanguíneo inadecuado. Cuando el suministro sanguíneo se reduce a
niveles que son inadecuados para la demanda miocárdica, el tejido
rápidamente se vuelve hipotóxico y los metabolitos celulares
tóxicos no pueden eliminarse. Las células miocárdicas rápidamente
usan los suministros de oxígeno que permanecen en la
microvasculatura local y el lapso de tiempo que el metabolismo
aeróbico continúa es indirectamente proporcional al grado de
oclusión arterial. Una vez el suministro de oxígeno se ha agotado,
la fosforilación oxidativa no puede continuar porque el oxígeno ya
no está disponible como un aceptor de electrones, el piruvato no
puede convertirse a acetil coenzima A y entrar en el ciclo del ácido
cítrico. El metabolismo miocárdico cambia a un metabolismo
anaeróbico usando las reservas de glucógeno y glucosa, y el piruvato
se fermenta a lactato. La acumulación de lactato es la causa
primaria del dolor de pecho en individuos con SCA. Como la isquemia
continúa, el tejido cardiaco se vuelve más ácido que el lactato y
otros intermedios ácidos se acumulan, los niveles de ATP disminuyen
y las fuentes de energía disponibles se agotan. El tejido cardiaco
se puede recuperar si se reperfunde 15-20 minutos
después de un acontecimiento isquémico. Después de que las reservas
de glucógeno celular se hayan agotado, la célula presenta
gradualmente características de necrosis, incluyendo el
hinchamiento mitocondrial y la pérdida de la integridad de la
membrana celular. Tras la reperfusión, estas células dañadas
mueren, posiblemente como resultado de la incapacidad de la célula
de mantener el equilibrio iónico. Una pérdida de la integridad de
la membrana produce que los contenidos citosólicos de la célula se
liberen a la circulación.
La angina estable, la angina inestable y el
infarto de miocardio comparten una característica común: dolor de
pecho constrictivo asociado con la isquemia miocárdica. La angina se
clasifica como estable o inestable a través de la interpretación de
un médico de los síntomas clínicos, con o sin cambios diagnósticos
en el ECG. La clasificación de angina como "estable" o
"inestable" no se refiere a la estabilidad de la placa por sí
misma, sino más bien, al grado de esfuerzo que se requiere para
provocar el dolor de pecho. Más notablemente, la clasificación de
dolores de pecho como angina estable o inestable (o incluso infarto
de miocardio leve) en casos distintos al infarto de miocardio
definitivo es completamente subjetiva. El diagnóstico y en este
caso la diferenciación, no se hacen mediante angiografía, que puede
cuantificar el grado de oclusión arterial, sino más bien mediante
la interpretación de un médico de los síntomas clínicos.
La angina estable se caracteriza por dolor de
pecho constrictivo que ocurre tras esfuerzo o estrés y se alivia
mediante el descanso o nitroglicerina sublingual. La angiografía
coronaria de pacientes con angina estable normalmente revela el
50-70% de la obstrucción de al menos una arteria
coronaria. La angina estable se diagnostica normalmente mediante la
evaluación de los síntomas clínicos y los cambios en el ECG. Los
pacientes con angina estable pueden tener anormalidades
transitorias de los segmentos ST, pero la sensibilidad y la
especificidad de estos cambios asociados con la angina estable es
baja.
La angina inestable se caracteriza por dolor de
pecho constrictivo en reposo que se alivia mediante la
nitroglicerina sublingual. El dolor de pecho de la angina se alivia
normalmente mediante nitroglicerina sublingual, y el dolor
normalmente disminuye en 30 minutos. La angina inestable representa
el estado clínico entre la angina estable y el IAM y se cree que se
debe principalmente a la progresión en la gravedad y la extensión de
la aterosclerosis, el espasmo arterial coronario o la hemorragia en
placas no oclusivas con la subsiguiente oclusión trombótica. La
angiografía coronaria de pacientes con angina inestable normalmente
revela el 90% o una obstrucción mayor de al menos una arteria
coronaria, lo que da como resultado una incapacidad del suministro
de oxígeno para cumplir incluso con la demanda de oxígeno
miocárdica basal. El crecimiento lento de las placas
ateroscleróticas estables o la ruptura de las placas
ateroscleróticas inestables con la posterior formación de trombos
puede producir una angina inestable. Ambas causas dan como
resultado el estrechamiento clínico de la arteria coronaria. La
angina inestable normalmente se asocia con la ruptura de la placa
aterosclerótica, la activación de plaquetas y la formación del
trombo. La angina inestable normalmente se diagnostica mediante los
síntomas clínicos, los cambios en el ECG y los cambios en los
marcadores cardiacos. Los tratamientos para pacientes con angina
inestable incluyen nitratos, aspirina, inhibidores de GPIIb/IIIa,
heparina y beta bloqueantes. Los pacientes también pueden recibir
angioplastia y endoprótesis vascular. Finalmente, los pacientes con
angina inestable tienen riesgo de desarrollar infarto agudo de
miocardio.
Por lo tanto, para proporcionar un diagnóstico
diferencial fiable entre los niveles de CK-18 o
fragmentos de la misma y/o precursor de IL-1\beta
y opcionalmente ECI de la angina de pecho estable e inestable y
opcionalmente también entre los de la angina de pecho estable, la
angina de pecho inestable y el infarto agudo de miocardio en una
muestra que se obtiene de un individuo que se sospecha que padece
una de dichas afecciones, se determinan y comparan a sus niveles
respectivos en individuos que padecen una de estas afecciones.
Los niveles de CK-18 o
fragmentos de los mismos y de ECI en individuos que padecen una
angina de pecho estable están disminuidos cuando se comparan con
los niveles que se encuentran en individuos que padecen una angina
de pecho inestable e infarto agudo de miocardio.
En contraste con esto, los niveles del precursor
de IL-1\beta están aumentados en individuos que
padecen una angina de pecho estable cuando se comparan con aquellos
niveles que se encuentran en individuos que padecen una angina de
pecho inestable.
Puesto que este método permite distinguir
claramente entre angina de pecho estable e inestable en un
individuo, los datos que se obtienen pueden ser útiles para diseñar
un tratamiento óptimo y adecuado para un individuo que padece una
angina de pecho estable o inestable e infarto agudo de
miocardio.
En un método para distinguir entre angina de
pecho estable e inestable o para diagnosticar una angina de pecho
estable e inestable en un individuo además se determina la cantidad
de caspasa-1 (ECI) en la muestra, se compara con la
cantidad de ECI presente en el control de referencia y se
diagnostica como angina de pecho estable si la cantidad de ECI en
la muestra está disminuida en comparación con la cantidad de ECI en
el control de referencia de al menos un individuo que padece una
angina de pecho inestable.
Además, un método para distinguir entre la
angina de pecho estable e inestable o para diagnosticar la angina
de pecho estable e inestable en un individuo puede implicar la
determinación de la cantidad de CK-18 o fragmentos
de la misma y/o precursor de IL-1\beta y/o ECI.
También es posible combinar la cuantificación de los marcadores
individuales: CK-18 o fragmentos de la misma y
precursor de IL-1\beta; CK-18 o
fragmentos de la misma, precursor de IL-1\beta y
ECI; CK-18 o fragmentos de la misma y ECI, precursor
de IL-1\beta y ECI.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención la cantidad de los fragmentos de citoqueratina
18 (CK-18) escindidos por caspasa se determina
inmunológicamente, preferiblemente mediante un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas, mediante un radioinmunoensayo o
mediante análisis por transferencia de Western.
Los niveles proteicos de CK-18 o
fragmentos de la misma, ECI y precursor de
IL-1\beta en la muestra pueden ensayarse usando
cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la
enzima ECI puede cuantificarse mediante un ensayo basado en su
actividad catalítica (por ejemplo, Thornberry, N. A. et al.
(1992) Nature 356, 768-74; Nicholson, D. W. et
al. (1995) Nature 376, 37-43; Tewari, M. et
al. (1995) Cell 81, 801-9;
Fernandes-Alnemri, T. et al. (1996) PNAS USA
93, 7464-9; Thornberry, N. A. (1994) Meth. Enzymol.
244, 615-31) o basado en la cuantificación de la
cantidad de proteína contenida en una muestra. Para determinar la
cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma, por
ejemplo, se conocen varios ensayos inmunológicos en la técnica
(Kramer G. et al. Cancer Res. (2004) 64:
1751-1756). Por ejemplo las técnicas basadas en
anticuerpos pueden emplearse preferiblemente para todos los
marcadores en un método de acuerdo con la presente solicitud. Por
ejemplo, el reconocimiento específico se proporciona mediante un
anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) y se usa un sistema
de detección secundario para detectar la presencia (o unión) del
anticuerpo primario. Los marcadores detectables se pueden conjugar
al anticuerpo secundario, tales como un marcador fluorescente, un
radiomarcador o una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina,
peroxidasa de rábano picante) que produce un producto
cuantificable, por ejemplo coloreado. En otro método adecuado, el
anticuerpo primario por sí mismo puede marcarse de manera
detectable. Como resultado, se proporciona el marcaje
inmunohistológico de una sección de tejido. Un extracto puede
producirse a partir de una muestra biológica (por ejemplo sangre,
tejido, células) para el análisis. Tal extracto (por ejemplo un
extracto de detergente) puede someterse a un ensayo de transferencia
Western o puntual/por ranuras respecto al nivel de la proteína de
interés, usando métodos de inmunotransferencia rutinarios (Jalkanen
et al. J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985);
Jalkanen et al. J. Cell. Biol. 105:
3087-3096 (1987)).
Otros métodos útiles basados en anticuerpos
incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Por ejemplo,
se puede usar un anticuerpo monoclonal específico de proteínas
tanto como una sonda inmunoadsorbente como como una sonda marcada
enzimáticamente para detectar y cuantificar la proteína de interés.
La cantidad de dicha proteína presente en una muestra se puede
calcular haciendo referencia a la cantidad presente en una
preparación patrón usando un algoritmo de computadora de regresión
lineal (véase laco-billi et al., Breast
Cancer Research and Treatment 11: 19-30 (1988)). O
se pueden emplear dos anticuerpos monoclonales diferentes contra a
la proteína de interés, uno como la sonda inmunoadsorbente y el
otro como una marcada enzimáticamente.
La muestra a analizar es preferiblemente un
fluido corporal, preferiblemente sangre, más preferiblemente plasma
o suero.
Todos los polipéptidos marcadores de acuerdo con
la presente invención se pueden detectar y cuantificar en sangre
(total) así como en plasma o suero, preferiblemente en forma soluble
o solubilizada.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención la muestra se obtiene de la arteria femoral. Las
muestras plasmáticas de control se obtienen a partir de pacientes
con angina de pecho estable e inestable de la cubita (ambos métodos
de muestreo representan el flujo sanguíneo periférico).
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de un kit para diagnosticar una enfermedad cardiovascular, para
distinguir entre la angina de pecho estable e inestable o para
diagnosticar la angina de pecho estable o inestable en un
in-
dividuo o para evaluar el riesgo de un individuo de desarrollar un trombo en el sistema cardiovascular comprendiendo:
dividuo o para evaluar el riesgo de un individuo de desarrollar un trombo en el sistema cardiovascular comprendiendo:
- medios para detectar los fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa y
- un control de referencia, en el que
- dichos métodos comprenden anticuerpos dirigidos contra los fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa y en el que el control de referencia se obtiene de al menos un individuo que no padece una enfermedad cardiovascular o de al menos un individuo que padece una angina de pecho estable o inestable.
En la práctica clínica el diagnóstico de
enfermedades cardiovasculares, la distinción entre la angina de
pecho estable e inestable así como el diagnóstico de la angina de
pecho son de interés particular puesto que permiten al practicante
evaluar los riesgos del paciente de ser susceptible al infarto agudo
de miocardio, las arritmias cardiacas graves como la taquicardia y
la fibrilación ventricular o el arresto cardiaco que conducen a la
muerte súbita. Sobre la base de los resultados que se obtienen
mediante el método y el kit de acuerdo con la presente invención se
pueden aplicar tratamientos y/o intervenciones quirúrgicas
adecuados. El kit de la presente invención también se puede emplear
para evaluar el riesgo de un individuo de desarrollar un trombo en
el sistema cardiovascular. Un nivel elevado de CK-18
o fragmentos de la misma en comparación con un individuo sano
indica un riesgo de desarrollar un trombo. Por lo tanto, la presente
invención se refiere también a un método para evaluar dicho
riesgo.
Dichos anticuerpos pueden ser policlonales o
monoclonales y se pueden conjugar con un marcador apropiado que
permita la detección de la unión de anticuerpos específicos contra
CK-18 o fragmentos de la misma. También es posible
usar anticuerpos secundarios dirigidos contra anticuerpos que se
unen a CK-18 o fragmentos de la misma.
La enfermedad cardiovascular a detectar mediante
el kit de acuerdo con la presente invención puede ser
aterosclerosis, una enfermedad coronaria, un síntoma coronario
agudo, preferiblemente angina de pecho inestable o infarto agudo de
miocardio, angina de pecho estable, accidente
cerebro-vascular, arteriosclerosis o reestenosis
asociadas a enfermedad inflamatoria o autoinmune.
La presente invención se ilustra más en las
siguientes figuras y ejemplos, sin embargo, sin estar restringida a
ellos.
La Fig. 1 muestra niveles plasmáticos de enzima
conversora de interleucina-1/ECI. La concentración
de ECI en plasma de 40 pacientes con angina estable (AS), angina
inestable (AI) se comparó con el plasma obtenido de la arteria
femoral y de la arteria coronaria en un infarto agudo de miocardio
(IAM). Cada caja representa el intercuartil que contiene el 50% de
los valores. La línea de un lado a otro de la caja indica la línea
media. Las patillas se extienden desde la caja a los valores más
altos y más bajos.
La Fig. 2 muestra los niveles plasmáticos de
neoepítopo M30 de citoqueratina 18 en el infarto agudo de miocardio,
la AE y la AI. La concentración de neoepítopo M30 de
CK-18 plasmática obtenida a partir de la arteria
coronaria de pacientes estaba aumentada notablemente cuando se
comparó con el flujo sanguíneo sistémico obtenido de la arteria
femoral, AE y AI. Los datos que se obtienen a partir de 40 pacientes
representan el intercuartil que contiene el 50% de los valores. La
línea de un lado a otro de la caja indica la línea media. Las
patillas se extienden desde la caja a los valores más altos y más
bajos.
La Fig. 3A a 3D muestra un trombo representativo
de un paciente con infarto agudo de miocardio (n=8). La Fig. 3A
muestra una tinción con hematoxinilina-eosina; la
Fig. 3D una tinción con fucsina ácida naranja G (fibrina -
rojo, eritrocitos, trombocitos y otras proteínas plasmáticas - naranja, leucocitos diseminados - azul); la Fig. 3C la inmunoreactividad positiva del neoepítopo M30 de CK-18 en el centro del trombo; la Fig. 3D un control negativo (todo con amplificación 200x).
rojo, eritrocitos, trombocitos y otras proteínas plasmáticas - naranja, leucocitos diseminados - azul); la Fig. 3C la inmunoreactividad positiva del neoepítopo M30 de CK-18 en el centro del trombo; la Fig. 3D un control negativo (todo con amplificación 200x).
En este ejemplo se investigó la expresión de
proteínas que se conoce que están asociadas con vías inflamatorias
y de activación específica de la apoptosis en IAM. Se determinó la
concentración de dichas proteínas en el plasma obtenido en el
sistema de la arteria coronaria en pacientes que padecían IAM y se
relacionó con los niveles sanguíneos sistémicos. Los pacientes a
los que se les diagnosticó AI y angina estable (AE) sirvieron como
controles en un estudio no aleatorizado comparativo. Además, el
trombo coronario agudo obtenido in vivo se analizó mediante
inmunohistoquímica. Los resultados evidenciaron concentraciones
aumentadas de ECI específicas de apoptosis y del producto de
escisión dependiente de caspasa CK-18 en el IAM en
comparación con AE y AI.
La inflamación sistémica y la activación inmune
específica de apoptosis desempeñan una función principal en los
síndromes coronarios agudos (SCA), incluyendo el infarto agudo de
miocardio (IAM). Los dispositivos de trombectomía se introdujeron
recientemente en el área clínica para permitir la eliminación del
material trombótico intracoronario en el entorno del IAM. Esta
técnica ofrece la única posibilidad de recoger sangre y trombos en
la arteria coronaria ocluida y la arteria femoral para comparar las
proteínas específicas de apoptosis e inflamatorias. Los pacientes
con angina estable (AE) y angina inestable (AI) sirvieron como
población de control.
Se incluyeron cuarenta pacientes consecutivos
sometidos a angiografía coronaria de emergencia en el estudio, si
cumplían los siguientes criterios: 1) dolor de pecho en el momento
de la angiografía coronaria, 2) nuevas elevaciones de segmentos ST
\geq2 mm en dos o más derivaciones torácicas, o nuevas elevaciones
de segmentos ST \geq1 mm en más de una derivación del plano
horizontal observada dentro de los 20 minutos de la angiografía
coronaria, 3) la anatomía coronaria adecuada para la trombectomía
X-sizer, 4) sin tratamiento trombolítico, 5)
material trombótico visible en el filtro y la unidad de botella del
X-sizer indicando la trombectomía exitosa y 6) el
consentimiento informado. Los criterios para el uso del
X-sizer fueron un diámetro de vaso \geq3 mm, un
defecto de contraste intraluminal grande, lo que sugiere trombos
dentro de 50 mm del ostium respectivo, con flujo de TIMI
0-1 después del pasaje de la guía angiográfica, en
ausencia de tortuosidad grave de los vasos, calcificación o acceso
vascular difícil.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Además, ocho pacientes consecutivos admitidos a
la institución para la evaluación del dolor de pecho de la angina,
se sometieron a angiografía coronaria y sirvieron como controles. La
AE (n=40) se definió mediante el típico dolor de pecho de la angina
causada por esfuerzo que se alivia mediante el reposo, la
administración de gliceril trinitrato o ambos con respuesta
positiva al ensayo de ECG bajo estrés de ejercicio y \geq50% de
estenosis de diámetro en \geq1 arteria coronaria en la
cateterización. Los pacientes con AI (n=40) se definieron de
acuerdo con los criterios de Braunwald.24. Todos los pacientes con
AI de clase IIIB tenían cambios en los segmentos ST diagnósticos,
inversión de la onda T o ambas. Ningún paciente incluido en el
estudio presentó pruebas de un proceso sistémico o inflamatorio
cardiaco en curso como se define mediante la historia clínica. La
Tabla 1 resume las características clínicas demográficas e
iniciales.
Se heparinizó a los pacientes a un tiempo de
coagulación activado \geq300 s y 250 mg de aspirina. Todas las
muestras sanguíneas se recogieron de la arteria femoral en
vacutainers citrato, se centrifugaron de manera inmediata (1300 xg,
4ºC, 10 minutos) y sirvieron como controles internos para las
muestras sanguíneas obtenidas directamente de la arteria coronaria
ocluida. El plasma pobre en plaquetas se congeló a -80ºC hasta los
ensayos. El sistema de catéter para la trombectomía
X-sizer (EndiCOR Medical Inc) consiste en un eje de
catéter de lumen dual conectado a un módulo de control portátil. El
lumen interno contiene un cortador helicoidal rotado a ~2.100 rpm
lo que aumenta la succión en el trombo además de aspirar a través
del lumen externo (véase la Figura 1).
Unos centímetros antes de la botella de vidrio
de vacío, el aspirado pasa una pequeña unidad de filtración en la
que el material trombótico y las partículas de la placa quedan
atrapadas, mientras que la sangre se aspira en la botella de vidrio
heparinizada. La sangre se transfirió de manera inmediata en los
vacutainers citrato y se centrifugó como se describe anteriormente.
El material del trombo atrapado en la unidad de filtro se fijó en
el 7,5% de formalina tamponada durante una noche, se incluyó en
parafina y se realizaron secciones en serie de 3 \mum con un
microtomo. La sangre aspirada por el lumen de la aspiradora se
transfirió inmediatamente en vacutainers citrato y procoagulantes
como se describe anteriormente. Las muestras se congelaron
inmediatamente a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron las concentraciones de proteína
mediante ELISA, adquirido de BenderMedSystems (Austria) y MBL
International (Estados Unidos). Se detectaron los niveles de
TNF-\alpha mediante ELISA de alta sensibilidad
(BenderMedSystems, Austria). Los ensayos se realizaron siguiendo las
instrucciones del fabricante. En pocas palabras, las placas se
prerevistieron o revistieron con un anticuerpo de revestimiento
suministrado, se sellaron y se incubaron durante una noche a 4ºC.
Se lavaron las placas (Tween 20 0,5 ml ad 1l de PBS) y se bloquearon
con tampón de ensayo (5 g de BSA; 0,5 ml de Tween 20 ad 1l de PBS)
durante dos horas a temperatura ambiente. Después se lavaron de
nuevo y se añadió un conjugado de biotina a cada pocillo. Además se
incubaron las placas durante 2 horas, se lavaron y se incubaron con
estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP).
Después de 1 hora de tratamiento y una etapa adicional de lavado, se
añadió la solución sustrato TMB (Sigma-Aldrich, St.
Louis, Ml, Estados Unidos). Cuando el desarrollo de color fue
evidente la reacción se finalizó con ácido sulfúrico 1 N. Se
leyeron las placas a 450 nm en un contador Wallac Multilabel 1420
(PerkinElmer, Estados Unidos).
\vskip1.000000\baselineskip
Un ELISA comercial, proporcionado por
BenderMedSystems (Austria), se usó para medir ECI. El ELISA de ECI
detecta tanto el precursor p45 como el complejo enzimáticamente
activo p10:p20. La interacción entre ECI y su sustrato precursor se
produce exclusivamente dentro de la célula. Las muestras y los
patrones se diluyeron en un diluyente de ensayo proporcionado. Las
placas se incubaron durante dos horas y se lavaron tres veces.
Después de otro periodo de incubación con un anticuerpo secundario
y una etapa de lavado se añadió el anticuerpo de detección
conjugado con HRP. Se incubaron las placas durante 30 minutos en un
dispositivo de rotación. Después se vaciaron y lavaron antes de que
se añadiera la solución sustrato TMB
(Sigma-Aldrich). La reacción de color se paró con
ácido sulfúrico 1 N y se sometió a una medición en un contador
Wallac Multilabel 1420 (PerkinElmer) a una longitud de onda 450
nm.
\vskip1.000000\baselineskip
El neoepítopo M30 de CK-18
circulante se midió mediante ELISA, adquirido de PEVIVA AB (Bromma,
Suecia). Este ELISA usa un anticuerpo monoclonal que reconoce un
epítopo en el fragmento de 236-396 de
CK-18 como receptor y un M30 conjugado con HRP como
detector. Los niveles de antígeno M30 se expresan en unidades/l. Una
unidad corresponde a 1,24 pmol de un péptido sintetizado que
contiene el motivo de reconocimiento de M30 de acuerdo con el
fabricante. La sensibilidad del ELISA es 30 U/l. Los coeficientes de
variación intra- e interensayos del ELISA CK-18
fueron 0,7-5,8% y 2,8-4,8%,
respectivamente. La cantidad de proteínas en cada muestra se calculó
de acuerdo con una curva patrón de valores de densidad óptica
construida para niveles conocidos de neoepítopo M30 de
CK-18. (Leers MP, Kolgen W, Bjorklund V, et
al., J Pathol 1999; 187(5): 567-72).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de la apoptosis se usó un
anticuerpo monoclonal de ratón contra el neoepítopo M30 25. Se
fijaron trombos frescos de pacientes con IAM en el 7,5% de formalina
tamponada y se incluyeron en parafina. Consecutivo, se tiñeron
secciones de 3 \mum con hematoxilina y fucsina ácida naranja G
(tinción tricrómica). Para la inmunotinción, se aplicó un
pretratamiento por microondas en tampón citrato (2x5 min, 600 W).
Para evitar la tinción inespecífica, se trataron las muestras con
el 5% de BSA (Sigma-Aldrich/solución salina
tamponada con tris (TBS) durante 30 minutos. Después, se incubaron
las muestras con el anticuerpo primario (1:50, anticuerpo
anti-M30, Roche, Alemania) durante una noche a
temperatura ambiente. Después de esto se incubó con anticuerpo de
ratón marcado con biotina (1:100, Vector Laboratories, Bulingame,
CA, Estados Unidos) durante 1 hora y por la detección mediante
fosfatasa alcalina conjugada con
estreptavidina-AP/10% de suero humano (1:100, Dako,
Dinamarca). La visualización se consiguió con rojo rápido (Sigma,
Estados Unidos). Para los controles negativos, se sustituyeron
anticuerpos primarios mediante IgG de ratón irrelevante.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se presentan como la media \pm
SEM, si no se afirma lo contrario. Debido al tamaño de muestra
relativamente pequeño, se usó el ensayo U
Mann-Whitney para calcular la significancia. Un p
valor de 0,05 se considera significativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las características demográficas y algunas
iniciales de pacientes se representan en la tabla 1. Tanto en los
grupos de estudio AE como los AI, un número similar de pacientes
tuvo una historia de infarto de miocardio o una intervención
coronaria previa (injerto de derivación de la arteria coronaria o
angioplastia coronaria transluminal percutánea). Los factores de
riesgo establecidos para la enfermedad coronaria, las
concentraciones totales de colesterol y los hallazgos angiográficos
fueron similares en ambos grupos.
El grupo IAM incluyó 40 pacientes, 28 hombres
(70%) y 12 mujeres (30%). La edad media fue de 59,3 años. El 30% de
los pacientes tuvo una terapia de revascularización previa mediante
ICP o cirugía de derivación. Nueve (22,5%) de los pacientes del
presente estudio padecieron diabetes, 25 (62,5%) hipertensión y 21
(52,5%) eran fumadores. Los niveles medios de colesterol fueron
206,3 mg/dl (ULN=199 mg/dl) y los triglicéridos fueron 204,6 mg/dl
(ULN=172 mg/dl). Los niveles medios de proteína C reactiva fueron
3,6 mg/dl (ULN=1 mg/dl) lo que indicó un proceso inflamatorio
sistémico. Diecinueve (47,5%) padecieron enfermedad de dos o tres
vasos. Sólo en un paciente la arteria principal izquierda estuvo
implicada. Más de la mitad de los pacientes (52,5%) mostraron
función ventricular izquierda reducida identificada mediante
ecocardiografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar si el síndrome de respuesta
inflamatoria sistémica se simula en el sitio del IAM en comparación
con AE y AI, se obtuvieron muestras plasmáticas mediante
X-sizer y se evaluaron. Las muestras plasmáticas
obtenidas de la arteria femoral en pacientes que padecían IAM
sirvieron como controles internos. Los derivados de citoquinas
inflamatorias (IL-1\betap,
IL-1\beta, TNF-\alpha,
TNF-R1, sCD40 y CD40L) y sus significancias se
representan en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se representa en la figura 1 los niveles
medios de plasma de la ECI soluble fueron 68,6 \pm 20,2 en AE,
81,5 \pm 24,3 en AI, 96 \pm 27,1 en IAM femoral (periférico) y
282,2 \pm 180 en las muestras IAM de arteria coronaria. Estos
datos prueban un aumento significativo en la concentración de ECI en
la muestra derivada del sitio del infarto de miocardio en
comparación con el nivel sanguíneo sistémico así como con AE y AI
(AE frente a AI p=0,023, AI frente a IAM periférico p=0,022 e IAM
periférico frente a IAM coronario p<0,001).
Los resultados que se representan en la Figura 2
muestran un aumento notable en la concentración del neoepítopo M30
de CK-18 en el plasma derivado del sitio del infarto
de miocardio en comparación con la periferia (411 \pm 15,3 frente
a 336,8 \pm 9,9, p=0,001). Se descubrieron más diferencias
significativas entre el IAM periférico y AI (336,8 \pm 9,9 frente
a 255 \pm 5, p<0,001), así como AI y AE (255,5 \pm 8,9 frente
a 232,4 \pm 4,9, p=0,027).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron los trombos recogidos mediante el
dispositivo de trombectomía a una inmunohistoquímica así como a una
tinción rutinaria con hematoxilina/eosina (HE) y fucsina ácida
naranja G. La Figura 3 (A, B, C, D) muestra un trombo
representativo (n=8) que produce isquemia miocárdica aguda. El panel
(A), que representa la tinción HE, contiene áreas descoloridas que
por otra inmunohistoquímica se determinó que consistían no sólo de
fibrina sino que también de cantidades significativas del
microfilamento de CK-18. Además, se pueden observar
los leucocitos y eritrocitos dispersos. Mediante tinción
inmunohistoquímica en las porciones centrales del trombo las áreas
positivas CK-18 son detectables (panel C), las que
principalmente corresponden a áreas ricas en precipitados de
fibrina (véase la tinción por fucsina ácida naranja G, panel B). El
panel D representa una tinción de control inespecífica para M30. La
capa de leucocitos de sangre periférica sirvió como controles
internos.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra que ECI, un miembro de la
familia caspasa, está notablemente aumentada en el sitio de la
trombosis coronaria aguda en pacientes que padecen IAM y sólo
moderadamente en la periferia así como en la AI, en comparación con
la AE. Interesantemente, en pacientes con IAM, este hallazgo se
asocia con un elevado contenido del microfilamento
CK-18 sistémico, un producto de la activación
específica de la caspasa.
La ECI/caspasa-1, una proteasa
con Cys285 que sirve como el residuo catalítico, escinde el
precursor de IL-1\beta inactivo biológicamente de
31 kDa en Asp116-Ala117 para generar la forma madura
de 17,5 kDa de IL-1\beta (Bombeli T, Karsan A,
Tait JF, Harlan JM., Blood 1997;89(7):
2429-42) (Kostura MJ, Tocci MJ, Limjuco G, et
al., Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86(14):
5227-31). La enzima activa consiste en dos
subunidades no idénticas (p10 y p20), de las que ambas son
esenciales para la actividad enzimática y por lo tanto desempeñan
una función esencial en la apoptosis de distintas células
incluyendo cardiomiocitos. La expresión aumentada de ECI en la
hipertrofia cardiaca, la sobreproducción de
TNF-\alpha en la cardiomiopatía (Kubota T,
Miyagishima M, Frye CS, et al., J Mol Cell Cardiol 2001;
33(7): 1331-44) y la disfunción miocárdica
inducida por endotoxinas (Fauvel H, Marchetti P, Chopin C,
Formstecher P, Neviere R., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001;
280(4): H1608-14) condujeron la evaluación
de la presencia de ECI soluble en el sitio del IAM. Se observó un
incremento medio de 4,1 veces de ECI en el sitio del IAM en
comparación con AI. Probablemente en condiciones de estrés
endotóxico o hipotónico se permite que la caspasa-1
actúe sinérgicamente con estos estresantes fisiológicos e induzca
la apoptosis mediante la caspasa-3. En un modelo
experimental de isquemia y daño por reperfusión se ha descubierto
que la transfección génica del antagonista del receptor
IL-1 reduce el tamaño del infarto (Frantz S,
Ducharme A, Sawyer D, et al., J Mol Cell Cardiol 2003;
35(6): 685-94.) y los niveles miocárdicos
aumentados de ECI pueden predisponer al daño miocárdico apoptótico
en condiciones de estrés (Syed FM, Hahn HS, Odley A, et al.,
Circ Res 2005; 96(10): 1103-9).
La Citoqueratina 18 un componente principal de
los filamentos intermedios, se expresa ampliamente los tejidos
epiteliales y en pequeñas cantidades en los fibroblastos y otras
células no epiteliales (Schaafsma HE, Ramaekers FC., Pathol Annu
1994; 29 Pt 1: 21-62). La Citoqueratina 18 se
fosforila en células apoptóticas, los sitios principales son en la
serina 53 y los microfilamentos se agregan rápidamente (Ku NO, Liao
J, Omary MB., J Biol Chem 1997; 272(52):
33197-203) (Caulin C, Salvesen GS, Oshima RG., J
Cell Biol 1997; 138(6): 1379-94). Diferentes
condiciones de estrés tales como el estrés por choque de calor y la
infección viral, pueden aumentar la reorganización y la solubilidad
de los microfilamentos y la polimerización alterada (Ku NO, Liao J,
Omary MB., J Biol Chem 1997; 272(52):
33197-203.) (Schutte B, Henfling M, Kolgen W, et
al., Exp Cell Res 2004; 297(1): 11-26).
La CK-18 fosforilada es un sustrato preferencial
para la proteolisis. La escisión de CK-18 mediada
por caspasa durante la apoptosis (Caulin C, Salvesen GS, Oshima
RG., J Cell Biol 1997; 138(6): 1379-94)
conduce a la formación de un neoepítopo específico, que reconoce el
anticuerpo M30 (Leers MP, Kolgen W, Bjorklund V, et al., J
Pathol 1999; 187(5): 567-72) (Kadyrov M,
Kaufmann P, Huppertz B., Placenta 2001; 22(1):
44-8). Interesantemente, un aumento notable en la
concentración de CK-18, neoepítopo M30, se midió en
el plasma obtenido directamente del sitio del infarto de miocardio.
Además, el contenido aumentado de CK-18 se
corroboró mediante el hallazgo de que el dispositivo de trombectomía
obtuvo trombos en IAM teñidos positivamente para
CK-18. Esta nueva característica de trombo puede
servir como una explicación adicional de porque las terapias
trombolíticas intravenosas que se dirigen a la lisis de la fibrina,
sólo restauran de manera incompleta el flujo coronario temprano y
completo en \geq50% de pacientes que padecen IAM (Valgimigli M,
Merli E, Malagutti P, et al., Arch Biochem Biophys 2003;
420(2): 255-61.) (Topol EJ. Toward,
Circulation 1998; 97(2): 211-8) (Rentrop KP.,
Circulation 2000; 101 (13): 1619-26).
El CD40L/CD154 es una proteína unida a la
transmembrana que expresan una variedad de células activadas
asociadas con el ateroma alterado, tales como las células
endoteliales vasculares, los macrófagos, los linfocitos T, las
células musculares lisas y las plaquetas (Mach F, Schonbeck U,
Sukhova GK, et al., Proc Natl Acad Sci U S A1997;
94(5): 1931-6). Este mediador proinflamatorio
puede escindirse de las membranas celulares para formar el sCD40L,
que mantiene sus propiedades biológicas para interaccionar con CD40
e iniciar una respuesta inflamatoria variada (Mach F, Schonbeck U,
Sukhova GK, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1997;
94(5): 1931-6) (Aukrust P, MullerF, UelandT,
et al., Circulation 1999; 100(6):
614-20). Los niveles aumentados de sCD40L se han
encontrado previamente en pacientes con AI (Aukrust P, Muller F,
Ueland T, et al., Circulation 1999; 100(6):
614-20) e infarto de miocardio. (Ohashi Y, Kawashima
S, Mori T, et al., Int J Cardiol 2005). De acuerdo con estos
hallazgos, los resultados presentes probaron un aumento
significativo de sCD40L en el sitio del infarto agudo de miocardio,
en comparación con AE.
Se ha mostrado previamente que el daño
endotelial es una parte integral del IAM y AI, (Mutin M, Canavy I,
Blann A, Bory M, Sampol J, Dignat-George F., Blood
1999; 93(9): 2951-8) y el suero de pacientes
con AI es proapoptótico en las células endoteliales de la vena
umbilical humana en comparación con aquel de pacientes con AE
(Valgimigli M, Agnoletti L, Curello S, et al., Circulation
2003; 107(2): 264-70). Además, cuando el
último suero reevaluó al año de seguimiento, en condiciones
clínicamente estables, se observó que ya no difería del de
pacientes con lesiones estables, lo que sugiere que la actividad
apoptótica aumentada del suero está ligada temporalmente a AI.
Los procesos inflamatorios tanto localmente
dentro de la placa aterosclerótica, como sistémicamente, dentro de
la circulación, son características establecidas en la patogénesis
de la enfermedad coronaria (Braunwald E. Circulation 1989;
80(2): 410-4). Se ha sugerido que la
apoptosis de las células endoteliales que cubren las lesiones
ateroscleróticas puede llevar a la ruptura de la placa y esta
liberación de factor tisular cargado de micropartículas de membrana
mediante células que experimentan la apoptosis podría iniciar
directamente la cascada de coagulación. La técnica de la
trombectomía aguda en el infarto de miocardio ofrece una posibilidad
única de recoger muestras sanguíneas directamente fuera de la
arteria coronaria causante en el momento del acontecimiento agudo y
compararlo con la sangre sistémica. Los datos sugieren que la
activación sistémica de los procesos inmunológicos en interacción
con apoptosis aumentada localmente en particular es un mecanismo
clave en el IAM.
El presente ejemplo es el primero en informar
sobre las elevadas proteínas especificas de apoptosis/inflamatorias
en el sitio de la trombosis coronaria aguda en comparación con la
sangre periférica de pacientes que padecen IAM. Se sabe de estudios
previos que IAM es un resultado de la placa inflamada localmente
seguido de la ruptura de la placa y la posterior oclusión
trombótica del vaso y la inflamación sistémica (Mutin M, Canavy I,
Blann A, Bory M, Sampol J, Dignat-George F., Blood
1999; 93(9): 2951-8). La expresión de genes
proapoptóticos como BAX, CASP1, FAS, p53 o PCNA fue
significativamente más alta en placas de SCA derivadas de
ateretectomía coronaria direccional, mientras que los genes
antiapoptóticos, como MDM2 se expresaron más en placas de pacientes
a los que se les había diagnosticado AE (Rossi ML, Marziliano N,
Merlini PA, et al. Circulation 2004; 110 (13):
1767-73). Los procesos inflamatorios sistémicos
incluyen entre otros la infiltración de monocitos, la atracción de
neutrófilos y la expansión de la placa desestabilizando las células
CD4+CD28- (Zal B, Kaski JC, Arno G, et al. Circulation 2004;
109(10): 1230-5). Estas observaciones indican
que los mecanismos por debajo de la homeostasis y la reparación
celular son activos y más equilibrados en la AE, mientras que las
placas inestables se podrían caracterizar mediante la muerte celular
programada desequilibrada que es resultado de la activación de
genes proapoptóticos. Además se informó de que los anticuerpos
dirigidos contra la anti-proteína del choque
térmico de 60 kDa, el colesterol, Clamydia pneumonie y
CK-18 (Willseron JT. Prog. Cardiovasc Dis 2002;
44(6): 569-78), se asocian con la enfermedad
cardiaca isquémica.
Los niveles aumentados de ECI y
CK-18 o fragmentos de los mismos, además de CD40L,
se asocian con la inestabilidad clínica y por lo tanto se pueden
considerar como características patognómicas de los síndromes
coronarios agudos. Esta información obtenida in vivo se
traslada a los ensayos incluyendo el uso farmacológico de los
inhibidores de caspasa en la prevención de la apoptosis del
cardiomiocito y la expansión del infarto de miocardio (Yaoita H,
Ogawa K, Maehara K, Maruyama Y. Circulation 1998; 97(3):
276-81). Las terapias nuevas que se dirigen a
CK-18 o fragmentos de la misma están garantizadas en
el IAM.
En resumen, el dispositivo de trombectomía
X-sizer se utilizó en pacientes que padecían de IAM
(n=40). Se incluyeron como poblaciones control AI (n=40) y AE
(n=40). Las proteínas específicas de apoptosis e inflamatorias el
precursor de IL-1\beta
(IL-1\betap), IL-1\beta,
TNF-\alpha, TNF-R1, CD40, CD40L,
la enzima conversora de interleucina-1\beta/ECI y
el CK-18 se determinaron mediante ELISA. Se usó la
inmunohistoquímica para evaluar la presencia de
CK-18 en el trombo coronario obtenido de pacientes
que padecían IAM. Las comparaciones de grupos se evaluaron mediante
el ensayo U Mann-Whitney.
Se determinó que IL-1\betap,
ECI y CK-18 (o sus fragmentos) solubles eran nuevos
discriminadores para AE y AI (p=0,034, p=0,023, p=0,027,
respectivamente). Interesantemente, las ECI y CK-18
solubles estaban aumentadas significativamente en el sitio del
infarto de miocardio en comparación con la sangre sistémica (ambos
p=0,001), lo que indicó una función patognómica nueva en el
acontecimiento agudo del infarto de miocardio. Esta observación se
corroboró mediante el hallazgo de que el M30, un anticuerpo capaz de
identificar CK-18, se tiñó de manera positiva en el
trombo coronario que provocaba el infarto de miocardio.
El infarto agudo de miocardio se relaciona con
niveles sistémicos aumentados de ECI y CK-18 in
vivo.
La utilización de dispositivos de trombectomía
permite la eliminación del material trombótico intracoronario que
ofrece la única posibilidad de recoger sangre y trombos y plasma en
la arteria coronaria ocluida y de manera concomitante en la arteria
femoral para comparar las proteínas específicas de apoptosis e
inflamatorias. Los pacientes con angina estable e inestable
sirvieron como control (todos los grupos, n=40). Las comparaciones
de grupos se evaluaron mediante el ensayo U de Mann Whitney.
Las proteínas específicas de apoptosis e
inflamatorias IL-1\betap,
IL-1\beta, hs-TNF\alpha,
TNF-R1, CD40, CD40L, enzima conversora de
interleucina-1\beta/ECI y CK-18 se
determinaron mediante ELISA. Se utilizó la inmunohistoquímica para
evaluar la presencia de CK-18 en el trombo coronario
obtenido de pacientes que padecieron infarto agudo de
miocardio.
La nueva información pertenece a: se identificó
que IL-1\betap, ECI y CK-18
solubles eran nuevos discriminadores entre la angina estable e
inestable (p=0,034, p=0,023, p=0,027, respectivamente).
Interesantemente, IL-1\beta,
hs-TNF\alpha, TNF-R1, CD40 y CD40L
no cumplieron ninguna significancia en el grupo inestable frente a
estable de la cohorte angina. Sin embargo, tiene que afirmarse que
la concentración de CD40L determinada en el presente ejemplo fue
comparable a los valores medios determinados en la bibliografía de
relevancia.
Interesantemente, ECI y CK-18
aumentaron significativamente en el sitio del infarto de miocardio
en comparación con la sangre sistémica en pacientes con infarto
agudo de miocardio (ambos, p=0,0001). Esto indica una función
patognómica nueva en el acontecimiento agudo del infarto de
miocardio. Esta observación se corroboró mediante el hallazgo de
que M30, un anticuerpo capaz de identificar CK-18,
se tiñó positivamente en el trombo que provocaba el infarto de
miocardio.
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inflammation in patients with unstable atherosclerotic plaques.
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569-78.
Claims (7)
1. El método para diagnosticar una enfermedad
cardiovascular en un individuo comprendiendo las etapas de:
- -
- proporcionar una muestra sanguínea de un individuo,
- -
- determinar la cantidad de fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa en dicha muestra,
- -
- comparar la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en dicha muestra con la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa presentes en un control de referencia de al menos un individuo que no padece una enfermedad cardiovascular y
- -
- diagnosticar una enfermedad cardiovascular si la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en la muestra está aumentada en comparación con la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en el control de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado por que la enfermedad cardiovascular es
aterosclerosis, una enfermedad coronaria, un síntoma agudo
coronario, preferiblemente angina de pecho inestable o infarto
agudo de miocardio, angina de pecho estable, accidente
cerebro-vascular, preferiblemente accidente
cerebro-vascular isquémico, enfermedad inflamatoria
o autoinmune asociada con arteriosclerosis o reestenosis.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
a 2, caracterizado por que la cantidad de fragmentos de
citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa
está determinada inmunológicamente, preferiblemente mediante ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas, mediante radioinmunoensayo o
mediante análisis de transferencia de Western.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la muestra
sanguínea es plasma o suero.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la muestra
sanguínea se obtiene de la arteria femoral.
6. Uso de un kit para el diagnóstico in
vitro de una enfermedad cardiovascular, para distinguir entre
la angina de pecho estable e inestable o para diagnosticar la angina
de pecho estable e inestable en un individuo o para evaluar el
riesgo de un individuo de desarrollar un trombo en el sistema
cardiovascular, comprendiendo el kit:
- -
- medios para detectar los fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa y
- -
- un control de referencia, en el que
dichos medios comprenden anticuerpos dirigidos
contra fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa y
en los que el control de referencia se obtiene a partir de al menos
un individuo que no padece una enfermedad cardiovascular o de al
menos un individuo que padece una angina de pecho estable o
inestable.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6,
caracterizado por que la enfermedad cardiovascular es
aterosclerosis, una enfermedad coronaria, un síntoma coronario
agudo, preferiblemente una angina de pecho inestable o infarto
agudo de miocardio, angina de pecho estable, accidente
cerebro-vascular, arteriosclerosis o reestenosis
asociadas a enfermedad inflamatoria o autoinmune.
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