JP2021087420A - Escherichia coli組成物およびその方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】組換えアドヘシンタンパク質を生成するため、そしてE.coli血清型に対する免疫応答を生じさせるための、組成物およびその使用方法を提供すること。【解決手段】1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドおよびその断片に関し、その組成物および方法を含む。本明細書では、E.coliに由来するポリペプチドおよびその断片、およびE.coliのリポ多糖に由来する修飾O多糖分子、ならびにそれらのコンジュゲートを含む組成物も開示される。さらなる側面では、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする配列を含む哺乳動物宿主細胞が本明細書に開示される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本願は、2019年11月1日に出願された米国仮出願第62/929,505号、2020年6月26日に出願された米国仮出願第63/045,038号、および2020年9月22日に出願された米国仮出願第63/081,629号に基づく利益を主張する。前述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、2019年11月1日に出願された米国仮出願第62/929,505号、2020年6月26日に出願された米国仮出願第63/045,038号、および2020年9月22日に出願された米国仮出願第63/081,629号に基づく利益を主張する。前述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本願は、EFS−Webによって電子出願されるものであり、.txtフォーマットで電子提出された配列表を含む。この.txtファイルは、2020年9月18日に作成され、152KBのサイズである「PC072517_03_SEQ_List_ST25.txt」という名称の配列表を含む。この.txtファイルに含まれる配列表は本明細書の一部をなし、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、EFS−Webによって電子出願されるものであり、.txtフォーマットで電子提出された配列表を含む。この.txtファイルは、2020年9月18日に作成され、152KBのサイズである「PC072517_03_SEQ_List_ST25.txt」という名称の配列表を含む。この.txtファイルに含まれる配列表は本明細書の一部をなし、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、Escherichia coli組成物およびその方法に関する。
細菌の線毛アドヘシンであるFimHおよびFmlHは、宿主細胞の特定の糖タンパク質を認識することにより、Escherichia coliが特徴的な尿路微小環境を利用することを可能にする。FimHは、尿上皮にあるマンノシル化されたウロプラキン受容体に結合し、一方でFmlHは、腎臓および炎症した膀胱の上皮表面タンパク質に付いたガラクトースまたはN−アセチルガラクトサミンO−グリカンに結合する。線毛FimHはまた、腸上皮上の高度にマンノシル化されたタンパク質に結合することにより、腸内毒素原性E.coli(ETEC)および多剤耐性のある侵襲性E.coliの腸内定着に関与する。
全長FimHは、短いリンカーによって接続されているN末端側のレクチンドメインとC末端側のピリンドメインの、2つのドメインから構成されている。FimHのレクチンドメインは、尿路上皮細胞表面にあるマンノシル化されたウロプラキン1aへの結合に関与する炭水化物認識ドメインを含む。ピリンドメインは、ドナー鎖相補性と呼ばれるプロセスにより、その後のFimGサブユニットのドナー鎖を介して繊毛のコアに固定される。
FimHのレクチンドメインの立体構造およびリガンド結合特性は、FimHのピリンドメインのアロステリック制御下にある。静止状態では、全長FimHの2つのドメインの相互作用が、浅い結合ポケットを特徴とする、モノマンノースに対する親和性が低い(例えば、Kd約300μMの)状態でレクチンドメインを安定化させる。マンノシドリガンドへの結合は、レクチンドメインおよびピリンドメインが近接した状態を保つ中親和性状態をもたらす立体構造変化を誘発する。しかしながら、せん断応力がかかると、レクチンドメインとピリンドメインは分離し、それによって高親和性状態(例えば、Kd<1.2μM)が誘発される。
ピリンドメインが及ぼす負のアロステリック調節がないため、分離したFimHのレクチンドメインは、高親和性状態にロックされる。分離し、高親和性状態にロックされた組換えレクチンドメインは、高い安定性を呈する。しかしながら、アドヘシンを結合性の低い立体構造にロックすると、接着を阻害する抗体の生成が誘発される。したがって、低親和性状態でレクチンドメインを安定化させることに関心が寄せられている。
さらに、製品開発に十分な高い収量でFimHを発現させる方法にも関心が寄せられている。FimHを含む組成物の開発を妨げる一因は、E.coliの周辺質においてFimHを天然状態で発現させる際に達成される収量が低いことである。ラボ−ベンチスケールで報告される典型的な収量は、精製されたFimCH複合体については3〜5mg/L、FimH(LD)については4〜10mg/Lであり、臨床試験材料の製造のためにスケーラブルとみなされるレベルを下回っている。FimHのインビボでの立体構造は、精製された組換え型のタンパク質により得られる立体構造とは異なる。一般に、FimHの天然の立体構造は、FimHと、周辺質のFimCと呼ばれるシャペロンタンパク質とのインビボでの相互作用によって少なくとも部分的に決定される。
FimHの組換え生成には、依然として課題がある。タンパク質の発現および精製は、型通りのプロセスではない。
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これらおよび他の需要を満たすため、本発明は、組換えアドヘシンタンパク質を生成するため、そしてE.coli血清型に対する免疫応答を生じさせるための、組成物およびその使用方法に関する。
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞に関する。いくつかの態様において、本ポリヌクレオチドは、E.coli線毛H(fimH)ポリペプチドに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする。いくつかの態様において、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドのN末端にフェニルアラニン残基を含む。
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を組換え哺乳動物細胞において産生する方法に関する。本方法は、組換え哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、ポリペプチドまたはその断片を発現させるステップと、ポリペプチドまたはその断片を回収するステップとを含む。いくつかの態様において、本方法は、ポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含む。いくつかの態様において、ポリペプチドの収量は、少なくとも0.05g/Lである。いくつかの態様において、ポリペプチドの収量は、少なくとも0.10g/Lである。
1つの側面において、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号28、および配列番号29、またはそれらのいずれかの組み合わせに対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む組成物に関する。
別の側面では、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号28、および配列番号29のいずれか1つにおける、少なくともn個の連続するアミノ酸(ここで、nは7以上(例えば8、10、12、14、16、18、20またはそれ以上)である)を有するポリペプチドを含む組成物に関する。いくつかの態様において、本組成物は、表1のいずれか1つの式、好ましくは式O1A、式O1B、式O2、式O6、および式O25Bから選択される糖類をさらに含み、式中、nは、1〜100、好ましくは31〜100の整数である。
配列の説明
配列番号1は、野生型の1型線毛D−マンノース特異的アドヘシン[Escherichia coli FimH J96]のアミノ酸配列を示す。
配列番号1は、野生型の1型線毛D−マンノース特異的アドヘシン[Escherichia coli FimH J96]のアミノ酸配列を示す。
配列番号2は、配列番号1のアミノ酸(aa)残基22〜300に対応する、FimHの断片(成熟FimHタンパク質)のアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、FimHレクチンドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、FimHレクチンドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、FimHピリンドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、E.coli FimHに由来するポリペプチド(pSB02198−pcDNA3.1(+)中のFimH mIgKシグナルペプチド/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7AAリンカー/FimG A1..K14/GGHis8)のアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、E.coli FimHに由来するポリペプチド(pSB02198−pcDNA3.1(+)中のFimH mIgKシグナルペプチド/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7AAリンカー/FimG A1..K14/GGHis8)のアミノ酸配列を示す。
配列番号6は、E.coli FimHに由来するポリペプチド(pSB02307−pcDNA3.1(+)中のFimH mIgKシグナルペプチド/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8)のアミノ酸配列を示す。
配列番号7は、E.coli FimHに由来するポリペプチドの断片(pSB02083 FimHレクチンドメイン野生型構築物)のアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、E.coli FimHに由来するポリペプチドの断片(pSB02158 FimHレクチンドメインロック変異体)のアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、E.coli FimHに由来するポリペプチドの断片(pSB02158 FimHレクチンドメインロック変異体)のアミノ酸配列を示す。
配列番号9は、E.coli FimGに由来するポリペプチドの断片(FimG A1..K14)のアミノ酸配列を示す。
配列番号10は、E.coli FimCに由来するポリペプチドの断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号10は、E.coli FimCに由来するポリペプチドの断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号11は、4aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号12は、5aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号13は、6aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号12は、5aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号13は、6aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号14は、7aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号15は、8aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号16は、9aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号15は、8aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号16は、9aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号17は、10aaリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号18は、FimH J96シグナル配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号19は、配列番号5(pSB02198−pcDNA3.1(+)中のFimH mIgKシグナルペプチド/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7AAリンカー/FimG A1..K14/GGHis8)のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号18は、FimH J96シグナル配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号19は、配列番号5(pSB02198−pcDNA3.1(+)中のFimH mIgKシグナルペプチド/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7AAリンカー/FimG A1..K14/GGHis8)のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号20は、配列番号5によるE.coli FimHに由来するポリペプチド(pSB02198−pcDNA3.1(+)中のFimH mIgKシグナルペプチド/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7AAリンカー/FimG A1..K14/GGHis8の成熟タンパク質)のアミノ酸配列を示す。
配列番号21は、E.coli FimGに由来するポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号22は、配列番号6(pSB02307−pcDNA3.1(+)中のFimH mIgKシグナルペプチド/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8)のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号22は、配列番号6(pSB02307−pcDNA3.1(+)中のFimH mIgKシグナルペプチド/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8)のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号23は、配列番号6によるE.coli FimHに由来するポリペプチド(pcDNA3.1(+)中のFimH mIgKシグナルペプチド/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8の成熟タンパク質)のアミノ酸配列を示す。
配列番号24は、配列番号7によるE.coli FimHに由来するポリペプチド(pSB02083 FimHレクチンドメイン野生型構築物の成熟タンパク質)のアミノ酸配列を示す。
配列番号25は、Hisタグのアミノ酸配列を示す。
配列番号26は、配列番号8によるE.coli FimHに由来するポリペプチド(pSB02158 FimHレクチンドメインロック変異体の成熟タンパク質)のアミノ酸配列を示す。
配列番号26は、配列番号8によるE.coli FimHに由来するポリペプチド(pSB02158 FimHレクチンドメインロック変異体の成熟タンパク質)のアミノ酸配列を示す。
配列番号27は、E.coli FimHに由来するポリペプチド(pSB01878)のアミノ酸配列を示す。
配列番号28は、E.coli FimHに由来するポリペプチド(K12)のアミノ酸配列を示す。
配列番号28は、E.coli FimHに由来するポリペプチド(K12)のアミノ酸配列を示す。
配列番号29は、E.coli FimHに由来するポリペプチド(UTI89)のアミノ酸配列を示す。
配列番号30は、O25b 2401 WzzBのアミノ酸配列を示す。
配列番号30は、O25b 2401 WzzBのアミノ酸配列を示す。
配列番号31は、O25a:K5:H1 WzzBのアミノ酸配列を示す。
配列番号32は、O25a ETEC ATCC WzzBのアミノ酸配列を示す。
配列番号33は、K12 W3110 WzzBのアミノ酸配列を示す。
配列番号32は、O25a ETEC ATCC WzzBのアミノ酸配列を示す。
配列番号33は、K12 W3110 WzzBのアミノ酸配列を示す。
配列番号34は、Salmonella LT2 WzzBのアミノ酸配列を示す。
配列番号35は、O25b 2401 FepEのアミノ酸配列を示す。
配列番号36は、O25a:K5:H1 FepEのアミノ酸配列を示す。
配列番号35は、O25b 2401 FepEのアミノ酸配列を示す。
配列番号36は、O25a:K5:H1 FepEのアミノ酸配列を示す。
配列番号37は、O25a ETEC ATCC FepEのアミノ酸配列を示す。
配列番号38は、O157 FepEのアミノ酸配列を示す。
配列番号39は、Salmonella LT2 FepEのアミノ酸配列を示す。
配列番号38は、O157 FepEのアミノ酸配列を示す。
配列番号39は、Salmonella LT2 FepEのアミノ酸配列を示す。
配列番号40は、LT2wzzB_Sのプライマー配列を示す。
配列番号41は、LT2wzzB_ASのプライマー配列を示す。
配列番号42は、O25bFepE_Sのプライマー配列を示す。
配列番号41は、LT2wzzB_ASのプライマー配列を示す。
配列番号42は、O25bFepE_Sのプライマー配列を示す。
配列番号43は、O25bFepE_Aのプライマー配列を示す。
配列番号44は、wzzB P1_Sのプライマー配列を示す。
配列番号45は、wzzB P2_ASのプライマー配列を示す。
配列番号44は、wzzB P1_Sのプライマー配列を示す。
配列番号45は、wzzB P2_ASのプライマー配列を示す。
配列番号46は、wzzB P3_Sのプライマー配列を示す。
配列番号47は、wzzB P4_ASのプライマー配列を示す。
配列番号48は、O157 FepE_Sのプライマー配列を示す。
配列番号47は、wzzB P4_ASのプライマー配列を示す。
配列番号48は、O157 FepE_Sのプライマー配列を示す。
配列番号49は、O157 FepE_ASのプライマー配列を示す。
配列番号50は、pBAD33_adaptor_Sのプライマー配列を示す。
配列番号51は、pBAD33_adaptor_ASのプライマー配列を示す。
配列番号50は、pBAD33_adaptor_Sのプライマー配列を示す。
配列番号51は、pBAD33_adaptor_ASのプライマー配列を示す。
配列番号52は、JUMPSTART_rのプライマー配列を示す。
配列番号53は、gnd_fのプライマー配列を示す。
配列番号54は、マウスIgKシグナル配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号53は、gnd_fのプライマー配列を示す。
配列番号54は、マウスIgKシグナル配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号55は、ヒトIgG受容体FcRn大サブユニットp51のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号56は、ヒトIL10タンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号56は、ヒトIL10タンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号57は、ヒト呼吸器多核体ウイルスA(株A2)融合糖タンパク質F0シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号58は、インフルエンザA血球凝集素シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号58は、インフルエンザA血球凝集素シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号59〜101は、ナノ構造関連ポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
配列番号102〜109は、シグナルペプチド予測に使用された様々な種のSignalP 4.1(DTU Bioinformatics)による配列を示す。
配列番号102〜109は、シグナルペプチド予測に使用された様々な種のSignalP 4.1(DTU Bioinformatics)による配列を示す。
本発明者らは、発現のために哺乳動物細胞を使用することにより、E.coliアドヘシンタンパク質に由来するポリペプチドの生成の課題を克服した。本開示の随所および実施例のセクションに例示されるように、哺乳動物細胞による組換えポリペプチドの発現は、E.coliにおけるポリペプチドの発現と比較して高い収量を一貫して達成したことが発見された。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、組換えポリペプチドおよびその断片を望ましい立体構造で安定化させる変異および発現構築物を同定した。
感染の一次段階、すなわち宿主細胞の受容体への細菌の付着および粘膜表面への定着を妨げることは、細菌感染を予防し、治療し、かつ/またはその可能性を低減させるために重要である。細菌の付着には、アドヘシンと呼ばれる細菌表面タンパク質と宿主細胞受容体との間の相互作用が関与しうる。FimHアドヘシン(尿路疾患性E.coli由来)を用いた過去の前臨床研究は、アドヘシンに対して抗体が生じることを確認している。中耳炎および齲歯から肺炎および敗血症に至るまで、感染症を予防する取り組みにおいて、アドヘシンの同定、特性評価、および単離における進歩が必要とされている。
FimHなどのアドヘシンタンパク質およびその断片を商業規模で生成するためには、ポリペプチドおよびその断片が十分な量で長時間にわたり、かつ好ましい立体構造で発現しうるように、好適な構築物および好適な宿主を同定する必要がある。例えば、いくつかの態様において、組換えポリペプチドの好ましい立体構造は、モノマンノースに対して低い親和性(例えば、Kd約300μM)を呈する。いくつかの態様において、好ましい立体構造は、モノマンノースに対して高い親和性(例えば、Kd<1.2μM)を呈する。
E.coliに由来するアドヘシンタンパク質は、E.coli細胞において組換え発現されてきた。しかしながら、その収量は10mg/Lに満たなかった。E.coliで産生する場合、繊毛に関連したアドヘシンを大量に精製することは困難でありうる。理論または機構に束縛されるものではないが、E.coliで発現した産物は、哺乳動物において効果的な免疫応答を生じさせるのに最適ではない立体構造を呈しうると示唆されている。
1つの側面において、本発明は、細菌アドヘシンタンパク質に由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え哺乳動物細胞を含む。
別の側面では、本発明は、ポリペプチドまたはその断片を哺乳動物細胞において産生する方法であって、(i)哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、前記ポリペプチドまたはその断片を発現させるステップと、(ii)前記ポリペプチドまたはその断片を培養物から回収するステップとを含む方法を含む。本方法は、ポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含んでもよい。また本明細書では、本方法により生成されたポリペプチドまたはその断片も開示される。
別の側面では、本発明は、ポリペプチドまたはその断片を哺乳動物細胞において産生する方法であって、(i)哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、前記ポリペプチドまたはその断片を発現させるステップと、(ii)前記ポリペプチドまたはその断片を培養物から回収するステップとを含む方法を含む。本方法は、ポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含んでもよい。また本明細書では、本方法により生成されたポリペプチドまたはその断片も開示される。
別の側面では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片を含む組成物を含む。本組成物は、インビボ投与に好適なポリペプチドまたはその断片を含みうる。例えば、かかる組成物におけるポリペプチドまたはその断片は、質量基準で少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の純度を有しうる。本組成物は、アジュバントをさらに含んでもよい。
さらなる側面では、本発明は、E.coliに対する免疫応答を誘発するのに使用される組成物を含む。E.coliに対する免疫応答を誘発するための本明細書に記載の組成物の使用、およびE.coliに対する免疫応答を誘発するための薬物の製造における本明細書に記載の組成物の使用もまた、開示される。
I. E.coliに由来するポリペプチドおよびその断片
1つの側面において、本明細書では、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、哺乳動物細胞が開示される。本明細書で使用される「に由来する」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失、または付加の導入によって変化している、本明細書に記載のFimHポリペプチドもしくはFimCHポリペプチド複合体またはそれらの断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関するものである。好ましくは、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型E.coli FimHポリペプチドまたは断片の配列に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有する配列を含む。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型FimHポリペプチドもしくはFimCHポリペプチド複合体またはそれらの断片と同一の全長のアミノ酸を有する。
1つの側面において、本明細書では、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、哺乳動物細胞が開示される。本明細書で使用される「に由来する」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失、または付加の導入によって変化している、本明細書に記載のFimHポリペプチドもしくはFimCHポリペプチド複合体またはそれらの断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関するものである。好ましくは、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型E.coli FimHポリペプチドまたは断片の配列に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有する配列を含む。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型FimHポリペプチドもしくはFimCHポリペプチド複合体またはそれらの断片と同一の全長のアミノ酸を有する。
断片は、当該配列のうち、少なくともn個の連続するアミノ酸を含むべきであり、特定の配列に応じて、nは7以上(例えば8、10、12、14、16、18、20またはそれ以上)である。好ましくは、断片は、配列のエピトープを含む。いくつかの態様において、断片は、E.coliに由来するポリペプチドのアミノ酸配列のうち、少なくとも50個の連続するアミノ酸残基、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基、少なくとも125個の連続するアミノ酸残基、少なくとも150個の連続するアミノ酸残基、少なくとも175個の連続するアミノ酸残基、少なくとも200個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも250個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型E.coli FimHポリペプチドまたは断片と比較して、1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含む。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型FimHポリペプチドまたはその断片と同様または同一の機能を有する。
好ましい態様では、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチド複合体またはそれらの断片は、単離または精製される。
好ましい態様では、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチド複合体またはそれらの断片は、単離または精製される。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞のゲノムDNAに組み込まれ、好適な条件下で培養されると、E.coliに由来する前記ポリペプチドまたはその断片が、哺乳動物細胞によって発現される。
好ましい態様では、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、可溶性である。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、哺乳動物宿主細胞から分泌される。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、哺乳動物宿主細胞から分泌される。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、N末端またはC末端の伸長のような、さらなるアミノ酸残基を含みうる。かかる伸長は、ポリペプチドまたはその断片の検出を容易にしうるタグ(例えば、モノクローナル抗体による検出のためのエピトープタグ)および/または精製を容易にしうるタグ(例えば、ニッケルキレート樹脂での精製を可能にするポリヒスチジンタグ)を1つまたは複数含んでもよい。いくつかの態様において、タグは、配列番号21および配列番号25のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む。このようなアフィニティ精製タグは、当技術分野において公知である。アフィニティ精製タグの例は、例えば、Hisタグ(例えば金属イオンに結合しうるヘキサヒスチジン)、マルトース結合タンパク質(MBP)(例えばアミロースに結合しうる)、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)(例えばグルタチオンに結合しうる)、FLAGタグ(例えば抗フラグ抗体に結合しうる)、Strepタグ(例えばストレプトアビジンまたはその誘導体に結合しうる)を含む。好ましい態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、N末端またはC末端の伸長のような、さらなるアミノ酸残基を含まない。いくつかの態様において、本明細書に記載のE.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、外来性タグ配列を含まない。
本明細書では特定のE.coli株に言及する場合があるが、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、特記なき限り、特定の菌株に限定されないことを理解されたい。
いくつかの態様において、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドのN末端にフェニルアラニン残基を含む。いくつかの態様において、FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、N末端の最初の20残基以内の位置にフェニルアラニン残基を含む。好ましくは、フェニルアラニン残基は、ポリペプチドの1位に位置する。例えば、いくつかの態様において、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片のN末端に、さらなるグリシン残基を含まない。
いくつかの態様において、野生型成熟E.coli FimHの1位のフェニルアラニン残基は、例えば、Ile、LeuおよびVal残基のいずれか1つのような脂肪族疎水性アミノ酸によって置換されている。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を発現させるために、シグナルペプチドが使用される場合がある。タンパク質を生成するためのシグナル配列および発現カセットは、当技術分野において公知である。一般に、リーダーペプチドは5〜30アミノ酸長であり、通常、新しく合成されたポリペプチドのN末端に存在する。シグナルペプチドは、一般的に、単一のアルファ−ヘリックスを形成する傾向がある疎水性アミノ酸の長い区間を含む。さらに、多くのシグナルペプチドは、正電荷を帯びたアミノ酸の短い区間から始まり、これは、転位置中のポリペプチドの形態を適切なものにすることに役立ちうる。シグナルペプチドの端部には、通常、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸の区間が存在する。シグナルペプチダーゼは、転位置中に切断する場合もあれば、転位置完了後に切断する場合もあり、遊離したシグナルペプチドおよび成熟タンパク質をもたらす。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、配列番号9、配列番号18、配列番号19、および配列番号22のいずれか1つに対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のE.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、切断可能なリンカーを含みうる。かかるリンカーは、例えばリンカーを切断することができる因子を加えることにより、精製された複合体からタグが分離されることを可能にする。切断可能なリンカーは、当技術分野において公知である。かかるリンカーは、例えば、感光性結合の照射または酸触媒加水分解によって切断されうる。切断可能なリンカーの別の例としては、プロテアーゼ認識部位を組み込み、好適なプロテアーゼ酵素の添加によって切断されうる、ポリペプチドリンカーが挙げられる。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型E.coli FimHポリペプチドまたは断片と比較して修飾を含む。修飾は、ポリペプチドへの分子の共有結合を含みうる。例えば、かかる修飾は、既知の保護基/ブロッキング基によるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などを含みうる。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型E.coli FimHポリペプチドまたは断片と比較して、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない当業者に公知の技術を使用した化学修飾などによる修飾を含みうる。別の態様では、修飾は、ポリペプチドへの脂質分子の共有結合を含みうる。いくつかの態様において、ポリペプチドは、対応する野生型E.coli FimHポリペプチドまたはその断片と比較して、ポリペプチドへの分子の共有結合を含まない。
例えば、細胞培養で生成されるタンパク質およびポリペプチドは、オリゴ糖鎖を含む共有結合した炭水化物構造を含む糖タンパク質でありうる。こうしたオリゴ糖鎖は、N結合またはO結合のいずれかを介してタンパク質に結合している。オリゴ糖鎖は、糖タンパク質の質量の大部分を構成しうる。一般的に、N結合型オリゴ糖は、Asn−X−Ser/Thr(ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸でありうる)の標的コンセンサス配列におけるアスパラギン残基の側鎖上のアミノ基に付加される。いくつかの態様において、グリコシル化部位は、アスパラギン−グリシン−スレオニン(NGT)、アスパラギン−イソロイシン−スレオニン(NIT)、アスパラギン−グリシン−セリン(NGS)、アスパラギン−セリン−スレオニン(NST)、およびアスパラギン−スレオニン−セリン(NTS)のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む。哺乳動物細胞において産生される、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、グリコシル化されていてもよい。グリコシル化は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の配列内のN結合型グリコシル化シグナルAsn−Xaa−Ser/Thrにおいて生じうる。「N結合型グリコシル化」とは、炭水化物部分がGIcNAcを介してポリペプチド鎖内のアスパラギン残基に結合することを意味する。N結合型炭水化物は、Man1−6(Man1−3)Manβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAcβ−Rという共通するコア構造を含み、ここで、Rは、生成されるE.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のアスパラギン残基を表す。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片におけるグリコシル化部位は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の配列内の変異によって除去される。例えば、いくつかの態様において、グリコシル化モチーフ(Asn−Xaa−Ser/Thr)のAsn残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ser、Asp、Thr、およびGlnのいずれか1つから選択される。
いくつかの態様において、グリコシル化モチーフのSer残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Asp、Thr、およびGlnのいずれか1つから選択される。
いくつかの態様において、グリコシル化モチーフのThr残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ser、Asp、およびGlnのいずれか1つから選択される。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片におけるグリコシル化部位(例えばAsn−Xaa−Ser/Thr)は、除去も修飾もされない。いくつかの態様において、グリコシル化を減少させる、または阻害する化合物が、細胞培養培地に添加されてもよい。そのような態様において、ポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化を阻害する化合物が存在しないことを除けば同一の条件下で細胞によって産生される、それ以外は同一のポリペプチドまたはタンパク質と比べて、非グリコシル化(すなわち、アグリコシル化)部位、すなわち、付加された炭水化物部分のない、全く占有されていないグリカン部位を少なくとももう1つ含むか、または、同じ潜在的グリコシル化部位において、炭水化物部分を少なくとも1つ少なく含む。そのような化合物は当技術分野において公知であり、ツニカマイシン、ツニカマイシン相同体、ストレプトビルジン、ミコスポシジン(mycospocidin)、アンホマイシン、ツシマイシン、抗生物質24010、抗生物質MM19290、バシトラシン、コリネトキシン、ショードマイシン、ジュイマイシン(duimycin)、1−デオキシマンノノジリマイシン、デオキシノジリマイシン、N−メチル−1−デオキシマンノジリマイシン、ブレフェルジンA、グルコースおよびマンノース類似体、2−デオキシ−D−グルコース、2−デオキシグルコース、D−(+)−マンノース、D−(+)ガラクトース、2−デオキシ−2−フルオロ−D−グルコース、1,4−ジデオキシ−1,4−イミノ−D−マンニトール(DIM)、フルオログルコース、フルオロマンノース、UDP−2−デオキシグルコース、GDP−2−デオキシグルコース、ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ阻害剤、25−ヒドロキシコレステロール、ヒドロキシコレステロール、スウェインソニン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、アクチノマイシンD、モネンシン、m−クロロカルボニル−シアニドフェニルヒドラゾン(CCCP)、コンパクチン、ドリチル−ホスホリル^−デオキシグルコース、N−アセチル−D−グルコサミン、ヒポキサンチン、チミジン、コレステロール、グルコサミン、マンノサミン、カスタノスペルミン、グルタミン、ブロモコンズリトール、コンズリトールエポキシドおよびコンズリトール誘導体、グリコシルメチル−p−ニトロフェニルトリアゼン、β−ヒドロキシノルバリン、スレオ−β−フルオロアスパラギン、D−(+)−グルコン酸δ−ラクトン、リン酸ジ(2−エチルヘキシル)、リン酸トリブチル、リン酸ドデシル、(ジフェニルメチル)−リン酸の2−ジメチルアミノエチルエステル、[2−(ジフェニルホスフィニルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムヨーダイド、ヨード酢酸、および/またはフルオロ酢酸を含みうるが、これらに限定されない。当業者は、過度の実験を行うことなく、本発明の方法および組成物に従って使用されうるグリコシル化阻害物質を容易に認識するか、または決定することができるであろう。そのような態様において、ポリペプチドまたはその断片のグリコシル化は、ポリペプチドまたはその断片へのアミノ酸変異の導入を行うことなく制御されうる。
いくつかの態様において、哺乳動物細胞によって産生されるポリペプチドまたはその断片のグリコシル化レベル(例えば、ポリペプチドまたはその断片において占有されているグリカン部位の数、その部位におけるグリコフォームのサイズおよび/または複雑さなど)は、そのような解糖を阻害する化合物および/または変異を欠く、それ以外は同一の培地において、それ以外は同一の条件下で生成されるポリペプチドまたはその断片のグリコシル化レベルよりも低い。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、N結合型タンパク質のグリコシル化部位を含まない。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、N結合型タンパク質の少なくとも1つのグリコシル化部位を含まない。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、N結合型タンパク質のグリコシル化部位のいずれも含まない。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、N結合型タンパク質のグリコシル化部位を含む。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、N結合型タンパク質のグリコシル化部位を最大で1つ含む。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、N結合型タンパク質のグリコシル化部位を最大で2つ含む。
異なる細胞株によって、またはトランスジェニック動物において発現された、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、互いと比べて異なるグリカン部位占有率、グリコフォーム、および/またはグリコシル化パターンを有しうる。いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物細胞において産生された、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のグリコシル化、グリカン占有率、またはグリコフォームパターンに関係ない、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を包含する。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドの1位のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、メチオニンではないE.coli FimHポリペプチド、例えば配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来しうる。好ましくは、E.coli FimHに由来するポリペプチドは、E.coliに由来するポリペプチドのアミノ酸配列の1位にフェニルアラニンを含む。別の好ましい態様では、E.coli FimHに由来するポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含み、好ましくは、E.coliに由来するポリペプチドのアミノ酸配列の1位の残基はフェニルアラニンである。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimHポリペプチドに由来しうる、配列番号4のアミノ酸配列を含みうる。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、および配列番号29のいずれか1つに対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、例えば、配列番号9のアミノ酸配列を有するE.coli FimGポリペプチドに由来してもよい。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、例えば、配列番号10のアミノ酸配列を有するE.coli FimCポリペプチドに由来してもよい。
A. E.coli FimHに由来するポリペプチドおよびその断片
好ましい態様では、ポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimHに由来する。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、全長E.coli FimHを含む。全長FimHは、短いリンカーによって接続されているN末端側のレクチンドメインとC末端側のピリンドメインの、2つのドメインを含む。いくつかの態様において、E.coli FimHの全長は、E.coli FimHの成熟タンパク質の全長を含む、279個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、E.coli FimHの全長は、E.coli FimHの成熟タンパク質の全長と、21アミノ酸長であるシグナルペプチド配列とを含む、300個のアミノ酸を含む。300アミノ酸長の野生型FimHの一次構造は、E.coli株間で高度に保存されている。
好ましい態様では、ポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimHに由来する。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、全長E.coli FimHを含む。全長FimHは、短いリンカーによって接続されているN末端側のレクチンドメインとC末端側のピリンドメインの、2つのドメインを含む。いくつかの態様において、E.coli FimHの全長は、E.coli FimHの成熟タンパク質の全長を含む、279個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、E.coli FimHの全長は、E.coli FimHの成熟タンパク質の全長と、21アミノ酸長であるシグナルペプチド配列とを含む、300個のアミノ酸を含む。300アミノ酸長の野生型FimHの一次構造は、E.coli株間で高度に保存されている。
全長E.coli FimHの例示的な配列は配列番号1である。全長FimH配列は、レクチンドメインの配列およびピリンドメインの配列を含む。FimHのレクチンドメインは、尿路上皮細胞表面にあるマンノシル化されたウロプラキン1aへの結合に関与する炭水化物認識ドメインを含む。ピリンドメインは、ドナー鎖相補性と呼ばれるプロセスにより、その後のFimGサブユニットのドナー鎖を介して繊毛のコアに固定される。
N末端から始まり、全長FimHの各ドメインの名称と、括弧でくくった例示的なアミノ酸配列が、FimHレクチン(配列番号2)およびFimHピリン(配列番号3)のように示される。
E.coli FimHに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号28、および配列番号29のいずれか1つに対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号28、および配列番号29のいずれか1つに対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有する、バリアントを含む。ある特定の態様において、FimHバリアントタンパク質は、(i)FimH−FimCの一部を形成し、(ii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号28、および配列番号29の少なくとも1つのエピトープを含み、かつ/または(iii)E.coli FimHと免疫学的に交差反応する抗体をインビボで生じうる。
いくつかの態様において、本組成物は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号28、および配列番号29のいずれか1つにおける、少なくともn個の連続するアミノ酸(ここで、nは7以上(例えば8、10、12、14、16、18、20またはそれ以上)である)を有するポリペプチドを含む。好ましくは、断片は、配列のエピトープを含む。いくつかの態様において、組成物は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号28、および配列番号29のいずれか1つのアミノ酸配列のうち、少なくとも50個の連続するアミノ酸残基、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基、少なくとも125個の連続するアミノ酸残基、少なくとも150個の連続するアミノ酸残基、少なくとも175個の連続するアミノ酸残基、少なくとも200個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも250個の連続するアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、本組成物は、配列番号1に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号2に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号3に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号4に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号20に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号23に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号24に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号26に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号28に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号30に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書に記載のE.coli FimHに由来する好適なポリペプチドおよびその断片の別の例は、野生型のN末端シグナル配列を欠き、配列番号1のアミノ酸残基22〜300に対応する配列番号2として示される。FimH断片の別の例は、配列番号1に示されるような、N末端シグナル配列および成熟タンパク質の全体を含む。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片におけるグリコシル化部位は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の配列内の変異によって除去される。例えば、いくつかの態様において、成熟E.coli FimHポリペプチドの7位の(例えば、配列番号2の番号付けによる)Asn残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、E.coli FimHポリペプチドのレクチンドメインの7位の(例えば、配列番号3の番号付けによる)Asn残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ser、Asp、Thr、およびGlnのいずれか1つから選択される。
いくつかの態様において、成熟E.coli FimHポリペプチドの10位の(例えば、配列番号2の番号付けによる)Thr残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、E.coli FimHポリペプチドのレクチンドメインの7位の(例えば、配列番号3の番号付けによる)Thr残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ser、Asp、およびGlnのいずれか1つから選択される。
いくつかの態様において、成熟E.coli FimHポリペプチドのN235位の(例えば、配列番号2の番号付けによる)Asn残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、成熟E.coli FimHポリペプチドのN228位の(例えば、配列番号2の番号付けによる)Asn残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ser、Asp、Thr、およびGlnのいずれか1つから選択される。
いくつかの態様において、成熟E.coli FimHポリペプチドの70位の(例えば、配列番号2の番号付けによる)Asn残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、E.coli FimHポリペプチドのレクチンドメインの70位の(例えば、配列番号3の番号付けによる)Asn残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ser、Asp、Thr、およびGlnのいずれか1つから選択される。
いくつかの態様において、成熟E.coli FimHポリペプチドの72位の(例えば、配列番号2の番号付けによる)Ser残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、E.coli FimHポリペプチドのレクチンドメインの72位の(例えば、配列番号3の番号付けによる)Ser残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Asp、Thr、およびGlnのいずれか1つから選択される。
本明細書で使用される「断片」という用語は、ポリペプチドに関するものであり、所与のポリペプチドのうち、そのポリペプチドに独特または特徴的である任意の明確な部分と定義される。この用語は、本明細書で使用される場合、所与のポリペプチドのうち、全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する、任意の明確な部分のことも意味する。ある特定の態様において、保持される活性の一部は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも10%である。ある特定の態様において、保持される活性の一部は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%である。ある特定の態様において、保持される活性の一部は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%である。ある特定の態様において、保持される活性の一部は、全長ポリペプチドの活性の100%以上である。いくつかの態様において、断片は、全長ポリペプチドのうちの少なくとも5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、またはそれ以上の連続するアミノ酸を含む。
B. FimH、FimCの複合体、およびそれらの断片
いくつかの態様において、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimCに由来するポリペプチドまたはその断片との複合体として存在する。好ましい態様では、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、E.coli FimCに由来するポリペプチドまたはその断片とが、複合体として、好ましくは1:1の比で複合体として存在する。理論または機構に束縛されるものではないが、全長FimHが周辺質シャペロンFimCによって活性のある立体構造で安定化されることにより、全長FimHタンパク質を精製することが可能になりうる。したがって、いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、全長FimHおよび全長FimCを含む。
いくつかの態様において、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimCに由来するポリペプチドまたはその断片との複合体として存在する。好ましい態様では、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、E.coli FimCに由来するポリペプチドまたはその断片とが、複合体として、好ましくは1:1の比で複合体として存在する。理論または機構に束縛されるものではないが、全長FimHが周辺質シャペロンFimCによって活性のある立体構造で安定化されることにより、全長FimHタンパク質を精製することが可能になりうる。したがって、いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、全長FimHおよび全長FimCを含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、FimHの断片およびFimCの断片を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、全長FimHおよびFimCの断片を含む。E.coli FimCの例示的な配列は配列番号10に示される。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、FimHの複合体形成断片を含む。
FimHの複合体形成断片は、FimCまたはその断片と複合体を形成する能力を保持するFimHタンパク質の任意の一部分でありうる。FimHの好適な複合体形成断片は、当技術分野において公知である標準的なアッセイ、例えば免疫共沈降アッセイ、架橋、または蛍光染色による共局在化などによって得るか、または決定することもできる。SDS−PAGEまたはウエスタンブロットも(例えば、ゲル電気泳動によって分かるように、FimH断片およびFimCまたはその断片が複合体として存在することを示すことによって)使用されうる。ある特定の態様において、FimHの複合体形成断片は、(i)FimH−FimC複合体の一部を形成し、(ii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号10、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号28、および配列番号29の少なくとも1つのエピトープを含み、かつ/または(iii)E.coli FimHと免疫学的に交差反応する抗体をインビボで生じうる。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、全長FimHを含み、このFimHは、FimCと複合体を形成していない。さらなる態様において、ポリペプチドまたはその断片は、FimHの断片を含み、この断片は、FimCと複合体を形成していない。いくつかの態様において、E.coli FimCに由来するポリペプチドまたはその断片は、配列番号10を含む。いくつかの態様において、複合体は、同じプラスミドから、好ましくは、ポリペプチドまたはその断片それぞれに対する別々のプロモーターの制御下で発現されうる。
いくつかの態様において、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片の構造に工学的に導入されてもよい、E.coli FimCに由来するポリペプチドまたはその断片に結合する。複合体におけるFimHに結合するFimC分子の部分は「ドナー鎖」と呼ばれ、FimCH複合体のFimHに結合するFimCの鎖を使用した天然FimH構造の形成の機構は、「ドナー鎖相補性」として知られている。
いくつかの態様において、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、適切なドナー鎖で補完されたバージョンのFimHによって発現させることができ、ここで、FimCH複合体のFimHと相互作用するFimCのアミノ酸配列自体が、FimC分子の残部が存在する必要なしに天然の立体構造をもたらすように、FimHのC末端において、工学操作により作製されている。いくつかの態様において、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、レクチン結合ドメインおよびピリンドメインのような単離されたドメインを含む複合体の形態で発現させることができ、このようなドメインは、共有結合的または非共有結合的にひとつに連結していてもよい。例えば、いくつかの態様において、連結するセグメントは、アミノ酸配列または単独重合体構造を含む他のオリゴマー構造を含みうる。
本発明の方法および組成物は、E.coliに由来する前記ポリペプチドまたはその断片が同時発現する、または組み合わさった状態で形成される、本明細書に記載の複合体を含みうる。
C. レクチンドメイン、ピリンドメイン、およびそれらのバリアント
FimHのレクチンドメインの立体構造およびリガンド結合特性は、FimHのピリンドメインのアロステリック制御下にありうる。静止状態では、全長FimHの2つのドメインの相互作用が、浅い結合ポケットを特徴とする、モノマンノースに対する親和性が低い(例えば、Kd約300μMの)状態でレクチンドメインを安定化させる。マンノシドリガンドへの結合は、レクチンドメインおよびピリンドメインが近接した状態を保つ中親和性状態をもたらす立体構造変化を誘発しうる。しかしながら、せん断応力がかかると、レクチンドメインとピリンドメインは分離し、高親和性状態(例えば、Kd<1.2μM)を誘発しうる。
FimHのレクチンドメインの立体構造およびリガンド結合特性は、FimHのピリンドメインのアロステリック制御下にありうる。静止状態では、全長FimHの2つのドメインの相互作用が、浅い結合ポケットを特徴とする、モノマンノースに対する親和性が低い(例えば、Kd約300μMの)状態でレクチンドメインを安定化させる。マンノシドリガンドへの結合は、レクチンドメインおよびピリンドメインが近接した状態を保つ中親和性状態をもたらす立体構造変化を誘発しうる。しかしながら、せん断応力がかかると、レクチンドメインとピリンドメインは分離し、高親和性状態(例えば、Kd<1.2μM)を誘発しうる。
ピリンドメインが及ぼす負のアロステリック調節がないため、分離したFimHのレクチンドメインは、高親和性状態(例えば、Kd<1.2μM)にロックされる。分離した組換えレクチンドメインは、高親和性状態にロックされる。しかしながら、アドヘシンを親和性の低い立体構造(例えば、Kd約300μM)にロックすると、接着を阻害する抗体の生成が誘発される。したがって、低親和性状態でレクチンドメインを安定化させることに関心が寄せられている。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimHのレクチンドメインを含む。レクチンドメインの例示的な配列は、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号24、および配列番号26のいずれか1つを含む。いくつかの態様において、E.coli FimHのレクチンドメインは、システイン置換を含む。好ましい態様では、E.coli FimHのレクチンドメインは、レクチンドメインの最初の50個以内のアミノ酸残基にシステイン置換を含む。いくつかの態様において、レクチンドメインは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のシステイン置換を含みうる。好ましくは、レクチンドメインは、2つのシステイン置換を含む。例えば、pSB02158およびpSB02198を参照されたい。
E.coli FimHに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号3に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号3に示される配列に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有する、FimHレクチンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号3に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimHのピリンドメインを含む。E.coli FimHに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号7に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号7に示される配列に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有する、FimHピリンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号4に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。E.coli FimHに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号8に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号8に示される配列に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有する、FimHレクチンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号8に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimHのピリンドメインを含む。E.coli FimHに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号24に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号24に示される配列に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有する、FimHピリンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号24に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。E.coli FimHに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号26に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号26に示される配列に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有する、FimHレクチンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号26に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の同一性を有するポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、本組成物は、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号24、および配列番号26のいずれか1つにおける、少なくともn個の連続するアミノ酸(ここで、nは7以上(例えば8、10、12、14、16、18、20またはそれ以上)である)を有するポリペプチドを含む。好ましくは、断片は、配列のエピトープを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号24、および配列番号26のいずれか1つのアミノ酸配列のうち、少なくとも50個の連続するアミノ酸残基、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基、少なくとも125個の連続するアミノ酸残基、少なくとも150個の連続するアミノ酸残基、少なくとも175個の連続するアミノ酸残基、少なくとも200個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも250個の連続するアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。
E.coli FimHまたはその相同体もしくはバリアントのレクチンドメインの位置および長さは、その配列の、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号24、および配列番号26のいずれか1つに対するペアワイズアライメントに基づいて、例えば、FimHのアミノ酸配列を配列番号1にアラインし、配列番号1の残基22〜179にアラインする配列を同定することによって、予測されうる。
D. 野生型N末端シグナル配列
いくつかの態様において、全長FimHのN末端の野生型シグナル配列は、宿主細胞において切断されて、成熟FimHポリペプチドをもたらす。したがって、宿主細胞によって発現されるFimHは、N末端シグナル配列を欠く場合がある。好ましい態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、野生型のN末端シグナル配列のコード配列を欠くヌクレオチド配列によってコードされうる。
いくつかの態様において、全長FimHのN末端の野生型シグナル配列は、宿主細胞において切断されて、成熟FimHポリペプチドをもたらす。したがって、宿主細胞によって発現されるFimHは、N末端シグナル配列を欠く場合がある。好ましい態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、野生型のN末端シグナル配列のコード配列を欠くヌクレオチド配列によってコードされうる。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、FimHのFimH−FimC複合体形成断片、N末端シグナル配列(例えば、配列番号1の残基1〜21)、またはそれらの組み合わせを含む。FimHの複合体形成断片は、FimCと複合体を形成する能力を保持するFimHタンパク質の任意の一部分でありうる。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、シグナル配列、レクチンドメイン、およびピリンドメインを含みうる全長FimHポリペプチドのN末端および/またはC末端における、1〜21個のアミノ酸残基を欠く(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21個のアミノ酸残基、または1〜21個の残基、1〜20個の残基、1〜15個の残基、1〜10個の残基、2〜20個の残基、2〜15個の残基、2〜10個の残基、5〜20個の残基、5〜15個の残基、もしくは5〜10個の残基を欠く)場合がある。
II. 核酸
1つの側面において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする核酸が開示される。E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする1つまたは複数の核酸構築物が、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のゲノム組み込み、およびその後の発現のために使用されうる。例えば、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする単一の核酸構築物が、宿主細胞に導入されてもよい。あるいは、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のコード配列が2つ以上の核酸構築物に搭載され、次いでこれらが宿主細胞に同時または順次に導入されてもよい。
1つの側面において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする核酸が開示される。E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする1つまたは複数の核酸構築物が、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のゲノム組み込み、およびその後の発現のために使用されうる。例えば、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする単一の核酸構築物が、宿主細胞に導入されてもよい。あるいは、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のコード配列が2つ以上の核酸構築物に搭載され、次いでこれらが宿主細胞に同時または順次に導入されてもよい。
例えば、1つの例示的な態様では、単一の核酸構築物が、E.coli FimHのレクチンドメインおよびピリンドメインをコードする。別の例示的な態様では、1つの核酸構築物がE.coli FimHのレクチンドメインをコードし、第2の核酸構築物がピリンドメインをコードする。いくつかの態様において、ゲノム組み込みが達成される。
核酸構築物は、1つもしくは複数のイントロンを含むゲノムDNA、またはcDNAを含みうる。いくつかの遺伝子は、イントロンが存在する場合、より効率的に発現される。いくつかの態様において、核酸配列は、前記哺乳動物細胞における外来性ポリペプチドの発現に好適である。
いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸は、任意の特定の細胞における発現レベルを上昇させるようにコドン最適化されている。
いくつかの態様において、核酸構築物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の分泌を指示するペプチドをコードするシグナル配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、E.coli FimHに由来するポリペプチドの天然シグナル配列を含む。E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片が内在性シグナル配列を含むいくつかの態様では、シグナル配列をコードする核酸配列は、宿主細胞におけるタンパク質の発現レベルを上昇させるようにコドン最適化されていてもよい。
いくつかの態様において、核酸構築物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の分泌を指示するペプチドをコードするシグナル配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、E.coli FimHに由来するポリペプチドの天然シグナル配列を含む。E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片が内在性シグナル配列を含むいくつかの態様では、シグナル配列をコードする核酸配列は、宿主細胞におけるタンパク質の発現レベルを上昇させるようにコドン最適化されていてもよい。
いくつかの態様において、シグナル配列の長さは、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長、21アミノ酸長、22アミノ酸長、23アミノ酸長、24アミノ酸長、25アミノ酸長、26アミノ酸長、27アミノ酸長、28アミノ酸長、29アミノ酸長、および30アミノ酸長のうちのいずれか1つである。いくつかの態様において、シグナル配列は、20アミノ酸長である。いくつかの態様において、シグナル配列は、21アミノ酸長である。
ポリペプチドまたはその断片がシグナル配列を含むいくつかの態様では、培養細胞におけるポリペプチドまたはその断片の発現レベルが向上するように、ポリペプチドに自然に関連する内在性シグナル配列が、野生型ポリペプチドに関連しないシグナル配列で置換されていてもよい。したがって、いくつかの態様において、核酸は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の天然シグナル配列を含まない。いくつかの態様において、核酸は、E.coli FimHに由来するポリペプチドの天然シグナル配列を含まない。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、好ましくはシグナル配列、あるいはE.coliに由来する成熟タンパク質もしくはポリペプチドまたはそれらの断片のN末端に特異的な切断部位を有する他のペプチドである、異種ペプチドとともに発現されうる。例えば、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片は、好ましくはシグナル配列、または成熟E.coli FimHタンパク質のN末端に特異的な切断部位を有する他のペプチドである、異種ペプチド(例えば、IgKシグナル配列)とともに発現されうる。好ましい態様において、成熟タンパク質E.coli FimHのN末端の特異的な切断部位は、成熟E.coli FimHタンパク質の最初のフェニルアラニン残基の直前に生じる。選択される異種配列は、好ましくは、宿主細胞により認識およびプロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。
好ましい態様において、シグナル配列は、IgKシグナル配列である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号18のアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、核酸は、配列番号19のアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、核酸は、配列番号22のアミノ酸配列をコードする。好ましい態様において、シグナル配列は、マウスIgKシグナル配列である。
E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を生成するための好適な哺乳動物発現ベクターは当技術分野において公知であり、Invitrogen(商標)のpSecTag2発現ベクターのように、市販されているものもある。例示的なマウスIgカッパシグナルペプチド配列は、配列ETDTLLLWVLLLWVPGSTG(配列番号54)を含む。いくつかの態様において、ベクターは、Thermo FisherのpBudCE4.1哺乳動物発現ベクターを含む。さらなる例示的かつ好適なベクターとしては、pcDNA(商標)3.1哺乳動物発現ベクター(Thermo Fisher)が挙げられる。
いくつかの態様において、シグナル配列は、血球凝集素シグナル配列を含まない。
いくつかの態様において、核酸は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の天然シグナル配列を含む。いくつかの態様において、シグナル配列は、IgKシグナル配列ではない。いくつかの態様において、シグナル配列は、血球凝集素シグナル配列を含む。
いくつかの態様において、核酸は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の天然シグナル配列を含む。いくつかの態様において、シグナル配列は、IgKシグナル配列ではない。いくつかの態様において、シグナル配列は、血球凝集素シグナル配列を含む。
1つの側面において、本明細書では、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のコード配列を含むベクターが開示される。例示的なベクターには、自己複製できるか、または哺乳動物細胞において複製できるプラスミドが含まれる。典型的な発現ベクターは、発現構築物におけるコード配列の発現の調節に有用である好適なプロモーター、エンハンサー、およびターミネーターを含む。ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質をもたらす(例えば、アンピシリンまたはネオマイシンなどの抗生物質に対する耐性を与える)選択マーカーも含みうる。
好適なプロモーターは、当技術分野において公知である。例示的なプロモーターとしては、例えば、CMVプロモーター、アデノウイルス、EF1a、GAPDHメタロチオネインプロモーター、SV−40初期プロモーター、SV−40後期プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリへドリンプロモーターなどが挙げられる。プロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよい。1つまたは複数のベクター(例えば、すべてのサブユニットもしくはドメインもしくはそれらの断片をコードする1つのベクター、またはサブユニットもしくはドメインもしくはそれらの断片を一緒にコードする複数のベクター)が使用されうる。
内部リボソーム侵入部位(IRES)および2Aペプチド配列が使用されてもよい。IRESおよび2Aペプチドは、複数の配列の同時発現のための代替的なアプローチを提供する。IRESは、より大きなタンパク質合成のプロセスの一部として、メッセンジャーRNA(mRNA)配列の中間での翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。真核生物では通常、翻訳は、mRNA分子の5’末端でのみ開始されうる。IRESエレメントは、1つの転写物における複数の遺伝子の発現を可能にする。IRESに基づくポリシストロニックベクターは、1つの転写物から複数のタンパク質を発現し、非発現クローンが選択から逃れることを低減させうる。2Aペプチドは、単一のオープンリーディングフレームにおける複数のタンパク質のポリタンパク質への翻訳を可能にし、ポリタンパク質は、後にリボソームスキップ機構を介して個々のタンパク質に切断される。2Aペプチドは、複数のタンパク質産物の発現のバランスをさらに向上させうる。例示的なIRES配列は、例えば、EV71 IRES、EMCV IRES、HCV IRESを含む。ゲノム組み込みについては、組み込みは、部位特異的である場合もランダムである場合もある。部位特異的な組換えは、本明細書に記載の核酸構築物に相同配列を導入することによって達成されうる。かかる相同配列は、宿主ゲノムにおける特定の標的部位で内在性配列と実質的にマッチする。あるいは、ランダムな組み込みが使用されてもよい。場合により、タンパク質の発現レベルは、組み込み部位に応じて異なりうる。したがって、所望の発現レベルを達成するクローンを同定するために、組換えタンパク質の発現レベルに従ってクローン数を選択することが望ましい場合がある。
例示的な核酸構築物は、図2A〜2Tのいずれか1つのように、図においてさらに説明される。
1つの側面において、核酸配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、および配列番号29のいずれか1つに対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
1つの側面において、核酸配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、および配列番号29のいずれか1つに対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
III. 宿主細胞
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする配列が内部で発現される哺乳動物宿主細胞に関する。一態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、宿主細胞において一過性に発現される。別の態様では、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ、宿主細胞は、好適な条件下で培養されると、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を発現する。好ましい態様では、ポリヌクレオチド配列は、高い効率およびゲノム安定性で発現される。
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする配列が内部で発現される哺乳動物宿主細胞に関する。一態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、宿主細胞において一過性に発現される。別の態様では、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ、宿主細胞は、好適な条件下で培養されると、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を発現する。好ましい態様では、ポリヌクレオチド配列は、高い効率およびゲノム安定性で発現される。
好適な哺乳動物宿主細胞は、当技術分野において公知である。好ましくは、宿主細胞は、工業製造規模でタンパク質を生成するのに好適である。例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞(サル腎臓(アフリカミドリザル)由来の細胞株)、Vero細胞、Hela細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞、NS0細胞(マウス骨髄腫細胞株)、およびC127細胞(非腫瘍形成性マウス細胞株)、ならびにそれらの誘導体のうちのいずれか1つを含む。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、マウスセルトリ細胞(TM4)、バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A)、マウス乳癌細胞(MMT)、ラット肝細胞腫細胞(HTC)、マウス骨髄腫細胞(NS0)、マウスハイブリドーマ細胞(Sp2/0)、マウス胸腺腫細胞(EL4)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞およびCHO細胞誘導体、マウス胚細胞(NIH/3T3、3T3 Li)、ラット心筋細胞(H9c2)、マウス筋芽細胞(C2C12)、およびマウス腎臓細胞(miMCD−3)が挙げられる。哺乳動物細胞株のさらなる例としては、NS0/1、Sp2/0、Hep G2、PER.C6、COS−7、TM4、CV1、VERO−76、MDCK、BRL 3A、W138、MMT 060562、TR1、MRC5、およびFS4が挙げられる。
本発明によれば、細胞培養しやすい任意の細胞が利用されうる。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明によって使用されうる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、BALB/cマウス骨髄腫株(NS0/1、ECACC番号:85110503)、ヒト網膜芽細胞腫(PER.C6、CruCell、Leiden、The Netherlands)、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS−7、ATCC CRL 1651)、ヒト胎児由来腎臓細胞株(293細胞または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた293細胞、Grahamら、J.Gen Virol.、36:59、1977)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10)、チャイニーズハムスター卵巣細胞+/−DHFR(CHO、UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:4216、1980)、マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol.Reprod.、23:243〜251頁、1980)、サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76、ATCC CRL−1 587)、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa、ATCC CCL 2)、イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34)、バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)、ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)、ヒト肝臓細胞(Hep G2、HB 8065)、マウス乳癌(MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI細胞(Matherら、Annals N.Y.Acad.Sci.、383:44〜68頁、1982)、MRC 5細胞、FS4細胞、およびヒト肝細胞腫株(Hep G2)が挙げられる。ある好ましい態様において、細胞は、CHO細胞である。いくつかの好ましい態様において、細胞は、GS細胞である。
さらに、本発明によれば、任意の数の市販されているハイブリドーマ細胞株および市販されていないハイブリドーマ細胞株が利用されうる。本明細書で使用される「ハイブリドーマ」という用語は、不死化細胞と抗体産生細胞との融合から生じる細胞または細胞の子孫を意味する。このような結果として得られるハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマを作り出すために使用される個々の細胞は、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびヒトを含むがこれらに限定されない、任意の哺乳動物起源に由来しうる。いくつかの態様において、ハイブリドーマは、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株との融合産物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合物の子孫が、後に形質細胞と融合すると生じる、トリオーマ細胞株である。いくつかの態様において、ハイブリドーマは、例えば、クアドローマ(例えば、Milsteinら、Nature、537:3053、1983を参照されたい)のような、抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞株である。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が最適な増殖のために異なる栄養必要量を有する場合があり、かつ/または異なる培養条件を必要とする場合があることを理解し、必要に応じて条件を改変することができるであろう。
いくつかの態様において、細胞は、第1の目的の遺伝子を含み、第1の目的の遺伝子は、染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、第1の目的の遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、目的の遺伝子(例えば、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするもの)、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、治療上の目的の遺伝子は、発現困難な(DtE:difficult to express)タンパク質をコードする遺伝子を含む。
いくつかの態様において、第1の目的の遺伝子は、部位特異的組み込み(SSI)哺乳動物細胞における2つの異なる組換え標的部位(RTS)の間に位置し、これら2つのRTSは、NL1座位またはNL2座位で染色体に組み込まれている。NL1座位、NL2座位、NL3座位、NL4座位、NL5座位、およびNL6座位の説明については、例えば、米国特許出願公開第20200002727号を参照されたい。いくつかの態様において、第1の目的の遺伝子は、NL1座位に位置する。いくつかの態様において、細胞は、第2の目的の遺伝子を含み、第2の目的の遺伝子は、染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、第2の目的の遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療上の目的の遺伝子(例えば、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片)、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、治療上の目的の遺伝子は、DtEタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、第2の目的の遺伝子は、2つのRTSの間に位置する。いくつかの態様において、第2の目的の遺伝子は、NL1座位またはNL2座位に位置する。いくつかの態様において、第1の目的の遺伝子は、NL1座位に位置し、第2の目的の遺伝子は、NL2座位に位置する。いくつかの態様において、細胞は、第3の目的の遺伝子を含み、第3の目的の遺伝子は、染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、第3の目的の遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療上の目的の遺伝子(例えば、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片)、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、治療上の目的の遺伝子は、DtEタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、第3の目的の遺伝子は、2つのRTSの間に位置する。いくつかの態様において、第3の目的の遺伝子は、NL1座位またはNL2座位に位置する。いくつかの態様において、第3の目的の遺伝子は、NL1座位およびNL2座位とは異なる座位に位置する。いくつかの態様において、第1の目的の遺伝子、第2の目的の遺伝子、および第3の目的の遺伝子は、3つの別々の座位にある。いくつかの態様において、第1の目的の遺伝子、第2の目的の遺伝子、および第3の目的の遺伝子のうちの少なくとも1つは、NL1座位にあり、第1の目的の遺伝子、第2の目的の遺伝子、および第3の目的の遺伝子のうちの少なくとも1つは、NL2座位にある。いくつかの態様において、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの態様において、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれている。
いくつかの態様において、本開示は、少なくとも4つの異なるRTSを含む哺乳動物細胞であって、(a)NL1座位またはNL2座位で染色体に組み込まれている少なくとも2つの異なるRTSと、(b)(a)の少なくとも2つのRTSの間に位置し、レポーター遺伝子、DtEタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む、第1の目的の遺伝子と、(c)(a)の座位とは異なる第2の染色体座に組み込まれており、レポーター遺伝子、DtEタンパク質(例えば、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片)をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む、第2の目的の遺伝子とを含む細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示は、少なくとも4つの異なるRTSを含む哺乳動物細胞であって、(a)Fer1L4座位で染色体に組み込まれている少なくとも2つの異なるRTSと、(b)NL1座位またはNL2座位で染色体に組み込まれている少なくとも2つの異なるRTSと、(c)Fer1L4座位で染色体に組み込まれており、レポーター遺伝子、DtEタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む、第1の目的の遺伝子と、(d)(b)のNL1座位またはNL2座位で染色体に組み込まれており、レポーター遺伝子、DtEタンパク質(例えば、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片)をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む、第2の目的の遺伝子とを含む細胞を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、少なくとも6つの異なるRTSを含む哺乳動物細胞であって、(a)Fer1L4座位で染色体に組み込まれている少なくとも2つの異なるRTSおよび第1の目的の遺伝子と、(b)NL1座位で染色体に組み込まれている少なくとも2つの異なるRTSおよび第2の目的の遺伝子と、(c)NL2座位で染色体に組み込まれている少なくとも2つの異なるRTSおよび第3の目的の遺伝子とを含む細胞を提供する。
本明細書で言及される場合、「作動可能な組み合わせで」、「作動可能な順序で」、および「作動可能に連結した」という用語は、所与の遺伝子の転写および/または所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が生成されるような様式における核酸配列の連結を意味するものである。この用語は、機能的なタンパク質が生成されるような様式におけるアミノ酸配列の連結も意味する。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、目的の遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、目的の遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、補助遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、補助遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、補助遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、補助遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、DtEタンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、DtEタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、DtEタンパク質をコードする遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、DtEタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれていない。いくつかの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれていない。いくつかの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれていない。
本明細書で言及される場合、「染色体に組み込まれている」または「染色体への組み込み」という用語は、核酸配列が、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞の染色体に安定に組み込まれること、すなわち、核酸配列が、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞のゲノムDNA(gDNA)の染色体に組み込まれることを意味する。いくつかの態様において、染色体に組み込まれている核酸配列は、安定である。いくつかの態様において、染色体に組み込まれている核酸配列は、プラスミドまたはベクター上に位置しない。いくつかの態様において、染色体に組み込まれている核酸配列は、切除されない。いくつかの態様において、染色体への組み込みは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)およびCRISPR関連タンパク質(Cas)遺伝子編集系(CRISPR/CAS)によって媒介される。
いくつかの態様において、宿主細胞は、懸濁培養で増殖させるのに好適である。懸濁に適格な宿主細胞は通常、単分散である、または、実質的に凝集することなく、ゆるく凝集した状態で増殖する。懸濁に適格な宿主細胞としては、順応または操作することなく懸濁培養に好適な細胞(例えば、造血細胞、リンパ球系細胞)や、付着依存性細胞(例えば、上皮細胞、線維芽細胞)の改変または順応により懸濁に適格にされた細胞が挙げられる。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の発現レベルまたは活性は、例えばE.coli宿主細胞などの細菌細胞におけるE.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の発現と比較して、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも75倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍上昇する。
本明細書に記載の宿主細胞は、大規模培養に好適である。例えば、細胞培養物は、10L、30L、50L、100L、150L、200L、300L、500L、1000L、2000L、3000L、4000L、5000L、10,000L、またはそれ以上でありうる。いくつかの態様において、細胞培養物のサイズは、10L〜5000L、10L〜10,000L、10L〜20,000L、10L〜50,000L、40L〜50,000L、100L〜50,000L、500L〜50,000L、1000L〜50,000L、2000L〜50,000L、3000L〜50,000L、4000L〜50,000L、4500L〜50,000L、1000L〜10,000L、1000L〜20,000L、1000L〜25,000L、1000L〜30,000L、15L〜2000L、40L〜1000L、100L〜500L、200L〜400L、またはこれらの値の間の任意の整数でありうる。細胞培養のための培地成分は当技術分野において公知であり、例えば、バッファー、アミノ酸内容物、ビタミン内容物、塩内容物、ミネラル内容物、血清内容物、炭素源内容物、脂質内容物、核酸内容物、ホルモン内容物、微量元素内容物、アンモニア内容物、補因子内容物、指示薬内容物、小分子内容物、加水分解産物内容物、および酵素修飾因子内容物を含みうる。
本明細書で使用される「培地」、「細胞培養培地」、および「培養培地」という用語は、増殖する哺乳動物細胞に栄養を与える栄養素を含む溶液を意味する。通常、このような溶液は、細胞が最低限の増殖および/または生存に必要とする必須および非必須のアミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに微量元素を供給する。このような溶液はまた、増殖および/または生存を最低限の割合以上に増強する、ホルモンおよび/または他の増殖因子、特定のイオン(例えば、ナトリウム、塩素イオン、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸イオン)、バッファー、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素(通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物)、高い最終濃度で存在する無機化合物(例えば、鉄)、アミノ酸、脂質、および/またはグルコースもしくは他のエネルギー源を含むがこれらに限定されない補足的成分を含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、細胞の生存および増殖に最適なpHおよび塩濃度になるように有利に処方される。いくつかの態様において、培地は、細胞培養の開始後に添加されるフィード培地である。
いくつかの態様では、培地の成分が既知であり制御されている多様な化学合成培地のうちの1つにおいて、細胞を増殖させてもよい。いくつかの態様では、培地のすべての成分が既知であり、かつ/または制御されているわけではない複合培地において、細胞を増殖させてもよい。哺乳動物細胞培養のための化学合成増殖培地は、過去数十年間にわたって広く開発され、公開されている。合成培地の成分はすべて十分に特性評価されており、したがって合成培地は、血清または加水分解産物などの複合添加物を含まない。初期の培地処方は、細胞増殖、および生存能の維持を可能にするように開発され、タンパク質の生成への配慮はほとんどまたはまったく払われなかった。より近年の培地処方は、生産性の高い組換えタンパク質を産生する細胞培養を支えることを明確な目的として開発されている。このような培地が、本発明の方法で使用するのに好ましい。このような培地は、一般に、高密度での細胞の増殖および/または維持を支えるために、栄養素、特にアミノ酸を大量に含む。必要であれば、こうした培地は、当業者により、本発明の方法で使用するために改変されうる。例えば、当業者は、本明細書に開示される方法において基礎培地またはフィード培地として使用するために、こうした培地中のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、および/またはメチオニンの量を減少させてもよい。
複合培地のすべての成分が十分に特性評価されているわけではなく、したがって複合培地は、数ある中でもとりわけ、単純な炭素源および/または複雑な炭素源、単純な窒素源および/または複雑な窒素源、ならびに血清などの添加物を含んでもよい。いくつかの態様において、本発明に好適な複合培地は、本明細書に記載の合成培地の他の成分に加えて、加水分解産物などの添加物を含む。いくつかの態様において、合成培地は通常、およそ50の化学物質を既知の濃度で水中に含む。それらのほとんどはまた、インスリン、IGF−1、トランスフェリン、またはBSAなどの十分に特性評価されたタンパク質を1つまたは複数含むが、他のものはタンパク質成分を必要とせず、したがってタンパク質不含合成培地と呼ばれる。培地の典型的な化学成分は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、および適切に分類できないその他のカテゴリという、5つの広範なカテゴリに分けられる。
細胞培養培地には、任意選択で、補足的成分を補ってもよい。本明細書で使用される「補足的成分」という用語は、増殖および/または生存を最低限の割合以上に増強する、ホルモンおよび/または他の増殖因子、特定のイオン(例えば、ナトリウム、塩素イオン、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸イオン)、バッファー、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素(通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物)、アミノ酸、脂質、および/またはグルコースもしくは他のエネルギー源を含むがこれらに限定されない成分を意味する。いくつかの態様において、補足的成分は、最初の細胞培養物に添加されうる。いくつかの態様において、補足的成分は、細胞培養の開始後に添加されうる。通常、微量元素とは、マイクロモル以下のレベルで含まれる多様な無機塩を意味する。例えば、一般的に含まれる微量元素は、亜鉛、セレン、銅などである。いくつかの態様において、最初の細胞培養培地には、鉄(二価鉄または二価鉄塩)が微量元素としてマイクロモル濃度で含まれる場合がある。微量元素の中では、マンガンも二価カチオン(MnCl2またはMnSO4)としてナノモルからマイクロモルの濃度範囲で含まれることが多い。さほど一般的ではない数多くの微量元素が、通常はナノモル濃度で加えられる。
いくつかの態様において、本発明の方法で使用される培地は、細胞培養物中、例えば1×106細胞/mL、5×106細胞/mL、1×107細胞/mL、5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、または5×108細胞/mLなどの高い細胞密度を支えるのに好適な培地である。いくつかの態様において、細胞培養物は、哺乳動物細胞のフェドバッチ培養物、好ましくはCHO細胞のフェドバッチ培養物である。
いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、チロシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、トリプトファンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、メチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、ロイシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、セリンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、スレオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、グリシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの2種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニンおよびトリプトファンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニンおよびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、チロシンおよびトリプトファンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、チロシンおよびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、トリプトファンおよびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの3種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、およびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、チロシン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの4種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの5種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの6種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの7種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM未満、1mM未満、0.1〜2mM、0.1〜1mM、0.5〜1.5mM、または0.5〜1mMの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM、好ましくは2mMを超える濃度で、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンのうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13種をさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM、好ましくは2mMを超える濃度で、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンのうちの少なくとも5種をさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM、好ましくは2mMを超える濃度で、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンをさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM、好ましくは2mMを超える濃度で、バリン、イソロイシン、プロリン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンのうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、または9種をさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM、好ましくは2mMを超える濃度で、バリン、イソロイシン、プロリン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンのうちの少なくとも5種をさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM、好ましくは2mMを超える濃度で、バリン、イソロイシン、プロリン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンをさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、3mM、5mM、7mM、10mM、15mM、または20mM、好ましくは10mMを超える濃度で、セリンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、3mM、5mM、7mM、10mM、15mM、または20mM、好ましくは10mMを超える濃度で、バリンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、3mM、5mM、7mM、10mM、15mM、または20mM、好ましくは10mMを超える濃度で、システインを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、3mM、5mM、7mM、10mM、15mM、または20mM、好ましくは10mMを超える濃度で、イソロイシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、3mM、5mM、7mM、10mM、15mM、または20mM、好ましくは10mMを超える濃度で、ロイシンを含む。いくつかの態様において、上記の細胞培養培地は、本明細書に開示される方法で使用するためのものである。いくつかの態様において、上記の細胞培養培地は、本明細書に開示される方法で基礎培地として使用される。いくつかの態様において、上記の細胞培養培地は、本明細書に開示される方法でフィード培地として使用される。
IV. 生成方法
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を生成する方法を含む。本方法は、哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を発現させるステップを含む。本方法は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を培養物から回収するステップをさらに含みうる。本方法は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含んでもよい。
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を生成する方法を含む。本方法は、哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を発現させるステップを含む。本方法は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を培養物から回収するステップをさらに含みうる。本方法は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、本方法は、ポリペプチドまたはその断片を、0.1g/L〜0.5g/Lの収量で生成する。
いくつかの態様では、細胞を、バッチ培養またはフェドバッチ培養で増殖させてもよく、この培養法では、ポリペプチドが十分に発現した後に培養が終了され、その後、発現されたポリペプチドが回収され、任意選択で精製される。いくつかの態様では、細胞を、灌流培養で増殖させてもよく、この培養法では、培養が終了されず、新しい栄養素および他の成分が培養物に定期的または連続的に添加され、この間、発現されたポリペプチドが定期的または連続的に回収される。
いくつかの態様では、細胞を、バッチ培養またはフェドバッチ培養で増殖させてもよく、この培養法では、ポリペプチドが十分に発現した後に培養が終了され、その後、発現されたポリペプチドが回収され、任意選択で精製される。いくつかの態様では、細胞を、灌流培養で増殖させてもよく、この培養法では、培養が終了されず、新しい栄養素および他の成分が培養物に定期的または連続的に添加され、この間、発現されたポリペプチドが定期的または連続的に回収される。
いくつかの態様では、容積の範囲が数ミリリットルから数リットルである小規模反応容器において、細胞を増殖させてもよい。いくつかの態様では、容積の範囲が少なくとも約1リットルから10、100、250、500、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000リットル、もしくはそれ以上、またはこれらの値の間の任意の容積である大規模な商業的バイオリアクターにおいて、細胞を増殖させてもよい。
細胞培養物の温度は、主に、細胞培養物が生存可能な状態を保ち、高レベルのポリペプチドが生成される温度範囲、代謝廃棄物の産生もしくは蓄積が最小限に抑えられる温度範囲、および/またはこれらの要因もしくは実践者が重要とみなす他の要因の任意の組み合わせに基づいて選択される。非限定的な一例として、CHO細胞は、およそ37℃で良好に増殖し、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生する。一般に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約25℃〜42℃の範囲内で良好に増殖し、かつ/または高レベルのタンパク質もしくはポリペプチドを産生することができるが、本開示によって教示される方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の哺乳動物細胞は、約35℃〜40℃の範囲内で良好に増殖し、かつ/または高レベルのタンパク質もしくはポリペプチドを産生することができる。ある特定の態様において、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、または45℃の温度で、細胞培養プロセス中に1回または複数回、細胞培養物を増殖させる。
本明細書で使用される「培養物」および「細胞培養物」という用語は、細胞集団の生存および/または増殖に好適な条件下で培地に懸濁される細胞集団を意味する。当業者には明らかになるであろうが、いくつかの態様において、本明細書で使用されるこれらの用語は、細胞集団およびこの集団が懸濁された培地を含む組み合わせを意味する。いくつかの態様において、細胞培養物の細胞は、哺乳動物細胞を含む。
本発明は、所望のプロセス(例えば、組換えタンパク質(例えば、抗体)の生成)に適した任意の細胞培養法で使用されうる。非限定的な例として、細胞を、バッチ培養またはフェドバッチ培養で増殖させてもよく、この培養法では、組換えタンパク質(例えば、抗体)が十分に発現した後に培養が終了され、その後、発現されたタンパク質(例えば、抗体)が回収される。あるいは、別の非限定的な例として、細胞を、バッチリフィードで増殖させてもよく、この培養法では、培養が終了されず、新しい栄養素および他の成分が培養物に定期的または連続的に添加され、この間、発現された組換えタンパク質(例えば、抗体)が定期的または連続的に回収される。他の好適な方法(例えば、スピンチューブ培養)が当技術分野において公知であり、本発明を実践するために使用されうる。
いくつかの態様において、本発明に好適な細胞培養は、フェドバッチ培養である。本明細書で使用される「フェドバッチ培養」という用語は、培養プロセス開始後に追加の成分が1回または複数回で培養物に供給される細胞培養の方法を意味する。このような供給される成分は、通常、培養プロセス中に枯渇した細胞のための栄養成分を含む。フェドバッチ培養は通常、ある時点で停止され、培地中の細胞および/または成分が回収され、任意選択で精製される。いくつかの態様において、フェドバッチ培養物は、フィード培地が補われた基礎培地を含む。
細胞は、実践者によって選択された任意の簡便な量で増殖させてよい。例えば、容積の範囲が数ミリリットルから数リットルである小規模反応容器において、細胞を増殖させてもよい。あるいは、容積の範囲が少なくとも約1リットルから10、50、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000、15000、20000、もしくは25000リットル、もしくはそれ以上、またはこれらの値の間の任意の容積である大規模な商業的バイオリアクターにおいて、細胞を増殖させてもよい。
細胞培養物の温度は、主に、細胞培養物が生存可能な状態を保つ温度範囲、および高レベルの所望の産物(例えば、組換えタンパク質)が生成される範囲に基づいて選択される。一般に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約25℃〜42℃の範囲内で良好に増殖し、所望の産物(例えば、組換えタンパク質)を産生することができるが、本開示によって教示される方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の哺乳動物細胞は、約35℃〜40℃の範囲内で良好に増殖し、所望の産物(例えば、組換えタンパク質または抗体)を産生することができる。ある特定の態様では、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、または45℃の温度で、細胞培養プロセス中に1回または複数回、細胞培養物を増殖させる。当業者は、細胞の特定の必要性および実践者による特定の生成要件に応じて、細胞を増殖させるのに適切な1つまたは複数の温度を選択することができるであろう。実践者の要求および細胞自体の要件に応じて、任意の時間にわたって細胞を増殖させてもよい。ある態様では、細胞を37℃で増殖させる。いくつかの態様では、細胞を36.5℃で増殖させる。
いくつかの態様では、実践者の要求および細胞自体の要件に応じて、初期増殖段階(または増殖段階)中に、より長い時間、またはより短い時間にわたり、細胞を増殖させてもよい。いくつかの態様では、予め定義された細胞密度を達成するのに十分な時間にわたり、細胞を増殖させる。いくつかの態様では、細胞を妨害せずに増殖させた場合に細胞が最終的に達するであろう最大細胞密度の所与の百分率である細胞密度を達成するのに十分な時間にわたり、細胞を増殖させる。例えば、所望の生細胞密度が最大細胞密度の1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または99パーセントを達成するのに十分な時間にわたり、細胞を増殖させてもよい。いくつかの態様では、細胞密度が培養1日当たり15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%よりも多く増大しない時点まで、細胞を増殖させる。いくつかの態様では、細胞密度が培養1日当たり5%よりも多く増大しない時点まで、細胞を増殖させる。
ある態様では、所定の時間にわたって細胞を増殖させる。例えば、細胞培養の出発濃度、細胞を増殖させる温度、および細胞の固有の増殖速度に応じて、0日、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、またはそれ以上、好ましくは4〜10日にわたり、細胞を増殖させてもよい。場合によっては、1か月以上にわたって細胞を増殖させてもよい。本発明の実践者は、タンパク質の生成要件および細胞自体の必要性に応じて、初期増殖段階の期間を選択することができるであろう。
細胞培養物は、細胞への酸素負荷および栄養素の分配を増大させるために、初期培養段階中に撹拌または振とうされる場合がある。本発明によれば、pH、温度、酸素負荷などを含むがこれらに限定されない、初期増殖段階中のバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することが有益でありうることを、当業者は理解するであろう。
初期増殖段階の終わりには、第2のセットの培養条件が適用され、培養物に代謝的変化が生じるように、培養条件のうちの少なくとも1つが変更される場合がある。代謝的変化は、例えば、細胞培養物の温度、pH、浸透圧、または化学誘発物質レベルの変化によって達成されうる。非限定的な一態様において、培養条件は、培養物の温度を変更することによって変更される。しかしながら、当技術分野において公知であるように、温度の変更は、適切な代謝的変化を達成することができる唯一の機構ではない。例えば、このような代謝的変化は、pH、浸透圧、および酪酸ナトリウムのレベルを含むがこれらに限定されない他の培養条件を変更することによっても達成されうる。培養物を変化させるタイミングは、本発明の実践者により、タンパク質の生成要件または細胞自体の必要性に基づいて決定される。
培養物の温度を変更する場合、温度の変更は、比較的緩やかであってもよい。例えば、温度の変更を完了するのに数時間または数日間かかってもよい。あるいは、温度の変更は、比較的急激であってもよい。例えば、温度の変化は、数時間以内に完了してもよい。ポリペプチドまたはタンパク質の商業的な大規模生産において標準的であるもののような、適切な生成および制御の設備を用いれば、温度の変化は、1時間以内に完了する場合さえある。
いくつかの態様において、細胞培養の条件が上述のように変更されたら、細胞培養物は、細胞培養物の生存および生存能に資する、かつ商業的に妥当なレベルでの所望のポリペプチドまたはタンパク質の発現に適切な、第2のセットの培養条件下での、後続の生産段階のために維持される。
上述のように、温度、pH、浸透圧、および酪酸ナトリウムのレベルを含むがこれらに限定されない、いくつかの培養条件のうちの1つまたは複数を変更することによって、培養物を変化させてもよい。いくつかの態様において、培養物の温度が変更される。この態様によれば、後続の生産段階において、培養物は、初期増殖段階の温度または温度範囲よりも低い温度または温度範囲で維持される。上述のように、細胞密度もしくは生存能を増大させるか、または組換えタンパク質の発現を増大させるために、複数の異なる温度変化が用いられうる。
いくつかの態様において、所望の細胞密度または生産力価に達するまで、後続の生産段階で細胞を維持してもよい。本発明の別の態様では、後続の生産段階中の所定の期間にわたり、細胞を増殖させる。例えば、後続の増殖段階の開始時の細胞培養物の濃度、細胞を増殖させる温度、および細胞の固有の増殖速度に応じて、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、またはそれ以上にわたり、細胞を増殖させてもよい。場合によっては、1か月以上にわたって細胞を増殖させてもよい。本発明の実践者は、ポリペプチドまたはタンパク質の生成要件および細胞自体の必要性に応じて、後続の生産段階の期間を選択することができるであろう。
細胞培養物は、細胞への酸素負荷および栄養素の分配を増大させるために、後続の生産段階中に撹拌または振とうされる場合がある。本発明によれば、pH、温度、酸素負荷などを含むがこれらに限定されない、後続の増殖段階中のバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することが有益でありうることを、当業者は理解するであろう。
いくつかの態様において、細胞は、組換えタンパク質を発現し、本発明の細胞培養法は、増殖段階および生産段階を含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法のいずれかのステップ(ii)は、細胞培養法の全体において適用される。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法のいずれかのステップ(ii)は、細胞培養法の一部において適用される。いくつかの態様において、ステップ(ii)は、既定の生細胞密度が得られるまで適用される。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法のいずれかのステップ(ii)は、細胞培養法の全体において適用される。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法のいずれかのステップ(ii)は、細胞培養法の一部において適用される。いくつかの態様において、ステップ(ii)は、既定の生細胞密度が得られるまで適用される。
いくつかの態様において、本発明の細胞培養法は、増殖段階および生産段階を含み、ステップ(ii)は、増殖段階において適用される。いくつかの態様において、本発明の細胞培養法は、増殖段階および生産段階を含み、ステップ(ii)は、増殖段階の一部において適用される。いくつかの態様において、本発明の細胞培養法は、増殖段階および生産段階を含み、ステップ(ii)は、増殖段階および生産段階において適用される。
本明細書に開示される方法のいずれかのステップ(ii)において、「維持する」という用語は、培養プロセス全体にわたり(回収まで)、または、例えば増殖段階、増殖段階の一部、もしくは既定の細胞密度が得られるまでのように、培養プロセスの一部にわたり、アミノ酸または代謝物の濃度をC1またはC2未満に維持することを意味しうる。
上述の方法のいずれかのいくつかの態様において、細胞の増殖および/または生産性は、対照培養と比較して増大し、前記対照培養は、ステップ(ii)を含まない点を除いては同一である。
上述の方法のいずれかのいくつかの態様において、本発明の方法は、細胞増殖を向上させる方法である。ある態様では、本発明の方法は、高密度細胞培養における高い細胞密度での細胞増殖を向上させる方法である。
本明細書で使用される高い細胞密度とは、1×106細胞/mL、5×106細胞/mL、1×107細胞/mL、5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、または5×108細胞/mL超、好ましくは1×107細胞/mL超、より好ましくは5×107細胞/mL超の細胞密度を意味する。
いくつかの態様において、本発明の方法は、細胞密度が1×106細胞/mL、5×106細胞/mL、1×107細胞/mL、5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、または5×108細胞/mL超である細胞培養における細胞増殖を向上させる方法である。いくつかの態様において、本発明の方法は、最大細胞密度が1×106細胞/mL、5×106細胞/mL、1×107細胞/mL、5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、または5×108細胞/mL超である細胞培養における細胞増殖を向上させる方法である。
いくつかの態様において、細胞増殖は、生細胞密度(VCD)、最大生細胞密度、または積算生細胞数(IVCC)によって決定される。いくつかの態様において、細胞増殖は、最大生細胞密度によって決定される。
本明細書で使用される「生細胞密度」という用語は、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を意味する。生細胞密度は、当業者に公知の任意の方法によって測定されうる。好ましくは、生細胞密度は、Bioprofile Flex(登録商標)などの自動細胞計数器を使用して測定される。本明細書で使用される最大細胞密度という用語は、細胞培養中に達成される最大細胞密度を意味する。本明細書で使用される「細胞生存能」という用語は、所与のセットの培養条件または実験変動下で生存する培養下の細胞の能力を意味する。当業者は、細胞生存能を決定する多くの方法のうちの1つが本発明に包含されることを理解するであろう。例えば、細胞生存能を決定するためには、生きている細胞の膜を通過することはないが、死んだ細胞または死にかけの細胞の破壊された膜を通過することはできる色素(例えば、トリパンブルー)を使用してもよい。
本明細書で使用される「積算生細胞数(IVCC)」という用語は、生細胞密度(VCD)曲線下面積を意味する。IVCCは、次式:IVCCt+1=IVCCt+(VCDt+VCDt+1)*(Δt)/2を使用して計算されうる。式中、Δtは、t時点とt+1時点との間の時間差である。IVCCt=0は、無視可能とみなされうる。VCDtおよびVCDt+1は、t時点およびt+1時点における生細胞密度である。
本明細書で使用される「力価」という用語は、例えば、所定量の培地量における細胞培養によって生成される組換え発現タンパク質の総量を意味する。力価は、通常、培地1リットル当たりのタンパク質のグラム単位で表現される。
いくつかの態様において、細胞増殖は、対照培養と比較して少なくとも5%、10%、15%、20%、または25%増大する。いくつかの態様において、細胞増殖は、対照培養と比較して少なくとも10%増大する。いくつかの態様において、細胞増殖は、対照培養と比較して少なくとも20%増大する。
いくつかの態様において、生産性は、力価および/または容量生産性によって決定される。
本明細書で使用される「力価」という用語は、例えば、所定量の培地量における細胞培養によって生成される組換え発現タンパク質の総量を意味する。力価は、通常、培地1リットル当たりのタンパク質のグラム単位で表現される。
本明細書で使用される「力価」という用語は、例えば、所定量の培地量における細胞培養によって生成される組換え発現タンパク質の総量を意味する。力価は、通常、培地1リットル当たりのタンパク質のグラム単位で表現される。
いくつかの態様において、生産性は、力価によって決定される。いくつかの態様において、生産性は、対照培養と比較して少なくとも5%、10%、15%、20%、または25%増大する。いくつかの態様において、生産性は、対照培養と比較して少なくとも10%増大する。いくつかの態様において、生産性は、対照培養と比較して少なくとも20%増大する。
いくつかの態様において、細胞培養物の最大細胞密度は、1×106細胞/mL、5×106細胞/mL、1×107細胞/mL、5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、または5×108細胞/mL超である。いくつかの態様において、細胞培養物の最大細胞密度は、5×106細胞/mL超である。いくつかの態様において、細胞培養物の最大細胞密度は、1×108細胞/mL超である。
V. 精製
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を生成する方法は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を単離および/または精製するステップを含む。いくつかの態様において、発現されたE.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、培地中に分泌され、したがって、細胞および他の固体は、遠心分離および/または濾過によって除去されうる。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を生成する方法は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を単離および/または精製するステップを含む。いくつかの態様において、発現されたE.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、培地中に分泌され、したがって、細胞および他の固体は、遠心分離および/または濾過によって除去されうる。
本明細書に記載の方法に従って生成される、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、任意の好適な方法を使用して、宿主細胞から回収され、精製されうる。ポリペプチドまたはその断片を精製する好適な方法は、沈殿、ならびに疎水性相互作用、イオン交換、アフィニティ、キレート化、およびサイズ排除のような様々なタイプのクロマトグラフィを含み、これらはすべて、当技術分野において公知である。好適な精製スキームは、これらまたは他の好適な方法のうちの2つ以上を含みうる。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のうちの1つまたは複数は、エピトープタグまたはHISタグ、Strepタグのような、精製を容易にする「タグ」を含みうる。このようなタグ付きポリペプチドは、例えば馴化培地から、キレートクロマトグラフィまたはアフィニティクロマトグラフィによって簡便に精製されうる。任意選択で、タグ配列は、精製後に切断されてもよい。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、アフィニティ精製のためのタグを含んでもよい。アフィニティ精製タグは、当技術分野において公知である。例としては、例えば、Hisタグ(金属イオンに結合する)、抗体、マルトース結合タンパク質(MBP)(アミロースに結合する)、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)(グルタチオンに結合する)、FLAGタグ、Strepタグ(ストレプトアビジンまたはその誘導体に結合する)が挙げられる。
好ましい態様では、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片は、精製タグを含まない。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の収量は、少なくとも約1mg/L、少なくとも約2mg/L、少なくとも約3mg/L、少なくとも約4mg/L、少なくとも約5mg/L、少なくとも約6mg/L、少なくとも約7mg/L、少なくとも約8mg/L、少なくとも約9mg/L、少なくとも約10mg/L、少なくとも約11mg/L、少なくとも約12mg/L、少なくとも約13mg/L、少なくとも約14mg/L、少なくとも約15mg/L、少なくとも約16mg/L、少なくとも約17mg/L、少なくとも約18mg/L、少なくとも約19mg/L、少なくとも約20mg/L、少なくとも約25mg/L、少なくとも約30mg/L、少なくとも約35mg/L、少なくとも約40mg/L、少なくとも約45mg/L、少なくとも約50mg/L、少なくとも約55mg/L、少なくとも約60mg/L、少なくとも約65mg/L、少なくとも約70mg/L、少なくとも約75mg/L、少なくとも約80mg/L、少なくとも約85mg/L、少なくとも約90mg/L、少なくとも約95mg/L、または少なくとも約100mg/Lである。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の収量は、少なくとも約1mg/L、少なくとも約2mg/L、少なくとも約3mg/L、少なくとも約4mg/L、少なくとも約5mg/L、少なくとも約6mg/L、少なくとも約7mg/L、少なくとも約8mg/L、少なくとも約9mg/L、少なくとも約10mg/L、少なくとも約11mg/L、少なくとも約12mg/L、少なくとも約13mg/L、少なくとも約14mg/L、少なくとも約15mg/L、少なくとも約16mg/L、少なくとも約17mg/L、少なくとも約18mg/L、少なくとも約19mg/L、少なくとも約20mg/L、少なくとも約25mg/L、少なくとも約30mg/L、少なくとも約35mg/L、少なくとも約40mg/L、少なくとも約45mg/L、少なくとも約50mg/L、少なくとも約55mg/L、少なくとも約60mg/L、少なくとも約65mg/L、少なくとも約70mg/L、少なくとも約75mg/L、少なくとも約80mg/L、少なくとも約85mg/L、少なくとも約90mg/L、少なくとも約95mg/L、または少なくとも約100mg/Lである。
いくつかの態様において、培養物は、少なくとも約10リットルのサイズ、例えば、少なくとも約10L、少なくとも約20L、少なくとも約30L、少なくとも約40L、少なくとも約50L、少なくとも約60L、少なくとも約70L、少なくとも約80L、少なくとも約90L、少なくとも約100L、少なくとも約150L、少なくとも約200L、少なくとも約250L、少なくとも約300L、少なくとも約400L、少なくとも約500L、少なくとも約600L、少なくとも約700L、少なくとも約800L、少なくとも約900L、少なくとも約1000L、少なくとも約2000L、少なくとも約3000L、少なくとも約4000L、少なくとも約5000L、少なくとも約6000L、少なくとも約10,000L、少なくとも約15,000L、少なくとも約20,000L、少なくとも約25,000L、少なくとも約30,000L、少なくとも約35,000L、少なくとも約40,000L、少なくとも約45,000L、少なくとも約50,000L、少なくとも約55,000L、少なくとも約60,000L、少なくとも約65,000L、少なくとも約70,000L、少なくとも約75,000L、少なくとも約80,000L、少なくとも約85,000L、少なくとも約90,000L、少なくとも約95,000L、少なくとも約100,000Lなどの体積である。
VI. 組成物および処方
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を含む組成物を含む。いくつかの態様において、本組成物は、E.coliの病原性種に対する免疫を与えうる抗体を含む免疫応答を生じさせる。
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を含む組成物を含む。いくつかの態様において、本組成物は、E.coliの病原性種に対する免疫を与えうる抗体を含む免疫応答を生じさせる。
いくつかの態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を唯一の抗原として含む。いくつかの態様において、本組成物は、コンジュゲートを含まない。
いくつかの態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片、および追加の抗原を含む。いくつかの態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片、および追加のE.coli抗原を含む。いくつかの態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片、およびE.coli由来のグリココンジュゲートを含む。
いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、E.coli FimHに由来する。
いくつかの態様において、本組成物は、E.coli FimCに由来するポリペプチドまたはその断片を含む。
いくつかの態様において、本組成物は、E.coli FimCに由来するポリペプチドまたはその断片を含む。
いくつかの態様において、本組成物は、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、E.coli FimCに由来するポリペプチドまたはその断片とを含む。
1つの側面において、本発明は、E.coli FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、式O1(例えば、式O1A、式O1B、および式O1C)、式O2、式O3、式O4(例えば、式O4:K52および式O4:K6)、式O5(例えば、式O5abおよび式O5ac(株180/C3))、式O6(例えば、式O6:K2;K13;K15および式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例えば、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、および式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例えば、式O23A)、式O24、式O25(例えば、式O25aおよび式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例えば、式O45および式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例えば、式O73(株73−1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187(式中、nは、1〜100の整数である)のいずれか1つから選択される構造を含む糖類とを含む組成物を含む。
いくつかの態様において、本組成物は、本明細書に開示される糖類のいずれか1つを含む。好ましい態様において、本組成物は、本明細書に開示されるコンジュゲートのいずれか1つを含む。
いくつかの態様において、本組成物は、E.coli血清型O25、好ましくは血清型O25bのグリココンジュゲートを少なくとも1つ含む。一態様において、本組成物は、E.coli血清型O1、好ましくは血清型O1aのグリココンジュゲートを少なくとも1つ含む。一態様において、本組成物は、E.coli血清型O2のグリココンジュゲートを少なくとも1つ含む。一態様において、本組成物は、E.coli血清型O6のグリココンジュゲートを少なくとも1つ含む。
一態様において、本組成物は、E.coli血清型O25、O1、O2、およびO6、好ましくはO25b、O1a、O2、およびO6のいずれか1つから選択されるグリココンジュゲートを少なくとも1つ含む。一態様において、本組成物は、E.coli血清型O25、O1、O2、およびO6、好ましくはO25b、O1a、O2、およびO6のいずれか1つから選択されるグリココンジュゲートを少なくとも2つ含む。一態様において、本組成物は、E.coli血清型O25、O1、O2、およびO6、好ましくはO25b、O1a、O2、およびO6のいずれか1つから選択されるグリココンジュゲートを少なくとも3つ含む。一態様において、本組成物は、O25、O1、O2、およびO6、好ましくはO25b、O1a、O2、およびO6の各E.coli血清型のグリココンジュゲートを含む。
好ましい態様では、上記の組成物のいずれかのグリココンジュゲートは、それぞれ、CRM197にコンジュゲートされている。
したがって、いくつかの態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、少なくとも1種のE.coli血清型のO抗原とを含む。好ましい態様では、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、2種以上のE.coli血清型のO抗原とを含む。例えば、本組成物は、2種の異なるE.coli血清型(または価数(valences)の「v」)から12種の異なる血清型(12v)のO抗原を含みうる。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、3種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、4種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、5種の異なるE.coli血清型のO抗原を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、6種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、7種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、8種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、9種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、10種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、11種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、12種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、13種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、14種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、15種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、16種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、17種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、18種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、19種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、20種の異なる血清型のO抗原とを含む。
したがって、いくつかの態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、少なくとも1種のE.coli血清型のO抗原とを含む。好ましい態様では、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、2種以上のE.coli血清型のO抗原とを含む。例えば、本組成物は、2種の異なるE.coli血清型(または価数(valences)の「v」)から12種の異なる血清型(12v)のO抗原を含みうる。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、3種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、4種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、5種の異なるE.coli血清型のO抗原を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、6種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、7種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、8種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、9種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、10種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、11種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、12種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、13種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、14種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、15種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、16種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、17種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、18種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、19種の異なる血清型のO抗原とを含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、20種の異なる血清型のO抗原とを含む。
好ましくは、E.coli糖類の数は、1種の血清型(または価数の「v」)から26種の異なる血清型(26v)の範囲でありうる。一態様では、1種の血清型が存在する。一態様では、2種の異なる血清型が存在する。一態様では、3種の異なる血清型が存在する。一態様では、4種の異なる血清型が存在する。一態様では、5種の異なる血清型が存在する。一態様では、6種の異なる血清型が存在する。一態様では、7種の異なる血清型が存在する。一態様では、8種の異なる血清型が存在する。一態様では、9種の異なる血清型が存在する。一態様では、10種の異なる血清型が存在する。一態様では、11種の異なる血清型が存在する。一態様では、12種の異なる血清型が存在する。一態様では、13種の異なる血清型が存在する。一態様では、14種の異なる血清型が存在する。一態様では、15種の異なる血清型が存在する。一態様では、16種の異なる血清型が存在する。一態様では、17種の異なる血清型が存在する。一態様では、18種の異なる血清型が存在する。一態様では、19種の異なる血清型が存在する。一態様では、20種の異なる血清型が存在する。一態様では、21種の異なる血清型が存在する。一態様では、22種の異なる血清型が存在する。一態様では、23種の異なる血清型が存在する。一態様では、24種の異なる血清型が存在する。ある態様では、25種の異なる血清型が存在する。一態様では、26種の異なる血清型が存在する。糖類は、担体タンパク質にコンジュゲートされて、本明細書に記載のグリココンジュゲートを形成する。
1つの側面において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、少なくとも1種のE.coli血清群のO抗原を含むグリココンジュゲートとを含み、このO抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、2種以上のE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、2種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、3種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、4種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、5種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、6種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、7種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、8種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、9種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、10種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、11種の異なるE.coli血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、12種の異なる血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、13種の異なる血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、14種の異なる血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、15種の異なる血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、16種の異なる血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、17種の異なる血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、18種の異なる血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、19種の異なる血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、20種の異なる血清型のO抗原とを含み、各O抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。
別の側面では、本組成物は、少なくとも1種のE.coli血清型のO多糖を含む。好ましい態様では、本組成物は、2種以上のE.coli血清型のO多糖を含む。例えば、本組成物は、2種の異なるE.coli血清型から12種の異なるE.coli血清型のO多糖を含みうる。一態様において、本組成物は、3種の異なるE.coli血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、4種の異なるE.coli血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、5種の異なるE.coli血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、6種の異なるE.coli血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、7種の異なるE.coli血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、8種の異なるE.coli血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、9種の異なるE.coli血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、10種の異なるE.coli血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、11種の異なるE.coli血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、12種の異なる血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、13種の異なる血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、14種の異なる血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、15種の異なる血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、16種の異なる血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、17種の異なる血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、18種の異なる血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、19種の異なる血清型のO多糖を含む。一態様において、本組成物は、20種の異なる血清型のO多糖を含む。
好ましい態様では、本組成物は、少なくとも1種のE.coli血清型のO多糖を含み、このO多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましい態様では、本組成物は、2種以上のE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。例えば、本組成物は、2種の異なるE.coli血清型から12種の異なるE.coli血清型のO多糖を含んでもよく、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、3種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、4種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、5種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、6種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、7種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、8種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、9種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、10種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、11種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、12種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、13種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、14種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、15種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、16種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、17種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、18種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、19種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、20種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。
最も好ましい態様では、本組成物は、少なくとも1種のE.coli血清型のO多糖を含み、このO多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。好ましい態様では、本組成物は、2種以上のE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。例えば、本組成物は、2種の異なるE.coli血清型から12種の異なるE.coli血清型のO多糖を含んでもよく、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、3種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、4種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、5種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、6種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、7種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、8種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、9種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、10種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、11種の異なるE.coli血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、12種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、13種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、14種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、15種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、16種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、17種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、18種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、19種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、20種の異なる血清型のO多糖を含み、各O多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。好ましい態様では、担体タンパク質は、CRM197である。
別の好ましい態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、CRM197にコンジュゲートされたO多糖とを含み、このO多糖は、式O25a(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。好ましい態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O25b(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O1a(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O2(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O6(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。
別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O17(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O15(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O18A(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O75(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O4(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O16(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O13(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O7(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。
別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O8(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、O多糖は、式O8(式中、nは、1〜20、好ましくは2〜5、より好ましくは3である)を含む。式O8は、例えば、図10Bに示される。別の態様では、本組成物は、CRM197にコンジュゲートされたO多糖をさらに含み、このO多糖は、式O9(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含む。別の態様では、O多糖は、式O9(式中、nは、1〜20、好ましくは4〜8、より好ましくは5である)を含む。式O9は、例えば、図10Bに示される。別の態様では、O多糖は、式O9a(式中、nは、1〜20、好ましくは4〜8、より好ましくは5である)を含む。式O9aは、例えば、図10Bに示される。
いくつかの態様において、O多糖は、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97、および式O101(式中、nは、1〜20、好ましくは4〜8、より好ましくは5である)のいずれか1つから選択される構造を含む。例えば、図10Bを参照されたい。
上述のように、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、コンジュゲートされたO多糖(抗原)の任意の組み合わせとを含みうる。1つの例示的な態様では、本組成物は、式O25bを含む多糖、式O1Aを含む多糖、式O2を含む多糖、および式O6を含む多糖を含む。より詳細には、かかる組成物は、(i)CRM197にコンジュゲートされたO多糖であって、式O25b(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含むO多糖と、(ii)CRM197にコンジュゲートされたO多糖であって、式O1a(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含むO多糖と、(iii)CRM197にコンジュゲートされたO多糖であって、式O2(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含むO多糖と、(iv)CRM197にコンジュゲートされたO多糖であって、式O6(式中、nは、少なくとも40である)、およびコア糖類を含むO多糖とを含む。
一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、O25aではないいずれかのE.coli血清型に由来する少なくとも1つのO多糖とを含む。例えば、一態様において、本組成物は、式O25aを含む糖類を含まない。かかる組成物は、例えば、式O25bを含むO多糖、式O1Aを含むO多糖、式O2を含むO多糖、および式O6を含むO多糖を含みうる。
一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、2種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、3種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、4種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、5種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、6種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、7種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、8種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、9種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、10種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、11種の異なるE.coli血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、12種の異なる血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、13種の異なる血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、14種の異なる血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、15種の異なる血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、16種の異なる血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、17種の異なる血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、18種の異なる血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、19種の異なる血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、20種の異なる血清型のO多糖とを含み、各O多糖は、CRM197にコンジュゲートされており、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む。
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O25b(式中、nは、15±2である)を含む組成物に関する。1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O25b(式中、nは、17±2である)を含む組成物に関する。1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O25b(式中、nは、55±2である)を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O25b(式中、nは、51±2である)を含む組成物に関する。一態様において、糖類は、E.coli R1コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、E.coli K12コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、KDO部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、CRM197である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはDMSOバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。
一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてIgG抗体を生じ、前記抗体は、ELISAアッセイにより決定した場合、少なくとも0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml、または0.5pg/mlの濃度で、E.coli血清型O25B多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物で免疫処置する前の血清と、免疫処置した後の血清とでOPA活性の比較を実施し、血清型O25Bに対する応答を比較することで、レスポンダーの増大の可能性を評価することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてIgG抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、E.coli血清型O25Bを殺傷することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能性抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、E.coli血清型O25Bを殺傷することができる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、E.coli血清型O25Bに対するレスポンダー(すなわち、インビトロOPAによって決定した場合の力価が少なくとも1:8の血清を有する個体)の割合を、免疫処置前の集団と比較して増大させる。一態様において、免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも50%の対象において、E.coli血清型O25Bに対して少なくとも1:8の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも60%、70%、80%、または少なくとも90%の対象において、E.coli血清型O25Bに対して少なくとも1:8の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、E.coli血清型O25Bに対するレスポンダー(すなわち、インビトロOPAによって決定した場合の力価が少なくとも1:8の血清を有する個体)の割合を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、ヒト対象のE.coli血清型O25Bに対するOPA力価を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O1a(式中、nは、39±2である)を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O1a(式中、nは、13±2である)を含む組成物に関する。一態様において、糖類は、E.coli R1コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、KDO部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、CRM197である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはDMSOバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。
一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてIgG抗体を生じ、前記抗体は、ELISAアッセイにより決定した場合、少なくとも0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml、または0.5pg/mlの濃度で、E.coli血清型O1A多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物で免疫処置する前の血清と、免疫処置した後の血清とでOPA活性の比較を実施し、血清型O1Aに対する応答を比較することで、レスポンダーの増大の可能性を評価することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてIgG抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、E.coli血清型O1Aを殺傷することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能性抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、E.coli血清型O1Aを殺傷することができる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、E.coli血清型O1Aに対するレスポンダー(すなわち、インビトロOPAによって決定した場合の力価が少なくとも1:8の血清を有する個体)の割合を、免疫処置前の集団と比較して増大させる。一態様において、免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも50%の対象において、E.coli血清型O1Aに対して少なくとも1:8の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも60%、70%、80%、または少なくとも90%の対象において、E.coli血清型O1Aに対して少なくとも1:8の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、E.coli血清型O1Aに対するレスポンダー(すなわち、インビトロOPAによって決定した場合の力価が少なくとも1:8の血清を有する個体)の割合を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、ヒト対象のE.coli血清型O1Aに対するOPA力価を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O2(式中、nは、43±2である)を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O2(式中、nは、47±2である)を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖類が、式O2(式中、nは、17±2である)を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖類が、式O2(式中、nは、18±2である)を含む組成物に関する。一態様において、糖類は、E.coli R1コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、E.coli R4コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、KDO部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、CRM197である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはDMSOバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。
一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてIgG抗体を生じ、前記抗体は、ELISAアッセイにより決定した場合、少なくとも0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml、または0.5pg/mlの濃度で、E.coli血清型O2多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物で免疫処置する前の血清と、免疫処置した後の血清とでOPA活性の比較を実施し、血清型O2に対する応答を比較することで、レスポンダーの増大の可能性を評価することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてIgG抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、E.coli血清型O2を殺傷することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能性抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、E.coli血清型O2を殺傷することができる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、E.coli血清型O2に対するレスポンダー(すなわち、インビトロOPAによって決定した場合の力価が少なくとも1:8の血清を有する個体)の割合を、免疫処置前の集団と比較して増大させる。一態様において、免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも50%の対象において、E.coli血清型O2に対して少なくとも1:8の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも60%、70%、80%、または少なくとも90%の対象において、E.coli血清型O2に対して少なくとも1:8の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、E.coli血清型O2に対するレスポンダー(すなわち、インビトロOPAによって決定した場合の力価が少なくとも1:8の血清を有する個体)の割合を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、ヒト対象のE.coli血清型O2に対するOPA力価を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。
1つの側面において、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O6(式中、nは、42±2である)を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O6(式中、nは、50±2である)を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖類が、式O6(式中、nは、17±2である)を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖類が、式O6(式中、nは、18±2である)を含む組成物に関する。一態様において、糖類は、E.coli R1コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、KDO部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、CRM197である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはDMSOバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。
一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてIgG抗体を生じ、前記抗体は、ELISAアッセイにより決定した場合、少なくとも0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml、または0.5pg/mlの濃度で、E.coli血清型O6多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物で免疫処置する前の血清と、免疫処置した後の血清とでOPA活性の比較を実施し、血清型O6に対する応答を比較することで、レスポンダーの増大の可能性を評価することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてIgG抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、E.coli血清型O6を殺傷することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能性抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、E.coli血清型O6を殺傷することができる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、E.coli血清型O6に対するレスポンダー(すなわち、インビトロOPAによって決定した場合の力価が少なくとも1:8の血清を有する個体)の割合を、免疫処置前の集団と比較して増大させる。一態様において、免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも50%の対象において、E.coli血清型O6に対して少なくとも1:8の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも60%、70%、80%、または少なくとも90%の対象において、E.coli血清型O6に対して少なくとも1:8の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、E.coli血清型O6に対するレスポンダー(すなわち、インビトロOPAによって決定した場合の力価が少なくとも1:8の血清を有する個体)の割合を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、ヒト対象のE.coli血清型O6に対するOPA力価を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。
1つの側面において、本組成物は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含み、この糖類は、式O1(例えば、式O1A、式O1B、および式O1C)、式O2、式O3、式O4(例えば、式O4:K52および式O4:K6)、式O5(例えば、式O5abおよび式O5ac(株180/C3))、式O6(例えば、式O6:K2;K13;K15および式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例えば、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、および式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例えば、式O23A)、式O24、式O25(例えば、式O25aおよび式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例えば、式O45および式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例えば、式O73(株73−1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187(式中、nは、1〜100の整数である)のいずれか1つから選択される構造を含む。一態様において、糖類は、E.coli R1コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、E.coli R2コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、E.coli R3コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、E.coli R4コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、E.coli K12コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、KDO部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、CRM197である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはDMSOバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。一態様において、本組成物は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29個のさらなるコンジュゲートから、最大で30個のさらなるコンジュゲートをさらに含み、各コンジュゲートは、担体タンパク質に共有結合した糖類を含み、糖類は、前記式のいずれか1つから選択される構造を含む。
A. 糖類
一態様において、糖類は、糖類のサイズを制御するために、異なるWzzタンパク質(例えば、WzzB)の発現(必ずしも過剰発現とは限らない)によって生成される。
一態様において、糖類は、糖類のサイズを制御するために、異なるWzzタンパク質(例えば、WzzB)の発現(必ずしも過剰発現とは限らない)によって生成される。
本明細書で使用される場合、「糖類」という用語は、単糖部分または単糖単位、ならびに二糖、オリゴ糖、および多糖を形成するように共有結合した2つ以上の単糖部分または単糖単位の組み合わせを意味する。糖類は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。
一態様において、糖類は、組換えグラム陰性菌において産生される。一態様において、糖類は、組換えE.coli細胞において産生される。一態様において、糖類は、組換えSalmonella細胞において産生される。例示的な細菌としては、E.coli O25K5H1、E.coli BD559、E.coli GAR2831、E.coli GAR865、E.coli GAR868、E.coli GAR869、E.coli GAR872、E.coli GAR878、E.coli GAR896、E.coli GAR1902、E.coli O25a ETC NR−5、E.coli O157:H7:K−、Salmonella enterica血清亜型Typhimurium株LT2、E.coli GAR2401、Salmonella enterica血清型 Enteritidis CVD 1943、Salmonella enterica血清型Typhimurium CVD 1925、Salmonella enterica血清型Paratyphi A CVD 1902、およびShigella flexneri CVD 1208Sが挙げられる。一態様において、細菌は、E.coli GAR2401ではない。こうした糖類の生成のための遺伝学的アプローチは、ワクチン成分としてのO多糖およびO抗原分子の効率的な生成を可能にする。
本明細書で使用される「wzzタンパク質」という用語は、例えば、wzzB、wzz、wzzSF、wzzST、fepE、wzzfepE、wzz1、およびwzz2のような、鎖の長さを決定するポリペプチドを意味する。例示的なwzz遺伝子配列のGenBank受入番号は、AF011910(E4991/76)、AF011911(F186)、AF011912(M70/1−1)、AF011913(79/311)、AF011914(Bi7509−41)、AF011915(C664−1992)、AF011916(C258−94)、AF011917(C722−89)、およびAF011919(EDL933)である。G7およびBi316−41 wzz遺伝子配列のGenBank受入番号は、それぞれ、U39305およびU39306である。例示的なwzz遺伝子配列のさらなるGenBank受入番号は、NP_459581(Salmonella enterica亜種enterica血清亜型Typhimurium株LT2 FepE)、AIG66859(E.coli O157:H7株EDL933 FepE)、NP_461024(Salmonella enterica亜種enterica血清亜型Typhimurium株LT2 WzzB)、NP_416531(E.coli K−12亜株MG1655 WzzB)、NP_415119(E.coli K−12亜株MG1655 FepE)である。好ましい態様において、wzzファミリータンパク質は、wzzB、wzz、wzzSF、wzzST、fepE、wzzfepE、wzz1、およびwzz2のいずれか1つ、最も好ましくはwzzB、より好ましくはfepEである。
例示的なwzzB配列は、配列番号30〜34に示される配列を含む。例示的なFepE配列は、配列番号35〜39に示される配列を含む。
いくつかの態様において、中鎖または長鎖のO抗原鎖を含むリポ多糖などの高分子量糖類を生成するために、修飾された糖類(対応する野生型糖類と比較して修飾されたもの)が、グラム陰性菌においてグラム陰性菌由来のwzzファミリータンパク質(例えば、fepE)を発現させること(必ずしも過剰発現とは限らない)、および/または第2のwzz遺伝子(例えば、wzzB)をスイッチオフすること(すなわち、抑制すること、欠失させること、除去すること)により、産生されうる。例えば、修飾された糖類は、wzz2を発現させ(必ずしも過剰発現とは限らない)、wzz1をスイッチオフすることにより、産生されうる。または、代替として、修飾された糖類は、wzzfepEを発現させ(必ずしも過剰発現とは限らない)、wzzBをスイッチオフすることにより、産生されうる。別の態様では、修飾された糖類は、wzzBを発現させ(必ずしも過剰発現とは限らない)、しかしwzzfepEをスイッチオフすることにより、産生されうる。別の態様では、修飾された糖類は、fepEを発現させることにより、産生されうる。好ましくは、wzzファミリータンパク質は、宿主細胞に対して異種である株に由来する。
いくつかの態様において、中鎖または長鎖のO抗原鎖を含むリポ多糖などの高分子量糖類を生成するために、修飾された糖類(対応する野生型糖類と比較して修飾されたもの)が、グラム陰性菌においてグラム陰性菌由来のwzzファミリータンパク質(例えば、fepE)を発現させること(必ずしも過剰発現とは限らない)、および/または第2のwzz遺伝子(例えば、wzzB)をスイッチオフすること(すなわち、抑制すること、欠失させること、除去すること)により、産生されうる。例えば、修飾された糖類は、wzz2を発現させ(必ずしも過剰発現とは限らない)、wzz1をスイッチオフすることにより、産生されうる。または、代替として、修飾された糖類は、wzzfepEを発現させ(必ずしも過剰発現とは限らない)、wzzBをスイッチオフすることにより、産生されうる。別の態様では、修飾された糖類は、wzzBを発現させ(必ずしも過剰発現とは限らない)、しかしwzzfepEをスイッチオフすることにより、産生されうる。別の態様では、修飾された糖類は、fepEを発現させることにより、産生されうる。好ましくは、wzzファミリータンパク質は、宿主細胞に対して異種である株に由来する。
いくつかの態様において、糖類は、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、および配列番号39のいずれか1つに対して少なくとも30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または100%の配列同一性であるアミノ酸配列を有するwzzファミリータンパク質を発現させることによって産生される。一態様において、wzzファミリータンパク質は、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、および配列番号39のいずれか1つから選択される配列を含む。好ましくは、wzzファミリータンパク質は、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34に対して少なくとも30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの態様において、糖類は、fepEタンパク質に対して少なくとも30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または100%の配列同一性であるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させることによって産生される。
1つの側面において、本発明は、グラム陰性菌において、wzzファミリータンパク質、好ましくはfepEを発現させて、中鎖または長鎖のO抗原鎖を含む高分子量糖類を生成することによって産生される糖類であって、対応する野生型O多糖と比較して少なくとも1、2、3、4、または5個多い繰り返し単位を有する、糖類に関する。1つの側面において、本発明は、中鎖または長鎖のO抗原鎖を含む高分子量糖類を生成するための、グラム陰性菌由来のwzzファミリータンパク質(例えば、wzzB)を発現する(必ずしも過剰発現するとは限らない)培養下のグラム陰性菌によって産生される糖類であって、対応する野生型O抗原と比較して少なくとも1、2、3、4、または5個多い繰り返し単位を有する、糖類に関する。対応する野生型糖類と比較して繰り返し単位数が増大している糖類のさらなる例については、下記のO多糖およびO抗原の説明を参照されたい。所望の鎖長は、所与のワクチン構築物との関連において、向上した、または最大の免疫原性をもたらすものである。
別の態様では、糖類は、表1から選択されるいずれか1つの式を含み、ここで、糖類における繰り返し単位数であるnは、対応する野生型O多糖における繰り返し単位数と比べて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそれ以上の繰り返し単位だけ大きい。好ましくは、糖類は、対応する野生型O多糖と比較して少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個多い繰り返し単位を含む。例えば、表24を参照されたい。糖類の長さを決定する方法は、当技術分野において公知である。そのような方法は、実施例13に記載されるように、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィを含む。
好ましい態様では、本発明は、中鎖または長鎖のO抗原鎖を含むリポ多糖などの高分子量糖類を生成するための、組換えE.coli宿主細胞において産生される糖類であって、内在性wzz O抗原長調節因子(例えば、wzzB)の遺伝子が欠失し、組換えE.coli宿主細胞に対して異種であるグラム陰性菌の(第2の)wzz遺伝子(例えば、Salmonella fepE)で置換されている、糖類に関する。いくつかの態様において、組換えE.coli宿主細胞は、Salmonellaの、好ましくはSalmonella entericaのwzz遺伝子を含む。
一態様において、宿主細胞は、安定に維持されたプラスミドベクターとして、wzzファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。別の態様では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体DNAに組み込まれた遺伝子として、wzzファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。E.coli宿主細胞においてプラスミドベクターを安定に発現させる方法、およびE.coli宿主細胞の染色体に異種遺伝子を組み込む方法は、当技術分野において公知である。一態様において、宿主細胞は、安定に維持されたプラスミドベクターとして、O抗原の異種遺伝子を含む。別の態様では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体DNAに組み込まれた遺伝子として、O抗原の異種遺伝子を含む。E.coli宿主細胞およびSalmonella宿主細胞においてプラスミドベクターを安定に発現させる方法は、当技術分野において公知である。E.coli宿主細胞およびSalmonella宿主細胞の染色体に異種遺伝子を組み込む方法は、当技術分野において公知である。
1つの側面において、組換え宿主細胞は、炭素源を含む培地中で培養される。E.coliを培養するための炭素源は、当技術分野において公知である。例示的な炭素源は、糖アルコール、ポリオール、アルドール糖、またはケト糖を含み、アラビノース、セロビオース、フルクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マルトース、マンニトール、マンノース、ラムノース、ラフィノース、ソルビトール、ソルボース、スクロース、トレハロース、ピルビン酸、コハク酸、およびメチルアミンを含むが、これらに限定されない。好ましい態様では、培地はグルコースを含む。いくつかの態様において、培地は、ポリオールまたはアルドール糖、例えば、マンニトール、イノシトール、ソルボース、グリセロール、ソルビトール、ラクトース、およびアラビノースを炭素源として含む。炭素源のすべてが培養の開始前に培地に添加される場合もあれば、培養中に段階的または連続的に添加される場合もある。
組換え宿主細胞のための例示的な培養培地は、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、クエン酸ナトリウム、Na2SO4、アスパラギン酸、グルコース、MgSO4、FeSO4−7H2O、Na2MoO4−2H2O、H3BO3、CoCl2−6H2O、CuCl2−2H2O、MnCl2−4H2O、ZnCl2、およびCaCl2−2H2Oのいずれか1つから選択される要素を含む。好ましくは、培地は、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、クエン酸ナトリウム、Na2SO4、アスパラギン酸、グルコース、MgSO4、FeSO4−7H2O、Na2MoO4−2H2O、H3BO3、CoCl2−6H2O、CuCl2−2H2O、MnCl2−4H2O、ZnCl2、およびCaCl2−2H2Oを含む。
本明細書で使用される培地は、固体であっても液体であってもよく、合成(すなわち人工)であっても天然であってもよく、組換え宿主細胞の培養のために十分な栄養素を含みうる。好ましくは、培地は液体培地である。
いくつかの態様において、培地は、好適な無機塩をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、微量栄養素をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、増殖因子をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、追加の炭素源をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および補足的な炭素源をさらに含んでもよい。E.coliを培養するのに好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および補足的な炭素源は、当技術分野において公知である。
いくつかの態様において、培地は、ペプトン、N−Zアミン、ダイズの酵素的加水分解産物、追加の酵母エキス、麦芽エキス、補助的な炭素源、および様々なビタミンなどの追加の成分を必要に応じて含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、ペプトン、N−Zアミン、ダイズの酵素的加水分解産物、追加の酵母エキス、麦芽エキス、補助的な炭素源、および様々なビタミンなどの追加の成分を含まない。
好適な補助的な炭素源の実例としては、例えばグルコース、フルクトース、マンニトール、デンプンまたはデンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物および糖蜜といった他の炭水化物、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸などの有機酸、ならびにグリセロール、イノシトール、マンニトールおよびソルビトールなどのアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、培地は、窒素源をさらに含む。E.coliを培養するのに好適な窒素源は、当技術分野において公知である。好適な窒素源の実例としては、アンモニアガスおよびアンモニア水を含むアンモニア、無機酸または有機酸のアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、および酢酸アンモニウム、尿素、硝酸塩または亜硝酸塩、ならびに他の窒素含有物質、例えば純粋または粗製の調製物としてのアミノ酸、肉エキス、ペプトン、フィッシュミール、魚加水分解産物、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解産物、ダイズかす加水分解産物、酵母エキス、乾燥酵母、エタノール酵母留出物、ダイズ粉、綿実ミールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、培地は、無機塩を含む。好適な無機塩の実例としては、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅、モリブデン、タングステンおよび他の微量元素、ならびにリン酸の各塩が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、培地は、適切な増殖因子を含む。適切な微量栄養素、増殖因子などの実例としては、純粋なもしくは部分的に精製された化学化合物としての、または天然物質中に存在するものとしての、補酵素A、パントテン酸、ピリドキシン−HCl、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、DL−6,8−チオクト酸、葉酸、ビタミンB12、他のビタミン、システインおよびヒドロキシプロリンなどのアミノ酸、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン、およびシトシンなどの塩基、チオ硫酸ナトリウム、p−アミノ安息香酸またはr−アミノ安息香酸、ナイアシンアミド、ニトリロ酢酸などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの量は、当技術分野において公知である方法および技術に従い、当業者によって経験的に決定されうる。
別の態様では、本明細書に記載の(対応する野生型糖類と比較して)修飾された糖類は、合成的に、例えばインビトロで生成される。糖類の合成的生成または合成は、コスト集約的かつ時間集約的な生成プロセスの回避を容易にしうる。一態様において、糖類は、好適に保護された単糖中間体から、例えば、順次グリコシル化戦略または順次グリコシル化と[3+2]ブロック合成戦略との組み合わせを使用することなどによって、合成的に合成される。例えば、チオグリコシドおよびグリコシルトリクロロアセトイミデート誘導体が、グリコシル化におけるグリコシル供与体として使用されうる。一態様において、インビトロで合成的に合成される糖類は、上述のwzzファミリータンパク質の操作などによる組換え手法によって生成された糖類と同一の構造を有する。
生成された(組換えまたは合成手法によって)糖類は、例えば、次のE.coli血清型:O1(例えば、O1A、O1B、およびO1C)、O2、O3、O4(例えば、O4:K52およびO4:K6)、O5(例えば、O5abおよびO5ac(株180/C3))、O6(例えば、O6:K2;K13;K15およびO6:K54)、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18(例えば、O18A、O18ac、O18A1、O18B、およびO18B1)、O19、O20、O21、O22、O23(例えば、O23A)、O24、O25(例えば、O25aおよびO25b)、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45(例えば、O45およびO45rel)、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D1、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73(例えば、O73(株73−1))、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、およびO187のいずれか1つを含む、任意のE.coli血清型に由来する構造を含む。
個々の多糖は、通常、当技術分野において公知の方法、例えば、透析、濃縮作業、透析濾過作業、接線流濾過、沈殿、溶出、遠心分離、沈殿、限外濾過、深層濾過、および/またはカラムクロマトグラフィ(イオン交換クロマトグラフィ、マルチモーダルイオン交換クロマトグラフィ、DEAE、および疎水性相互作用クロマトグラフィ)などによって精製される(多糖−タンパク質コンジュゲートの量に対して濃縮される)。好ましくは、多糖は、接線流濾過を含む方法によって精製される。
精製された多糖は、本明細書でさらに説明するように、反応することが可能になるように(例えば、担体タンパク質に対して直接的に、またはeTECスペーサーなどのリンカーを介して)活性化されて(例えば、化学的に活性化されて)から、本発明のグリココンジュゲートに組み込まれてもよい。
好ましい一態様において、本発明の糖類は、E.coli血清型に由来し、血清型はO25aである。別の好ましい態様において、血清型はO25bである。別の好ましい態様において、血清型はO1Aである。別の好ましい態様において、血清型はO2である。別の好ましい態様において、血清型はO6である。別の好ましい態様において、血清型はO17である。別の好ましい態様において、血清型はO15である。別の好ましい態様において、血清型はO18Aである。別の好ましい態様において、血清型はO75である。別の好ましい態様において、血清型はO4である。別の好ましい態様において、血清型はO16である。別の好ましい態様において、血清型はO13である。別の好ましい態様において、血清型はO7である。別の好ましい態様において、血清型はO8である。別の好ましい態様において、血清型はO9である。
本明細書で使用される場合、上記の血清型のいずれかへの言及は、当技術分野において公知であり、対応する血清型に特有である繰り返し単位構造(後述するO単位)を含む血清型を意味する。例えば、「O25a」血清型という用語(当技術分野では血清型「O25」としても知られる)は、表1に示される式O25を包含する血清型を意味する。別の例として、「O25b」血清型という用語は、表1に示される式O25bを包含する血清型を意味する。
本明細書で使用される場合、血清型は、特記なき限り、例えば、式「O18」という用語が式O18A、式O18ac、式18A1、式O18B、および式O18B1を総称的に意味するように、本明細書では総称的に参照される。
本明細書で使用される場合、「O1」という用語は、それぞれ表1に示される式O1A、式O1A1、式O1B、および式O1Cのいずれか1つのように、表1による式名に総称「O1」を含む式の種を総称的に意味する。したがって、「O1血清型」は、式O1A、式O1A1、式O1B、および式O1Cのいずれか1つを包含する血清型を総称的に意味する。
本明細書で使用される場合、「O6」という用語は、それぞれ表1に示される式O6:K2;K13;K15;およびO6:K54のいずれか1つのように、表1による式名に総称「O6」を含む式の種を総称的に意味する。したがって、「O6血清型」は、式O6:K2;K13;K15;およびO6:K54のいずれか1つを包含する血清型を総称的に意味する。
表1による式名に総称を含む式の種を総称的に意味する用語の他の例は、「O4」、「O5」、「O18」、および「O45」を含む。
本明細書で使用される場合、「O2」という用語は、表1に示される式O2を意味する。「O2 O抗原」という用語は、表1に示される式O2を包含する糖類を意味する。
本明細書で使用される場合、「O2」という用語は、表1に示される式O2を意味する。「O2 O抗原」という用語は、表1に示される式O2を包含する糖類を意味する。
本明細書で使用される場合、上記の血清型のO抗原への言及は、対応する血清型名が付された式を包含する糖類を意味する。例えば、「O25B O抗原」という用語は、表1に示される式O25Bを包含する糖類を意味する。
別の例として、「O1 O抗原」という用語は、それぞれ表1に示される式O1A、式O1A1、式O1B、および式O1Cのように、「O1」という用語を含む式を包含する糖類を総称的に意味する。
別の例として、「O6 O抗原」という用語は、それぞれ表1に示される式O6:K2、式O6:K13、式O6:K15、および式O6:K54のように、「O6」という用語を含む式を包含する糖類を総称的に意味する。
B. O多糖
本明細書で使用される場合、「O多糖」という用語は、構造が全細胞またはリピドAを含まないことを条件として、O抗原を含む任意の構造を意味する。例えば、一態様において、O多糖は、リピドAが結合していないリポ多糖を含む。リピドAを除去するステップは当技術分野において公知であり、例として、酸の添加による熱処理を含む。例示的なプロセスは、1%酢酸による100℃で90分間の処理を含む。このプロセスは、除去されるリピドAを単離するプロセスと組み合わされる。リピドAを単離する例示的なプロセスは、超遠心分離を含む。
本明細書で使用される場合、「O多糖」という用語は、構造が全細胞またはリピドAを含まないことを条件として、O抗原を含む任意の構造を意味する。例えば、一態様において、O多糖は、リピドAが結合していないリポ多糖を含む。リピドAを除去するステップは当技術分野において公知であり、例として、酸の添加による熱処理を含む。例示的なプロセスは、1%酢酸による100℃で90分間の処理を含む。このプロセスは、除去されるリピドAを単離するプロセスと組み合わされる。リピドAを単離する例示的なプロセスは、超遠心分離を含む。
一態様において、O多糖は、O抗原からなる構造を意味し、この場合、O多糖は、O抗原という用語と同義である。好ましい一態様において、O多糖は、O抗原の繰り返し単位を含み、コア糖類を含まない構造を意味する。したがって、一態様において、O多糖は、E.coli R1コア部分を含まない。別の態様では、O多糖は、E.coli R2コア部分を含まない。別の態様では、O多糖は、E.coli R3コア部分を含まない。別の態様では、O多糖は、E.coli R4コア部分を含まない。別の態様では、O多糖は、E.coli K12コア部分を含まない。別の好ましい態様において、O多糖は、O抗原およびコア糖類を含む構造を意味する。別の態様では、O多糖は、O抗原、コア糖類、およびKDO部分を含む構造を意味する。
コアオリゴ糖を含むO多糖をLPSから精製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、LPSの精製後、精製されたLPSが、100℃で90分間、1%(v/v)酢酸中で加熱することにより加水分解され、その後、4℃で5時間、142,000×gでの超遠心分離が行われる場合がある。O多糖を含む上清がフリーズドライされ、4℃で保管される。ある特定の態様において、O多糖の簡単な精製を可能にする莢膜合成遺伝子の欠失が記載される。
O多糖は、LPSからリピドAを除去するための弱酸加水分解を含むがこれに限定されない方法によって単離されうる。他の態様は、O多糖を調製するための薬剤としてのヒドラジンの使用を含みうる。LPSの調製は、当技術分野において公知の方法によって達成されうる。
ある特定の態様では、Wzzタンパク質(例えば、wzzB)を発現する(必ずしも過剰発現するとは限らない)野生型、修飾型、または弱毒型のグラム陰性菌株から精製されたO多糖が、コンジュゲートワクチンにおいて使用するために提供される。好ましい態様では、O多糖鎖が、wzzタンパク質を発現する(必ずしも過剰発現するとは限らない)グラム陰性菌株から、コンジュゲートまたは複合ワクチンのいずれかとして、ワクチン抗原として使用するために精製される。
一態様において、O多糖は、対応する野生型O多糖と比較して、約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍、またはそれ以上増大した分子量を有する。好ましい態様では、O多糖は、対応する野生型O多糖と比較して、1倍以上5倍以下に増大した分子量を有する。別の態様では、O多糖は、対応する野生型O多糖と比較して、2倍以上4倍以下に増大した分子量を有する。対応する野生型O多糖と比較したO多糖の分子量の増大は、好ましくは、O抗原の繰り返し単位数の増大に関連する。一態様において、O多糖の分子量の増大は、wzzファミリータンパク質によるものである。
一態様において、O多糖は、対応する野生型O多糖と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100kDa、またはそれ以上増大した分子量を有する。一態様において、本発明のO多糖は、対応する野生型O多糖と比較して、1kDa以上200kDa以下増大した分子量を有する。一態様において、分子量は、5kDa以上200kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上200kDa以下増大する。一態様において、分子量は、12kDa以上200kDa以下増大する。一態様において、分子量は、15kDa以上200kDa以下増大する。一態様において、分子量は、18kDa以上200kDa以下増大する。一態様において、分子量は、20kDa以上200kDa以下増大する。一態様において、分子量は、21kDa以上200kDa以下増大する。一態様において、分子量は、22kDa以上200kDa以下増大する。一態様において、分子量は、30kDa以上200kDa以下増大する。一態様において、分子量は、1kDa以上100kDa以下増大する。一態様において、分子量は、5kDa以上100kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上100kDa以下増大する。一態様において、分子量は、12kDa以上100kDa以下増大する。一態様において、分子量は、15kDa以上100kDa以下増大する。一態様において、分子量は、20kDa以上100kDa以下増大する。一態様において、分子量は、1kDa以上75kDa以下増大する。一態様において、分子量は、5kDa以上75kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上75kDa以下増大する。一態様において、分子量は、12kDa以上75kDa以下増大する。一態様において、分子量は、15kDa以上75kDa以下増大する。一態様において、分子量は、18kDa以上75kDa以下増大する。一態様において、分子量は、20kDa以上75kDa以下増大する。一態様において、分子量は、30kDa以上75Da以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上90kDa以下増大する。一態様において、分子量は、12kDa以上85kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上75kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上70kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上60kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上50kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上49kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上48kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上47kDa以下増大する。一態様において、分子量は、10kDa以上46kDa以下増大する。一態様において、分子量は、20kDa以上45kDa以下増大する。一態様において、分子量は、20kDa以上44kDa以下増大する。一態様において、分子量は、20kDa以上43kDa以下増大する。一態様において、分子量は、20kDa以上42kDa以下増大する。一態様において、分子量は、20kDa以上41kDa以下増大する。このような、対応する野生型O多糖と比較したO多糖の分子量の増大は、好ましくは、O抗原の繰り返し単位数の増大に関連する。一態様において、O多糖の分子量の増大は、wzzファミリータンパク質によるものである。例えば、表21を参照されたい。
別の態様では、O多糖は、表1から選択されるいずれか1つの式を含み、ここで、O多糖における繰り返し単位数であるnは、対応する野生型O多糖における繰り返し単位数と比べて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそれ以上の繰り返し単位だけ大きい。好ましくは、糖類は、対応する野生型O多糖と比較して少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個多い繰り返し単位を含む。例えば、表21を参照されたい。
C. O抗原
O抗原は、グラム陰性菌の外膜におけるリポ多糖(LPS)の一部である。O抗原は細胞表面に存在し、可変的な細胞構成要素である。O抗原の可変性は、グラム陰性菌の血清型判定のための基礎を提供する。現在のE.coli血清型判定スキームは、O多糖1〜181を含む。
O抗原は、グラム陰性菌の外膜におけるリポ多糖(LPS)の一部である。O抗原は細胞表面に存在し、可変的な細胞構成要素である。O抗原の可変性は、グラム陰性菌の血清型判定のための基礎を提供する。現在のE.coli血清型判定スキームは、O多糖1〜181を含む。
O抗原はオリゴ糖繰り返し単位(O単位)を含み、その野生型構造は、通常、広範な糖の残基を2つから8つ含む。例示的なE.coli O抗原のO単位は表1に示される。図9A〜9Cおよび図10A〜10Bも参照されたい。
一態様において、本発明の糖類は、1つのオリゴ糖単位でありうる。一態様において、本発明の糖類は、関連する血清型のオリゴ糖の1つの繰り返し単位である。そのような態様において、糖類は、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97、および式O101のいずれか1つから選択される構造を含みうる。
一態様において、本発明の糖類は、オリゴ糖でありうる。オリゴ糖は、低い繰り返し単位数(通常は5〜15の繰り返し単位)を有し、通常は、合成的に、または多糖の加水分解によって得られる。そのような態様において、糖類は、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97、および式O101のいずれか1つから選択される構造を含みうる。
好ましくは、本発明の糖類および本発明の免疫原性組成物における糖類のすべてが多糖である。高分子量多糖は、抗原の表面に存在するエピトープに起因して、ある特定の抗体免疫応答を誘発しうる。高分子量多糖の単離および精製は、好ましくは、本発明のコンジュゲート、組成物、および方法において使用するために想定される。
いくつかの態様において、個々のO抗原ポリマーそれぞれにおける繰り返しO単位数(ひいてはポリマー鎖の長さおよび分子量)は、内膜タンパク質であるwzz鎖長調節因子に依存する。異なるwzzタンパク質は、異なる範囲のモーダル長(4〜100超の繰り返し単位)をもたらす。「モーダル長」という用語は、繰り返しO単位数を意味する。グラム陰性菌は、長いものと短いものとの2つの異なるOAgモーダル鎖長をもたらす、2つの異なるWzzタンパク質を有することが多い。グラム陰性菌におけるwzzファミリータンパク質(例えば、wzzB)の発現(必ずしも過剰発現とは限らない)は、O抗原の長さを操作して、特定の長さ範囲をもつO抗原の細菌による産生を変化させ、またはバイアスをかけ、高収量の高分子量リポ多糖の生成を増強させることを可能にしうる。一態様において、本明細書で使用される「短鎖」モーダル長は、低い繰り返しO単位数、例えば、1〜20を意味する。一態様において、本明細書で使用される「長鎖」モーダル長は、20超、かつ最大40までの繰り返しO単位数を意味する。一態様において、本明細書で使用される「超長鎖」モーダル長は、40超の繰り返しO単位を意味する。
一態様において、生成される糖類は、対応する野生型O多糖と比較して少なくとも10個多い繰り返し単位、15個多い繰り返し単位、20個多い繰り返し単位、25個多い繰り返し単位、30個多い繰り返し単位、35個多い繰り返し単位、40個多い繰り返し単位、45個多い繰り返し単位、50個多い繰り返し単位、55個多い繰り返し単位、60個多い繰り返し単位、65個多い繰り返し単位、70個多い繰り返し単位、75個多い繰り返し単位、80個多い繰り返し単位、85個多い繰り返し単位、90個多い繰り返し単位、95個多い繰り返し単位、または100個多い繰り返し単位を有する。
別の態様では、本発明の糖類は、対応する野生型O多糖と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそれ以上多い繰り返し単位を有する。好ましくは、糖類は、対応する野生型O多糖と比較して少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個多い繰り返し単位を含む。例えば、表21を参照されたい。糖類の長さを決定する方法は、当技術分野において公知である。そのような方法は、実施例13に記載されるように、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィを含む。
糖類における繰り返し単位数を決定する方法もまた、当技術分野において公知である。例えば、繰り返し単位数(または式中の「n」)は、多糖の分子量(コア糖類またはKDO残基の分子量を含まない)を、繰り返し単位の分子量(すなわち、例えば表1に示される対応する式における、式中の各単糖の分子量の和として理論的に計算されうる構造の分子量)で割ることによって計算されうる。式中の各単糖の分子量は、当技術分野において公知である。例えば、式O25bの繰り返し単位の分子量は、約862Daである。例えば、式O1aの繰り返し単位の分子量は、約845Daである。例えば、式O2の繰り返し単位の分子量は、約829Daである。例えば、式O6の繰り返し単位の分子量は、約893Daである。コンジュゲートにおける繰り返し単位数を決定する際は、担体タンパク質の分子量およびタンパク質:多糖比が計算の要素に入れられる。本明細書で定義されるように、「n」は、多糖分子中の繰り返し単位数である(表1では括弧でくくられて表されている)。当技術分野において公知であるように、生体高分子における繰り返し構造には、例えば分枝の欠落のように、繰り返しが不完全な領域が散在していてもよい。さらに、当技術分野では、細菌などの天然源から単離または精製された多糖が、サイズおよび分枝において不均一でありうることが知られている。そのような場合、nは、母集団内の分子のnの平均値または中央値を表しうる。
一態様において、O多糖は、対応する野生型O多糖と比較して少なくとも1つ多いO抗原の繰り返し単位を有する。O抗原の繰り返し単位は、表1に示される。一態様において、O多糖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそれ以上の全繰り返し単位を含む。好ましくは、糖類は、合計で3以上80以下の繰り返し単位を有する。別の態様では、O多糖は、対応する野生型O多糖と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそれ以上多い繰り返し単位を有する。
一態様において、糖類は、O抗原の式(例えば、表1(図9A〜9Cおよび図10A〜10Bも参照されたい)に示される式など)のいずれかにおけるnが、1、2、3、4、5、10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40以上で、200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、または50以下の整数であるO抗原を含む。任意の最小数と任意の最大数とを組み合わせて範囲を定義してもよい。例示的な範囲は、例えば、1以上1000以下、10以上500以下、および20以上80以下、好ましくは90以下を含む。好ましい一態様において、nは、31以上90以下である。好ましい態様では、nは、40〜90、より好ましくは60〜85である。
一態様において、糖類は、O抗原の式のいずれか1つにおけるnが1以上200以下であるO抗原を含む。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、5以上200以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、10以上200以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、25以上200以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、50以上200以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、75以上200以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、100以上200以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、125以上200以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、150以上200以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、175以上200以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、1以上100以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、5以上100以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、10以上100以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、25以上100以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、50以上100以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、75以上100以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、1以上75以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、5以上75以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、10以上75以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、20以上75以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、25以上75以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、30以上75以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、40以上75以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、50以上75以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、30以上90以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、35以上85以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、35以上75以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、35以上70以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、35以上60以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、35以上50以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、35以上49以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、35以上48以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、35以上47以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、35以上46以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、36以上45以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、37以上44以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、38以上43以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、39以上42以下である。一態様において、O抗原の式のいずれか1つにおけるnは、39以上41以下である。
例えば、一態様において、糖類のnは、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、または90、最も好ましくは40である。別の態様では、nは、35以上60以下である。例えば、一態様において、nは、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、および60のいずれか1つ、好ましくは50である。別の好ましい態様において、nは、55以上75以下である。例えば、一態様において、nは、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、または69、最も好ましくは60である。
糖類の構造は、1D、1H、および/または13C、2D TOCSY、DQF−COSY、NOESY、および/またはHMQCを含む、例えばNMRなどの当技術分野において公知である方法およびツールによって決定されうる。
いくつかの態様において、コンジュゲーション前の精製された多糖は、5kDa〜400kDaの分子量を有する。他のかかる態様において、糖類は、10kDa〜400kDa、5kDa〜400kDa、5kDa〜300kDa、5kDa〜200kDa、5kDa〜150kDa、10kDa〜100kDa、10kDa〜75kDa、10kDa〜60kDa、10kDa〜40kDa、10kDa〜100kDa、10kDa〜200kDa、15kDa〜150kDa、12kDa〜120kDa、12kDa〜75kDa、12kDa〜50kDa、12〜60kDa、35kDa〜75kDa、40kDa〜60kDa、35kDa〜60kDa、20kDa〜60kDa、12kDa〜20kDa、または20kDa〜50kDaの分子量を有する。さらなる態様において、多糖は、7kDa〜15kDa、8kDa〜16kDa、9kDa〜25kDa、10kDa〜100、10kDa〜60kDa、10kDa〜70kDa、10kDa〜160kDa、15kDa〜600kDa、20kDa〜1000kDa、20kDa〜600kDa、20kDa〜400kDa、30kDa〜1,000KDa、30kDa〜60kDa、30kDa〜50kDa、または5kDa〜60kDaの分子量を有する。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。
本明細書で使用される場合、多糖または担体タンパク質−多糖コンジュゲートの「分子量」という用語は、マルチアングルレーザー光散乱検出器(MALLS)と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)によって計算される分子量を意味する。
多糖は、通常の精製工程中にサイズがわずかに縮小する場合がある。さらに、本明細書に記載されるように、多糖は、コンジュゲーション前にサイズ分類技術に供される場合がある。機械的または化学的なサイズ分類が用いられうる。酢酸を使用した化学的加水分解が実施されうる。機械的サイズ分類は、高圧均質化せん断を使用して実施されうる。上述の分子量範囲は、コンジュゲーション前(例えば、活性化前)の精製された多糖に関するものである。
D. コアオリゴ糖
コアオリゴ糖は、野生型E.coliのLPSにおけるリピドAとO抗原外部領域との間に位置する。より詳細には、コアオリゴ糖は、野生型E.coliにおけるO抗原とリピドAとの間の結合を含む多糖の一部である。この結合は、最も内側の3−デオキシ−d−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(KDO))残基のヘミケタール官能基と、リピドAのGlcNAc−残基のヒドロキシル基との間のケトシド結合を含む。コアオリゴ糖領域は、野生型E.coli株間で高度の類似性を示す。これは通常、限定された数の糖を含む。コアオリゴ糖は、内側コア領域および外側コア領域を含む。
コアオリゴ糖は、野生型E.coliのLPSにおけるリピドAとO抗原外部領域との間に位置する。より詳細には、コアオリゴ糖は、野生型E.coliにおけるO抗原とリピドAとの間の結合を含む多糖の一部である。この結合は、最も内側の3−デオキシ−d−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(KDO))残基のヘミケタール官能基と、リピドAのGlcNAc−残基のヒドロキシル基との間のケトシド結合を含む。コアオリゴ糖領域は、野生型E.coli株間で高度の類似性を示す。これは通常、限定された数の糖を含む。コアオリゴ糖は、内側コア領域および外側コア領域を含む。
より詳細には、内側コアは、主にL−グリセロ−D−マンノ−ヘプトース(ヘプトース)およびKDO残基から構成されている。内側コアは高度に保存されている。KDO残基は、次式のKDOを含む。
コアオリゴ糖の外部領域は、内側コア領域よりも高い多様性を示し、この領域における差が、E.coliの5つの化学型であるR1、R2、R3、R4、およびK−12を区別する。5つの既知の化学型の外側コアオリゴ糖の炭水化物骨格の一般化構造を示す図24を参照されたい。HepIIが内側コアオリゴ糖の最後の残基である。外側コアオリゴ糖のすべてに、(六炭糖)3炭水化物骨格および2つの側鎖残基を有する構造的テーマが共通するが、骨格内の六炭糖の順序、ならびに側鎖残基の性質、位置、および結合はいずれも異なりうる。R1およびR4外側コアオリゴ糖の構造は高度に類似しており、単一のβ結合残基のみが異なる。
当技術分野において、野生型E.coliのコアオリゴ糖は、末端のオリゴ糖の構造に基づいて、E.coli R1、E.coli R2、E.coli R3、E.coli R4、およびE.coli K12という5つの異なる化学型に分類される。
好ましい態様では、本明細書に記載の組成物は、O抗原に結合したコアオリゴ糖がO多糖に含まれるグリココンジュゲートを含む。一態様において、本組成物は、E.coli R1、E.coli R2、E.coli R3、E.coli R4、およびE.coli K12のうち少なくともいずれか1つのコアE.coli化学型に対する免疫応答を誘発する。別の態様では、本組成物は、少なくとも2つのコアE.coli化学型に対する免疫応答を誘発する。別の態様では、本組成物は、少なくとも3つのコアE.coli化学型に対する免疫応答を誘発する。別の態様では、本組成物は、少なくとも4つのコアE.coli化学型に対する免疫応答を誘発する。別の態様では、本組成物は、5つすべてのコアE.coli化学型に対する免疫応答を誘発する。
別の好ましい態様において、本明細書に記載の組成物は、O抗原に結合したコアオリゴ糖がO多糖に含まれないグリココンジュゲートを含む。一態様において、かかる組成物は、グリココンジュゲートが、コアオリゴ糖を含まないO多糖を有するにもかかわらず、E.coli R1、E.coli R2、E.coli R3、E.coli R4、およびE.coli K12のうち少なくともいずれか1つのコアE.coli化学型に対する免疫応答を誘発する。
E.coli血清型は、5つの化学型のうちの1つによって特徴付けられる場合がある。表2は、化学型によって特徴付けられる例示的な血清型の一覧である。太字の血清型は、示されるコア化学型に最も一般的に関連付けられる血清型を表す。したがって、好ましい態様において、本組成物は、E.coli R1、E.coli R2、E.coli R3、E.coli R4、およびE.coli K12のうち少なくともいずれか1つのコアE.coli化学型に対する免疫応答を誘発し、この免疫応答は、それぞれの対応するE.coli血清型のいずれか1つに対する免疫応答を含む。
いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O8、式O18、式O9、式O13、式O20、式O21、式O91、および式O163(式中、nは、1〜100である)を有する糖類から選択される、R1化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図24に示されるE.coli R1コア部分をさらに含む。
いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O18、式O13、式O20、式O21、式O91、および式O163(式中、nは、1〜100、好ましくは31〜100、より好ましくは35〜90、最も好ましくは35〜65である)を有する糖類から選択される、R1化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、糖類にE.coli R1コア部分をさらに含む。
いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式O21、式O44、式O11、式O89、式O162、および式O9(式中、nは、1〜100、好ましくは31〜100、より好ましくは35〜90、最も好ましくは35〜65である)を有する糖類から選択される、R2化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図24に示されるE.coli R2コア部分をさらに含む。
いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式O25b、式O15、式O153、式O21、式O17、式O11、式O159、式O22、式O86、および式O93(式中、nは、1〜100、好ましくは31〜100、より好ましくは35〜90、最も好ましくは35〜65である)を有する糖類から選択される、R3化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図24に示されるE.coli R3コア部分をさらに含む。
いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式O2、式O1、式O86、式O7、式O102、式O160、および式O166(式中、nは、1〜100、好ましくは31〜100、より好ましくは35〜90、最も好ましくは35〜65である)を有する糖類から選択される、R4化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図24に示されるE.coli R4コア部分をさらに含む。
いくつかの態様において、本組成物は、K−12化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類(例えば、式O25bを有する糖類および式O16を有する糖類から選択されるもの)(式中、nは、1〜1000、好ましくは31〜100、より好ましくは35〜90、最も好ましくは35〜65である)を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図24に示されるE.coli K−12コア部分をさらに含む。
いくつかの態様において、糖類は、コア糖類を含む。したがって、一態様において、O多糖は、E.coli R1コア部分をさらに含む。別の態様では、O多糖は、E.coli R2コア部分をさらに含む。別の態様では、O多糖は、E.coli R3コア部分をさらに含む。別の態様では、O多糖は、E.coli R4コア部分をさらに含む。別の態様では、O多糖は、E.coli K12コア部分をさらに含む。
いくつかの態様において、糖類は、コア糖類を含まない。したがって、一態様において、O多糖は、E.coli R1コア部分を含まない。別の態様では、O多糖は、E.coli R2コア部分を含まない。別の態様では、O多糖は、E.coli R3コア部分を含まない。別の態様では、O多糖は、E.coli R4コア部分を含まない。別の態様では、O多糖は、E.coli K12コア部分を含まない。
E. コンジュゲートされたO抗原
O抗原または好ましくはO多糖のタンパク質担体への化学結合は、O抗原またはO多糖の免疫原性を向上させうる。しかしながら、ポリマーサイズの可変性は、生産における現実的課題を呈する。商業用途において、糖類のサイズは、様々なコンジュゲーション合成戦略との適合性、生成物の均一性、およびコンジュゲートの免疫原性に影響を及ぼしうる。O抗原合成経路の操作によってWzzファミリータンパク質鎖長調節因子の発現を制御することで、E.coliを含む多様なグラム陰性菌株における所望の長さのO抗原鎖の産生が可能になる。
O抗原または好ましくはO多糖のタンパク質担体への化学結合は、O抗原またはO多糖の免疫原性を向上させうる。しかしながら、ポリマーサイズの可変性は、生産における現実的課題を呈する。商業用途において、糖類のサイズは、様々なコンジュゲーション合成戦略との適合性、生成物の均一性、およびコンジュゲートの免疫原性に影響を及ぼしうる。O抗原合成経路の操作によってWzzファミリータンパク質鎖長調節因子の発現を制御することで、E.coliを含む多様なグラム陰性菌株における所望の長さのO抗原鎖の産生が可能になる。
一態様において、担体タンパク質と反応することができる活性化型糖類を生成するために、精製された糖類が化学的に活性化される。活性化されたら、各糖類が別々に担体タンパク質にコンジュゲートされて、コンジュゲート、すなわちグリココンジュゲートを形成する。本明細書で使用される場合、「グリココンジュゲート」という用語は、担体タンパク質に共有結合した糖類を意味する。一態様において、糖類は、担体タンパク質に直接連結される。別の態様では、糖類は、スペーサー/リンカーを介してタンパク質に連結される。コンジュゲートは、O抗原に沿った1つもしくは複数の部位で担体をO抗原に結合させるスキーム、またはコアオリゴ糖の少なくとも1つの残基を活性化させるスキームによって調製されうる。
一態様において、各糖類は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされる。タンパク質担体が組成物中の2つ以上の糖類に対して同じである場合、これらの糖類は、担体タンパク質の同じ分子にコンジュゲートされてもよい(例えば、担体分子に2つ以上の異なる糖類がコンジュゲートされる)。
好ましい態様では、糖類はそれぞれ、タンパク質担体の異なる分子に個別にコンジュゲートされる(タンパク質担体の各分子に1種類の糖類のみがコンジュゲートされる)。前記態様において、糖類は、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされると言われる。
糖類の化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、本明細書に開示される活性化およびコンジュゲーションの方法によって達成されうる。担体タンパク質への多糖のコンジュゲーションの後、グリココンジュゲートは多様な技術によって精製される(多糖−タンパク質コンジュゲートの量に対して濃縮される)。これらの技術は、濃縮/透析濾過作業、沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィ、および深層濾過を含む。個々のグリココンジュゲートが精製された後、これらが複合されて、本発明の免疫原性組成物が処方される。
活性化。本発明はさらに、本明細書に記載の態様のいずれかによって生成される活性化型多糖に関し、この多糖は、化学試薬によって活性化されて、リンカーまたは担体タンパク質へのコンジュゲーションのための反応性基をもたらす。いくつかの態様において、本発明の糖類は、担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に活性化される。いくつかの態様において、活性化度は、多糖の分子量を有意に低減させない。例えば、いくつかの態様において、活性化度は、多糖の骨格を切断しない。いくつかの態様において、活性化度は、CRM197などの担体タンパク質において修飾されているリジン残基の数(アミノ酸解析によって決定される)によって測定されるコンジュゲーション度に有意な影響を及ぼさない。例えば、いくつかの態様において、活性化度は、担体タンパク質において修飾されているリジン残基の数(アミノ酸解析によって決定される)を、同じ活性化度における参照多糖とのコンジュゲートの担体タンパク質において修飾されているリジン残基の数と比較して、3倍有意に増大させない。いくつかの態様において、活性化度は、コンジュゲートされていない遊離糖類のレベルを上昇させない。いくつかの態様において、活性化度は、最適な糖類/タンパク質比を減少させない。
いくつかの態様において、活性化型糖類は、活性化型糖類の糖類繰り返し単位当たりのチオールのモルが1〜100%、例えば、2〜80%、2〜50%、3〜30%、および4〜25%である活性化率を有する。活性化度は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、≧20%、≧30%、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、または≧90%、または約100%である。好ましくは、活性化度は、最大で50%、より好ましくは最大で25%である。一態様において、活性化度は、最大で20%である。任意の最小数と任意の最大数とを組み合わせて範囲を定義してもよい。
一態様において、多糖は、1−シアノ−4−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)で活性化されて、シアン酸エステルを生じる。活性化型多糖は、次いで、担体タンパク質(好ましくはCRM197または破傷風トキソイド)のアミノ基に直接、またはスペーサー(リンカー)基を介してカップリングされる。
例えば、スペーサーは、チオール化多糖をもたらすシスタミンまたはシステアミンであってもよく、チオール化多糖は、マレイミド活性化担体タンパク質との反応(例えば、N−[γ−マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル(GMBS)を使用)、またはハロアセチル化担体タンパク質との反応(例えば、ヨードアセトイミド、N−スクシンイミジルブロモアセテート(SBA;SIB)、N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)、スルホスクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(スルホ−SIAB)、N−スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)、またはスクシンイミジル3−[ブロモアセトアミド]プロプリオネート(SBAP)を使用)の後に得られるチオエーテル結合を介して、担体にカップリングされうる。一態様において、シアン酸エステル(任意選択でCDAP化学により作製される)が、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド(ADH)にカップリングされ、アミノ誘導体化された糖類が、カルボジイミド(例えば、EDACまたはEDC)化学を使用して、タンパク質担体のカルボキシル基を介して担体タンパク質(例えば、CRM197)にコンジュゲートされる。
他の好適なコンジュゲーション技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p−ニトロ安息香酸、N−ヒドロキシスクシンイミド、S−NHS、EDC、TSTUを使用する。コンジュゲーションは、カルボニルリンカーを必要とする場合があり、カルボニルリンカーは、糖類の遊離ヒドロキシル基をCDIと反応させ、その後、タンパク質と反応させてカルバメート結合を形成することによって形成されうる。これは、アノマー末端の第一級ヒドロキシル基への還元、第一級ヒドロキシル基の任意選択による保護/脱保護、第一級ヒドロキシル基をCDIと反応させることによるCDIカルバメート中間体の形成、およびタンパク質のアミノ基とのCDIカルバメート中間体のカップリング(CDI化学)を伴いうる。
分子量。いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、10kDa〜2,000kDaの分子量を有する糖類を含む。他の態様では、糖類は、50kDa〜1,000kDaの分子量を有する。他の態様では、糖類は、70kDa〜900kDaの分子量を有する。他の態様では、糖類は、100kDa〜800kDaの分子量を有する。他の態様では、糖類は、200kDa〜600kDaの分子量を有する。さらなる態様において、糖類は、100kDa〜1000kDa、100kDa〜900kDa、100kDa〜800kDa、100kDa〜700kDa、100kDa〜600kDa、100kDa〜500kDa、100kDa〜400kDa、100kDa〜300kDa、150kDa〜1,000kDa、150kDa〜900kDa、150kDa〜800kDa、150kDa〜700kDa、150kDa〜600kDa、150kDa〜500kDa、150kDa〜400kDa、150kDa〜300kDa、200kDa〜1,000kDa、200kDa〜900kDa、200kDa〜800kDa、200kDa〜700kDa、200kDa〜600kDa、200kDa〜500kDa、200kDa〜400kDa、200kDa〜300、250kDa〜1,000kDa、250kDa〜900kDa、250kDa〜800kDa、250kDa〜700kDa、250kDa〜600kDa、250kDa〜500kDa、250kDa〜400kDa、250kDa〜350kDa、300kDa〜1,000kDa、300kDa〜900kDa、300kDa〜800kDa、300kDa〜700kDa、300kDa〜600kDa、300kDa〜500kDa、300kDa〜400kDa、400kDa〜1,000kDa、400kDa〜900kDa、400kDa〜800kDa、400kDa〜700kDa、400kDa〜600kDa、500kDa〜600kDaの分子量を有する。一態様において、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、単一末端コンジュゲーションによって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、水性バッファー中において調製される還元的アミノ化化学(RAC)によって生成される。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。
いくつかの態様において、本発明のグリココンジュゲートは、400kDa〜15,000kDa、500kDa〜10,000kDa、2,000kDa〜10,000kDa、3,000kDa〜8,000kDa、または3,000kDa〜5,000kDaの分子量を有する。他の態様では、グリココンジュゲートは、500kDa〜10,000kDaの分子量を有する。他の態様では、グリココンジュゲートは、1,000kDa〜8,000kDaの分子量を有する。さらに他の態様において、グリココンジュゲートは、2,000kDa〜8,000kDaまたは3,000kDa〜7,000kDaの分子量を有する。さらなる態様において、本発明のグリココンジュゲートは、200kDa〜20,000kDa、200kDa〜15,000kDa、200kDa〜10,000kDa、200kDa〜7,500kDa、200kDa〜5,000kDa、200kDa〜3,000kDa、200kDa〜1,000kDa、500kDa〜20,000kDa、500kDa〜15,000kDa、500kDa〜12,500kDa、500kDa〜10,000kDa、500kDa〜7,500kDa、500kDa〜6,000kDa、500kDa〜5,000kDa、500kDa〜4,000kDa、500kDa〜3,000kDa、500kDa〜2,000kDa、500kDa〜1,500kDa、500kDa〜1,000kDa、750kDa〜20,000kDa、750kDa〜15,000kDa、750kDa〜12,500kDa、750kDa〜10,000kDa、750kDa〜7,500kDa、750kDa〜6,000kDa、750kDa〜5,000kDa、750kDa〜4,000kDa、750kDa〜3,000kDa、750kDa〜2,000kDa、750kDa〜1,500kDa、1,000kDa〜15,000kDa、1,000kDa〜12,500kDa、1,000kDa〜10,000kDa、1,000kDa〜7,500kDa、1,000kDa〜6,000kDa、1,000kDa〜5,000kDa、1,000kDa〜4,000kDa、1,000kDa〜2,500kDa、2,000kDa〜15,000kDa、2,000kDa〜12,500kDa、2,000kDa〜10,000kDa、2,000kDa〜7,500kDa、2,000kDa〜6,000kDa、2,000kDa〜5,000kDa、2,000kDa〜4,000kDa、または2,000kDa〜3,000kDaの分子量を有する。一態様において、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、本明細書に記載のeTECコンジュゲーションによって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、還元的アミノ化化学(RAC)によって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、DMSO中において調製される還元的アミノ化化学(RAC)によって生成される。
さらなる態様において、本発明のグリココンジュゲートは、1,000kDa〜20,000kDa、1,000kDa〜15,000kDa、2,000kDa〜10,000kDa、2000kDa〜7,500kDa、2,000kDa〜5,000kDa、3,000kDa〜20,000kDa、3,000kDa〜15,000kDa、3,000kDa〜12,500kDa、4,000kDa〜10,000kDa、4,000kDa〜7,500kDa、4,000kDa〜6,000kDa、または5,000kDa〜7,000kDaの分子量を有する。一態様において、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、還元的アミノ化化学(RAC)によって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、DMSO中において調製される還元的アミノ化化学(RAC)によって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、本明細書に記載のeTECコンジュゲーションによって生成される。
さらなる態様において、本発明のグリココンジュゲートは、5,000kDa〜20,000kDa、5,000kDa〜15,000kDa、5,000kDa〜10,000kDa、5,000kDa〜7,500kDa、6,000kDa〜20,000kDa、6,000kDa〜15,000kDa、6,000kDa〜12,500kDa、6,000kDa〜10,000kDa、または6,000kDa〜7,500kDaの分子量を有する。
グリココンジュゲートの分子量は、SEC−MALLSによって測定されうる。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。本発明のグリココンジュゲートは、糖類の担体タンパク質に対する比(重量/重量)によって特徴付けることもできる。いくつかの態様において、グリココンジュゲートにおける多糖の担体タンパク質に対する比(w/w)は、0.5〜3(例えば、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、または約3.0)である。他の態様では、糖類の担体タンパク質に対する比(w/w)は、0.5〜2.0、0.5〜1.5、0.8〜1.2、0.5〜1.0、1.0〜1.5、または1.0〜2.0である。さらなる態様において、糖類の担体タンパク質に対する比(w/w)は、0.8〜1.2である。好ましい態様では、コンジュゲートにおける多糖の担体タンパク質に対する比は、0.9〜1.1である。このような態様のいくつかにおいて、担体タンパク質は、CRM197である。
グリココンジュゲートは、分子サイズ分布(Kd)によって特徴付けることもできる。コンジュゲートの相対的な分子サイズ分布を決定するためには、サイズ排除クロマトグラフィ媒体(CL−4B)が使用されうる。サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)は、重力式カラムにおいてコンジュゲートの分子サイズ分布をプロファイリングするために使用される。媒体の細孔から排除される大きな分子は、小分子よりも速く溶出する。フラクションコレクターがカラム溶出物を収集するために使用される。糖類アッセイによる比色測定で画分が試験される。Kdの決定のためには、分子が完全に排除される分率(V0)、(Kd=0)、および最大の保持を表す分率(Vi)、(Kd=1)を確立するようにカラムを較正する。指定されたサンプル属性に達するときの分率(Ve)は、式Kd=(Ve−Vo)/(Vi−V0)により、Kdに関連付けられる。
遊離糖類。本発明のグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされていないにもかかわらずグリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖類を含みうる。遊離糖類は、グリココンジュゲートに非共有結合的に会合している(すなわち、非共有結合的に結合している、吸着されている、またはグリココンジュゲート中にまたはグリココンジュゲートにより捕捉されている)場合がある。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、または15%の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して約25%未満の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約20%の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約15%の遊離多糖を含む。別の好ましい態様において、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して約8%未満の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約6%の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約5%の遊離多糖を含む。例えば、表19、表20、表21、表22、表23、表24、および表25を参照されたい。
共有結合。他の態様では、コンジュゲートは、5〜10個の糖類繰り返し単位毎、2〜7個の糖類繰り返し単位毎、3〜8個の糖類繰り返し単位毎、4〜9個の糖類繰り返し単位毎、6〜11個の糖類繰り返し単位毎、7〜12個の糖類繰り返し単位毎、8〜13個の糖類繰り返し単位毎、9〜14個の糖類繰り返し単位毎、10〜15個の糖類繰り返し単位毎、2〜6個の糖類繰り返し単位毎、3〜7個の糖類繰り返し単位毎、4〜8個の糖類繰り返し単位毎、6〜10個の糖類繰り返し単位毎、7〜11個の糖類繰り返し単位毎、8〜12個の糖類繰り返し単位毎、9〜13個の糖類繰り返し単位毎、10〜14個の糖類繰り返し単位毎、10〜20個の糖類繰り返し単位毎、4〜25個の糖類繰り返し単位毎、または2〜25個の糖類繰り返し単位毎に、担体タンパク質と糖類との間に少なくとも1つの共有結合を含む。多くの態様において、担体タンパク質は、CRM197である。別の態様では、担体タンパク質と糖類との間の少なくとも1つの結合は、多糖の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の糖類繰り返し単位毎に生じる。一態様において、担体タンパク質は、CRM197である。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。
リジン残基。本発明のグリココンジュゲートを特徴付ける別の方法は、コンジュゲートされるリジンの範囲(コンジュゲーション度)として特徴付けられうる、糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質(例えば、CRM197)におけるリジン残基の数によるものである。多糖への共有結合に起因する担体タンパク質のリジン修飾の証拠は、当業者に公知の定法を使用したアミノ酸解析によって得ることができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために使用される担体タンパク質出発材料と比較して、回収されるリジン残基の数を減少させる。好ましい態様では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、2〜15、2〜13、2〜10、2〜8、2〜6、2〜5、2〜4、3〜15、3〜13、3〜10、3〜8、3〜6、3〜5、3〜4、5〜15、5〜10、8〜15、8〜12、10〜15、または10〜12である。一態様において、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、または約15である。好ましい態様では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、4〜7である。このような態様のいくつかにおいて、担体タンパク質は、CRM197である。
担体タンパク質のリジンへの糖類鎖の結合の頻度は、本発明のグリココンジュゲートを特徴付ける別のパラメータである。例えば、いくつかの態様において、多糖の4個の糖類繰り返し単位毎に、担体タンパク質と多糖との間に少なくとも1つの共有結合が存在する。別の態様では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の10個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも1回生じる。別の態様では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の15個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも1回生じる。さらなる態様では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の25個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも1回生じる。
O−アセチル化。いくつかの態様において、本発明の糖類は、O−アセチル化される。いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、10〜100%、20〜100%、30〜100%、40〜100%、50〜100%、60〜100%、70〜100%、75〜100%、80〜100%、90〜100%、50〜90%、60〜90%、70〜90%、または80〜90%のO−アセチル化度を有する糖類を含む。他の態様では、O−アセチル化度は、≧10%、≧20%、≧30%、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、または≧90%、または約100%である。O−アセチル化度(%)とは、100%(各繰り返し単位が、アセチル化された構造に対して完全にアセチル化されている状態)に対する所与の糖類の百分率を意味する。
いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、還元的アミノ化によって調製される。いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲート糖類であり、この糖類は、担体タンパク質に直接的に共有結合している。いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合している。
還元的アミノ化。一態様において、糖類は、還元的アミノ化により(例えば、米国特許出願公開第2006/0228380号、米国特許出願公開第2007/0231340号、米国特許出願公開第2007/0184071号、および米国特許出願公開第2007/0184072号、WO2006/110381、WO2008/079653、およびWO2008/143709に記載されるように)、担体タンパク質にコンジュゲートされる。
還元的アミノ化は、(1)糖類の酸化、(2)活性化型糖類および担体タンパク質の還元によるコンジュゲートの形成を含む。糖類は、酸化の前に任意選択で加水分解される。機械的または化学的な加水分解が用いられうる。酢酸を使用した化学的加水分解が実施されうる。
酸化ステップは、過ヨウ素酸との反応を伴いうる。本明細書で使用される「過ヨウ素酸」という用語は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を意味する。この用語はまた、メタ過ヨウ素酸(IO4 −)およびオルト過ヨウ素酸(IO6 5−)と、過ヨウ素酸の様々な塩(例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム)の両方を含む。一態様において、多糖は、メタ過ヨウ素酸の存在下、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウム(NalO4)の存在下で酸化される。別の態様では、多糖は、オルト過ヨウ素酸の存在下、好ましくは過ヨウ素酸の存在下で酸化される。
一態様において、酸化剤は、第一級ヒドロキシルを選択的に酸化させる酸化体の存在下における、ピペリジン−N−オキシまたはピロリジン−N−オキシ化合物などの安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物である。前記反応において、実際の酸化体は、触媒サイクルにおけるN−オキソアンモニウム塩である。ある側面において、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン−N−オキシまたはピロリジン−N−オキシ化合物である。ある側面において、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、TEMPO(2,2,6,6−テトラメチル−1−ピペリジニルオキシ)またはPROXYL(2,2,5,5−テトラメチル−1−ピロリジニルオキシ)部分を有する。ある側面において、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、TEMPOまたはその誘導体である。ある側面において、前記酸化体は、N−ハロ部分を有する分子である。ある側面において、前記酸化体は、N−クロロスクシンイミド、N−ブロモスクシンイミド、N−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、1,3,5−トリクロロ−1,3,5−トリアジナン−2,4,6−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、1,3,5−トリブロモ−1,3,5−トリアジナン−2,4,6−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸、および1,3,5−トリヨード−1,3,5−トリアジナン−2,4,6−トリオンのいずれか1つから選択される。好ましくは、前記酸化体は、N−クロロスクシンイミドである。
糖類の酸化ステップ後、糖類は、活性化されたと言われ、以降本明細書では「活性化型」と呼ばれる。活性化型糖類および担体タンパク質は、独立して(別々の凍結乾燥により)、または一緒に(同時凍結乾燥により)、凍結乾燥(フリーズドライ)されうる。一態様において、活性化型糖類および担体タンパク質は、同時凍結乾燥される。別の態様では、活性化型多糖および担体タンパク質は、独立して凍結乾燥される。
一態様において、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行われ、考えられる非還元糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、およびパラチニットを含む。
コンジュゲーションプロセスの次のステップは、還元剤を使用した活性化型糖類および担体タンパク質の還元により、コンジュゲートを形成すること(いわゆる還元的アミノ化)である。好適な還元剤は、ブレンステッド酸もしくはルイス酸の存在下におけるシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、または水素化ホウ素ナトリウムもしくは水素化ホウ素亜鉛などのシアノ水素化ホウ素、ピリジンボラン、2−ピコリンボラン、2,6−ジボラン−メタノール、ジメチルアミン−ボラン、t−BuMe’PrN−BH3、ベンジルアミン−BH3、もしくは5−エチル−2−メチルピリジンボラン(PEMB)などのアミンボラン、ボラン−ピリジン、または水素化ホウ素交換樹脂を含む。一態様において、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
ある態様において、還元反応は、水性溶媒(例えば、PBS、MES、HEPES、Bis−tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、ビシン、またはHEPBから選択され、6.0〜8.5、7.0〜8.0、または7.0〜7.5のpH)において行われ、別の態様では、この反応は、非プロトン溶媒において行われる。ある態様において、還元反応は、DMSO(ジメチルスルホキシド)またはDMF(ジメチルホルムアミド)溶媒において行われる。DMSOまたはDMF溶媒は、凍結乾燥された活性化型多糖および担体タンパク質を再構成するために使用されうる。
還元反応の終わりに、未反応のアルデヒド基がコンジュゲート中に残っている場合があり、これらは、好適なキャッピング剤を使用してキャッピングされうる。一態様において、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)である。コンジュゲーション(還元反応および任意選択のキャッピング)後、グリココンジュゲートは、当業者に公知の多様な技術によって精製される(多糖−タンパク質コンジュゲートの量に対して濃縮される)場合がある。これらの技術は、透析、濃縮/透析濾過作業、接線流濾過沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィ(DEAEまたは疎水性相互作用クロマトグラフィ)、および深層濾過を含む。グリココンジュゲートは、透析濾過および/またはイオン交換クロマトグラフィおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィによって精製されうる。ある態様において、グリココンジュゲートは、透析濾過またはイオン交換クロマトグラフィまたはサイズ排除クロマトグラフィによって精製される。一態様において、グリココンジュゲートは、滅菌濾過される。
好ましい態様では、O25B、O1、O2、およびO6のいずれか1つから選択されるE.coli血清型のグリココンジュゲートは、還元的アミノ化によって調製される。好ましい態様では、E.coli血清型O25B、O1、O2、およびO6のグリココンジュゲートは、還元的アミノ化によって調製される。
1つの側面において、本発明は、
により表される式O25Bの糖類(式中、nは、1以上の任意の整数である)に結合した担体タンパク質、例えば、CRM197を含むコンジュゲートに関する。好ましい態様では、nは、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40以上で、200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、または50以下の整数である。任意の最小数と任意の最大数とを組み合わせて範囲を定義してもよい。例示的な範囲は、例えば、1以上1000以下、10以上500以下、および20以上80以下を含む。好ましい一態様において、nは、31以上90以下、より好ましくは40〜90、最も好ましくは60〜85である。
別の側面では、本発明は、表1(図9A〜9Cおよび図10A〜10Bも参照されたい)に示される以下の構造のいずれか1つを有する糖類(式中、nは、1以上の整数である)に結合した担体タンパク質、例えば、CRM197を含むコンジュゲートに関する。
理論または機構に束縛されるものではないが、いくつかの態様において、安定なコンジュゲートは、抗原の重要な免疫原性エピトープの構造的完全性を保つこととのバランスがとれるレベルの糖類抗原修飾を必要とすると考えられる。
活性化およびアルデヒドの形成。いくつかの態様において、本発明の糖類は活性化され、アルデヒドの形成をもたらす。糖類が活性化されるこのような態様において、活性化率(%)(または酸化度(DO))(例えば、実施例32を参照されたい)とは、活性化型多糖のアルデヒドのモル当たりの糖類繰り返し単位のモルを意味する。例えば、いくつかの態様では、多糖の繰り返し単位における隣接ジオールの過ヨウ素酸酸化によって糖類が活性化され、アルデヒドの形成がもたらされる。糖類繰り返し単位に対する過ヨウ素酸ナトリウムのモル当量(meq)および酸化中の温度を変化させると、異なるレベルの酸化度(DO)がもたらされる。
糖類およびアルデヒドの濃度は、通常、比色アッセイによって決定される。代替的な試薬は、第一級アルコール基からのアルデヒドの形成をもたらすTEMPO(2,2,6,6−テトラメチルピペリジン1−オキシルラジカル)−N−クロロスクシンイミド(NCS)の組み合わせである。
いくつかの態様において、活性化型糖類は、活性化型糖類のアルデヒドのモル当たりの糖類繰り返し単位のモルが1〜100、例えば、2〜80、2〜50、3〜30、および4〜25などである酸化度を有する。活性化度は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、≧20、≧30、≧40、≧50、≧60、≧70、≧80、または≧90、または約100である。好ましくは、酸化度(DO)は、5以上50以下、より好ましくは10以上25以下である。一態様において、活性化度は、10以上25以下である。任意の最小数と任意の最大数とを組み合わせて範囲を定義してもよい。酸化度の値は、活性化率(%)として表される場合がある。例えば、一態様において、10のDO値は、活性化型糖類における合計10個の糖類繰り返し単位のうち、1個は活性化型糖類の繰り返し単位であることを意味し、この場合、10のDO値は、10%活性化と表されうる。
いくつかの態様において、還元的アミノ化化学によって調製されるコンジュゲートは、担体タンパク質および糖類を含み、この糖類は、式O1(例えば、式O1A、式O1B、および式O1C)、式O2、式O3、式O4(例えば、式O4:K52および式O4:K6)、式O5(例えば、式O5abおよび式O5ac(株180/C3))、式O6(例えば、式O6:K2;K13;K15および式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例えば、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、および式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例えば、式O23A)、式O24、式O25(例えば、式O25aおよび式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例えば、式O45および式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例えば、式O73(株73−1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187のいずれか1つから選択される構造を含む。いくつかの態様において、コンジュゲートにおける糖類は、nが1〜1000、5〜1000、好ましくは31〜100、より好ましくは35〜90、最も好ましくは35〜65の整数である式を含む。
単一末端結合コンジュゲート。いくつかの態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲート糖類であり、この糖類は、糖類の1つの末端において担体タンパク質に共有結合している。いくつかの態様において、単一末端結合コンジュゲート糖類は、末端糖類を有する。例えば、多糖の末端の1つ(末端糖類残基)が担体タンパク質に共有結合している場合、コンジュゲートは、単一末端結合している。いくつかの態様において、多糖の末端糖類残基がリンカーを介して担体タンパク質に共有結合している場合、コンジュゲートは、単一末端結合している。このようなリンカーは、例えば、シスタミンリンカー(A1)、3,3’−ジチオビス(プロパン酸ジヒドラジド)リンカー(A4)、および2,2’−ジチオ−N,N’−ビス(エタン−2,1−ジイル)ビス(2−(アミノオキシ)アセトアミド)リンカー(A6)を含みうる。
いくつかの態様において、糖類は、3−デオキシ−d−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(KDO)残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされ、単一末端結合コンジュゲートを形成する。例えば、実施例26、実施例27、実施例28、および図17を参照されたい。
いくつかの態様において、コンジュゲートは、好ましくは、バイオコンジュゲートではない。「バイオコンジュゲート」という用語は、宿主細胞の機構が抗原をタンパク質に結合させる(例えば、N結合)、宿主細胞のバックグラウンドで調製されるタンパク質(例えば、担体タンパク質)と抗原、例えばO抗原(例えば、O25B)とのコンジュゲートを意味する。グリココンジュゲートは、バイオコンジュゲートだけでなく、宿主細胞におけるコンジュゲートの調製を必要としない手法、例えば、タンパク質と糖類の化学結合によるコンジュゲーションによって調製される糖抗原(例えば、オリゴ糖および多糖)とタンパク質のコンジュゲートも含む。
チオール活性化型糖類。いくつかの態様において、本発明の糖類は、チオール活性化型である。糖類がチオール活性化型であるこのような態様において、活性化率(%)とは、活性化型多糖の糖類繰り返し単位当たりのチオールのモルを意味する。糖類およびチオールの濃度は、通常、スルフヒドリルの定量化のためのEllmanアッセイによって決定される。例えば、いくつかの態様において、糖類は、ジスルフィドアミンリンカーによる2−ケト−3−デオキシオクタン酸(KDO)の活性化を含む。例えば、実施例10および図31を参照されたい。いくつかの態様において、糖類は、二価のヘテロ二機能性リンカー(本明細書では「スペーサー」とも呼ばれる)を介して担体タンパク質に共有結合している。リンカーは、好ましくは、糖類と担体タンパク質との間にチオエーテル結合をもたらし、本明細書で「チオエーテルグリココンジュゲート」と呼ばれるグリココンジュゲートをもたらす。いくつかの態様において、リンカーはさらに、例えば(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)のように、カルバメート結合およびアミド結合をもたらす。例えば、実施例21を参照されたい。
いくつかの態様において、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質および糖類を含み、この糖類は、式O1(例えば、式O1A、式O1B、および式O1C)、式O2、式O3、式O4(例えば、式O4:K52および式O4:K6)、式O5(例えば、式O5abおよび式O5ac(株180/C3))、式O6(例えば、式O6:K2;K13;K15および式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例えば、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、および式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例えば、式O23A)、式O24、式O25(例えば、式O25aおよび式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例えば、式O45および式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例えば、式O73(株73−1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187のいずれか1つから選択される構造を含む。いくつかの態様において、コンジュゲートにおける糖類は、nが1〜1000、5〜1000、好ましくは31〜100、より好ましくは35〜90、最も好ましくは35〜65の整数である式を含む。
例えば、一態様において、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質と、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97、および式O101(式中、nは、1〜10の整数である)から選択される構造を有する糖類とを含む。
F. eTECコンジュゲート
1つの側面において、本発明は、広く、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサー(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第9517274号および国際特許出願公開第2014027302号に記載されている)を介して担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされている上述のE.coliに由来する糖類を含むグリココンジュゲート(かかるグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物を含む)、ならびにかかるグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物の調製および使用の方法に関する。前記グリココンジュゲートは、1つまたは複数のeTECスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされた糖類を含み、この糖類は、カルバメート結合を介してeTECスペーサーに共有結合的にコンジュゲートされており、担体タンパク質は、アミド結合を介してeTECスペーサーに共有結合的にコンジュゲートされている。eTECスペーサーは、7つの直鎖状原子(すなわち、−C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)−)を含み、安定なチオエーテル結合およびアミド結合を糖類と担体タンパク質との間にもたらす。
1つの側面において、本発明は、広く、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサー(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第9517274号および国際特許出願公開第2014027302号に記載されている)を介して担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされている上述のE.coliに由来する糖類を含むグリココンジュゲート(かかるグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物を含む)、ならびにかかるグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物の調製および使用の方法に関する。前記グリココンジュゲートは、1つまたは複数のeTECスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされた糖類を含み、この糖類は、カルバメート結合を介してeTECスペーサーに共有結合的にコンジュゲートされており、担体タンパク質は、アミド結合を介してeTECスペーサーに共有結合的にコンジュゲートされている。eTECスペーサーは、7つの直鎖状原子(すなわち、−C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)−)を含み、安定なチオエーテル結合およびアミド結合を糖類と担体タンパク質との間にもたらす。
本発明のeTEC結合グリココンジュゲートは、一般式(I):
(式中、eTECスペーサーを構成する原子は、中央の四角に含まれている)によって表されうる。
本発明の前記グリココンジュゲートにおいて、糖類は、多糖であってもオリゴ糖であってもよい。
本発明の前記グリココンジュゲートにおいて、糖類は、多糖であってもオリゴ糖であってもよい。
本発明のグリココンジュゲートに組み込まれる担体タンパク質は、本明細書にさらに記載される、または当業者に公知の、かかる目的に広く好適な担体タンパク質の群から選択される。特定の態様において、担体タンパク質は、CRM197である。
別の側面では、本発明は、eTECスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に記載の糖類を含むグリココンジュゲートを作製する方法であって、a)糖類を有機溶媒中で炭酸誘導体と反応させて、活性化型糖類を生成するステップと、b)活性化型糖類をシスタミンもしくはシステアミンまたはそれらの塩と反応させて、チオール化糖類を生成するステップと、c)チオール化糖類を還元剤と反応させて、1つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化型チオール化糖類を生成するステップと、d)活性化型チオール化糖類を、1つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化型担体タンパク質と反応させて、チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、e)チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを、(i)活性化型担体タンパク質のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第1のキャッピング試薬、および/または(ii)活性化型チオール化糖類のコンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第2のキャッピング試薬と反応させることにより、eTEC結合グリココンジュゲートを生成するステップとを含む方法を提供する。
多くの態様において、炭酸誘導体は、1,1’−カルボニル−ジ−(1,2,4−トリアゾール)(CDT)または1,1’−カルボニルジイミダゾール(CDI)である。好ましくは、炭酸誘導体はCDTであり、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド(DMSO)などの極性非プロトン溶媒である。好ましい態様において、チオール化糖類は、二官能性対称チオアルキルアミン試薬、シスタミンまたはその塩との活性化型糖類の反応によって生成される。あるいは、チオール化糖類は、システアミンまたはその塩との活性化型糖類の反応によって形成されうる。本発明の方法によって生成されるeTEC結合グリココンジュゲートは、一般式(I)によって表されうる。
多くの態様において、第1のキャッピング試薬は、N−アセチル−L−システインであり、これは、担体タンパク質のリジン残基のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基と反応して、チオエーテル結合を介して活性化リジン残基に共有結合しているS−カルボキシメチルシステイン(CMC)残基を形成する。
他の態様では、第2のキャッピング試薬は、ヨードアセトアミド(IAA)であり、これは、活性化型チオール化糖類のコンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル基と反応して、キャッピングされたチオアセトアミドをもたらす。多くの場合、ステップe)は、第1のキャッピング試薬と第2のキャッピング試薬の両方によるキャッピングを含む。ある特定の態様において、ステップe)は、第1のキャッピング試薬としてのN−アセチル−L−システイン、および第2のキャッピング試薬としてのIAAによるキャッピングを含む。
いくつかの態様において、キャッピングステップe)は、第1および/または第2のキャッピング試薬との反応の後に、還元剤、例えば、DTT、TCEP、またはメルカプトエタノールとの反応をさらに含む。
本発明のeTEC結合グリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、遊離スルフヒドリル残基を含みうる。いくつかの事例において、本明細書において提供される方法によって形成された活性化型チオール化糖類は、複数の遊離スルフヒドリル残基を含み、そのいくつかは、コンジュゲーションステップ中に担体タンパク質への共有結合性コンジュゲーションを受けない場合がある。このような残留遊離スルフヒドリル残基は、反応する可能性がある官能基をキャッピングするために、チオール反応性キャッピング試薬、例えば、ヨードアセトアミド(IAA)との反応によってキャッピングされる。他のチオール反応性キャッピング試薬、例えば、マレイミド含有試薬なども想定される。
さらに、本発明のeTEC結合グリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、コンジュゲートされていない残留担体タンパク質を含む場合があり、この残留担体タンパク質は、キャッピングプロセスステップ中に修飾を受けた活性化型担体タンパク質を含みうる。
いくつかの態様において、ステップd)は、活性化型チオール化糖類を活性化型担体タンパク質と反応させる前に、1つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化型担体タンパク質を用意するステップをさらに含む。多くの態様において、活性化型担体タンパク質は、1つまたは複数のα−ブロモアセトアミド基を含む。
別の側面では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれかに従って生成されたeTECスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている本明細書に記載の糖類を含むeTEC結合グリココンジュゲートを提供する。
いくつかの態様において、担体タンパク質はCRM197であり、CRM197と多糖との間のeTECスペーサーを介した共有結合は、多糖の4、10、15、または25個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも1回生じる。
本発明の側面のそれぞれについて、本明細書に記載の方法および組成物の特定の態様では、eTEC結合グリココンジュゲートは、本明細書に記載の糖類、例えばE.coliに由来する糖類を含む。
別の側面では、本発明は、対象の細菌感染、疾患、または状態を予防する、治療する、または改善する方法であって、本発明の免疫原性組成物を免疫学的有効量で対象に投与するステップを含み、前記免疫原性組成物が、本明細書に記載の糖類を含むeTEC結合グリココンジュゲートを含む方法を提供する。いくつかの態様において、糖類は、E.coliに由来する。
いくつかの態様において、eTEC結合グリココンジュゲートは、担体タンパク質および糖類を含み、前記糖類は、式O1(例えば、式O1A、式O1B、および式O1C)、式O2、式O3、式O4(例えば、式O4:K52および式O4:K6)、式O5(例えば、式O5abおよび式O5ac(株180/C3))、式O6(例えば、式O6:K2;K13;K15および式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例えば、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、および式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例えば、式O23A)、式O24、式O25(例えば、式O25aおよび式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例えば、式O45および式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例えば、式O73(株73−1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187のいずれか1つから選択される構造を含む。いくつかの態様において、コンジュゲートにおける糖類は、nが1〜1000、5〜1000、好ましくは31〜100、より好ましくは35〜90、最も好ましくは35〜65の整数である式を含む。
糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質中のリジン残基の数は、コンジュゲートされるリジンの範囲として特徴付けることができる。例えば、免疫原性組成物のいくつかの態様では、CRM197は、39個のリジン残基中、糖類に共有結合したものを4〜16個含みうる。このパラメータを表す別の方法は、CRM197のリジンの約10%〜約41%が糖類に共有結合しているということである。他の態様では、CRM197は、39個のリジン残基中、糖類に共有結合したものを2〜20個含みうる。このパラメータを表す別の方法は、CRM197のリジンの約5%〜約50%が糖類に共有結合しているということである。
多くの態様において、担体タンパク質はCRM197であり、CRM197と多糖との間のeTECスペーサーを介した共有結合は、多糖の4、10、15、または25個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも1回生じる。
他の態様では、コンジュゲートは、5〜10個の糖類繰り返し単位毎、2〜7個の糖類繰り返し単位毎、3〜8個の糖類繰り返し単位毎、4〜9個の糖類繰り返し単位毎、6〜11個の糖類繰り返し単位毎、7〜12個の糖類繰り返し単位毎、8〜13個の糖類繰り返し単位毎、9〜14個の糖類繰り返し単位毎、10〜15個の糖類繰り返し単位毎、2〜6個の糖類繰り返し単位毎、3〜7個の糖類繰り返し単位毎、4〜8個の糖類繰り返し単位毎、6〜10個の糖類繰り返し単位毎、7〜11個の糖類繰り返し単位毎、8〜12個の糖類繰り返し単位毎、9〜13個の糖類繰り返し単位毎、10〜14個の糖類繰り返し単位毎、10〜20個の糖類繰り返し単位毎、または4〜25個の糖類繰り返し単位毎に、担体タンパク質と糖類の間に少なくとも1つの共有結合を含む。
別の態様では、担体タンパク質と糖類との間の少なくとも1つの結合は、多糖の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の糖類繰り返し単位毎に生じる。
G. 担体タンパク質
本発明のグリココンジュゲートのある成分は、糖類がコンジュゲートされる担体タンパク質である。「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」という用語は、本明細書では同義に使用されうる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション工程に対して改変可能であるべきである。
本発明のグリココンジュゲートのある成分は、糖類がコンジュゲートされる担体タンパク質である。「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」という用語は、本明細書では同義に使用されうる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション工程に対して改変可能であるべきである。
コンジュゲートの成分の1つは、O多糖がコンジュゲートされる担体タンパク質である。一態様において、コンジュゲートは、O多糖のコアオリゴ糖にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む(図24を参照されたい)。一態様において、コンジュゲートは、O多糖のO抗原にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む。
「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」という用語は、本明細書では同義に使用されうる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション工程に対して改変可能であるべきである。
好ましい態様では、コンジュゲートの担体タンパク質は、独立して、TT、DT、DT変異体(例えばCRM197)、H.influenzaeタンパク質D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特に、WO01/98334およびWO03/54007に記載されるもの)、無毒化されたニューモリシン、PorB、N19タンパク質、PspA、OMPC、C.Difficileの毒素AまたはB、およびPsaAのいずれか1つから選択される。ある態様において、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、DT(ジフテリアトキソイド)である。別の態様では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、TT(破傷風トキソイド)である。別の態様では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、PD(Haemophilus influenzaeタンパク質D(例えば、EP0594610Bを参照されたい))である。いくつかの態様において、担体タンパク質は、ポリ(L−リジン)(PLL)を含む。
好ましい態様では、糖類は、CRM197タンパク質にコンジュゲートされている。CRM197タンパク質は、ジフテリア毒素の無毒型であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に区別できない。CRM197は、毒素産生性コリネファージベータのニトロソグアニジン変異誘発によって作り出される非毒素産生性ファージβ197tox−に感染したC.diphtheriaeによって産生される。CRM197タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子における一塩基変化(グアニンからアデニン)によってジフテリア毒素と異なる。この一塩基変化は、成熟タンパク質におけるアミノ酸置換(グリシンからグルタミン酸)を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒な特性を消失させる。CRM197タンパク質は、糖類のための安全かつ効果的なT細胞依存性担体である。
したがって、いくつかの態様において、本発明のコンジュゲートは、担体タンパク質としてCRM197を含み、糖類がCRM197に共有結合している。
好ましい態様では、グリココンジュゲートの担体タンパク質は、DT(ジフテリア毒素)、TT(破傷風トキソイド)またはTTの断片C、CRM197(ジフテリア毒素の無毒だが抗原的に同一のバリアント)、他のDT変異体(例えばCRM176、CRM228、CRM45(Uchidaら、J.Biol.Chem.218;3838〜3844頁、1973)、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103、またはCRM107;ならびにNichollsおよびYoule、Genetically Engineered Toxins、Ed:Frankel、Maecel Dekker Inc、1992に記載されている他の変異;Glu−148の欠失またはAsp、Gln、もしくはSerへの変異、および/またはAla158の欠失またはGIyへの変異、ならびにUS4709017またはUS4950740に開示されている他の変異;少なくとも1つまたは複数の残基Lys516、Lys526、Phe530および/またはLys534の変異、ならびにUS5917017またはUS6455673に開示されている他の変異;またはUS5843711に開示されている断片)、肺炎球菌ニューモリシン(Kuoら(1995)Infect lmmun 63;2706〜13頁)[何らかの様式で無毒化されたply、例えばdPLY−GMBS(WO04081515、PCT/EP2005/010258)またはdPLY−ホルモルを含む]、PhtX、例えばPhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtDまたはPhtEの配列は、WO00/37105またはWO00/39299に開示されている)およびPhtタンパク質の融合物、例えばPhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A−E(WO01/98334、WO03/54007、WO2009/000826)、OMPC(通常はN.meningitidis血清群Bから抽出される髄膜炎菌性外膜タンパク質(EP0372501))、PorB(N.meningitidis由来)、PD(Haemophilus influenzaeタンパク質D(例えば、EP0594610Bを参照されたい))、またはそれらの免疫学的機能的同等物、合成ペプチド(EP0378881、EP0427347)、熱ショックタンパク質(WO93/17712、WO94/03208)、百日咳タンパク質(WO98/58668、EP0471177)、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン(WO91/01146)、様々な病原体由来抗原の複数のヒトCD4+T細胞エピトープを含む人工タンパク質(Falugiら(2001)Eur J Immunol 31;3816〜3824頁)、例えばN19タンパク質(Baraldoiら(2004)Infect lmmun 72;4884〜7頁)、肺炎球菌表面タンパク質PspA(WO02/091998)、鉄取り込みタンパク質(WO01/72337)、C.difficileの毒素AまたはB(WO00/61761)、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌接着タンパク質(PsaA)、組換えPseudomonas aeruginosa外毒素A(特にその無毒の変異体(例えばグルタミン酸553に置換を有する外毒素A(Uchida Cameron DM、RJ Collier.1987.J.Bacteriol.169:4967〜4971頁))からなる群から選択される。卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体(PPD)といった他のタンパク質も、担体タンパク質として使用されうる。他の好適な担体タンパク質は、コレラトキソイド(例えば、国際特許出願第2004/083251号に記載されている)、E.coli LT、E.coli ST、およびPseudomonas aeruginosaの外毒素Aなどの不活性化細菌毒素を含む。
好ましい態様では、グリココンジュゲートの担体タンパク質は、DT(ジフテリア毒素)、TT(破傷風トキソイド)またはTTの断片C、CRM197(ジフテリア毒素の無毒だが抗原的に同一のバリアント)、他のDT変異体(例えばCRM176、CRM228、CRM45(Uchidaら、J.Biol.Chem.218;3838〜3844頁、1973)、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103、またはCRM107;ならびにNichollsおよびYoule、Genetically Engineered Toxins、Ed:Frankel、Maecel Dekker Inc、1992に記載されている他の変異;Glu−148の欠失またはAsp、Gln、もしくはSerへの変異、および/またはAla158の欠失またはGIyへの変異、ならびにUS4709017またはUS4950740に開示されている他の変異;少なくとも1つまたは複数の残基Lys516、Lys526、Phe530および/またはLys534の変異、ならびにUS5917017またはUS6455673に開示されている他の変異;またはUS5843711に開示されている断片)、肺炎球菌ニューモリシン(Kuoら(1995)Infect lmmun 63;2706〜13頁)[何らかの様式で無毒化されたply、例えばdPLY−GMBS(WO04081515、PCT/EP2005/010258)またはdPLY−ホルモルを含む]、PhtX、例えばPhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtDまたはPhtEの配列は、WO00/37105またはWO00/39299に開示されている)およびPhtタンパク質の融合物、例えばPhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A−E(WO01/98334、WO03/54007、WO2009/000826)、OMPC(通常はN.meningitidis血清群Bから抽出される髄膜炎菌性外膜タンパク質(EP0372501))、PorB(N.meningitidis由来)、PD(Haemophilus influenzaeタンパク質D(例えば、EP0594610Bを参照されたい))、またはそれらの免疫学的機能的同等物、合成ペプチド(EP0378881、EP0427347)、熱ショックタンパク質(WO93/17712、WO94/03208)、百日咳タンパク質(WO98/58668、EP0471177)、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン(WO91/01146)、様々な病原体由来抗原の複数のヒトCD4+T細胞エピトープを含む人工タンパク質(Falugiら(2001)Eur J Immunol 31;3816〜3824頁)、例えばN19タンパク質(Baraldoiら(2004)Infect lmmun 72;4884〜7頁)、肺炎球菌表面タンパク質PspA(WO02/091998)、鉄取り込みタンパク質(WO01/72337)、C.difficileの毒素AまたはB(WO00/61761)、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌接着タンパク質(PsaA)、組換えPseudomonas aeruginosa外毒素A(特にその無毒の変異体(例えばグルタミン酸553に置換を有する外毒素A(Uchida Cameron DM、RJ Collier.1987.J.Bacteriol.169:4967〜4971頁))からなる群から選択される。卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体(PPD)といった他のタンパク質も、担体タンパク質として使用されうる。他の好適な担体タンパク質は、コレラトキソイド(例えば、国際特許出願第2004/083251号に記載されている)、E.coli LT、E.coli ST、およびPseudomonas aeruginosaの外毒素Aなどの不活性化細菌毒素を含む。
いくつかの態様において、担体タンパク質は、例えば、CRM197、ジフテリア毒素断片B(DTFB)、DTFB C8、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、TTの断片C、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはPseudomonas aeruginosaの外毒素A、P.aeruginosaの無毒化された外毒素A(EPA)、マルトース結合タンパク質(MBP)、フラジェリン、S.aureusの無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Streptococcus pneumoniaeニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、C.jejuni AcrA、ならびにC.jejuniの天然糖タンパク質のいずれか1つから選択される。一態様において、担体タンパク質は、無毒化されたPseudomonas外毒素(EPA)である。別の態様では、担体タンパク質は、無毒化されたPseudomonas外毒素(EPA)ではない。一態様において、担体タンパク質は、フラジェリンである。別の態様では、担体タンパク質は、フラジェリンではない。
好ましい態様では、グリココンジュゲートの担体タンパク質は、独立して、TT、DT、DT変異体(例えばCRM197)、H.influenzaeタンパク質D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特に、WO01/98334およびWO03/54007に記載されるもの)、無毒化されたニューモリシン、PorB、N19タンパク質、PspA、OMPC、C.Difficileの毒素AまたはB、およびPsaAからなる群から選択される。ある態様において、本発明のグリココンジュゲートの担体タンパク質は、DT(ジフテリアトキソイド)である。別の態様では、本発明のグリココンジュゲートの担体タンパク質は、TT(破傷風トキソイド)である。別の態様では、本発明のグリココンジュゲートの担体タンパク質は、PD(Haemophilus influenzaeタンパク質D(例えば、EP0594610Bを参照されたい))である。
好ましい態様では、本発明の莢膜糖類は、CRM197タンパク質にコンジュゲートされている。CRM197タンパク質は、ジフテリア毒素の無毒型であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に区別できない。CRM197は、毒素産生性コリネファージベータのニトロソグアニジン変異誘発によって作り出される非毒素産生性ファージβ197tox−に感染したC.diphtheriaeによって産生される(Uchida、T.ら、1971、Nature New Biology 233:8〜11頁)。CRM197タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子における一塩基変化(グアニンからアデニン)によってジフテリア毒素と異なる。この一塩基変化は、成熟タンパク質におけるアミノ酸置換(グリシンからグルタミン酸)を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒な特性を消失させる。CRM197タンパク質は、糖類のための安全かつ効果的なT細胞依存性担体である。CRM197およびその生成に関するさらなる詳細は、例えばUS5,614,382で確認することができる。
したがって、多くの態様において、本発明のグリココンジュゲートは、担体タンパク質としてCRM197を含み、莢膜多糖がCRM197に共有結合している。
H. 組成物の投与量
投与レジメンは、最適な所望の応答をもたらすように調整されうる。例えば、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の単回用量を投与してもよいし、いくつかの分割用量を徐々に投与してもよいし、または状況の緊急性が示すのに比例して用量を低減もしくは増大させてもよい。投与量の値は、軽減しようとする状態のタイプおよび重症度に応じて変わる場合があり、単回または複数回の用量を含みうることに留意されたい。さらに、特定の投与レジメンは、任意の特定の対象に合わせて、個々の必要性および組成物の投与を施行または監督する専門家の判断に従って徐々に調整されるべきであること、また、本明細書で示される投与量の範囲は例示に過ぎず、特許請求される組成物の範囲または実践を制限する意図はないことを理解されたい。治療用タンパク質の適切な投与量および投与レジメンの決定は、関連する技術分野において周知であり、これが本発明に包含されることは、本明細書に開示される教示内容を提供された当業者には理解されるであろう。
H. 組成物の投与量
投与レジメンは、最適な所望の応答をもたらすように調整されうる。例えば、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の単回用量を投与してもよいし、いくつかの分割用量を徐々に投与してもよいし、または状況の緊急性が示すのに比例して用量を低減もしくは増大させてもよい。投与量の値は、軽減しようとする状態のタイプおよび重症度に応じて変わる場合があり、単回または複数回の用量を含みうることに留意されたい。さらに、特定の投与レジメンは、任意の特定の対象に合わせて、個々の必要性および組成物の投与を施行または監督する専門家の判断に従って徐々に調整されるべきであること、また、本明細書で示される投与量の範囲は例示に過ぎず、特許請求される組成物の範囲または実践を制限する意図はないことを理解されたい。治療用タンパク質の適切な投与量および投与レジメンの決定は、関連する技術分野において周知であり、これが本発明に包含されることは、本明細書に開示される教示内容を提供された当業者には理解されるであろう。
いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の組成物中の量は、各タンパク質抗原約10μg〜約300μgの範囲でありうる。いくつかの態様において、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片の組成物中の量は、各タンパク質抗原約20μg〜約200μgの範囲でありうる。
各用量におけるグリココンジュゲートの量は、典型的なワクチンにおいて著しい有害な副作用を伴わずに免疫防御反応を誘発する量として選択される。このような量は、どの特定の免疫原が用いられるか、そしてこれがどのように提示されるかに応じて異なる。
免疫原性組成物中の特定のグリココンジュゲートの量は、そのコンジュゲートについての全多糖(コンジュゲートされたものとコンジュゲートされていないもの)に基づいて計算されうる。例えば、20%の遊離多糖を含むグリココンジュゲートは、多糖100gの用量に、コンジュゲートされた多糖約80g、およびコンジュゲートされていない多糖約20gを有する。グリココンジュゲートの量は、E.coli血清型に応じて異なりうる。糖類の濃度は、ウロン酸アッセイによって決定されうる。
免疫原性組成物中の異なる多糖成分の「免疫原性量」は異なってよく、それぞれが約1.0g、約2.0g、約3.0g、約4.0g、約5.0g、約6.0g、約7.0g、約8.0g、約9.0g、約10.0g、約15.0g、約20.0g、約30.0g、約40.0pg、約50.0pg、約60.0pg、約70.0pg、約80.0pg、約90.0pg、または約100.0gの任意の特定の多糖抗原を含みうる。概して、各用量は、所与の血清型の多糖を0.1g〜100g、特に0.5g〜20g、より特定すると1g〜10g、さらにより特定すると2g〜5g含む。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。一態様において、各用量は、所与の血清型の多糖を1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g、または20g含む。
担体タンパク質の量。概して、各用量は、5g〜150gの担体タンパク質、特に10g〜100gの担体タンパク質、より特定すると15g〜100gの担体タンパク質、より特定すると25〜75gの担体タンパク質、より特定すると30g〜70gの担体タンパク質、より特定すると30〜60gの担体タンパク質、より特定すると30g〜50gの担体タンパク質、さらにより特定すると40〜60gの担体タンパク質を含む。一態様において、前記担体タンパク質は、CRM197である。一態様において、各用量は、約25g、約26g、約27g、約28g、約29g、約30g、約31g、約32g、約33g、約34g、約35g、約36g、約37g、約38g、約39g、約40g、約41g、約42g、約43g、約44g、約45g、約46g、約47g、約48g、約49g、約50g、約51g、約52g、約53g、約54g、約55g、約56g、約57g、約58g、約59g、約60g、約61g、約62g、約63g、約64g、約65g、約66g、約67g、68g、約69g、約70g、約71g、約72g、約73g、約74g、または約75gの担体タンパク質を含む。一態様において、前記担体タンパク質は、CRM197である。
I. アジュバント
いくつかの態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、少なくとも1つ、2つ、または3つのアジュバントをさらに含みうる。「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強させる化合物または混合物を意味する。抗原は、主に送達系として機能するか、主に免疫調節因子として機能するか、または両方の強い特長を有する場合がある。好適なアジュバントは、ヒトを含む哺乳動物において使用するのに好適なものを含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、少なくとも1つ、2つ、または3つのアジュバントをさらに含みうる。「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強させる化合物または混合物を意味する。抗原は、主に送達系として機能するか、主に免疫調節因子として機能するか、または両方の強い特長を有する場合がある。好適なアジュバントは、ヒトを含む哺乳動物において使用するのに好適なものを含む。
ヒトにおいて使用されうる公知の好適な送達系タイプのアジュバントの例は、ミョウバン(例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、または水酸化アルミニウム)、リン酸カルシウム、リポソーム、水中油エマルジョン、例えばMF59(4.3%w/vスクアレン、0.5%w/vポリソルベート80(Tween80)、0.5%w/vトリオレイン酸ソルビタン(Span85))、油中水エマルジョン、例えばMontanide、およびポリ(D,L−ラクチド−コグリコリド)(PLG)微粒子またはナノ粒子を含むが、これらに限定されない。
ある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、または水酸化アルミニウム)をアジュバントとして含む。好ましい態様では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムをアジュバントとして含む。ある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、0.1mg/mL〜1mg/mLまたは0.2mg/mL〜0.3mg/mLの元素アルミニウムをリン酸アルミニウムの形態で含む。ある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、約0.25mg/mLの元素アルミニウムをリン酸アルミニウムの形態で含む。ヒトにおいて使用されうる公知の好適な免疫調節タイプのアジュバントの例は、沈香の樹皮からのサポニン抽出物(QS21、Quil A)、TLR4アゴニスト、例えばMPL(モノホスホリルリピドA)、3DMPL(3−O−脱アシル化MPL)またはGLA−AQ、LT/CT変異体、サイトカイン、例えば様々なインターロイキン(例えば、IL−2、IL−12)またはGM−CSF、AS01などを含むが、これらに限定されない。
ヒトにおいて使用されうる、送達機能と免疫調節機能の両方を有する公知の好適な免疫調節タイプのアジュバントの例は、ISCOMS(例えば、Sjolanderら(1998)J.Leukocyte Biol.64:713頁、WO90/03184、WO96/11711、WO00/48630、WO98/36772、WO00/41720、WO2006/134423、およびWO2007/026190を参照されたい)、またはTLR4アゴニストと水中油エマルジョンとの組み合わせであるGLA−EMを含むが、これらに限定されない。
動物実験を含むがこれに限定されない獣医学的用途では、完全フロイントアジュバント(CFA)、フロイント不完全アジュバント(IFA)、Emulsigen、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(CGP 11637、nor−MDPと呼ばれる)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(CGP 19835A、MTP−PEと呼ばれる)、ならびに、細菌から抽出される3つの成分、モノホスホリルリピドA、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS)を2%スクアレン/Tween80エマルジョンに含むRIBIを使用することができる。
本明細書に開示される免疫原性組成物の有効性を増強させるアジュバントのさらなる例は、(1)水中油エマルジョン製剤(ムラミルペプチド(下記参照)または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤の有無を問わない)、例えば(a)サブミクロンエマルジョンに微小流動化された、あるいはより大きな粒径のエマルジョンを生成するようにボルテックスされた、10%スクアラン、0.4%Tween80、5%プルロニックブロックポリマーL121、およびthr−MDPを含むSAF、ならびに(b)2%スクアレン、0.2%Tween80、および1つまたは複数の細菌細胞壁成分、例えばモノホスホリルリピドA(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)を含むRIBI(商標)アジュバント系(RAS)(Ribi Immunochem、Hamilton、Mont.)、好ましくはMPL+CWSを含むもの(DETOX(商標))、(2)サポニンアジュバント、例えばQS21、STIMULON(商標)(Cambridge Bioscience、Worcester、Mass.)、ABISCO(登録商標)(Isconova、Sweden)、またはISCOMATRIX(登録商標)(Commonwealth Serum Laboratories、Australia)(これを使用してもよいし、これから粒子を生成してもよい)、例えばISCOM(免疫刺激複合体)(このISCOMSは、追加の界面活性剤を欠いていてもよい)(例えば、WO00/07621)、(3)完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)、(4)サイトカイン、例えばインターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12(例えば、WO99/44636))、インターフェロン(例えば、ガンマインターフェロン)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など、(5)モノホスホリルリピドA(MPL)または3−O−脱アシル化MPL(3dMPL)(例えば、GB2220211、EP0689454を参照されたい)(例えば、WO00/56358を参照されたい)、(6)3dMPLと、例えば、QS21および/または水中油エマルジョンの組み合わせ(例えば、EP0835318、EP0735898、EP0761231を参照されたい)、(7)ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル(例えば、WO99/52549を参照されたい)、(8)オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(例えば、WO01/21207)、またはオクトキシノールなどの少なくとも1つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤(例えば、WO01/21152)、(9)サポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド(例えば、CpGオリゴヌクレオチド)(例えば、WO00/62800)、(10)免疫刺激剤および金属塩の粒子(例えば、WO00/23105を参照されたい)、(11)サポニンおよび水中油エマルジョン(例えば、WO99/11241)、(12)サポニン(例えば、QS21)+3dMPL+IM2(任意選択でステロールを含む)(例えば、WO98/57659)、(13)組成物の効力を増強させる免疫刺激剤として機能する他の物質を含むが、これらに限定されない。ムラミルペプチドは、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−25アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミンMTP−PE)などを含む。
本発明のある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、CpGオリゴヌクレオチドをアジュバントとして含む。本明細書で使用されるCpGオリゴヌクレオチドとは、免疫刺激性CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)を意味し、したがって、これらの用語は、特記なき限り同義に使用される。免疫刺激性CpGオリゴデオキシヌクレオチドは、非メチル化シトシン−グアニンのジヌクレオチドである免疫刺激性CpGモチーフを1つまたは複数、任意選択で特定の好ましい塩基との関連で含む。CpG免疫刺激性モチーフのメチル化状態は、概して、ジヌクレオチド内のシトシン残基に関するものである。非メチル化CpGジヌクレオチドを少なくとも1つ含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、3’グアニンへのリン酸結合によって連結された5’非メチル化シトシンを含み、Toll様受容体9(TLR−9)への結合を介して免疫系を活性化させるオリゴヌクレオチドである。別の態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数のメチル化CpGジヌクレオチドを含んでもよく、これは、TLR9を介して免疫系を活性化させるが、CpGモチーフがメチル化されていないかのように、あまり強力には活性化させない。CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の回文構造を含んでもよく、この回文構造が、CpGジヌクレオチドを含んでもよい。CpGオリゴヌクレオチドは、米国特許第6,194,388号、米国特許第6,207,646号、米国特許第6,214,806号、米国特許第6,218,371号、米国特許第6,239,116号、および米国特許第6,339,068号を含め、いくつかの交付済み特許、公開特許出願、および他の公開文献に記載されている。
本発明のある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、WO2010/125480の3頁22行から12頁36行に記載されているCpGオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。
異なるクラスのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドが同定されている。これらはA、B、C、およびPクラスと呼ばれ、WO2010/125480の3頁22行から12頁36行にさらに詳細に記載されている。本発明の方法は、こうした異なるクラスのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用を含む。
VII. ナノ粒子
別の側面では、1)ナノ構造、および2)少なくとも1つの線毛ポリペプチド抗原またはその断片を含む免疫原性複合体が本明細書に開示される。好ましくは、線毛ポリペプチドまたはその断片は、E.coli線毛H(fimH)に由来する。好ましい態様では、線毛ポリペプチドは、上述の線毛ポリペプチドのいずれか1つから選択される。例えば、線毛ポリペプチドは、配列番号1〜10、18、20、21、23、24、および26〜29から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を含みうる。
別の側面では、1)ナノ構造、および2)少なくとも1つの線毛ポリペプチド抗原またはその断片を含む免疫原性複合体が本明細書に開示される。好ましくは、線毛ポリペプチドまたはその断片は、E.coli線毛H(fimH)に由来する。好ましい態様では、線毛ポリペプチドは、上述の線毛ポリペプチドのいずれか1つから選択される。例えば、線毛ポリペプチドは、配列番号1〜10、18、20、21、23、24、および26〜29から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を含みうる。
いくつかの態様において、抗原は、提示されるエピトープに対する適応免疫応答の発生を刺激するように、ナノ構造外部に融合またはコンジュゲートされる。いくつかの態様において、免疫原性複合体は、発生する免疫応答のタイプを各病原体に合わせるのに役立つ、外部に結合した、かつ/またはケージ内部に封入されたアジュバントまたは他の免疫調節性化合物をさらに含む。
いくつかの態様において、ナノ構造は、同一の第1のナノ構造関連ポリペプチドを複数含む単一のアセンブリを含む。
代替的な態様では、ナノ構造は、同一の第1のナノ構造関連ポリペプチド複数、および第2のアセンブリ複数を含む複数性アセンブリを含み、第2のアセンブリはそれぞれ、同一の第2のナノ構造関連ポリペプチドを複数含む。
代替的な態様では、ナノ構造は、同一の第1のナノ構造関連ポリペプチド複数、および第2のアセンブリ複数を含む複数性アセンブリを含み、第2のアセンブリはそれぞれ、同一の第2のナノ構造関連ポリペプチドを複数含む。
様々なナノ構造プラットフォームが、本明細書に記載の免疫原性組成物を生成するのに用いられうる。いくつかの態様において、用いられるナノ構造は、単一のサブユニットの複数のコピーによって形成される。いくつかの態様において、用いられるナノ構造は、複数の異なるサブユニットの複数のコピーによって形成される。
ナノ構造は通常、ボールのような形状であり、かつ/または回転対称性(例えば、3回回転軸および5回回転軸)、例えば、本明細書に例示される正二十面体構造を有する。
いくつかの態様において、抗原は、フェリチン(FR)、E2p、Qβ、およびI3−01に由来する自己集合性ナノ構造のような自己集合性ナノ粒子で提示される。E2pは、Bacillus stearothermophilus由来のジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼの再設計されたバリアントである。I3−01は、自己集合して超安定なナノ粒子になりうる工学操作されたタンパク質である。これらのタンパク質のサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。第1の側面において、本明細書では、配列番号59〜92からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも75%同一であり、かつ少なくとも1つの同定された界面位置において同一であるアミノ酸配列を含む、ナノ構造関連ポリペプチドが開示される。ナノ構造関連ポリペプチドは、例えば、ナノ構造を調製するために使用されうる。ナノ構造関連ポリペプチドは、対になって自己集合し、正二十面体ナノ構造のようなナノ構造を形成する能力のために設計された。
いくつかの態様において、抗原は、フェリチン(FR)、E2p、Qβ、およびI3−01に由来する自己集合性ナノ構造のような自己集合性ナノ粒子で提示される。E2pは、Bacillus stearothermophilus由来のジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼの再設計されたバリアントである。I3−01は、自己集合して超安定なナノ粒子になりうる工学操作されたタンパク質である。これらのタンパク質のサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。第1の側面において、本明細書では、配列番号59〜92からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも75%同一であり、かつ少なくとも1つの同定された界面位置において同一であるアミノ酸配列を含む、ナノ構造関連ポリペプチドが開示される。ナノ構造関連ポリペプチドは、例えば、ナノ構造を調製するために使用されうる。ナノ構造関連ポリペプチドは、対になって自己集合し、正二十面体ナノ構造のようなナノ構造を形成する能力のために設計された。
いくつかの態様において、ナノ構造は、(a)複数の第1のアセンブリおよび(b)複数の第2のアセンブリを含み、第1のアセンブリのそれぞれは、同一の第1のナノ構造関連ポリペプチドを複数含み、第1のナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号59〜92からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、第2のアセンブリのそれぞれは、同一の第2のナノ構造関連ポリペプチドを複数含み、第2のナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号59〜92からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、第2のナノ構造関連ポリペプチドは、第1のナノ構造関連ポリペプチドとは異なり、複数の第1のアセンブリは、複数の第2のアセンブリと非共有結合的に相互作用して、ナノ構造を形成する。
ナノ構造は、正二十面体対称性におけるもののような、第1のアセンブリおよび第2のアセンブリの配置を定めてナノ構造にする、対称に繰り返し、非天然、非共有結合性のポリペプチド間界面を含む。
配列番号59〜92は、例示的なナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。配列番号59〜92の例示的なナノ構造関連ポリペプチドの界面残基の数は、4〜13残基の範囲である。様々な態様において、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号59〜92からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であり、かつ少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個の同定された界面位置(所与のナノ構造関連ポリペプチドの界面残基の数に応じる)において同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様では、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号59〜92からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であり、かつ同定された界面位置の少なくとも20%、25%、33%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、または100%で同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号59〜98からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を有するナノ構造関連ポリペプチドを含む。
非限定的な一態様において、ナノ構造関連ポリペプチドは、目的の「カーゴ」への共有結合を容易にするように修飾されうる。非限定的な一例において、ナノ構造関連ポリペプチドは、例えば、ナノ構造関連ポリペプチドのナノ構造が、向上した免疫応答を発生させるためのワクチンとして送達される多数の抗原を提示する足場となるように、1つまたは複数の目的の抗原への結合を容易にするように所定の位置で様々なシステイン残基を導入することによって修飾されうる。
いくつかの態様において、ナノ構造関連ポリペプチドに存在するが、コンジュゲーションに使用されるよう意図されるものではない天然システイン残基のいくつかまたはすべてを、所定の位置でコンジュゲーションを容易にするように他のアミノ酸に変異させてもよい。別の非限定的な態様では、ナノ構造関連ポリペプチドは、「エンドソーム脱出」を容易にするのに役立つ部分との結合(共有結合性または非共有結合性)によって修飾されうる。標的化送達のように、目的の分子を標的細胞に送達することを含む用途において、重要なステップは、エンドソーム(送達ビヒクルが細胞内に侵入する地点である膜結合オルガネラ)からの脱出でありうる。エンドソームは、内容物を分解するリソソームへと成熟する。したがって、エンドソームがリソソームになる前に、送達ビヒクルがエンドソームからどうにかして「脱出」しなければ、送達ビヒクルは分解され、その機能を果たさない。エンドソームを破壊し、サイトゾルへの脱出を可能にする脂質または有機ポリマーには、様々なものがある。したがって、この態様において、ナノ構造関連ポリペプチドは、例えば、かかる脂質または有機ポリマーの、単量体または結果として得られるアセンブリの表面への化学的コンジュゲーションを可能にする、システイン残基の導入により、修飾されうる。別の非限定的な例では、ナノ構造関連ポリペプチドは、例えば、ナノ構造のインビトロまたはインビボでの可視化を可能にするフルオロフォアまたは他の造影剤の化学的コンジュゲーションを可能にする、システイン残基の導入により、修飾されうる。
ナノ構造関連ポリペプチドの表面アミノ酸残基は、タンパク質サブユニットまたは集合したナノ構造の安定性または可溶性を向上させるために変異させてもよい。当業者には分かるように、ナノ構造関連ポリペプチドが既存のタンパク質ファミリーに対して著しい配列相同性を有する場合、そのファミリーに属する他のタンパク質の複数配列アライメントが、タンパク質の安定性および/または可溶性を増大させうる非保存的位置でのアミノ酸変異の選択の指針とするために使用される場合があり、これは、コンセンサスタンパク質設計と呼ばれるプロセスである(9)。
ナノ構造関連ポリペプチドの表面アミノ酸残基は、タンパク質表面に全体的な正電荷または全体的な負電荷を与えるために、正電荷を帯びたアミノ酸(Arg、Lys)または負電荷を帯びたアミノ酸(Asp、Glu)に変異させてもよい。非限定的な一態様において、ナノ構造関連ポリペプチドの表面アミノ酸残基は、自己集合性ナノ構造の内部表面に高い正味電荷を与えるように変異させてもよい。次いで、このようなナノ構造は、ナノ構造内部表面とカーゴ分子との間の静電相互作用による反対の正味電荷によってカーゴ分子をパッケージングまたは封入するために使用されうる。非限定的な一態様において、ナノ構造関連ポリペプチドの表面アミノ酸残基は、自己集合性ナノ構造の内部表面に正味の正電荷を与えるために、主にアルギニンまたはリジン残基に変異させてもよい。次いで、ナノ構造関連ポリペプチドを含む溶液は、核酸を自己集合性ナノ構造内に封入するために、dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA、cDNA、miRNA、siRNA、shRNA、piRNA、または他の核酸などの核酸カーゴ分子の存在下で混合されうる。このようなナノ構造は、例えば、核酸を保護する、送達する、または濃縮するために使用されうる。
一態様において、ナノ構造は、正二十面体対称性を有する。この態様において、ナノ構造は、60コピーの第1のナノ構造関連ポリペプチド、および60コピーの第2のナノ構造関連ポリペプチドを含みうる。このような一態様において、第1のアセンブリのそれぞれにおける同一の第1のナノ構造関連ポリペプチドの数は、第2のアセンブリのそれぞれにおける同一の第2のナノ構造関連ポリペプチドの数とは異なる。例えば、一態様において、ナノ構造は、12個の第1のアセンブリおよび20個の第2のアセンブリを含む。この態様において、第1のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第1のナノ構造関連ポリペプチドを5コピー含んでよく、第2のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第2のナノ構造関連ポリペプチドを3コピー含んでよい。別の態様では、ナノ構造は、12個の第1のアセンブリおよび30個の第2のアセンブリを含む。この態様において、第1のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第1のナノ構造関連ポリペプチドを5コピー含んでよく、第2のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第2のナノ構造関連ポリペプチドを2コピー含んでよい。さらなる態様において、ナノ構造は、20個の第1のアセンブリおよび30個の第2のアセンブリを含む。この態様において、第1のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第1のナノ構造関連ポリペプチドを3コピー含んでよく、第2のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第2のナノ構造関連ポリペプチドを2コピー含んでよい。これらの態様はすべて、規則的な正二十面体対称性をもつ合成ナノ物質を形成することができる。
以下の実施例は、本発明がより良好に理解されうるように示される。これらの実施例は、例証のみを目的とし、いかなるかたちであれ本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例は、本発明のいくつかの態様を説明する。
構築物の概要
調査したFimH構築物はすべて、予想された分子量をもつ単量体タンパク質であった。
FimC−FimH複合体の予想分子量は53.1kDaである。
FimCの予想分子量は24kDaである。
FimCの予想分子量は24kDaである。
FimHレクチン結合ドメインの哺乳動物における発現
この非限定的な実施例は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のHEK細胞株における産生に関する。収量は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のE.coli宿主細胞における発現と比べて比較的高かった。
この非限定的な実施例は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のHEK細胞株における産生に関する。収量は、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のE.coli宿主細胞における発現と比べて比較的高かった。
哺乳動物細胞からのFimHバリアントの産生を達成するために、SignalP予測アルゴリズムを使用して、タンパク質および断片の分泌について異なる異種シグナル配列を解析した。野生型FimHリーダー配列も解析した。予測では、野生型FimHリーダー配列が哺乳動物細胞でのFimHバリアントの分泌のために機能する可能性があることが示されたが、分泌されたバリアントは、全長野生型FimHのF22残基(配列番号1参照)ではなく、全長野生型FimHのW20残基(配列番号1参照)で切断されると予測された。血球凝集素シグナル配列は機能しないと予測された。マウスIgKシグナル配列は、配列番号1のF22、または成熟タンパク質のF1残基のN末端をもたらすと予測された。
これらの解析に基づいて、DNAを合成し、FimHレクチン結合ドメインを野生型FimHリーダーとともに発現する構築物を組換え生成した。FimHレクチン結合ドメインをmIgKシグナル配列とともに発現する構築物も調製した。Hisタグなどのアフィニティ精製タグを、E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片のC末端に導入して、精製を容易にした。
発現プラスミドを、HEK宿主細胞、すなわちEXPI293哺乳動物細胞にトランスフェクトした。
E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片が首尾よく発現された。例えば、pSB01892 FimHdscG構築物について、F22における成熟FimHの起点に融合したmIgKシグナル配列を使用した好ましいN末端プロセシングが、MSによって示された。このプロセシングは、レクチンドメイン構築物pSB01878に対して正しいと考えられ、質量スペクトルデータはこれを裏付ける。
E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片が首尾よく発現された。例えば、pSB01892 FimHdscG構築物について、F22における成熟FimHの起点に融合したmIgKシグナル配列を使用した好ましいN末端プロセシングが、MSによって示された。このプロセシングは、レクチンドメイン構築物pSB01878に対して正しいと考えられ、質量スペクトルデータはこれを裏付ける。
好ましいN末端プロセシング(すなわち、配列番号1のF22におけるプロセシング)は、天然FimHリーダーペプチドでは示されなかった。
pSB01877およびpSB01878構築物は、pcDNA3.1(+)哺乳動物発現ベクターに含まれる。細胞を希釈し、その後、20mlのトランスフェクションで使用した。各構築物につき1μg/mlのDNAを使用し、Expifectamineプロトコールを使用して125mlフラスコで細胞にトランスフェクトした。72時間後、細胞生存能は依然として良好であったため、発現を96時間まで継続させた。72時間時点でサンプルを取り、それぞれ10μlをSDS PAGEゲルで泳動させ、発現について調べた。
pSB01877およびpSB01878構築物は、pcDNA3.1(+)哺乳動物発現ベクターに含まれる。細胞を希釈し、その後、20mlのトランスフェクションで使用した。各構築物につき1μg/mlのDNAを使用し、Expifectamineプロトコールを使用して125mlフラスコで細胞にトランスフェクトした。72時間後、細胞生存能は依然として良好であったため、発現を96時間まで継続させた。72時間時点でサンプルを取り、それぞれ10μlをSDS PAGEゲルで泳動させ、発現について調べた。
96時間後、馴化培地を回収し、0.25mlのNickel Excel樹脂を添加し、一晩4℃で回転させながらバッチ結合させた。TrisCl pH8.0、NaCl、イミダゾールで溶出させた。図4を参照されたい。
pSB01878の予想質量は、N末端F22と整合する。1つまたは2つの部位にグリコシル化が存在する(N−Dの各脱アミド化から質量+1)。
グリコシル化変異体を構築した。例えば、pSB02081、pSB02082、pSB02083、pSB02088、およびpSB02089を参照されたい。グリコシル化変異体は、目的のポリペプチドを発現した。結果については図5を参照されたい。
グリコシル化変異体を構築した。例えば、pSB02081、pSB02082、pSB02083、pSB02088、およびpSB02089を参照されたい。グリコシル化変異体は、目的のポリペプチドを発現した。結果については図5を参照されたい。
FimHレクチンドメインロック変異体も構築した。例えば、pSB02158を参照されたい。pSB02158構築物の発現の結果は、図6Bに示される。
0.5ピコモル(pmoles)のフルオレセインにコンジュゲートされたアミノフェニル−マンノピラノシド(APMP)を使用した蛍光偏光アッセイを行った。このアッセイは、室温、300RPMで64時間にわたって行った。結果を図6Cに示す。
0.5ピコモル(pmoles)のフルオレセインにコンジュゲートされたアミノフェニル−マンノピラノシド(APMP)を使用した蛍光偏光アッセイを行った。このアッセイは、室温、300RPMで64時間にわたって行った。結果を図6Cに示す。
FimH/C複合体、pSB01879およびpSB01880の哺乳動物における発現
FimH/C複合体の生成のために、EF1アルファプロモーター下のFimCと、野生型またはmIgKシグナルペプチドのいずれかを伴うFimHとの二重発現構築物を調製した。これらをpBudCE4.1哺乳動物発現ベクター(ThermoFisher)にクローニングし、C末端HisタグをFimCに付加した。SignalP解析に基づいて、成熟タンパク質の最初の残基としてG37 FimCがもたらされるという肯定的な予測が得られたため、mIgKシグナルペプチドを使用した分泌のために、FimCバリアントを設計した。
FimH/C複合体の生成のために、EF1アルファプロモーター下のFimCと、野生型またはmIgKシグナルペプチドのいずれかを伴うFimHとの二重発現構築物を調製した。これらをpBudCE4.1哺乳動物発現ベクター(ThermoFisher)にクローニングし、C末端HisタグをFimCに付加した。SignalP解析に基づいて、成熟タンパク質の最初の残基としてG37 FimCがもたらされるという肯定的な予測が得られたため、mIgKシグナルペプチドを使用した分泌のために、FimCバリアントを設計した。
より詳細には、これらの構築物は、ベクターpBudCE4.1内のEF1アルファプロモーター下にFimC断片を、同じベクター内のCMVプロモーター下にFimH断片インサートを有するように設計された。ベクターpBudCE4.1は、哺乳動物細胞における発現のためのプロモーターを2つ有する、Thermo Fisherの発現ベクターである。NotIおよびXhoIで消化し、同じ部位でpBudCE4.1ベクターにサブクローニングすることにより、FimC断片インサート(pSB01881インサート)をサブクローニングした。これらを、2xYTゼオシン(50μg/ml)プレートに蒔いた。ゼオシン50μg/mlを含む2xYTにコロニーを播種し、一晩37℃で増殖させ、プラスミドを調製した。これらをNotIおよびXhoIで消化して、インサートの存在を調べ、すべてのコロニーで、インサートのサイズは約722bpであった。
pSB01881をHindIIIおよびBamHIで消化し、pSB01879インサートおよびpSB01880インサートDNAをHindIIIおよびBamHIで消化した。これらの断片をゲル単離し、pSB01881ベクターにサブクローニングし、2xYTゼオシン(zeo)(50μg/ml)プレートに蒔いた。それぞれのコロニーを2xYTゼオシン(50μg/ml)に播種し、一晩37℃で増殖させ、プラスミドを調製し、NotIおよびXhoIで消化してFimCインサートの存在を調べ、HindIIIおよびBamHIで消化してFimHインサートの存在を調べた。すべてのクローンで、両方のクローニング部位に予想されたサイズのインサートが存在した。その後、pSB01879−1およびpSB01880−1クローンを発現に使用した。
FimH/FimC複合体はまた、EXPI293細胞において発現することが示されている。発現は、プロモーター、例えばEF1α、CAG、Ub、Tub、または他のプロモーターを切り替えることによって最適化されうる。
好ましいN末端プロセシング(すなわち、配列番号1のF22におけるプロセシング)は、天然FimHリーダーペプチドでは示されなかった。
シグナルペプチド予測のために使用したSignalP 4.1(DTU Bioinformatics)による例示的な結果を、以下に示す。さらなるシグナルペプチドが、成熟FimHポリペプチドまたはその断片の1位にPheの好ましいN末端をもたらすことが予測される。以下は、4つの一般的なシグナル配列の代表的サンプルセットに過ぎない。
シグナルペプチド予測のために使用したSignalP 4.1(DTU Bioinformatics)による例示的な結果を、以下に示す。さらなるシグナルペプチドが、成熟FimHポリペプチドまたはその断片の1位にPheの好ましいN末端をもたらすことが予測される。以下は、4つの一般的なシグナル配列の代表的サンプルセットに過ぎない。
以下のシグナルペプチド配列は、成熟FimHポリペプチドまたはその断片の1位にPheの好ましいN末端をもたらすことが予測された。
以下のシグナルペプチド配列は、成熟FimHポリペプチドまたはその断片の1位にPheの好ましいN末端をもたらすことが予測されなかった。
FimHとFimGペプチドのドナー鎖相補性融合物の哺乳動物における発現
いくつかのリンカー長を試験した。野生型FimHと、FimHのF22に融合したmIgKシグナルペプチドの両方で、FimHをN末端FimGペプチドに融合させるこれらのリンカーを用いた組換え発現を準備した。
いくつかのリンカー長を試験した。野生型FimHと、FimHのF22に融合したmIgKシグナルペプチドの両方で、FimHをN末端FimGペプチドに融合させるこれらのリンカーを用いた組換え発現を準備した。
FimHドナー鎖相補性FimG構築物はまた、EXPI293細胞において堅実に発現することが示されている。
好ましいN末端プロセシング(すなわち、配列番号1のF22におけるプロセシング)は、天然FimHリーダーペプチドでは示されなかった。
好ましいN末端プロセシング(すなわち、配列番号1のF22におけるプロセシング)は、天然FimHリーダーペプチドでは示されなかった。
ドナー鎖相補性構築物については、様々なリンカーおよびFimGペプチドを含んだpcDNA3.1(+)中のベース構築物を生成するようにオリゴヌクレオチドを設計した。FimHの配列番号1の番号付けにより、G294 V295 T296残基において、特有のBstEII部位を組み込んだ。同じBstEII部位をリンカーに組み込んで、ベース構築物を生成した。
pSB01882−01895のベース構築物を構築した。プライマーを使用して、ACCUPRIME PFX DNA Polymerase(Thermo Fisher)を用いたpcDNA3.1(+)のPCR増幅を行い、PCR産物をNdeI(CMVプロモーター中)およびBamHIで消化し、NdeIおよびBamHIで消化されたpcDNA3.1(+)にクローニングし、ゲル単離して断片を取り出した。
対照としてのEXPI293細胞と併せて、pSB01877、01878、01879、01880、01885、および01892を用いた別の一過性トランスフェクションを行った。
メーカーのプロトコールに従ったThermo FisherのEXPI293細胞における一過性トランスフェクション発現試験において、構築物pSB01882からpSB01895を使用した。10μlの馴化培地をロードした72時間にわたる20mLのEXPI293細胞における発現後の結果を示す図3を参照されたい。高レベルの発現が観察された。pSB01879およびpSB01880構築物からの発現後、FimH/FimC複合体が存在する。20mlの馴化培地をNickel Excelにバッチ結合させ、40CVで洗浄、イミダゾールで溶出した。
さらなるFimHドナー鎖相補性構築物を調製した。例えば、pSB02198、pSB02199、pSB02200、pSB02304、pSB02305、pSB02306、pSB02307、pSB02308の各構築物を参照されたい。pSB2198 FimH dscGロック変異型構築物の発現を図7に示す。pSB2198 FimH dscGロック変異体は、一過性発現から12mg/Lをもたらした。
Vi−CELL XR 2.04(Beckman Coulter,Inc.)によれば、以下の内容が観察された(発現に使用した実際の細胞型はHEK細胞であった)。
プロセシングされるシグナルペプチドと合わせた断片の分子量
FimH成熟タンパク質におけるPhe1(配列番号2の番号付けによる)のN末端α−アミノ基は、D−マンノースの臨界極性認識をもたらす
理論または機構に束縛されるものではないが、FimH成熟タンパク質のPhe1(配列番号2の番号付けによる)の直前での正しいシグナルペプチドの切断が、機能的なFimHタンパク質を発現するために重要であると示唆されている。N末端α−アミノ基での変化、例えばFimHタンパク質のPhe1の前でN末端にアミノ酸を付加することで、D−マンノースのO2原子、O5原子、およびO6原子との水素結合相互作用を消失させ、D−マンノースとの立体反発を導入することにより、マンノース結合をブロックすることができる。このことは、配列番号2のPhe1の前に追加のGly残基を付加することがマンノース結合の不検出につながるという、本発明者らの実験的観察によって裏付けられる。
理論または機構に束縛されるものではないが、FimH成熟タンパク質のPhe1(配列番号2の番号付けによる)の直前での正しいシグナルペプチドの切断が、機能的なFimHタンパク質を発現するために重要であると示唆されている。N末端α−アミノ基での変化、例えばFimHタンパク質のPhe1の前でN末端にアミノ酸を付加することで、D−マンノースのO2原子、O5原子、およびO6原子との水素結合相互作用を消失させ、D−マンノースとの立体反発を導入することにより、マンノース結合をブロックすることができる。このことは、配列番号2のPhe1の前に追加のGly残基を付加することがマンノース結合の不検出につながるという、本発明者らの実験的観察によって裏付けられる。
D−マンノースに結合したFimHの結晶構造の解析により、以下の内容が観察された。Phe1のN末端α−アミノ基は、配列番号2の番号付けによるFimHのAsp54および配列番号2の番号付けによるFimHのGln133の側鎖とともに、D−マンノースの臨界極性認識モチーフをもたらし、これらの極性相互作用の変異および変化は、マンノース結合の不在につながる。
FimHにおけるPhe1の側鎖はD−マンノースと直接相互作用することはなく、むしろFimH内部に埋没しており、Phe1が他の残基、例えば脂肪族疎水性残基(Ile、Leu、またはVal)によって置換されうることを示唆している
D−マンノースおよびその類似体と複合したFimHの結晶構造(例えばPDB ID:1QUN)の解析は、Phe1の側鎖(配列番号2の番号付けによる)がD−マンノースと直接相互作用することはなく、むしろその芳香環をVal56、Tyr95、Gln133およびPhe144の側鎖(配列番号2の番号付けによる)にスタッキングすることによって結合ポケットを安定化することを示す。
D−マンノースおよびその類似体と複合したFimHの結晶構造(例えばPDB ID:1QUN)の解析は、Phe1の側鎖(配列番号2の番号付けによる)がD−マンノースと直接相互作用することはなく、むしろその芳香環をVal56、Tyr95、Gln133およびPhe144の側鎖(配列番号2の番号付けによる)にスタッキングすることによって結合ポケットを安定化することを示す。
Pheに代わる代替的なN末端残基は、FimHタンパク質を安定化し、マンノース結合を許容し、正しいシグナルペプチド切断を可能にしうる。そのような残基は、当技術分野において公知である好適な方法によって、例えばFimHの結晶構造の外観検査、またはBioLuminate(商標)[BioLuminate、Schrodinger LLC、New York、2017]、Discovery Studio(商標)[Discovery Studio Modeling Environment、Dassault Systemes、San Diego、2017]、MOE(商標)[Molecular Operating Environment、Chemical Computing Group Inc.、Montreal、2017]、およびRosetta(商標)[Rosetta、University of Washington、Seattle、2017]などのコンピュータによるタンパク質設計ソフトウェアを使用した、より定量的な選択によって同定されうる。実例が図9A〜9Cに示される。置換アミノ酸は、脂肪族疎水性アミノ酸(例えばIle、Leu、およびVal)でありうる。図11は、FimHタンパク質を安定化し、マンノース結合を許容しうる脂肪族疎水性側鎖を有する他のアミノ酸、例えばIle、LeuおよびValとのPhe1の変異誘発のコンピュータによるスキャニングを示す。
FimHタンパク質における配列番号2の番号付けによるAsn7の変異は、マンノース、mAb21、またはmAb475の結合に影響を及ぼすことなく、推定上のN−グリコシル化部位を除去し、脱アミド化を防止しうる。
哺乳動物細胞株から分泌されるE.coli FimHの過剰発現は、配列番号2の番号付けによる残基Asn7におけるN結合型グリコシル化をもたらしうる。さらに、残基Asn7は溶媒曝露され、Gly残基が続き、脱アミド化を非常に受けやすくなる。
D−マンノースおよびその類似体と複合したFimHの結晶構造(例えばPDB ID:1QUN)の解析は、Asn7がマンノース結合部位から20Å超離れており、この部位における変異がマンノース結合に影響を及ぼさないはずであることを示す。したがって、Asn7の他のアミノ酸(例えばSer、AspおよびGln)への変異は、推定上のN−グリコシル化部位を効果的に除去し、脱アミド化を防止しうる。
E.coli株およびS.enterica株
臨床株および誘導体を表10に記載する。さらなる参照株は、臨床的なO25a血清型株のO25K5H1、およびS.enterica血清亜型Typhimurium株LT2を含んだ。
臨床株および誘導体を表10に記載する。さらなる参照株は、臨床的なO25a血清型株のO25K5H1、およびS.enterica血清亜型Typhimurium株LT2を含んだ。
E.coli株において、標的のオープンリーディングフレームを除去するが短い瘢痕(scar)配列を残す遺伝子ノックアウトを構築した。
加水分解されたO抗原鎖およびコア糖は、以降、簡略化のためにO多糖(OPS)と記載する。
加水分解されたO抗原鎖およびコア糖は、以降、簡略化のためにO多糖(OPS)と記載する。
wzzB、fepE、およびO抗原遺伝子クラスターのクローニングのためのオリゴヌクレオチドプライマー
プラスミド
プラスミドベクターおよびサブクローンを表12に記載する。様々なE.coliおよびSalmonellaのwzzBおよびfepE遺伝子を保有するPCR断片を、精製されたゲノムDNAから増幅し、Invitrogen PCR(登録商標)Bluntクローニングキットにおいて提供される高コピー数プラスミドにサブクローニングした(図12A〜12B)。このプラスミドは、pUCレプリコンに基づく。天然のプロモーターを有するE.coli wzzB遺伝子を増幅するためにプライマーP3およびP4を使用した。これらのプライマーは、UDP−グルコース−6−デヒドロゲナーゼをコードする近位の遺伝子およびホスホリボシルアデニンヌクレオチドヒドロラーゼをコードする遠位の遺伝子の各領域(Genbank MG1655 NC_000913.3にアノテートされている)に結合するように設計されている。先述のプライマーを使用し、Salmonella fepE遺伝子を含むPCR断片およびプロモーターを増幅した。類似したE.coli fepEプライマーを、利用可能なGenbankゲノム配列または内部で生成された全ゲノムデータ(GAR2401およびO25K5H1の場合)に基づいて設計した。低コピー数プラスミドpBAD33を使用して、アラビノースプロモーターの制御下でO抗原生合成遺伝子を発現させた。まず、5’側のプロモーターおよび3’側の6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(gnd)遺伝子と相同のユニバーサルプライマーを使用して増幅された長いPCR断片のクローニング(Gibson法による)を容易にするように、プラスミドを修飾した(表12)。O25b生合成オペロンを含むpBAD33サブクローンを図12A〜12Bに示す。
プラスミドベクターおよびサブクローンを表12に記載する。様々なE.coliおよびSalmonellaのwzzBおよびfepE遺伝子を保有するPCR断片を、精製されたゲノムDNAから増幅し、Invitrogen PCR(登録商標)Bluntクローニングキットにおいて提供される高コピー数プラスミドにサブクローニングした(図12A〜12B)。このプラスミドは、pUCレプリコンに基づく。天然のプロモーターを有するE.coli wzzB遺伝子を増幅するためにプライマーP3およびP4を使用した。これらのプライマーは、UDP−グルコース−6−デヒドロゲナーゼをコードする近位の遺伝子およびホスホリボシルアデニンヌクレオチドヒドロラーゼをコードする遠位の遺伝子の各領域(Genbank MG1655 NC_000913.3にアノテートされている)に結合するように設計されている。先述のプライマーを使用し、Salmonella fepE遺伝子を含むPCR断片およびプロモーターを増幅した。類似したE.coli fepEプライマーを、利用可能なGenbankゲノム配列または内部で生成された全ゲノムデータ(GAR2401およびO25K5H1の場合)に基づいて設計した。低コピー数プラスミドpBAD33を使用して、アラビノースプロモーターの制御下でO抗原生合成遺伝子を発現させた。まず、5’側のプロモーターおよび3’側の6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(gnd)遺伝子と相同のユニバーサルプライマーを使用して増幅された長いPCR断片のクローニング(Gibson法による)を容易にするように、プラスミドを修飾した(表12)。O25b生合成オペロンを含むpBAD33サブクローンを図12A〜12Bに示す。
O抗原の精製
発酵ブロスを酢酸で処理して最終濃度1〜2%(最終pH4.1)とした。酸処理したブロスを2時間100℃に加熱することにより、OAgの抽出および脱脂を達成した。酸加水分解の最後にバッチを周囲温度に冷まし、14%NH4OHを添加して最終pHを6.1とした。中和されたブロスを遠心分離し、遠心分離液を収集した。この遠心分離液にCaCl2のリン酸ナトリウム溶液を添加し、結果として得られたスラリーを室温で30分インキュベートした。固体を遠心分離によって除去し、10kDa膜を使用して遠心分離液を12倍に濃縮した後、水に対する透析濾過を2回行った。次いで、カーボンフィルターを使用し、OAgを含んだ残余分を精製した。カーボンフィルターにかけた濾液を4.0M硫酸アンモニウムで1:1(v/v)に希釈した。硫酸アンモニウムの最終濃度は2Mであった。カーボンフィルターにかけ、硫酸アンモニウム処理した濾液に、ランニングバッファーとして2M硫酸アンモニウムを用い、膜を使用した精製をさらに行った。フロースルー中のOAgを収集した。長鎖OAgについては、HIC濾液を濃縮し、次いで、5kDa膜を使用し、水(20透析濾過容量)に対してバッファー交換した。短鎖(天然)のOAg多糖については、MWCOをさらに低減させて収量を高めた。
発酵ブロスを酢酸で処理して最終濃度1〜2%(最終pH4.1)とした。酸処理したブロスを2時間100℃に加熱することにより、OAgの抽出および脱脂を達成した。酸加水分解の最後にバッチを周囲温度に冷まし、14%NH4OHを添加して最終pHを6.1とした。中和されたブロスを遠心分離し、遠心分離液を収集した。この遠心分離液にCaCl2のリン酸ナトリウム溶液を添加し、結果として得られたスラリーを室温で30分インキュベートした。固体を遠心分離によって除去し、10kDa膜を使用して遠心分離液を12倍に濃縮した後、水に対する透析濾過を2回行った。次いで、カーボンフィルターを使用し、OAgを含んだ残余分を精製した。カーボンフィルターにかけた濾液を4.0M硫酸アンモニウムで1:1(v/v)に希釈した。硫酸アンモニウムの最終濃度は2Mであった。カーボンフィルターにかけ、硫酸アンモニウム処理した濾液に、ランニングバッファーとして2M硫酸アンモニウムを用い、膜を使用した精製をさらに行った。フロースルー中のOAgを収集した。長鎖OAgについては、HIC濾液を濃縮し、次いで、5kDa膜を使用し、水(20透析濾過容量)に対してバッファー交換した。短鎖(天然)のOAg多糖については、MWCOをさらに低減させて収量を高めた。
O25b長鎖O抗原のCRM197へのコンジュゲーション
過ヨウ素酸酸化を使用した後、還元的アミノ化化学(RAC)を使用したコンジュゲーションを行うことで、長鎖O25b多糖−CRM197コンジュゲートの第1のセットを生成した(表14)。酸化レベルを変化させることにより、3つの活性化レベル(低、中、および高)のコンジュゲートバリアントを生成した。凍結乾燥した活性化型多糖を、凍結乾燥したCRM197と反応させることにより、コンジュゲートを生成し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として使用して、DMSO培地中で再構成した。コンジュゲーション反応を23℃で24時間行い、その後、水素化ホウ素ナトリウムを使用したキャッピングを3時間行った。コンジュゲーションクエンチステップの後、5mMコハク酸塩/0.9%NaCl(pH6.0)を使用した100K MWCOの再生セルロース膜での限外濾過/透析濾過により、コンジュゲートを精製した。コンジュゲートの最終濾過は、0.22μm膜を使用して行った。特に明記しない限り、以下の実施例を通して開示されるコンジュゲートは、コア糖類部分を含む。
過ヨウ素酸酸化を使用した後、還元的アミノ化化学(RAC)を使用したコンジュゲーションを行うことで、長鎖O25b多糖−CRM197コンジュゲートの第1のセットを生成した(表14)。酸化レベルを変化させることにより、3つの活性化レベル(低、中、および高)のコンジュゲートバリアントを生成した。凍結乾燥した活性化型多糖を、凍結乾燥したCRM197と反応させることにより、コンジュゲートを生成し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として使用して、DMSO培地中で再構成した。コンジュゲーション反応を23℃で24時間行い、その後、水素化ホウ素ナトリウムを使用したキャッピングを3時間行った。コンジュゲーションクエンチステップの後、5mMコハク酸塩/0.9%NaCl(pH6.0)を使用した100K MWCOの再生セルロース膜での限外濾過/透析濾過により、コンジュゲートを精製した。コンジュゲートの最終濾過は、0.22μm膜を使用して行った。特に明記しない限り、以下の実施例を通して開示されるコンジュゲートは、コア糖類部分を含む。
1.1. 異種ポリメラーゼ鎖長調節因子によりもたらされる長鎖O抗原の発現
初期のE.coli株の構築はO25血清型に重点を置いた。目的は、異種wzzB遺伝子またはfepE遺伝子を過剰発現させて、これらがO25 wzzBノックアウト株において鎖長を増加させるかどうかを確認することであった。まず、血液分離株をPCRによってスクリーニングして、O25aおよびO25bサブタイプの株を同定した。次に、アンピシリンに対する感受性について株をスクリーニングした。単一のアンピシリン感受性O25b分離株GAR2401が同定され、これにwzzB欠失を導入した。同様に、O25a株O25K5H1にwzzB欠失を行った。これらの変異の遺伝的相補性のために、GAR2401およびO25K5H1のwzzB遺伝子を高コピーのPCR−Blunt IIクローニングベクターにサブクローニングし、電気穿孔によって両方の株に導入した。さらに、E.coli K−12およびS.enterica血清亜型Typhimurium LT2のwzzB遺伝子、また、E.coli O25K5H1、GAR 2401、O25a ETEC NR−5、O157:H7:K−およびS.enterica血清亜型Typhimurium LT2のfepE遺伝子も、同様にクローニングし、移入した。
初期のE.coli株の構築はO25血清型に重点を置いた。目的は、異種wzzB遺伝子またはfepE遺伝子を過剰発現させて、これらがO25 wzzBノックアウト株において鎖長を増加させるかどうかを確認することであった。まず、血液分離株をPCRによってスクリーニングして、O25aおよびO25bサブタイプの株を同定した。次に、アンピシリンに対する感受性について株をスクリーニングした。単一のアンピシリン感受性O25b分離株GAR2401が同定され、これにwzzB欠失を導入した。同様に、O25a株O25K5H1にwzzB欠失を行った。これらの変異の遺伝的相補性のために、GAR2401およびO25K5H1のwzzB遺伝子を高コピーのPCR−Blunt IIクローニングベクターにサブクローニングし、電気穿孔によって両方の株に導入した。さらに、E.coli K−12およびS.enterica血清亜型Typhimurium LT2のwzzB遺伝子、また、E.coli O25K5H1、GAR 2401、O25a ETEC NR−5、O157:H7:K−およびS.enterica血清亜型Typhimurium LT2のfepE遺伝子も、同様にクローニングし、移入した。
細菌をLB培地で一晩増殖させ、LPSをフェノールで抽出し、SDS PAGE(4〜12%アクリルアミド)によって分解し、染色した。各ウェルのゲルに、同数の細菌細胞(およそ2OD600単位)から抽出したLPSをロードした。天然E.coli LPSの内部標準から、鎖長の広い分布を示す(1つの繰り返し単位だけ異なる)サンプルのサブセットから識別可能なラダーを数えることにより、LPSのサイズを推定した。図13Aの左側には、O25a O25K5HΔwzzBのプラスミド形質転換体のLPSプロファイルが示され、右側には、O25b GAR 2401ΔwzzB形質転換体の類似したプロファイルが示されている。図13Bには、O25特異的血清でプローブした複製ゲルのイムノブロットが示されている。
この実験の結果は、E.coli O25aΔwzzB宿主への相同wzzB遺伝子の導入が、Salmonella LT2 wzzBと同様に、短鎖O25 LPS(10〜20倍)の発現を回復させることを示す。GAR2401のO25b wzzB遺伝子の導入は短鎖O25 LPSの発現を回復させないため、この株のWzzB酵素に欠損があることが示唆される。E.coli WzzBアミノ酸配列の比較は、A210EおよびP253S置換が関与しうることを示唆する。意義深いことに、O25a O25K5H1におけるSalmonella LT2 fepEおよびE.coli fepEは、超長鎖(VL)OAg LPSを発現する能力をもたらし、Salmonella LT2 fepEは、E.coli fepEによってもたらされたサイズを超えるOAgをもたらした。
同様の発現パターンがGAR2401ΔwzzB形質転換体でも観察された。E.coli O25aまたはK12株のwzzBは、短鎖LPSを産生する能力を回復させた。Salmonella LT2 fepEは最も長いLPSを生成し、E.coli fepEはわずかに短いLPSを生成し、Salmonella LT2 wzzBは中間サイズの長さのLPS(L)をもたらした。他のE.coli fepE遺伝子の超長鎖LPS産生能力を、E.coli O25aΔwzzBの形質転換体を用いた別の実験で評価した。GAR2401、O25a ETEC株、およびO157 Shigella毒素産生株のfepE遺伝子も、超長鎖LPSを産生する能力をもたらしたが、Salmonella LT2 fepEによって生成されたLPSほど長くはなかった(図14)。
血清型O25aおよびO25b株において、Salmonella LT2 fepEが、評価したポリメラーゼ調節因子の最も長いLPSを生成することを確立したので、本発明者らは次に、これが他のE.coli血清型でも超長鎖LPSを産生するかどうかの決定を目指した。血清型O1、O2、O6、O15、およびO75の野生型菌血症分離株をSalmonella fepEプラスミドで形質転換し、LPSを抽出した。図15に示される結果は、Salmonella fepEが、血液感染に関連する他の普遍的な血清型で超長鎖LPSを作る能力をもたらしうることを裏付ける。この結果は、Salmonella fepEのプラスミドに基づく発現が、これらの株で内在性wzzBによって通常発揮される鎖長の制御を無効にするようであることも示す。
1.2. 共通のE.coli宿主株におけるO抗原のプラスミドに基づく発現。
バイオプロセス開発の観点からすれば、複数の株ではなく共通のE.coli宿主において異なる血清型のO抗原を産生する能力は、個々の抗原の製造を大幅に簡略化するであろう。この目的のために、異なる血清型のO抗原遺伝子クラスターをPCRによって増幅し、アラビノース調節プロモーターの制御下で低コピー数プラスミド(pBAD33)にクローニングした。このプラスミドは、異なる(p15a)レプリコンおよび異なる選択可能マーカー(クロラムフェニコール対カナマイシン)を保有するため、E.coliにおいてSalmonella LT2 fepEプラスミドと適合する(共存することができる)。第1の実験では、pBAD33 O25bオペロンプラスミドサブクローンをSalmonella LT2 fepEプラスミドとともにGAR2401ΔwzzBにコトランスフェクトし、0.2%アラビノースの存在下または非存在下で形質転換体を増幅させた。図16A〜16Bに示される結果は、超長鎖O抗原LPSがアラビノース依存性様式で産生されたことを示した。
バイオプロセス開発の観点からすれば、複数の株ではなく共通のE.coli宿主において異なる血清型のO抗原を産生する能力は、個々の抗原の製造を大幅に簡略化するであろう。この目的のために、異なる血清型のO抗原遺伝子クラスターをPCRによって増幅し、アラビノース調節プロモーターの制御下で低コピー数プラスミド(pBAD33)にクローニングした。このプラスミドは、異なる(p15a)レプリコンおよび異なる選択可能マーカー(クロラムフェニコール対カナマイシン)を保有するため、E.coliにおいてSalmonella LT2 fepEプラスミドと適合する(共存することができる)。第1の実験では、pBAD33 O25bオペロンプラスミドサブクローンをSalmonella LT2 fepEプラスミドとともにGAR2401ΔwzzBにコトランスフェクトし、0.2%アラビノースの存在下または非存在下で形質転換体を増幅させた。図16A〜16Bに示される結果は、超長鎖O抗原LPSがアラビノース依存性様式で産生されたことを示した。
他の血清型からクローニングされたO抗原遺伝子クラスターも同様に評価した。この結果を図17に示す。Salmonella LT2 fepEおよびpBAD33−OAgプラスミドの同時発現は、O1、O2(4つのうち2つのクローン)、O16、O21、およびO75の各血清型に対応する検出可能な長鎖LPSをもたらした。理由は明らかではないが、pBAD33−O6プラスミドは、試験した4つすべての分離株で検出可能なLPSを産生できなかった。発現レベルは様々であったが、この結果は、共通の宿主における長鎖O抗原の発現が実現可能であることを示す。しかしながら、場合によっては、発現を向上させるために、例えばプラスミドプロモーター配列の修飾による、さらなる最適化が必要でありうる。
Salmonella LT2 fepEプラスミドありまたはなしの、異なる血清型O25 E.coli株のLPSのプロファイルを、図18に示す。O抗原の発酵、抽出、および精製について、天然の短鎖O25b OAgの産生のためのGAR2831と、長鎖O25b OAgの産生のためのGAR2401ΔwzzB/fepEとの2つの株を研究した。図18のSDS−PAGEゲルに示される、対応する短鎖型および長鎖型のLPSは、赤で強調されている。酢酸を用いて発酵した細菌から多糖を直接抽出し、精製した。精製された短鎖および長鎖または超長鎖のO25b多糖のサイズ排除クロマトグラフィプロファイルを、図19A〜19Bに示す。2ロットの短鎖多糖(GAR2831由来)の特性が、単一の超長鎖多糖調製物(株GAR2401ΔwzzB/fepE由来)と比較されている。長鎖O抗原の分子質量は、短鎖O抗原の分子質量と比べて3.3倍高く、繰り返し単位数は、約65(超長鎖)対約20と推定された。表13を参照されたい。
従来の還元的アミノ化プロセスを使用し、超長鎖O25b O抗原多糖をジフテリアトキソイドCRM197にコンジュゲートした。中(5.5%)、低(4.4%)、および高(8.3%)の異なる過ヨウ素酸活性化度で、3つの異なるロットのグリココンジュゲートを調製した。結果として得られた調製物およびコンジュゲートされていない多糖には、内毒素の混入がないことが示された(表14)。
一群4匹のウサギ(New Zealand White雌)のそれぞれに、図20Aに示すスケジュールに従い、10mcgのグリココンジュゲートおよび20mcgのQS21アジュバントを接種し、血清をサンプリングした(VAC−2017−PRL−EC−0723)。10mcg用量は、細菌グリココンジュゲートの評価でウサギに慣例的に投与される範囲において低い方であることは特筆に値する(20〜50mcgがより典型的である)。別の研究(VAC−2017−PRL−GB−0698)では、同じ用量(多糖10mcg+QS21アジュバント20mcg)および同一の投与スケジュールを使用して、一群のウサギにコンジュゲートされていない多糖も接種した。
3つのO25bグリココンジュゲート調製物に対するウサギの抗体応答をLUMINEXアッセイで評価した。このアッセイでは、コンジュゲートされていないO25b長鎖多糖に予め結合した、メチル化したヒト血清アルブミンをカルボキシビーズにコーティングした。血清サンプル中のO25b特異的IgG抗体の存在を、フィコエリトリン(PE)で標識した抗IgG二次抗体で検出した。最も良好に応答したウサギ(各群4匹中1匹)から第0週(免疫前)、第6週(2投与後(post−dose 2)、PD2)、第8週(3投与後、PD3)、および第12週(4投与後、PD4)でサンプリングした血清において観察された免疫応答のプロファイルを図21A〜21Cに示す。12匹のウサギのいずれからも、有意な免疫前血清IgG力価は検出されなかった。対照的に、接種後のウサギの血清では、3群すべてでO25b抗原特異的抗体応答が検出され、低活性化グリココンジュゲート群の応答は、中活性化グリココンジュゲート群または高活性化グリココンジュゲート群よりもわずかに高い傾向にあった。最大の応答は、3投与後の時点までに観察された。低活性化群のウサギ1匹および高活性化群のウサギ1匹は、接種に応答しなかった(ノンレスポンダー)。
CRM197担体タンパク質コンジュゲーションが長鎖O25b OAg多糖の免疫原性に及ぼす影響を評価するために、コンジュゲートされていない多糖を接種したウサギの血清中の抗体の存在を、低活性化CRM197グリココンジュゲートを接種したウサギの血清と比較した(図22A〜22F)。注目すべきことに、遊離多糖には免疫原性がなく、免疫前血清と比べて免疫血清ではIgG応答を実質的に生じさせなかった(図22A)。対照的に、一連の血清希釈度(1:100〜1:6400)で、O25b OAg−CRM197を接種したウサギ4匹中3匹のPD4血清中では、免疫前血清レベルのおよそ10倍高いO25b OAg特異的IgGの平均蛍光強度値(MFI)が観察された。これらの結果は、10mcgの用量レベルでO25b OAg多糖に対するIgG抗体を生成する担体タンパク質コンジュゲーションの必要性を示す。
TSAプレートで増殖させた細菌を、PBSに懸濁し、OD600を2.0に調整し、4%パラホルムアルデヒドを含むPBSで固定した。4%BSA/PBSで1時間ブロッキングした後、2%BSA/PBS中の免疫前血清およびPD3免疫血清の段階希釈物とともに細菌をインキュベートし、結合したIgGをPE標識二次F(ab)抗体で検出した。
O25b OAg−CRM197により生じたO25b抗体の特異性が、インタクトな細菌を用いたフローサイトメトリー実験で示された。Accuriフローサイトメーターで、PEコンジュゲートF(ab’)2断片ヤギ抗ウサギIgGにより、全細胞へのIgGの結合が検出された。
図23A〜23Cに示されるように、免疫前ウサギ抗体は、野生型血清型O25b分離株のGAR2831およびGAR2401またはK−12 E.coli株に結合できなかったが、対応するPD3抗体は、濃度依存的様式でO25b菌を染色した。OAgを発現する能力を欠く陰性対照のK−12株は、PD3抗体の極めて弱い結合しか示さなかった。これは、その表面に露出した内側コアオリゴ糖エピトープが存在することに起因する可能性が極めて高い。野生型O25b分離株へのSalmonella fepEプラスミドの導入は、大幅に向上した染色をもたらし、このことは、より長いOAg多糖によりもたらされる免疫原性エピトープの密度が比較的高いことと整合する。
結論:記載した結果は、Salmonella fepEがSalmonella種における超長鎖O抗原多糖の決定要因であるだけでなく、超長鎖OAgを作る能力を異なるO抗原血清型のE.coli株に与えることもできることを示す。この特性は、精製および適切な担体タンパク質への化学的コンジュゲーションを容易にし、より分子量の高い複合体の形成によって免疫原性を潜在的に向上させることにより、バイオプロセス開発のための特性が向上したO抗原ワクチン多糖を生成するために活用されうる。
初期ウサギ研究は、RAC O25b OAg−CRM197に対する第1のポリクローナル抗体試薬およびIgG応答を生成した。
過ヨウ素酸酸化を使用した後、還元的アミノ化化学(RAC)を使用したコンジュゲーションを行うことで、長鎖O25b多糖−CRM197コンジュゲートを生成した(表14)。表24も参照されたい。
過ヨウ素酸酸化を使用した後、還元的アミノ化化学(RAC)を使用したコンジュゲーションを行うことで、長鎖O25b多糖−CRM197コンジュゲートを生成した(表14)。表24も参照されたい。
ウサギ研究1(VAC−2017−PRL−EC−0723)(上記の実施例13にも記載)では、ウサギ5匹/群に、図20Aに示されるスケジュールに従い、低(L)活性化、中(M)活性化、または高(H)活性化RAC各10μg(+QS21)を含む組成物を投与した。コンジュゲートされていない遊離O25b多糖には免疫原性がないことが、後続のウサギ研究(VAC−2017−PRL−GB−0698)において観察された(図25を参照されたい)。
ウサギ研究2(VAC−2018−PRL−EC−077)では、ウサギ2匹/群に、図20Bに示されるスケジュールに従い、L−RAC(AlOH3、QS21、またはアジュバントなし)を含む組成物を投与した。
ウサギ4−1、4−2、5−1、5−2、6−1、および6−2には、実施例13に記載した超長鎖のコンジュゲートされていないO25b多糖を投与し、第18週の血清を試験した。
より詳細には、ウサギ4−1には、コンジュゲートされていないO25b 50μg、AlOH3アジュバント100μgを含む組成物を投与した。ウサギ4−2には、コンジュゲートされていないO25b 50μg、AlOH3アジュバント100μgを含む組成物を投与した。ウサギ5−1には、コンジュゲートされていないO25b 50μg、QS−21アジュバント50μgを含む組成物を投与した。ウサギ5−2には、コンジュゲートされていないO25b 50μg、QS−21アジュバント50μgを含む組成物を投与した。ウサギ6−1には、コンジュゲートされていないO25b 50μgを含み、アジュバントを含まない組成物を投与した。ウサギ6−2には、コンジュゲートされていないO25b 50μgを含み、アジュバントを含まない組成物を投与した。
O25b RACコンジュゲートを用いたウサギ研究:dLIA血清希釈力価
ウサギ研究2(VAC−2018−PRL−EC−077):研究1(VAC−2017−PRL−EC−0723)で最も良好に応答したウサギに対する、O25b dLIA血清希釈力価。これらの実験では、改変された直接結合Luminexアッセイを実施した。このアッセイでは、先述のメチル化した血清アルブミン長鎖O抗原混合物の代わりに、O25b長鎖O抗原のポリリジンコンジュゲートをLuminexカルボキシビーズに受動的に吸着させた。ポリリジン−O25bコンジュゲートの使用は、アッセイの感度およびIgG濃度依存的応答の質を向上させ、曲線の当てはめ(4つのパラメータを用いる非線形方程式)の使用による血清希釈力価の決定を可能にした。表15では、第1の研究における最も力価の高いウサギ血清中のO25b IgG力価を、第2の研究のウサギの血清と比較している。
ウサギ研究2(VAC−2018−PRL−EC−077):研究1(VAC−2017−PRL−EC−0723)で最も良好に応答したウサギに対する、O25b dLIA血清希釈力価。これらの実験では、改変された直接結合Luminexアッセイを実施した。このアッセイでは、先述のメチル化した血清アルブミン長鎖O抗原混合物の代わりに、O25b長鎖O抗原のポリリジンコンジュゲートをLuminexカルボキシビーズに受動的に吸着させた。ポリリジン−O25bコンジュゲートの使用は、アッセイの感度およびIgG濃度依存的応答の質を向上させ、曲線の当てはめ(4つのパラメータを用いる非線形方程式)の使用による血清希釈力価の決定を可能にした。表15では、第1の研究における最も力価の高いウサギ血清中のO25b IgG力価を、第2の研究のウサギの血清と比較している。
第2のウサギ研究における比較的高い用量(10μgに対して50/20μg)は、IgG力価を向上させなかった。
2か月の休止は、IgG応答を高める(より短い間隔では観察されない)。
2か月の休止は、IgG応答を高める(より短い間隔では観察されない)。
ミョウバンは、QS21を用いた場合またはアジュバントなしの場合と比較して、ウサギにおけるIgG応答を増強させるようである。
仔ウサギ補体(BRC)および好中球源としてのHL60細胞を用いたオプソニン食作用アッセイ(OPA)を確立して、O抗原グリココンジュゲートの機能的免疫原性を測定した。予め凍結させたE.coli GAR2831菌ストックを、37℃のLuriaブロス(LB)培地で増殖させた。細胞をペレット化し、20%グリセロールを補ったPBS1ml当たり1OD600単位の濃度に懸濁し、凍結させた。予め滴定し、解凍した細菌を、1%ゼラチンを含むHBSS(ハンクス平衡塩類溶液)中で0.5×105CFU/mlに希釈し、10μL(103CFU)をU底組織培養マイクロプレートで段階希釈血清20μLと混合し、この混合物を5%CO2インキュベーターにて37℃で30分、700rpm(BELLCO Shaker)で振とうした。2.5%補体10μl(仔ウサギ血清、PEL−FREEZ 31061−3、HBGに予め希釈した)と、HL−60細胞20μL(0.75×107/ml)と、HBG 40μLとをU底組織培養マイクロプレートに加え、この混合物を、5%CO2インキュベーターにて37℃で45分、700rpm(BELLCO Shaker)で振とうした。その後、水100μLを適用し、フィルターを真空処理し、150μLの50%LBを適用することにより準備した、予め湿らせたMILLIPORE MULTISCREENHTS HVフィルタープレートの対応するウェルに、各反応物100μLのうち10μLを移した。フィルタープレートを真空濾過し、5%CO2インキュベーターにて37℃で一晩インキュベートした。翌日、固定、COOMASSIE色素による染色、および脱染液による脱染の後、IMMUNOSPOT(登録商標)アナライザーおよびIMMUNOCAPTUREソフトウェアを使用し、コロニーを計数した。OPA活性の特異性を確立するために、免疫血清を、OPA反応において他のアッセイ成分と合わせる前に、精製された長鎖O25b O抗原100μg/mLとともにプレインキュベートした。OPAアッセイは、観察される殺傷のHL60細胞または補体への依存性を示すために、これらの成分を含まない対照反応物を含む。
仔ウサギ補体(BRC)および好中球源としてのHL60細胞を用いたオプソニン食作用アッセイ(OPA)を確立して、O抗原グリココンジュゲートの機能的免疫原性を測定した。予め凍結させたE.coli GAR2831菌ストックを、37℃のLuriaブロス(LB)培地で増殖させた。細胞をペレット化し、20%グリセロールを補ったPBS1ml当たり1OD600単位の濃度に懸濁し、凍結させた。予め滴定し、解凍した細菌を、1%ゼラチンを含むHBSS(ハンクス平衡塩類溶液)中で0.5×105CFU/mlに希釈し、10μL(103CFU)をU底組織培養マイクロプレートで段階希釈血清20μLと混合し、この混合物を5%CO2インキュベーターにて37℃で30分、700rpm(BELLCO Shaker)で振とうした。2.5%補体10μl(仔ウサギ血清、PEL−FREEZ 31061−3、HBGに予め希釈した)と、HL−60細胞20μL(0.75×107/ml)と、HBG 40μLとをU底組織培養マイクロプレートに加え、この混合物を、5%CO2インキュベーターにて37℃で45分、700rpm(BELLCO Shaker)で振とうした。その後、水100μLを適用し、フィルターを真空処理し、150μLの50%LBを適用することにより準備した、予め湿らせたMILLIPORE MULTISCREENHTS HVフィルタープレートの対応するウェルに、各反応物100μLのうち10μLを移した。フィルタープレートを真空濾過し、5%CO2インキュベーターにて37℃で一晩インキュベートした。翌日、固定、COOMASSIE色素による染色、および脱染液による脱染の後、IMMUNOSPOT(登録商標)アナライザーおよびIMMUNOCAPTUREソフトウェアを使用し、コロニーを計数した。OPA活性の特異性を確立するために、免疫血清を、OPA反応において他のアッセイ成分と合わせる前に、精製された長鎖O25b O抗原100μg/mLとともにプレインキュベートした。OPAアッセイは、観察される殺傷のHL60細胞または補体への依存性を示すために、これらの成分を含まない対照反応物を含む。
両方のウサギ研究の代表的なウサギから得た対応する免疫前および接種後の血清サンプルをアッセイで評価し、血清希釈力価を決定した(表16、図26A〜26B)。コンジュゲートされていないO25b長鎖O抗原多糖とのプレインキュベーションは、殺菌活性をブロックし、OPAの特異性を示した(図19C、表16、OPA力価)。
ウサギ2−3への投与は次のように行った。ウサギ2−3への投与:10/10/10/10μgのRACコンジュゲート+QS21、4投与後(PD4)に採血。ウサギ1−2への投与は次のように行った。50/20/20/20μgのRACコンジュゲート+Al(OH)3、PD4採血。
コンジュゲートされていないO25b長鎖O抗原多糖、および得られたO25b RAC/DMSO長鎖O抗原グリココンジュゲートにより生じるO抗原O25b IgGレベル。
第0週、第5週、および第13週において、一群10匹のCD−1マウスに、1匹当たり0.2μgまたは2.0μgのO25b RAC/DMSO長鎖O抗原グリココンジュゲートを皮下注射し、免疫原性試験のため、第3週(1投与後、PD1)、第6週(2投与後、PD2)、および第13週(3投与後、PD3)の各時点で採血した。O25b特異的マウスmAbを内部標準として用いる定量的Luminexアッセイ(詳細については実施例15を参照のこと)により、抗原特異的IgGのレベルを決定した。ベースラインのIgGレベル(点線)は、ランダムに選択された接種をしていないマウス20匹からプールされた血清で決定した。コンジュゲートされていない遊離O25b長鎖O抗原多糖免疫原は、いずれの時点でもベースラインレベルを超えるIgGを誘発しなかった。対照的に、O25b−CRM197 RAC長鎖コンジュゲートグリココンジュゲートでは、2回の投与後にIgG応答が観察された。堅実で均一なIgG応答がPD3までに観察され、PD2では中等度かつより可変性の高いIgGレベルが観察された。GMT IgG値(ng/ml)は95%CIエラーバーとともに示されている。図27A〜27Cを参照されたい。
O25b仔ウサギ補体(BRC)のOPA特異性。
A−B)ウサギ2−3および1−2のO25b RAC/DMSO長鎖O抗原免疫後の血清は、殺菌性OPA活性を示す(しかし、対応する免疫前の対照血清はこれを示さない)。C)ウサギ1−2の免疫血清のOPA活性は、長鎖O抗原O25b多糖100μg/mLとのプレインキュベーションによってブロックされた。株GAR2831の細菌をHL60、2.5%BRC、および血清の段階希釈物とともに1時間37℃でインキュベートし、フィルタープレート上の微小コロニー(CFU)を数えることにより、生存した細菌を計数した。図26A〜26Cを参照されたい。
A−B)ウサギ2−3および1−2のO25b RAC/DMSO長鎖O抗原免疫後の血清は、殺菌性OPA活性を示す(しかし、対応する免疫前の対照血清はこれを示さない)。C)ウサギ1−2の免疫血清のOPA活性は、長鎖O抗原O25b多糖100μg/mLとのプレインキュベーションによってブロックされた。株GAR2831の細菌をHL60、2.5%BRC、および血清の段階希釈物とともに1時間37℃でインキュベートし、フィルタープレート上の微小コロニー(CFU)を数えることにより、生存した細菌を計数した。図26A〜26Cを参照されたい。
RACおよびeTEC O25b長鎖グリココンジュゲートは、単一末端グリココンジュゲートよりも免疫原性が高い。
カルバペネム耐性フルオロキノロン耐性MDR株Atlas187913を用いたBRC OPAアッセイ。一群20匹のCD−1マウスに、図28A〜28Bに示したものと同じスケジュールに従い、2μgのグリココンジュゲートを接種し、OPA応答を2投与後(PD2)(図28A)および3投与後(PD3)(図28B)の各時点で決定した。バーは95%CIのGMTを示す。接種をしていないベースラインを超えるレスポンダー率が示されている。Welch補正を用いた独立t検定(Graphpad Prism)を使用し、異なる群のログ変換データを評価して、差が統計的に有意であったかどうかを評価した。結果を表17にまとめる。図28A〜28Bを参照されたい。eTEC O1a長鎖グリココンジュゲート2μgを接種したマウスでは、PD2およびPD3のO1aに対するOPA力価(データは示さない)は、それぞれ、表17に示す、PD2およびPD3のO25bに対するOPA力価よりも高いことが観察された。
カルバペネム耐性フルオロキノロン耐性MDR株Atlas187913を用いたBRC OPAアッセイ。一群20匹のCD−1マウスに、図28A〜28Bに示したものと同じスケジュールに従い、2μgのグリココンジュゲートを接種し、OPA応答を2投与後(PD2)(図28A)および3投与後(PD3)(図28B)の各時点で決定した。バーは95%CIのGMTを示す。接種をしていないベースラインを超えるレスポンダー率が示されている。Welch補正を用いた独立t検定(Graphpad Prism)を使用し、異なる群のログ変換データを評価して、差が統計的に有意であったかどうかを評価した。結果を表17にまとめる。図28A〜28Bを参照されたい。eTEC O1a長鎖グリココンジュゲート2μgを接種したマウスでは、PD2およびPD3のO1aに対するOPA力価(データは示さない)は、それぞれ、表17に示す、PD2およびPD3のO25bに対するOPA力価よりも高いことが観察された。
eTEC化学のOPA免疫原性は、多糖活性化レベルの変化によって向上しうる。
カルバペネム耐性フルオロキノロン耐性MDR株Atlas187913を用いたBRC OPAアッセイ。一群20匹のCD−1マウスに、示される長鎖O25b eTECグリココンジュゲート0.2μgまたは2μgを接種し、PD2時点のOPA応答を決定した。Welch補正を用いた独立t検定(Graphpad Prism)を使用し、4%活性化群と17%活性化群との集約したログ変換データを評価して、OPA応答の差が統計的に有意であったことを確認した。個々の群のGMTおよびレスポンダー率を表18にまとめる。図29を参照されたい。
カルバペネム耐性フルオロキノロン耐性MDR株Atlas187913を用いたBRC OPAアッセイ。一群20匹のCD−1マウスに、示される長鎖O25b eTECグリココンジュゲート0.2μgまたは2μgを接種し、PD2時点のOPA応答を決定した。Welch補正を用いた独立t検定(Graphpad Prism)を使用し、4%活性化群と17%活性化群との集約したログ変換データを評価して、OPA応答の差が統計的に有意であったことを確認した。個々の群のGMTおよびレスポンダー率を表18にまとめる。図29を参照されたい。
負荷試験は、長鎖E.coli O25b eTECコンジュゲートが3回の投与後に防御を生じることを示す。
示されたスケジュールに従い、2μg用量で免疫処置した一群20匹のCD−1マウスに、株GAR2831の細菌1×109個を腹腔内(IP)負荷した。その後の生存率を6日間モニタリングした。4%、10%または17%のレベルで活性化されたeTECグリココンジュゲートを接種したマウス群は致死的な感染から防御されたが、接種をしていない対照マウスまたはコンジュゲートされていないO25b長鎖多糖2μgを接種したマウスは防御されなかった。図30A〜30Bを参照されたい。
示されたスケジュールに従い、2μg用量で免疫処置した一群20匹のCD−1マウスに、株GAR2831の細菌1×109個を腹腔内(IP)負荷した。その後の生存率を6日間モニタリングした。4%、10%または17%のレベルで活性化されたeTECグリココンジュゲートを接種したマウス群は致死的な感染から防御されたが、接種をしていない対照マウスまたはコンジュゲートされていないO25b長鎖多糖2μgを接種したマウスは防御されなかった。図30A〜30Bを参照されたい。
eTEC結合グリココンジュゲートの調製プロセス
糖類の活性化およびシスタミン二塩酸塩によるチオール化。糖類を無水ジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成する。溶液の含水量はKarl Fischer(KF)解析によって決定し、0.1〜1.0%、典型的には0.5%の含水量に達するように調整する。
糖類の活性化およびシスタミン二塩酸塩によるチオール化。糖類を無水ジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成する。溶液の含水量はKarl Fischer(KF)解析によって決定し、0.1〜1.0%、典型的には0.5%の含水量に達するように調整する。
活性化を開始するには、1,1’−カルボニル−ジ−1,2,4−トリアゾール(CDT)または1,1’−カルボニルジイミダゾール(CDI)の溶液をDMSO中100mg/mLの濃度で新たに調製する。糖類を様々な量のCDT/CDI(1〜10モル当量)で活性化させ、反応を室温または35℃で1〜5時間続ける。活性化反応液中にCDI/CDTが残存していた場合は水を加えてクエンチした。計算を行って加える水の量を決定し、最終的な含水量を水溶液全体の2〜3%にする。反応を室温で0.5時間にわたって続けた。シスタミン二塩酸塩を、50mg/mLの濃度で無水DMSO中において新たに調製する。活性化型糖類を1〜2mol当量のシスタミン二塩酸塩と反応させる。あるいは、活性化型糖類を1〜2mol当量のシステアミン塩酸塩と反応させる。チオール化反応を室温で5〜20時間続けて、チオール化糖類を生成する。加えたCDT/CDIの量により、チオール化レベルを決定する。
活性化型チオール化糖類の還元および精製。チオール化糖類の反応混合物に、3〜6mol当量のトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)溶液を加え、室温で3〜5時間反応させる。次いでこの反応混合物を、予め冷却した10mM一塩基性リン酸ナトリウムに添加することによって5〜10倍に希釈し、5μmフィルターで濾過する。30〜40倍の透析濾過容量の予め冷却した10mM一塩基性リン酸ナトリウムに対して、チオール化糖類の透析濾過を行う。活性化型チオール化糖類残余分のアリコートを取り、糖類濃度およびチオール含量を決定する(Ellmanアッセイ)。
ブロモアセチル化担体タンパク質の活性化および精製。担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BAANS)、ブロモアセチルブロミド、または別の好適な試薬などのブロモアセチル化剤との反応によってブロモアセチル化する。
担体タンパク質(0.1Mリン酸ナトリウム中、pH8.0±0.2)を、活性化前に、まず約pH7で8±3℃に保つ。このタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BAANS)をジメチルスルホキシド(DMSO)ストック溶液(20mg/mL)として0.25〜0.5のBAANS:タンパク質比(w/w)で加える。この反応物を5±3℃で30〜60分間穏やかに混合する。結果として得られたブロモアセチル化(活性化)タンパク質を、例えば、10mMリン酸バッファー(pH7.0)を使用し、10kDa MWCOの膜を使用した限外濾過/透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度をLowryタンパク質アッセイによって推定する。
活性化の程度を、抑制伝導率検出と連動したイオン交換液体クロマトグラフィ(イオンクロマトグラフィ)による全ブロミドアッセイによって決定する。活性化したブロモアセチル化タンパク質に結合したブロミドをアッセイサンプル調製物中のタンパク質から切断し、存在しうるあらゆる遊離ブロミドとともに定量化する。タンパク質に共有結合した残存するブロミドがあれば、サンプルをアルカリ性2−メルカプトエタノール中で加熱することにより、臭化物イオンへの変換によって遊離させる。
ブロモアセチル化CRM197の活性化および精製。CRM197をpH7の10mMリン酸緩衝0.9%NaCl(PBS)で5mg/mLに希釈し、次いで、1Mストック溶液を使用してpH7.0の0.1M NaHCO3を作った。DMSO1mL当たり20mgのBAANSストック溶液を使用し、1:0.35(w:w)のCRM197:BAANS比でBAANSを添加した。この反応混合物を3℃〜11℃で30分〜1時間インキュベートしてから、10K MWCOの膜および10mMリン酸ナトリウム/0.9%NaCl(pH7.0)を使用した限外濾過/透析濾過によって精製した。精製された活性化型CRM197をLowryアッセイによりアッセイして、タンパク質濃度を決定し、次いでPBSで5mg/mLに希釈した。スクロースを凍結保護物質として5%重量/体積で添加し、活性化型タンパク質を凍結させ、コンジュゲーションに必要になるまで−25℃で保管した。CRM197のリジン残基のブロモアセチル化は一貫性が非常に高く、利用可能な39個のリジン中15〜25個のリジンの活性化をもたらした。この反応は、高い収量の活性化型タンパク質を生成した。
活性化型チオール化糖類のブロモアセチル化担体タンパク質へのコンジュゲーション。ブロモアセチル化担体タンパク質および活性化型チオール化糖類を後に加える。糖類/タンパク質の投入比は0.8±0.2である。反応物のpHを1M NaOH溶液で9.0±0.1に調整する。コンジュゲーション反応を5℃で20±4時間続ける。
残存する反応性官能基のキャッピング。担体タンパク質の未反応のブロモアセチル化残基を、キャッピング試薬としての2mol当量のN−アセチル−L−システインと3〜5時間5℃で反応させることによってクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を5℃で20〜24時間、4mol当量のヨードアセトアミド(IAA)でキャッピングする。
eTEC結合グリココンジュゲートの精製。コンジュゲーション反応(IAAキャッピング後)混合物を0.45μmフィルターで濾過する。pH6.0の5mMコハク酸−0.9%食塩水に対して、グリココンジュゲートの限外濾過/透析濾過を行う。次いで、グリココンジュゲートの残余分を0.2μmフィルターで濾過する。グリココンジュゲートのアリコートをアッセイのために取る。残りのグリココンジュゲートを5℃で保管する。表21、表22、表23、表24、および表25を参照されたい。
E.coli−O25B eTECコンジュゲートの調製
活性化プロセス:E.coli−O25bリポ多糖の活性化。凍結乾燥したE.coli−O25b多糖を無水ジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成した。凍結乾燥O25b/DMSO溶液の含水量をKarl Fischer(KF)解析によって決定した。0.5%の含水量に達するようにWFIをO25b/DMSO溶液に加えることにより、含水量を調整した。
活性化プロセス:E.coli−O25bリポ多糖の活性化。凍結乾燥したE.coli−O25b多糖を無水ジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成した。凍結乾燥O25b/DMSO溶液の含水量をKarl Fischer(KF)解析によって決定した。0.5%の含水量に達するようにWFIをO25b/DMSO溶液に加えることにより、含水量を調整した。
活性化を開始するために、1,1’−カルボニルジイミダゾール(CDI)を、100mg/mLでDMSO溶液中において新たに調製した。E.coli−O25b多糖を、チオール化ステップの前に様々な量のCDIで活性化させた。CDIでの活性化は、室温または35℃で1〜3時間にわたって行った。活性化反応液中にCDIが残存していた場合は水を加えてクエンチした。計算を行って加える水の量を決定し、最終的な含水量を水溶液全体の2〜3%にする。反応を室温で0.5時間にわたって続けた。
活性化型E.coli−O25b多糖のチオール化。シスタミン二塩酸塩を、無水DMSO中において新たに調製し、活性化型多糖反応液に1〜2mol当量のシスタミン二塩酸塩を添加した。反応を室温で20±4時間にわたって続けた。
活性化型チオール化E.coli−O25b多糖の還元および精製。チオール化糖類の反応混合物に、3〜6mol当量のトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)溶液を加え、室温で3〜5時間反応させた。次いでこの反応混合物を、予め冷却した10mM一塩基性リン酸ナトリウムに添加することによって5〜10倍に希釈し、5μmフィルターで濾過した。5K MWCOの限外濾過膜カセットを用い、40倍の透析濾過容量の予め冷却した10mM一塩基性リン酸ナトリウムに対して、チオール化糖類の透析濾過を行った。チオール化O25b多糖の残余分を、糖類濃度アッセイおよびチオールアッセイ(Ellman)の両方のために取った。活性化プロセスのフロー図を図32Aに提示する。
コンジュゲーションプロセス:チオール化E.coli−O25b多糖のブロモアセチル化CRM197へのコンジュゲーション。実施例21に記載のように、CRM197担体タンパク質をブロモアセチル化により別々に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のために活性化型E.coli−O25b多糖と反応させた。ブロモアセチル化CRM197およびチオール化O25b多糖を反応容器内でひとつに混合した。糖類/タンパク質の投入比は0.8±0.2であった。反応物のpHを8.0〜10.0に調整した。コンジュゲーション反応を5℃で20±4時間続けた。
ブロモアセチル化CRM197およびチオール化E.coli−O25b多糖の反応性基のキャッピング。CRM197タンパク質の未反応のブロモアセチル化残基を、2mol当量のN−アセチル−L−システインと3〜5時間5℃で反応させることによってキャッピングし、その後、チオール化O25b−多糖に遊離スルフヒドリル基が残存していれば、4mol当量のヨードアセトアミド(IAA)により5℃で20〜24時間キャッピングする。
eTEC結合E.coli−O25bグリココンジュゲートの精製。コンジュゲーション溶液を0.45μmまたは5μmのフィルターで濾過した。100K MWCOの限外濾過膜カセットを用い、O25bグリココンジュゲートの透析濾過を行った。pH6.0の5mMコハク酸−0.9%食塩水に対して、透析濾過を行った。次いで、E.coli−O25bグリココンジュゲートの100Kの残余分を、0.22μmフィルターで濾過し、5℃で保管した。
コンジュゲーションプロセスのフロー図を図32Bに提示する。
コンジュゲーションプロセスのフロー図を図32Bに提示する。
結果
いくつかのバッチのE.coli−O25b eTECグリココンジュゲートの反応パラメータおよび特性評価データを表19に示す。CDIでの活性化と、シスタミン二塩酸塩でのチオール化は、41〜92%の糖類収率および<5〜14%の遊離糖類を有するグリココンジュゲートを生成した。表21、表22、表23、表24、および表25も参照されたい。
いくつかのバッチのE.coli−O25b eTECグリココンジュゲートの反応パラメータおよび特性評価データを表19に示す。CDIでの活性化と、シスタミン二塩酸塩でのチオール化は、41〜92%の糖類収率および<5〜14%の遊離糖類を有するグリココンジュゲートを生成した。表21、表22、表23、表24、および表25も参照されたい。
E.coli O抗原多糖−CRM197 eTECコンジュゲートの調製手順(E.coli血清型O25b、O1a、O2、およびO6のO抗原に適用される)
多糖の活性化。
多糖の活性化。
E.coli O抗原多糖を無水ジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成する。活性化を開始するために、様々な量の1,1’−カルボニルジイミダゾール(CDI)(1〜10モル当量)を多糖溶液に添加し、反応を室温または35℃で1〜5時間続ける。次いで、活性化反応液中にCDIが残存していた場合は水(2〜3%、v/v)を加えてクエンチした。反応を室温で0.5時間にわたって続けた後、1〜2mol当量のシスタミン二塩酸塩を添加する。反応を室温で5〜20時間続けてから、3〜6mol当量のトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)で処理して、チオール化糖類を生成する。加えたCDIの量により、チオール化レベルを決定する。
次いでこの反応混合物を、予め冷却した10mM一塩基性リン酸ナトリウムに添加することによって5〜10倍に希釈し、5μmフィルターで濾過する。30〜40倍の透析濾過容量の予め冷却した10mM一塩基性リン酸ナトリウムに対して、チオール化糖類の透析濾過を行う。活性化型チオール化糖類残余分のアリコートを取り、糖類濃度およびチオール含量を決定する(Ellmanアッセイ)。
担体タンパク質(CRM197)の活性化
CRM197(0.1Mリン酸ナトリウム中、pH8.0±0.2)を、活性化前に、まず約pH8で8±3℃に保つ。このタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BAANS)をジメチルスルホキシド(DMSO)ストック溶液(20mg/mL)として0.25〜0.5のBAANS:タンパク質比(w/w)で加える。この反応物を5±3℃で30〜60分間穏やかに混合する。結果として得られたブロモアセチル化(活性化)タンパク質を、例えば、10mMリン酸バッファー(pH7.0)を使用し、10kDa MWCOの膜を使用した限外濾過/透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度をLowryタンパク質アッセイによって推定する。
CRM197(0.1Mリン酸ナトリウム中、pH8.0±0.2)を、活性化前に、まず約pH8で8±3℃に保つ。このタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BAANS)をジメチルスルホキシド(DMSO)ストック溶液(20mg/mL)として0.25〜0.5のBAANS:タンパク質比(w/w)で加える。この反応物を5±3℃で30〜60分間穏やかに混合する。結果として得られたブロモアセチル化(活性化)タンパク質を、例えば、10mMリン酸バッファー(pH7.0)を使用し、10kDa MWCOの膜を使用した限外濾過/透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度をLowryタンパク質アッセイによって推定する。
コンジュゲーション
その後、活性化型CRM197および活性化型E.coli O抗原多糖をリアクターに加え、混合する。糖類/タンパク質の投入比は1±0.2である。反応物のpHを1M NaOH溶液で9.0±0.1に調整する。コンジュゲーション反応を5℃で20±4時間続ける。担体タンパク質の未反応のブロモアセチル化残基を、キャッピング試薬としての2mol当量のN−アセチル−L−システインと3〜5時間5℃で反応させることによってクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を5℃で20〜24時間、4mol当量のヨードアセトアミド(IAA)でキャッピングする。次いで、pH6.0の5mMコハク酸−0.9%食塩水に対して行われる限外濾過/透析濾過を使用して、反応混合物を精製する。次いで、精製されたコンジュゲートを0.2μmフィルターで濾過する。表21、表22、表23、表24、および表25を参照されたい。
その後、活性化型CRM197および活性化型E.coli O抗原多糖をリアクターに加え、混合する。糖類/タンパク質の投入比は1±0.2である。反応物のpHを1M NaOH溶液で9.0±0.1に調整する。コンジュゲーション反応を5℃で20±4時間続ける。担体タンパク質の未反応のブロモアセチル化残基を、キャッピング試薬としての2mol当量のN−アセチル−L−システインと3〜5時間5℃で反応させることによってクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を5℃で20〜24時間、4mol当量のヨードアセトアミド(IAA)でキャッピングする。次いで、pH6.0の5mMコハク酸−0.9%食塩水に対して行われる限外濾過/透析濾過を使用して、反応混合物を精製する。次いで、精製されたコンジュゲートを0.2μmフィルターで濾過する。表21、表22、表23、表24、および表25を参照されたい。
一般的手順−還元的アミノ化化学(RAC)によるO抗原(E.coli血清型O1、O2、O6、25b由来)多糖のコンジュゲーション
ジメチルスルホキシドにおけるコンジュゲーション(RAC/DMSO)
多糖の活性化
100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.0±0.2)において、計算された量の500mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)および注射用水(WFI)を連続的に添加して多糖の最終濃度を2.0g/Lとすることにより、多糖の酸化を行った。必要に応じて、反応物のpHをおよそpH6.0に調整した。pH調整後、反応物の温度を4℃に冷ました。およそ0.09〜0.13モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムの添加により酸化を開始した。酸化反応をおよそ5±3℃で20±4時間行った。
ジメチルスルホキシドにおけるコンジュゲーション(RAC/DMSO)
多糖の活性化
100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.0±0.2)において、計算された量の500mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)および注射用水(WFI)を連続的に添加して多糖の最終濃度を2.0g/Lとすることにより、多糖の酸化を行った。必要に応じて、反応物のpHをおよそpH6.0に調整した。pH調整後、反応物の温度を4℃に冷ました。およそ0.09〜0.13モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムの添加により酸化を開始した。酸化反応をおよそ5±3℃で20±4時間行った。
5K MWCOの限外濾過カセットを使用し、活性化型多糖の濃縮および透析濾過を行った。透析濾過は、20倍の透析濾過容量のWFIに対して行った。次いで、精製された活性化型多糖を5±3℃で保管した。精製された活性化型糖類は、とりわけ、(i)比色アッセイによる糖類濃度、(ii)比色アッセイによるアルデヒド濃度、(iii)酸化度、および(iv)SEC−MALLSによる分子量によって特性評価される。
活性化型多糖とスクロース賦形剤の複合、および凍結乾燥
活性化型多糖をスクロースと複合して、活性化型多糖1グラム当たりスクロース25グラムの比にした。次いで、複合した混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥した活性化型多糖を含むボトルを−20±5℃で保管した。計算された量のCRM197タンパク質を別々にシェル凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥したCRM197を−20±5℃で保管した。
活性化型多糖をスクロースと複合して、活性化型多糖1グラム当たりスクロース25グラムの比にした。次いで、複合した混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥した活性化型多糖を含むボトルを−20±5℃で保管した。計算された量のCRM197タンパク質を別々にシェル凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥したCRM197を−20±5℃で保管した。
凍結乾燥した活性化型多糖および担体タンパク質の再構成
凍結乾燥した活性化型多糖を無水ジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成した。多糖が完全に溶解したら、凍結乾燥したCRM197に等量の無水DMSOを添加して再構成した。
凍結乾燥した活性化型多糖を無水ジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成した。多糖が完全に溶解したら、凍結乾燥したCRM197に等量の無水DMSOを添加して再構成した。
コンジュゲーションおよびキャッピング
再構成された活性化型多糖を、再構成されたCRM197と反応容器内で合わせた後、十分に混合して透明な溶液を得てから、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いたコンジュゲーションを開始した。反応液中の多糖の最終濃度はおよそ1g/Lであった。反応混合物に0.5〜2.0MEqのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、23±2℃で20〜48時間インキュベートすることにより、コンジュゲーションを開始した。2MEqの水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を添加して未反応のアルデヒドをキャッピングすることにより、コンジュゲーション反応を停止させた。このキャッピング反応は、23±2℃で3±1時間にわたって続いた。
再構成された活性化型多糖を、再構成されたCRM197と反応容器内で合わせた後、十分に混合して透明な溶液を得てから、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いたコンジュゲーションを開始した。反応液中の多糖の最終濃度はおよそ1g/Lであった。反応混合物に0.5〜2.0MEqのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、23±2℃で20〜48時間インキュベートすることにより、コンジュゲーションを開始した。2MEqの水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を添加して未反応のアルデヒドをキャッピングすることにより、コンジュゲーション反応を停止させた。このキャッピング反応は、23±2℃で3±1時間にわたって続いた。
コンジュゲートの精製
コンジュゲート溶液を、冷却した5mMコハク酸−0.9%食塩水(pH6.0)で1:10に希釈し、100〜300K MWCOの膜を使用した接線流濾過による精製の準備をした。希釈したコンジュゲート溶液を5μmフィルターに通し、5mMコハク酸/0.9%食塩水(pH6.0)を媒体として使用して透析濾過を行った。透析濾過が完了した後、コンジュゲート残余分を0.22μmフィルターに通して移した。コンジュゲートをおよそ0.5mg/mLの標的糖類濃度まで5mMコハク酸/0.9%食塩水(pH6)でさらに希釈した。あるいは、20mMヒスチジン−0.9%食塩水(pH6.5)を使用し、100〜300K MWCOの膜を使用した接線流濾過により、コンジュゲートを精製する。最終の0.22μm濾過ステップを完了して、免疫原性コンジュゲートを得た。表21、表22、表23、表24、および表25を参照されたい。
コンジュゲート溶液を、冷却した5mMコハク酸−0.9%食塩水(pH6.0)で1:10に希釈し、100〜300K MWCOの膜を使用した接線流濾過による精製の準備をした。希釈したコンジュゲート溶液を5μmフィルターに通し、5mMコハク酸/0.9%食塩水(pH6.0)を媒体として使用して透析濾過を行った。透析濾過が完了した後、コンジュゲート残余分を0.22μmフィルターに通して移した。コンジュゲートをおよそ0.5mg/mLの標的糖類濃度まで5mMコハク酸/0.9%食塩水(pH6)でさらに希釈した。あるいは、20mMヒスチジン−0.9%食塩水(pH6.5)を使用し、100〜300K MWCOの膜を使用した接線流濾過により、コンジュゲートを精製する。最終の0.22μm濾過ステップを完了して、免疫原性コンジュゲートを得た。表21、表22、表23、表24、および表25を参照されたい。
E.coli血清型O25B、O1A、O2、およびO6に適用される、水性バッファーにおけるコンジュゲーション(RAC/水性)
多糖の活性化および透析濾過を、DMSOに基づくコンジュゲーションのためのものと同じ様式で行った。
多糖の活性化および透析濾過を、DMSOに基づくコンジュゲーションのためのものと同じ様式で行った。
濾過した活性化型糖類を、血清型に応じて0.4〜2w/wの範囲の多糖対タンパク質の質量比で、CRM197と複合した。この投入比は、結果として得られるコンジュゲートの多糖対CRM197比を制御するように選択した。
次いで、複合した混合物を凍結乾燥した。コンジュゲーション後、多糖とタンパク質の混合物を、血清型に応じて5〜25g/Lの範囲の多糖濃度で0.1Mリン酸ナトリウムバッファーに溶解し、pHを血清型に応じて6.0〜8.0に調整した。反応混合物に0.5〜2.0MEqのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、23±2℃で20〜48時間インキュベートすることにより、コンジュゲーションを開始した。1〜2MEqの水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を添加して未反応のアルデヒドをキャッピングすることにより、コンジュゲーション反応を停止させた。
あるいは、濾過した活性化型糖類および計算された量のCRM197タンパク質を別々にシェル凍結し、凍結乾燥してから、0.1Mリン酸ナトリウムバッファーに溶解することで合わせ、次いで、後続のコンジュゲーションを上述のように進めてもよい。
E.coli O抗原多糖−CRM197単一末端コンジュゲートの調製手順
グラム陰性菌の外膜の一般的な成分であるリポ多糖(LPS)は、リピドA、コア領域、およびO抗原(O特異的多糖またはO多糖とも呼ばれる)を含む。異なる血清型のO抗原繰り返し単位は、組成、構造、および血清学的特長において異なる。本発明で使用されるO抗原は、その鎖末端において、2−ケト−3−デオキシオクタン酸(KDO)と呼ばれる糖単位を含むコアドメインに結合している。多糖鎖のランダムな活性化(例えば、過ヨウ素酸ナトリウムまたはカルボジイミドによる活性化)に基づくいくつかのコンジュゲーション方法とは異なる。本発明は、ジスルフィドアミンリンカーによるKDOの選択的活性化を含むコンジュゲーションプロセスを開示し、この糖単位は、チオール官能基が露出されると、図31(単一末端コンジュゲートの調製)に示されるように、ブロモ活性化型CRM197タンパク質にコンジュゲートされる。
グラム陰性菌の外膜の一般的な成分であるリポ多糖(LPS)は、リピドA、コア領域、およびO抗原(O特異的多糖またはO多糖とも呼ばれる)を含む。異なる血清型のO抗原繰り返し単位は、組成、構造、および血清学的特長において異なる。本発明で使用されるO抗原は、その鎖末端において、2−ケト−3−デオキシオクタン酸(KDO)と呼ばれる糖単位を含むコアドメインに結合している。多糖鎖のランダムな活性化(例えば、過ヨウ素酸ナトリウムまたはカルボジイミドによる活性化)に基づくいくつかのコンジュゲーション方法とは異なる。本発明は、ジスルフィドアミンリンカーによるKDOの選択的活性化を含むコンジュゲーションプロセスを開示し、この糖単位は、チオール官能基が露出されると、図31(単一末端コンジュゲートの調製)に示されるように、ブロモ活性化型CRM197タンパク質にコンジュゲートされる。
シスタミンリンカー(A1)に基づくコンジュゲーション
O抗原多糖およびシスタミン(KDOの50〜250mol当量)をリン酸バッファー中で混合し、pHを6.0〜7.0に調整した。この混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)(KDOの5〜30mol当量)を添加し、この混合物を37℃で48〜72時間撹拌した。室温に冷まし、等量のリン酸バッファーで希釈した後、混合物をトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(添加したシスタミンの1.2mol当量)で処理した。次いでこの混合物を、5KDa MWCOの膜を使用した10mM一塩基性リン酸ナトリウム溶液に対する透析濾過によって精製して、チオール含有O抗原多糖を得た。チオール含量は、Ellmanアッセイによって決定されうる。
O抗原多糖およびシスタミン(KDOの50〜250mol当量)をリン酸バッファー中で混合し、pHを6.0〜7.0に調整した。この混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)(KDOの5〜30mol当量)を添加し、この混合物を37℃で48〜72時間撹拌した。室温に冷まし、等量のリン酸バッファーで希釈した後、混合物をトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(添加したシスタミンの1.2mol当量)で処理した。次いでこの混合物を、5KDa MWCOの膜を使用した10mM一塩基性リン酸ナトリウム溶液に対する透析濾過によって精製して、チオール含有O抗原多糖を得た。チオール含量は、Ellmanアッセイによって決定されうる。
次いで、上記のチオール活性化型O抗原多糖をブロモ活性化型CRM197タンパク質と0.5〜2.0の比で混合することにより、コンジュゲーションを進めた。反応混合物のpHを1M NaOH溶液で8.0〜10.0に調整する。コンジュゲーション反応を5℃で24±4時間続けた。担体タンパク質の未反応のブロモ残基を、2mol当量のN−アセチル−L−システインと5℃で3〜5時間反応させることによってクエンチした。次いで、3mol当量のヨードアセトアミド(添加したN−アセチル−L−システインに関連する)を加え、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を5℃でさらに3〜5時間続け、1M NaOHの添加によって両方のキャッピングステップのpHを8.0〜10.0に維持した。30KDa MWCOの膜を使用した5mMコハク酸−0.9%食塩水(pH6.0)に対する限外濾過/透析濾過の後に、結果として生じたコンジュゲートを得た。表21、表22、表23、表24、および表25を参照されたい。
3,3’−ジチオビス(プロパン酸ジヒドラジド)リンカー(A4)に基づくコンジュゲーション
O抗原多糖および3,3’−ジチオビス(プロパン酸ジヒドラジド)(KDOの5〜50mol当量)を酢酸バッファー中で混合し、pHを4.5〜5.5に調整した。この混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)(KDOの5〜30mol当量)を添加し、この混合物を23〜37℃で24〜72時間撹拌した。次いでこの混合物を、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(添加した3,3’−ジチオビス(プロパン酸ジヒドラジド)リンカーの1.2mol当量)で処理した。次いでこの混合物を、5KDa MWCOの膜を使用した10mM一塩基性リン酸ナトリウム溶液に対する透析濾過によって精製して、チオール含有O抗原多糖を得た。チオール含量は、Ellmanアッセイによって決定されうる。
O抗原多糖および3,3’−ジチオビス(プロパン酸ジヒドラジド)(KDOの5〜50mol当量)を酢酸バッファー中で混合し、pHを4.5〜5.5に調整した。この混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)(KDOの5〜30mol当量)を添加し、この混合物を23〜37℃で24〜72時間撹拌した。次いでこの混合物を、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(添加した3,3’−ジチオビス(プロパン酸ジヒドラジド)リンカーの1.2mol当量)で処理した。次いでこの混合物を、5KDa MWCOの膜を使用した10mM一塩基性リン酸ナトリウム溶液に対する透析濾過によって精製して、チオール含有O抗原多糖を得た。チオール含量は、Ellmanアッセイによって決定されうる。
次いで、上記のチオール活性化型O抗原多糖をブロモ活性化型CRM197タンパク質と0.5〜2.0の比で混合することにより、コンジュゲーションを進めた。反応混合物のpHを1M NaOH溶液で8.0〜10.0に調整する。コンジュゲーション反応を5℃で24±4時間続けた。担体タンパク質の未反応のブロモ残基を、2mol当量のN−アセチル−L−システインと5℃で3〜5時間反応させることによってクエンチした。次いで、3mol当量のヨードアセトアミド(添加したN−アセチル−L−システインに関連する)を加え、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を5℃でさらに3〜5時間続け、1M NaOHの添加によって両方のキャッピングステップのpHを8.0〜10.0に維持した。30KDa MWCOの膜を使用した5mMコハク酸−0.9%食塩水(pH6.0)に対する限外濾過/透析濾過の後に、結果として生じたコンジュゲートを得た。
2,2’−ジチオ−N,N’−ビス(エタン−2,1−ジイル)ビス(2−(アミノオキシ)アセトアミド)リンカー(A6)に基づくコンジュゲーション
O抗原多糖および2,2’−ジチオ−N,N’−ビス(エタン−2,1−ジイル)ビス(2−(アミノオキシ)アセトアミド)(KDOの5〜50mol当量)を酢酸バッファー中で混合し、pHを4.5〜5.5に調整した。次いでこの混合物を23〜37℃で24〜72時間撹拌し、その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)(KDOの5〜30mol当量)を添加し、この混合物をさらに3〜24時間撹拌した。次いでこの混合物を、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(添加したリンカーの1.2mol当量)で処理した。次いでこの混合物を、5KDa MWCOの膜を使用した10mM一塩基性リン酸ナトリウム溶液に対する透析濾過によって精製して、チオール含有O抗原多糖を得た。チオール含量は、Ellmanアッセイによって決定されうる。
O抗原多糖および2,2’−ジチオ−N,N’−ビス(エタン−2,1−ジイル)ビス(2−(アミノオキシ)アセトアミド)(KDOの5〜50mol当量)を酢酸バッファー中で混合し、pHを4.5〜5.5に調整した。次いでこの混合物を23〜37℃で24〜72時間撹拌し、その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)(KDOの5〜30mol当量)を添加し、この混合物をさらに3〜24時間撹拌した。次いでこの混合物を、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(添加したリンカーの1.2mol当量)で処理した。次いでこの混合物を、5KDa MWCOの膜を使用した10mM一塩基性リン酸ナトリウム溶液に対する透析濾過によって精製して、チオール含有O抗原多糖を得た。チオール含量は、Ellmanアッセイによって決定されうる。
次いで、上記のチオール活性化型O抗原多糖をブロモ活性化型CRM197タンパク質と0.5〜2.0の比で混合することにより、コンジュゲーションを進めた。反応混合物のpHを1M NaOH溶液で8.0〜10.0に調整する。コンジュゲーション反応を5℃で24±4時間続けた。担体タンパク質の未反応のブロモ残基を、2mol当量のN−アセチル−L−システインと5℃で3〜5時間反応させることによってクエンチした。次いで、3mol当量のヨードアセトアミド(添加したN−アセチル−L−システインに関連する)を加え、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を5℃でさらに3〜5時間続け、1M NaOHの添加によって両方のキャッピングステップのpHを8.0〜10.0に維持した。30KDa MWCOの膜を使用した5mMコハク酸−0.9%食塩水(pH6.0)に対する限外濾過/透析濾過の後に、結果として生じたコンジュゲートを得た。
ブロモ活性化型CRM197の調製
CRM197を、0.1Mリン酸ナトリウム、pH8.0±0.2の溶液中において調製し、5±3℃に冷却した。このタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BAANS)をジメチルスルホキシド(DMSO)ストック溶液(20mg/mL)として0.25〜0.5のBAANS:タンパク質比(w/w)で加える。この反応物を5±3℃で30〜60分間穏やかに混合する。結果として得られたブロモアセチル化(活性化)タンパク質を、例えば、10mMリン酸バッファー(pH7.0)を使用し、10kDa MWCOの膜を使用した限外濾過/透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度をLowryタンパク質アッセイによって推定する。
CRM197を、0.1Mリン酸ナトリウム、pH8.0±0.2の溶液中において調製し、5±3℃に冷却した。このタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BAANS)をジメチルスルホキシド(DMSO)ストック溶液(20mg/mL)として0.25〜0.5のBAANS:タンパク質比(w/w)で加える。この反応物を5±3℃で30〜60分間穏やかに混合する。結果として得られたブロモアセチル化(活性化)タンパク質を、例えば、10mMリン酸バッファー(pH7.0)を使用し、10kDa MWCOの膜を使用した限外濾過/透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度をLowryタンパク質アッセイによって推定する。
E.coli O−Ag−TTコンジュゲートの調製
凍結乾燥したE.coli血清型O25b長鎖多糖、ロット番号709766−30(約6.92mg/mL、MW:約39kDa)、50mgを破傷風トキソイド(TT)コンジュゲーションに使用した。
凍結乾燥したE.coli血清型O25b長鎖多糖、ロット番号709766−30(約6.92mg/mL、MW:約39kDa)、50mgを破傷風トキソイド(TT)コンジュゲーションに使用した。
E.coli血清型O1a長鎖多糖710958−142−3(約6.3mg/mL、MW:約44.3kDa)(50mg、7.94mL)を凍結乾燥した。
E.coli血清型O6長鎖多糖、710758−121−1(約16.8mg/mL、MW:約44kDa)(50mg、2.98mL)を凍結乾燥した。
E.coli血清型O6長鎖多糖、710758−121−1(約16.8mg/mL、MW:約44kDa)(50mg、2.98mL)を凍結乾燥した。
上記の凍結乾燥した多糖のそれぞれをWFIに溶解しておよそ5〜10mg/mLにし、これに、0.5mL(100mgの(1−シアノ−4−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)を1mLのアセトニトリルに含む溶液)を添加し、室温で撹拌した。トリエチルアミン(TEA)0.2M(2mL)を添加し、室温で撹拌した。
破傷風トキソイド(TT)の調製:TT(100mg、47ml)をおよそ20mLに濃縮し、濾過管を使用して食塩水(2×50mL)で2回洗浄した。その後、HEPESおよび食塩水でこれを希釈し、HEPESの最終濃度を約0.25Mにした。
TTを上述のように調製し、反応物のpHを約9.1〜9.2に調整した。この反応混合物を室温で撹拌した。
20〜24時間後、反応をグリシン(0.5mL)でクエンチした。その後、MWCO再生セルロース膜を使用してこれを濃縮し、食塩水に対する透析濾過を行った。濾過して解析した。表26を参照されたい。
20〜24時間後、反応をグリシン(0.5mL)でクエンチした。その後、MWCO再生セルロース膜を使用してこれを濃縮し、食塩水に対する透析濾過を行った。濾過して解析した。表26を参照されたい。
O抗原の発酵、精製、およびコンジュゲーションのさらなる結果
下記の例示的なプロセスは、概して、すべてのE.coli血清型に適用可能である。各多糖の生成は、バッチ生成発酵の後、下流精製の前に化学的不活性化を行うことを含んだ。
下記の例示的なプロセスは、概して、すべてのE.coli血清型に適用可能である。各多糖の生成は、バッチ生成発酵の後、下流精製の前に化学的不活性化を行うことを含んだ。
株および保管。短鎖O抗原の生合成に用いた株は、E.coliの野生型臨床株であった。天然wzzb遺伝子の欠失を有するようにWanner−Datsenko法によって工学操作され、Salmonella由来の「長鎖」伸長機能fepEによって補完された短鎖産生株の誘導体を用い、長鎖O抗原を生成した。fepE機能は、高コピーのcolE1に基づく「topo」ベクター、または、colE1に基づくベクターpET30aからT7プロモーター領域が欠失した低コピー誘導体のいずれかで、その天然のプロモーターから発現された。
動物質を含まないLBまたは最少培地のいずれかにおいて、少なくとも3.0のOD600まで細胞を増殖させることにより、細胞バンクを調製した。次いで、ブロスを新鮮な培地で希釈し、80%グリセロールと合わせて、2.0OD600/mLで20%のグリセロール最終濃度を得た。
シード培養および発酵に使用した培地。用いられたシードおよび発酵培地には、次の処方が共通する:KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、クエン酸ナトリウム、Na2SO4、アスパラギン酸、グルコース、MgSO4、FeSO4−7H2O、Na2MoO4−2H2O、H3BO3、CoCl2−6H2O、CuCl2−2H2O、MnCl2−4H2O、ZnCl2、およびCaCl2−2H2O。
シードおよび発酵条件。単一のシードバイアルから0.1%でシードを播種した。シードのフラスコを37℃で16〜18時間インキュベートし、典型的に10〜20OD600/mLを達成した。
発酵は、10Lのステンレス鋼定置蒸気滅菌型発酵装置で行った。
発酵装置の播種は、典型的には、10OD600のシードから1:1000であった。バッチフェーズは、10g/Lのバッチグルコースで増殖が進む期間であり、通常は8時間持続する。グルコースの枯渇後、溶解酸素の急激な上昇があり、この時点でグルコースを発酵物に供給した。次いで、発酵は通常16〜18時間続き、収量は120OD600/mLを超える。
発酵装置の播種は、典型的には、10OD600のシードから1:1000であった。バッチフェーズは、10g/Lのバッチグルコースで増殖が進む期間であり、通常は8時間持続する。グルコースの枯渇後、溶解酸素の急激な上昇があり、この時点でグルコースを発酵物に供給した。次いで、発酵は通常16〜18時間続き、収量は120OD600/mLを超える。
血清型O1a、O2、O6およびO25bの短鎖/長鎖O抗原の生成の初期評価。O1a、O2、O6、およびO25bの野生型株を、添加最少培地においてバッチモードでOD600=15〜20まで発酵させた。酸素消費量の急激な減少をもたらすグルコースの枯渇後、増殖を制限するグルコースの供給を、グルコース溶液から16〜18時間にわたって適用した。細胞密度は124〜145OD600単位/mLに達した。その後、回収ブロスのpHを約3.8に調整し、2時間にわたって95℃に加熱した。次いで、加水分解したブロスを25℃に冷まし、pH6.0にし、遠心分離して固体を除去した。結果として得られた上清を、次いで、O抗原の定量化のためにSEC−HPLCカラムにロードした。2240〜4180mg/Lの範囲の生産性が得られた。これらのバッチの精製された短鎖O抗原の分子量は、10〜15kDaの範囲であることが見出された。また、O2およびO6の加水分解産物のSECクロマトグラフィは、O1aおよびO25bの加水分解産物には顕在しなかった特徴的かつ分離可能な混入多糖を明らかにしたことも認められた。
O1a、O2、O6およびO25b O抗原の長鎖型は、異種の相補的なfepE遺伝子を高コピーのカナマイシン選択可能なtopoプラスミドに搭載した各株のwzzb欠失型の発酵によって得られた。カナマイシン選択にもかかわらず、短鎖について発酵が行われた。124〜177OD600/mLで観察された最終的な細胞密度は、3500〜9850mg/LのO抗原生産性に関連付けられた。長鎖O抗原の相補性に基づく合成は、親短鎖株と少なくとも同程度に生産性があり、場合により、その生産性は親短鎖株よりも高かった。精製されたO抗原多糖の分子量は33〜49kDa、または対応する短鎖のサイズの約3倍であった。
O2およびO6の長鎖加水分解産物は混入多糖ピークの証拠を示したことが認められ、このピークは、長鎖抗原の場合には、O抗原のメインピークのショルダーとして観察された。O1およびO25bは、短鎖の親で以前に見られたような混入多糖の産生の証拠を示さなかった。
増殖速度の抑制は、fepEが存在しないtopoレプリコンの存在に関連することが見出された。さらに、Δwzzb変異自体は、増殖速度に有害作用を及ぼさなかった。このことは、増殖速度の乱れがプラスミドベクターによってもたらされたことを示す。
O11、O13、O16、O21およびO75 O抗原の生成についての株の評価。血清型O11、O13、O16、O21およびO75の複数の野生型株が、発酵において不要な多糖を産生する傾向を、SEC−HPLCによって評価した。O11、O13、O16、O21およびO75の各株を、混入多糖が存在せず、1000mg/L超のO抗原を産生する能力があり、Δwzzb形質の導入のためのWanner−Datsenkoリコンビニアリングを可能にする抗生物質感受性プロファイルを提示するものについて選択した。
カナマイシン耐性があることが一般に見出されるO11、O13、O16、O21およびO75のΔwzzb株へのfepEの導入を可能にする、クロラムフェニコール選択可能なtopo−fepEおよびpET−fepEを構築した。結果として得られたtopo−fepEおよびpET−fepEを有する株をクロラムフェニコール選択で発酵させ、酸加水分解したブロスの上清をSEC−HPLCによって評価した。高コピー(topo)と低コピー(pET)の両方のfepE構築物が、それぞれ親野生型と同様の生産性でO抗原の合成を指示した。干渉する可能性のある多糖の発現は観察されなかった。
wzzbプラスミド保有株の増殖速度の評価は、O11、O13およびO21がtopo−fepEの存在によって抑制されることはなかったが、pET−fepEによって抑制されたことを示した。O16株およびO75株は、レプリコンの選択とは無関係に許容可能な増殖速度を示した。
多糖の精製プロセスは、O抗原を遊離させるための酸加水分解を含んだ。発酵リアクター内の血清型特異的E.coli培養物の粗懸濁物を、酢酸で直接処理して最終pHを3.5±0.5にし、酸性化したブロスを少なくとも1時間にわたって95±5℃の温度に加熱した。この処理は、オリゴ糖の近位末端にあるKDOとリピドAとの間の不安定な結合を切断し、したがってO−Ag鎖を遊離させる。遊離したO−Agを含む酸性化したブロスを20±10℃に冷ました後、NH4OHを使用してpH7±1.0に中和した。このプロセスは、いくつかの遠心分離、濾過、および濃縮/透析濾過作業ステップをさらに含んだ。
試験したO抗原(O4、O11、O21、O75)に対するコンジュゲーション(RAC/DMSO)
調製したPLLコンジュゲート
哺乳動物細胞におけるE.coliポリペプチドの安定発現。FimH GSDまたはFimH LDを発現する安定なCHOクローンを、SSI(部位特異的組み込み)安定発現系の使用により生成した。
宿主CHO細胞は、CHOK1SV GS−KOバックグラウンドから工学操作された細胞株である(CHOK1SV GS−KO宿主細胞株の説明については、例えば、米国特許出願第20200002727号を参照されたい)。簡潔に述べると、2つのFRT部位に囲まれた緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含むランディングパッドを、宿主細胞のゲノム内の転写ホットスポットに標的挿入した。GFP遺伝子は、フリッパーゼリコンビナーゼ(FLPe)と同時発現されるLVECベクターのFRT部位にも囲まれているGS遺伝子および目的の遺伝子と交換されうる。この系は、ランダムな組み込みと好ましく匹敵する増殖プロファイルおよび生産性プロファイルを有するだけでなく、少なくとも100世代にわたる遺伝子型および表現型の安定性も提示する。
本明細書で言及される場合、「FRT部位」という用語は、酵母の2μmプラスミドのフリッパーゼ(FLP)遺伝子の産物であるFLPリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒しうるヌクレオチド配列を意味する。多様な非同一のFRT部位が当技術分野で公知である。様々なFRT部位の配列は、そのすべてが、組換えが生じる8塩基対の非対称性コア領域にフランキングする同一の13塩基対の逆方向反復を含むという点で類似している。部位の方向性、および異なるFRT部位間の多様性に関与するのは、この非対称性コア領域である。これらの実例(非限定的な例)は、天然に存在するFRT(F)、ならびにFRT F1およびFRT F2などのいくつかの変異型またはバリアントFRT部位を含む。
本明細書で言及される場合、「ランディングパッド」という用語は、宿主細胞の染色体に組み込まれる第1の組換え標的部位を含む核酸配列を意味する。いくつかの態様において、ランディング部位は、宿主細胞の染色体に組み込まれる組換え標的部位を2つ以上含む。いくつかの態様において、細胞は、1、2、3、4、5、6、7、または8個のランディングパッドを含む。いくつかの態様において、細胞は、1、2、または3個のランディングパッドを含む。いくつかの態様において、細胞は、4個のランディングパッドを含む。いくつかの態様において、ランディングパッドは、最大1、2、3、4、5、6、7、または8個の異なる染色体座に組み込まれる。いくつかの態様において、ランディングパッドは、最大1、2、または3個の異なる染色体座に組み込まれる。いくつかの態様において、ランディングパッドは、4個の異なる染色体座に組み込まれる。
FimH GSDまたはFimH LDのLVEC発現ベクターおよびFLPe発現ベクターを、BioRad Gene Pulser XcellまたはAmaxa 4D−Nucleofectorのいずれかを用いた電気穿孔により、SSI宿主細胞にコトランスフェクトした。次いで、グルタミンを含まない培地で細胞を培養して、GS遺伝子がランディングパッド部位で組み込まれた細胞を選択した。通常、細胞は2〜3週間で回復する。次いで、FACSまたは限界希釈のいずれかにより、96ウェルプレートで単細胞クローニングを行った。細胞を含むウェルの力価をランク付けして、上位48クローンまで絞り込んだ。24ディープウェルプレートで2回目のフェドバッチスクリーニングを行って、上位12クローンまで絞り込んだ。Ambr15で3回目のフェドバッチスクリーニングを実行して、上位3クローンまで絞り込んだ。Ambr250実験を使用して、最も良好なクローンを同定した。最上位のクローンについて、その同定後、マスター細胞バンクおよびワーキング細胞バンクを生成した。
細胞株の開発ならびにFimH−DSG WTタンパク質およびFimHLDWTタンパク質の生産リアクターにおける発現
ここに記載する実施例は、FimH−DSG WTおよびFimHLDWTの各タンパク質のコード配列がCHOゲノムに安定に組み込まれている安定なCHO細胞株から両タンパク質を産生する例について説明する。
ここに記載する実施例は、FimH−DSG WTおよびFimHLDWTの各タンパク質のコード配列がCHOゲノムに安定に組み込まれている安定なCHO細胞株から両タンパク質を産生する例について説明する。
生産バイオリアクターの設定において、選択された安定なCHO細胞株は、FimH−DSG WTについては培養物1リットル当たり約1グラム、FimHLDWTについては培養物1リットル当たり250ミリグラムで、標的タンパク質を産生することができた。生産リアクターのシード株は、ワーキング細胞バンクを解凍したバイアルから連続的にスケールアップし、生産リアクターに十分な細胞を供給するため、振とうフラスコ内で3回の継代を経て、0.3×106細胞/mlの播種生細胞密度を使用して増殖させた。細胞は36.5℃、5%CO2で3〜4日間増殖させた。
生産リアクターは、1×106細胞/mlの播種細胞密度を標的として、最終の振とうフラスコから播種した。生産リアクターは、36.5℃で7日間、7.05(±0.15)のpHを使用し、5〜10%のCO2飽和度を標的として増殖させた。pHは、塩基制御では炭酸水素ナトリウム/カリウム、酸制御ではCO2散布によって制御する。溶解酸素は、散布による純酸素を使用し、40%の設定値に制御する。7日目に温度を31℃に調整した。1日目に、生細胞密度に相関してフィードを加えるフィード戦略を使用し、リアクターへの供給を行った。これは、フィード成分が実行中に尽きないことを確実にするために、0.75のフィード係数を使用して達成される。次いで、フィードを連続的に加えて、1日を通じて所望の量のフィードを供給する。
生産リアクターを13日目に回収し、回収された培養物を遠心分離し、0.22μmフィルターにかけた後、下流処理を行った。
以下の条項は、本発明のさらなる態様を説明する。
以下の条項は、本発明のさらなる態様を説明する。
C1。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、式O1(例えば、式O1A、式O1B、および式O1C)、式O2、式O3、式O4(例えば、式O4:K52および式O4:K6)、式O5(例えば、式O5abおよび式O5ac(株180/C3))、式O6(例えば、式O6:K2;K13;K15および式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例えば、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、および式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例えば、式O23A)、式O24、式O25(例えば、式O25aおよび式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例えば、式O45および式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例えば、式O73(株73−1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187(式中、nは、1〜100の整数である)のいずれか1つから選択される構造を含む糖類とを含む組成物。
C2。糖類が、式O1(例えば、式O1A、式O1B、および式O1C)、式O2、式O3、式O4(例えば、式O4:K52および式O4:K6)、式O5(例えば、式O5abおよび式O5ac(株180/C3))、式O6(例えば、式O6:K2;K13;K15および式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18(例えば、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、および式O18B1)、式O21、式O23(例えば、式O23A)、式O24、式O25(例えば、式O25aおよび式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45(例えば、式O45および式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73(例えば、式O73(株73−1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式O111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、式62D1、式O22、式O35、式O65、式O66、式O83、式O91、式O105、式O116、式O117、式O139、式O153、式O167、および式O172(式中、nは、20〜100の整数である)から選択される構造を含む、条項C1に記載の組成物。
C3。糖類が、式O1(例えば、式O1A、式O1B、および式O1C)、式O2、式O3、式O4(例えば、式O4:K52および式O4:K6)、式O5(例えば、式O5abおよび式O5ac(株180/C3))、式O6(例えば、式O6:K2;K13;K15および式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18(例えば、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、および式O18B1)、式O21、式O23(例えば、式O23A)、式O24、式O25(例えば、式O25aおよび式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45(例えば、式O45および式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73(例えば、式O73(株73−1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式O111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、および式62D1(式中、nは、20〜100の整数である)から選択される構造を含む、条項C2に記載の組成物。
C4。式O1(例えば、式O1A、式O1B、および式O1C)、式O2、式O6(例えば、式O6:K2;K13;K15および式O6:K54)、式O15、式O16、式O21、式O25(例えば、式O25aおよび式O25b)、および式O75から選択される構造を含む、条項C2に記載の組成物。
C5。式O4、式O11、式O21、および式O75から選択される構造を含む、条項C2に記載の組成物。
C6。糖類が、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97、および式O101から選択される構造を含まない、条項C1に記載の組成物。
C6。糖類が、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97、および式O101から選択される構造を含まない、条項C1に記載の組成物。
C7。糖類が、式O12から選択される構造を含まない、条項C1に記載の組成物。
C8。糖類が、グラム陰性菌においてwzzファミリータンパク質を発現させて前記糖類を生成することによって産生される、条項C4に記載の組成物。
C8。糖類が、グラム陰性菌においてwzzファミリータンパク質を発現させて前記糖類を生成することによって産生される、条項C4に記載の組成物。
C9。wzzファミリータンパク質が、wzzB、wzz、wzzSF、wzzST、fepE、wzzfepE、wzz1、およびwzz2からなる群から選択される、条項C8に記載の組成物。
C10。wzzファミリータンパク質が、wzzBである、条項C8に記載の組成物。
C11。wzzファミリータンパク質が、fepEである、条項C8に記載の組成物。
C12。wzzファミリータンパク質が、wzzBおよびfepEである、条項C8に記載の組成物。
C11。wzzファミリータンパク質が、fepEである、条項C8に記載の組成物。
C12。wzzファミリータンパク質が、wzzBおよびfepEである、条項C8に記載の組成物。
C13。wzzファミリータンパク質が、Salmonella entericaに由来する、条項C8に記載の組成物。
C14。wzzファミリータンパク質が、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、および配列番号39のいずれか1つから選択される配列を含む、条項C8に記載の組成物。
C14。wzzファミリータンパク質が、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、および配列番号39のいずれか1つから選択される配列を含む、条項C8に記載の組成物。
C15。wzzファミリータンパク質が、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、条項C8に記載の組成物。
C16。wzzファミリータンパク質が、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、および配列番号39のいずれか1つから選択される配列を含む、条項C8に記載の組成物。
C17。糖類が、合成的に合成されている、条項C1に記載の組成物。
C18。糖類が、E.coli R1部分をさらに含む、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C18。糖類が、E.coli R1部分をさらに含む、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C19。糖類が、E.coli R2部分をさらに含む、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C20。糖類が、E.coli R3部分をさらに含む、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C20。糖類が、E.coli R3部分をさらに含む、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C21。糖類が、E.coli R4部分をさらに含む、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C22。糖類が、E.coli K−12部分をさらに含む、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C22。糖類が、E.coli K−12部分をさらに含む、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C23。糖類が、3−デオキシ−d−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(KDO)部分をさらに含む、条項C1〜C22のいずれか一項に記載の組成物。
C24。糖類が、E.coli R1部分をさらに含まない、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C24。糖類が、E.coli R1部分をさらに含まない、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C25。糖類が、E.coli R2部分をさらに含まない、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C26。糖類が、E.coli R3部分をさらに含まない、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C26。糖類が、E.coli R3部分をさらに含まない、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C27。糖類が、E.coli R4部分をさらに含まない、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C28。糖類が、E.coli K−12部分をさらに含まない、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C28。糖類が、E.coli K−12部分をさらに含まない、条項C1〜C17のいずれか一項に記載の組成物。
C29。糖類が、3−デオキシ−d−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(KDO)部分をさらに含まない、条項C1〜C22のいずれか一項に記載の組成物。
C30。糖類が、リピドAを含まない、条項C1〜C23のいずれか一項に記載の組成物。
C30。糖類が、リピドAを含まない、条項C1〜C23のいずれか一項に記載の組成物。
C31。多糖が、10kDa〜2,000kDa、または50kDa〜2,000kDaの分子量を有する、条項C1〜C30のいずれか一項に記載の組成物。
C32。糖類が、20〜40kDaの平均分子量を有する、条項C1〜C31のいずれか一項に記載の組成物。
C32。糖類が、20〜40kDaの平均分子量を有する、条項C1〜C31のいずれか一項に記載の組成物。
C33。糖類が、40,000〜60,000kDaの平均分子量を有する、条項C1〜C32のいずれか一項に記載の組成物。
C34。nが、31〜90の整数である、条項C1〜C33のいずれか一項に記載の組成物。
C34。nが、31〜90の整数である、条項C1〜C33のいずれか一項に記載の組成物。
C35。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、E.coliに由来する組成物。
C36。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した条項C1〜条項C34のいずれか一項に記載の糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物。
C37。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、条項C35または条項C36に記載のコンジュゲートとを含む組成物であって、担体タンパク質が、ポリ(L−リジン)、CRM197、ジフテリア毒素断片B(DTFB)、DTFB C8、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、TTの断片C、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはPseudomonas aeruginosaの外毒素A、P.aeruginosaの無毒化された外毒素A(EPA)、マルトース結合タンパク質(MBP)、S.aureusの無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Streptococcus pneumoniaeニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、C.jejuni AcrA、ならびにC.jejuniの天然糖タンパク質のいずれか1つから選択される、組成物。
C38。担体タンパク質が、CRM197である、条項C35〜条項C37のいずれか一項に記載の組成物。
C39。担体タンパク質が、破傷風トキソイド(TT)である、条項C35〜条項C37のいずれか一項に記載の組成物。
C39。担体タンパク質が、破傷風トキソイド(TT)である、条項C35〜条項C37のいずれか一項に記載の組成物。
C40。担体タンパク質が、ポリ(L−リジン)である、条項C35〜条項C37のいずれか一項に記載の組成物。
C41。コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される、条項C35〜条項C39のいずれか一項に記載の組成物。
C41。コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される、条項C35〜条項C39のいずれか一項に記載の組成物。
C42。コンジュゲートが、CDAP化学によって調製される、条項C35〜条項C39のいずれか一項に記載の組成物。
C43。コンジュゲートが、単一末端結合コンジュゲート糖類である、条項C35〜条項C39のいずれか一項に記載の組成物。
C43。コンジュゲートが、単一末端結合コンジュゲート糖類である、条項C35〜条項C39のいずれか一項に記載の組成物。
C44。糖類が、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項C35〜条項C39のいずれか一項に記載の組成物。
C45。糖類が、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされており、糖類が、カルバメート結合を介してeTECスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してeTECスペーサーに共有結合している、条項C44に記載の組成物。
C46。CRM197が、eTECスペーサーを介して多糖に共有結合したリジン残基を2〜20個、または4〜16個含む、条項C44または条項C45に記載の組成物。
C47。糖類:担体タンパク質の比(w/w)が、0.2〜4である、条項C35〜条項C46のいずれか一項に記載の組成物。
C47。糖類:担体タンパク質の比(w/w)が、0.2〜4である、条項C35〜条項C46のいずれか一項に記載の組成物。
C48。糖類のタンパク質に対する比が、0.5以上2以下である、条項C35〜条項C46のいずれか一項に記載の組成物。
C49。糖類のタンパク質に対する比が、0.4〜1.7である、条項C35〜条項C46のいずれか一項に記載の組成物。
C49。糖類のタンパク質に対する比が、0.4〜1.7である、条項C35〜条項C46のいずれか一項に記載の組成物。
C50。糖類が、3−デオキシ−d−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(KDO)残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項C43〜条項C49のいずれか一項に記載の組成物。
C51。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97、および式O101(式中、nは、1〜10の整数である)から選択される構造を含む組成物。
C52。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、条項C1〜条項C34のいずれか一項に記載の糖類と、薬学的に許容される希釈剤とを含む組成物。
C53。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、条項C35〜条項C51のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤とを含む組成物。
C53。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、条項C35〜条項C51のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤とを含む組成物。
C54。組成物中の糖類の総量と比較して最大で約25%の遊離糖類を含む、条項C53に記載の組成物。
C55。アジュバントをさらに含む、条項C52または条項C53に記載の組成物。
C55。アジュバントをさらに含む、条項C52または条項C53に記載の組成物。
C56。アルミニウムをさらに含む、条項C52または条項C53に記載の組成物。
C57。QS−21をさらに含む、条項C52または条項C53に記載の組成物。
C58。CpGオリゴヌクレオチドをさらに含む、条項C52または条項C53に記載の組成物。
C57。QS−21をさらに含む、条項C52または条項C53に記載の組成物。
C58。CpGオリゴヌクレオチドをさらに含む、条項C52または条項C53に記載の組成物。
C59。アジュバントを含まない、条項C52または条項C53に記載の組成物。
C60。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、E.coliに由来する糖類とを含む組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してeTECスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してeTECスペーサーに共有結合している、組成物。
C60。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、E.coliに由来する糖類とを含む組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してeTECスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してeTECスペーサーに共有結合している、組成物。
C61。糖類が、E.coliに由来するO抗原である、条項C60に記載の組成物。
C62。薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含む、条項C60に記載の組成物。
C62。薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含む、条項C60に記載の組成物。
C63。糖類が、E.coliに由来するO抗原である、条項C60に記載の組成物。
C64。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた条項C1〜条項C17のいずれか一項に記載の糖類とを含む組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してeTECスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してeTECスペーサーに共有結合している、組成物。
C64。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた条項C1〜条項C17のいずれか一項に記載の糖類とを含む組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してeTECスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してeTECスペーサーに共有結合している、組成物。
C65。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片、ならびに(i)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたE.coli O25B抗原のコンジュゲート、(ii)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたE.coli O1A抗原のコンジュゲート、(iii)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたE.coli O2抗原のコンジュゲート、および(iv)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたO6抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、E.coli O25B抗原が、式O25B(式中、nは、30超の整数である)の構造を含む組成物。
C66。前記担体タンパク質が、ポリ(L−リジン)、CRM197、ジフテリア毒素断片B(DTFB)、DTFB C8、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、TTの断片C、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはPseudomonas aeruginosaの外毒素A、P.aeruginosaの無毒化された外毒素A(EPA)、マルトース結合タンパク質(MBP)、S.aureusの無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Streptococcus pneumoniaeニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、C.jejuni AcrA、ならびにC.jejuniの天然糖タンパク質のいずれか1つから選択される、条項65に記載の組成物。
C67。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片、ならびに(i)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたE.coli O25B抗原のコンジュゲート、(ii)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたE.coli O4抗原のコンジュゲート、(iii)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたE.coli O11抗原のコンジュゲート、および(iv)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたO21抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、E.coli O25B抗原が、式O75(式中、nは、30超の整数である)の構造を含む組成物。
C68。前記担体タンパク質が、ポリ(L−リジン)、CRM197、ジフテリア毒素断片B(DTFB)、DTFB C8、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、TTの断片C、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはPseudomonas aeruginosaの外毒素A、P.aeruginosaの無毒化された外毒素A(EPA)、マルトース結合タンパク質(MBP)、S.aureusの無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Streptococcus pneumoniaeニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、C.jejuni AcrA、ならびにC.jejuniの天然糖タンパク質のいずれか1つから選択される、条項67に記載の組成物。
C69。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物を作製する方法であって、a)糖類を有機溶媒中で1,1’−カルボニル−ジ−(1,2,4−トリアゾール)(CDT)または1,1’−カルボニルジイミダゾール(CDI)と反応させて、活性化型糖類を生成するステップと、b)活性化型糖類をシスタミンもしくはシステアミンまたはそれらの塩と反応させて、チオール化糖類を生成するステップと、c)チオール化糖類を還元剤と反応させて、1つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化型チオール化糖類を生成するステップと、d)活性化型チオール化糖類を、1つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化型担体タンパク質と反応させて、チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、e)チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを、(i)活性化型担体タンパク質のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第1のキャッピング試薬、および/または(ii)コンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第2のキャッピング試薬と反応させることにより、eTEC結合グリココンジュゲートを生成するステップとを含み、FimHに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを組換え哺乳動物細胞で発現させるステップと、前記ポリペプチドまたはその断片を単離するステップとをさらに含み、糖類がE.coliに由来する方法。
C70。条項C1〜条項C34のいずれか一項に記載の組成物を作製するステップを含む、条項C69に記載の方法。
C71。キャッピングステップe)が、チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを、(i)第1のキャッピング試薬としてのN−アセチル−L−システイン、および/または(ii)第2のキャッピング試薬としてのヨードアセトアミドと反応させるステップを含む、条項C69または条項C70に記載の方法。
C71。キャッピングステップe)が、チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを、(i)第1のキャッピング試薬としてのN−アセチル−L−システイン、および/または(ii)第2のキャッピング試薬としてのヨードアセトアミドと反応させるステップを含む、条項C69または条項C70に記載の方法。
C72。トリアゾールまたはイミダゾールとの反応によって糖類を複合して、複合糖類を用意し、複合糖類をシェル凍結し、凍結乾燥し、有機溶媒中で再構成するステップを、ステップa)の前にさらに含む、条項C69〜条項C71のいずれか一項に記載の方法。
C73。ステップc)で生成されたチオール化多糖の精製をさらに含み、精製ステップが透析濾過を含む、条項C69〜条項C72のいずれか一項に記載の方法。
C74。透析濾過によるeTEC結合グリココンジュゲートの精製をさらに含む、条項C69〜条項C73のいずれか一項に記載の方法。
C74。透析濾過によるeTEC結合グリココンジュゲートの精製をさらに含む、条項C69〜条項C73のいずれか一項に記載の方法。
C75。ステップa)の有機溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド(DMA)、N−メチル−2−ピロリドン(NMP)、アセトニトリル、1,3−ジメチル−3,4,5,6−テトラヒドロ−2(1H)−ピリミジノン(DMPU)、およびヘキサメチルホスホラミド(HMPA)、またはそれらの混合物のいずれか1つから選択される極性非プロトン溶媒である、条項C69〜条項C74のいずれか一項に記載の方法。
C76。KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、クエン酸ナトリウム、Na2SO4、アスパラギン酸、グルコース、MgSO4、FeSO4−7H2O、Na2MoO4−2H2O、H3BO3、CoCl2−6H2O、CuCl2−2H2O、MnCl2−4H2O、ZnCl2、およびCaCl2−2H2Oを含む培地。
C77。E.coliを培養するために使用される、条項C76に記載の培地。
C78。条項C1〜条項C34のいずれか一項に記載の糖類を生成する方法であって、組換えE.coliを培地中で培養するステップと、前記細胞を前記培地中で培養することで、前記細胞が前記糖類を産生することにより、前記糖類を生成するステップとを含む方法。
C78。条項C1〜条項C34のいずれか一項に記載の糖類を生成する方法であって、組換えE.coliを培地中で培養するステップと、前記細胞を前記培地中で培養することで、前記細胞が前記糖類を産生することにより、前記糖類を生成するステップとを含む方法。
C79。培地が、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、クエン酸ナトリウム、Na2SO4、アスパラギン酸、グルコース、MgSO4、FeSO4−7H2O、Na2MoO4−2H2O、H3BO3、CoCl2−6H2O、CuCl2−2H2O、MnCl2−4H2O、ZnCl2、およびCaCl2−2H2Oのいずれか1つから選択される要素を含む、条項C78に記載の方法。
C80。培地が、ダイズ加水分解産物を含む、条項C78に記載の方法。
C81。培地が、酵母エキスを含む、条項C78に記載の方法。
C82。培地が、ダイズ加水分解産物および酵母エキスをさらに含まない、条項C78に記載の方法。
C81。培地が、酵母エキスを含む、条項C78に記載の方法。
C82。培地が、ダイズ加水分解産物および酵母エキスをさらに含まない、条項C78に記載の方法。
C83。E.coli細胞が、wzzB、wzz、wzzSF、wzzST、fepE、wzzfepE、wzz1、およびwzz2のいずれか1つから選択される異種wzzファミリータンパク質を含む、条項C78に記載の方法。
C84。E.coli細胞が、wzzB、wzz、wzzSF、wzzST、fepE、wzzfepE、wzz1、およびwzz2のいずれか1つから選択されるSalmonella entericaのwzzファミリータンパク質を含む、条項C78に記載の方法。
C85。wzzファミリータンパク質が、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、および配列番号19のいずれか1つから選択される配列を含む、条項C84に記載の方法。
C86。培養ステップが、120OD600/mLを超える収量をもたらす、条項C78に記載の方法。
C87。糖類を精製するステップをさらに含む、条項C78に記載の方法。
C87。糖類を精製するステップをさらに含む、条項C78に記載の方法。
C88。精製ステップが、透析、濃縮作業、透析濾過作業、接線流濾過、沈殿、溶出、遠心分離、沈殿、限外濾過、深層濾過、およびカラムクロマトグラフィ(イオン交換クロマトグラフィ、マルチモーダルイオン交換クロマトグラフィ、DEAE、および疎水性相互作用クロマトグラフィ)のいずれか1つを含む、条項C78に記載の方法。
C89。条項C1〜条項C68のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法。
C90。免疫応答が、抗E.coli O特異的多糖血清抗体の誘発を含む、条項C89に記載の方法。
C90。免疫応答が、抗E.coli O特異的多糖血清抗体の誘発を含む、条項C89に記載の方法。
C91。免疫応答が、抗E.coli IgG抗体の誘発を含む、条項C89に記載の方法。
C92。免疫応答が、E.coliに対する殺菌活性の誘発を含む、条項C89に記載の方法。
C92。免疫応答が、E.coliに対する殺菌活性の誘発を含む、条項C89に記載の方法。
C93。免疫応答が、E.coliに対するオプソニン食作用性抗体の誘発を含む、条項C89に記載の方法。
C94。免疫応答が、初回投与後の少なくとも1,000〜200,000の幾何平均力価(GMT)レベルを含む、条項C89に記載の方法。
C94。免疫応答が、初回投与後の少なくとも1,000〜200,000の幾何平均力価(GMT)レベルを含む、条項C89に記載の方法。
C95。組成物が、式O25(式中、nは、40〜100の整数である)を含む糖類を含み、免疫応答が、初回投与後の少なくとも1,000〜200,000の幾何平均力価(GMT)レベルを含む、条項C89に記載の方法。
C96。哺乳動物に、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿路性敗血症、腹腔内感染症、髄膜炎、複雑性肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児/乳児敗血症、好中球減少性発熱、および他の血流感染、肺炎、菌血症、ならびに敗血症から選択される状態のいずれか1つのリスクがある、条項C89に記載の方法。
C97。哺乳動物が、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿路性敗血症、腹腔内感染症、髄膜炎、複雑性肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児/乳児敗血症、好中球減少性発熱、および他の血流感染、肺炎、菌血症、ならびに敗血症から選択される状態のいずれか1つを有する、条項C89に記載の方法。
C98。(i)対象において、腸管外病原性Escherichia coliに対する免疫応答を誘発する、(ii)対象において、腸管外病原性Escherichia coliに対する免疫応答を誘発する、または(iii)対象において、腸管外病原性Escherichia coliに特異的なオプソニン食作用性抗体の産生を誘発する方法であって、条項C1〜条項C68のいずれか一項に記載の組成物を有効量で対象に投与するステップを含む方法。
C99。対象に、尿路感染を発症するリスクがある、条項C98に記載の方法。
C100。対象に、菌血症を発症するリスクがある、条項C98に記載の方法。
C101。対象に、敗血症を発症するリスクがある、条項C98に記載の方法。
C100。対象に、菌血症を発症するリスクがある、条項C98に記載の方法。
C101。対象に、敗血症を発症するリスクがある、条項C98に記載の方法。
C102。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片、ならびに(i)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたE.coli O25B抗原のコンジュゲート、(ii)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたE.coli O1A抗原のコンジュゲート、(iii)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたE.coli O2抗原のコンジュゲート、および(iv)担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたO6抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、E.coli O25B抗原が、式O25B(式中、nは、30超の整数である)の構造を含む組成物。
C103。担体タンパク質が、ポリ(L−リジン)、P.aeruginosaの無毒化された外毒素A(EPA)、CRM197、マルトース結合タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、S.aureusの無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化されたバリアント、Streptococcus pneumoniaeニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、C.jejuni AcrA、ならびにC.jejuniの天然糖タンパク質からなる群から選択される、条項C102に記載の組成物。
C104。(i)対象において、腸管外病原性Escherichia coliに対する免疫応答を誘発する、(ii)対象において、腸管外病原性Escherichia coliに対する免疫応答を誘発する、または(iii)対象において、腸管外病原性Escherichia coliに特異的なオプソニン食作用性抗体の産生を誘発する方法であって、条項C1に記載の組成物を有効量で対象に投与するステップを含む方法。
C105。対象に、尿路感染を発症するリスクがある、条項C104に記載の方法。
C106。対象に、菌血症を発症するリスクがある、条項C104に記載の方法。
C107。対象に、敗血症を発症するリスクがある、条項C104に記載の方法。
C106。対象に、菌血症を発症するリスクがある、条項C104に記載の方法。
C107。対象に、敗血症を発症するリスクがある、条項C104に記載の方法。
C108。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、E.coliの対応する野生型O多糖と比較して少なくとも5個多い繰り返し単位を含む糖類とを含む組成物。
C109。糖類が式O25aを含み、E.coliがE.coli血清型O25aである、条項C108に記載の組成物。
C109。糖類が式O25aを含み、E.coliがE.coli血清型O25aである、条項C108に記載の組成物。
C110。糖類が式O25bを含み、E.coliがE.coli血清型O25bである、条項C108に記載の組成物。
C111。糖類が式O2を含み、E.coliがE.coli血清型O2である、条項C108に記載の組成物。
C111。糖類が式O2を含み、E.coliがE.coli血清型O2である、条項C108に記載の組成物。
C112。糖類が式O6を含み、E.coliがE.coli血清型O6である、条項C108に記載の組成物。
C113。糖類が式O1を含み、E.coliがE.coli血清型O1である、条項C108に記載の組成物。
C113。糖類が式O1を含み、E.coliがE.coli血清型O1である、条項C108に記載の組成物。
C114。糖類が式O17を含み、E.coliがE.coli血清型O17である、条項C108に記載の組成物。
C115。糖類が、式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187(式中、nは、5〜1000の整数である)から選択される構造を含む、条項C108に記載の組成物。
C115。糖類が、式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187(式中、nは、5〜1000の整数である)から選択される構造を含む、条項C108に記載の組成物。
C116。E.coliが、O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O25b、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、およびO187からなる群から選択されるE.coli血清型である、条項C108に記載の組成物。
C117。糖類が、グラム陰性菌においてwzzファミリータンパク質を過剰発現させて前記糖類を生成することを含む培養下のグラム陰性菌によって産生されるO多糖の繰り返し単位を増大させることによって産生される、条項C108に記載の組成物。
C118。過剰発現されるwzzファミリータンパク質が、wzzB、wzz、wzzSF、wzzST、fepE、wzzfepE、wzz1、およびwzz2からなる群から選択される、条項C117に記載の組成物。
C119。過剰発現されるwzzファミリータンパク質が、wzzBである、条項C117に記載の組成物。
C120。過剰発現されるwzzファミリータンパク質が、fepEである、条項C117に記載の組成物。
C120。過剰発現されるwzzファミリータンパク質が、fepEである、条項C117に記載の組成物。
C121。過剰発現されるwzzファミリータンパク質が、wzzBおよびfepEである、条項C117に記載の組成物。
C122。糖類が、合成的に合成されている、条項C108に記載の組成物。
C122。糖類が、合成的に合成されている、条項C108に記載の組成物。
C123。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した条項C108に記載の糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物。
C124。担体タンパク質が、CRM197である、条項C123に記載の組成物。
C124。担体タンパク質が、CRM197である、条項C123に記載の組成物。
C125。糖類が、式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187(式中、nは、5〜1000の整数である)から選択される構造を含む、条項C123に記載の組成物。
C126。前記糖類が、対応する野生型O多糖と比較して少なくとも5個多い繰り返し単位を含む、条項C123に記載の組成物。
C127。薬学的に許容される希釈剤をさらに含む、条項C1に記載の組成物。
C127。薬学的に許容される希釈剤をさらに含む、条項C1に記載の組成物。
C128。アジュバントをさらに含む、条項C127に記載の組成物。
C129。アルミニウムをさらに含む、条項C127に記載の組成物。
C130。QS−21をさらに含む、条項C127に記載の組成物。
C129。アルミニウムをさらに含む、条項C127に記載の組成物。
C130。QS−21をさらに含む、条項C127に記載の組成物。
C131。アジュバントを含まない、条項C127に記載の組成物。
C132。条項C127に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。
C132。条項C127に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。
C133。薬学的に許容される希釈剤をさらに含む、条項C123に記載の組成物。
C134。条項C133に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。
C134。条項C133に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。
C135。免疫応答が、抗E.coli O特異的多糖血清抗体の誘発を含む、条項C132またはC134に記載の方法。
C136。抗E.coli O特異的多糖血清抗体が、IgG抗体である、条項C135に記載の方法。
C136。抗E.coli O特異的多糖血清抗体が、IgG抗体である、条項C135に記載の方法。
C137。抗E.coli O特異的多糖血清抗体が、E.coliに対する殺菌活性を有するIgG抗体である、条項C135に記載の方法。
C138。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、E.coliに由来する糖類とを含む免疫原性組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してeTECスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してeTECスペーサーに共有結合している、免疫原性組成物。
C138。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、E.coliに由来する糖類とを含む免疫原性組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してeTECスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してeTECスペーサーに共有結合している、免疫原性組成物。
C139。薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含む、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C140。糖類が、E.coliに由来するO抗原である、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C140。糖類が、E.coliに由来するO抗原である、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C141。糖類が、式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187(式中、nは、5〜1000の整数である)から選択される構造を含む、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C142。糖類が、75〜100%のO−アセチル化度を有する、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C143。担体タンパク質が、CRM197である、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C143。担体タンパク質が、CRM197である、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C144。CRM197が、eTECスペーサーを介して多糖に共有結合したリジン残基を2〜20個含む、条項C143に記載の免疫原性組成物。
C145。CRM197が、eTECスペーサーを介して多糖に共有結合したリジン残基を4〜16個含む、条項C143に記載の免疫原性組成物。
C145。CRM197が、eTECスペーサーを介して多糖に共有結合したリジン残基を4〜16個含む、条項C143に記載の免疫原性組成物。
C146。追加の抗原をさらに含む、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C147。アジュバントをさらに含む、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C148。アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである、条項C147に記載の免疫原性組成物。
C147。アジュバントをさらに含む、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C148。アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである、条項C147に記載の免疫原性組成物。
C149。アジュバントを含まない、条項C138に記載の免疫原性組成物。
C150。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質にコンジュゲートされたE.coliに由来する糖類を含むグリココンジュゲートとを含む免疫原性組成物であって、グリココンジュゲートが、還元的アミノ化を使用して調製される、免疫原性組成物。
C150。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質にコンジュゲートされたE.coliに由来する糖類を含むグリココンジュゲートとを含む免疫原性組成物であって、グリココンジュゲートが、還元的アミノ化を使用して調製される、免疫原性組成物。
C151。薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含む、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C152。糖類が、E.coliに由来するO抗原である、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C152。糖類が、E.coliに由来するO抗原である、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C153。糖類が、式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、および式O187(式中、nは、5〜1000の整数である)から選択される構造を含む、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C154。糖類が、75〜100%のO−アセチル化度を有する、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C155。担体タンパク質が、CRM197である、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C155。担体タンパク質が、CRM197である、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C156。追加の抗原をさらに含む、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C157。アジュバントをさらに含む、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C158。アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである、条項C157に記載の免疫原性組成物。
C157。アジュバントをさらに含む、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C158。アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである、条項C157に記載の免疫原性組成物。
C159。アジュバントを含まない、条項C150に記載の免疫原性組成物。
C160。条項C138〜C159のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。
C160。条項C138〜C159のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。
C161。免疫応答が、抗E.coli O特異的多糖血清抗体の誘発を含む、条項C160に記載の方法。
C162。抗E.coli O特異的多糖血清抗体が、IgG抗体である、条項C135に記載の方法。
C162。抗E.coli O特異的多糖血清抗体が、IgG抗体である、条項C135に記載の方法。
C163。抗E.coli O特異的多糖血清抗体が、E.coliに対する殺菌活性を有するIgG抗体である、条項C135に記載の方法。
C164。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2;K13;K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187、(式中、nは、対応する野生型E.coli多糖における繰り返し単位数よりも大きい)のいずれか1つから選択される構造を含む糖類とを含む組成物。
C164。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2;K13;K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187、(式中、nは、対応する野生型E.coli多糖における繰り返し単位数よりも大きい)のいずれか1つから選択される構造を含む糖類とを含む組成物。
C165。nが、31〜100の整数である、条項C164に記載の組成物。
C166。糖類が、式O1A、式O1B、および式O1C、式O2、式O6、ならびに式O25Bのいずれか1つによる構造を含む、条項C164に記載の組成物。
C166。糖類が、式O1A、式O1B、および式O1C、式O2、式O6、ならびに式O25Bのいずれか1つによる構造を含む、条項C164に記載の組成物。
C167。糖類が、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、および配列番号39のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するwzzファミリータンパク質を発現する組換え宿主細胞において産生される、条項C164に記載の組成物。
C168。タンパク質が、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34のいずれか1つを含む、条項C167に記載の組成物。
C169。糖類が、合成的に合成されている、条項C164に記載の糖類。
C169。糖類が、合成的に合成されている、条項C164に記載の糖類。
C170。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片と、糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、前記糖類が、式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2;K13;K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式O111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187、(式中、nは、1〜100の整数である)のいずれか1つから選択される構造を含む、組成物。
C171。糖類が、式O25b、式O1A、式O2、および式O6のいずれか1つを含む、条項C170に記載の組成物。
C172。糖類が、E.coli R1部分、E.coli R2部分、E.coli R3部分、E.coli R4部分、およびE.coli K−12部分のいずれか1つをさらに含む、条項C170に記載の組成物。
C172。糖類が、E.coli R1部分、E.coli R2部分、E.coli R3部分、E.coli R4部分、およびE.coli K−12部分のいずれか1つをさらに含む、条項C170に記載の組成物。
C173。糖類が、E.coli R1部分、E.coli R2部分、E.coli R3部分、E.coli R4部分、およびE.coli K−12部分のいずれか1つをさらに含まない、条項C170に記載の組成物。糖類が、E.coli R2部分をさらに含まない、条項C170に記載の組成物。
C174。糖類が、3−デオキシ−d−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(KDO)部分をさらに含む、条項C170に記載の組成物。
C175。担体タンパク質が、CRM197、ジフテリア毒素断片B(DTFB)、DTFB C8、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、TTの断片C、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはPseudomonas aeruginosaの外毒素A、P.aeruginosaの無毒化された外毒素A(EPA)、マルトース結合タンパク質(MBP)、S.aureusの無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Streptococcus pneumoniaeニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、C.jejuni AcrA、ならびにC.jejuniの天然糖タンパク質のいずれか1つから選択される、条項C170に記載の組成物。
C175。担体タンパク質が、CRM197、ジフテリア毒素断片B(DTFB)、DTFB C8、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、TTの断片C、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはPseudomonas aeruginosaの外毒素A、P.aeruginosaの無毒化された外毒素A(EPA)、マルトース結合タンパク質(MBP)、S.aureusの無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Streptococcus pneumoniaeニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、C.jejuni AcrA、ならびにC.jejuniの天然糖タンパク質のいずれか1つから選択される、条項C170に記載の組成物。
C176。担体タンパク質が、CRM197である、条項C170に記載の組成物。
C177。担体タンパク質が、破傷風トキソイドである、条項C170に記載の組成物。
C177。担体タンパク質が、破傷風トキソイドである、条項C170に記載の組成物。
C178。糖類のタンパク質に対する比が、0.5以上2以下である、条項C170に記載の組成物。
C179。コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される、条項C170に記載の組成物。
C179。コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される、条項C170に記載の組成物。
C180。糖類が、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項C170に記載の組成物。
C181。糖類が、単一末端結合コンジュゲート糖類である、条項C170に記載の組成物。
C182。糖類が、3−デオキシ−d−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(KDO)残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項C174に記載の組成物。
C182。糖類が、3−デオキシ−d−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(KDO)残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項C174に記載の組成物。
C183。コンジュゲートが、CDAP化学によって調製される、条項C170に記載の組成物。
C184。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片、ならびに(a)式O25b(式中、nは、31〜90の整数である)を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、(b)式O1A(式中、nは、31〜90の整数である)を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、(c)式O2(式中、nは、31〜90の整数である)を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、および(d)式O6(式中、nは、31〜90の整数である)を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートを含む組成物。
C184。FimHに由来するポリペプチドまたはその断片、ならびに(a)式O25b(式中、nは、31〜90の整数である)を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、(b)式O1A(式中、nは、31〜90の整数である)を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、(c)式O2(式中、nは、31〜90の整数である)を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、および(d)式O6(式中、nは、31〜90の整数である)を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートを含む組成物。
C185。式O15、式O16、式O17、式O18、および式O75(式中、nは、31〜90の整数である)のいずれか1つから選択される構造を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートをさらに含む、条項C184に記載の組成物。
C186。組成物中の糖類の総量と比較して最大で25%の遊離糖類を含む、条項C184に記載の組成物。
C187。条項C184〜C186のいずれか一項に記載の組成物を有効量で哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物においてEscherichia coliに対する免疫応答を生じさせる方法。
C187。条項C184〜C186のいずれか一項に記載の組成物を有効量で哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物においてEscherichia coliに対する免疫応答を生じさせる方法。
C188。免疫応答が、E.coliに対するオプソニン食作用性抗体を含む、条項C187に記載の方法。
C189。免疫応答が、E.coli感染から哺乳動物を防御する、条項C187に記載の方法。
C189。免疫応答が、E.coli感染から哺乳動物を防御する、条項C187に記載の方法。
C190。(a)E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする第1の目的の遺伝子であって、少なくとも2つの組換え標的部位(RTS)の間に組み込まれている遺伝子を含む哺乳動物細胞。
C191。2つのRTSが、NL1座位またはNL2座位で染色体に組み込まれている、条項C190に記載の態様。
C192。第1の目的の遺伝子が、レポーター遺伝子、発現困難なタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせをさらに含む、条項C190に記載の態様。
C192。第1の目的の遺伝子が、レポーター遺伝子、発現困難なタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせをさらに含む、条項C190に記載の態様。
C193。(a)の座位とは異なる第2の染色体座に組み込まれた第2の目的の遺伝子をさらに含む、条項C190に記載の態様であって、第2の目的の遺伝子が、レポーター遺伝子、発現困難なタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む態様。
Claims (73)
- E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞。
- 前記ポリペプチドが、E.coli線毛H(FimH)に由来する、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのN末端にフェニルアラニン残基を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、N末端の最初の20残基以内の位置にフェニルアラニン残基を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの1位にフェニルアラニン残基を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの1位にあるフェニルアラニン残基の直前にグリシン残基を含まない、請求項5に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの7位にN−グリコシル化部位を含まない、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの7位にAsn残基を含まない、請求項6に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、Ser、Asp、Thr、およびGlnからなる群から選択される残基を7位に含む、請求項8に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの70位にN−グリコシル化部位を含まない、請求項5に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの70位にAsn残基を含まない、請求項10に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの70位にSer残基を含まない、請求項10に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのN−グリコシル化部位に、Ser、Asp、Thr、およびGlnからなる群から選択される残基置換を含む、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記N−グリコシル化部位が、前記ポリペプチドのN235位を含む、請求項13に記載の組換え細胞。
- 前記N−グリコシル化部位が、前記ポリペプチドのN228位を含む、請求項13に記載の組換え細胞。
- 前記N−グリコシル化部位が、前記ポリペプチドのN235位およびN228位を含む、請求項13に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、配列番号3を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの1位に脂肪族疎水性アミノ酸残基を含む、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記脂肪族疎水性アミノ酸残基が、Ile、Leu、およびValからなる群から選択される、請求項19に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、FimHの断片を含む、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、FimHのレクチンドメインを含む、請求項21に記載の組換え細胞。
- 前記レクチンドメインが、約17022ダルトンの質量を備える、請求項22に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、FimCポリペプチドまたはその断片と複合体を形成している、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記FimCポリペプチドまたはその断片が、前記FimCポリペプチドまたはその断片の37位にグリシン残基を含む、請求項24に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、低親和性の立体構造にある、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、FimGによって安定化されている、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、FimGのドナー鎖ペプチド(DsG)によって安定化されている、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、リンカー配列をさらにコードする、請求項28に記載の組換え細胞。
- 前記リンカーが、4個以上15個以下のアミノ酸残基を含む、請求項29に記載の組換え細胞。
- 前記リンカーが、5個以上10個以下のアミノ酸残基を含む、請求項29に記載の組換え細胞。
- 前記リンカーが、7個のアミノ酸残基を含む、請求項29に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、天然のFimHリーダーペプチド、インフルエンザ血球凝集素シグナルペプチド、およびヒト呼吸器多核体ウイルスA(A2株)融合糖タンパク質F0シグナルペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチドを含まない、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、マウスIgKシグナルペプチド配列を含む、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、ヒトIgG受容体FcRn大サブユニットp51のシグナルペプチドおよびヒトIL10タンパク質のシグナルペプチドから選択されるいずれか1つのシグナルペプチド配列を含む、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、配列番号3の番号付けによるアミノ酸60位のアルギニンからプロリンへの変異(R60P)を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドの発現レベルが、野生型E.coli細胞の周辺質で発現する対応する野生型ポリペプチドの発現レベルよりも高い、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドの発現レベルが、10mg/Lよりも高い、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、前記哺乳動物細胞のゲノムDNAに組み込まれている、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記細胞が、ヒト胎児由来腎臓細胞である、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ヒト胎児由来腎臓細胞が、HEK293細胞を含む、請求項40に記載の組換え細胞。
- 前記HEK293細胞が、HEK293T細胞、HEK293TS細胞、およびHEK293E細胞のうちのいずれか1つから選択される、請求項42に記載の組換え細胞。
- 前記細胞が、CHO細胞である、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記CHO細胞が、CHO−K1細胞、CHO−DUXB11、CHO−DG44細胞、またはCHO−S細胞である、請求項44に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが可溶性である、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが前記細胞から分泌される、請求項1に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1の番号付けによるN28Q置換を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1の番号付けによるN28D置換を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1の番号付けによるN28S置換を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1の番号付けによるN28Q、V48C、およびL55Cのいずれか1つから選択される置換を含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1の番号付けによる置換N92Sを含む、請求項2に記載の組換え細胞。
- FimHに由来する前記ポリペプチドまたはその断片が、配列番号1の番号付けによるV48CおよびL55Cのいずれか1つから選択される置換を含む、請求項1に記載の組換え細胞。
- 請求項1に記載の組換え細胞を含み、少なくとも5リットルのサイズである、培養物。
- 前記ポリペプチドまたはその断片の収量が、少なくとも0.05g/Lである、請求項49に記載の培養物。
- 前記ポリペプチドまたはその断片の収量が、少なくとも0.10g/Lである、請求項55に記載の培養物。
- E.coliに由来するポリペプチドまたはその断片を生成する方法であって、請求項1に記載の組換え哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、前記ポリペプチドまたはその断片を発現させるステップと、前記ポリペプチドまたはその断片を回収するステップとを含む方法。
- 前記ポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含む、請求項57に記載の方法。
- 前記細胞が、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、および配列番号27のいずれか1つをコードする核酸を含む、請求項57に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたはその断片の収量が、少なくとも0.05g/Lである、請求項57に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたはその断片の収量が、少なくとも0.10g/Lである、請求項57に記載の方法。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号28、および配列番号29のいずれか1つに対して少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドを含む組成物。
- 表1のいずれか1つの式から選択される構造を含む糖類をさらに含む、請求項62に記載の組成物。
- 前記糖類が担体タンパク質に共有結合している、請求項63に記載の組成物。
- 前記担体タンパク質が、ポリ(L−リジン)、CRM197、ジフテリア毒素断片B(DTFB)、DTFB C8、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、TTの断片C、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはPseudomonas aeruginosaの外毒素A、P.aeruginosaの無毒化された外毒素A(EPA)、マルトース結合タンパク質(MBP)、S.aureusの無毒化された溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Streptococcus pneumoniaeニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、C.jejuni AcrA、ならびにC.jejuniの天然糖タンパク質のいずれか1つから選択される、請求項64に記載の組成物。
- 前記担体タンパク質が、CRM197である、請求項64に記載の組成物。
- 前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド(TT)である、請求項64に記載の組成物。
- 前記担体タンパク質が、ポリ(L−リジン)である、請求項64に記載の組成物。
- 前記糖類が、還元的アミノ化によって担体タンパク質に共有結合している、請求項64に記載の組成物。
- 前記糖類が、CDAP化学によって担体タンパク質に共有結合している、請求項64に記載の組成物。
- 前記糖類が、単一末端結合コンジュゲーションによって担体タンパク質に共有結合している、請求項64に記載の組成物。
- 前記糖類が、(2−((2−オキソエチル)チオ)エチル)カルバメート(eTEC)スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合している、請求項64に記載の組成物。
- 配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、および配列番号27からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
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