ES2346483T3

ES2346483T3 - Metodo para diagnosticar enfermedades cardiovasculares.

Info

Publication number: ES2346483T3
Application number: ES07718389T
Authority: ES
Inventors: Hendrik Jan Ankersmit
Original assignee: Medizinische Universitaet Wien
Current assignee: Medizinische Universitaet Wien
Priority date: 2006-04-24
Filing date: 2007-04-16
Publication date: 2010-10-15
Anticipated expiration: 2027-04-16
Also published as: EP2010921A2; WO2007121495A3; US20090098104A1; DE602007007595D1; EP2010921B1; US8129135B2; WO2007121495A2; JP2009534672A; ATE473448T1

Abstract

El método para diagnosticar una enfermedad cardiovascular en un individuo comprendiendo las etapas de: - proporcionar una muestra sanguínea de un individuo, - determinar la cantidad de fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa en dicha muestra, - comparar la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en dicha muestra con la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa presentes en un control de referencia de al menos un individuo que no padece una enfermedad cardiovascular y - diagnosticar una enfermedad cardiovascular si la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en la muestra está aumentada en comparación con la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en el control de referencia.

Description

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Método para diagnosticar enfermedades cardiovasculares.

La presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad cardiovascular.

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS; Ginebra) las enfermedades cardiovasculares son la causa de más de 15 millones de muertes en el mundo cada año. Explican el 50% de todas las muertes en varios países desarrollados y más del 50% en África y en el Oeste y Sudeste Asiático. También son la causa principal de muerte en adultos. Además, muchos incidentes cardiovasculares no son necesariamente letales, pero pueden afectar a la capa-
cidad de vivir una vida diaria normal, lo que da como resultado enormes costes de asistencia sanitaria para la sociedad.

Debido a la mejora en las medicaciones agudas y crónicas y los procedimientos quirúrgicos, así como los cambios en el estilo de vida y en la alimentación, ha habido unos descensos significativos en la mortalidad total de las enfermedades cardiovasculares durante las últimas décadas. A pesar de ello, debido a estas altas incidencias y tasas de mortalidad, las enfermedades cardiovasculares son objeto de enormes inversiones por parte de tanto industrias biotecnológicas como farmacéuticas.

Sin embargo, un tratamiento y una prevención eficaces de las enfermedades cardiovasculares no sólo implica la administración de los medicamentos adecuados si no que también necesita herramientas de diagnóstico fiables. Por lo tanto, es de gran importancia, la identificación y el uso de marcadores moleculares de enfermedades cardiovasculares para el diagnóstico y la prevención precoces. Por ejemplo, las troponinas cardiacas las liberan de manera selectiva los miocardiocitos dañados. La especifidad de este acontecimiento es suficientemente alta para producir mejoras en el diagnóstico de trastornos isquémicos cardiacos agudos. Además permite al médico predecir el riesgo y los escenarios de resultados para los pacientes de manera más fiable.

Además, la búsqueda de marcadores biológicos indicativos de la formación de aterosclerosis, de su progreso y desestabilización es de gran importancia en los entornos clínicos de síndromes coronarios agudos y otras entidades clínicas relacionadas con acontecimientos isquémicos, por ejemplo el accidente cerebro-vascular.

A día de hoy, múltiples líneas de evidencia sugieren que la aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica e implica componentes del sistema inmune en la aterogénesis. Recientemente, el trabajo de investigación identificó la participación del potente mediador inmune CD40 y su equivalente el ligando de CD40 (CD40L o CD154) de estar implicados en la inflamación. Previamente, se sugirió que los marcadores de la inflamación general tales como la proteína C reactiva de alta sensibilidad (hsCRP) y la interleucina-6, así como el amiloide del suero, estaban relacionados con resultados adversos en pacientes con enfermedad coronaria.

Bancher-Todesca et al (Hypertens in Pregnancy. (2001): 89-98) describe la sobreexpresión de CK-18 en mujeres que padecen hipertensión inducida por el embarazo (HIE).

En el documento WO 99/16789 se describen los compuestos antigénicos relacionados con la apoptosis.

En Nikkari Seppo T et al (Atherosclerosis (98) 1993: 11-16) se describen los autoanticuerpos en enfermedades coronarias por lo que los Autores de dichos estudios especulan sobre la asociación entre la unión de Anticuerpos, entre otros a CK-18 y las enfermedades coronarias.

En Adlbrecht C et al (Europ. J. Clin. Invest. 37 (2007): 372-380) se analizan los niveles elevados de la enzima conversora de interleucina \beta y la citoqueratina 18 escindidos por caspasa en el infarto agudo de miocardio.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para diagnosticar enfermedades cardiovasculares en un individuo. También se describe un método para distinguir la angina de pecho estable de la inestable y medios para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, en particular enfermedades asociadas con la trombosis.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad cardiovascular en un individuo, comprendiendo las etapas de:

-: proporcionar una muestra sanguínea de un individuo,

-: determinar la cantidad de fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa en dicha muestra,

-: comparar la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en dicha muestra con la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa presentes en un control de referencia de al menos un individuo que no padece una enfermedad cardiovascular y

-: diagnosticar una enfermedad cardiovascular si la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en la muestra está aumentada en comparación con la cantidad de los fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en el control de referencia.

Además, se descubrió que la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma y de precursor de IL-\beta en una muestra de un individuo que padecía o que se sospechaba que padecía una enfermedad cardiovascular en comparación con una muestra de un individuo sano indica una enfermedad cardiovascular. La cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma y de precursor de IL-1\beta en una muestra de un individuo que padece una enfermedad cardiovascular está aumentada y disminuida, respectivamente, en comparación con la cantidad de dichos marcadores en una muestra obtenida de un individuo sano que no padece una enfermedad cardiovascular.

La inflamación local y sistémica desempeña una función principal en las enfermedades cardiovasculares, en particular en síndromes coronarios agudos (SCA), incluyendo la angina inestable (AI) y el infarto agudo de miocardio (IAM). Distintos datos indican que la apoptosis es un acontecimiento clave durante el desarrollo y el progreso de la placa aterosclerótica. Aunque se ha demostrado claramente que el IAM ocurre como un resultado directo de la necrosis miocítica inducida por isquemia, se ha descrito la apoptosis como una entidad importante que contribuye después de la oclusión de la arteria coronaria. Mecánicamente, la formación de trombos después de la ruptura de la placa supone la oclusión de los vasos en el IAM y contribuye a un flujo comprometido en la AI. La intervención coronaria percutánea urgente (ICP) es la opción de tecnología punta para el tratamiento de pacientes con SCA y se asocia con tasas de reperfusión más altas y mejor resultado que la terapia trombolítica. Sin embargo, la ICP conlleva el riesgo de movilizar material trombótico y trombogénico, produciendo embolización distal y daño microcirculatorio, que puede limitar la recuperación miocárdica.

Se introdujeron varios dispositivos de trombectomía en el área clínica para permitir la fragmentación y eliminación de material trombótico intracoronario en el entorno del IAM. En prospectiva, los ensayos aleatorizados, por ejemplo el dispositivo de trombectomía X-sizer se ha mostrado que mejora el flujo epicardiaco y la resolución del segmento ST. Sin embargo, no se podría demostrar la mejora de la supervivencia o una mejor recuperación miocardiaca en estos estudios. A pesar del efecto de la trombectomía aguda en la supervivencia, no se probaron la función ventricular y la mejora de la calidad de vida en grandes ensayos multicéntricos hasta el día de hoy, la técnica ofrece la posibilidad de recoger muestras sanguíneas del sitio de la trombosis arterial aguda en la arteria coronaria para permitir la investigación de proteínas que se sabe que están asociadas con la inflamación y apoptosis.

La apoptosis se refiere a las alteraciones morfológicas que exhiben las células que están muriendo "activamente" que incluyen la retracción celular, la vesiculización de la membrana, la condensación de la cromatina y la fragmentación del ADN. La muerte celular apoptótica puede ser el resultado de la activación controlada del desarrollo de programas de ejecución endógenos o de la transducción de señales de muerte activadas por una gran variedad de estímulos exógenos. Una vía principal necesita la activación del receptor de la enzima conversora de interleucina 1\beta (ECI) y una familia de proteasas de cisteína de tipo proteína 32, homólogas al producto génico del gen de muerte celular ced-3 de Caenorhabditis elegans. Otras proteínas que se conoce que están asociadas con la inflamación y la apoptosis incluyen IL-1\beta y el precursor de IL-1\beta (IL-1\betap), TNF-\alpha y TNF-R1/CD120a, CD95 y CD95L/CD178, CD40 y CD40L/CD154. Además, los pacientes con AI muestran concentraciones aumentadas de componentes solubles desprendidos de la membrana, procedentes de células CD3+ activadas, macrófagos y células endoteliales, lo que indica una renovación apoptótica periférica intravascular aumentada. Se indicó que estas partículas que se desprenden de la membrana habían aumentado la capacidad procoagulativa. Además, se descubrió que pacientes con enfermedad cardiaca isquémica desarrollan anticuerpos contra la citoqueratina 18 (CK-18) o fragmentos de la misma, un producto del citoesqueleto que se presenta en las células endoteliales y la microvasculatura cardiaca que están experimentando apoptosis.

Se ha descrito en publicaciones que todos estos marcadores son pronosticadores positivos de la enfermedad coronaria y se describió que los p-valores estaban en un intervalo de 0,04-0,05.

El término "control de referencia", como se usa en este documento, significa una muestra de preferiblemente la misma fuente (por ejemplo sangre, suero, etc.) que se obtiene de al menos un individuo sano para compararse con la muestra del individuo a analizar. Para recoger resultados comparables el control de referencia, así como la muestra del individuo, deben obtenerse, manipularse y tratarse de la misma forma. El número de individuos sanos para obtener un valor de control de referencia puede ser al menos 1, preferiblemente al menos 2, más preferiblemente al menos 5, aún más preferiblemente al menos 10, en particular al menos 20. Sin embargo, también se pueden obtener valores de al menos 100, 1000 ó 10000 individuos.

"Cantidad" y el término que se usa como su sinónimo "nivel", como se usa en el contexto de la presente invención significa la concentración de un marcador presente en una muestra.

Las expresiones "la cantidad está aumenta en comparación con" y "la cantidad está disminuida en comparación con", como se usa en este documento, significan que la cantidad determinada en la muestra a analizar diverge con significancia estadística del valor control o "normal" (= sano), por ejemplo al menos el 30%, preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 100%, aún más preferiblemente al menos el 200%, de la cantidad del control de referencia. Como se usa en el presente documento, el término "CK-18 o fragmentos de la misma" se refiere a CK-18 y los fragmentos específicos de la misma que se obtienen por ejemplo mediante la escisión mediada por caspasa de la citoqueratina 18 en células apoptóticas y que se liberan a partir de células (véase, por ejemplo Kramer G et al. Cancer Res. (2004) 64:1751-1756). Los fragmentos específicos son aquellos que se reconocen específicamente como productos de la degradación de CK-18 que se producen mediante procesos fisiológicos o patológicos dentro del cuerpo humano. Los fragmentos específicos de CK-18 también se pueden producir in vitro por ejemplo mediante el tratamiento por proteasas o químico de CK-18 o (mediante una fragmentación mayor de) mediante fragmentos generados fisiológicamente-patológicamente. Estos fragmentos de CK-18 deben -en cualquier caso- ser específicos de CK-18 (es decir identificarse de manera no ambigua como fragmentos de CK-18) y deberían tener al menos 8 residuos de aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 10 aminoácidos de longitud, especialmente al menos 15 aminoácidos de longitud. Estos fragmentos deberían tener (o seleccionarse para tener) una secuencia de aminoácidos característica (única) para que se reconozcan específicamente. Los fragmentos preferidos de CK-18 tienen una longitud de 50 a 400 residuos de aminoácidos, preferiblemente de 100 a 350 residuos de aminoácidos, especialmente de 150 a 300 residuos de aminoácidos. La CK-18 o los fragmentos de la misma pueden detectarse mediante anticuerpos específicos policlonales o monoclonales (que no reconocen o reaccionan de manera cruzada con otras proteínas, tales como otras citoqueratinas). Un número significativo de estos anticuerpos anti-CK-18 que reconocen específicamente CK-18 o fragmentos de la misma está disponible en el mercado. Un ejemplo de dichos anticuerpos es el anticuerpo MB30 que reconoce la secuencia EDFNLGDALD en un fragmento de CK-18 escindido por caspasa que tiene un sitio de escisión después de DALD (Documento EP 1 019 438 A). Este anticuerpo es incluso específico para este fragmento y no reconoce la CK-18 no escindida. Por consiguiente, los medios de detección (por ejemplo anticuerpos) que no son sólo específicos de CK-18, sino que también son específicos para ciertos fragmentos de CK-18 son medios preferidos para detectar fragmentos de CK-18 de acuerdo con la presente invención. Los fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa son fragmentos de CK-18 específicamente preferidos de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con la presente invención un "individuo que no padece una enfermedad cardiovascular" significa un individuo cuyos niveles de CK-18 (o fragmentos de la misma), precursor de IL-1\beta y/o caspasa-1 (ECI) se asemejan a aquellos de un individuo sano.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención la enfermedad cardiovascular es aterosclerosis, una enfermedad coronaria, un síntoma coronario agudo, preferiblemente angina de pecho inestable o infarto agudo de miocardio, angina de pecho estable, accidente cerebro vascular, preferiblemente accidente cerebro vascular isquémico, arteriosclerosis o reestenosis asociadas a enfermedad inflamatoria o autoinmune.

El término "enfermedad cardiovascular" como se usa en este documento se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que afecte al sistema vascular, incluyendo los vasos cardiacos y sanguíneos. Una enfermedad o trastorno vascular incluye cualquier enfermedad o trastorno caracterizados por una disfunción vascular, incluyendo, por ejemplo, estenosis intravascular (estrechamiento) u oclusión (bloqueo), debido al desarrollo de la placa aterosclerótica y enfermedades y trastornos que son el resultado de esto. Las enfermedades cardiovasculares particularmente preferidas se seleccionan del grupo que consiste en aterosclerosis, una enfermedad coronaria, un síntoma coronario agudo, preferiblemente angina de pecho inestable o infarto agudo de miocardio, angina de pecho estable, accidente cerebro vascular, preferiblemente accidente cerebro vascular isquémico, arteriosclerosis o reestenosis asociadas a enfermedad inflamatoria o autoinmune.

La cantidad de caspasa-1 (ECI) en la muestra puede determinarse adicionalmente, comparase con la cantidad de ECI presente en control de referencia y diagnosticarse a una enfermedad cardiovascular si la cantidad de ECI en la muestra está aumentada en comparación con la cantidad de ECI en el control de referencia.

La determinación de la cantidad de ECI en una muestra en combinación con la determinación de las cantidades de CK-18 o fragmentos de la misma y/o el precursor de IL-1\beta permite un diagnóstico aún más preciso.

La citoqueratina 18 también puede usarse en un método para distinguir entre la angina de pecho estable e inestable o para diagnosticar la angina de pecho estable o inestable o para la evaluación del riesgo de reestenosis después de la intervención coronaria percutánea en un individuo comprendiendo las etapas de:

-: proporcionar una muestra de un individuo,

-: determinar la cantidad de citoqueratina 18 o fragmentos de la misma (CK- 18 o fragmentos de la misma) y/o precursor de interleucina-1\beta (precursor IL-1\beta) en dicha muestra,

-: comparar la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma y/o precursor de IL-1\beta en dicha muestra con la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma y/o precursor de IL-1\beta presentes en al menos un control de referencia de al menos un individuo que padece una angina de pecho estable o inestable,

-: diagnosticar la angina de pecho estable si la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma en la muestra está disminuida y la cantidad de precursor de IL-1\beta en la muestra está aumentada en comparación con la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma y/o precursor de IL-1\beta en el control de referencia de al menos un individuo que padece una angina de pecho inestable (también es posible diagnosticar una angina de pecho estable cuando las cantidades determinadas de marcador se comparan con los niveles en un individuo que padece una angina de pecho estable).

La angina de pecho es el resultado de una isquemia de miocardio, que se produce por un desequilibrio entre el suministro y la demanda de oxígeno del miocardio. Específicamente, la demanda excede el suministro debido al suministro sanguíneo inadecuado. El corazón supone un pequeño porcentaje del peso corporal total, pero es responsable del 7% del consumo de oxígeno del cuerpo. El metabolismo del tejido cardiaco es altamente aeróbico y tiene una reserva muy pequeña para compensar el suministro sanguíneo inadecuado. Cuando el suministro sanguíneo se reduce a niveles que son inadecuados para la demanda miocárdica, el tejido rápidamente se vuelve hipotóxico y los metabolitos celulares tóxicos no pueden eliminarse. Las células miocárdicas rápidamente usan los suministros de oxígeno que permanecen en la microvasculatura local y el lapso de tiempo que el metabolismo aeróbico continúa es indirectamente proporcional al grado de oclusión arterial. Una vez el suministro de oxígeno se ha agotado, la fosforilación oxidativa no puede continuar porque el oxígeno ya no está disponible como un aceptor de electrones, el piruvato no puede convertirse a acetil coenzima A y entrar en el ciclo del ácido cítrico. El metabolismo miocárdico cambia a un metabolismo anaeróbico usando las reservas de glucógeno y glucosa, y el piruvato se fermenta a lactato. La acumulación de lactato es la causa primaria del dolor de pecho en individuos con SCA. Como la isquemia continúa, el tejido cardiaco se vuelve más ácido que el lactato y otros intermedios ácidos se acumulan, los niveles de ATP disminuyen y las fuentes de energía disponibles se agotan. El tejido cardiaco se puede recuperar si se reperfunde 15-20 minutos después de un acontecimiento isquémico. Después de que las reservas de glucógeno celular se hayan agotado, la célula presenta gradualmente características de necrosis, incluyendo el hinchamiento mitocondrial y la pérdida de la integridad de la membrana celular. Tras la reperfusión, estas células dañadas mueren, posiblemente como resultado de la incapacidad de la célula de mantener el equilibrio iónico. Una pérdida de la integridad de la membrana produce que los contenidos citosólicos de la célula se liberen a la circulación.

La angina estable, la angina inestable y el infarto de miocardio comparten una característica común: dolor de pecho constrictivo asociado con la isquemia miocárdica. La angina se clasifica como estable o inestable a través de la interpretación de un médico de los síntomas clínicos, con o sin cambios diagnósticos en el ECG. La clasificación de angina como "estable" o "inestable" no se refiere a la estabilidad de la placa por sí misma, sino más bien, al grado de esfuerzo que se requiere para provocar el dolor de pecho. Más notablemente, la clasificación de dolores de pecho como angina estable o inestable (o incluso infarto de miocardio leve) en casos distintos al infarto de miocardio definitivo es completamente subjetiva. El diagnóstico y en este caso la diferenciación, no se hacen mediante angiografía, que puede cuantificar el grado de oclusión arterial, sino más bien mediante la interpretación de un médico de los síntomas clínicos.

La angina estable se caracteriza por dolor de pecho constrictivo que ocurre tras esfuerzo o estrés y se alivia mediante el descanso o nitroglicerina sublingual. La angiografía coronaria de pacientes con angina estable normalmente revela el 50-70% de la obstrucción de al menos una arteria coronaria. La angina estable se diagnostica normalmente mediante la evaluación de los síntomas clínicos y los cambios en el ECG. Los pacientes con angina estable pueden tener anormalidades transitorias de los segmentos ST, pero la sensibilidad y la especificidad de estos cambios asociados con la angina estable es baja.

La angina inestable se caracteriza por dolor de pecho constrictivo en reposo que se alivia mediante la nitroglicerina sublingual. El dolor de pecho de la angina se alivia normalmente mediante nitroglicerina sublingual, y el dolor normalmente disminuye en 30 minutos. La angina inestable representa el estado clínico entre la angina estable y el IAM y se cree que se debe principalmente a la progresión en la gravedad y la extensión de la aterosclerosis, el espasmo arterial coronario o la hemorragia en placas no oclusivas con la subsiguiente oclusión trombótica. La angiografía coronaria de pacientes con angina inestable normalmente revela el 90% o una obstrucción mayor de al menos una arteria coronaria, lo que da como resultado una incapacidad del suministro de oxígeno para cumplir incluso con la demanda de oxígeno miocárdica basal. El crecimiento lento de las placas ateroscleróticas estables o la ruptura de las placas ateroscleróticas inestables con la posterior formación de trombos puede producir una angina inestable. Ambas causas dan como resultado el estrechamiento clínico de la arteria coronaria. La angina inestable normalmente se asocia con la ruptura de la placa aterosclerótica, la activación de plaquetas y la formación del trombo. La angina inestable normalmente se diagnostica mediante los síntomas clínicos, los cambios en el ECG y los cambios en los marcadores cardiacos. Los tratamientos para pacientes con angina inestable incluyen nitratos, aspirina, inhibidores de GPIIb/IIIa, heparina y beta bloqueantes. Los pacientes también pueden recibir angioplastia y endoprótesis vascular. Finalmente, los pacientes con angina inestable tienen riesgo de desarrollar infarto agudo de miocardio.

Por lo tanto, para proporcionar un diagnóstico diferencial fiable entre los niveles de CK-18 o fragmentos de la misma y/o precursor de IL-1\beta y opcionalmente ECI de la angina de pecho estable e inestable y opcionalmente también entre los de la angina de pecho estable, la angina de pecho inestable y el infarto agudo de miocardio en una muestra que se obtiene de un individuo que se sospecha que padece una de dichas afecciones, se determinan y comparan a sus niveles respectivos en individuos que padecen una de estas afecciones.

Los niveles de CK-18 o fragmentos de los mismos y de ECI en individuos que padecen una angina de pecho estable están disminuidos cuando se comparan con los niveles que se encuentran en individuos que padecen una angina de pecho inestable e infarto agudo de miocardio.

En contraste con esto, los niveles del precursor de IL-1\beta están aumentados en individuos que padecen una angina de pecho estable cuando se comparan con aquellos niveles que se encuentran en individuos que padecen una angina de pecho inestable.

Puesto que este método permite distinguir claramente entre angina de pecho estable e inestable en un individuo, los datos que se obtienen pueden ser útiles para diseñar un tratamiento óptimo y adecuado para un individuo que padece una angina de pecho estable o inestable e infarto agudo de miocardio.

En un método para distinguir entre angina de pecho estable e inestable o para diagnosticar una angina de pecho estable e inestable en un individuo además se determina la cantidad de caspasa-1 (ECI) en la muestra, se compara con la cantidad de ECI presente en el control de referencia y se diagnostica como angina de pecho estable si la cantidad de ECI en la muestra está disminuida en comparación con la cantidad de ECI en el control de referencia de al menos un individuo que padece una angina de pecho inestable.

Además, un método para distinguir entre la angina de pecho estable e inestable o para diagnosticar la angina de pecho estable e inestable en un individuo puede implicar la determinación de la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma y/o precursor de IL-1\beta y/o ECI. También es posible combinar la cuantificación de los marcadores individuales: CK-18 o fragmentos de la misma y precursor de IL-1\beta; CK-18 o fragmentos de la misma, precursor de IL-1\beta y ECI; CK-18 o fragmentos de la misma y ECI, precursor de IL-1\beta y ECI.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención la cantidad de los fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa se determina inmunológicamente, preferiblemente mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, mediante un radioinmunoensayo o mediante análisis por transferencia de Western.

Los niveles proteicos de CK-18 o fragmentos de la misma, ECI y precursor de IL-1\beta en la muestra pueden ensayarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la enzima ECI puede cuantificarse mediante un ensayo basado en su actividad catalítica (por ejemplo, Thornberry, N. A. et al. (1992) Nature 356, 768-74; Nicholson, D. W. et al. (1995) Nature 376, 37-43; Tewari, M. et al. (1995) Cell 81, 801-9; Fernandes-Alnemri, T. et al. (1996) PNAS USA 93, 7464-9; Thornberry, N. A. (1994) Meth. Enzymol. 244, 615-31) o basado en la cuantificación de la cantidad de proteína contenida en una muestra. Para determinar la cantidad de CK-18 o fragmentos de la misma, por ejemplo, se conocen varios ensayos inmunológicos en la técnica (Kramer G. et al. Cancer Res. (2004) 64: 1751-1756). Por ejemplo las técnicas basadas en anticuerpos pueden emplearse preferiblemente para todos los marcadores en un método de acuerdo con la presente solicitud. Por ejemplo, el reconocimiento específico se proporciona mediante un anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) y se usa un sistema de detección secundario para detectar la presencia (o unión) del anticuerpo primario. Los marcadores detectables se pueden conjugar al anticuerpo secundario, tales como un marcador fluorescente, un radiomarcador o una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) que produce un producto cuantificable, por ejemplo coloreado. En otro método adecuado, el anticuerpo primario por sí mismo puede marcarse de manera detectable. Como resultado, se proporciona el marcaje inmunohistológico de una sección de tejido. Un extracto puede producirse a partir de una muestra biológica (por ejemplo sangre, tejido, células) para el análisis. Tal extracto (por ejemplo un extracto de detergente) puede someterse a un ensayo de transferencia Western o puntual/por ranuras respecto al nivel de la proteína de interés, usando métodos de inmunotransferencia rutinarios (Jalkanen et al. J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen et al. J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)).

Otros métodos útiles basados en anticuerpos incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo monoclonal específico de proteínas tanto como una sonda inmunoadsorbente como como una sonda marcada enzimáticamente para detectar y cuantificar la proteína de interés. La cantidad de dicha proteína presente en una muestra se puede calcular haciendo referencia a la cantidad presente en una preparación patrón usando un algoritmo de computadora de regresión lineal (véase laco-billi et al., Breast Cancer Research and Treatment 11: 19-30 (1988)). O se pueden emplear dos anticuerpos monoclonales diferentes contra a la proteína de interés, uno como la sonda inmunoadsorbente y el otro como una marcada enzimáticamente.

La muestra a analizar es preferiblemente un fluido corporal, preferiblemente sangre, más preferiblemente plasma o suero.

Todos los polipéptidos marcadores de acuerdo con la presente invención se pueden detectar y cuantificar en sangre (total) así como en plasma o suero, preferiblemente en forma soluble o solubilizada.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención la muestra se obtiene de la arteria femoral. Las muestras plasmáticas de control se obtienen a partir de pacientes con angina de pecho estable e inestable de la cubita (ambos métodos de muestreo representan el flujo sanguíneo periférico).

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un kit para diagnosticar una enfermedad cardiovascular, para distinguir entre la angina de pecho estable e inestable o para diagnosticar la angina de pecho estable o inestable en un in-
dividuo o para evaluar el riesgo de un individuo de desarrollar un trombo en el sistema cardiovascular comprendiendo:

: medios para detectar los fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa y

: un control de referencia, en el que

: dichos métodos comprenden anticuerpos dirigidos contra los fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa y en el que el control de referencia se obtiene de al menos un individuo que no padece una enfermedad cardiovascular o de al menos un individuo que padece una angina de pecho estable o inestable.

En la práctica clínica el diagnóstico de enfermedades cardiovasculares, la distinción entre la angina de pecho estable e inestable así como el diagnóstico de la angina de pecho son de interés particular puesto que permiten al practicante evaluar los riesgos del paciente de ser susceptible al infarto agudo de miocardio, las arritmias cardiacas graves como la taquicardia y la fibrilación ventricular o el arresto cardiaco que conducen a la muerte súbita. Sobre la base de los resultados que se obtienen mediante el método y el kit de acuerdo con la presente invención se pueden aplicar tratamientos y/o intervenciones quirúrgicas adecuados. El kit de la presente invención también se puede emplear para evaluar el riesgo de un individuo de desarrollar un trombo en el sistema cardiovascular. Un nivel elevado de CK-18 o fragmentos de la misma en comparación con un individuo sano indica un riesgo de desarrollar un trombo. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método para evaluar dicho riesgo.

Dichos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y se pueden conjugar con un marcador apropiado que permita la detección de la unión de anticuerpos específicos contra CK-18 o fragmentos de la misma. También es posible usar anticuerpos secundarios dirigidos contra anticuerpos que se unen a CK-18 o fragmentos de la misma.

La enfermedad cardiovascular a detectar mediante el kit de acuerdo con la presente invención puede ser aterosclerosis, una enfermedad coronaria, un síntoma coronario agudo, preferiblemente angina de pecho inestable o infarto agudo de miocardio, angina de pecho estable, accidente cerebro-vascular, arteriosclerosis o reestenosis asociadas a enfermedad inflamatoria o autoinmune.

La presente invención se ilustra más en las siguientes figuras y ejemplos, sin embargo, sin estar restringida a ellos.

La Fig. 1 muestra niveles plasmáticos de enzima conversora de interleucina-1/ECI. La concentración de ECI en plasma de 40 pacientes con angina estable (AS), angina inestable (AI) se comparó con el plasma obtenido de la arteria femoral y de la arteria coronaria en un infarto agudo de miocardio (IAM). Cada caja representa el intercuartil que contiene el 50% de los valores. La línea de un lado a otro de la caja indica la línea media. Las patillas se extienden desde la caja a los valores más altos y más bajos.

La Fig. 2 muestra los niveles plasmáticos de neoepítopo M30 de citoqueratina 18 en el infarto agudo de miocardio, la AE y la AI. La concentración de neoepítopo M30 de CK-18 plasmática obtenida a partir de la arteria coronaria de pacientes estaba aumentada notablemente cuando se comparó con el flujo sanguíneo sistémico obtenido de la arteria femoral, AE y AI. Los datos que se obtienen a partir de 40 pacientes representan el intercuartil que contiene el 50% de los valores. La línea de un lado a otro de la caja indica la línea media. Las patillas se extienden desde la caja a los valores más altos y más bajos.

La Fig. 3A a 3D muestra un trombo representativo de un paciente con infarto agudo de miocardio (n=8). La Fig. 3A muestra una tinción con hematoxinilina-eosina; la Fig. 3D una tinción con fucsina ácida naranja G (fibrina -
rojo, eritrocitos, trombocitos y otras proteínas plasmáticas - naranja, leucocitos diseminados - azul); la Fig. 3C la inmunoreactividad positiva del neoepítopo M30 de CK-18 en el centro del trombo; la Fig. 3D un control negativo (todo con amplificación 200x).

Ejemplo

En este ejemplo se investigó la expresión de proteínas que se conoce que están asociadas con vías inflamatorias y de activación específica de la apoptosis en IAM. Se determinó la concentración de dichas proteínas en el plasma obtenido en el sistema de la arteria coronaria en pacientes que padecían IAM y se relacionó con los niveles sanguíneos sistémicos. Los pacientes a los que se les diagnosticó AI y angina estable (AE) sirvieron como controles en un estudio no aleatorizado comparativo. Además, el trombo coronario agudo obtenido in vivo se analizó mediante inmunohistoquímica. Los resultados evidenciaron concentraciones aumentadas de ECI específicas de apoptosis y del producto de escisión dependiente de caspasa CK-18 en el IAM en comparación con AE y AI.

La inflamación sistémica y la activación inmune específica de apoptosis desempeñan una función principal en los síndromes coronarios agudos (SCA), incluyendo el infarto agudo de miocardio (IAM). Los dispositivos de trombectomía se introdujeron recientemente en el área clínica para permitir la eliminación del material trombótico intracoronario en el entorno del IAM. Esta técnica ofrece la única posibilidad de recoger sangre y trombos en la arteria coronaria ocluida y la arteria femoral para comparar las proteínas específicas de apoptosis e inflamatorias. Los pacientes con angina estable (AE) y angina inestable (AI) sirvieron como población de control.

Pacientes y características clínicas

Se incluyeron cuarenta pacientes consecutivos sometidos a angiografía coronaria de emergencia en el estudio, si cumplían los siguientes criterios: 1) dolor de pecho en el momento de la angiografía coronaria, 2) nuevas elevaciones de segmentos ST \geq2 mm en dos o más derivaciones torácicas, o nuevas elevaciones de segmentos ST \geq1 mm en más de una derivación del plano horizontal observada dentro de los 20 minutos de la angiografía coronaria, 3) la anatomía coronaria adecuada para la trombectomía X-sizer, 4) sin tratamiento trombolítico, 5) material trombótico visible en el filtro y la unidad de botella del X-sizer indicando la trombectomía exitosa y 6) el consentimiento informado. Los criterios para el uso del X-sizer fueron un diámetro de vaso \geq3 mm, un defecto de contraste intraluminal grande, lo que sugiere trombos dentro de 50 mm del ostium respectivo, con flujo de TIMI 0-1 después del pasaje de la guía angiográfica, en ausencia de tortuosidad grave de los vasos, calcificación o acceso vascular difícil.

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Además, ocho pacientes consecutivos admitidos a la institución para la evaluación del dolor de pecho de la angina, se sometieron a angiografía coronaria y sirvieron como controles. La AE (n=40) se definió mediante el típico dolor de pecho de la angina causada por esfuerzo que se alivia mediante el reposo, la administración de gliceril trinitrato o ambos con respuesta positiva al ensayo de ECG bajo estrés de ejercicio y \geq50% de estenosis de diámetro en \geq1 arteria coronaria en la cateterización. Los pacientes con AI (n=40) se definieron de acuerdo con los criterios de Braunwald.24. Todos los pacientes con AI de clase IIIB tenían cambios en los segmentos ST diagnósticos, inversión de la onda T o ambas. Ningún paciente incluido en el estudio presentó pruebas de un proceso sistémico o inflamatorio cardiaco en curso como se define mediante la historia clínica. La Tabla 1 resume las características clínicas demográficas e iniciales.

TABLA 1 Características de los pacientes de estudio

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Recolección y procesamiento de muestras

Se heparinizó a los pacientes a un tiempo de coagulación activado \geq300 s y 250 mg de aspirina. Todas las muestras sanguíneas se recogieron de la arteria femoral en vacutainers citrato, se centrifugaron de manera inmediata (1300 xg, 4ºC, 10 minutos) y sirvieron como controles internos para las muestras sanguíneas obtenidas directamente de la arteria coronaria ocluida. El plasma pobre en plaquetas se congeló a -80ºC hasta los ensayos. El sistema de catéter para la trombectomía X-sizer (EndiCOR Medical Inc) consiste en un eje de catéter de lumen dual conectado a un módulo de control portátil. El lumen interno contiene un cortador helicoidal rotado a ~2.100 rpm lo que aumenta la succión en el trombo además de aspirar a través del lumen externo (véase la Figura 1).

Unos centímetros antes de la botella de vidrio de vacío, el aspirado pasa una pequeña unidad de filtración en la que el material trombótico y las partículas de la placa quedan atrapadas, mientras que la sangre se aspira en la botella de vidrio heparinizada. La sangre se transfirió de manera inmediata en los vacutainers citrato y se centrifugó como se describe anteriormente. El material del trombo atrapado en la unidad de filtro se fijó en el 7,5% de formalina tamponada durante una noche, se incluyó en parafina y se realizaron secciones en serie de 3 \mum con un microtomo. La sangre aspirada por el lumen de la aspiradora se transfirió inmediatamente en vacutainers citrato y procoagulantes como se describe anteriormente. Las muestras se congelaron inmediatamente a -80ºC.

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Cuantificación de IL-1\betap, IL-1\beta, TNF-\alpha, TNF-R1, CD40 y CD40L solubles

Se midieron las concentraciones de proteína mediante ELISA, adquirido de BenderMedSystems (Austria) y MBL International (Estados Unidos). Se detectaron los niveles de TNF-\alpha mediante ELISA de alta sensibilidad (BenderMedSystems, Austria). Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, las placas se prerevistieron o revistieron con un anticuerpo de revestimiento suministrado, se sellaron y se incubaron durante una noche a 4ºC. Se lavaron las placas (Tween 20 0,5 ml ad 1l de PBS) y se bloquearon con tampón de ensayo (5 g de BSA; 0,5 ml de Tween 20 ad 1l de PBS) durante dos horas a temperatura ambiente. Después se lavaron de nuevo y se añadió un conjugado de biotina a cada pocillo. Además se incubaron las placas durante 2 horas, se lavaron y se incubaron con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de 1 hora de tratamiento y una etapa adicional de lavado, se añadió la solución sustrato TMB (Sigma-Aldrich, St. Louis, Ml, Estados Unidos). Cuando el desarrollo de color fue evidente la reacción se finalizó con ácido sulfúrico 1 N. Se leyeron las placas a 450 nm en un contador Wallac Multilabel 1420 (PerkinElmer, Estados Unidos).

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Cuantificación de la ECI soluble

Un ELISA comercial, proporcionado por BenderMedSystems (Austria), se usó para medir ECI. El ELISA de ECI detecta tanto el precursor p45 como el complejo enzimáticamente activo p10:p20. La interacción entre ECI y su sustrato precursor se produce exclusivamente dentro de la célula. Las muestras y los patrones se diluyeron en un diluyente de ensayo proporcionado. Las placas se incubaron durante dos horas y se lavaron tres veces. Después de otro periodo de incubación con un anticuerpo secundario y una etapa de lavado se añadió el anticuerpo de detección conjugado con HRP. Se incubaron las placas durante 30 minutos en un dispositivo de rotación. Después se vaciaron y lavaron antes de que se añadiera la solución sustrato TMB (Sigma-Aldrich). La reacción de color se paró con ácido sulfúrico 1 N y se sometió a una medición en un contador Wallac Multilabel 1420 (PerkinElmer) a una longitud de onda 450 nm.

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Cuantificación del neoepítopo M30 de citoqueratina 18

El neoepítopo M30 de CK-18 circulante se midió mediante ELISA, adquirido de PEVIVA AB (Bromma, Suecia). Este ELISA usa un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo en el fragmento de 236-396 de CK-18 como receptor y un M30 conjugado con HRP como detector. Los niveles de antígeno M30 se expresan en unidades/l. Una unidad corresponde a 1,24 pmol de un péptido sintetizado que contiene el motivo de reconocimiento de M30 de acuerdo con el fabricante. La sensibilidad del ELISA es 30 U/l. Los coeficientes de variación intra- e interensayos del ELISA CK-18 fueron 0,7-5,8% y 2,8-4,8%, respectivamente. La cantidad de proteínas en cada muestra se calculó de acuerdo con una curva patrón de valores de densidad óptica construida para niveles conocidos de neoepítopo M30 de CK-18. (Leers MP, Kolgen W, Bjorklund V, et al., J Pathol 1999; 187(5): 567-72).

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Inmunohistoquímica

Para la detección de la apoptosis se usó un anticuerpo monoclonal de ratón contra el neoepítopo M30 25. Se fijaron trombos frescos de pacientes con IAM en el 7,5% de formalina tamponada y se incluyeron en parafina. Consecutivo, se tiñeron secciones de 3 \mum con hematoxilina y fucsina ácida naranja G (tinción tricrómica). Para la inmunotinción, se aplicó un pretratamiento por microondas en tampón citrato (2x5 min, 600 W). Para evitar la tinción inespecífica, se trataron las muestras con el 5% de BSA (Sigma-Aldrich/solución salina tamponada con tris (TBS) durante 30 minutos. Después, se incubaron las muestras con el anticuerpo primario (1:50, anticuerpo anti-M30, Roche, Alemania) durante una noche a temperatura ambiente. Después de esto se incubó con anticuerpo de ratón marcado con biotina (1:100, Vector Laboratories, Bulingame, CA, Estados Unidos) durante 1 hora y por la detección mediante fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina-AP/10% de suero humano (1:100, Dako, Dinamarca). La visualización se consiguió con rojo rápido (Sigma, Estados Unidos). Para los controles negativos, se sustituyeron anticuerpos primarios mediante IgG de ratón irrelevante.

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Análisis estadístico

Los resultados se presentan como la media \pm SEM, si no se afirma lo contrario. Debido al tamaño de muestra relativamente pequeño, se usó el ensayo U Mann-Whitney para calcular la significancia. Un p valor de 0,05 se considera significativo.

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Resultados

Las características demográficas y algunas iniciales de pacientes se representan en la tabla 1. Tanto en los grupos de estudio AE como los AI, un número similar de pacientes tuvo una historia de infarto de miocardio o una intervención coronaria previa (injerto de derivación de la arteria coronaria o angioplastia coronaria transluminal percutánea). Los factores de riesgo establecidos para la enfermedad coronaria, las concentraciones totales de colesterol y los hallazgos angiográficos fueron similares en ambos grupos.

El grupo IAM incluyó 40 pacientes, 28 hombres (70%) y 12 mujeres (30%). La edad media fue de 59,3 años. El 30% de los pacientes tuvo una terapia de revascularización previa mediante ICP o cirugía de derivación. Nueve (22,5%) de los pacientes del presente estudio padecieron diabetes, 25 (62,5%) hipertensión y 21 (52,5%) eran fumadores. Los niveles medios de colesterol fueron 206,3 mg/dl (ULN=199 mg/dl) y los triglicéridos fueron 204,6 mg/dl (ULN=172 mg/dl). Los niveles medios de proteína C reactiva fueron 3,6 mg/dl (ULN=1 mg/dl) lo que indicó un proceso inflamatorio sistémico. Diecinueve (47,5%) padecieron enfermedad de dos o tres vasos. Sólo en un paciente la arteria principal izquierda estuvo implicada. Más de la mitad de los pacientes (52,5%) mostraron función ventricular izquierda reducida identificada mediante ecocardiografía.

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Proteínas inflamatorias y específicas de apoptosis

Para investigar si el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica se simula en el sitio del IAM en comparación con AE y AI, se obtuvieron muestras plasmáticas mediante X-sizer y se evaluaron. Las muestras plasmáticas obtenidas de la arteria femoral en pacientes que padecían IAM sirvieron como controles internos. Los derivados de citoquinas inflamatorias (IL-1\betap, IL-1\beta, TNF-\alpha, TNF-R1, sCD40 y CD40L) y sus significancias se representan en la tabla 2.

TABLA 2 Niveles plasmáticos de citoquinas y otras proteínas de membrana solubles en AE, AI e IAM

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ECI soluble y CK-18

Como se representa en la figura 1 los niveles medios de plasma de la ECI soluble fueron 68,6 \pm 20,2 en AE, 81,5 \pm 24,3 en AI, 96 \pm 27,1 en IAM femoral (periférico) y 282,2 \pm 180 en las muestras IAM de arteria coronaria. Estos datos prueban un aumento significativo en la concentración de ECI en la muestra derivada del sitio del infarto de miocardio en comparación con el nivel sanguíneo sistémico así como con AE y AI (AE frente a AI p=0,023, AI frente a IAM periférico p=0,022 e IAM periférico frente a IAM coronario p<0,001).

Los resultados que se representan en la Figura 2 muestran un aumento notable en la concentración del neoepítopo M30 de CK-18 en el plasma derivado del sitio del infarto de miocardio en comparación con la periferia (411 \pm 15,3 frente a 336,8 \pm 9,9, p=0,001). Se descubrieron más diferencias significativas entre el IAM periférico y AI (336,8 \pm 9,9 frente a 255 \pm 5, p<0,001), así como AI y AE (255,5 \pm 8,9 frente a 232,4 \pm 4,9, p=0,027).

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Detección de CK-18 en el trombo que provoca el infarto de miocardio

Se sometieron los trombos recogidos mediante el dispositivo de trombectomía a una inmunohistoquímica así como a una tinción rutinaria con hematoxilina/eosina (HE) y fucsina ácida naranja G. La Figura 3 (A, B, C, D) muestra un trombo representativo (n=8) que produce isquemia miocárdica aguda. El panel (A), que representa la tinción HE, contiene áreas descoloridas que por otra inmunohistoquímica se determinó que consistían no sólo de fibrina sino que también de cantidades significativas del microfilamento de CK-18. Además, se pueden observar los leucocitos y eritrocitos dispersos. Mediante tinción inmunohistoquímica en las porciones centrales del trombo las áreas positivas CK-18 son detectables (panel C), las que principalmente corresponden a áreas ricas en precipitados de fibrina (véase la tinción por fucsina ácida naranja G, panel B). El panel D representa una tinción de control inespecífica para M30. La capa de leucocitos de sangre periférica sirvió como controles internos.

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Discusión

Este ejemplo demuestra que ECI, un miembro de la familia caspasa, está notablemente aumentada en el sitio de la trombosis coronaria aguda en pacientes que padecen IAM y sólo moderadamente en la periferia así como en la AI, en comparación con la AE. Interesantemente, en pacientes con IAM, este hallazgo se asocia con un elevado contenido del microfilamento CK-18 sistémico, un producto de la activación específica de la caspasa.

La ECI/caspasa-1, una proteasa con Cys285 que sirve como el residuo catalítico, escinde el precursor de IL-1\beta inactivo biológicamente de 31 kDa en Asp116-Ala117 para generar la forma madura de 17,5 kDa de IL-1\beta (Bombeli T, Karsan A, Tait JF, Harlan JM., Blood 1997;89(7): 2429-42) (Kostura MJ, Tocci MJ, Limjuco G, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86(14): 5227-31). La enzima activa consiste en dos subunidades no idénticas (p10 y p20), de las que ambas son esenciales para la actividad enzimática y por lo tanto desempeñan una función esencial en la apoptosis de distintas células incluyendo cardiomiocitos. La expresión aumentada de ECI en la hipertrofia cardiaca, la sobreproducción de TNF-\alpha en la cardiomiopatía (Kubota T, Miyagishima M, Frye CS, et al., J Mol Cell Cardiol 2001; 33(7): 1331-44) y la disfunción miocárdica inducida por endotoxinas (Fauvel H, Marchetti P, Chopin C, Formstecher P, Neviere R., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001; 280(4): H1608-14) condujeron la evaluación de la presencia de ECI soluble en el sitio del IAM. Se observó un incremento medio de 4,1 veces de ECI en el sitio del IAM en comparación con AI. Probablemente en condiciones de estrés endotóxico o hipotónico se permite que la caspasa-1 actúe sinérgicamente con estos estresantes fisiológicos e induzca la apoptosis mediante la caspasa-3. En un modelo experimental de isquemia y daño por reperfusión se ha descubierto que la transfección génica del antagonista del receptor IL-1 reduce el tamaño del infarto (Frantz S, Ducharme A, Sawyer D, et al., J Mol Cell Cardiol 2003; 35(6): 685-94.) y los niveles miocárdicos aumentados de ECI pueden predisponer al daño miocárdico apoptótico en condiciones de estrés (Syed FM, Hahn HS, Odley A, et al., Circ Res 2005; 96(10): 1103-9).

La Citoqueratina 18 un componente principal de los filamentos intermedios, se expresa ampliamente los tejidos epiteliales y en pequeñas cantidades en los fibroblastos y otras células no epiteliales (Schaafsma HE, Ramaekers FC., Pathol Annu 1994; 29 Pt 1: 21-62). La Citoqueratina 18 se fosforila en células apoptóticas, los sitios principales son en la serina 53 y los microfilamentos se agregan rápidamente (Ku NO, Liao J, Omary MB., J Biol Chem 1997; 272(52): 33197-203) (Caulin C, Salvesen GS, Oshima RG., J Cell Biol 1997; 138(6): 1379-94). Diferentes condiciones de estrés tales como el estrés por choque de calor y la infección viral, pueden aumentar la reorganización y la solubilidad de los microfilamentos y la polimerización alterada (Ku NO, Liao J, Omary MB., J Biol Chem 1997; 272(52): 33197-203.) (Schutte B, Henfling M, Kolgen W, et al., Exp Cell Res 2004; 297(1): 11-26). La CK-18 fosforilada es un sustrato preferencial para la proteolisis. La escisión de CK-18 mediada por caspasa durante la apoptosis (Caulin C, Salvesen GS, Oshima RG., J Cell Biol 1997; 138(6): 1379-94) conduce a la formación de un neoepítopo específico, que reconoce el anticuerpo M30 (Leers MP, Kolgen W, Bjorklund V, et al., J Pathol 1999; 187(5): 567-72) (Kadyrov M, Kaufmann P, Huppertz B., Placenta 2001; 22(1): 44-8). Interesantemente, un aumento notable en la concentración de CK-18, neoepítopo M30, se midió en el plasma obtenido directamente del sitio del infarto de miocardio. Además, el contenido aumentado de CK-18 se corroboró mediante el hallazgo de que el dispositivo de trombectomía obtuvo trombos en IAM teñidos positivamente para CK-18. Esta nueva característica de trombo puede servir como una explicación adicional de porque las terapias trombolíticas intravenosas que se dirigen a la lisis de la fibrina, sólo restauran de manera incompleta el flujo coronario temprano y completo en \geq50% de pacientes que padecen IAM (Valgimigli M, Merli E, Malagutti P, et al., Arch Biochem Biophys 2003; 420(2): 255-61.) (Topol EJ. Toward, Circulation 1998; 97(2): 211-8) (Rentrop KP., Circulation 2000; 101 (13): 1619-26).

El CD40L/CD154 es una proteína unida a la transmembrana que expresan una variedad de células activadas asociadas con el ateroma alterado, tales como las células endoteliales vasculares, los macrófagos, los linfocitos T, las células musculares lisas y las plaquetas (Mach F, Schonbeck U, Sukhova GK, et al., Proc Natl Acad Sci U S A1997; 94(5): 1931-6). Este mediador proinflamatorio puede escindirse de las membranas celulares para formar el sCD40L, que mantiene sus propiedades biológicas para interaccionar con CD40 e iniciar una respuesta inflamatoria variada (Mach F, Schonbeck U, Sukhova GK, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1997; 94(5): 1931-6) (Aukrust P, MullerF, UelandT, et al., Circulation 1999; 100(6): 614-20). Los niveles aumentados de sCD40L se han encontrado previamente en pacientes con AI (Aukrust P, Muller F, Ueland T, et al., Circulation 1999; 100(6): 614-20) e infarto de miocardio. (Ohashi Y, Kawashima S, Mori T, et al., Int J Cardiol 2005). De acuerdo con estos hallazgos, los resultados presentes probaron un aumento significativo de sCD40L en el sitio del infarto agudo de miocardio, en comparación con AE.

Se ha mostrado previamente que el daño endotelial es una parte integral del IAM y AI, (Mutin M, Canavy I, Blann A, Bory M, Sampol J, Dignat-George F., Blood 1999; 93(9): 2951-8) y el suero de pacientes con AI es proapoptótico en las células endoteliales de la vena umbilical humana en comparación con aquel de pacientes con AE (Valgimigli M, Agnoletti L, Curello S, et al., Circulation 2003; 107(2): 264-70). Además, cuando el último suero reevaluó al año de seguimiento, en condiciones clínicamente estables, se observó que ya no difería del de pacientes con lesiones estables, lo que sugiere que la actividad apoptótica aumentada del suero está ligada temporalmente a AI.

Los procesos inflamatorios tanto localmente dentro de la placa aterosclerótica, como sistémicamente, dentro de la circulación, son características establecidas en la patogénesis de la enfermedad coronaria (Braunwald E. Circulation 1989; 80(2): 410-4). Se ha sugerido que la apoptosis de las células endoteliales que cubren las lesiones ateroscleróticas puede llevar a la ruptura de la placa y esta liberación de factor tisular cargado de micropartículas de membrana mediante células que experimentan la apoptosis podría iniciar directamente la cascada de coagulación. La técnica de la trombectomía aguda en el infarto de miocardio ofrece una posibilidad única de recoger muestras sanguíneas directamente fuera de la arteria coronaria causante en el momento del acontecimiento agudo y compararlo con la sangre sistémica. Los datos sugieren que la activación sistémica de los procesos inmunológicos en interacción con apoptosis aumentada localmente en particular es un mecanismo clave en el IAM.

El presente ejemplo es el primero en informar sobre las elevadas proteínas especificas de apoptosis/inflamatorias en el sitio de la trombosis coronaria aguda en comparación con la sangre periférica de pacientes que padecen IAM. Se sabe de estudios previos que IAM es un resultado de la placa inflamada localmente seguido de la ruptura de la placa y la posterior oclusión trombótica del vaso y la inflamación sistémica (Mutin M, Canavy I, Blann A, Bory M, Sampol J, Dignat-George F., Blood 1999; 93(9): 2951-8). La expresión de genes proapoptóticos como BAX, CASP1, FAS, p53 o PCNA fue significativamente más alta en placas de SCA derivadas de ateretectomía coronaria direccional, mientras que los genes antiapoptóticos, como MDM2 se expresaron más en placas de pacientes a los que se les había diagnosticado AE (Rossi ML, Marziliano N, Merlini PA, et al. Circulation 2004; 110 (13): 1767-73). Los procesos inflamatorios sistémicos incluyen entre otros la infiltración de monocitos, la atracción de neutrófilos y la expansión de la placa desestabilizando las células CD4+CD28- (Zal B, Kaski JC, Arno G, et al. Circulation 2004; 109(10): 1230-5). Estas observaciones indican que los mecanismos por debajo de la homeostasis y la reparación celular son activos y más equilibrados en la AE, mientras que las placas inestables se podrían caracterizar mediante la muerte celular programada desequilibrada que es resultado de la activación de genes proapoptóticos. Además se informó de que los anticuerpos dirigidos contra la anti-proteína del choque térmico de 60 kDa, el colesterol, Clamydia pneumonie y CK-18 (Willseron JT. Prog. Cardiovasc Dis 2002; 44(6): 569-78), se asocian con la enfermedad cardiaca isquémica.

Los niveles aumentados de ECI y CK-18 o fragmentos de los mismos, además de CD40L, se asocian con la inestabilidad clínica y por lo tanto se pueden considerar como características patognómicas de los síndromes coronarios agudos. Esta información obtenida in vivo se traslada a los ensayos incluyendo el uso farmacológico de los inhibidores de caspasa en la prevención de la apoptosis del cardiomiocito y la expansión del infarto de miocardio (Yaoita H, Ogawa K, Maehara K, Maruyama Y. Circulation 1998; 97(3): 276-81). Las terapias nuevas que se dirigen a CK-18 o fragmentos de la misma están garantizadas en el IAM.

En resumen, el dispositivo de trombectomía X-sizer se utilizó en pacientes que padecían de IAM (n=40). Se incluyeron como poblaciones control AI (n=40) y AE (n=40). Las proteínas específicas de apoptosis e inflamatorias el precursor de IL-1\beta (IL-1\betap), IL-1\beta, TNF-\alpha, TNF-R1, CD40, CD40L, la enzima conversora de interleucina-1\beta/ECI y el CK-18 se determinaron mediante ELISA. Se usó la inmunohistoquímica para evaluar la presencia de CK-18 en el trombo coronario obtenido de pacientes que padecían IAM. Las comparaciones de grupos se evaluaron mediante el ensayo U Mann-Whitney.

Se determinó que IL-1\betap, ECI y CK-18 (o sus fragmentos) solubles eran nuevos discriminadores para AE y AI (p=0,034, p=0,023, p=0,027, respectivamente). Interesantemente, las ECI y CK-18 solubles estaban aumentadas significativamente en el sitio del infarto de miocardio en comparación con la sangre sistémica (ambos p=0,001), lo que indicó una función patognómica nueva en el acontecimiento agudo del infarto de miocardio. Esta observación se corroboró mediante el hallazgo de que el M30, un anticuerpo capaz de identificar CK-18, se tiñó de manera positiva en el trombo coronario que provocaba el infarto de miocardio.

El infarto agudo de miocardio se relaciona con niveles sistémicos aumentados de ECI y CK-18 in vivo.

La utilización de dispositivos de trombectomía permite la eliminación del material trombótico intracoronario que ofrece la única posibilidad de recoger sangre y trombos y plasma en la arteria coronaria ocluida y de manera concomitante en la arteria femoral para comparar las proteínas específicas de apoptosis e inflamatorias. Los pacientes con angina estable e inestable sirvieron como control (todos los grupos, n=40). Las comparaciones de grupos se evaluaron mediante el ensayo U de Mann Whitney.

Las proteínas específicas de apoptosis e inflamatorias IL-1\betap, IL-1\beta, hs-TNF\alpha, TNF-R1, CD40, CD40L, enzima conversora de interleucina-1\beta/ECI y CK-18 se determinaron mediante ELISA. Se utilizó la inmunohistoquímica para evaluar la presencia de CK-18 en el trombo coronario obtenido de pacientes que padecieron infarto agudo de miocardio.

La nueva información pertenece a: se identificó que IL-1\betap, ECI y CK-18 solubles eran nuevos discriminadores entre la angina estable e inestable (p=0,034, p=0,023, p=0,027, respectivamente).

Interesantemente, IL-1\beta, hs-TNF\alpha, TNF-R1, CD40 y CD40L no cumplieron ninguna significancia en el grupo inestable frente a estable de la cohorte angina. Sin embargo, tiene que afirmarse que la concentración de CD40L determinada en el presente ejemplo fue comparable a los valores medios determinados en la bibliografía de relevancia.

Interesantemente, ECI y CK-18 aumentaron significativamente en el sitio del infarto de miocardio en comparación con la sangre sistémica en pacientes con infarto agudo de miocardio (ambos, p=0,0001). Esto indica una función patognómica nueva en el acontecimiento agudo del infarto de miocardio. Esta observación se corroboró mediante el hallazgo de que M30, un anticuerpo capaz de identificar CK-18, se tiñó positivamente en el trombo que provocaba el infarto de miocardio.

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Claims

1. El método para diagnosticar una enfermedad cardiovascular en un individuo comprendiendo las etapas de:

-: proporcionar una muestra sanguínea de un individuo,

-: diagnosticar una enfermedad cardiovascular si la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en la muestra está aumentada en comparación con la cantidad de fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa en el control de referencia.

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2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la enfermedad cardiovascular es aterosclerosis, una enfermedad coronaria, un síntoma agudo coronario, preferiblemente angina de pecho inestable o infarto agudo de miocardio, angina de pecho estable, accidente cerebro-vascular, preferiblemente accidente cerebro-vascular isquémico, enfermedad inflamatoria o autoinmune asociada con arteriosclerosis o reestenosis.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 a 2, caracterizado por que la cantidad de fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa está determinada inmunológicamente, preferiblemente mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, mediante radioinmunoensayo o mediante análisis de transferencia de Western.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la muestra sanguínea es plasma o suero.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la muestra sanguínea se obtiene de la arteria femoral.

6. Uso de un kit para el diagnóstico in vitro de una enfermedad cardiovascular, para distinguir entre la angina de pecho estable e inestable o para diagnosticar la angina de pecho estable e inestable en un individuo o para evaluar el riesgo de un individuo de desarrollar un trombo en el sistema cardiovascular, comprendiendo el kit:

-: medios para detectar los fragmentos de citoqueratina 18 (CK-18) escindidos por caspasa y

-: un control de referencia, en el que

dichos medios comprenden anticuerpos dirigidos contra fragmentos de CK-18 escindidos por caspasa y en los que el control de referencia se obtiene a partir de al menos un individuo que no padece una enfermedad cardiovascular o de al menos un individuo que padece una angina de pecho estable o inestable.

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7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que la enfermedad cardiovascular es aterosclerosis, una enfermedad coronaria, un síntoma coronario agudo, preferiblemente una angina de pecho inestable o infarto agudo de miocardio, angina de pecho estable, accidente cerebro-vascular, arteriosclerosis o reestenosis asociadas a enfermedad inflamatoria o autoinmune.