JP2021087420A

JP2021087420A - Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ組成物およびその方法

Info

Publication number: JP2021087420A
Application number: JP2020180095A
Authority: JP
Inventors: アナリーサ・シビル・アンダーソン; Sybil Anderson Annaliesa; ウェイ・チェン; Wei Chen; ローレント・オリバー・チョーロ; Oliver CHORRO Laurent; リン・チュウ; Ling Chu; ロバート・ジー・ケイ・ドナルド; G K Donald Robert; マシュー・カーティス・グリッフォー; Curtis Griffor Matthew; ジャンジン・グー; Jianxin Gu; ツェキアン・グアン; Zeqiang Guan; ジンーフアン・キム; Jin-Hwan Kim; スリニバス・コデイル; KODALI Srinivas
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2021-06-10
Also published as: CA3159573A1; AU2020375214B2; KR20220092572A; IL292494A; MX2022005252A; US20230000966A1; EP4051696A1; WO2021084429A1; CN114667343A; AU2020375214A1

Abstract

【課題】組換えアドヘシンタンパク質を生成するため、そしてＥ．ｃｏｌｉ血清型に対する免疫応答を生じさせるための、組成物およびその使用方法を提供すること。【解決手段】１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドおよびその断片に関し、その組成物および方法を含む。本明細書では、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドおよびその断片、およびＥ．ｃｏｌｉのリポ多糖に由来する修飾Ｏ多糖分子、ならびにそれらのコンジュゲートを含む組成物も開示される。さらなる側面では、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする配列を含む哺乳動物宿主細胞が本明細書に開示される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年１１月１日に出願された米国仮出願第６２／９２９，５０５号、２０２０年６月２６日に出願された米国仮出願第６３／０４５，０３８号、および２０２０年９月２２日に出願された米国仮出願第６３／０８１，６２９号に基づく利益を主張する。前述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の参照
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂによって電子出願されるものであり、．ｔｘｔフォーマットで電子提出された配列表を含む。この．ｔｘｔファイルは、２０２０年９月１８日に作成され、１５２ＫＢのサイズである「ＰＣ０７２５１７＿０３＿ＳＥＱ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の配列表を含む。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は本明細書の一部をなし、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ組成物およびその方法に関する。

細菌の線毛アドヘシンであるＦｉｍＨおよびＦｍｌＨは、宿主細胞の特定の糖タンパク質を認識することにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉが特徴的な尿路微小環境を利用することを可能にする。ＦｉｍＨは、尿上皮にあるマンノシル化されたウロプラキン受容体に結合し、一方でＦｍｌＨは、腎臓および炎症した膀胱の上皮表面タンパク質に付いたガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンＯ−グリカンに結合する。線毛ＦｉｍＨはまた、腸上皮上の高度にマンノシル化されたタンパク質に結合することにより、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）および多剤耐性のある侵襲性Ｅ．ｃｏｌｉの腸内定着に関与する。

全長ＦｉｍＨは、短いリンカーによって接続されているＮ末端側のレクチンドメインとＣ末端側のピリンドメインの、２つのドメインから構成されている。ＦｉｍＨのレクチンドメインは、尿路上皮細胞表面にあるマンノシル化されたウロプラキン１ａへの結合に関与する炭水化物認識ドメインを含む。ピリンドメインは、ドナー鎖相補性と呼ばれるプロセスにより、その後のＦｉｍＧサブユニットのドナー鎖を介して繊毛のコアに固定される。

ＦｉｍＨのレクチンドメインの立体構造およびリガンド結合特性は、ＦｉｍＨのピリンドメインのアロステリック制御下にある。静止状態では、全長ＦｉｍＨの２つのドメインの相互作用が、浅い結合ポケットを特徴とする、モノマンノースに対する親和性が低い（例えば、Ｋ_ｄ約３００μＭの）状態でレクチンドメインを安定化させる。マンノシドリガンドへの結合は、レクチンドメインおよびピリンドメインが近接した状態を保つ中親和性状態をもたらす立体構造変化を誘発する。しかしながら、せん断応力がかかると、レクチンドメインとピリンドメインは分離し、それによって高親和性状態（例えば、Ｋ_ｄ＜１．２μＭ）が誘発される。

ピリンドメインが及ぼす負のアロステリック調節がないため、分離したＦｉｍＨのレクチンドメインは、高親和性状態にロックされる。分離し、高親和性状態にロックされた組換えレクチンドメインは、高い安定性を呈する。しかしながら、アドヘシンを結合性の低い立体構造にロックすると、接着を阻害する抗体の生成が誘発される。したがって、低親和性状態でレクチンドメインを安定化させることに関心が寄せられている。

さらに、製品開発に十分な高い収量でＦｉｍＨを発現させる方法にも関心が寄せられている。ＦｉｍＨを含む組成物の開発を妨げる一因は、Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質においてＦｉｍＨを天然状態で発現させる際に達成される収量が低いことである。ラボ−ベンチスケールで報告される典型的な収量は、精製されたＦｉｍＣＨ複合体については３〜５ｍｇ／Ｌ、ＦｉｍＨ（ＬＤ）については４〜１０ｍｇ／Ｌであり、臨床試験材料の製造のためにスケーラブルとみなされるレベルを下回っている。ＦｉｍＨのインビボでの立体構造は、精製された組換え型のタンパク質により得られる立体構造とは異なる。一般に、ＦｉｍＨの天然の立体構造は、ＦｉｍＨと、周辺質のＦｉｍＣと呼ばれるシャペロンタンパク質とのインビボでの相互作用によって少なくとも部分的に決定される。

ＦｉｍＨの組換え生成には、依然として課題がある。タンパク質の発現および精製は、型通りのプロセスではない。

米国特許出願公開第２０２００００２７２７号米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号米国特許出願公開第２００７／０２３１３４０号米国特許出願公開第２００７／０１８４０７１号米国特許出願公開第２００７／０１８４０７２号ＷＯ２００６／１１０３８１ＷＯ２００８／０７９６５３ＷＯ２００８／１４３７０９米国特許第９５１７２７４号国際特許出願公開第２０１４０２７３０２号ＷＯ０１／９８３３４ＷＯ０３／５４００７ＥＰ０５９４６１０ＢＵＳ４７０９０１７ＵＳ４９５０７４０ＵＳ５９１７０１７ＵＳ６４５５６７３ＵＳ５８４３７１１ＷＯ０４０８１５１５ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８ＷＯ００／３７１０５ＷＯ００／３９２９９ＷＯ２００９／０００８２６ＥＰ０３７２５０１ＥＰ０３７８８８１ＥＰ０４２７３４７ＷＯ９３／１７７１２ＷＯ９４／０３２０８ＷＯ９８／５８６６８ＥＰ０４７１１７７ＷＯ９１／０１１４６ＷＯ０２／０９１９９８ＷＯ０１／７２３３７ＷＯ００／６１７６１国際特許出願第２００４／０８３２５１号ＵＳ５，６１４，３８２ＷＯ９０／０３１８４ＷＯ９６／１１７１１ＷＯ００／４８６３０ＷＯ９８／３６７７２ＷＯ００／４１７２０ＷＯ２００６／１３４４２３ＷＯ２００７／０２６１９０ＷＯ００／０７６２１ＷＯ９９／４４６３６ＧＢ２２２０２１１ＥＰ０６８９４５４ＷＯ００／５６３５８ＥＰ０８３５３１８ＥＰ０７３５８９８ＥＰ０７６１２３１ＷＯ９９／５２５４９ＷＯ０１／２１２０７ＷＯ０１／２１１５２ＷＯ００／６２８００ＷＯ００／２３１０５ＷＯ９９／１１２４１ＷＯ９８／５７６５９米国特許第６，１９４，３８８号米国特許第６，２０７，６４６号米国特許第６，２１４，８０６号米国特許第６，２１８，３７１号米国特許第６，２３９，１１６号米国特許第６，３３９，０６８号ＷＯ２０１０／１２５４８０米国特許出願第２０２００００２７２７号

Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１頁、１９８０Ｍａｔｈｅｒら、ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８頁、１９８２Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、５３７：３０５３、１９８３Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８；３８３８〜３８４４頁、１９７３ＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ、ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴｏｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、ＭａｅｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ、１９９２Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔｌｍｍｕｎ６３；２７０６〜１３頁Ｆａｌｕｇｉら（２００１）ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ３１；３８１６〜３８２４頁Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔｌｍｍｕｎ７２；４８８４〜７頁ＵｃｈｉｄａＣａｍｅｒｏｎＤＭ、ＲＪＣｏｌｌｉｅｒ．１９８７．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４９６７〜４９７１頁Ｕｃｈｉｄａ、Ｔ．ら、１９７１、ＮａｔｕｒｅＮｅｗＢｉｏｌｏｇｙ２３３：８〜１１頁Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ｊ．ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌ．６４：７１３頁

これらおよび他の需要を満たすため、本発明は、組換えアドヘシンタンパク質を生成するため、そしてＥ．ｃｏｌｉ血清型に対する免疫応答を生じさせるための、組成物およびその使用方法に関する。

１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞に関する。いくつかの態様において、本ポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ線毛Ｈ（ｆｉｍＨ）ポリペプチドに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドのＮ末端にフェニルアラニン残基を含む。

１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を組換え哺乳動物細胞において産生する方法に関する。本方法は、組換え哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、ポリペプチドまたはその断片を発現させるステップと、ポリペプチドまたはその断片を回収するステップとを含む。いくつかの態様において、本方法は、ポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含む。いくつかの態様において、ポリペプチドの収量は、少なくとも０．０５ｇ／Ｌである。いくつかの態様において、ポリペプチドの収量は、少なくとも０．１０ｇ／Ｌである。

１つの側面において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９、またはそれらのいずれかの組み合わせに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む組成物に関する。

別の側面では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つにおける、少なくともｎ個の連続するアミノ酸（ここで、ｎは７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０またはそれ以上）である）を有するポリペプチドを含む組成物に関する。いくつかの態様において、本組成物は、表１のいずれか１つの式、好ましくは式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ２、式Ｏ６、および式Ｏ２５Ｂから選択される糖類をさらに含み、式中、ｎは、１〜１００、好ましくは３１〜１００の整数である。

図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図１Ａ〜１Ｈは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図２Ａ〜２Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを示す図である。発現および精製の結果を示す図である。発現および精製の結果を示す図である。発現の結果を示す図である。図６Ａ〜６Ｃは、ｐＳＢ０２０８３およびｐＳＢ０２１５８のＳＥＣプールおよび収量を含めた親和性を示す図である。図６Ａ〜６Ｃは、ｐＳＢ０２０８３およびｐＳＢ０２１５８のＳＥＣプールおよび収量を含めた親和性を示す図である。図６Ａ〜６Ｃは、ｐＳＢ０２０８３およびｐＳＢ０２１５８のＳＥＣプールおよび収量を含めた親和性を示す図である。ｐＳＢ２１９８ＦｉｍＨｄｓｃＧロック変異型構築物の発現の結果を示す図である。ｐＳＢ２３０７ＦｉｍＨｄｓｃＧ野生型の発現の結果を示す図である。図９Ａ〜９Ｃは、ポリメラーゼ依存性経路により合成された、骨格に４つ以下の残基を有するＯ抗原の構造を示す図である。図９Ａ〜９Ｃは、ポリメラーゼ依存性経路により合成された、骨格に４つ以下の残基を有するＯ抗原の構造を示す図である。図９Ａ〜９Ｃは、ポリメラーゼ依存性経路により合成された、骨格に４つ以下の残基を有するＯ抗原の構造を示す図である。図１０Ａは、ポリメラーゼ依存性経路により合成された、骨格に５つまたは６つの残基を有するＯ抗原の構造を示す図である。図１０Ｂは、ＡＢＣトランスポーター依存性経路により合成されると考えられるＯ抗原を示す図である。図１０Ａは、ポリメラーゼ依存性経路により合成された、骨格に５つまたは６つの残基を有するＯ抗原の構造を示す図である。図１０Ｂは、ＡＢＣトランスポーター依存性経路により合成されると考えられるＯ抗原を示す図である。ＦｉｍＨタンパク質を安定化し、マンノース結合を許容しうる脂肪族疎水性側鎖を有する他のアミノ酸、例えばＩｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌとのＰｈｅ１の変異誘発のコンピュータによるスキャニングを示す図である。図１２Ａ〜１２Ｂは、ｐＵＣレプリコンプラスミド、細胞当たり５００〜７００コピー、鎖長調節因子（図１２Ａ）、およびＰ１５ａレプリコンプラスミド、細胞当たり１０〜１２コピー、Ｏ抗原オペロン（図１２Ｂ）の各プラスミドを示す図である。図１２Ａ〜１２Ｂは、ｐＵＣレプリコンプラスミド、細胞当たり５００〜７００コピー、鎖長調節因子（図１２Ａ）、およびＰ１５ａレプリコンプラスミド、細胞当たり１０〜１２コピー、Ｏ抗原オペロン（図１２Ｂ）の各プラスミドを示す図である。図１３Ａ〜１３Ｂは、異種ｗｚｚＢおよびｆｅｐＥ鎖長調節因子のプラスミドに基づく発現による、血清型Ｏ２５ａ株およびＯ２５ｂ株におけるＯ抗原鎖長の調整を示す図である。ｗｚｚＢノックアウト株Ｏ２５Ｋ５Ｈ１（Ｏ２５ａ）およびＧＡＲ２４０１（Ｏ２５ｂ）のプラスミド形質転換体におけるＬＰＳ発現の遺伝的相補性が示されている。図１３Ａの左側には、Ｏ２５ａＯ２５Ｋ５ＨΔｗｚｚＢのプラスミド形質転換体のＬＰＳプロファイルが示され、右側には、Ｏ２５ｂＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体の類似したプロファイルが示されている。図１３Ｂには、Ｏ２５特異的血清（ＳｔａｔｅｎｓＳｅｒｕｍＩｎｓｔｉｔｕｔ）でプローブした複製ゲルのイムノブロットが示されている。Ｏ２５ａ ΔｗｘｘＢ（ノックアウト）バックグラウンドがレーン１〜７に関連し、Ｏ２５ｂ２４０１ ΔｗｚｚＢ（ノックアウト）バックグラウンドがレーン８〜１５に関連する。図１３Ａ〜１３Ｂは、異種ｗｚｚＢおよびｆｅｐＥ鎖長調節因子のプラスミドに基づく発現による、血清型Ｏ２５ａ株およびＯ２５ｂ株におけるＯ抗原鎖長の調整を示す図である。ｗｚｚＢノックアウト株Ｏ２５Ｋ５Ｈ１（Ｏ２５ａ）およびＧＡＲ２４０１（Ｏ２５ｂ）のプラスミド形質転換体におけるＬＰＳ発現の遺伝的相補性が示されている。図１３Ａの左側には、Ｏ２５ａＯ２５Ｋ５ＨΔｗｚｚＢのプラスミド形質転換体のＬＰＳプロファイルが示され、右側には、Ｏ２５ｂＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体の類似したプロファイルが示されている。図１３Ｂには、Ｏ２５特異的血清（ＳｔａｔｅｎｓＳｅｒｕｍＩｎｓｔｉｔｕｔ）でプローブした複製ゲルのイムノブロットが示されている。Ｏ２５ａ ΔｗｘｘＢ（ノックアウト）バックグラウンドがレーン１〜７に関連し、Ｏ２５ｂ２４０１ ΔｗｚｚＢ（ノックアウト）バックグラウンドがレーン８〜１５に関連する。宿主Ｏ２５Ｋ５Ｈ１ΔｗｚｚＢにおいてＥ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａｆｅｐＥプラスミドによってもたらされた長鎖Ｏ抗原の発現を示す図である。多様な臨床分離株において、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｆｅｐＥの発現が、長鎖Ｏ抗原ＬＰＳを生成することを示す図である。図１６Ａ〜１６Ｂは、Ｏ２５ｂＯ抗原ノックアウト宿主株における、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原ＬＰＳの、プラスミドを介したアラビノース誘導性発現を示す図である。ＳＰＳＰＡＧＥの結果が図１６Ａに示され、Ｏ２５イムノブロットの結果が図１６Ｂに示される。図１６Ａと図１６Ｂの両方において、レーン１は、クローン１、アラビノースなしのものであり、レーン２は、クローン１、０．２％アラビノースのものであり、レーン３は、クローン９、アラビノースなしのものであり、レーン４は、クローン９、０．２％アラビノースのものであり、レーン５は、Ｏ５５Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ標品のものであり、レーン６は、Ｏ１１１Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ標品のものである。共通の宿主株における、長鎖Ｏ抗原ＬＰＳの、プラスミドを介したアラビノース誘導性発現を示す図である。探索的バイオプロセス（ＥｘｐｌｏｒａｔｏｒｙＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓ）株におけるＯ２５Ｏ抗原ＬＰＳの発現を示す図である。図１９Ａ〜１９Ｂは、ＧＡＲ２８３１および‘２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥの各株から精製された、短鎖Ｏ２５ｂＯ抗原（図１９Ａ、株１Ｏ２５ｂ野生型（ｗｔ）２８３１）および長鎖Ｏ２５ｂＯ抗原（図１９Ｂ、株２Ｏ２５ｂ２４０１ΔｗｚｚＢ／ＬＴ２ＦｅｐＥ）のＳＥＣプロファイルおよび特性を示す図である。図１９Ａ〜１９Ｂは、ＧＡＲ２８３１および‘２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥの各株から精製された、短鎖Ｏ２５ｂＯ抗原（図１９Ａ、株１Ｏ２５ｂ野生型（ｗｔ）２８３１）および長鎖Ｏ２５ｂＯ抗原（図１９Ｂ、株２Ｏ２５ｂ２４０１ΔｗｚｚＢ／ＬＴ２ＦｅｐＥ）のＳＥＣプロファイルおよび特性を示す図である。図２０Ａ〜２０Ｂは、ウサギにおける接種スケジュールを示す図である。（図２０Ａ）ウサギ研究１ＶＡＣ−２０１７−ＰＲＬ−ＥＣ−０７２３の接種スケジュールに関する情報、（図２０Ｂ）ウサギ研究２ＶＡＣ−２０１８−ＰＲＬ−ＥＣ−０７７の接種スケジュール。図２０Ａ〜２０Ｂは、ウサギにおける接種スケジュールを示す図である。（図２０Ａ）ウサギ研究１ＶＡＣ−２０１７−ＰＲＬ−ＥＣ−０７２３の接種スケジュールに関する情報、（図２０Ｂ）ウサギ研究２ＶＡＣ−２０１８−ＰＲＬ−ＥＣ−０７７の接種スケジュール。図２１Ａ〜２１Ｃは、Ｏ２５ｂグリココンジュゲートのＩｇＧ応答を示す図である。−●−は採血前の結果を表し、−■−は採血１（６週）の結果を表し、−▲−は採血２（８週）の結果を表し、−◆−は採血３（１２週）の結果を表す。図２１Ａは、ウサギ１−３（中活性化）の結果を示し、図２１Ｂは、ウサギ２−３（低活性化）の結果を示し、図２１Ｃは、ウサギ３−１（高活性化）の結果を示す。図２１Ａ〜２１Ｃは、Ｏ２５ｂグリココンジュゲートのＩｇＧ応答を示す図である。−●−は採血前の結果を表し、−■−は採血１（６週）の結果を表し、−▲−は採血２（８週）の結果を表し、−◆−は採血３（１２週）の結果を表す。図２１Ａは、ウサギ１−３（中活性化）の結果を示し、図２１Ｂは、ウサギ２−３（低活性化）の結果を示し、図２１Ｃは、ウサギ３−１（高活性化）の結果を示す。図２１Ａ〜２１Ｃは、Ｏ２５ｂグリココンジュゲートのＩｇＧ応答を示す図である。−●−は採血前の結果を表し、−■−は採血１（６週）の結果を表し、−▲−は採血２（８週）の結果を表し、−◆−は採血３（１２週）の結果を表す。図２１Ａは、ウサギ１−３（中活性化）の結果を示し、図２１Ｂは、ウサギ２−３（低活性化）の結果を示し、図２１Ｃは、ウサギ３−１（高活性化）の結果を示す。図２２Ａ〜２２Ｆは、コンジュゲートされていない多糖、すなわち、遊離Ｏ２５ｂ多糖（図２２Ａ〜２２Ｃ、−●−は、ウサギＡ−１の採血前の結果を表し、−■−は、第６週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表し、−▲−は、第８週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表す）と比較した、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲート、すなわち、低活性化Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（図２２Ｄ〜２２Ｆ、−●−は、ウサギ２−１の採血前の結果を表し、−■−は、第１２週のウサギ２−１の抗血清の結果を表す）に対するＩｇＧ応答を示す図である。ＭＦＩは、１０００未満のＭＦＩ範囲における免疫前抗体と免疫抗体との差を強調するために、ログスケールでプロットされていることに留意されたい。図２２Ａは、ウサギＡ−１（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｂは、ウサギＡ−３（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｃは、ウサギＡ−４（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｄは、ウサギ２−１（低活性化）の結果を示し、図２２Ｅは、ウサギ２−２（低活性化）の結果を示し、図２２Ｆは、ウサギ２−３（低活性化）の結果を示す。図２２Ａ〜２２Ｆは、コンジュゲートされていない多糖、すなわち、遊離Ｏ２５ｂ多糖（図２２Ａ〜２２Ｃ、−●−は、ウサギＡ−１の採血前の結果を表し、−■−は、第６週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表し、−▲−は、第８週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表す）と比較した、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲート、すなわち、低活性化Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（図２２Ｄ〜２２Ｆ、−●−は、ウサギ２−１の採血前の結果を表し、−■−は、第１２週のウサギ２−１の抗血清の結果を表す）に対するＩｇＧ応答を示す図である。ＭＦＩは、１０００未満のＭＦＩ範囲における免疫前抗体と免疫抗体との差を強調するために、ログスケールでプロットされていることに留意されたい。図２２Ａは、ウサギＡ−１（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｂは、ウサギＡ−３（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｃは、ウサギＡ−４（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｄは、ウサギ２−１（低活性化）の結果を示し、図２２Ｅは、ウサギ２−２（低活性化）の結果を示し、図２２Ｆは、ウサギ２−３（低活性化）の結果を示す。図２２Ａ〜２２Ｆは、コンジュゲートされていない多糖、すなわち、遊離Ｏ２５ｂ多糖（図２２Ａ〜２２Ｃ、−●−は、ウサギＡ−１の採血前の結果を表し、−■−は、第６週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表し、−▲−は、第８週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表す）と比較した、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲート、すなわち、低活性化Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（図２２Ｄ〜２２Ｆ、−●−は、ウサギ２−１の採血前の結果を表し、−■−は、第１２週のウサギ２−１の抗血清の結果を表す）に対するＩｇＧ応答を示す図である。ＭＦＩは、１０００未満のＭＦＩ範囲における免疫前抗体と免疫抗体との差を強調するために、ログスケールでプロットされていることに留意されたい。図２２Ａは、ウサギＡ−１（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｂは、ウサギＡ−３（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｃは、ウサギＡ−４（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｄは、ウサギ２−１（低活性化）の結果を示し、図２２Ｅは、ウサギ２−２（低活性化）の結果を示し、図２２Ｆは、ウサギ２−３（低活性化）の結果を示す。図２２Ａ〜２２Ｆは、コンジュゲートされていない多糖、すなわち、遊離Ｏ２５ｂ多糖（図２２Ａ〜２２Ｃ、−●−は、ウサギＡ−１の採血前の結果を表し、−■−は、第６週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表し、−▲−は、第８週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表す）と比較した、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲート、すなわち、低活性化Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（図２２Ｄ〜２２Ｆ、−●−は、ウサギ２−１の採血前の結果を表し、−■−は、第１２週のウサギ２−１の抗血清の結果を表す）に対するＩｇＧ応答を示す図である。ＭＦＩは、１０００未満のＭＦＩ範囲における免疫前抗体と免疫抗体との差を強調するために、ログスケールでプロットされていることに留意されたい。図２２Ａは、ウサギＡ−１（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｂは、ウサギＡ−３（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｃは、ウサギＡ−４（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｄは、ウサギ２−１（低活性化）の結果を示し、図２２Ｅは、ウサギ２−２（低活性化）の結果を示し、図２２Ｆは、ウサギ２−３（低活性化）の結果を示す。図２２Ａ〜２２Ｆは、コンジュゲートされていない多糖、すなわち、遊離Ｏ２５ｂ多糖（図２２Ａ〜２２Ｃ、−●−は、ウサギＡ−１の採血前の結果を表し、−■−は、第６週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表し、−▲−は、第８週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表す）と比較した、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲート、すなわち、低活性化Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（図２２Ｄ〜２２Ｆ、−●−は、ウサギ２−１の採血前の結果を表し、−■−は、第１２週のウサギ２−１の抗血清の結果を表す）に対するＩｇＧ応答を示す図である。ＭＦＩは、１０００未満のＭＦＩ範囲における免疫前抗体と免疫抗体との差を強調するために、ログスケールでプロットされていることに留意されたい。図２２Ａは、ウサギＡ−１（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｂは、ウサギＡ−３（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｃは、ウサギＡ−４（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｄは、ウサギ２−１（低活性化）の結果を示し、図２２Ｅは、ウサギ２−２（低活性化）の結果を示し、図２２Ｆは、ウサギ２−３（低活性化）の結果を示す。図２２Ａ〜２２Ｆは、コンジュゲートされていない多糖、すなわち、遊離Ｏ２５ｂ多糖（図２２Ａ〜２２Ｃ、−●−は、ウサギＡ−１の採血前の結果を表し、−■−は、第６週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表し、−▲−は、第８週のウサギＡ−１の抗血清の結果を表す）と比較した、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲート、すなわち、低活性化Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（図２２Ｄ〜２２Ｆ、−●−は、ウサギ２−１の採血前の結果を表し、−■−は、第１２週のウサギ２−１の抗血清の結果を表す）に対するＩｇＧ応答を示す図である。ＭＦＩは、１０００未満のＭＦＩ範囲における免疫前抗体と免疫抗体との差を強調するために、ログスケールでプロットされていることに留意されたい。図２２Ａは、ウサギＡ−１（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｂは、ウサギＡ−３（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｃは、ウサギＡ−４（コンジュゲートされていない多糖）の結果を示し、図２２Ｄは、ウサギ２−１（低活性化）の結果を示し、図２２Ｅは、ウサギ２−２（低活性化）の結果を示し、図２２Ｆは、ウサギ２−３（低活性化）の結果を示す。図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｏ２５ｂ抗血清で検出された、天然Ｏ２５ｂＯ抗原と長鎖Ｏ２５ｂＯ抗原との表面発現を示す図である。図２３Ａは、−●−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２８３１の結果を表し、−■−が採血前に対するＯ２５ｂ２８３１野生型の結果を表し、−▲−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２８３１／ｆｅｐＥの結果を表し、−▼−が採血前に対するＯ２５ｂ２８３１／ｆｅｐＥの結果を表す、結果を示す図である。図２３Ｂは、−●−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２４０１の結果を表し、−■−が採血前に対するＯ２５ｂ２４０１の結果を表し、−▲−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２４０１／ｆｅｐＥの結果を表し、−▼−が採血前に対するＯ２５ｂ２４０１／ｆｅｐＥの結果を表す、結果を示す図である。図２３Ｃは、−●−がＰＤ３抗血清に対するＥ．ｃｏｌｉＫ１２の結果を表し、−■−が採血前に対するＥ．ｃｏｌｉＫ１２の結果を表す、結果を示す図である。図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｏ２５ｂ抗血清で検出された、天然Ｏ２５ｂＯ抗原と長鎖Ｏ２５ｂＯ抗原との表面発現を示す図である。図２３Ａは、−●−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２８３１の結果を表し、−■−が採血前に対するＯ２５ｂ２８３１野生型の結果を表し、−▲−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２８３１／ｆｅｐＥの結果を表し、−▼−が採血前に対するＯ２５ｂ２８３１／ｆｅｐＥの結果を表す、結果を示す図である。図２３Ｂは、−●−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２４０１の結果を表し、−■−が採血前に対するＯ２５ｂ２４０１の結果を表し、−▲−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２４０１／ｆｅｐＥの結果を表し、−▼−が採血前に対するＯ２５ｂ２４０１／ｆｅｐＥの結果を表す、結果を示す図である。図２３Ｃは、−●−がＰＤ３抗血清に対するＥ．ｃｏｌｉＫ１２の結果を表し、−■−が採血前に対するＥ．ｃｏｌｉＫ１２の結果を表す、結果を示す図である。図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｏ２５ｂ抗血清で検出された、天然Ｏ２５ｂＯ抗原と長鎖Ｏ２５ｂＯ抗原との表面発現を示す図である。図２３Ａは、−●−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２８３１の結果を表し、−■−が採血前に対するＯ２５ｂ２８３１野生型の結果を表し、−▲−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２８３１／ｆｅｐＥの結果を表し、−▼−が採血前に対するＯ２５ｂ２８３１／ｆｅｐＥの結果を表す、結果を示す図である。図２３Ｂは、−●−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２４０１の結果を表し、−■−が採血前に対するＯ２５ｂ２４０１の結果を表し、−▲−がＰＤ３抗血清に対するＯ２５ｂ２４０１／ｆｅｐＥの結果を表し、−▼−が採血前に対するＯ２５ｂ２４０１／ｆｅｐＥの結果を表す、結果を示す図である。図２３Ｃは、−●−がＰＤ３抗血清に対するＥ．ｃｏｌｉＫ１２の結果を表し、−■−が採血前に対するＥ．ｃｏｌｉＫ１２の結果を表す、結果を示す図である。５つの既知の化学型の外側コアオリゴ糖の炭水化物骨格の一般化構造を示す図である。特記なき限り、すべてのグリコースがα−アノマー構成にある。産物が各結合の形成を触媒する遺伝子は、破線矢印で示されている。アステリスクは、Ｏ抗原の結合が生じるコアオリゴ糖の残基を意味する。コンジュゲートされていない遊離Ｏ２５ｂ多糖に免疫原性がないことを示す（ｄＬＩＡ）図である。−●−は、第１８週（１週＝ＰＤ４）の４−１の抗血清の結果を表し、−■−は、第１８週（１週＝ＰＤ４）の４−２の抗血清の結果を表し、−▲−は、第１８週（１週＝ＰＤ４）の５−１の抗血清の結果を表し、−▼−は、第１８週（１週＝ＰＤ４）の５−２の抗血清の結果を表し、−＊−は、第１８週（１週＝ＰＤ４）の６−１の抗血清の結果を表し、−∧−は、第１８週（１週＝ＰＤ４）の６−２の抗血清の結果を表す。図２６Ａ〜２６Ｃは、仔ウサギ補体（ＢＲＣ）ウサギＯ２５ｂ還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）コンジュゲートの免疫血清オプソニン食作用性アッセイ（ＯＰＡ）力価の特異性を示すグラフである。図２６Ａは、ウサギ２−３の免疫前血清（−●−）および第１３週の免疫後血清（−■−）のＯＰＡ力価を示す。図２６Ｂは、ウサギ１−２の免疫前血清（−●−）および第１９週の免疫後血清（−■−）のＯＰＡ力価を示す。図２６Ｃは、ウサギ１−２免疫血清のＯＰＡ活性が、精製されたコンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖１００μｇ／ｍＬとのプレインキュベーションによってブロックされた、ウサギ１−２の第１９週のＯＰＡ力価特異性を示し、−■−は、第１９週のウサギ１−２免疫血清の結果を表し、−▼−は、第１９週のウサギ１−２のｗ／Ｒ１長鎖ＯＡｇの結果を表す。図２６Ａ〜２６Ｃは、仔ウサギ補体（ＢＲＣ）ウサギＯ２５ｂ還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）コンジュゲートの免疫血清オプソニン食作用性アッセイ（ＯＰＡ）力価の特異性を示すグラフである。図２６Ａは、ウサギ２−３の免疫前血清（−●−）および第１３週の免疫後血清（−■−）のＯＰＡ力価を示す。図２６Ｂは、ウサギ１−２の免疫前血清（−●−）および第１９週の免疫後血清（−■−）のＯＰＡ力価を示す。図２６Ｃは、ウサギ１−２免疫血清のＯＰＡ活性が、精製されたコンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖１００μｇ／ｍＬとのプレインキュベーションによってブロックされた、ウサギ１−２の第１９週のＯＰＡ力価特異性を示し、−■−は、第１９週のウサギ１−２免疫血清の結果を表し、−▼−は、第１９週のウサギ１−２のｗ／Ｒ１長鎖ＯＡｇの結果を表す。図２６Ａ〜２６Ｃは、仔ウサギ補体（ＢＲＣ）ウサギＯ２５ｂ還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）コンジュゲートの免疫血清オプソニン食作用性アッセイ（ＯＰＡ）力価の特異性を示すグラフである。図２６Ａは、ウサギ２−３の免疫前血清（−●−）および第１３週の免疫後血清（−■−）のＯＰＡ力価を示す。図２６Ｂは、ウサギ１−２の免疫前血清（−●−）および第１９週の免疫後血清（−■−）のＯＰＡ力価を示す。図２６Ｃは、ウサギ１−２免疫血清のＯＰＡ活性が、精製されたコンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖１００μｇ／ｍＬとのプレインキュベーションによってブロックされた、ウサギ１−２の第１９週のＯＰＡ力価特異性を示し、−■−は、第１９週のウサギ１−２免疫血清の結果を表し、−▼−は、第１９週のウサギ１−２のｗ／Ｒ１長鎖ＯＡｇの結果を表す。図２７Ａは、例示的な投与スケジュールの例を示す図である。図２７Ｂおよび図２７Ｃは、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖（図２７Ｂ、Ｏ２５ｂ遊離多糖（２μｇ））、および得られたＯ２５ｂＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲート（図２７Ｃ、Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ_１９７ＲＡＣ長鎖（２μｇ））によって生じたＯ抗原Ｏ２５ｂＩｇＧレベルを示すグラフであり、−…−（点線）は、ナイーブＣＤ１Ｏ２５ｂＩｇＧレベルを表す。図２７Ａは、例示的な投与スケジュールの例を示す図である。図２７Ｂおよび図２７Ｃは、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖（図２７Ｂ、Ｏ２５ｂ遊離多糖（２μｇ））、および得られたＯ２５ｂＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲート（図２７Ｃ、Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ_１９７ＲＡＣ長鎖（２μｇ））によって生じたＯ抗原Ｏ２５ｂＩｇＧレベルを示すグラフであり、−…−（点線）は、ナイーブＣＤ１Ｏ２５ｂＩｇＧレベルを表す。図２７Ａは、例示的な投与スケジュールの例を示す図である。図２７Ｂおよび図２７Ｃは、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖（図２７Ｂ、Ｏ２５ｂ遊離多糖（２μｇ））、および得られたＯ２５ｂＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲート（図２７Ｃ、Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ_１９７ＲＡＣ長鎖（２μｇ））によって生じたＯ抗原Ｏ２５ｂＩｇＧレベルを示すグラフであり、−…−（点線）は、ナイーブＣＤ１Ｏ２５ｂＩｇＧレベルを表す。図２８Ａ〜２８Ｂは、ＲＡＣ、ｅＴＥＣＯ２５ｂ長鎖グリココンジュゲート、および単一末端グリココンジュゲートの２投与後（図２８Ａ）および３投与後（図２８Ｂ）のＯＰＡ免疫原性を示すグラフであり、−○−は、単一末端短鎖２μｇの結果を表し、−●−は、単一末端長鎖２μｇの結果を表し、−▲−は、ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖２μｇの結果を表し、−▼−は、ｅＴＥＣ長鎖２μｇの結果を表し、＊は、バックグラウンド対照（ｎ＝２０）を表す。†レスポンダー率は、接種をしていないベースラインの２倍を超える力価を有するマウスの割合（％）である。図２８Ａ〜２８Ｂは、ＲＡＣ、ｅＴＥＣＯ２５ｂ長鎖グリココンジュゲート、および単一末端グリココンジュゲートの２投与後（図２８Ａ）および３投与後（図２８Ｂ）のＯＰＡ免疫原性を示すグラフであり、−○−は、単一末端短鎖２μｇの結果を表し、−●−は、単一末端長鎖２μｇの結果を表し、−▲−は、ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖２μｇの結果を表し、−▼−は、ｅＴＥＣ長鎖２μｇの結果を表し、＊は、バックグラウンド対照（ｎ＝２０）を表す。†レスポンダー率は、接種をしていないベースラインの２倍を超える力価を有するマウスの割合（％）である。ｅＴＥＣ化学のＯＰＡ免疫原性および多糖の活性化レベルの変化を示すグラフである。†レスポンダー率は、接種をしていないベースラインの２倍を超える力価を有するマウスの割合（％）である。図３０Ａ〜３０Ｂは、例示的な投与スケジュール（図３０Ａ）の例、およびＥ．ｃｏｌｉｅＴＥＣコンジュゲートの投与によって免疫処置したマウスの、Ｏ２５ｂ分離株の致死的負荷からの防御を示すグラフ（図３０Ｂ）である。−◇−は、ｅＴＥＣ長鎖１７％活性化を表し、−△−は、ｅＴＥＣ長鎖１０％活性化を表し、−▽−は、ｅＴＥＣ長鎖４％活性化を表し、−□−は、Ｏ２５ｂ多糖を表し、−○−は、接種をしていない対照を表す。図３０Ａ〜３０Ｂは、例示的な投与スケジュール（図３０Ａ）の例、およびＥ．ｃｏｌｉｅＴＥＣコンジュゲートの投与によって免疫処置したマウスの、Ｏ２５ｂ分離株の致死的負荷からの防御を示すグラフ（図３０Ｂ）である。−◇−は、ｅＴＥＣ長鎖１７％活性化を表し、−△−は、ｅＴＥＣ長鎖１０％活性化を表し、−▽−は、ｅＴＥＣ長鎖４％活性化を表し、−□−は、Ｏ２５ｂ多糖を表し、−○−は、接種をしていない対照を表す。単一末端コンジュゲートの例示的な調製を示す概略図であり、このコンジュゲーションプロセスは、チオール官能基を露出させた後の、ジスルフィドアミンリンカーによる２−ケト−３−デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）の選択的活性化を含む。ＫＤＯは次いで、図３１に示されるように、ブロモ活性化型ＣＲＭ_１９７タンパク質にコンジュゲートされる（単一末端コンジュゲートの調製）。図３２Ａ〜３２Ｂは、ＣＲＭ_１９７とのＥ．ｃｏｌｉグリココンジュゲートの調製に使用される活性化プロセス（図３２Ａ）およびコンジュゲーションプロセス（図３２Ｂ）の例示的なプロセスフロー図である。図３２Ａ〜３２Ｂは、ＣＲＭ_１９７とのＥ．ｃｏｌｉグリココンジュゲートの調製に使用される活性化プロセス（図３２Ａ）およびコンジュゲーションプロセス（図３２Ｂ）の例示的なプロセスフロー図である。

配列の説明
配列番号１は、野生型の１型線毛Ｄ−マンノース特異的アドヘシン［ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＦｉｍＨＪ９６］のアミノ酸配列を示す。

配列番号２は、配列番号１のアミノ酸（ａａ）残基２２〜３００に対応する、ＦｉｍＨの断片（成熟ＦｉｍＨタンパク質）のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＦｉｍＨレクチンドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号４は、ＦｉｍＨピリンドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチド（ｐＳＢ０２１９８−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のＦｉｍＨｍＩｇＫシグナルペプチド／Ｆ２２．．Ｑ３００Ｊ９６ＦｉｍＨＮ２８ＳＶ４８ＣＬ５５ＣＮ９１ＳＮ２４９Ｑ／７ＡＡリンカー／ＦｉｍＧＡ１．．Ｋ１４／ＧＧＨｉｓ８）のアミノ酸配列を示す。

配列番号６は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチド（ｐＳＢ０２３０７−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のＦｉｍＨｍＩｇＫシグナルペプチド／Ｆ２２．．Ｑ３００Ｊ９６ＦｉｍＨＮ２８ＳＮ９１ＳＮ２４９Ｑ／Ｈｉｓ８）のアミノ酸配列を示す。

配列番号７は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドの断片（ｐＳＢ０２０８３ＦｉｍＨレクチンドメイン野生型構築物）のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドの断片（ｐＳＢ０２１５８ＦｉｍＨレクチンドメインロック変異体）のアミノ酸配列を示す。

配列番号９は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＧに由来するポリペプチドの断片（ＦｉｍＧＡ１．．Ｋ１４）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＣに由来するポリペプチドの断片のアミノ酸配列を示す。

配列番号１１は、４ａａリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、５ａａリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、６ａａリンカーのアミノ酸配列を示す。

配列番号１４は、７ａａリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、８ａａリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、９ａａリンカーのアミノ酸配列を示す。

配列番号１７は、１０ａａリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ＦｉｍＨＪ９６シグナル配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、配列番号５（ｐＳＢ０２１９８−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のＦｉｍＨｍＩｇＫシグナルペプチド／Ｆ２２．．Ｑ３００Ｊ９６ＦｉｍＨＮ２８ＳＶ４８ＣＬ５５ＣＮ９１ＳＮ２４９Ｑ／７ＡＡリンカー／ＦｉｍＧＡ１．．Ｋ１４／ＧＧＨｉｓ８）のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。

配列番号２０は、配列番号５によるＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチド（ｐＳＢ０２１９８−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のＦｉｍＨｍＩｇＫシグナルペプチド／Ｆ２２．．Ｑ３００Ｊ９６ＦｉｍＨＮ２８ＳＶ４８ＣＬ５５ＣＮ９１ＳＮ２４９Ｑ／７ＡＡリンカー／ＦｉｍＧＡ１．．Ｋ１４／ＧＧＨｉｓ８の成熟タンパク質）のアミノ酸配列を示す。

配列番号２１は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＧに由来するポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、配列番号６（ｐＳＢ０２３０７−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のＦｉｍＨｍＩｇＫシグナルペプチド／Ｆ２２．．Ｑ３００Ｊ９６ＦｉｍＨＮ２８ＳＮ９１ＳＮ２４９Ｑ／Ｈｉｓ８）のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。

配列番号２３は、配列番号６によるＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチド（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のＦｉｍＨｍＩｇＫシグナルペプチド／Ｆ２２．．Ｑ３００Ｊ９６ＦｉｍＨＮ２８ＳＮ９１ＳＮ２４９Ｑ／Ｈｉｓ８の成熟タンパク質）のアミノ酸配列を示す。

配列番号２４は、配列番号７によるＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチド（ｐＳＢ０２０８３ＦｉｍＨレクチンドメイン野生型構築物の成熟タンパク質）のアミノ酸配列を示す。

配列番号２５は、Ｈｉｓタグのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、配列番号８によるＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチド（ｐＳＢ０２１５８ＦｉｍＨレクチンドメインロック変異体の成熟タンパク質）のアミノ酸配列を示す。

配列番号２７は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチド（ｐＳＢ０１８７８）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチド（Ｋ１２）のアミノ酸配列を示す。

配列番号２９は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチド（ＵＴＩ８９）のアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、Ｏ２５ｂ２４０１ＷｚｚＢのアミノ酸配列を示す。

配列番号３１は、Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ＷｚｚＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、Ｏ２５ａＥＴＥＣＡＴＣＣＷｚｚＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、Ｋ１２Ｗ３１１０ＷｚｚＢのアミノ酸配列を示す。

配列番号３４は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ＷｚｚＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、Ｏ２５ｂ２４０１ＦｅｐＥのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ＦｅｐＥのアミノ酸配列を示す。

配列番号３７は、Ｏ２５ａＥＴＥＣＡＴＣＣＦｅｐＥのアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、Ｏ１５７ＦｅｐＥのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ＦｅｐＥのアミノ酸配列を示す。

配列番号４０は、ＬＴ２ｗｚｚＢ＿Ｓのプライマー配列を示す。
配列番号４１は、ＬＴ２ｗｚｚＢ＿ＡＳのプライマー配列を示す。
配列番号４２は、Ｏ２５ｂＦｅｐＥ＿Ｓのプライマー配列を示す。

配列番号４３は、Ｏ２５ｂＦｅｐＥ＿Ａのプライマー配列を示す。
配列番号４４は、ｗｚｚＢＰ１＿Ｓのプライマー配列を示す。
配列番号４５は、ｗｚｚＢＰ２＿ＡＳのプライマー配列を示す。

配列番号４６は、ｗｚｚＢＰ３＿Ｓのプライマー配列を示す。
配列番号４７は、ｗｚｚＢＰ４＿ＡＳのプライマー配列を示す。
配列番号４８は、Ｏ１５７ＦｅｐＥ＿Ｓのプライマー配列を示す。

配列番号４９は、Ｏ１５７ＦｅｐＥ＿ＡＳのプライマー配列を示す。
配列番号５０は、ｐＢＡＤ３３＿ａｄａｐｔｏｒ＿Ｓのプライマー配列を示す。
配列番号５１は、ｐＢＡＤ３３＿ａｄａｐｔｏｒ＿ＡＳのプライマー配列を示す。

配列番号５２は、ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ＿ｒのプライマー配列を示す。
配列番号５３は、ｇｎｄ＿ｆのプライマー配列を示す。
配列番号５４は、マウスＩｇＫシグナル配列のアミノ酸配列を示す。

配列番号５５は、ヒトＩｇＧ受容体ＦｃＲｎ大サブユニットｐ５１のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、ヒトＩＬ１０タンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。

配列番号５７は、ヒト呼吸器多核体ウイルスＡ（株Ａ２）融合糖タンパク質Ｆ０シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、インフルエンザＡ血球凝集素シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。

配列番号５９〜１０１は、ナノ構造関連ポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
配列番号１０２〜１０９は、シグナルペプチド予測に使用された様々な種のＳｉｇｎａｌＰ４．１（ＤＴＵＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）による配列を示す。

本発明者らは、発現のために哺乳動物細胞を使用することにより、Ｅ．ｃｏｌｉアドヘシンタンパク質に由来するポリペプチドの生成の課題を克服した。本開示の随所および実施例のセクションに例示されるように、哺乳動物細胞による組換えポリペプチドの発現は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリペプチドの発現と比較して高い収量を一貫して達成したことが発見された。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、組換えポリペプチドおよびその断片を望ましい立体構造で安定化させる変異および発現構築物を同定した。

感染の一次段階、すなわち宿主細胞の受容体への細菌の付着および粘膜表面への定着を妨げることは、細菌感染を予防し、治療し、かつ／またはその可能性を低減させるために重要である。細菌の付着には、アドヘシンと呼ばれる細菌表面タンパク質と宿主細胞受容体との間の相互作用が関与しうる。ＦｉｍＨアドヘシン（尿路疾患性Ｅ．ｃｏｌｉ由来）を用いた過去の前臨床研究は、アドヘシンに対して抗体が生じることを確認している。中耳炎および齲歯から肺炎および敗血症に至るまで、感染症を予防する取り組みにおいて、アドヘシンの同定、特性評価、および単離における進歩が必要とされている。

ＦｉｍＨなどのアドヘシンタンパク質およびその断片を商業規模で生成するためには、ポリペプチドおよびその断片が十分な量で長時間にわたり、かつ好ましい立体構造で発現しうるように、好適な構築物および好適な宿主を同定する必要がある。例えば、いくつかの態様において、組換えポリペプチドの好ましい立体構造は、モノマンノースに対して低い親和性（例えば、Ｋ_ｄ約３００μＭ）を呈する。いくつかの態様において、好ましい立体構造は、モノマンノースに対して高い親和性（例えば、Ｋ_ｄ＜１．２μＭ）を呈する。

Ｅ．ｃｏｌｉに由来するアドヘシンタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において組換え発現されてきた。しかしながら、その収量は１０ｍｇ／Ｌに満たなかった。Ｅ．ｃｏｌｉで産生する場合、繊毛に関連したアドヘシンを大量に精製することは困難でありうる。理論または機構に束縛されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉで発現した産物は、哺乳動物において効果的な免疫応答を生じさせるのに最適ではない立体構造を呈しうると示唆されている。

１つの側面において、本発明は、細菌アドヘシンタンパク質に由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え哺乳動物細胞を含む。
別の側面では、本発明は、ポリペプチドまたはその断片を哺乳動物細胞において産生する方法であって、（ｉ）哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、前記ポリペプチドまたはその断片を発現させるステップと、（ｉｉ）前記ポリペプチドまたはその断片を培養物から回収するステップとを含む方法を含む。本方法は、ポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含んでもよい。また本明細書では、本方法により生成されたポリペプチドまたはその断片も開示される。

別の側面では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片を含む組成物を含む。本組成物は、インビボ投与に好適なポリペプチドまたはその断片を含みうる。例えば、かかる組成物におけるポリペプチドまたはその断片は、質量基準で少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の純度を有しうる。本組成物は、アジュバントをさらに含んでもよい。

さらなる側面では、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を誘発するのに使用される組成物を含む。Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を誘発するための本明細書に記載の組成物の使用、およびＥ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を誘発するための薬物の製造における本明細書に記載の組成物の使用もまた、開示される。

Ｉ．Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドおよびその断片
１つの側面において、本明細書では、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、哺乳動物細胞が開示される。本明細書で使用される「に由来する」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失、または付加の導入によって変化している、本明細書に記載のＦｉｍＨポリペプチドもしくはＦｉｍＣＨポリペプチド複合体またはそれらの断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関するものである。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドまたは断片の配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型ＦｉｍＨポリペプチドもしくはＦｉｍＣＨポリペプチド複合体またはそれらの断片と同一の全長のアミノ酸を有する。

断片は、当該配列のうち、少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むべきであり、特定の配列に応じて、ｎは７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０またはそれ以上）である。好ましくは、断片は、配列のエピトープを含む。いくつかの態様において、断片は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドのアミノ酸配列のうち、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドまたは断片と比較して、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含む。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片と同様または同一の機能を有する。
好ましい態様では、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチド複合体またはそれらの断片は、単離または精製される。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ、好適な条件下で培養されると、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する前記ポリペプチドまたはその断片が、哺乳動物細胞によって発現される。

好ましい態様では、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、可溶性である。
いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、哺乳動物宿主細胞から分泌される。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｎ末端またはＣ末端の伸長のような、さらなるアミノ酸残基を含みうる。かかる伸長は、ポリペプチドまたはその断片の検出を容易にしうるタグ（例えば、モノクローナル抗体による検出のためのエピトープタグ）および／または精製を容易にしうるタグ（例えば、ニッケルキレート樹脂での精製を可能にするポリヒスチジンタグ）を１つまたは複数含んでもよい。いくつかの態様において、タグは、配列番号２１および配列番号２５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。このようなアフィニティ精製タグは、当技術分野において公知である。アフィニティ精製タグの例は、例えば、Ｈｉｓタグ（例えば金属イオンに結合しうるヘキサヒスチジン）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（例えばアミロースに結合しうる）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（例えばグルタチオンに結合しうる）、ＦＬＡＧタグ（例えば抗フラグ抗体に結合しうる）、Ｓｔｒｅｐタグ（例えばストレプトアビジンまたはその誘導体に結合しうる）を含む。好ましい態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｎ末端またはＣ末端の伸長のような、さらなるアミノ酸残基を含まない。いくつかの態様において、本明細書に記載のＥ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、外来性タグ配列を含まない。

本明細書では特定のＥ．ｃｏｌｉ株に言及する場合があるが、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、特記なき限り、特定の菌株に限定されないことを理解されたい。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドのＮ末端にフェニルアラニン残基を含む。いくつかの態様において、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｎ末端の最初の２０残基以内の位置にフェニルアラニン残基を含む。好ましくは、フェニルアラニン残基は、ポリペプチドの１位に位置する。例えば、いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片のＮ末端に、さらなるグリシン残基を含まない。

いくつかの態様において、野生型成熟Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨの１位のフェニルアラニン残基は、例えば、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌ残基のいずれか１つのような脂肪族疎水性アミノ酸によって置換されている。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を発現させるために、シグナルペプチドが使用される場合がある。タンパク質を生成するためのシグナル配列および発現カセットは、当技術分野において公知である。一般に、リーダーペプチドは５〜３０アミノ酸長であり、通常、新しく合成されたポリペプチドのＮ末端に存在する。シグナルペプチドは、一般的に、単一のアルファ−ヘリックスを形成する傾向がある疎水性アミノ酸の長い区間を含む。さらに、多くのシグナルペプチドは、正電荷を帯びたアミノ酸の短い区間から始まり、これは、転位置中のポリペプチドの形態を適切なものにすることに役立ちうる。シグナルペプチドの端部には、通常、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸の区間が存在する。シグナルペプチダーゼは、転位置中に切断する場合もあれば、転位置完了後に切断する場合もあり、遊離したシグナルペプチドおよび成熟タンパク質をもたらす。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、本明細書に記載のＥ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、切断可能なリンカーを含みうる。かかるリンカーは、例えばリンカーを切断することができる因子を加えることにより、精製された複合体からタグが分離されることを可能にする。切断可能なリンカーは、当技術分野において公知である。かかるリンカーは、例えば、感光性結合の照射または酸触媒加水分解によって切断されうる。切断可能なリンカーの別の例としては、プロテアーゼ認識部位を組み込み、好適なプロテアーゼ酵素の添加によって切断されうる、ポリペプチドリンカーが挙げられる。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドまたは断片と比較して修飾を含む。修飾は、ポリペプチドへの分子の共有結合を含みうる。例えば、かかる修飾は、既知の保護基／ブロッキング基によるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などを含みうる。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドまたは断片と比較して、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない当業者に公知の技術を使用した化学修飾などによる修飾を含みうる。別の態様では、修飾は、ポリペプチドへの脂質分子の共有結合を含みうる。いくつかの態様において、ポリペプチドは、対応する野生型Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片と比較して、ポリペプチドへの分子の共有結合を含まない。

例えば、細胞培養で生成されるタンパク質およびポリペプチドは、オリゴ糖鎖を含む共有結合した炭水化物構造を含む糖タンパク質でありうる。こうしたオリゴ糖鎖は、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかを介してタンパク質に結合している。オリゴ糖鎖は、糖タンパク質の質量の大部分を構成しうる。一般的に、Ｎ結合型オリゴ糖は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸でありうる）の標的コンセンサス配列におけるアスパラギン残基の側鎖上のアミノ基に付加される。いくつかの態様において、グリコシル化部位は、アスパラギン−グリシン−スレオニン（ＮＧＴ）、アスパラギン−イソロイシン−スレオニン（ＮＩＴ）、アスパラギン−グリシン−セリン（ＮＧＳ）、アスパラギン−セリン−スレオニン（ＮＳＴ）、およびアスパラギン−スレオニン−セリン（ＮＴＳ）のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。哺乳動物細胞において産生される、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、グリコシル化されていてもよい。グリコシル化は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の配列内のＮ結合型グリコシル化シグナルＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにおいて生じうる。「Ｎ結合型グリコシル化」とは、炭水化物部分がＧＩｃＮＡｃを介してポリペプチド鎖内のアスパラギン残基に結合することを意味する。Ｎ結合型炭水化物は、Ｍａｎ１−６（Ｍａｎ１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒという共通するコア構造を含み、ここで、Ｒは、生成されるＥ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片のアスパラギン残基を表す。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片におけるグリコシル化部位は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の配列内の変異によって除去される。例えば、いくつかの態様において、グリコシル化モチーフ（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）のＡｓｎ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。

いくつかの態様において、グリコシル化モチーフのＳｅｒ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。

いくつかの態様において、グリコシル化モチーフのＴｈｒ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片におけるグリコシル化部位（例えばＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は、除去も修飾もされない。いくつかの態様において、グリコシル化を減少させる、または阻害する化合物が、細胞培養培地に添加されてもよい。そのような態様において、ポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化を阻害する化合物が存在しないことを除けば同一の条件下で細胞によって産生される、それ以外は同一のポリペプチドまたはタンパク質と比べて、非グリコシル化（すなわち、アグリコシル化）部位、すなわち、付加された炭水化物部分のない、全く占有されていないグリカン部位を少なくとももう１つ含むか、または、同じ潜在的グリコシル化部位において、炭水化物部分を少なくとも１つ少なく含む。そのような化合物は当技術分野において公知であり、ツニカマイシン、ツニカマイシン相同体、ストレプトビルジン、ミコスポシジン（ｍｙｃｏｓｐｏｃｉｄｉｎ）、アンホマイシン、ツシマイシン、抗生物質２４０１０、抗生物質ＭＭ１９２９０、バシトラシン、コリネトキシン、ショードマイシン、ジュイマイシン（ｄｕｉｍｙｃｉｎ）、１−デオキシマンノノジリマイシン、デオキシノジリマイシン、Ｎ−メチル−１−デオキシマンノジリマイシン、ブレフェルジンＡ、グルコースおよびマンノース類似体、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシグルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（＋）ガラクトース、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール（ＤＩＭ）、フルオログルコース、フルオロマンノース、ＵＤＰ−２−デオキシグルコース、ＧＤＰ−２−デオキシグルコース、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、２５−ヒドロキシコレステロール、ヒドロキシコレステロール、スウェインソニン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、アクチノマイシンＤ、モネンシン、ｍ−クロロカルボニル−シアニドフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、コンパクチン、ドリチル−ホスホリル＾−デオキシグルコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ヒポキサンチン、チミジン、コレステロール、グルコサミン、マンノサミン、カスタノスペルミン、グルタミン、ブロモコンズリトール、コンズリトールエポキシドおよびコンズリトール誘導体、グリコシルメチル−ｐ−ニトロフェニルトリアゼン、β−ヒドロキシノルバリン、スレオ−β−フルオロアスパラギン、Ｄ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトン、リン酸ジ（２−エチルヘキシル）、リン酸トリブチル、リン酸ドデシル、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムヨーダイド、ヨード酢酸、および／またはフルオロ酢酸を含みうるが、これらに限定されない。当業者は、過度の実験を行うことなく、本発明の方法および組成物に従って使用されうるグリコシル化阻害物質を容易に認識するか、または決定することができるであろう。そのような態様において、ポリペプチドまたはその断片のグリコシル化は、ポリペプチドまたはその断片へのアミノ酸変異の導入を行うことなく制御されうる。

いくつかの態様において、哺乳動物細胞によって産生されるポリペプチドまたはその断片のグリコシル化レベル（例えば、ポリペプチドまたはその断片において占有されているグリカン部位の数、その部位におけるグリコフォームのサイズおよび／または複雑さなど）は、そのような解糖を阻害する化合物および／または変異を欠く、それ以外は同一の培地において、それ以外は同一の条件下で生成されるポリペプチドまたはその断片のグリコシル化レベルよりも低い。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合型タンパク質のグリコシル化部位を含まない。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合型タンパク質の少なくとも１つのグリコシル化部位を含まない。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合型タンパク質のグリコシル化部位のいずれも含まない。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合型タンパク質のグリコシル化部位を含む。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合型タンパク質のグリコシル化部位を最大で１つ含む。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合型タンパク質のグリコシル化部位を最大で２つ含む。

異なる細胞株によって、またはトランスジェニック動物において発現された、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、互いと比べて異なるグリカン部位占有率、グリコフォーム、および／またはグリコシル化パターンを有しうる。いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物細胞において産生された、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片のグリコシル化、グリカン占有率、またはグリコフォームパターンに関係ない、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を包含する。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドの１位のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、メチオニンではないＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチド、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来しうる。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドのアミノ酸配列の１位にフェニルアラニンを含む。別の好ましい態様では、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドのアミノ酸配列の１位の残基はフェニルアラニンである。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドに由来しうる、配列番号４のアミノ酸配列を含みうる。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、例えば、配列番号９のアミノ酸配列を有するＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＧポリペプチドに由来してもよい。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＣポリペプチドに由来してもよい。

Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドおよびその断片
好ましい態様では、ポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来する。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、全長Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨを含む。全長ＦｉｍＨは、短いリンカーによって接続されているＮ末端側のレクチンドメインとＣ末端側のピリンドメインの、２つのドメインを含む。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨの全長は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨの成熟タンパク質の全長を含む、２７９個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨの全長は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨの成熟タンパク質の全長と、２１アミノ酸長であるシグナルペプチド配列とを含む、３００個のアミノ酸を含む。３００アミノ酸長の野生型ＦｉｍＨの一次構造は、Ｅ．ｃｏｌｉ株間で高度に保存されている。

全長Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨの例示的な配列は配列番号１である。全長ＦｉｍＨ配列は、レクチンドメインの配列およびピリンドメインの配列を含む。ＦｉｍＨのレクチンドメインは、尿路上皮細胞表面にあるマンノシル化されたウロプラキン１ａへの結合に関与する炭水化物認識ドメインを含む。ピリンドメインは、ドナー鎖相補性と呼ばれるプロセスにより、その後のＦｉｍＧサブユニットのドナー鎖を介して繊毛のコアに固定される。

Ｎ末端から始まり、全長ＦｉｍＨの各ドメインの名称と、括弧でくくった例示的なアミノ酸配列が、ＦｉｍＨレクチン（配列番号２）およびＦｉｍＨピリン（配列番号３）のように示される。

Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する、バリアントを含む。ある特定の態様において、ＦｉｍＨバリアントタンパク質は、（ｉ）ＦｉｍＨ−ＦｉｍＣの一部を形成し、（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９の少なくとも１つのエピトープを含み、かつ／または（ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨと免疫学的に交差反応する抗体をインビボで生じうる。

いくつかの態様において、本組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つにおける、少なくともｎ個の連続するアミノ酸（ここで、ｎは７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０またはそれ以上）である）を有するポリペプチドを含む。好ましくは、断片は、配列のエピトープを含む。いくつかの態様において、組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つのアミノ酸配列のうち、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。

いくつかの態様において、本組成物は、配列番号１に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号３に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号２０に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号２３に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号２４に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号２６に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号２８に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号３０に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。

本明細書に記載のＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来する好適なポリペプチドおよびその断片の別の例は、野生型のＮ末端シグナル配列を欠き、配列番号１のアミノ酸残基２２〜３００に対応する配列番号２として示される。ＦｉｍＨ断片の別の例は、配列番号１に示されるような、Ｎ末端シグナル配列および成熟タンパク質の全体を含む。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片におけるグリコシル化部位は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の配列内の変異によって除去される。例えば、いくつかの態様において、成熟Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドの７位の（例えば、配列番号２の番号付けによる）Ａｓｎ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドのレクチンドメインの７位の（例えば、配列番号３の番号付けによる）Ａｓｎ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。

いくつかの態様において、成熟Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドの１０位の（例えば、配列番号２の番号付けによる）Ｔｈｒ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドのレクチンドメインの７位の（例えば、配列番号３の番号付けによる）Ｔｈｒ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。

いくつかの態様において、成熟Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドのＮ２３５位の（例えば、配列番号２の番号付けによる）Ａｓｎ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、成熟Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドのＮ２２８位の（例えば、配列番号２の番号付けによる）Ａｓｎ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。

いくつかの態様において、成熟Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドの７０位の（例えば、配列番号２の番号付けによる）Ａｓｎ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドのレクチンドメインの７０位の（例えば、配列番号３の番号付けによる）Ａｓｎ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。

いくつかの態様において、成熟Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドの７２位の（例えば、配列番号２の番号付けによる）Ｓｅｒ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨポリペプチドのレクチンドメインの７２位の（例えば、配列番号３の番号付けによる）Ｓｅｒ残基は、好ましくは置換によって、変異させてもよい。いくつかの態様において、残基の置換は、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。

本明細書で使用される「断片」という用語は、ポリペプチドに関するものであり、所与のポリペプチドのうち、そのポリペプチドに独特または特徴的である任意の明確な部分と定義される。この用語は、本明細書で使用される場合、所与のポリペプチドのうち、全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する、任意の明確な部分のことも意味する。ある特定の態様において、保持される活性の一部は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。ある特定の態様において、保持される活性の一部は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％である。ある特定の態様において、保持される活性の一部は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。ある特定の態様において、保持される活性の一部は、全長ポリペプチドの活性の１００％以上である。いくつかの態様において、断片は、全長ポリペプチドのうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはそれ以上の連続するアミノ酸を含む。

Ｂ．ＦｉｍＨ、ＦｉｍＣの複合体、およびそれらの断片
いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片との複合体として存在する。好ましい態様では、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片とが、複合体として、好ましくは１：１の比で複合体として存在する。理論または機構に束縛されるものではないが、全長ＦｉｍＨが周辺質シャペロンＦｉｍＣによって活性のある立体構造で安定化されることにより、全長ＦｉｍＨタンパク質を精製することが可能になりうる。したがって、いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、全長ＦｉｍＨおよび全長ＦｉｍＣを含む。

いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＨの断片およびＦｉｍＣの断片を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、全長ＦｉｍＨおよびＦｉｍＣの断片を含む。Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＣの例示的な配列は配列番号１０に示される。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＨの複合体形成断片を含む。

ＦｉｍＨの複合体形成断片は、ＦｉｍＣまたはその断片と複合体を形成する能力を保持するＦｉｍＨタンパク質の任意の一部分でありうる。ＦｉｍＨの好適な複合体形成断片は、当技術分野において公知である標準的なアッセイ、例えば免疫共沈降アッセイ、架橋、または蛍光染色による共局在化などによって得るか、または決定することもできる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウエスタンブロットも（例えば、ゲル電気泳動によって分かるように、ＦｉｍＨ断片およびＦｉｍＣまたはその断片が複合体として存在することを示すことによって）使用されうる。ある特定の態様において、ＦｉｍＨの複合体形成断片は、（ｉ）ＦｉｍＨ−ＦｉｍＣ複合体の一部を形成し、（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１０、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９の少なくとも１つのエピトープを含み、かつ／または（ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨと免疫学的に交差反応する抗体をインビボで生じうる。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、全長ＦｉｍＨを含み、このＦｉｍＨは、ＦｉｍＣと複合体を形成していない。さらなる態様において、ポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＨの断片を含み、この断片は、ＦｉｍＣと複合体を形成していない。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片は、配列番号１０を含む。いくつかの態様において、複合体は、同じプラスミドから、好ましくは、ポリペプチドまたはその断片それぞれに対する別々のプロモーターの制御下で発現されうる。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片の構造に工学的に導入されてもよい、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片に結合する。複合体におけるＦｉｍＨに結合するＦｉｍＣ分子の部分は「ドナー鎖」と呼ばれ、ＦｉｍＣＨ複合体のＦｉｍＨに結合するＦｉｍＣの鎖を使用した天然ＦｉｍＨ構造の形成の機構は、「ドナー鎖相補性」として知られている。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、適切なドナー鎖で補完されたバージョンのＦｉｍＨによって発現させることができ、ここで、ＦｉｍＣＨ複合体のＦｉｍＨと相互作用するＦｉｍＣのアミノ酸配列自体が、ＦｉｍＣ分子の残部が存在する必要なしに天然の立体構造をもたらすように、ＦｉｍＨのＣ末端において、工学操作により作製されている。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、レクチン結合ドメインおよびピリンドメインのような単離されたドメインを含む複合体の形態で発現させることができ、このようなドメインは、共有結合的または非共有結合的にひとつに連結していてもよい。例えば、いくつかの態様において、連結するセグメントは、アミノ酸配列または単独重合体構造を含む他のオリゴマー構造を含みうる。

本発明の方法および組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する前記ポリペプチドまたはその断片が同時発現する、または組み合わさった状態で形成される、本明細書に記載の複合体を含みうる。

Ｃ．レクチンドメイン、ピリンドメイン、およびそれらのバリアント
ＦｉｍＨのレクチンドメインの立体構造およびリガンド結合特性は、ＦｉｍＨのピリンドメインのアロステリック制御下にありうる。静止状態では、全長ＦｉｍＨの２つのドメインの相互作用が、浅い結合ポケットを特徴とする、モノマンノースに対する親和性が低い（例えば、Ｋ_ｄ約３００μＭの）状態でレクチンドメインを安定化させる。マンノシドリガンドへの結合は、レクチンドメインおよびピリンドメインが近接した状態を保つ中親和性状態をもたらす立体構造変化を誘発しうる。しかしながら、せん断応力がかかると、レクチンドメインとピリンドメインは分離し、高親和性状態（例えば、Ｋ_ｄ＜１．２μＭ）を誘発しうる。

ピリンドメインが及ぼす負のアロステリック調節がないため、分離したＦｉｍＨのレクチンドメインは、高親和性状態（例えば、Ｋ_ｄ＜１．２μＭ）にロックされる。分離した組換えレクチンドメインは、高親和性状態にロックされる。しかしながら、アドヘシンを親和性の低い立体構造（例えば、Ｋ_ｄ約３００μＭ）にロックすると、接着を阻害する抗体の生成が誘発される。したがって、低親和性状態でレクチンドメインを安定化させることに関心が寄せられている。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨのレクチンドメインを含む。レクチンドメインの例示的な配列は、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号２４、および配列番号２６のいずれか１つを含む。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨのレクチンドメインは、システイン置換を含む。好ましい態様では、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨのレクチンドメインは、レクチンドメインの最初の５０個以内のアミノ酸残基にシステイン置換を含む。いくつかの態様において、レクチンドメインは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のシステイン置換を含みうる。好ましくは、レクチンドメインは、２つのシステイン置換を含む。例えば、ｐＳＢ０２１５８およびｐＳＢ０２１９８を参照されたい。

Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号３に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号３に示される配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する、ＦｉｍＨレクチンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号３に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨのピリンドメインを含む。Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号７に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号７に示される配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する、ＦｉｍＨピリンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号８に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号８に示される配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する、ＦｉｍＨレクチンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号８に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨのピリンドメインを含む。Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号２４に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号２４に示される配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する、ＦｉｍＨピリンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号２４に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号２６に対して様々な程度の同一性、例えば、配列番号２６に示される配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する、ＦｉｍＨレクチンドメインバリアントを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号２６に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。

いくつかの態様において、本組成物は、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号２４、および配列番号２６のいずれか１つにおける、少なくともｎ個の連続するアミノ酸（ここで、ｎは７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０またはそれ以上）である）を有するポリペプチドを含む。好ましくは、断片は、配列のエピトープを含む。いくつかの態様において、本組成物は、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号２４、および配列番号２６のいずれか１つのアミノ酸配列のうち、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。

Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨまたはその相同体もしくはバリアントのレクチンドメインの位置および長さは、その配列の、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号２４、および配列番号２６のいずれか１つに対するペアワイズアライメントに基づいて、例えば、ＦｉｍＨのアミノ酸配列を配列番号１にアラインし、配列番号１の残基２２〜１７９にアラインする配列を同定することによって、予測されうる。

Ｄ．野生型Ｎ末端シグナル配列
いくつかの態様において、全長ＦｉｍＨのＮ末端の野生型シグナル配列は、宿主細胞において切断されて、成熟ＦｉｍＨポリペプチドをもたらす。したがって、宿主細胞によって発現されるＦｉｍＨは、Ｎ末端シグナル配列を欠く場合がある。好ましい態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、野生型のＮ末端シグナル配列のコード配列を欠くヌクレオチド配列によってコードされうる。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＨのＦｉｍＨ−ＦｉｍＣ複合体形成断片、Ｎ末端シグナル配列（例えば、配列番号１の残基１〜２１）、またはそれらの組み合わせを含む。ＦｉｍＨの複合体形成断片は、ＦｉｍＣと複合体を形成する能力を保持するＦｉｍＨタンパク質の任意の一部分でありうる。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、シグナル配列、レクチンドメイン、およびピリンドメインを含みうる全長ＦｉｍＨポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端における、１〜２１個のアミノ酸残基を欠く（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１個のアミノ酸残基、または１〜２１個の残基、１〜２０個の残基、１〜１５個の残基、１〜１０個の残基、２〜２０個の残基、２〜１５個の残基、２〜１０個の残基、５〜２０個の残基、５〜１５個の残基、もしくは５〜１０個の残基を欠く）場合がある。

ＩＩ．核酸
１つの側面において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする核酸が開示される。Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする１つまたは複数の核酸構築物が、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片のゲノム組み込み、およびその後の発現のために使用されうる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする単一の核酸構築物が、宿主細胞に導入されてもよい。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片のコード配列が２つ以上の核酸構築物に搭載され、次いでこれらが宿主細胞に同時または順次に導入されてもよい。

例えば、１つの例示的な態様では、単一の核酸構築物が、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨのレクチンドメインおよびピリンドメインをコードする。別の例示的な態様では、１つの核酸構築物がＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＨのレクチンドメインをコードし、第２の核酸構築物がピリンドメインをコードする。いくつかの態様において、ゲノム組み込みが達成される。

核酸構築物は、１つもしくは複数のイントロンを含むゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含みうる。いくつかの遺伝子は、イントロンが存在する場合、より効率的に発現される。いくつかの態様において、核酸配列は、前記哺乳動物細胞における外来性ポリペプチドの発現に好適である。

いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸は、任意の特定の細胞における発現レベルを上昇させるようにコドン最適化されている。
いくつかの態様において、核酸構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の分泌を指示するペプチドをコードするシグナル配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドの天然シグナル配列を含む。Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片が内在性シグナル配列を含むいくつかの態様では、シグナル配列をコードする核酸配列は、宿主細胞におけるタンパク質の発現レベルを上昇させるようにコドン最適化されていてもよい。

いくつかの態様において、シグナル配列の長さは、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、２５アミノ酸長、２６アミノ酸長、２７アミノ酸長、２８アミノ酸長、２９アミノ酸長、および３０アミノ酸長のうちのいずれか１つである。いくつかの態様において、シグナル配列は、２０アミノ酸長である。いくつかの態様において、シグナル配列は、２１アミノ酸長である。

ポリペプチドまたはその断片がシグナル配列を含むいくつかの態様では、培養細胞におけるポリペプチドまたはその断片の発現レベルが向上するように、ポリペプチドに自然に関連する内在性シグナル配列が、野生型ポリペプチドに関連しないシグナル配列で置換されていてもよい。したがって、いくつかの態様において、核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の天然シグナル配列を含まない。いくつかの態様において、核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドの天然シグナル配列を含まない。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、好ましくはシグナル配列、あるいはＥ．ｃｏｌｉに由来する成熟タンパク質もしくはポリペプチドまたはそれらの断片のＮ末端に特異的な切断部位を有する他のペプチドである、異種ペプチドとともに発現されうる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、好ましくはシグナル配列、または成熟Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨタンパク質のＮ末端に特異的な切断部位を有する他のペプチドである、異種ペプチド（例えば、ＩｇＫシグナル配列）とともに発現されうる。好ましい態様において、成熟タンパク質Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨのＮ末端の特異的な切断部位は、成熟Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨタンパク質の最初のフェニルアラニン残基の直前に生じる。選択される異種配列は、好ましくは、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。

好ましい態様において、シグナル配列は、ＩｇＫシグナル配列である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、核酸は、配列番号１９のアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、核酸は、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする。好ましい態様において、シグナル配列は、マウスＩｇＫシグナル配列である。

Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を生成するための好適な哺乳動物発現ベクターは当技術分野において公知であり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）のｐＳｅｃＴａｇ２発現ベクターのように、市販されているものもある。例示的なマウスＩｇカッパシグナルペプチド配列は、配列ＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号５４）を含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのｐＢｕｄＣＥ４．１哺乳動物発現ベクターを含む。さらなる例示的かつ好適なベクターとしては、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１哺乳動物発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が挙げられる。

いくつかの態様において、シグナル配列は、血球凝集素シグナル配列を含まない。
いくつかの態様において、核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の天然シグナル配列を含む。いくつかの態様において、シグナル配列は、ＩｇＫシグナル配列ではない。いくつかの態様において、シグナル配列は、血球凝集素シグナル配列を含む。

１つの側面において、本明細書では、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片のコード配列を含むベクターが開示される。例示的なベクターには、自己複製できるか、または哺乳動物細胞において複製できるプラスミドが含まれる。典型的な発現ベクターは、発現構築物におけるコード配列の発現の調節に有用である好適なプロモーター、エンハンサー、およびターミネーターを含む。ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質をもたらす（例えば、アンピシリンまたはネオマイシンなどの抗生物質に対する耐性を与える）選択マーカーも含みうる。

好適なプロモーターは、当技術分野において公知である。例示的なプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス、ＥＦ１ａ、ＧＡＰＤＨメタロチオネインプロモーター、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリへドリンプロモーターなどが挙げられる。プロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよい。１つまたは複数のベクター（例えば、すべてのサブユニットもしくはドメインもしくはそれらの断片をコードする１つのベクター、またはサブユニットもしくはドメインもしくはそれらの断片を一緒にコードする複数のベクター）が使用されうる。

内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および２Ａペプチド配列が使用されてもよい。ＩＲＥＳおよび２Ａペプチドは、複数の配列の同時発現のための代替的なアプローチを提供する。ＩＲＥＳは、より大きなタンパク質合成のプロセスの一部として、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の中間での翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。真核生物では通常、翻訳は、ｍＲＮＡ分子の５’末端でのみ開始されうる。ＩＲＥＳエレメントは、１つの転写物における複数の遺伝子の発現を可能にする。ＩＲＥＳに基づくポリシストロニックベクターは、１つの転写物から複数のタンパク質を発現し、非発現クローンが選択から逃れることを低減させうる。２Ａペプチドは、単一のオープンリーディングフレームにおける複数のタンパク質のポリタンパク質への翻訳を可能にし、ポリタンパク質は、後にリボソームスキップ機構を介して個々のタンパク質に切断される。２Ａペプチドは、複数のタンパク質産物の発現のバランスをさらに向上させうる。例示的なＩＲＥＳ配列は、例えば、ＥＶ７１ＩＲＥＳ、ＥＭＣＶＩＲＥＳ、ＨＣＶＩＲＥＳを含む。ゲノム組み込みについては、組み込みは、部位特異的である場合もランダムである場合もある。部位特異的な組換えは、本明細書に記載の核酸構築物に相同配列を導入することによって達成されうる。かかる相同配列は、宿主ゲノムにおける特定の標的部位で内在性配列と実質的にマッチする。あるいは、ランダムな組み込みが使用されてもよい。場合により、タンパク質の発現レベルは、組み込み部位に応じて異なりうる。したがって、所望の発現レベルを達成するクローンを同定するために、組換えタンパク質の発現レベルに従ってクローン数を選択することが望ましい場合がある。

例示的な核酸構築物は、図２Ａ〜２Ｔのいずれか１つのように、図においてさらに説明される。
１つの側面において、核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。

ＩＩＩ．宿主細胞
１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする配列が内部で発現される哺乳動物宿主細胞に関する。一態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、宿主細胞において一過性に発現される。別の態様では、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ、宿主細胞は、好適な条件下で培養されると、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を発現する。好ましい態様では、ポリヌクレオチド配列は、高い効率およびゲノム安定性で発現される。

好適な哺乳動物宿主細胞は、当技術分野において公知である。好ましくは、宿主細胞は、工業製造規模でタンパク質を生成するのに好適である。例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞（サル腎臓（アフリカミドリザル）由来の細胞株）、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＮＳ０細胞（マウス骨髄腫細胞株）、およびＣ１２７細胞（非腫瘍形成性マウス細胞株）、ならびにそれらの誘導体のうちのいずれか１つを含む。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、マウス乳癌細胞（ＭＭＴ）、ラット肝細胞腫細胞（ＨＴＣ）、マウス骨髄腫細胞（ＮＳ０）、マウスハイブリドーマ細胞（Ｓｐ２／０）、マウス胸腺腫細胞（ＥＬ４）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＨＯ細胞誘導体、マウス胚細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３、３Ｔ３Ｌｉ）、ラット心筋細胞（Ｈ９ｃ２）、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）、およびマウス腎臓細胞（ｍｉＭＣＤ−３）が挙げられる。哺乳動物細胞株のさらなる例としては、ＮＳ０／１、Ｓｐ２／０、ＨｅｐＧ２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＯＳ−７、ＴＭ４、ＣＶ１、ＶＥＲＯ−７６、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、ＭＭＴ０６０５６２、ＴＲ１、ＭＲＣ５、およびＦＳ４が挙げられる。

本発明によれば、細胞培養しやすい任意の細胞が利用されうる。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明によって使用されうる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳ０／１、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児由来腎臓細胞株（２９３細胞または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１頁、１９８０）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８頁、１９８２）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞腫株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。ある好ましい態様において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの好ましい態様において、細胞は、ＧＳ細胞である。

さらに、本発明によれば、任意の数の市販されているハイブリドーマ細胞株および市販されていないハイブリドーマ細胞株が利用されうる。本明細書で使用される「ハイブリドーマ」という用語は、不死化細胞と抗体産生細胞との融合から生じる細胞または細胞の子孫を意味する。このような結果として得られるハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマを作り出すために使用される個々の細胞は、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびヒトを含むがこれらに限定されない、任意の哺乳動物起源に由来しうる。いくつかの態様において、ハイブリドーマは、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株との融合産物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合物の子孫が、後に形質細胞と融合すると生じる、トリオーマ細胞株である。いくつかの態様において、ハイブリドーマは、例えば、クアドローマ（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、５３７：３０５３、１９８３を参照されたい）のような、抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞株である。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が最適な増殖のために異なる栄養必要量を有する場合があり、かつ／または異なる培養条件を必要とする場合があることを理解し、必要に応じて条件を改変することができるであろう。

いくつかの態様において、細胞は、第１の目的の遺伝子を含み、第１の目的の遺伝子は、染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、第１の目的の遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、目的の遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするもの）、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、治療上の目的の遺伝子は、発現困難な（ＤｔＥ：ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｅｘｐｒｅｓｓ）タンパク質をコードする遺伝子を含む。

いくつかの態様において、第１の目的の遺伝子は、部位特異的組み込み（ＳＳＩ）哺乳動物細胞における２つの異なる組換え標的部位（ＲＴＳ）の間に位置し、これら２つのＲＴＳは、ＮＬ１座位またはＮＬ２座位で染色体に組み込まれている。ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位、およびＮＬ６座位の説明については、例えば、米国特許出願公開第２０２００００２７２７号を参照されたい。いくつかの態様において、第１の目的の遺伝子は、ＮＬ１座位に位置する。いくつかの態様において、細胞は、第２の目的の遺伝子を含み、第２の目的の遺伝子は、染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、第２の目的の遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療上の目的の遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片）、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、治療上の目的の遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、第２の目的の遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの態様において、第２の目的の遺伝子は、ＮＬ１座位またはＮＬ２座位に位置する。いくつかの態様において、第１の目的の遺伝子は、ＮＬ１座位に位置し、第２の目的の遺伝子は、ＮＬ２座位に位置する。いくつかの態様において、細胞は、第３の目的の遺伝子を含み、第３の目的の遺伝子は、染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、第３の目的の遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療上の目的の遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片）、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、治療上の目的の遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、第３の目的の遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの態様において、第３の目的の遺伝子は、ＮＬ１座位またはＮＬ２座位に位置する。いくつかの態様において、第３の目的の遺伝子は、ＮＬ１座位およびＮＬ２座位とは異なる座位に位置する。いくつかの態様において、第１の目的の遺伝子、第２の目的の遺伝子、および第３の目的の遺伝子は、３つの別々の座位にある。いくつかの態様において、第１の目的の遺伝子、第２の目的の遺伝子、および第３の目的の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ１座位にあり、第１の目的の遺伝子、第２の目的の遺伝子、および第３の目的の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ２座位にある。いくつかの態様において、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの態様において、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれている。

いくつかの態様において、本開示は、少なくとも４つの異なるＲＴＳを含む哺乳動物細胞であって、（ａ）ＮＬ１座位またはＮＬ２座位で染色体に組み込まれている少なくとも２つの異なるＲＴＳと、（ｂ）（ａ）の少なくとも２つのＲＴＳの間に位置し、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む、第１の目的の遺伝子と、（ｃ）（ａ）の座位とは異なる第２の染色体座に組み込まれており、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片）をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む、第２の目的の遺伝子とを含む細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示は、少なくとも４つの異なるＲＴＳを含む哺乳動物細胞であって、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位で染色体に組み込まれている少なくとも２つの異なるＲＴＳと、（ｂ）ＮＬ１座位またはＮＬ２座位で染色体に組み込まれている少なくとも２つの異なるＲＴＳと、（ｃ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位で染色体に組み込まれており、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む、第１の目的の遺伝子と、（ｄ）（ｂ）のＮＬ１座位またはＮＬ２座位で染色体に組み込まれており、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片）をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む、第２の目的の遺伝子とを含む細胞を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、少なくとも６つの異なるＲＴＳを含む哺乳動物細胞であって、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位で染色体に組み込まれている少なくとも２つの異なるＲＴＳおよび第１の目的の遺伝子と、（ｂ）ＮＬ１座位で染色体に組み込まれている少なくとも２つの異なるＲＴＳおよび第２の目的の遺伝子と、（ｃ）ＮＬ２座位で染色体に組み込まれている少なくとも２つの異なるＲＴＳおよび第３の目的の遺伝子とを含む細胞を提供する。

本明細書で言及される場合、「作動可能な組み合わせで」、「作動可能な順序で」、および「作動可能に連結した」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が生成されるような様式における核酸配列の連結を意味するものである。この用語は、機能的なタンパク質が生成されるような様式におけるアミノ酸配列の連結も意味する。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、目的の遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、目的の遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、補助遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、補助遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、補助遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、補助遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結しており、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれていない。いくつかの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれていない。いくつかの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結しており、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムの染色体に組み込まれていない。

本明細書で言及される場合、「染色体に組み込まれている」または「染色体への組み込み」という用語は、核酸配列が、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞の染色体に安定に組み込まれること、すなわち、核酸配列が、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の染色体に組み込まれることを意味する。いくつかの態様において、染色体に組み込まれている核酸配列は、安定である。いくつかの態様において、染色体に組み込まれている核酸配列は、プラスミドまたはベクター上に位置しない。いくつかの態様において、染色体に組み込まれている核酸配列は、切除されない。いくつかの態様において、染色体への組み込みは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）遺伝子編集系（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ）によって媒介される。

いくつかの態様において、宿主細胞は、懸濁培養で増殖させるのに好適である。懸濁に適格な宿主細胞は通常、単分散である、または、実質的に凝集することなく、ゆるく凝集した状態で増殖する。懸濁に適格な宿主細胞としては、順応または操作することなく懸濁培養に好適な細胞（例えば、造血細胞、リンパ球系細胞）や、付着依存性細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞）の改変または順応により懸濁に適格にされた細胞が挙げられる。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の発現レベルまたは活性は、例えばＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞などの細菌細胞におけるＥ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の発現と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍上昇する。

本明細書に記載の宿主細胞は、大規模培養に好適である。例えば、細胞培養物は、１０Ｌ、３０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、２０００Ｌ、３０００Ｌ、４０００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、またはそれ以上でありうる。いくつかの態様において、細胞培養物のサイズは、１０Ｌ〜５０００Ｌ、１０Ｌ〜１０，０００Ｌ、１０Ｌ〜２０，０００Ｌ、１０Ｌ〜５０，０００Ｌ、４０Ｌ〜５０，０００Ｌ、１００Ｌ〜５０，０００Ｌ、５００Ｌ〜５０，０００Ｌ、１０００Ｌ〜５０，０００Ｌ、２０００Ｌ〜５０，０００Ｌ、３０００Ｌ〜５０，０００Ｌ、４０００Ｌ〜５０，０００Ｌ、４５００Ｌ〜５０，０００Ｌ、１０００Ｌ〜１０，０００Ｌ、１０００Ｌ〜２０，０００Ｌ、１０００Ｌ〜２５，０００Ｌ、１０００Ｌ〜３０，０００Ｌ、１５Ｌ〜２０００Ｌ、４０Ｌ〜１０００Ｌ、１００Ｌ〜５００Ｌ、２００Ｌ〜４００Ｌ、またはこれらの値の間の任意の整数でありうる。細胞培養のための培地成分は当技術分野において公知であり、例えば、バッファー、アミノ酸内容物、ビタミン内容物、塩内容物、ミネラル内容物、血清内容物、炭素源内容物、脂質内容物、核酸内容物、ホルモン内容物、微量元素内容物、アンモニア内容物、補因子内容物、指示薬内容物、小分子内容物、加水分解産物内容物、および酵素修飾因子内容物を含みうる。

本明細書で使用される「培地」、「細胞培養培地」、および「培養培地」という用語は、増殖する哺乳動物細胞に栄養を与える栄養素を含む溶液を意味する。通常、このような溶液は、細胞が最低限の増殖および／または生存に必要とする必須および非必須のアミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに微量元素を供給する。このような溶液はまた、増殖および／または生存を最低限の割合以上に増強する、ホルモンおよび／または他の増殖因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩素イオン、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸イオン）、バッファー、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、高い最終濃度で存在する無機化合物（例えば、鉄）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースもしくは他のエネルギー源を含むがこれらに限定されない補足的成分を含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度になるように有利に処方される。いくつかの態様において、培地は、細胞培養の開始後に添加されるフィード培地である。

いくつかの態様では、培地の成分が既知であり制御されている多様な化学合成培地のうちの１つにおいて、細胞を増殖させてもよい。いくつかの態様では、培地のすべての成分が既知であり、かつ／または制御されているわけではない複合培地において、細胞を増殖させてもよい。哺乳動物細胞培養のための化学合成増殖培地は、過去数十年間にわたって広く開発され、公開されている。合成培地の成分はすべて十分に特性評価されており、したがって合成培地は、血清または加水分解産物などの複合添加物を含まない。初期の培地処方は、細胞増殖、および生存能の維持を可能にするように開発され、タンパク質の生成への配慮はほとんどまたはまったく払われなかった。より近年の培地処方は、生産性の高い組換えタンパク質を産生する細胞培養を支えることを明確な目的として開発されている。このような培地が、本発明の方法で使用するのに好ましい。このような培地は、一般に、高密度での細胞の増殖および／または維持を支えるために、栄養素、特にアミノ酸を大量に含む。必要であれば、こうした培地は、当業者により、本発明の方法で使用するために改変されうる。例えば、当業者は、本明細書に開示される方法において基礎培地またはフィード培地として使用するために、こうした培地中のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、および／またはメチオニンの量を減少させてもよい。

複合培地のすべての成分が十分に特性評価されているわけではなく、したがって複合培地は、数ある中でもとりわけ、単純な炭素源および／または複雑な炭素源、単純な窒素源および／または複雑な窒素源、ならびに血清などの添加物を含んでもよい。いくつかの態様において、本発明に好適な複合培地は、本明細書に記載の合成培地の他の成分に加えて、加水分解産物などの添加物を含む。いくつかの態様において、合成培地は通常、およそ５０の化学物質を既知の濃度で水中に含む。それらのほとんどはまた、インスリン、ＩＧＦ−１、トランスフェリン、またはＢＳＡなどの十分に特性評価されたタンパク質を１つまたは複数含むが、他のものはタンパク質成分を必要とせず、したがってタンパク質不含合成培地と呼ばれる。培地の典型的な化学成分は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、および適切に分類できないその他のカテゴリという、５つの広範なカテゴリに分けられる。

細胞培養培地には、任意選択で、補足的成分を補ってもよい。本明細書で使用される「補足的成分」という用語は、増殖および／または生存を最低限の割合以上に増強する、ホルモンおよび／または他の増殖因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩素イオン、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸イオン）、バッファー、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースもしくは他のエネルギー源を含むがこれらに限定されない成分を意味する。いくつかの態様において、補足的成分は、最初の細胞培養物に添加されうる。いくつかの態様において、補足的成分は、細胞培養の開始後に添加されうる。通常、微量元素とは、マイクロモル以下のレベルで含まれる多様な無機塩を意味する。例えば、一般的に含まれる微量元素は、亜鉛、セレン、銅などである。いくつかの態様において、最初の細胞培養培地には、鉄（二価鉄または二価鉄塩）が微量元素としてマイクロモル濃度で含まれる場合がある。微量元素の中では、マンガンも二価カチオン（ＭｎＣｌ_２またはＭｎＳＯ_４）としてナノモルからマイクロモルの濃度範囲で含まれることが多い。さほど一般的ではない数多くの微量元素が、通常はナノモル濃度で加えられる。

いくつかの態様において、本発明の方法で使用される培地は、細胞培養物中、例えば１×１０^６細胞／ｍＬ、５×１０^６細胞／ｍＬ、１×１０^７細胞／ｍＬ、５×１０^７細胞／ｍＬ、１×１０^８細胞／ｍＬ、または５×１０^８細胞／ｍＬなどの高い細胞密度を支えるのに好適な培地である。いくつかの態様において、細胞培養物は、哺乳動物細胞のフェドバッチ培養物、好ましくはＣＨＯ細胞のフェドバッチ培養物である。

いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、チロシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、トリプトファンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、メチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、ロイシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、セリンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、スレオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、グリシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの２種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニンおよびトリプトファンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニンおよびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、チロシンおよびトリプトファンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、チロシンおよびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、トリプトファンおよびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの３種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、およびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、チロシン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの４種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの５種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの６種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンのうちの７種を含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１〜２ｍＭ、０．１〜１ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭ、または０．５〜１ｍＭの濃度で、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニン、およびグリシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭを超える濃度で、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３種をさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭを超える濃度で、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンのうちの少なくとも５種をさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭを超える濃度で、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンをさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭを超える濃度で、バリン、イソロイシン、プロリン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９種をさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭを超える濃度で、バリン、イソロイシン、プロリン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンのうちの少なくとも５種をさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭを超える濃度で、バリン、イソロイシン、プロリン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンをさらに含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭを超える濃度で、セリンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭを超える濃度で、バリンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭを超える濃度で、システインを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭを超える濃度で、イソロイシンを含む。いくつかの態様において、細胞培養培地は、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭを超える濃度で、ロイシンを含む。いくつかの態様において、上記の細胞培養培地は、本明細書に開示される方法で使用するためのものである。いくつかの態様において、上記の細胞培養培地は、本明細書に開示される方法で基礎培地として使用される。いくつかの態様において、上記の細胞培養培地は、本明細書に開示される方法でフィード培地として使用される。

ＩＶ．生成方法
１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を生成する方法を含む。本方法は、哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を発現させるステップを含む。本方法は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を培養物から回収するステップをさらに含みうる。本方法は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含んでもよい。

いくつかの態様において、本方法は、ポリペプチドまたはその断片を、０．１ｇ／Ｌ〜０．５ｇ／Ｌの収量で生成する。
いくつかの態様では、細胞を、バッチ培養またはフェドバッチ培養で増殖させてもよく、この培養法では、ポリペプチドが十分に発現した後に培養が終了され、その後、発現されたポリペプチドが回収され、任意選択で精製される。いくつかの態様では、細胞を、灌流培養で増殖させてもよく、この培養法では、培養が終了されず、新しい栄養素および他の成分が培養物に定期的または連続的に添加され、この間、発現されたポリペプチドが定期的または連続的に回収される。

いくつかの態様では、容積の範囲が数ミリリットルから数リットルである小規模反応容器において、細胞を増殖させてもよい。いくつかの態様では、容積の範囲が少なくとも約１リットルから１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル、もしくはそれ以上、またはこれらの値の間の任意の容積である大規模な商業的バイオリアクターにおいて、細胞を増殖させてもよい。

細胞培養物の温度は、主に、細胞培養物が生存可能な状態を保ち、高レベルのポリペプチドが生成される温度範囲、代謝廃棄物の産生もしくは蓄積が最小限に抑えられる温度範囲、および／またはこれらの要因もしくは実践者が重要とみなす他の要因の任意の組み合わせに基づいて選択される。非限定的な一例として、ＣＨＯ細胞は、およそ３７℃で良好に増殖し、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生する。一般に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約２５℃〜４２℃の範囲内で良好に増殖し、かつ／または高レベルのタンパク質もしくはポリペプチドを産生することができるが、本開示によって教示される方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の哺乳動物細胞は、約３５℃〜４０℃の範囲内で良好に増殖し、かつ／または高レベルのタンパク質もしくはポリペプチドを産生することができる。ある特定の態様において、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度で、細胞培養プロセス中に１回または複数回、細胞培養物を増殖させる。

本明細書で使用される「培養物」および「細胞培養物」という用語は、細胞集団の生存および／または増殖に好適な条件下で培地に懸濁される細胞集団を意味する。当業者には明らかになるであろうが、いくつかの態様において、本明細書で使用されるこれらの用語は、細胞集団およびこの集団が懸濁された培地を含む組み合わせを意味する。いくつかの態様において、細胞培養物の細胞は、哺乳動物細胞を含む。

本発明は、所望のプロセス（例えば、組換えタンパク質（例えば、抗体）の生成）に適した任意の細胞培養法で使用されうる。非限定的な例として、細胞を、バッチ培養またはフェドバッチ培養で増殖させてもよく、この培養法では、組換えタンパク質（例えば、抗体）が十分に発現した後に培養が終了され、その後、発現されたタンパク質（例えば、抗体）が回収される。あるいは、別の非限定的な例として、細胞を、バッチリフィードで増殖させてもよく、この培養法では、培養が終了されず、新しい栄養素および他の成分が培養物に定期的または連続的に添加され、この間、発現された組換えタンパク質（例えば、抗体）が定期的または連続的に回収される。他の好適な方法（例えば、スピンチューブ培養）が当技術分野において公知であり、本発明を実践するために使用されうる。

いくつかの態様において、本発明に好適な細胞培養は、フェドバッチ培養である。本明細書で使用される「フェドバッチ培養」という用語は、培養プロセス開始後に追加の成分が１回または複数回で培養物に供給される細胞培養の方法を意味する。このような供給される成分は、通常、培養プロセス中に枯渇した細胞のための栄養成分を含む。フェドバッチ培養は通常、ある時点で停止され、培地中の細胞および／または成分が回収され、任意選択で精製される。いくつかの態様において、フェドバッチ培養物は、フィード培地が補われた基礎培地を含む。

細胞は、実践者によって選択された任意の簡便な量で増殖させてよい。例えば、容積の範囲が数ミリリットルから数リットルである小規模反応容器において、細胞を増殖させてもよい。あるいは、容積の範囲が少なくとも約１リットルから１０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５０００、２００００、もしくは２５０００リットル、もしくはそれ以上、またはこれらの値の間の任意の容積である大規模な商業的バイオリアクターにおいて、細胞を増殖させてもよい。

細胞培養物の温度は、主に、細胞培養物が生存可能な状態を保つ温度範囲、および高レベルの所望の産物（例えば、組換えタンパク質）が生成される範囲に基づいて選択される。一般に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約２５℃〜４２℃の範囲内で良好に増殖し、所望の産物（例えば、組換えタンパク質）を産生することができるが、本開示によって教示される方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の哺乳動物細胞は、約３５℃〜４０℃の範囲内で良好に増殖し、所望の産物（例えば、組換えタンパク質または抗体）を産生することができる。ある特定の態様では、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度で、細胞培養プロセス中に１回または複数回、細胞培養物を増殖させる。当業者は、細胞の特定の必要性および実践者による特定の生成要件に応じて、細胞を増殖させるのに適切な１つまたは複数の温度を選択することができるであろう。実践者の要求および細胞自体の要件に応じて、任意の時間にわたって細胞を増殖させてもよい。ある態様では、細胞を３７℃で増殖させる。いくつかの態様では、細胞を３６．５℃で増殖させる。

いくつかの態様では、実践者の要求および細胞自体の要件に応じて、初期増殖段階（または増殖段階）中に、より長い時間、またはより短い時間にわたり、細胞を増殖させてもよい。いくつかの態様では、予め定義された細胞密度を達成するのに十分な時間にわたり、細胞を増殖させる。いくつかの態様では、細胞を妨害せずに増殖させた場合に細胞が最終的に達するであろう最大細胞密度の所与の百分率である細胞密度を達成するのに十分な時間にわたり、細胞を増殖させる。例えば、所望の生細胞密度が最大細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセントを達成するのに十分な時間にわたり、細胞を増殖させてもよい。いくつかの態様では、細胞密度が培養１日当たり１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％よりも多く増大しない時点まで、細胞を増殖させる。いくつかの態様では、細胞密度が培養１日当たり５％よりも多く増大しない時点まで、細胞を増殖させる。

ある態様では、所定の時間にわたって細胞を増殖させる。例えば、細胞培養の出発濃度、細胞を増殖させる温度、および細胞の固有の増殖速度に応じて、０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、またはそれ以上、好ましくは４〜１０日にわたり、細胞を増殖させてもよい。場合によっては、１か月以上にわたって細胞を増殖させてもよい。本発明の実践者は、タンパク質の生成要件および細胞自体の必要性に応じて、初期増殖段階の期間を選択することができるであろう。

細胞培養物は、細胞への酸素負荷および栄養素の分配を増大させるために、初期培養段階中に撹拌または振とうされる場合がある。本発明によれば、ｐＨ、温度、酸素負荷などを含むがこれらに限定されない、初期増殖段階中のバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することが有益でありうることを、当業者は理解するであろう。

初期増殖段階の終わりには、第２のセットの培養条件が適用され、培養物に代謝的変化が生じるように、培養条件のうちの少なくとも１つが変更される場合がある。代謝的変化は、例えば、細胞培養物の温度、ｐＨ、浸透圧、または化学誘発物質レベルの変化によって達成されうる。非限定的な一態様において、培養条件は、培養物の温度を変更することによって変更される。しかしながら、当技術分野において公知であるように、温度の変更は、適切な代謝的変化を達成することができる唯一の機構ではない。例えば、このような代謝的変化は、ｐＨ、浸透圧、および酪酸ナトリウムのレベルを含むがこれらに限定されない他の培養条件を変更することによっても達成されうる。培養物を変化させるタイミングは、本発明の実践者により、タンパク質の生成要件または細胞自体の必要性に基づいて決定される。

培養物の温度を変更する場合、温度の変更は、比較的緩やかであってもよい。例えば、温度の変更を完了するのに数時間または数日間かかってもよい。あるいは、温度の変更は、比較的急激であってもよい。例えば、温度の変化は、数時間以内に完了してもよい。ポリペプチドまたはタンパク質の商業的な大規模生産において標準的であるもののような、適切な生成および制御の設備を用いれば、温度の変化は、１時間以内に完了する場合さえある。

いくつかの態様において、細胞培養の条件が上述のように変更されたら、細胞培養物は、細胞培養物の生存および生存能に資する、かつ商業的に妥当なレベルでの所望のポリペプチドまたはタンパク質の発現に適切な、第２のセットの培養条件下での、後続の生産段階のために維持される。

上述のように、温度、ｐＨ、浸透圧、および酪酸ナトリウムのレベルを含むがこれらに限定されない、いくつかの培養条件のうちの１つまたは複数を変更することによって、培養物を変化させてもよい。いくつかの態様において、培養物の温度が変更される。この態様によれば、後続の生産段階において、培養物は、初期増殖段階の温度または温度範囲よりも低い温度または温度範囲で維持される。上述のように、細胞密度もしくは生存能を増大させるか、または組換えタンパク質の発現を増大させるために、複数の異なる温度変化が用いられうる。

いくつかの態様において、所望の細胞密度または生産力価に達するまで、後続の生産段階で細胞を維持してもよい。本発明の別の態様では、後続の生産段階中の所定の期間にわたり、細胞を増殖させる。例えば、後続の増殖段階の開始時の細胞培養物の濃度、細胞を増殖させる温度、および細胞の固有の増殖速度に応じて、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、またはそれ以上にわたり、細胞を増殖させてもよい。場合によっては、１か月以上にわたって細胞を増殖させてもよい。本発明の実践者は、ポリペプチドまたはタンパク質の生成要件および細胞自体の必要性に応じて、後続の生産段階の期間を選択することができるであろう。

細胞培養物は、細胞への酸素負荷および栄養素の分配を増大させるために、後続の生産段階中に撹拌または振とうされる場合がある。本発明によれば、ｐＨ、温度、酸素負荷などを含むがこれらに限定されない、後続の増殖段階中のバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することが有益でありうることを、当業者は理解するであろう。

いくつかの態様において、細胞は、組換えタンパク質を発現し、本発明の細胞培養法は、増殖段階および生産段階を含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法のいずれかのステップ（ｉｉ）は、細胞培養法の全体において適用される。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法のいずれかのステップ（ｉｉ）は、細胞培養法の一部において適用される。いくつかの態様において、ステップ（ｉｉ）は、既定の生細胞密度が得られるまで適用される。

いくつかの態様において、本発明の細胞培養法は、増殖段階および生産段階を含み、ステップ（ｉｉ）は、増殖段階において適用される。いくつかの態様において、本発明の細胞培養法は、増殖段階および生産段階を含み、ステップ（ｉｉ）は、増殖段階の一部において適用される。いくつかの態様において、本発明の細胞培養法は、増殖段階および生産段階を含み、ステップ（ｉｉ）は、増殖段階および生産段階において適用される。

本明細書に開示される方法のいずれかのステップ（ｉｉ）において、「維持する」という用語は、培養プロセス全体にわたり（回収まで）、または、例えば増殖段階、増殖段階の一部、もしくは既定の細胞密度が得られるまでのように、培養プロセスの一部にわたり、アミノ酸または代謝物の濃度をＣ１またはＣ２未満に維持することを意味しうる。

上述の方法のいずれかのいくつかの態様において、細胞の増殖および／または生産性は、対照培養と比較して増大し、前記対照培養は、ステップ（ｉｉ）を含まない点を除いては同一である。

上述の方法のいずれかのいくつかの態様において、本発明の方法は、細胞増殖を向上させる方法である。ある態様では、本発明の方法は、高密度細胞培養における高い細胞密度での細胞増殖を向上させる方法である。

本明細書で使用される高い細胞密度とは、１×１０^６細胞／ｍＬ、５×１０^６細胞／ｍＬ、１×１０^７細胞／ｍＬ、５×１０^７細胞／ｍＬ、１×１０^８細胞／ｍＬ、または５×１０^８細胞／ｍＬ超、好ましくは１×１０^７細胞／ｍＬ超、より好ましくは５×１０^７細胞／ｍＬ超の細胞密度を意味する。

いくつかの態様において、本発明の方法は、細胞密度が１×１０^６細胞／ｍＬ、５×１０^６細胞／ｍＬ、１×１０^７細胞／ｍＬ、５×１０^７細胞／ｍＬ、１×１０^８細胞／ｍＬ、または５×１０^８細胞／ｍＬ超である細胞培養における細胞増殖を向上させる方法である。いくつかの態様において、本発明の方法は、最大細胞密度が１×１０^６細胞／ｍＬ、５×１０^６細胞／ｍＬ、１×１０^７細胞／ｍＬ、５×１０^７細胞／ｍＬ、１×１０^８細胞／ｍＬ、または５×１０^８細胞／ｍＬ超である細胞培養における細胞増殖を向上させる方法である。

いくつかの態様において、細胞増殖は、生細胞密度（ＶＣＤ）、最大生細胞密度、または積算生細胞数（ＩＶＣＣ）によって決定される。いくつかの態様において、細胞増殖は、最大生細胞密度によって決定される。

本明細書で使用される「生細胞密度」という用語は、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を意味する。生細胞密度は、当業者に公知の任意の方法によって測定されうる。好ましくは、生細胞密度は、ＢｉｏｐｒｏｆｉｌｅＦｌｅｘ（登録商標）などの自動細胞計数器を使用して測定される。本明細書で使用される最大細胞密度という用語は、細胞培養中に達成される最大細胞密度を意味する。本明細書で使用される「細胞生存能」という用語は、所与のセットの培養条件または実験変動下で生存する培養下の細胞の能力を意味する。当業者は、細胞生存能を決定する多くの方法のうちの１つが本発明に包含されることを理解するであろう。例えば、細胞生存能を決定するためには、生きている細胞の膜を通過することはないが、死んだ細胞または死にかけの細胞の破壊された膜を通過することはできる色素（例えば、トリパンブルー）を使用してもよい。

本明細書で使用される「積算生細胞数（ＩＶＣＣ）」という用語は、生細胞密度（ＶＣＤ）曲線下面積を意味する。ＩＶＣＣは、次式：ＩＶＣＣ_ｔ＋１＝ＩＶＣＣ_ｔ＋（ＶＣＤ_ｔ＋ＶＣＤ_ｔ＋１）＊（Δｔ）／２を使用して計算されうる。式中、Δｔは、ｔ時点とｔ＋１時点との間の時間差である。ＩＶＣＣ_ｔ＝０は、無視可能とみなされうる。ＶＣＤ_ｔおよびＶＣＤ_ｔ＋１は、ｔ時点およびｔ＋１時点における生細胞密度である。

本明細書で使用される「力価」という用語は、例えば、所定量の培地量における細胞培養によって生成される組換え発現タンパク質の総量を意味する。力価は、通常、培地１リットル当たりのタンパク質のグラム単位で表現される。

いくつかの態様において、細胞増殖は、対照培養と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％増大する。いくつかの態様において、細胞増殖は、対照培養と比較して少なくとも１０％増大する。いくつかの態様において、細胞増殖は、対照培養と比較して少なくとも２０％増大する。

いくつかの態様において、生産性は、力価および／または容量生産性によって決定される。
本明細書で使用される「力価」という用語は、例えば、所定量の培地量における細胞培養によって生成される組換え発現タンパク質の総量を意味する。力価は、通常、培地１リットル当たりのタンパク質のグラム単位で表現される。

いくつかの態様において、生産性は、力価によって決定される。いくつかの態様において、生産性は、対照培養と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％増大する。いくつかの態様において、生産性は、対照培養と比較して少なくとも１０％増大する。いくつかの態様において、生産性は、対照培養と比較して少なくとも２０％増大する。

いくつかの態様において、細胞培養物の最大細胞密度は、１×１０^６細胞／ｍＬ、５×１０^６細胞／ｍＬ、１×１０^７細胞／ｍＬ、５×１０^７細胞／ｍＬ、１×１０^８細胞／ｍＬ、または５×１０^８細胞／ｍＬ超である。いくつかの態様において、細胞培養物の最大細胞密度は、５×１０^６細胞／ｍＬ超である。いくつかの態様において、細胞培養物の最大細胞密度は、１×１０^８細胞／ｍＬ超である。

Ｖ．精製
いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を生成する方法は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を単離および／または精製するステップを含む。いくつかの態様において、発現されたＥ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、培地中に分泌され、したがって、細胞および他の固体は、遠心分離および／または濾過によって除去されうる。

本明細書に記載の方法に従って生成される、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、任意の好適な方法を使用して、宿主細胞から回収され、精製されうる。ポリペプチドまたはその断片を精製する好適な方法は、沈殿、ならびに疎水性相互作用、イオン交換、アフィニティ、キレート化、およびサイズ排除のような様々なタイプのクロマトグラフィを含み、これらはすべて、当技術分野において公知である。好適な精製スキームは、これらまたは他の好適な方法のうちの２つ以上を含みうる。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片のうちの１つまたは複数は、エピトープタグまたはＨＩＳタグ、Ｓｔｒｅｐタグのような、精製を容易にする「タグ」を含みうる。このようなタグ付きポリペプチドは、例えば馴化培地から、キレートクロマトグラフィまたはアフィニティクロマトグラフィによって簡便に精製されうる。任意選択で、タグ配列は、精製後に切断されてもよい。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、アフィニティ精製のためのタグを含んでもよい。アフィニティ精製タグは、当技術分野において公知である。例としては、例えば、Ｈｉｓタグ（金属イオンに結合する）、抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（アミロースに結合する）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（グルタチオンに結合する）、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ（ストレプトアビジンまたはその誘導体に結合する）が挙げられる。

好ましい態様では、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片は、精製タグを含まない。
いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の収量は、少なくとも約１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１６ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１７ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１８ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１９ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約１００ｍｇ／Ｌである。

いくつかの態様において、培養物は、少なくとも約１０リットルのサイズ、例えば、少なくとも約１０Ｌ、少なくとも約２０Ｌ、少なくとも約３０Ｌ、少なくとも約４０Ｌ、少なくとも約５０Ｌ、少なくとも約６０Ｌ、少なくとも約７０Ｌ、少なくとも約８０Ｌ、少なくとも約９０Ｌ、少なくとも約１００Ｌ、少なくとも約１５０Ｌ、少なくとも約２００Ｌ、少なくとも約２５０Ｌ、少なくとも約３００Ｌ、少なくとも約４００Ｌ、少なくとも約５００Ｌ、少なくとも約６００Ｌ、少なくとも約７００Ｌ、少なくとも約８００Ｌ、少なくとも約９００Ｌ、少なくとも約１０００Ｌ、少なくとも約２０００Ｌ、少なくとも約３０００Ｌ、少なくとも約４０００Ｌ、少なくとも約５０００Ｌ、少なくとも約６０００Ｌ、少なくとも約１０，０００Ｌ、少なくとも約１５，０００Ｌ、少なくとも約２０，０００Ｌ、少なくとも約２５，０００Ｌ、少なくとも約３０，０００Ｌ、少なくとも約３５，０００Ｌ、少なくとも約４０，０００Ｌ、少なくとも約４５，０００Ｌ、少なくとも約５０，０００Ｌ、少なくとも約５５，０００Ｌ、少なくとも約６０，０００Ｌ、少なくとも約６５，０００Ｌ、少なくとも約７０，０００Ｌ、少なくとも約７５，０００Ｌ、少なくとも約８０，０００Ｌ、少なくとも約８５，０００Ｌ、少なくとも約９０，０００Ｌ、少なくとも約９５，０００Ｌ、少なくとも約１００，０００Ｌなどの体積である。

ＶＩ．組成物および処方
１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を含む組成物を含む。いくつかの態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉの病原性種に対する免疫を与えうる抗体を含む免疫応答を生じさせる。

いくつかの態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を唯一の抗原として含む。いくつかの態様において、本組成物は、コンジュゲートを含まない。

いくつかの態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片、および追加の抗原を含む。いくつかの態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片、および追加のＥ．ｃｏｌｉ抗原を含む。いくつかの態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片、およびＥ．ｃｏｌｉ由来のグリココンジュゲートを含む。

いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来する。
いくつかの態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片を含む。

いくつかの態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片とを含む。

１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３−１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１〜１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む糖類とを含む組成物を含む。

いくつかの態様において、本組成物は、本明細書に開示される糖類のいずれか１つを含む。好ましい態様において、本組成物は、本明細書に開示されるコンジュゲートのいずれか１つを含む。

いくつかの態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５、好ましくは血清型Ｏ２５ｂのグリココンジュゲートを少なくとも１つ含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１、好ましくは血清型Ｏ１ａのグリココンジュゲートを少なくとも１つ含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２のグリココンジュゲートを少なくとも１つ含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６のグリココンジュゲートを少なくとも１つ含む。

一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくはＯ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択されるグリココンジュゲートを少なくとも１つ含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくはＯ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択されるグリココンジュゲートを少なくとも２つ含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくはＯ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択されるグリココンジュゲートを少なくとも３つ含む。一態様において、本組成物は、Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくはＯ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６の各Ｅ．ｃｏｌｉ血清型のグリココンジュゲートを含む。

好ましい態様では、上記の組成物のいずれかのグリココンジュゲートは、それぞれ、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされている。
したがって、いくつかの態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、少なくとも１種のＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含む。好ましい態様では、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、２種以上のＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含む。例えば、本組成物は、２種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型（または価数（ｖａｌｅｎｃｅｓ）の「ｖ」）から１２種の異なる血清型（１２ｖ）のＯ抗原を含みうる。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、３種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、４種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、５種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、６種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、７種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、８種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、９種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１０種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１１種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１２種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１３種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１４種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１５種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１６種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１７種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１８種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１９種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、２０種の異なる血清型のＯ抗原とを含む。

好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ糖類の数は、１種の血清型（または価数の「ｖ」）から２６種の異なる血清型（２６ｖ）の範囲でありうる。一態様では、１種の血清型が存在する。一態様では、２種の異なる血清型が存在する。一態様では、３種の異なる血清型が存在する。一態様では、４種の異なる血清型が存在する。一態様では、５種の異なる血清型が存在する。一態様では、６種の異なる血清型が存在する。一態様では、７種の異なる血清型が存在する。一態様では、８種の異なる血清型が存在する。一態様では、９種の異なる血清型が存在する。一態様では、１０種の異なる血清型が存在する。一態様では、１１種の異なる血清型が存在する。一態様では、１２種の異なる血清型が存在する。一態様では、１３種の異なる血清型が存在する。一態様では、１４種の異なる血清型が存在する。一態様では、１５種の異なる血清型が存在する。一態様では、１６種の異なる血清型が存在する。一態様では、１７種の異なる血清型が存在する。一態様では、１８種の異なる血清型が存在する。一態様では、１９種の異なる血清型が存在する。一態様では、２０種の異なる血清型が存在する。一態様では、２１種の異なる血清型が存在する。一態様では、２２種の異なる血清型が存在する。一態様では、２３種の異なる血清型が存在する。一態様では、２４種の異なる血清型が存在する。ある態様では、２５種の異なる血清型が存在する。一態様では、２６種の異なる血清型が存在する。糖類は、担体タンパク質にコンジュゲートされて、本明細書に記載のグリココンジュゲートを形成する。

１つの側面において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、少なくとも１種のＥ．ｃｏｌｉ血清群のＯ抗原を含むグリココンジュゲートとを含み、このＯ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、２種以上のＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、２種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、３種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、４種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、５種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、６種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、７種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、８種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、９種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１０種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１１種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１２種の異なる血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１３種の異なる血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１４種の異なる血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１５種の異なる血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１６種の異なる血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１７種の異なる血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１８種の異なる血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１９種の異なる血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、２０種の異なる血清型のＯ抗原とを含み、各Ｏ抗原は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。

別の側面では、本組成物は、少なくとも１種のＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。好ましい態様では、本組成物は、２種以上のＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。例えば、本組成物は、２種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型から１２種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含みうる。一態様において、本組成物は、３種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、４種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、５種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、６種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、７種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、８種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、９種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１０種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１１種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１２種の異なる血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１３種の異なる血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１４種の異なる血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１５種の異なる血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１６種の異なる血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１７種の異なる血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１８種の異なる血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、１９種の異なる血清型のＯ多糖を含む。一態様において、本組成物は、２０種の異なる血清型のＯ多糖を含む。

好ましい態様では、本組成物は、少なくとも１種のＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、このＯ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましい態様では、本組成物は、２種以上のＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。例えば、本組成物は、２種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型から１２種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含んでもよく、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、３種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、４種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、５種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、６種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、７種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、８種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、９種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１０種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１１種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１２種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１３種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１４種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１５種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１６種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１７種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１８種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、１９種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一態様において、本組成物は、２０種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。

最も好ましい態様では、本組成物は、少なくとも１種のＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、このＯ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。好ましい態様では、本組成物は、２種以上のＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。例えば、本組成物は、２種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型から１２種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含んでもよく、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、３種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、４種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、５種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、６種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、７種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、８種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、９種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１０種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１１種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１２種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１３種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１４種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１５種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１６種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１７種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１８種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、１９種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、２０種の異なる血清型のＯ多糖を含み、各Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。好ましい態様では、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

別の好ましい態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖とを含み、このＯ多糖は、式Ｏ２５ａ（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。好ましい態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ１ａ（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ２（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ６（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。

別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ１７（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ１５（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ１８Ａ（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ７５（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ４（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ１６（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ１３（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ７（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。

別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ８（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、Ｏ多糖は、式Ｏ８（式中、ｎは、１〜２０、好ましくは２〜５、より好ましくは３である）を含む。式Ｏ８は、例えば、図１０Ｂに示される。別の態様では、本組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、このＯ多糖は、式Ｏ９（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含む。別の態様では、Ｏ多糖は、式Ｏ９（式中、ｎは、１〜２０、好ましくは４〜８、より好ましくは５である）を含む。式Ｏ９は、例えば、図１０Ｂに示される。別の態様では、Ｏ多糖は、式Ｏ９ａ（式中、ｎは、１〜２０、好ましくは４〜８、より好ましくは５である）を含む。式Ｏ９ａは、例えば、図１０Ｂに示される。

いくつかの態様において、Ｏ多糖は、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは、１〜２０、好ましくは４〜８、より好ましくは５である）のいずれか１つから選択される構造を含む。例えば、図１０Ｂを参照されたい。

上述のように、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、コンジュゲートされたＯ多糖（抗原）の任意の組み合わせとを含みうる。１つの例示的な態様では、本組成物は、式Ｏ２５ｂを含む多糖、式Ｏ１Ａを含む多糖、式Ｏ２を含む多糖、および式Ｏ６を含む多糖を含む。より詳細には、かかる組成物は、（ｉ）ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含むＯ多糖と、（ｉｉ）ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１ａ（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含むＯ多糖と、（ｉｉｉ）ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含むＯ多糖と、（ｉｖ）ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ６（式中、ｎは、少なくとも４０である）、およびコア糖類を含むＯ多糖とを含む。

一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、Ｏ２５ａではないいずれかのＥ．ｃｏｌｉ血清型に由来する少なくとも１つのＯ多糖とを含む。例えば、一態様において、本組成物は、式Ｏ２５ａを含む糖類を含まない。かかる組成物は、例えば、式Ｏ２５ｂを含むＯ多糖、式Ｏ１Ａを含むＯ多糖、式Ｏ２を含むＯ多糖、および式Ｏ６を含むＯ多糖を含みうる。

一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、２種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、３種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、４種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、５種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、６種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、７種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、８種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、９種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１０種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１１種の異なるＥ．ｃｏｌｉ血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１２種の異なる血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１３種の異なる血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１４種の異なる血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１５種の異なる血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１６種の異なる血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１７種の異なる血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１８種の異なる血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、１９種の異なる血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、２０種の異なる血清型のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされており、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む。

１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、１５±２である）を含む組成物に関する。１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、１７±２である）を含む組成物に関する。１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、５５±２である）を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、５１±２である）を含む組成物に関する。一態様において、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはＤＭＳＯバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。

一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を生じ、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌ、または０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂ多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物で免疫処置する前の血清と、免疫処置した後の血清とでＯＰＡ活性の比較を実施し、血清型Ｏ２５Ｂに対する応答を比較することで、レスポンダーの増大の可能性を評価することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂを殺傷することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能性抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂを殺傷することができる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂに対するレスポンダー（すなわち、インビトロＯＰＡによって決定した場合の力価が少なくとも１：８の血清を有する個体）の割合を、免疫処置前の集団と比較して増大させる。一態様において、免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも５０％の対象において、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂに対して少なくとも１：８の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂに対して少なくとも１：８の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂに対するレスポンダー（すなわち、インビトロＯＰＡによって決定した場合の力価が少なくとも１：８の血清を有する個体）の割合を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、ヒト対象のＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂに対するＯＰＡ力価を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。

１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ１ａ（式中、ｎは、３９±２である）を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ１ａ（式中、ｎは、１３±２である）を含む組成物に関する。一態様において、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはＤＭＳＯバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。

一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を生じ、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌ、または０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１Ａ多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物で免疫処置する前の血清と、免疫処置した後の血清とでＯＰＡ活性の比較を実施し、血清型Ｏ１Ａに対する応答を比較することで、レスポンダーの増大の可能性を評価することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１Ａを殺傷することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能性抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１Ａを殺傷することができる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１Ａに対するレスポンダー（すなわち、インビトロＯＰＡによって決定した場合の力価が少なくとも１：８の血清を有する個体）の割合を、免疫処置前の集団と比較して増大させる。一態様において、免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも５０％の対象において、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１Ａに対して少なくとも１：８の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１Ａに対して少なくとも１：８の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１Ａに対するレスポンダー（すなわち、インビトロＯＰＡによって決定した場合の力価が少なくとも１：８の血清を有する個体）の割合を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、ヒト対象のＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１Ａに対するＯＰＡ力価を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。

１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ２（式中、ｎは、４３±２である）を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ２（式中、ｎは、４７±２である）を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ２（式中、ｎは、１７±２である）を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ２（式中、ｎは、１８±２である）を含む組成物に関する。一態様において、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはＤＭＳＯバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。

一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を生じ、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌ、または０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物で免疫処置する前の血清と、免疫処置した後の血清とでＯＰＡ活性の比較を実施し、血清型Ｏ２に対する応答を比較することで、レスポンダーの増大の可能性を評価することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２を殺傷することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能性抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２を殺傷することができる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２に対するレスポンダー（すなわち、インビトロＯＰＡによって決定した場合の力価が少なくとも１：８の血清を有する個体）の割合を、免疫処置前の集団と比較して増大させる。一態様において、免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも５０％の対象において、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２に対して少なくとも１：８の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２に対して少なくとも１：８の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２に対するレスポンダー（すなわち、インビトロＯＰＡによって決定した場合の力価が少なくとも１：８の血清を有する個体）の割合を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、ヒト対象のＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２に対するＯＰＡ力価を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。

１つの側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ６（式中、ｎは、４２±２である）を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ６（式中、ｎは、５０±２である）を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ６（式中、ｎは、１７±２である）を含む組成物に関する。別の側面では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ６（式中、ｎは、１８±２である）を含む組成物に関する。一態様において、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはＤＭＳＯバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。

一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を生じ、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌ、または０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物で免疫処置する前の血清と、免疫処置した後の血清とでＯＰＡ活性の比較を実施し、血清型Ｏ６に対する応答を比較することで、レスポンダーの増大の可能性を評価することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６を殺傷することができる。一態様において、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能性抗体を生じ、前記抗体は、インビトロのオプソニン食作用性アッセイにより決定した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６を殺傷することができる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６に対するレスポンダー（すなわち、インビトロＯＰＡによって決定した場合の力価が少なくとも１：８の血清を有する個体）の割合を、免疫処置前の集団と比較して増大させる。一態様において、免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも５０％の対象において、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６に対して少なくとも１：８の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、インビトロのオプソニン食作用性殺傷アッセイによって決定した場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６に対して少なくとも１：８の力価を生じる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６に対するレスポンダー（すなわち、インビトロＯＰＡによって決定した場合の力価が少なくとも１：８の血清を有する個体）の割合を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。一態様において、本発明の免疫原性組成物は、ヒト対象のＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６に対するＯＰＡ力価を、免疫処置前の集団と比較して有意に増大させる。

１つの側面において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含み、この糖類は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３−１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１〜１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む。一態様において、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４コア糖類部分をさらに含む。一態様において、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２コア糖類部分をさらに含む。別の態様では、糖類は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一態様において、コンジュゲートは、還元的アミノ化化学により、好ましくはＤＭＳＯバッファー中において調製される。一態様において、糖類は、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、本組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。一態様において、本組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９個のさらなるコンジュゲートから、最大で３０個のさらなるコンジュゲートをさらに含み、各コンジュゲートは、担体タンパク質に共有結合した糖類を含み、糖類は、前記式のいずれか１つから選択される構造を含む。

Ａ．糖類
一態様において、糖類は、糖類のサイズを制御するために、異なるＷｚｚタンパク質（例えば、ＷｚｚＢ）の発現（必ずしも過剰発現とは限らない）によって生成される。

本明細書で使用される場合、「糖類」という用語は、単糖部分または単糖単位、ならびに二糖、オリゴ糖、および多糖を形成するように共有結合した２つ以上の単糖部分または単糖単位の組み合わせを意味する。糖類は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。

一態様において、糖類は、組換えグラム陰性菌において産生される。一態様において、糖類は、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞において産生される。一態様において、糖類は、組換えＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞において産生される。例示的な細菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５Ｋ５Ｈ１、Ｅ．ｃｏｌｉＢＤ５５９、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ２８３１、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ８６５、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ８６８、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ８６９、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ８７２、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ８７８、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ８９６、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ１９０２、Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５ａＥＴＣＮＲ−５、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７：Ｋ−、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ血清亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＬＴ２、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ２４０１、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ血清型ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓＣＶＤ１９４３、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ血清型ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＣＶＤ１９２５、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ血清型ＰａｒａｔｙｐｈｉＡＣＶＤ１９０２、およびＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉＣＶＤ１２０８Ｓが挙げられる。一態様において、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉＧＡＲ２４０１ではない。こうした糖類の生成のための遺伝学的アプローチは、ワクチン成分としてのＯ多糖およびＯ抗原分子の効率的な生成を可能にする。

本明細書で使用される「ｗｚｚタンパク質」という用語は、例えば、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１、およびｗｚｚ２のような、鎖の長さを決定するポリペプチドを意味する。例示的なｗｚｚ遺伝子配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＡＦ０１１９１０（Ｅ４９９１／７６）、ＡＦ０１１９１１（Ｆ１８６）、ＡＦ０１１９１２（Ｍ７０／１−１）、ＡＦ０１１９１３（７９／３１１）、ＡＦ０１１９１４（Ｂｉ７５０９−４１）、ＡＦ０１１９１５（Ｃ６６４−１９９２）、ＡＦ０１１９１６（Ｃ２５８−９４）、ＡＦ０１１９１７（Ｃ７２２−８９）、およびＡＦ０１１９１９（ＥＤＬ９３３）である。Ｇ７およびＢｉ３１６−４１ｗｚｚ遺伝子配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、それぞれ、Ｕ３９３０５およびＵ３９３０６である。例示的なｗｚｚ遺伝子配列のさらなるＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＮＰ＿４５９５８１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＬＴ２ＦｅｐＥ）、ＡＩＧ６６８５９（Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３ＦｅｐＥ）、ＮＰ＿４６１０２４（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ血清亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＬＴ２ＷｚｚＢ）、ＮＰ＿４１６５３１（Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２亜株ＭＧ１６５５ＷｚｚＢ）、ＮＰ＿４１５１１９（Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２亜株ＭＧ１６５５ＦｅｐＥ）である。好ましい態様において、ｗｚｚファミリータンパク質は、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１、およびｗｚｚ２のいずれか１つ、最も好ましくはｗｚｚＢ、より好ましくはｆｅｐＥである。

例示的なｗｚｚＢ配列は、配列番号３０〜３４に示される配列を含む。例示的なＦｅｐＥ配列は、配列番号３５〜３９に示される配列を含む。
いくつかの態様において、中鎖または長鎖のＯ抗原鎖を含むリポ多糖などの高分子量糖類を生成するために、修飾された糖類（対応する野生型糖類と比較して修飾されたもの）が、グラム陰性菌においてグラム陰性菌由来のｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｆｅｐＥ）を発現させること（必ずしも過剰発現とは限らない）、および／または第２のｗｚｚ遺伝子（例えば、ｗｚｚＢ）をスイッチオフすること（すなわち、抑制すること、欠失させること、除去すること）により、産生されうる。例えば、修飾された糖類は、ｗｚｚ２を発現させ（必ずしも過剰発現とは限らない）、ｗｚｚ１をスイッチオフすることにより、産生されうる。または、代替として、修飾された糖類は、ｗｚｚｆｅｐＥを発現させ（必ずしも過剰発現とは限らない）、ｗｚｚＢをスイッチオフすることにより、産生されうる。別の態様では、修飾された糖類は、ｗｚｚＢを発現させ（必ずしも過剰発現とは限らない）、しかしｗｚｚｆｅｐＥをスイッチオフすることにより、産生されうる。別の態様では、修飾された糖類は、ｆｅｐＥを発現させることにより、産生されうる。好ましくは、ｗｚｚファミリータンパク質は、宿主細胞に対して異種である株に由来する。

いくつかの態様において、糖類は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つに対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であるアミノ酸配列を有するｗｚｚファミリータンパク質を発現させることによって産生される。一態様において、ｗｚｚファミリータンパク質は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つから選択される配列を含む。好ましくは、ｗｚｚファミリータンパク質は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４に対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、糖類は、ｆｅｐＥタンパク質に対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させることによって産生される。

１つの側面において、本発明は、グラム陰性菌において、ｗｚｚファミリータンパク質、好ましくはｆｅｐＥを発現させて、中鎖または長鎖のＯ抗原鎖を含む高分子量糖類を生成することによって産生される糖類であって、対応する野生型Ｏ多糖と比較して少なくとも１、２、３、４、または５個多い繰り返し単位を有する、糖類に関する。１つの側面において、本発明は、中鎖または長鎖のＯ抗原鎖を含む高分子量糖類を生成するための、グラム陰性菌由来のｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現する（必ずしも過剰発現するとは限らない）培養下のグラム陰性菌によって産生される糖類であって、対応する野生型Ｏ抗原と比較して少なくとも１、２、３、４、または５個多い繰り返し単位を有する、糖類に関する。対応する野生型糖類と比較して繰り返し単位数が増大している糖類のさらなる例については、下記のＯ多糖およびＯ抗原の説明を参照されたい。所望の鎖長は、所与のワクチン構築物との関連において、向上した、または最大の免疫原性をもたらすものである。

別の態様では、糖類は、表１から選択されるいずれか１つの式を含み、ここで、糖類における繰り返し単位数であるｎは、対応する野生型Ｏ多糖における繰り返し単位数と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上の繰り返し単位だけ大きい。好ましくは、糖類は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個多い繰り返し単位を含む。例えば、表２４を参照されたい。糖類の長さを決定する方法は、当技術分野において公知である。そのような方法は、実施例１３に記載されるように、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィを含む。

好ましい態様では、本発明は、中鎖または長鎖のＯ抗原鎖を含むリポ多糖などの高分子量糖類を生成するための、組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞において産生される糖類であって、内在性ｗｚｚＯ抗原長調節因子（例えば、ｗｚｚＢ）の遺伝子が欠失し、組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に対して異種であるグラム陰性菌の（第２の）ｗｚｚ遺伝子（例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｆｅｐＥ）で置換されている、糖類に関する。いくつかの態様において、組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａのｗｚｚ遺伝子を含む。

一態様において、宿主細胞は、安定に維持されたプラスミドベクターとして、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。別の態様では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた遺伝子として、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞においてプラスミドベクターを安定に発現させる方法、およびＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞の染色体に異種遺伝子を組み込む方法は、当技術分野において公知である。一態様において、宿主細胞は、安定に維持されたプラスミドベクターとして、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。別の態様では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた遺伝子として、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ宿主細胞においてプラスミドベクターを安定に発現させる方法は、当技術分野において公知である。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ宿主細胞の染色体に異種遺伝子を組み込む方法は、当技術分野において公知である。

１つの側面において、組換え宿主細胞は、炭素源を含む培地中で培養される。Ｅ．ｃｏｌｉを培養するための炭素源は、当技術分野において公知である。例示的な炭素源は、糖アルコール、ポリオール、アルドール糖、またはケト糖を含み、アラビノース、セロビオース、フルクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マルトース、マンニトール、マンノース、ラムノース、ラフィノース、ソルビトール、ソルボース、スクロース、トレハロース、ピルビン酸、コハク酸、およびメチルアミンを含むが、これらに限定されない。好ましい態様では、培地はグルコースを含む。いくつかの態様において、培地は、ポリオールまたはアルドール糖、例えば、マンニトール、イノシトール、ソルボース、グリセロール、ソルビトール、ラクトース、およびアラビノースを炭素源として含む。炭素源のすべてが培養の開始前に培地に添加される場合もあれば、培養中に段階的または連続的に添加される場合もある。

組換え宿主細胞のための例示的な培養培地は、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４−２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２−４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２、およびＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む。好ましくは、培地は、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４−２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２−４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２、およびＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏを含む。

本明細書で使用される培地は、固体であっても液体であってもよく、合成（すなわち人工）であっても天然であってもよく、組換え宿主細胞の培養のために十分な栄養素を含みうる。好ましくは、培地は液体培地である。

いくつかの態様において、培地は、好適な無機塩をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、微量栄養素をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、増殖因子をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、追加の炭素源をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および補足的な炭素源をさらに含んでもよい。Ｅ．ｃｏｌｉを培養するのに好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および補足的な炭素源は、当技術分野において公知である。

いくつかの態様において、培地は、ペプトン、Ｎ−Ｚアミン、ダイズの酵素的加水分解産物、追加の酵母エキス、麦芽エキス、補助的な炭素源、および様々なビタミンなどの追加の成分を必要に応じて含んでもよい。いくつかの態様において、培地は、ペプトン、Ｎ−Ｚアミン、ダイズの酵素的加水分解産物、追加の酵母エキス、麦芽エキス、補助的な炭素源、および様々なビタミンなどの追加の成分を含まない。

好適な補助的な炭素源の実例としては、例えばグルコース、フルクトース、マンニトール、デンプンまたはデンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物および糖蜜といった他の炭水化物、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸などの有機酸、ならびにグリセロール、イノシトール、マンニトールおよびソルビトールなどのアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、培地は、窒素源をさらに含む。Ｅ．ｃｏｌｉを培養するのに好適な窒素源は、当技術分野において公知である。好適な窒素源の実例としては、アンモニアガスおよびアンモニア水を含むアンモニア、無機酸または有機酸のアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、および酢酸アンモニウム、尿素、硝酸塩または亜硝酸塩、ならびに他の窒素含有物質、例えば純粋または粗製の調製物としてのアミノ酸、肉エキス、ペプトン、フィッシュミール、魚加水分解産物、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解産物、ダイズかす加水分解産物、酵母エキス、乾燥酵母、エタノール酵母留出物、ダイズ粉、綿実ミールなどが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、培地は、無機塩を含む。好適な無機塩の実例としては、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅、モリブデン、タングステンおよび他の微量元素、ならびにリン酸の各塩が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、培地は、適切な増殖因子を含む。適切な微量栄養素、増殖因子などの実例としては、純粋なもしくは部分的に精製された化学化合物としての、または天然物質中に存在するものとしての、補酵素Ａ、パントテン酸、ピリドキシン−ＨＣｌ、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＤＬ−６，８−チオクト酸、葉酸、ビタミンＢ_１２、他のビタミン、システインおよびヒドロキシプロリンなどのアミノ酸、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン、およびシトシンなどの塩基、チオ硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸またはｒ−アミノ安息香酸、ナイアシンアミド、ニトリロ酢酸などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの量は、当技術分野において公知である方法および技術に従い、当業者によって経験的に決定されうる。

別の態様では、本明細書に記載の（対応する野生型糖類と比較して）修飾された糖類は、合成的に、例えばインビトロで生成される。糖類の合成的生成または合成は、コスト集約的かつ時間集約的な生成プロセスの回避を容易にしうる。一態様において、糖類は、好適に保護された単糖中間体から、例えば、順次グリコシル化戦略または順次グリコシル化と［３＋２］ブロック合成戦略との組み合わせを使用することなどによって、合成的に合成される。例えば、チオグリコシドおよびグリコシルトリクロロアセトイミデート誘導体が、グリコシル化におけるグリコシル供与体として使用されうる。一態様において、インビトロで合成的に合成される糖類は、上述のｗｚｚファミリータンパク質の操作などによる組換え手法によって生成された糖類と同一の構造を有する。

生成された（組換えまたは合成手法によって）糖類は、例えば、次のＥ．ｃｏｌｉ血清型：Ｏ１（例えば、Ｏ１Ａ、Ｏ１Ｂ、およびＯ１Ｃ）、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４（例えば、Ｏ４：Ｋ５２およびＯ４：Ｋ６）、Ｏ５（例えば、Ｏ５ａｂおよびＯ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、Ｏ６（例えば、Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５およびＯ６：Ｋ５４）、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８（例えば、Ｏ１８Ａ、Ｏ１８ａｃ、Ｏ１８Ａ１、Ｏ１８Ｂ、およびＯ１８Ｂ１）、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３（例えば、Ｏ２３Ａ）、Ｏ２４、Ｏ２５（例えば、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ）、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５（例えば、Ｏ４５およびＯ４５ｒｅｌ）、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、６２Ｄ_１、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３（例えば、Ｏ７３（株７３−１））、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、Ｏ１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７のいずれか１つを含む、任意のＥ．ｃｏｌｉ血清型に由来する構造を含む。

個々の多糖は、通常、当技術分野において公知の方法、例えば、透析、濃縮作業、透析濾過作業、接線流濾過、沈殿、溶出、遠心分離、沈殿、限外濾過、深層濾過、および／またはカラムクロマトグラフィ（イオン交換クロマトグラフィ、マルチモーダルイオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ、および疎水性相互作用クロマトグラフィ）などによって精製される（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に対して濃縮される）。好ましくは、多糖は、接線流濾過を含む方法によって精製される。

精製された多糖は、本明細書でさらに説明するように、反応することが可能になるように（例えば、担体タンパク質に対して直接的に、またはｅＴＥＣスペーサーなどのリンカーを介して）活性化されて（例えば、化学的に活性化されて）から、本発明のグリココンジュゲートに組み込まれてもよい。

好ましい一態様において、本発明の糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型に由来し、血清型はＯ２５ａである。別の好ましい態様において、血清型はＯ２５ｂである。別の好ましい態様において、血清型はＯ１Ａである。別の好ましい態様において、血清型はＯ２である。別の好ましい態様において、血清型はＯ６である。別の好ましい態様において、血清型はＯ１７である。別の好ましい態様において、血清型はＯ１５である。別の好ましい態様において、血清型はＯ１８Ａである。別の好ましい態様において、血清型はＯ７５である。別の好ましい態様において、血清型はＯ４である。別の好ましい態様において、血清型はＯ１６である。別の好ましい態様において、血清型はＯ１３である。別の好ましい態様において、血清型はＯ７である。別の好ましい態様において、血清型はＯ８である。別の好ましい態様において、血清型はＯ９である。

本明細書で使用される場合、上記の血清型のいずれかへの言及は、当技術分野において公知であり、対応する血清型に特有である繰り返し単位構造（後述するＯ単位）を含む血清型を意味する。例えば、「Ｏ２５ａ」血清型という用語（当技術分野では血清型「Ｏ２５」としても知られる）は、表１に示される式Ｏ２５を包含する血清型を意味する。別の例として、「Ｏ２５ｂ」血清型という用語は、表１に示される式Ｏ２５ｂを包含する血清型を意味する。

本明細書で使用される場合、血清型は、特記なき限り、例えば、式「Ｏ１８」という用語が式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１を総称的に意味するように、本明細書では総称的に参照される。

本明細書で使用される場合、「Ｏ１」という用語は、それぞれ表１に示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つのように、表１による式名に総称「Ｏ１」を含む式の種を総称的に意味する。したがって、「Ｏ１血清型」は、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つを包含する血清型を総称的に意味する。

本明細書で使用される場合、「Ｏ６」という用語は、それぞれ表１に示される式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つのように、表１による式名に総称「Ｏ６」を含む式の種を総称的に意味する。したがって、「Ｏ６血清型」は、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つを包含する血清型を総称的に意味する。

表１による式名に総称を含む式の種を総称的に意味する用語の他の例は、「Ｏ４」、「Ｏ５」、「Ｏ１８」、および「Ｏ４５」を含む。
本明細書で使用される場合、「Ｏ２」という用語は、表１に示される式Ｏ２を意味する。「Ｏ２Ｏ抗原」という用語は、表１に示される式Ｏ２を包含する糖類を意味する。

本明細書で使用される場合、上記の血清型のＯ抗原への言及は、対応する血清型名が付された式を包含する糖類を意味する。例えば、「Ｏ２５ＢＯ抗原」という用語は、表１に示される式Ｏ２５Ｂを包含する糖類を意味する。

別の例として、「Ｏ１Ｏ抗原」という用語は、それぞれ表１に示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのように、「Ｏ１」という用語を含む式を包含する糖類を総称的に意味する。

別の例として、「Ｏ６Ｏ抗原」という用語は、それぞれ表１に示される式Ｏ６：Ｋ２、式Ｏ６：Ｋ１３、式Ｏ６：Ｋ１５、および式Ｏ６：Ｋ５４のように、「Ｏ６」という用語を含む式を包含する糖類を総称的に意味する。

Ｂ．Ｏ多糖
本明細書で使用される場合、「Ｏ多糖」という用語は、構造が全細胞またはリピドＡを含まないことを条件として、Ｏ抗原を含む任意の構造を意味する。例えば、一態様において、Ｏ多糖は、リピドＡが結合していないリポ多糖を含む。リピドＡを除去するステップは当技術分野において公知であり、例として、酸の添加による熱処理を含む。例示的なプロセスは、１％酢酸による１００℃で９０分間の処理を含む。このプロセスは、除去されるリピドＡを単離するプロセスと組み合わされる。リピドＡを単離する例示的なプロセスは、超遠心分離を含む。

一態様において、Ｏ多糖は、Ｏ抗原からなる構造を意味し、この場合、Ｏ多糖は、Ｏ抗原という用語と同義である。好ましい一態様において、Ｏ多糖は、Ｏ抗原の繰り返し単位を含み、コア糖類を含まない構造を意味する。したがって、一態様において、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１コア部分を含まない。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２コア部分を含まない。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３コア部分を含まない。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４コア部分を含まない。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２コア部分を含まない。別の好ましい態様において、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖類を含む構造を意味する。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｏ抗原、コア糖類、およびＫＤＯ部分を含む構造を意味する。

コアオリゴ糖を含むＯ多糖をＬＰＳから精製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、ＬＰＳの精製後、精製されたＬＰＳが、１００℃で９０分間、１％（ｖ／ｖ）酢酸中で加熱することにより加水分解され、その後、４℃で５時間、１４２，０００×ｇでの超遠心分離が行われる場合がある。Ｏ多糖を含む上清がフリーズドライされ、４℃で保管される。ある特定の態様において、Ｏ多糖の簡単な精製を可能にする莢膜合成遺伝子の欠失が記載される。

Ｏ多糖は、ＬＰＳからリピドＡを除去するための弱酸加水分解を含むがこれに限定されない方法によって単離されうる。他の態様は、Ｏ多糖を調製するための薬剤としてのヒドラジンの使用を含みうる。ＬＰＳの調製は、当技術分野において公知の方法によって達成されうる。

ある特定の態様では、Ｗｚｚタンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現する（必ずしも過剰発現するとは限らない）野生型、修飾型、または弱毒型のグラム陰性菌株から精製されたＯ多糖が、コンジュゲートワクチンにおいて使用するために提供される。好ましい態様では、Ｏ多糖鎖が、ｗｚｚタンパク質を発現する（必ずしも過剰発現するとは限らない）グラム陰性菌株から、コンジュゲートまたは複合ワクチンのいずれかとして、ワクチン抗原として使用するために精製される。

一態様において、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５１倍、５２倍、５３倍、５４倍、５５倍、５６倍、５７倍、５８倍、５９倍、６０倍、６１倍、６２倍、６３倍、６４倍、６５倍、６６倍、６７倍、６８倍、６９倍、７０倍、７１倍、７２倍、７３倍、７４倍、７５倍、７６倍、７７倍、７８倍、７９倍、８０倍、８１倍、８２倍、８３倍、８４倍、８５倍、８６倍、８７倍、８８倍、８９倍、９０倍、９１倍、９２倍、９３倍、９４倍、９５倍、９６倍、９７倍、９８倍、９９倍、１００倍、またはそれ以上増大した分子量を有する。好ましい態様では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１倍以上５倍以下に増大した分子量を有する。別の態様では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、２倍以上４倍以下に増大した分子量を有する。対応する野生型Ｏ多糖と比較したＯ多糖の分子量の増大は、好ましくは、Ｏ抗原の繰り返し単位数の増大に関連する。一態様において、Ｏ多糖の分子量の増大は、ｗｚｚファミリータンパク質によるものである。

一態様において、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｋＤａ、またはそれ以上増大した分子量を有する。一態様において、本発明のＯ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大した分子量を有する。一態様において、分子量は、５ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１２ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１５ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１８ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２１ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２２ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、３０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、５ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１５ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２０ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１ｋＤａ以上７５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、５ｋＤａ以上７５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上７５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１２ｋＤａ以上７５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１５ｋＤａ以上７５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１８ｋＤａ以上７５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２０ｋＤａ以上７５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、３０ｋＤａ以上７５Ｄａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１２ｋＤａ以上８５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上７５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上７０ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上６０ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上４９ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上４８ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上４７ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、１０ｋＤａ以上４６ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２０ｋＤａ以上４５ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２０ｋＤａ以上４４ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２０ｋＤａ以上４３ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２０ｋＤａ以上４２ｋＤａ以下増大する。一態様において、分子量は、２０ｋＤａ以上４１ｋＤａ以下増大する。このような、対応する野生型Ｏ多糖と比較したＯ多糖の分子量の増大は、好ましくは、Ｏ抗原の繰り返し単位数の増大に関連する。一態様において、Ｏ多糖の分子量の増大は、ｗｚｚファミリータンパク質によるものである。例えば、表２１を参照されたい。

別の態様では、Ｏ多糖は、表１から選択されるいずれか１つの式を含み、ここで、Ｏ多糖における繰り返し単位数であるｎは、対応する野生型Ｏ多糖における繰り返し単位数と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上の繰り返し単位だけ大きい。好ましくは、糖類は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個多い繰り返し単位を含む。例えば、表２１を参照されたい。

Ｃ．Ｏ抗原
Ｏ抗原は、グラム陰性菌の外膜におけるリポ多糖（ＬＰＳ）の一部である。Ｏ抗原は細胞表面に存在し、可変的な細胞構成要素である。Ｏ抗原の可変性は、グラム陰性菌の血清型判定のための基礎を提供する。現在のＥ．ｃｏｌｉ血清型判定スキームは、Ｏ多糖１〜１８１を含む。

Ｏ抗原はオリゴ糖繰り返し単位（Ｏ単位）を含み、その野生型構造は、通常、広範な糖の残基を２つから８つ含む。例示的なＥ．ｃｏｌｉＯ抗原のＯ単位は表１に示される。図９Ａ〜９Ｃおよび図１０Ａ〜１０Ｂも参照されたい。

一態様において、本発明の糖類は、１つのオリゴ糖単位でありうる。一態様において、本発明の糖類は、関連する血清型のオリゴ糖の１つの繰り返し単位である。そのような態様において、糖類は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含みうる。

一態様において、本発明の糖類は、オリゴ糖でありうる。オリゴ糖は、低い繰り返し単位数（通常は５〜１５の繰り返し単位）を有し、通常は、合成的に、または多糖の加水分解によって得られる。そのような態様において、糖類は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含みうる。

好ましくは、本発明の糖類および本発明の免疫原性組成物における糖類のすべてが多糖である。高分子量多糖は、抗原の表面に存在するエピトープに起因して、ある特定の抗体免疫応答を誘発しうる。高分子量多糖の単離および精製は、好ましくは、本発明のコンジュゲート、組成物、および方法において使用するために想定される。

いくつかの態様において、個々のＯ抗原ポリマーそれぞれにおける繰り返しＯ単位数（ひいてはポリマー鎖の長さおよび分子量）は、内膜タンパク質であるｗｚｚ鎖長調節因子に依存する。異なるｗｚｚタンパク質は、異なる範囲のモーダル長（４〜１００超の繰り返し単位）をもたらす。「モーダル長」という用語は、繰り返しＯ単位数を意味する。グラム陰性菌は、長いものと短いものとの２つの異なるＯＡｇモーダル鎖長をもたらす、２つの異なるＷｚｚタンパク質を有することが多い。グラム陰性菌におけるｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）の発現（必ずしも過剰発現とは限らない）は、Ｏ抗原の長さを操作して、特定の長さ範囲をもつＯ抗原の細菌による産生を変化させ、またはバイアスをかけ、高収量の高分子量リポ多糖の生成を増強させることを可能にしうる。一態様において、本明細書で使用される「短鎖」モーダル長は、低い繰り返しＯ単位数、例えば、１〜２０を意味する。一態様において、本明細書で使用される「長鎖」モーダル長は、２０超、かつ最大４０までの繰り返しＯ単位数を意味する。一態様において、本明細書で使用される「超長鎖」モーダル長は、４０超の繰り返しＯ単位を意味する。

一態様において、生成される糖類は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して少なくとも１０個多い繰り返し単位、１５個多い繰り返し単位、２０個多い繰り返し単位、２５個多い繰り返し単位、３０個多い繰り返し単位、３５個多い繰り返し単位、４０個多い繰り返し単位、４５個多い繰り返し単位、５０個多い繰り返し単位、５５個多い繰り返し単位、６０個多い繰り返し単位、６５個多い繰り返し単位、７０個多い繰り返し単位、７５個多い繰り返し単位、８０個多い繰り返し単位、８５個多い繰り返し単位、９０個多い繰り返し単位、９５個多い繰り返し単位、または１００個多い繰り返し単位を有する。

別の態様では、本発明の糖類は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上多い繰り返し単位を有する。好ましくは、糖類は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個多い繰り返し単位を含む。例えば、表２１を参照されたい。糖類の長さを決定する方法は、当技術分野において公知である。そのような方法は、実施例１３に記載されるように、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィを含む。

糖類における繰り返し単位数を決定する方法もまた、当技術分野において公知である。例えば、繰り返し単位数（または式中の「ｎ」）は、多糖の分子量（コア糖類またはＫＤＯ残基の分子量を含まない）を、繰り返し単位の分子量（すなわち、例えば表１に示される対応する式における、式中の各単糖の分子量の和として理論的に計算されうる構造の分子量）で割ることによって計算されうる。式中の各単糖の分子量は、当技術分野において公知である。例えば、式Ｏ２５ｂの繰り返し単位の分子量は、約８６２Ｄａである。例えば、式Ｏ１ａの繰り返し単位の分子量は、約８４５Ｄａである。例えば、式Ｏ２の繰り返し単位の分子量は、約８２９Ｄａである。例えば、式Ｏ６の繰り返し単位の分子量は、約８９３Ｄａである。コンジュゲートにおける繰り返し単位数を決定する際は、担体タンパク質の分子量およびタンパク質：多糖比が計算の要素に入れられる。本明細書で定義されるように、「ｎ」は、多糖分子中の繰り返し単位数である（表１では括弧でくくられて表されている）。当技術分野において公知であるように、生体高分子における繰り返し構造には、例えば分枝の欠落のように、繰り返しが不完全な領域が散在していてもよい。さらに、当技術分野では、細菌などの天然源から単離または精製された多糖が、サイズおよび分枝において不均一でありうることが知られている。そのような場合、ｎは、母集団内の分子のｎの平均値または中央値を表しうる。

一態様において、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して少なくとも１つ多いＯ抗原の繰り返し単位を有する。Ｏ抗原の繰り返し単位は、表１に示される。一態様において、Ｏ多糖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上の全繰り返し単位を含む。好ましくは、糖類は、合計で３以上８０以下の繰り返し単位を有する。別の態様では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上多い繰り返し単位を有する。

一態様において、糖類は、Ｏ抗原の式（例えば、表１（図９Ａ〜９Ｃおよび図１０Ａ〜１０Ｂも参照されたい）に示される式など）のいずれかにおけるｎが、１、２、３、４、５、１０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０以上で、２００、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、または５０以下の整数であるＯ抗原を含む。任意の最小数と任意の最大数とを組み合わせて範囲を定義してもよい。例示的な範囲は、例えば、１以上１０００以下、１０以上５００以下、および２０以上８０以下、好ましくは９０以下を含む。好ましい一態様において、ｎは、３１以上９０以下である。好ましい態様では、ｎは、４０〜９０、より好ましくは６０〜８５である。

一態様において、糖類は、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎが１以上２００以下であるＯ抗原を含む。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、５以上２００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、１０以上２００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、２５以上２００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、５０以上２００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、７５以上２００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、１００以上２００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、１２５以上２００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、１５０以上２００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、１７５以上２００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、１以上１００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、５以上１００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、１０以上１００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、２５以上１００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、５０以上１００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、７５以上１００以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、１以上７５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、５以上７５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、１０以上７５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、２０以上７５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、２５以上７５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３０以上７５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、４０以上７５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、５０以上７５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３０以上９０以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３５以上８５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３５以上７５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３５以上７０以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３５以上６０以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３５以上５０以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３５以上４９以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３５以上４８以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３５以上４７以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３５以上４６以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３６以上４５以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３７以上４４以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３８以上４３以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３９以上４２以下である。一態様において、Ｏ抗原の式のいずれか１つにおけるｎは、３９以上４１以下である。

例えば、一態様において、糖類のｎは、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０、最も好ましくは４０である。別の態様では、ｎは、３５以上６０以下である。例えば、一態様において、ｎは、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０のいずれか１つ、好ましくは５０である。別の好ましい態様において、ｎは、５５以上７５以下である。例えば、一態様において、ｎは、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９、最も好ましくは６０である。

糖類の構造は、１Ｄ、１Ｈ、および／または１３Ｃ、２ＤＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、および／またはＨＭＱＣを含む、例えばＮＭＲなどの当技術分野において公知である方法およびツールによって決定されうる。

いくつかの態様において、コンジュゲーション前の精製された多糖は、５ｋＤａ〜４００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる態様において、糖類は、１０ｋＤａ〜４００ｋＤａ、５ｋＤａ〜４００ｋＤａ、５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、５ｋＤａ〜２００ｋＤａ、５ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜７５ｋＤａ、１０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、１５ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、１２ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、１２ｋＤａ〜７５ｋＤａ、１２ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１２〜６０ｋＤａ、３５ｋＤａ〜７５ｋＤａ、４０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、３５ｋＤａ〜６０ｋＤａ、２０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、１２ｋＤａ〜２０ｋＤａ、または２０ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する。さらなる態様において、多糖は、７ｋＤａ〜１５ｋＤａ、８ｋＤａ〜１６ｋＤａ、９ｋＤａ〜２５ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１００、１０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜７０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１６０ｋＤａ、１５ｋＤａ〜６００ｋＤａ、２０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、２０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、２０ｋＤａ〜４００ｋＤａ、３０ｋＤａ〜１，０００ＫＤａ、３０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、３０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、または５ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量を有する。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。

本明細書で使用される場合、多糖または担体タンパク質−多糖コンジュゲートの「分子量」という用語は、マルチアングルレーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって計算される分子量を意味する。

多糖は、通常の精製工程中にサイズがわずかに縮小する場合がある。さらに、本明細書に記載されるように、多糖は、コンジュゲーション前にサイズ分類技術に供される場合がある。機械的または化学的なサイズ分類が用いられうる。酢酸を使用した化学的加水分解が実施されうる。機械的サイズ分類は、高圧均質化せん断を使用して実施されうる。上述の分子量範囲は、コンジュゲーション前（例えば、活性化前）の精製された多糖に関するものである。

Ｄ．コアオリゴ糖
コアオリゴ糖は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉのＬＰＳにおけるリピドＡとＯ抗原外部領域との間に位置する。より詳細には、コアオリゴ糖は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＯ抗原とリピドＡとの間の結合を含む多糖の一部である。この結合は、最も内側の３−デオキシ−ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（ＫＤＯ））残基のヘミケタール官能基と、リピドＡのＧｌｃＮＡｃ−残基のヒドロキシル基との間のケトシド結合を含む。コアオリゴ糖領域は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株間で高度の類似性を示す。これは通常、限定された数の糖を含む。コアオリゴ糖は、内側コア領域および外側コア領域を含む。

より詳細には、内側コアは、主にＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース（ヘプトース）およびＫＤＯ残基から構成されている。内側コアは高度に保存されている。ＫＤＯ残基は、次式のＫＤＯを含む。

コアオリゴ糖の外部領域は、内側コア領域よりも高い多様性を示し、この領域における差が、Ｅ．ｃｏｌｉの５つの化学型であるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＫ−１２を区別する。５つの既知の化学型の外側コアオリゴ糖の炭水化物骨格の一般化構造を示す図２４を参照されたい。ＨｅｐＩＩが内側コアオリゴ糖の最後の残基である。外側コアオリゴ糖のすべてに、（六炭糖）_３炭水化物骨格および２つの側鎖残基を有する構造的テーマが共通するが、骨格内の六炭糖の順序、ならびに側鎖残基の性質、位置、および結合はいずれも異なりうる。Ｒ１およびＲ４外側コアオリゴ糖の構造は高度に類似しており、単一のβ結合残基のみが異なる。

当技術分野において、野生型Ｅ．ｃｏｌｉのコアオリゴ糖は、末端のオリゴ糖の構造に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４、およびＥ．ｃｏｌｉＫ１２という５つの異なる化学型に分類される。

好ましい態様では、本明細書に記載の組成物は、Ｏ抗原に結合したコアオリゴ糖がＯ多糖に含まれるグリココンジュゲートを含む。一態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４、およびＥ．ｃｏｌｉＫ１２のうち少なくともいずれか１つのコアＥ．ｃｏｌｉ化学型に対する免疫応答を誘発する。別の態様では、本組成物は、少なくとも２つのコアＥ．ｃｏｌｉ化学型に対する免疫応答を誘発する。別の態様では、本組成物は、少なくとも３つのコアＥ．ｃｏｌｉ化学型に対する免疫応答を誘発する。別の態様では、本組成物は、少なくとも４つのコアＥ．ｃｏｌｉ化学型に対する免疫応答を誘発する。別の態様では、本組成物は、５つすべてのコアＥ．ｃｏｌｉ化学型に対する免疫応答を誘発する。

別の好ましい態様において、本明細書に記載の組成物は、Ｏ抗原に結合したコアオリゴ糖がＯ多糖に含まれないグリココンジュゲートを含む。一態様において、かかる組成物は、グリココンジュゲートが、コアオリゴ糖を含まないＯ多糖を有するにもかかわらず、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４、およびＥ．ｃｏｌｉＫ１２のうち少なくともいずれか１つのコアＥ．ｃｏｌｉ化学型に対する免疫応答を誘発する。

Ｅ．ｃｏｌｉ血清型は、５つの化学型のうちの１つによって特徴付けられる場合がある。表２は、化学型によって特徴付けられる例示的な血清型の一覧である。太字の血清型は、示されるコア化学型に最も一般的に関連付けられる血清型を表す。したがって、好ましい態様において、本組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４、およびＥ．ｃｏｌｉＫ１２のうち少なくともいずれか１つのコアＥ．ｃｏｌｉ化学型に対する免疫応答を誘発し、この免疫応答は、それぞれの対応するＥ．ｃｏｌｉ血清型のいずれか１つに対する免疫応答を含む。

いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ８、式Ｏ１８、式Ｏ９、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは、１〜１００である）を有する糖類から選択される、Ｒ１化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図２４に示されるＥ．ｃｏｌｉＲ１コア部分をさらに含む。

いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ１８、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは、１〜１００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を有する糖類から選択される、Ｒ１化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、糖類にＥ．ｃｏｌｉＲ１コア部分をさらに含む。

いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式Ｏ２１、式Ｏ４４、式Ｏ１１、式Ｏ８９、式Ｏ１６２、および式Ｏ９（式中、ｎは、１〜１００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を有する糖類から選択される、Ｒ２化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図２４に示されるＥ．ｃｏｌｉＲ２コア部分をさらに含む。

いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ１５、式Ｏ１５３、式Ｏ２１、式Ｏ１７、式Ｏ１１、式Ｏ１５９、式Ｏ２２、式Ｏ８６、および式Ｏ９３（式中、ｎは、１〜１００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を有する糖類から選択される、Ｒ３化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図２４に示されるＥ．ｃｏｌｉＲ３コア部分をさらに含む。

いくつかの態様において、本組成物は、例えば、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ８６、式Ｏ７、式Ｏ１０２、式Ｏ１６０、および式Ｏ１６６（式中、ｎは、１〜１００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を有する糖類から選択される、Ｒ４化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図２４に示されるＥ．ｃｏｌｉＲ４コア部分をさらに含む。

いくつかの態様において、本組成物は、Ｋ−１２化学型を有する血清型に由来する構造を含む糖類（例えば、式Ｏ２５ｂを有する糖類および式Ｏ１６を有する糖類から選択されるもの）（式中、ｎは、１〜１０００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を含む。いくつかの態様において、前記組成物中の糖類は、例えば、図２４に示されるＥ．ｃｏｌｉＫ−１２コア部分をさらに含む。

いくつかの態様において、糖類は、コア糖類を含む。したがって、一態様において、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１コア部分をさらに含む。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２コア部分をさらに含む。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３コア部分をさらに含む。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４コア部分をさらに含む。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２コア部分をさらに含む。

いくつかの態様において、糖類は、コア糖類を含まない。したがって、一態様において、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１コア部分を含まない。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２コア部分を含まない。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３コア部分を含まない。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４コア部分を含まない。別の態様では、Ｏ多糖は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２コア部分を含まない。

Ｅ．コンジュゲートされたＯ抗原
Ｏ抗原または好ましくはＯ多糖のタンパク質担体への化学結合は、Ｏ抗原またはＯ多糖の免疫原性を向上させうる。しかしながら、ポリマーサイズの可変性は、生産における現実的課題を呈する。商業用途において、糖類のサイズは、様々なコンジュゲーション合成戦略との適合性、生成物の均一性、およびコンジュゲートの免疫原性に影響を及ぼしうる。Ｏ抗原合成経路の操作によってＷｚｚファミリータンパク質鎖長調節因子の発現を制御することで、Ｅ．ｃｏｌｉを含む多様なグラム陰性菌株における所望の長さのＯ抗原鎖の産生が可能になる。

一態様において、担体タンパク質と反応することができる活性化型糖類を生成するために、精製された糖類が化学的に活性化される。活性化されたら、各糖類が別々に担体タンパク質にコンジュゲートされて、コンジュゲート、すなわちグリココンジュゲートを形成する。本明細書で使用される場合、「グリココンジュゲート」という用語は、担体タンパク質に共有結合した糖類を意味する。一態様において、糖類は、担体タンパク質に直接連結される。別の態様では、糖類は、スペーサー／リンカーを介してタンパク質に連結される。コンジュゲートは、Ｏ抗原に沿った１つもしくは複数の部位で担体をＯ抗原に結合させるスキーム、またはコアオリゴ糖の少なくとも１つの残基を活性化させるスキームによって調製されうる。

一態様において、各糖類は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされる。タンパク質担体が組成物中の２つ以上の糖類に対して同じである場合、これらの糖類は、担体タンパク質の同じ分子にコンジュゲートされてもよい（例えば、担体分子に２つ以上の異なる糖類がコンジュゲートされる）。

好ましい態様では、糖類はそれぞれ、タンパク質担体の異なる分子に個別にコンジュゲートされる（タンパク質担体の各分子に１種類の糖類のみがコンジュゲートされる）。前記態様において、糖類は、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされると言われる。

糖類の化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、本明細書に開示される活性化およびコンジュゲーションの方法によって達成されうる。担体タンパク質への多糖のコンジュゲーションの後、グリココンジュゲートは多様な技術によって精製される（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に対して濃縮される）。これらの技術は、濃縮／透析濾過作業、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィ、および深層濾過を含む。個々のグリココンジュゲートが精製された後、これらが複合されて、本発明の免疫原性組成物が処方される。

活性化。本発明はさらに、本明細書に記載の態様のいずれかによって生成される活性化型多糖に関し、この多糖は、化学試薬によって活性化されて、リンカーまたは担体タンパク質へのコンジュゲーションのための反応性基をもたらす。いくつかの態様において、本発明の糖類は、担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に活性化される。いくつかの態様において、活性化度は、多糖の分子量を有意に低減させない。例えば、いくつかの態様において、活性化度は、多糖の骨格を切断しない。いくつかの態様において、活性化度は、ＣＲＭ_１９７などの担体タンパク質において修飾されているリジン残基の数（アミノ酸解析によって決定される）によって測定されるコンジュゲーション度に有意な影響を及ぼさない。例えば、いくつかの態様において、活性化度は、担体タンパク質において修飾されているリジン残基の数（アミノ酸解析によって決定される）を、同じ活性化度における参照多糖とのコンジュゲートの担体タンパク質において修飾されているリジン残基の数と比較して、３倍有意に増大させない。いくつかの態様において、活性化度は、コンジュゲートされていない遊離糖類のレベルを上昇させない。いくつかの態様において、活性化度は、最適な糖類／タンパク質比を減少させない。

いくつかの態様において、活性化型糖類は、活性化型糖類の糖類繰り返し単位当たりのチオールのモルが１〜１００％、例えば、２〜８０％、２〜５０％、３〜３０％、および４〜２５％である活性化率を有する。活性化度は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、または≧９０％、または約１００％である。好ましくは、活性化度は、最大で５０％、より好ましくは最大で２５％である。一態様において、活性化度は、最大で２０％である。任意の最小数と任意の最大数とを組み合わせて範囲を定義してもよい。

一態様において、多糖は、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化されて、シアン酸エステルを生じる。活性化型多糖は、次いで、担体タンパク質（好ましくはＣＲＭ_１９７または破傷風トキソイド）のアミノ基に直接、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングされる。

例えば、スペーサーは、チオール化多糖をもたらすシスタミンまたはシステアミンであってもよく、チオール化多糖は、マレイミド活性化担体タンパク質との反応（例えば、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を使用）、またはハロアセチル化担体タンパク質との反応（例えば、ヨードアセトイミド、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ；ＳＩＢ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、またはスクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロプリオネート（ＳＢＡＰ）を使用）の後に得られるチオエーテル結合を介して、担体にカップリングされうる。一態様において、シアン酸エステル（任意選択でＣＤＡＰ化学により作製される）が、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）にカップリングされ、アミノ誘導体化された糖類が、カルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を使用して、タンパク質担体のカルボキシル基を介して担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ_１９７）にコンジュゲートされる。

他の好適なコンジュゲーション技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。コンジュゲーションは、カルボニルリンカーを必要とする場合があり、カルボニルリンカーは、糖類の遊離ヒドロキシル基をＣＤＩと反応させ、その後、タンパク質と反応させてカルバメート結合を形成することによって形成されうる。これは、アノマー末端の第一級ヒドロキシル基への還元、第一級ヒドロキシル基の任意選択による保護／脱保護、第一級ヒドロキシル基をＣＤＩと反応させることによるＣＤＩカルバメート中間体の形成、およびタンパク質のアミノ基とのＣＤＩカルバメート中間体のカップリング（ＣＤＩ化学）を伴いうる。

分子量。いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む。他の態様では、糖類は、５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの分子量を有する。他の態様では、糖類は、７０ｋＤａ〜９００ｋＤａの分子量を有する。他の態様では、糖類は、１００ｋＤａ〜８００ｋＤａの分子量を有する。他の態様では、糖類は、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａの分子量を有する。さらなる態様において、糖類は、１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜４００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜９００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜７００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜４００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３００、２５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜９００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜７００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜３５０ｋＤａ、３００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜４００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜６００ｋＤａの分子量を有する。一態様において、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、単一末端コンジュゲーションによって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、水性バッファー中において調製される還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）によって生成される。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。

いくつかの態様において、本発明のグリココンジュゲートは、４００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、３，０００ｋＤａ〜８，０００ｋＤａ、または３，０００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量を有する。他の態様では、グリココンジュゲートは、５００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の態様では、グリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ〜８，０００ｋＤａの分子量を有する。さらに他の態様において、グリココンジュゲートは、２，０００ｋＤａ〜８，０００ｋＤａまたは３，０００ｋＤａ〜７，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる態様において、本発明のグリココンジュゲートは、２００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜６，０００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、または２，０００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの分子量を有する。一態様において、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、本明細書に記載のｅＴＥＣコンジュゲーションによって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）によって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、ＤＭＳＯ中において調製される還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）によって生成される。

さらなる態様において、本発明のグリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ、３，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ、３，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、３，０００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａ、４，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、４，０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、４，０００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａ、または５，０００ｋＤａ〜７，０００ｋＤａの分子量を有する。一態様において、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）によって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、ＤＭＳＯ中において調製される還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）によって生成される。別の態様では、このような分子量を有するグリココンジュゲートは、本明細書に記載のｅＴＥＣコンジュゲーションによって生成される。

さらなる態様において、本発明のグリココンジュゲートは、５，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ、５，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、５，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、５，０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、６，０００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ、６，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａ、６，０００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａ、６，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、または６，０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａの分子量を有する。

グリココンジュゲートの分子量は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって測定されうる。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。本発明のグリココンジュゲートは、糖類の担体タンパク質に対する比（重量／重量）によって特徴付けることもできる。いくつかの態様において、グリココンジュゲートにおける多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５〜３（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０）である。他の態様では、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５〜２．０、０．５〜１．５、０．８〜１．２、０．５〜１．０、１．０〜１．５、または１．０〜２．０である。さらなる態様において、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．８〜１．２である。好ましい態様では、コンジュゲートにおける多糖の担体タンパク質に対する比は、０．９〜１．１である。このような態様のいくつかにおいて、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

グリココンジュゲートは、分子サイズ分布（Ｋ_ｄ）によって特徴付けることもできる。コンジュゲートの相対的な分子サイズ分布を決定するためには、サイズ排除クロマトグラフィ媒体（ＣＬ−４Ｂ）が使用されうる。サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）は、重力式カラムにおいてコンジュゲートの分子サイズ分布をプロファイリングするために使用される。媒体の細孔から排除される大きな分子は、小分子よりも速く溶出する。フラクションコレクターがカラム溶出物を収集するために使用される。糖類アッセイによる比色測定で画分が試験される。Ｋ_ｄの決定のためには、分子が完全に排除される分率（Ｖ_０）、（Ｋ_ｄ＝０）、および最大の保持を表す分率（Ｖ_ｉ）、（Ｋ_ｄ＝１）を確立するようにカラムを較正する。指定されたサンプル属性に達するときの分率（Ｖ_ｅ）は、式Ｋ_ｄ＝（Ｖ_ｅ−Ｖ_ｏ）／（Ｖ_ｉ−Ｖ_０）により、Ｋｄに関連付けられる。

遊離糖類。本発明のグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされていないにもかかわらずグリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖類を含みうる。遊離糖類は、グリココンジュゲートに非共有結合的に会合している（すなわち、非共有結合的に結合している、吸着されている、またはグリココンジュゲート中にまたはグリココンジュゲートにより捕捉されている）場合がある。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、または１５％の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して約２５％未満の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約２０％の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約１５％の遊離多糖を含む。別の好ましい態様において、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して約８％未満の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約６％の遊離多糖を含む。好ましい態様では、グリココンジュゲートは、多糖の総量と比較して最大で約５％の遊離多糖を含む。例えば、表１９、表２０、表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。

共有結合。他の態様では、コンジュゲートは、５〜１０個の糖類繰り返し単位毎、２〜７個の糖類繰り返し単位毎、３〜８個の糖類繰り返し単位毎、４〜９個の糖類繰り返し単位毎、６〜１１個の糖類繰り返し単位毎、７〜１２個の糖類繰り返し単位毎、８〜１３個の糖類繰り返し単位毎、９〜１４個の糖類繰り返し単位毎、１０〜１５個の糖類繰り返し単位毎、２〜６個の糖類繰り返し単位毎、３〜７個の糖類繰り返し単位毎、４〜８個の糖類繰り返し単位毎、６〜１０個の糖類繰り返し単位毎、７〜１１個の糖類繰り返し単位毎、８〜１２個の糖類繰り返し単位毎、９〜１３個の糖類繰り返し単位毎、１０〜１４個の糖類繰り返し単位毎、１０〜２０個の糖類繰り返し単位毎、４〜２５個の糖類繰り返し単位毎、または２〜２５個の糖類繰り返し単位毎に、担体タンパク質と糖類との間に少なくとも１つの共有結合を含む。多くの態様において、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。別の態様では、担体タンパク質と糖類との間の少なくとも１つの結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の糖類繰り返し単位毎に生じる。一態様において、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。

リジン残基。本発明のグリココンジュゲートを特徴付ける別の方法は、コンジュゲートされるリジンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けられうる、糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ_１９７）におけるリジン残基の数によるものである。多糖への共有結合に起因する担体タンパク質のリジン修飾の証拠は、当業者に公知の定法を使用したアミノ酸解析によって得ることができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために使用される担体タンパク質出発材料と比較して、回収されるリジン残基の数を減少させる。好ましい態様では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５、または１０〜１２である。一態様において、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５である。好ましい態様では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、４〜７である。このような態様のいくつかにおいて、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

担体タンパク質のリジンへの糖類鎖の結合の頻度は、本発明のグリココンジュゲートを特徴付ける別のパラメータである。例えば、いくつかの態様において、多糖の４個の糖類繰り返し単位毎に、担体タンパク質と多糖との間に少なくとも１つの共有結合が存在する。別の態様では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１０個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも１回生じる。別の態様では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１５個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも１回生じる。さらなる態様では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の２５個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも１回生じる。

Ｏ−アセチル化。いくつかの態様において、本発明の糖類は、Ｏ−アセチル化される。いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、または８０〜９０％のＯ−アセチル化度を有する糖類を含む。他の態様では、Ｏ−アセチル化度は、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、または≧９０％、または約１００％である。Ｏ−アセチル化度（％）とは、１００％（各繰り返し単位が、アセチル化された構造に対して完全にアセチル化されている状態）に対する所与の糖類の百分率を意味する。

いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、還元的アミノ化によって調製される。いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲート糖類であり、この糖類は、担体タンパク質に直接的に共有結合している。いくつかの態様において、グリココンジュゲートは、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合している。

還元的アミノ化。一態様において、糖類は、還元的アミノ化により（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、米国特許出願公開第２００７／０２３１３４０号、米国特許出願公開第２００７／０１８４０７１号、および米国特許出願公開第２００７／０１８４０７２号、ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／０７９６５３、およびＷＯ２００８／１４３７０９に記載されるように）、担体タンパク質にコンジュゲートされる。

還元的アミノ化は、（１）糖類の酸化、（２）活性化型糖類および担体タンパク質の還元によるコンジュゲートの形成を含む。糖類は、酸化の前に任意選択で加水分解される。機械的または化学的な加水分解が用いられうる。酢酸を使用した化学的加水分解が実施されうる。

酸化ステップは、過ヨウ素酸との反応を伴いうる。本明細書で使用される「過ヨウ素酸」という用語は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を意味する。この用語はまた、メタ過ヨウ素酸（ＩＯ_４ ⁻）およびオルト過ヨウ素酸（ＩＯ_６ ^５−）と、過ヨウ素酸の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）の両方を含む。一態様において、多糖は、メタ過ヨウ素酸の存在下、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａｌＯ_４）の存在下で酸化される。別の態様では、多糖は、オルト過ヨウ素酸の存在下、好ましくは過ヨウ素酸の存在下で酸化される。

一態様において、酸化剤は、第一級ヒドロキシルを選択的に酸化させる酸化体の存在下における、ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物などの安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物である。前記反応において、実際の酸化体は、触媒サイクルにおけるＮ−オキソアンモニウム塩である。ある側面において、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である。ある側面において、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）またはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する。ある側面において、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。ある側面において、前記酸化体は、Ｎ−ハロ部分を有する分子である。ある側面において、前記酸化体は、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸、および１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンのいずれか１つから選択される。好ましくは、前記酸化体は、Ｎ−クロロスクシンイミドである。

糖類の酸化ステップ後、糖類は、活性化されたと言われ、以降本明細書では「活性化型」と呼ばれる。活性化型糖類および担体タンパク質は、独立して（別々の凍結乾燥により）、または一緒に（同時凍結乾燥により）、凍結乾燥（フリーズドライ）されうる。一態様において、活性化型糖類および担体タンパク質は、同時凍結乾燥される。別の態様では、活性化型多糖および担体タンパク質は、独立して凍結乾燥される。

一態様において、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行われ、考えられる非還元糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、およびパラチニットを含む。

コンジュゲーションプロセスの次のステップは、還元剤を使用した活性化型糖類および担体タンパク質の還元により、コンジュゲートを形成すること（いわゆる還元的アミノ化）である。好適な還元剤は、ブレンステッド酸もしくはルイス酸の存在下におけるシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、または水素化ホウ素ナトリウムもしくは水素化ホウ素亜鉛などのシアノ水素化ホウ素、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン、２，６−ジボラン−メタノール、ジメチルアミン−ボラン、ｔ−ＢｕＭｅ’ＰｒＮ−ＢＨ３、ベンジルアミン−ＢＨ３、もしくは５−エチル−２−メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）などのアミンボラン、ボラン−ピリジン、または水素化ホウ素交換樹脂を含む。一態様において、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。

ある態様において、還元反応は、水性溶媒（例えば、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシン、またはＨＥＰＢから選択され、６．０〜８．５、７．０〜８．０、または７．０〜７．５のｐＨ）において行われ、別の態様では、この反応は、非プロトン溶媒において行われる。ある態様において、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒において行われる。ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒は、凍結乾燥された活性化型多糖および担体タンパク質を再構成するために使用されうる。

還元反応の終わりに、未反応のアルデヒド基がコンジュゲート中に残っている場合があり、これらは、好適なキャッピング剤を使用してキャッピングされうる。一態様において、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）である。コンジュゲーション（還元反応および任意選択のキャッピング）後、グリココンジュゲートは、当業者に公知の多様な技術によって精製される（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に対して濃縮される）場合がある。これらの技術は、透析、濃縮／透析濾過作業、接線流濾過沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィ（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィ）、および深層濾過を含む。グリココンジュゲートは、透析濾過および／またはイオン交換クロマトグラフィおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィによって精製されうる。ある態様において、グリココンジュゲートは、透析濾過またはイオン交換クロマトグラフィまたはサイズ排除クロマトグラフィによって精製される。一態様において、グリココンジュゲートは、滅菌濾過される。

好ましい態様では、Ｏ２５Ｂ、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択されるＥ．ｃｏｌｉ血清型のグリココンジュゲートは、還元的アミノ化によって調製される。好ましい態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂ、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６のグリココンジュゲートは、還元的アミノ化によって調製される。

１つの側面において、本発明は、

により表される式Ｏ２５Ｂの糖類（式中、ｎは、１以上の任意の整数である）に結合した担体タンパク質、例えば、ＣＲＭ_１９７を含むコンジュゲートに関する。好ましい態様では、ｎは、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０以上で、２００、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、または５０以下の整数である。任意の最小数と任意の最大数とを組み合わせて範囲を定義してもよい。例示的な範囲は、例えば、１以上１０００以下、１０以上５００以下、および２０以上８０以下を含む。好ましい一態様において、ｎは、３１以上９０以下、より好ましくは４０〜９０、最も好ましくは６０〜８５である。

別の側面では、本発明は、表１（図９Ａ〜９Ｃおよび図１０Ａ〜１０Ｂも参照されたい）に示される以下の構造のいずれか１つを有する糖類（式中、ｎは、１以上の整数である）に結合した担体タンパク質、例えば、ＣＲＭ_１９７を含むコンジュゲートに関する。

理論または機構に束縛されるものではないが、いくつかの態様において、安定なコンジュゲートは、抗原の重要な免疫原性エピトープの構造的完全性を保つこととのバランスがとれるレベルの糖類抗原修飾を必要とすると考えられる。

活性化およびアルデヒドの形成。いくつかの態様において、本発明の糖類は活性化され、アルデヒドの形成をもたらす。糖類が活性化されるこのような態様において、活性化率（％）（または酸化度（ＤＯ））（例えば、実施例３２を参照されたい）とは、活性化型多糖のアルデヒドのモル当たりの糖類繰り返し単位のモルを意味する。例えば、いくつかの態様では、多糖の繰り返し単位における隣接ジオールの過ヨウ素酸酸化によって糖類が活性化され、アルデヒドの形成がもたらされる。糖類繰り返し単位に対する過ヨウ素酸ナトリウムのモル当量（ｍｅｑ）および酸化中の温度を変化させると、異なるレベルの酸化度（ＤＯ）がもたらされる。

糖類およびアルデヒドの濃度は、通常、比色アッセイによって決定される。代替的な試薬は、第一級アルコール基からのアルデヒドの形成をもたらすＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルラジカル）−Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）の組み合わせである。

いくつかの態様において、活性化型糖類は、活性化型糖類のアルデヒドのモル当たりの糖類繰り返し単位のモルが１〜１００、例えば、２〜８０、２〜５０、３〜３０、および４〜２５などである酸化度を有する。活性化度は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、≧２０、≧３０、≧４０、≧５０、≧６０、≧７０、≧８０、または≧９０、または約１００である。好ましくは、酸化度（ＤＯ）は、５以上５０以下、より好ましくは１０以上２５以下である。一態様において、活性化度は、１０以上２５以下である。任意の最小数と任意の最大数とを組み合わせて範囲を定義してもよい。酸化度の値は、活性化率（％）として表される場合がある。例えば、一態様において、１０のＤＯ値は、活性化型糖類における合計１０個の糖類繰り返し単位のうち、１個は活性化型糖類の繰り返し単位であることを意味し、この場合、１０のＤＯ値は、１０％活性化と表されうる。

いくつかの態様において、還元的アミノ化化学によって調製されるコンジュゲートは、担体タンパク質および糖類を含み、この糖類は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３−１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む。いくつかの態様において、コンジュゲートにおける糖類は、ｎが１〜１０００、５〜１０００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５の整数である式を含む。

単一末端結合コンジュゲート。いくつかの態様において、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲート糖類であり、この糖類は、糖類の１つの末端において担体タンパク質に共有結合している。いくつかの態様において、単一末端結合コンジュゲート糖類は、末端糖類を有する。例えば、多糖の末端の１つ（末端糖類残基）が担体タンパク質に共有結合している場合、コンジュゲートは、単一末端結合している。いくつかの態様において、多糖の末端糖類残基がリンカーを介して担体タンパク質に共有結合している場合、コンジュゲートは、単一末端結合している。このようなリンカーは、例えば、シスタミンリンカー（Ａ１）、３，３’−ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカー（Ａ４）、および２，２’−ジチオ−Ｎ，Ｎ’−ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２−（アミノオキシ）アセトアミド）リンカー（Ａ６）を含みうる。

いくつかの態様において、糖類は、３−デオキシ−ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされ、単一末端結合コンジュゲートを形成する。例えば、実施例２６、実施例２７、実施例２８、および図１７を参照されたい。

いくつかの態様において、コンジュゲートは、好ましくは、バイオコンジュゲートではない。「バイオコンジュゲート」という用語は、宿主細胞の機構が抗原をタンパク質に結合させる（例えば、Ｎ結合）、宿主細胞のバックグラウンドで調製されるタンパク質（例えば、担体タンパク質）と抗原、例えばＯ抗原（例えば、Ｏ２５Ｂ）とのコンジュゲートを意味する。グリココンジュゲートは、バイオコンジュゲートだけでなく、宿主細胞におけるコンジュゲートの調製を必要としない手法、例えば、タンパク質と糖類の化学結合によるコンジュゲーションによって調製される糖抗原（例えば、オリゴ糖および多糖）とタンパク質のコンジュゲートも含む。

チオール活性化型糖類。いくつかの態様において、本発明の糖類は、チオール活性化型である。糖類がチオール活性化型であるこのような態様において、活性化率（％）とは、活性化型多糖の糖類繰り返し単位当たりのチオールのモルを意味する。糖類およびチオールの濃度は、通常、スルフヒドリルの定量化のためのＥｌｌｍａｎアッセイによって決定される。例えば、いくつかの態様において、糖類は、ジスルフィドアミンリンカーによる２−ケト−３−デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）の活性化を含む。例えば、実施例１０および図３１を参照されたい。いくつかの態様において、糖類は、二価のヘテロ二機能性リンカー（本明細書では「スペーサー」とも呼ばれる）を介して担体タンパク質に共有結合している。リンカーは、好ましくは、糖類と担体タンパク質との間にチオエーテル結合をもたらし、本明細書で「チオエーテルグリココンジュゲート」と呼ばれるグリココンジュゲートをもたらす。いくつかの態様において、リンカーはさらに、例えば（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）のように、カルバメート結合およびアミド結合をもたらす。例えば、実施例２１を参照されたい。

いくつかの態様において、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質および糖類を含み、この糖類は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３−１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む。いくつかの態様において、コンジュゲートにおける糖類は、ｎが１〜１０００、５〜１０００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５の整数である式を含む。

例えば、一態様において、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質と、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは、１〜１０の整数である）から選択される構造を有する糖類とを含む。

Ｆ．ｅＴＥＣコンジュゲート
１つの側面において、本発明は、広く、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサー（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９５１７２７４号および国際特許出願公開第２０１４０２７３０２号に記載されている）を介して担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされている上述のＥ．ｃｏｌｉに由来する糖類を含むグリココンジュゲート（かかるグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物を含む）、ならびにかかるグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物の調製および使用の方法に関する。前記グリココンジュゲートは、１つまたは複数のｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされた糖類を含み、この糖類は、カルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合的にコンジュゲートされており、担体タンパク質は、アミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合的にコンジュゲートされている。ｅＴＥＣスペーサーは、７つの直鎖状原子（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）−）を含み、安定なチオエーテル結合およびアミド結合を糖類と担体タンパク質との間にもたらす。

本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、一般式（Ｉ）：

（式中、ｅＴＥＣスペーサーを構成する原子は、中央の四角に含まれている）によって表されうる。
本発明の前記グリココンジュゲートにおいて、糖類は、多糖であってもオリゴ糖であってもよい。

本発明のグリココンジュゲートに組み込まれる担体タンパク質は、本明細書にさらに記載される、または当業者に公知の、かかる目的に広く好適な担体タンパク質の群から選択される。特定の態様において、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

別の側面では、本発明は、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に記載の糖類を含むグリココンジュゲートを作製する方法であって、ａ）糖類を有機溶媒中で炭酸誘導体と反応させて、活性化型糖類を生成するステップと、ｂ）活性化型糖類をシスタミンもしくはシステアミンまたはそれらの塩と反応させて、チオール化糖類を生成するステップと、ｃ）チオール化糖類を還元剤と反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化型チオール化糖類を生成するステップと、ｄ）活性化型チオール化糖類を、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化型担体タンパク質と反応させて、チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化型担体タンパク質のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬、および／または（ｉｉ）活性化型チオール化糖類のコンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させることにより、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを生成するステップとを含む方法を提供する。

多くの態様において、炭酸誘導体は、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）である。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであり、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン溶媒である。好ましい態様において、チオール化糖類は、二官能性対称チオアルキルアミン試薬、シスタミンまたはその塩との活性化型糖類の反応によって生成される。あるいは、チオール化糖類は、システアミンまたはその塩との活性化型糖類の反応によって形成されうる。本発明の方法によって生成されるｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、一般式（Ｉ）によって表されうる。

多くの態様において、第１のキャッピング試薬は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインであり、これは、担体タンパク質のリジン残基のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基と反応して、チオエーテル結合を介して活性化リジン残基に共有結合しているＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）残基を形成する。

他の態様では、第２のキャッピング試薬は、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）であり、これは、活性化型チオール化糖類のコンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル基と反応して、キャッピングされたチオアセトアミドをもたらす。多くの場合、ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬と第２のキャッピング試薬の両方によるキャッピングを含む。ある特定の態様において、ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、および第２のキャッピング試薬としてのＩＡＡによるキャッピングを含む。

いくつかの態様において、キャッピングステップｅ）は、第１および／または第２のキャッピング試薬との反応の後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプトエタノールとの反応をさらに含む。

本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、遊離スルフヒドリル残基を含みうる。いくつかの事例において、本明細書において提供される方法によって形成された活性化型チオール化糖類は、複数の遊離スルフヒドリル残基を含み、そのいくつかは、コンジュゲーションステップ中に担体タンパク質への共有結合性コンジュゲーションを受けない場合がある。このような残留遊離スルフヒドリル残基は、反応する可能性がある官能基をキャッピングするために、チオール反応性キャッピング試薬、例えば、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）との反応によってキャッピングされる。他のチオール反応性キャッピング試薬、例えば、マレイミド含有試薬なども想定される。

さらに、本発明のｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、コンジュゲートされていない残留担体タンパク質を含む場合があり、この残留担体タンパク質は、キャッピングプロセスステップ中に修飾を受けた活性化型担体タンパク質を含みうる。

いくつかの態様において、ステップｄ）は、活性化型チオール化糖類を活性化型担体タンパク質と反応させる前に、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化型担体タンパク質を用意するステップをさらに含む。多くの態様において、活性化型担体タンパク質は、１つまたは複数のα−ブロモアセトアミド基を含む。

別の側面では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれかに従って生成されたｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている本明細書に記載の糖類を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを提供する。

いくつかの態様において、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７であり、ＣＲＭ_１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを介した共有結合は、多糖の４、１０、１５、または２５個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも１回生じる。

本発明の側面のそれぞれについて、本明細書に記載の方法および組成物の特定の態様では、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、本明細書に記載の糖類、例えばＥ．ｃｏｌｉに由来する糖類を含む。

別の側面では、本発明は、対象の細菌感染、疾患、または状態を予防する、治療する、または改善する方法であって、本発明の免疫原性組成物を免疫学的有効量で対象に投与するステップを含み、前記免疫原性組成物が、本明細書に記載の糖類を含むｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを含む方法を提供する。いくつかの態様において、糖類は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する。

いくつかの態様において、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートは、担体タンパク質および糖類を含み、前記糖類は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３−１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む。いくつかの態様において、コンジュゲートにおける糖類は、ｎが１〜１０００、５〜１０００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５の整数である式を含む。

糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質中のリジン残基の数は、コンジュゲートされるリジンの範囲として特徴付けることができる。例えば、免疫原性組成物のいくつかの態様では、ＣＲＭ_１９７は、３９個のリジン残基中、糖類に共有結合したものを４〜１６個含みうる。このパラメータを表す別の方法は、ＣＲＭ_１９７のリジンの約１０％〜約４１％が糖類に共有結合しているということである。他の態様では、ＣＲＭ_１９７は、３９個のリジン残基中、糖類に共有結合したものを２〜２０個含みうる。このパラメータを表す別の方法は、ＣＲＭ_１９７のリジンの約５％〜約５０％が糖類に共有結合しているということである。

多くの態様において、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７であり、ＣＲＭ_１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを介した共有結合は、多糖の４、１０、１５、または２５個の糖類繰り返し単位毎に少なくとも１回生じる。

他の態様では、コンジュゲートは、５〜１０個の糖類繰り返し単位毎、２〜７個の糖類繰り返し単位毎、３〜８個の糖類繰り返し単位毎、４〜９個の糖類繰り返し単位毎、６〜１１個の糖類繰り返し単位毎、７〜１２個の糖類繰り返し単位毎、８〜１３個の糖類繰り返し単位毎、９〜１４個の糖類繰り返し単位毎、１０〜１５個の糖類繰り返し単位毎、２〜６個の糖類繰り返し単位毎、３〜７個の糖類繰り返し単位毎、４〜８個の糖類繰り返し単位毎、６〜１０個の糖類繰り返し単位毎、７〜１１個の糖類繰り返し単位毎、８〜１２個の糖類繰り返し単位毎、９〜１３個の糖類繰り返し単位毎、１０〜１４個の糖類繰り返し単位毎、１０〜２０個の糖類繰り返し単位毎、または４〜２５個の糖類繰り返し単位毎に、担体タンパク質と糖類の間に少なくとも１つの共有結合を含む。

別の態様では、担体タンパク質と糖類との間の少なくとも１つの結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の糖類繰り返し単位毎に生じる。

Ｇ．担体タンパク質
本発明のグリココンジュゲートのある成分は、糖類がコンジュゲートされる担体タンパク質である。「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」という用語は、本明細書では同義に使用されうる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション工程に対して改変可能であるべきである。

コンジュゲートの成分の１つは、Ｏ多糖がコンジュゲートされる担体タンパク質である。一態様において、コンジュゲートは、Ｏ多糖のコアオリゴ糖にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む（図２４を参照されたい）。一態様において、コンジュゲートは、Ｏ多糖のＯ抗原にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む。

「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」という用語は、本明細書では同義に使用されうる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション工程に対して改変可能であるべきである。

好ましい態様では、コンジュゲートの担体タンパク質は、独立して、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（例えばＣＲＭ_１９７）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７に記載されるもの）、無毒化されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、Ｃ．Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡまたはＢ、およびＰｓａＡのいずれか１つから選択される。ある態様において、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の態様では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の態様では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ（例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい））である。いくつかの態様において、担体タンパク質は、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）を含む。

好ましい態様では、糖類は、ＣＲＭ_１９７タンパク質にコンジュゲートされている。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の無毒型であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に区別できない。ＣＲＭ_１９７は、毒素産生性コリネファージベータのニトロソグアニジン変異誘発によって作り出される非毒素産生性ファージβ１９７ｔｏｘ⁻に感染したＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅによって産生される。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子における一塩基変化（グアニンからアデニン）によってジフテリア毒素と異なる。この一塩基変化は、成熟タンパク質におけるアミノ酸置換（グリシンからグルタミン酸）を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒な特性を消失させる。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、糖類のための安全かつ効果的なＴ細胞依存性担体である。

したがって、いくつかの態様において、本発明のコンジュゲートは、担体タンパク質としてＣＲＭ_１９７を含み、糖類がＣＲＭ_１９７に共有結合している。
好ましい態様では、グリココンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の無毒だが抗原的に同一のバリアント）、他のＤＴ変異体（例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８；３８３８〜３８４４頁、１９７３）、ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、またはＣＲＭ１０７；ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ、ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴｏｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、ＭａｅｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ、１９９２に記載されている他の変異；Ｇｌｕ−１４８の欠失またはＡｓｐ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒへの変異、および／またはＡｌａ１５８の欠失またはＧＩｙへの変異、ならびにＵＳ４７０９０１７またはＵＳ４９５０７４０に開示されている他の変異；少なくとも１つまたは複数の残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の変異、ならびにＵＳ５９１７０１７またはＵＳ６４５５６７３に開示されている他の変異；またはＵＳ５８４３７１１に開示されている断片）、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔｌｍｍｕｎ６３；２７０６〜１３頁）［何らかの様式で無毒化されたｐｌｙ、例えばｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（ＷＯ０４０８１５１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）またはｄＰＬＹ−ホルモルを含む］、ＰｈｔＸ、例えばＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤまたはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５またはＷＯ００／３９２９９に開示されている）およびＰｈｔタンパク質の融合物、例えばＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物、ＰｈｔＡ−Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／５４００７、ＷＯ２００９／０００８２６）、ＯＭＰＣ（通常はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂから抽出される髄膜炎菌性外膜タンパク質（ＥＰ０３７２５０１））、ＰｏｒＢ（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来）、ＰＤ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ（例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい））、またはそれらの免疫学的機能的同等物、合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１、ＥＰ０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ０４７１１７７）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン（ＷＯ９１／０１１４６）、様々な病原体由来抗原の複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ３１；３８１６〜３８２４頁）、例えばＮ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔｌｍｍｕｎ７２；４８８４〜７頁）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取り込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（特にその無毒の変異体（例えばグルタミン酸５５３に置換を有する外毒素Ａ（ＵｃｈｉｄａＣａｍｅｒｏｎＤＭ、ＲＪＣｏｌｌｉｅｒ．１９８７．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４９６７〜４９７１頁））からなる群から選択される。卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）といった他のタンパク質も、担体タンパク質として使用されうる。他の好適な担体タンパク質は、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願第２００４／０８３２５１号に記載されている）、Ｅ．ｃｏｌｉＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉＳＴ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａなどの不活性化細菌毒素を含む。

いくつかの態様において、担体タンパク質は、例えば、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無毒化された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、フラジェリン、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの無毒化された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＡｃｒＡ、ならびにＣ．ｊｅｊｕｎｉの天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される。一態様において、担体タンパク質は、無毒化されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＥＰＡ）である。別の態様では、担体タンパク質は、無毒化されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＥＰＡ）ではない。一態様において、担体タンパク質は、フラジェリンである。別の態様では、担体タンパク質は、フラジェリンではない。

好ましい態様では、グリココンジュゲートの担体タンパク質は、独立して、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（例えばＣＲＭ_１９７）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７に記載されるもの）、無毒化されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、Ｃ．Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡまたはＢ、およびＰｓａＡからなる群から選択される。ある態様において、本発明のグリココンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の態様では、本発明のグリココンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の態様では、本発明のグリココンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ（例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい））である。

好ましい態様では、本発明の莢膜糖類は、ＣＲＭ_１９７タンパク質にコンジュゲートされている。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の無毒型であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に区別できない。ＣＲＭ_１９７は、毒素産生性コリネファージベータのニトロソグアニジン変異誘発によって作り出される非毒素産生性ファージβ１９７ｔｏｘ−に感染したＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅによって産生される（Ｕｃｈｉｄａ、Ｔ．ら、１９７１、ＮａｔｕｒｅＮｅｗＢｉｏｌｏｇｙ２３３：８〜１１頁）。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子における一塩基変化（グアニンからアデニン）によってジフテリア毒素と異なる。この一塩基変化は、成熟タンパク質におけるアミノ酸置換（グリシンからグルタミン酸）を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒な特性を消失させる。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、糖類のための安全かつ効果的なＴ細胞依存性担体である。ＣＲＭ_１９７およびその生成に関するさらなる詳細は、例えばＵＳ５，６１４，３８２で確認することができる。

したがって、多くの態様において、本発明のグリココンジュゲートは、担体タンパク質としてＣＲＭ_１９７を含み、莢膜多糖がＣＲＭ_１９７に共有結合している。
Ｈ．組成物の投与量
投与レジメンは、最適な所望の応答をもたらすように調整されうる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の単回用量を投与してもよいし、いくつかの分割用量を徐々に投与してもよいし、または状況の緊急性が示すのに比例して用量を低減もしくは増大させてもよい。投与量の値は、軽減しようとする状態のタイプおよび重症度に応じて変わる場合があり、単回または複数回の用量を含みうることに留意されたい。さらに、特定の投与レジメンは、任意の特定の対象に合わせて、個々の必要性および組成物の投与を施行または監督する専門家の判断に従って徐々に調整されるべきであること、また、本明細書で示される投与量の範囲は例示に過ぎず、特許請求される組成物の範囲または実践を制限する意図はないことを理解されたい。治療用タンパク質の適切な投与量および投与レジメンの決定は、関連する技術分野において周知であり、これが本発明に包含されることは、本明細書に開示される教示内容を提供された当業者には理解されるであろう。

いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の組成物中の量は、各タンパク質抗原約１０μｇ〜約３００μｇの範囲でありうる。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片の組成物中の量は、各タンパク質抗原約２０μｇ〜約２００μｇの範囲でありうる。

各用量におけるグリココンジュゲートの量は、典型的なワクチンにおいて著しい有害な副作用を伴わずに免疫防御反応を誘発する量として選択される。このような量は、どの特定の免疫原が用いられるか、そしてこれがどのように提示されるかに応じて異なる。

免疫原性組成物中の特定のグリココンジュゲートの量は、そのコンジュゲートについての全多糖（コンジュゲートされたものとコンジュゲートされていないもの）に基づいて計算されうる。例えば、２０％の遊離多糖を含むグリココンジュゲートは、多糖１００ｇの用量に、コンジュゲートされた多糖約８０ｇ、およびコンジュゲートされていない多糖約２０ｇを有する。グリココンジュゲートの量は、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型に応じて異なりうる。糖類の濃度は、ウロン酸アッセイによって決定されうる。

免疫原性組成物中の異なる多糖成分の「免疫原性量」は異なってよく、それぞれが約１．０ｇ、約２．０ｇ、約３．０ｇ、約４．０ｇ、約５．０ｇ、約６．０ｇ、約７．０ｇ、約８．０ｇ、約９．０ｇ、約１０．０ｇ、約１５．０ｇ、約２０．０ｇ、約３０．０ｇ、約４０．０ｐｇ、約５０．０ｐｇ、約６０．０ｐｇ、約７０．０ｐｇ、約８０．０ｐｇ、約９０．０ｐｇ、または約１００．０ｇの任意の特定の多糖抗原を含みうる。概して、各用量は、所与の血清型の多糖を０．１ｇ〜１００ｇ、特に０．５ｇ〜２０ｇ、より特定すると１ｇ〜１０ｇ、さらにより特定すると２ｇ〜５ｇ含む。上記のあらゆる範囲内のあらゆる整数が、本開示の一態様として想定される。一態様において、各用量は、所与の血清型の多糖を１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇ、または２０ｇ含む。

担体タンパク質の量。概して、各用量は、５ｇ〜１５０ｇの担体タンパク質、特に１０ｇ〜１００ｇの担体タンパク質、より特定すると１５ｇ〜１００ｇの担体タンパク質、より特定すると２５〜７５ｇの担体タンパク質、より特定すると３０ｇ〜７０ｇの担体タンパク質、より特定すると３０〜６０ｇの担体タンパク質、より特定すると３０ｇ〜５０ｇの担体タンパク質、さらにより特定すると４０〜６０ｇの担体タンパク質を含む。一態様において、前記担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一態様において、各用量は、約２５ｇ、約２６ｇ、約２７ｇ、約２８ｇ、約２９ｇ、約３０ｇ、約３１ｇ、約３２ｇ、約３３ｇ、約３４ｇ、約３５ｇ、約３６ｇ、約３７ｇ、約３８ｇ、約３９ｇ、約４０ｇ、約４１ｇ、約４２ｇ、約４３ｇ、約４４ｇ、約４５ｇ、約４６ｇ、約４７ｇ、約４８ｇ、約４９ｇ、約５０ｇ、約５１ｇ、約５２ｇ、約５３ｇ、約５４ｇ、約５５ｇ、約５６ｇ、約５７ｇ、約５８ｇ、約５９ｇ、約６０ｇ、約６１ｇ、約６２ｇ、約６３ｇ、約６４ｇ、約６５ｇ、約６６ｇ、約６７ｇ、６８ｇ、約６９ｇ、約７０ｇ、約７１ｇ、約７２ｇ、約７３ｇ、約７４ｇ、または約７５ｇの担体タンパク質を含む。一態様において、前記担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

Ｉ．アジュバント
いくつかの態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、少なくとも１つ、２つ、または３つのアジュバントをさらに含みうる。「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強させる化合物または混合物を意味する。抗原は、主に送達系として機能するか、主に免疫調節因子として機能するか、または両方の強い特長を有する場合がある。好適なアジュバントは、ヒトを含む哺乳動物において使用するのに好適なものを含む。

ヒトにおいて使用されうる公知の好適な送達系タイプのアジュバントの例は、ミョウバン（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、または水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、水中油エマルジョン、例えばＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５））、油中水エマルジョン、例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコリド）（ＰＬＧ）微粒子またはナノ粒子を含むが、これらに限定されない。

ある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、または水酸化アルミニウム）をアジュバントとして含む。好ましい態様では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムをアジュバントとして含む。ある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬまたは０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬの元素アルミニウムをリン酸アルミニウムの形態で含む。ある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、約０．２５ｍｇ／ｍＬの元素アルミニウムをリン酸アルミニウムの形態で含む。ヒトにおいて使用されうる公知の好適な免疫調節タイプのアジュバントの例は、沈香の樹皮からのサポニン抽出物（ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ）、ＴＬＲ４アゴニスト、例えばＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）またはＧＬＡ−ＡＱ、ＬＴ／ＣＴ変異体、サイトカイン、例えば様々なインターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）またはＧＭ−ＣＳＦ、ＡＳ０１などを含むが、これらに限定されない。

ヒトにおいて使用されうる、送達機能と免疫調節機能の両方を有する公知の好適な免疫調節タイプのアジュバントの例は、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ｊ．ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌ．６４：７１３頁、ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ００／４８６３０、ＷＯ９８／３６７７２、ＷＯ００／４１７２０、ＷＯ２００６／１３４４２３、およびＷＯ２００７／０２６１９０を参照されたい）、またはＴＬＲ４アゴニストと水中油エマルジョンとの組み合わせであるＧＬＡ−ＥＭを含むが、これらに限定されない。

動物実験を含むがこれに限定されない獣医学的用途では、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、ならびに、細菌から抽出される３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョンに含むＲＩＢＩを使用することができる。

本明細書に開示される免疫原性組成物の有効性を増強させるアジュバントのさらなる例は、（１）水中油エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤の有無を問わない）、例えば（ａ）サブミクロンエマルジョンに微小流動化された、あるいはより大きな粒径のエマルジョンを生成するようにボルテックスされた、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ、ならびに（ｂ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１つまたは複数の細菌細胞壁成分、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳを含むもの（ＤＥＴＯＸ（商標））、（２）サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）、ＡＢＩＳＣＯ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈＳｅｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（これを使用してもよいし、これから粒子を生成してもよい）、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）（このＩＳＣＯＭＳは、追加の界面活性剤を欠いていてもよい）（例えば、ＷＯ００／０７６２１）、（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、（４）サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（例えば、ＷＯ９９／４４６３６））、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など、（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ２２２０２１１、ＥＰ０６８９４５４を参照されたい）（例えば、ＷＯ００／５６３５８を参照されたい）、（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンの組み合わせ（例えば、ＥＰ０８３５３１８、ＥＰ０７３５８９８、ＥＰ０７６１２３１を参照されたい）、（７）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９を参照されたい）、（８）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１２０７）、またはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１１５２）、（９）サポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（例えば、ＷＯ００／６２８００）、（１０）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、ＷＯ００／２３１０５を参照されたい）、（１１）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）、（１２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（任意選択でステロールを含む）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９）、（１３）組成物の効力を増強させる免疫刺激剤として機能する他の物質を含むが、これらに限定されない。ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などを含む。

本発明のある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドをアジュバントとして含む。本明細書で使用されるＣｐＧオリゴヌクレオチドとは、免疫刺激性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧＯＤＮ）を意味し、したがって、これらの用語は、特記なき限り同義に使用される。免疫刺激性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、非メチル化シトシン−グアニンのジヌクレオチドである免疫刺激性ＣｐＧモチーフを１つまたは複数、任意選択で特定の好ましい塩基との関連で含む。ＣｐＧ免疫刺激性モチーフのメチル化状態は、概して、ジヌクレオチド内のシトシン残基に関するものである。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、３’グアニンへのリン酸結合によって連結された５’非メチル化シトシンを含み、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）への結合を介して免疫系を活性化させるオリゴヌクレオチドである。別の態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含んでもよく、これは、ＴＬＲ９を介して免疫系を活性化させるが、ＣｐＧモチーフがメチル化されていないかのように、あまり強力には活性化させない。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の回文構造を含んでもよく、この回文構造が、ＣｐＧジヌクレオチドを含んでもよい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９４，３８８号、米国特許第６，２０７，６４６号、米国特許第６，２１４，８０６号、米国特許第６，２１８，３７１号、米国特許第６，２３９，１１６号、および米国特許第６，３３９，０６８号を含め、いくつかの交付済み特許、公開特許出願、および他の公開文献に記載されている。

本発明のある態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁２２行から１２頁３６行に記載されているＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。

異なるクラスのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが同定されている。これらはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＰクラスと呼ばれ、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁２２行から１２頁３６行にさらに詳細に記載されている。本発明の方法は、こうした異なるクラスのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用を含む。

ＶＩＩ．ナノ粒子
別の側面では、１）ナノ構造、および２）少なくとも１つの線毛ポリペプチド抗原またはその断片を含む免疫原性複合体が本明細書に開示される。好ましくは、線毛ポリペプチドまたはその断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ線毛Ｈ（ｆｉｍＨ）に由来する。好ましい態様では、線毛ポリペプチドは、上述の線毛ポリペプチドのいずれか１つから選択される。例えば、線毛ポリペプチドは、配列番号１〜１０、１８、２０、２１、２３、２４、および２６〜２９から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含みうる。

いくつかの態様において、抗原は、提示されるエピトープに対する適応免疫応答の発生を刺激するように、ナノ構造外部に融合またはコンジュゲートされる。いくつかの態様において、免疫原性複合体は、発生する免疫応答のタイプを各病原体に合わせるのに役立つ、外部に結合した、かつ／またはケージ内部に封入されたアジュバントまたは他の免疫調節性化合物をさらに含む。

いくつかの態様において、ナノ構造は、同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを複数含む単一のアセンブリを含む。
代替的な態様では、ナノ構造は、同一の第１のナノ構造関連ポリペプチド複数、および第２のアセンブリ複数を含む複数性アセンブリを含み、第２のアセンブリはそれぞれ、同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを複数含む。

様々なナノ構造プラットフォームが、本明細書に記載の免疫原性組成物を生成するのに用いられうる。いくつかの態様において、用いられるナノ構造は、単一のサブユニットの複数のコピーによって形成される。いくつかの態様において、用いられるナノ構造は、複数の異なるサブユニットの複数のコピーによって形成される。

ナノ構造は通常、ボールのような形状であり、かつ／または回転対称性（例えば、３回回転軸および５回回転軸）、例えば、本明細書に例示される正二十面体構造を有する。
いくつかの態様において、抗原は、フェリチン（ＦＲ）、Ｅ２ｐ、Ｑβ、およびＩ３−０１に由来する自己集合性ナノ構造のような自己集合性ナノ粒子で提示される。Ｅ２ｐは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼの再設計されたバリアントである。Ｉ３−０１は、自己集合して超安定なナノ粒子になりうる工学操作されたタンパク質である。これらのタンパク質のサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。第１の側面において、本明細書では、配列番号５９〜９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも７５％同一であり、かつ少なくとも１つの同定された界面位置において同一であるアミノ酸配列を含む、ナノ構造関連ポリペプチドが開示される。ナノ構造関連ポリペプチドは、例えば、ナノ構造を調製するために使用されうる。ナノ構造関連ポリペプチドは、対になって自己集合し、正二十面体ナノ構造のようなナノ構造を形成する能力のために設計された。

いくつかの態様において、ナノ構造は、（ａ）複数の第１のアセンブリおよび（ｂ）複数の第２のアセンブリを含み、第１のアセンブリのそれぞれは、同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを複数含み、第１のナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号５９〜９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、第２のアセンブリのそれぞれは、同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを複数含み、第２のナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号５９〜９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、第２のナノ構造関連ポリペプチドは、第１のナノ構造関連ポリペプチドとは異なり、複数の第１のアセンブリは、複数の第２のアセンブリと非共有結合的に相互作用して、ナノ構造を形成する。

ナノ構造は、正二十面体対称性におけるもののような、第１のアセンブリおよび第２のアセンブリの配置を定めてナノ構造にする、対称に繰り返し、非天然、非共有結合性のポリペプチド間界面を含む。

配列番号５９〜９２は、例示的なナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。配列番号５９〜９２の例示的なナノ構造関連ポリペプチドの界面残基の数は、４〜１３残基の範囲である。様々な態様において、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号５９〜９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつ少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個の同定された界面位置（所与のナノ構造関連ポリペプチドの界面残基の数に応じる）において同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様では、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号５９〜９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつ同定された界面位置の少なくとも２０％、２５％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または１００％で同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号５９〜９８からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を有するナノ構造関連ポリペプチドを含む。

非限定的な一態様において、ナノ構造関連ポリペプチドは、目的の「カーゴ」への共有結合を容易にするように修飾されうる。非限定的な一例において、ナノ構造関連ポリペプチドは、例えば、ナノ構造関連ポリペプチドのナノ構造が、向上した免疫応答を発生させるためのワクチンとして送達される多数の抗原を提示する足場となるように、１つまたは複数の目的の抗原への結合を容易にするように所定の位置で様々なシステイン残基を導入することによって修飾されうる。

いくつかの態様において、ナノ構造関連ポリペプチドに存在するが、コンジュゲーションに使用されるよう意図されるものではない天然システイン残基のいくつかまたはすべてを、所定の位置でコンジュゲーションを容易にするように他のアミノ酸に変異させてもよい。別の非限定的な態様では、ナノ構造関連ポリペプチドは、「エンドソーム脱出」を容易にするのに役立つ部分との結合（共有結合性または非共有結合性）によって修飾されうる。標的化送達のように、目的の分子を標的細胞に送達することを含む用途において、重要なステップは、エンドソーム（送達ビヒクルが細胞内に侵入する地点である膜結合オルガネラ）からの脱出でありうる。エンドソームは、内容物を分解するリソソームへと成熟する。したがって、エンドソームがリソソームになる前に、送達ビヒクルがエンドソームからどうにかして「脱出」しなければ、送達ビヒクルは分解され、その機能を果たさない。エンドソームを破壊し、サイトゾルへの脱出を可能にする脂質または有機ポリマーには、様々なものがある。したがって、この態様において、ナノ構造関連ポリペプチドは、例えば、かかる脂質または有機ポリマーの、単量体または結果として得られるアセンブリの表面への化学的コンジュゲーションを可能にする、システイン残基の導入により、修飾されうる。別の非限定的な例では、ナノ構造関連ポリペプチドは、例えば、ナノ構造のインビトロまたはインビボでの可視化を可能にするフルオロフォアまたは他の造影剤の化学的コンジュゲーションを可能にする、システイン残基の導入により、修飾されうる。

ナノ構造関連ポリペプチドの表面アミノ酸残基は、タンパク質サブユニットまたは集合したナノ構造の安定性または可溶性を向上させるために変異させてもよい。当業者には分かるように、ナノ構造関連ポリペプチドが既存のタンパク質ファミリーに対して著しい配列相同性を有する場合、そのファミリーに属する他のタンパク質の複数配列アライメントが、タンパク質の安定性および／または可溶性を増大させうる非保存的位置でのアミノ酸変異の選択の指針とするために使用される場合があり、これは、コンセンサスタンパク質設計と呼ばれるプロセスである（９）。

ナノ構造関連ポリペプチドの表面アミノ酸残基は、タンパク質表面に全体的な正電荷または全体的な負電荷を与えるために、正電荷を帯びたアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）または負電荷を帯びたアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）に変異させてもよい。非限定的な一態様において、ナノ構造関連ポリペプチドの表面アミノ酸残基は、自己集合性ナノ構造の内部表面に高い正味電荷を与えるように変異させてもよい。次いで、このようなナノ構造は、ナノ構造内部表面とカーゴ分子との間の静電相互作用による反対の正味電荷によってカーゴ分子をパッケージングまたは封入するために使用されうる。非限定的な一態様において、ナノ構造関連ポリペプチドの表面アミノ酸残基は、自己集合性ナノ構造の内部表面に正味の正電荷を与えるために、主にアルギニンまたはリジン残基に変異させてもよい。次いで、ナノ構造関連ポリペプチドを含む溶液は、核酸を自己集合性ナノ構造内に封入するために、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、または他の核酸などの核酸カーゴ分子の存在下で混合されうる。このようなナノ構造は、例えば、核酸を保護する、送達する、または濃縮するために使用されうる。

一態様において、ナノ構造は、正二十面体対称性を有する。この態様において、ナノ構造は、６０コピーの第１のナノ構造関連ポリペプチド、および６０コピーの第２のナノ構造関連ポリペプチドを含みうる。このような一態様において、第１のアセンブリのそれぞれにおける同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドの数は、第２のアセンブリのそれぞれにおける同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドの数とは異なる。例えば、一態様において、ナノ構造は、１２個の第１のアセンブリおよび２０個の第２のアセンブリを含む。この態様において、第１のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを５コピー含んでよく、第２のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを３コピー含んでよい。別の態様では、ナノ構造は、１２個の第１のアセンブリおよび３０個の第２のアセンブリを含む。この態様において、第１のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを５コピー含んでよく、第２のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを２コピー含んでよい。さらなる態様において、ナノ構造は、２０個の第１のアセンブリおよび３０個の第２のアセンブリを含む。この態様において、第１のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを３コピー含んでよく、第２のアセンブリのそれぞれは、例えば、同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを２コピー含んでよい。これらの態様はすべて、規則的な正二十面体対称性をもつ合成ナノ物質を形成することができる。

以下の実施例は、本発明がより良好に理解されうるように示される。これらの実施例は、例証のみを目的とし、いかなるかたちであれ本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例は、本発明のいくつかの態様を説明する。

構築物の概要

調査したＦｉｍＨ構築物はすべて、予想された分子量をもつ単量体タンパク質であった。

ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ複合体の予想分子量は５３．１ｋＤａである。
ＦｉｍＣの予想分子量は２４ｋＤａである。

ＦｉｍＨレクチン結合ドメインの哺乳動物における発現
この非限定的な実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片のＨＥＫ細胞株における産生に関する。収量は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片のＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞における発現と比べて比較的高かった。

哺乳動物細胞からのＦｉｍＨバリアントの産生を達成するために、ＳｉｇｎａｌＰ予測アルゴリズムを使用して、タンパク質および断片の分泌について異なる異種シグナル配列を解析した。野生型ＦｉｍＨリーダー配列も解析した。予測では、野生型ＦｉｍＨリーダー配列が哺乳動物細胞でのＦｉｍＨバリアントの分泌のために機能する可能性があることが示されたが、分泌されたバリアントは、全長野生型ＦｉｍＨのＦ２２残基（配列番号１参照）ではなく、全長野生型ＦｉｍＨのＷ２０残基（配列番号１参照）で切断されると予測された。血球凝集素シグナル配列は機能しないと予測された。マウスＩｇＫシグナル配列は、配列番号１のＦ２２、または成熟タンパク質のＦ１残基のＮ末端をもたらすと予測された。

これらの解析に基づいて、ＤＮＡを合成し、ＦｉｍＨレクチン結合ドメインを野生型ＦｉｍＨリーダーとともに発現する構築物を組換え生成した。ＦｉｍＨレクチン結合ドメインをｍＩｇＫシグナル配列とともに発現する構築物も調製した。Ｈｉｓタグなどのアフィニティ精製タグを、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片のＣ末端に導入して、精製を容易にした。

発現プラスミドを、ＨＥＫ宿主細胞、すなわちＥＸＰＩ２９３哺乳動物細胞にトランスフェクトした。
Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片が首尾よく発現された。例えば、ｐＳＢ０１８９２ＦｉｍＨｄｓｃＧ構築物について、Ｆ２２における成熟ＦｉｍＨの起点に融合したｍＩｇＫシグナル配列を使用した好ましいＮ末端プロセシングが、ＭＳによって示された。このプロセシングは、レクチンドメイン構築物ｐＳＢ０１８７８に対して正しいと考えられ、質量スペクトルデータはこれを裏付ける。

好ましいＮ末端プロセシング（すなわち、配列番号１のＦ２２におけるプロセシング）は、天然ＦｉｍＨリーダーペプチドでは示されなかった。
ｐＳＢ０１８７７およびｐＳＢ０１８７８構築物は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）哺乳動物発現ベクターに含まれる。細胞を希釈し、その後、２０ｍｌのトランスフェクションで使用した。各構築物につき１μｇ／ｍｌのＤＮＡを使用し、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅプロトコールを使用して１２５ｍｌフラスコで細胞にトランスフェクトした。７２時間後、細胞生存能は依然として良好であったため、発現を９６時間まで継続させた。７２時間時点でサンプルを取り、それぞれ１０μｌをＳＤＳＰＡＧＥゲルで泳動させ、発現について調べた。

９６時間後、馴化培地を回収し、０．２５ｍｌのＮｉｃｋｅｌＥｘｃｅｌ樹脂を添加し、一晩４℃で回転させながらバッチ結合させた。ＴｒｉｓＣｌｐＨ８．０、ＮａＣｌ、イミダゾールで溶出させた。図４を参照されたい。

ｐＳＢ０１８７８の予想質量は、Ｎ末端Ｆ２２と整合する。１つまたは２つの部位にグリコシル化が存在する（Ｎ−Ｄの各脱アミド化から質量＋１）。
グリコシル化変異体を構築した。例えば、ｐＳＢ０２０８１、ｐＳＢ０２０８２、ｐＳＢ０２０８３、ｐＳＢ０２０８８、およびｐＳＢ０２０８９を参照されたい。グリコシル化変異体は、目的のポリペプチドを発現した。結果については図５を参照されたい。

ＦｉｍＨレクチンドメインロック変異体も構築した。例えば、ｐＳＢ０２１５８を参照されたい。ｐＳＢ０２１５８構築物の発現の結果は、図６Ｂに示される。
０．５ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ）のフルオレセインにコンジュゲートされたアミノフェニル−マンノピラノシド（ＡＰＭＰ）を使用した蛍光偏光アッセイを行った。このアッセイは、室温、３００ＲＰＭで６４時間にわたって行った。結果を図６Ｃに示す。

ＦｉｍＨ／Ｃ複合体、ｐＳＢ０１８７９およびｐＳＢ０１８８０の哺乳動物における発現
ＦｉｍＨ／Ｃ複合体の生成のために、ＥＦ１アルファプロモーター下のＦｉｍＣと、野生型またはｍＩｇＫシグナルペプチドのいずれかを伴うＦｉｍＨとの二重発現構築物を調製した。これらをｐＢｕｄＣＥ４．１哺乳動物発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にクローニングし、Ｃ末端ＨｉｓタグをＦｉｍＣに付加した。ＳｉｇｎａｌＰ解析に基づいて、成熟タンパク質の最初の残基としてＧ３７ＦｉｍＣがもたらされるという肯定的な予測が得られたため、ｍＩｇＫシグナルペプチドを使用した分泌のために、ＦｉｍＣバリアントを設計した。

より詳細には、これらの構築物は、ベクターｐＢｕｄＣＥ４．１内のＥＦ１アルファプロモーター下にＦｉｍＣ断片を、同じベクター内のＣＭＶプロモーター下にＦｉｍＨ断片インサートを有するように設計された。ベクターｐＢｕｄＣＥ４．１は、哺乳動物細胞における発現のためのプロモーターを２つ有する、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの発現ベクターである。ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ部位でｐＢｕｄＣＥ４．１ベクターにサブクローニングすることにより、ＦｉｍＣ断片インサート（ｐＳＢ０１８８１インサート）をサブクローニングした。これらを、２ｘＹＴゼオシン（５０μｇ／ｍｌ）プレートに蒔いた。ゼオシン５０μｇ／ｍｌを含む２ｘＹＴにコロニーを播種し、一晩３７℃で増殖させ、プラスミドを調製した。これらをＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化して、インサートの存在を調べ、すべてのコロニーで、インサートのサイズは約７２２ｂｐであった。

ｐＳＢ０１８８１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＳＢ０１８７９インサートおよびｐＳＢ０１８８０インサートＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。これらの断片をゲル単離し、ｐＳＢ０１８８１ベクターにサブクローニングし、２ｘＹＴゼオシン（ｚｅｏ）（５０μｇ／ｍｌ）プレートに蒔いた。それぞれのコロニーを２ｘＹＴゼオシン（５０μｇ／ｍｌ）に播種し、一晩３７℃で増殖させ、プラスミドを調製し、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化してＦｉｍＣインサートの存在を調べ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化してＦｉｍＨインサートの存在を調べた。すべてのクローンで、両方のクローニング部位に予想されたサイズのインサートが存在した。その後、ｐＳＢ０１８７９−１およびｐＳＢ０１８８０−１クローンを発現に使用した。

ＦｉｍＨ／ＦｉｍＣ複合体はまた、ＥＸＰＩ２９３細胞において発現することが示されている。発現は、プロモーター、例えばＥＦ１α、ＣＡＧ、Ｕｂ、Ｔｕｂ、または他のプロモーターを切り替えることによって最適化されうる。

好ましいＮ末端プロセシング（すなわち、配列番号１のＦ２２におけるプロセシング）は、天然ＦｉｍＨリーダーペプチドでは示されなかった。
シグナルペプチド予測のために使用したＳｉｇｎａｌＰ４．１（ＤＴＵＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）による例示的な結果を、以下に示す。さらなるシグナルペプチドが、成熟ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片の１位にＰｈｅの好ましいＮ末端をもたらすことが予測される。以下は、４つの一般的なシグナル配列の代表的サンプルセットに過ぎない。

以下のシグナルペプチド配列は、成熟ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片の１位にＰｈｅの好ましいＮ末端をもたらすことが予測された。

以下のシグナルペプチド配列は、成熟ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片の１位にＰｈｅの好ましいＮ末端をもたらすことが予測されなかった。

ＦｉｍＨとＦｉｍＧペプチドのドナー鎖相補性融合物の哺乳動物における発現
いくつかのリンカー長を試験した。野生型ＦｉｍＨと、ＦｉｍＨのＦ２２に融合したｍＩｇＫシグナルペプチドの両方で、ＦｉｍＨをＮ末端ＦｉｍＧペプチドに融合させるこれらのリンカーを用いた組換え発現を準備した。

ＦｉｍＨドナー鎖相補性ＦｉｍＧ構築物はまた、ＥＸＰＩ２９３細胞において堅実に発現することが示されている。
好ましいＮ末端プロセシング（すなわち、配列番号１のＦ２２におけるプロセシング）は、天然ＦｉｍＨリーダーペプチドでは示されなかった。

ドナー鎖相補性構築物については、様々なリンカーおよびＦｉｍＧペプチドを含んだｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のベース構築物を生成するようにオリゴヌクレオチドを設計した。ＦｉｍＨの配列番号１の番号付けにより、Ｇ２９４Ｖ２９５Ｔ２９６残基において、特有のＢｓｔＥＩＩ部位を組み込んだ。同じＢｓｔＥＩＩ部位をリンカーに組み込んで、ベース構築物を生成した。

ｐＳＢ０１８８２−０１８９５のベース構築物を構築した。プライマーを使用して、ＡＣＣＵＰＲＩＭＥＰＦＸＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ（ＣＭＶプロモーター中）およびＢａｍＨＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングし、ゲル単離して断片を取り出した。

対照としてのＥＸＰＩ２９３細胞と併せて、ｐＳＢ０１８７７、０１８７８、０１８７９、０１８８０、０１８８５、および０１８９２を用いた別の一過性トランスフェクションを行った。

メーカーのプロトコールに従ったＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＥＸＰＩ２９３細胞における一過性トランスフェクション発現試験において、構築物ｐＳＢ０１８８２からｐＳＢ０１８９５を使用した。１０μｌの馴化培地をロードした７２時間にわたる２０ｍＬのＥＸＰＩ２９３細胞における発現後の結果を示す図３を参照されたい。高レベルの発現が観察された。ｐＳＢ０１８７９およびｐＳＢ０１８８０構築物からの発現後、ＦｉｍＨ／ＦｉｍＣ複合体が存在する。２０ｍｌの馴化培地をＮｉｃｋｅｌＥｘｃｅｌにバッチ結合させ、４０ＣＶで洗浄、イミダゾールで溶出した。

さらなるＦｉｍＨドナー鎖相補性構築物を調製した。例えば、ｐＳＢ０２１９８、ｐＳＢ０２１９９、ｐＳＢ０２２００、ｐＳＢ０２３０４、ｐＳＢ０２３０５、ｐＳＢ０２３０６、ｐＳＢ０２３０７、ｐＳＢ０２３０８の各構築物を参照されたい。ｐＳＢ２１９８ＦｉｍＨｄｓｃＧロック変異型構築物の発現を図７に示す。ｐＳＢ２１９８ＦｉｍＨｄｓｃＧロック変異体は、一過性発現から１２ｍｇ／Ｌをもたらした。

Ｖｉ−ＣＥＬＬＸＲ２．０４（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）によれば、以下の内容が観察された（発現に使用した実際の細胞型はＨＥＫ細胞であった）。

プロセシングされるシグナルペプチドと合わせた断片の分子量

ＦｉｍＨ成熟タンパク質におけるＰｈｅ１（配列番号２の番号付けによる）のＮ末端α−アミノ基は、Ｄ−マンノースの臨界極性認識をもたらす
理論または機構に束縛されるものではないが、ＦｉｍＨ成熟タンパク質のＰｈｅ１（配列番号２の番号付けによる）の直前での正しいシグナルペプチドの切断が、機能的なＦｉｍＨタンパク質を発現するために重要であると示唆されている。Ｎ末端α−アミノ基での変化、例えばＦｉｍＨタンパク質のＰｈｅ１の前でＮ末端にアミノ酸を付加することで、Ｄ−マンノースのＯ２原子、Ｏ５原子、およびＯ６原子との水素結合相互作用を消失させ、Ｄ−マンノースとの立体反発を導入することにより、マンノース結合をブロックすることができる。このことは、配列番号２のＰｈｅ１の前に追加のＧｌｙ残基を付加することがマンノース結合の不検出につながるという、本発明者らの実験的観察によって裏付けられる。

Ｄ−マンノースに結合したＦｉｍＨの結晶構造の解析により、以下の内容が観察された。Ｐｈｅ１のＮ末端α−アミノ基は、配列番号２の番号付けによるＦｉｍＨのＡｓｐ５４および配列番号２の番号付けによるＦｉｍＨのＧｌｎ１３３の側鎖とともに、Ｄ−マンノースの臨界極性認識モチーフをもたらし、これらの極性相互作用の変異および変化は、マンノース結合の不在につながる。

ＦｉｍＨにおけるＰｈｅ１の側鎖はＤ−マンノースと直接相互作用することはなく、むしろＦｉｍＨ内部に埋没しており、Ｐｈｅ１が他の残基、例えば脂肪族疎水性残基（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＶａｌ）によって置換されうることを示唆している
Ｄ−マンノースおよびその類似体と複合したＦｉｍＨの結晶構造（例えばＰＤＢＩＤ：１ＱＵＮ）の解析は、Ｐｈｅ１の側鎖（配列番号２の番号付けによる）がＤ−マンノースと直接相互作用することはなく、むしろその芳香環をＶａｌ５６、Ｔｙｒ９５、Ｇｌｎ１３３およびＰｈｅ１４４の側鎖（配列番号２の番号付けによる）にスタッキングすることによって結合ポケットを安定化することを示す。

Ｐｈｅに代わる代替的なＮ末端残基は、ＦｉｍＨタンパク質を安定化し、マンノース結合を許容し、正しいシグナルペプチド切断を可能にしうる。そのような残基は、当技術分野において公知である好適な方法によって、例えばＦｉｍＨの結晶構造の外観検査、またはＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（商標）［ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ、ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒＬＬＣ、ＮｅｗＹｏｒｋ、２０１７］、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ（商標）［ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏＭｏｄｅｌｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＤａｓｓａｕｌｔＳｙｓｔｅｍｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、２０１７］、ＭＯＥ（商標）［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐＩｎｃ．、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、２０１７］、およびＲｏｓｅｔｔａ（商標）［Ｒｏｓｅｔｔａ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、２０１７］などのコンピュータによるタンパク質設計ソフトウェアを使用した、より定量的な選択によって同定されうる。実例が図９Ａ〜９Ｃに示される。置換アミノ酸は、脂肪族疎水性アミノ酸（例えばＩｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌ）でありうる。図１１は、ＦｉｍＨタンパク質を安定化し、マンノース結合を許容しうる脂肪族疎水性側鎖を有する他のアミノ酸、例えばＩｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌとのＰｈｅ１の変異誘発のコンピュータによるスキャニングを示す。

ＦｉｍＨタンパク質における配列番号２の番号付けによるＡｓｎ７の変異は、マンノース、ｍＡｂ２１、またはｍＡｂ４７５の結合に影響を及ぼすことなく、推定上のＮ−グリコシル化部位を除去し、脱アミド化を防止しうる。

哺乳動物細胞株から分泌されるＥ．ｃｏｌｉＦｉｍＨの過剰発現は、配列番号２の番号付けによる残基Ａｓｎ７におけるＮ結合型グリコシル化をもたらしうる。さらに、残基Ａｓｎ７は溶媒曝露され、Ｇｌｙ残基が続き、脱アミド化を非常に受けやすくなる。

Ｄ−マンノースおよびその類似体と複合したＦｉｍＨの結晶構造（例えばＰＤＢＩＤ：１ＱＵＮ）の解析は、Ａｓｎ７がマンノース結合部位から２０Å超離れており、この部位における変異がマンノース結合に影響を及ぼさないはずであることを示す。したがって、Ａｓｎ７の他のアミノ酸（例えばＳｅｒ、ＡｓｐおよびＧｌｎ）への変異は、推定上のＮ−グリコシル化部位を効果的に除去し、脱アミド化を防止しうる。

Ｅ．ｃｏｌｉ株およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ株
臨床株および誘導体を表１０に記載する。さらなる参照株は、臨床的なＯ２５ａ血清型株のＯ２５Ｋ５Ｈ１、およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＬＴ２を含んだ。

Ｅ．ｃｏｌｉ株において、標的のオープンリーディングフレームを除去するが短い瘢痕（ｓｃａｒ）配列を残す遺伝子ノックアウトを構築した。
加水分解されたＯ抗原鎖およびコア糖は、以降、簡略化のためにＯ多糖（ＯＰＳ）と記載する。

ｗｚｚＢ、ｆｅｐＥ、およびＯ抗原遺伝子クラスターのクローニングのためのオリゴヌクレオチドプライマー

プラスミド
プラスミドベクターおよびサブクローンを表１２に記載する。様々なＥ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｗｚｚＢおよびｆｅｐＥ遺伝子を保有するＰＣＲ断片を、精製されたゲノムＤＮＡから増幅し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＰＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔクローニングキットにおいて提供される高コピー数プラスミドにサブクローニングした（図１２Ａ〜１２Ｂ）。このプラスミドは、ｐＵＣレプリコンに基づく。天然のプロモーターを有するＥ．ｃｏｌｉｗｚｚＢ遺伝子を増幅するためにプライマーＰ３およびＰ４を使用した。これらのプライマーは、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼをコードする近位の遺伝子およびホスホリボシルアデニンヌクレオチドヒドロラーゼをコードする遠位の遺伝子の各領域（ＧｅｎｂａｎｋＭＧ１６５５ＮＣ＿０００９１３．３にアノテートされている）に結合するように設計されている。先述のプライマーを使用し、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｆｅｐＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片およびプロモーターを増幅した。類似したＥ．ｃｏｌｉｆｅｐＥプライマーを、利用可能なＧｅｎｂａｎｋゲノム配列または内部で生成された全ゲノムデータ（ＧＡＲ２４０１およびＯ２５Ｋ５Ｈ１の場合）に基づいて設計した。低コピー数プラスミドｐＢＡＤ３３を使用して、アラビノースプロモーターの制御下でＯ抗原生合成遺伝子を発現させた。まず、５’側のプロモーターおよび３’側の６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）遺伝子と相同のユニバーサルプライマーを使用して増幅された長いＰＣＲ断片のクローニング（Ｇｉｂｓｏｎ法による）を容易にするように、プラスミドを修飾した（表１２）。Ｏ２５ｂ生合成オペロンを含むｐＢＡＤ３３サブクローンを図１２Ａ〜１２Ｂに示す。

Ｏ抗原の精製
発酵ブロスを酢酸で処理して最終濃度１〜２％（最終ｐＨ４．１）とした。酸処理したブロスを２時間１００℃に加熱することにより、ＯＡｇの抽出および脱脂を達成した。酸加水分解の最後にバッチを周囲温度に冷まし、１４％ＮＨ_４ＯＨを添加して最終ｐＨを６．１とした。中和されたブロスを遠心分離し、遠心分離液を収集した。この遠心分離液にＣａＣｌ_２のリン酸ナトリウム溶液を添加し、結果として得られたスラリーを室温で３０分インキュベートした。固体を遠心分離によって除去し、１０ｋＤａ膜を使用して遠心分離液を１２倍に濃縮した後、水に対する透析濾過を２回行った。次いで、カーボンフィルターを使用し、ＯＡｇを含んだ残余分を精製した。カーボンフィルターにかけた濾液を４．０Ｍ硫酸アンモニウムで１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。硫酸アンモニウムの最終濃度は２Ｍであった。カーボンフィルターにかけ、硫酸アンモニウム処理した濾液に、ランニングバッファーとして２Ｍ硫酸アンモニウムを用い、膜を使用した精製をさらに行った。フロースルー中のＯＡｇを収集した。長鎖ＯＡｇについては、ＨＩＣ濾液を濃縮し、次いで、５ｋＤａ膜を使用し、水（２０透析濾過容量）に対してバッファー交換した。短鎖（天然）のＯＡｇ多糖については、ＭＷＣＯをさらに低減させて収量を高めた。

Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原のＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーション
過ヨウ素酸酸化を使用した後、還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）を使用したコンジュゲーションを行うことで、長鎖Ｏ２５ｂ多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの第１のセットを生成した（表１４）。酸化レベルを変化させることにより、３つの活性化レベル（低、中、および高）のコンジュゲートバリアントを生成した。凍結乾燥した活性化型多糖を、凍結乾燥したＣＲＭ_１９７と反応させることにより、コンジュゲートを生成し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として使用して、ＤＭＳＯ培地中で再構成した。コンジュゲーション反応を２３℃で２４時間行い、その後、水素化ホウ素ナトリウムを使用したキャッピングを３時間行った。コンジュゲーションクエンチステップの後、５ｍＭコハク酸塩／０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を使用した１００ＫＭＷＣＯの再生セルロース膜での限外濾過／透析濾過により、コンジュゲートを精製した。コンジュゲートの最終濾過は、０．２２μｍ膜を使用して行った。特に明記しない限り、以下の実施例を通して開示されるコンジュゲートは、コア糖類部分を含む。

１．１．異種ポリメラーゼ鎖長調節因子によりもたらされる長鎖Ｏ抗原の発現
初期のＥ．ｃｏｌｉ株の構築はＯ２５血清型に重点を置いた。目的は、異種ｗｚｚＢ遺伝子またはｆｅｐＥ遺伝子を過剰発現させて、これらがＯ２５ｗｚｚＢノックアウト株において鎖長を増加させるかどうかを確認することであった。まず、血液分離株をＰＣＲによってスクリーニングして、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂサブタイプの株を同定した。次に、アンピシリンに対する感受性について株をスクリーニングした。単一のアンピシリン感受性Ｏ２５ｂ分離株ＧＡＲ２４０１が同定され、これにｗｚｚＢ欠失を導入した。同様に、Ｏ２５ａ株Ｏ２５Ｋ５Ｈ１にｗｚｚＢ欠失を行った。これらの変異の遺伝的相補性のために、ＧＡＲ２４０１およびＯ２５Ｋ５Ｈ１のｗｚｚＢ遺伝子を高コピーのＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩクローニングベクターにサブクローニングし、電気穿孔によって両方の株に導入した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清亜型ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＬＴ２のｗｚｚＢ遺伝子、また、Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５Ｋ５Ｈ１、ＧＡＲ２４０１、Ｏ２５ａＥＴＥＣＮＲ−５、Ｏ１５７：Ｈ７：Ｋ−およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血清亜型ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＬＴ２のｆｅｐＥ遺伝子も、同様にクローニングし、移入した。

細菌をＬＢ培地で一晩増殖させ、ＬＰＳをフェノールで抽出し、ＳＤＳＰＡＧＥ（４〜１２％アクリルアミド）によって分解し、染色した。各ウェルのゲルに、同数の細菌細胞（およそ２ＯＤ_６００単位）から抽出したＬＰＳをロードした。天然Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳの内部標準から、鎖長の広い分布を示す（１つの繰り返し単位だけ異なる）サンプルのサブセットから識別可能なラダーを数えることにより、ＬＰＳのサイズを推定した。図１３Ａの左側には、Ｏ２５ａＯ２５Ｋ５ＨΔｗｚｚＢのプラスミド形質転換体のＬＰＳプロファイルが示され、右側には、Ｏ２５ｂＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体の類似したプロファイルが示されている。図１３Ｂには、Ｏ２５特異的血清でプローブした複製ゲルのイムノブロットが示されている。

この実験の結果は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５ａΔｗｚｚＢ宿主への相同ｗｚｚＢ遺伝子の導入が、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｗｚｚＢと同様に、短鎖Ｏ２５ＬＰＳ（１０〜２０倍）の発現を回復させることを示す。ＧＡＲ２４０１のＯ２５ｂｗｚｚＢ遺伝子の導入は短鎖Ｏ２５ＬＰＳの発現を回復させないため、この株のＷｚｚＢ酵素に欠損があることが示唆される。Ｅ．ｃｏｌｉＷｚｚＢアミノ酸配列の比較は、Ａ２１０ＥおよびＰ２５３Ｓ置換が関与しうることを示唆する。意義深いことに、Ｏ２５ａＯ２５Ｋ５Ｈ１におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｆｅｐＥおよびＥ．ｃｏｌｉｆｅｐＥは、超長鎖（ＶＬ）ＯＡｇＬＰＳを発現する能力をもたらし、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｆｅｐＥは、Ｅ．ｃｏｌｉｆｅｐＥによってもたらされたサイズを超えるＯＡｇをもたらした。

同様の発現パターンがＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体でも観察された。Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５ａまたはＫ１２株のｗｚｚＢは、短鎖ＬＰＳを産生する能力を回復させた。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｆｅｐＥは最も長いＬＰＳを生成し、Ｅ．ｃｏｌｉｆｅｐＥはわずかに短いＬＰＳを生成し、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｗｚｚＢは中間サイズの長さのＬＰＳ（Ｌ）をもたらした。他のＥ．ｃｏｌｉｆｅｐＥ遺伝子の超長鎖ＬＰＳ産生能力を、Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５ａΔｗｚｚＢの形質転換体を用いた別の実験で評価した。ＧＡＲ２４０１、Ｏ２５ａＥＴＥＣ株、およびＯ１５７Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素産生株のｆｅｐＥ遺伝子も、超長鎖ＬＰＳを産生する能力をもたらしたが、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｆｅｐＥによって生成されたＬＰＳほど長くはなかった（図１４）。

血清型Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ株において、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｆｅｐＥが、評価したポリメラーゼ調節因子の最も長いＬＰＳを生成することを確立したので、本発明者らは次に、これが他のＥ．ｃｏｌｉ血清型でも超長鎖ＬＰＳを産生するかどうかの決定を目指した。血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ６、Ｏ１５、およびＯ７５の野生型菌血症分離株をＳａｌｍｏｎｅｌｌａｆｅｐＥプラスミドで形質転換し、ＬＰＳを抽出した。図１５に示される結果は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｆｅｐＥが、血液感染に関連する他の普遍的な血清型で超長鎖ＬＰＳを作る能力をもたらしうることを裏付ける。この結果は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｆｅｐＥのプラスミドに基づく発現が、これらの株で内在性ｗｚｚＢによって通常発揮される鎖長の制御を無効にするようであることも示す。

１．２．共通のＥ．ｃｏｌｉ宿主株におけるＯ抗原のプラスミドに基づく発現。
バイオプロセス開発の観点からすれば、複数の株ではなく共通のＥ．ｃｏｌｉ宿主において異なる血清型のＯ抗原を産生する能力は、個々の抗原の製造を大幅に簡略化するであろう。この目的のために、異なる血清型のＯ抗原遺伝子クラスターをＰＣＲによって増幅し、アラビノース調節プロモーターの制御下で低コピー数プラスミド（ｐＢＡＤ３３）にクローニングした。このプラスミドは、異なる（ｐ１５ａ）レプリコンおよび異なる選択可能マーカー（クロラムフェニコール対カナマイシン）を保有するため、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｆｅｐＥプラスミドと適合する（共存することができる）。第１の実験では、ｐＢＡＤ３３Ｏ２５ｂオペロンプラスミドサブクローンをＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｆｅｐＥプラスミドとともにＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢにコトランスフェクトし、０．２％アラビノースの存在下または非存在下で形質転換体を増幅させた。図１６Ａ〜１６Ｂに示される結果は、超長鎖Ｏ抗原ＬＰＳがアラビノース依存性様式で産生されたことを示した。

他の血清型からクローニングされたＯ抗原遺伝子クラスターも同様に評価した。この結果を図１７に示す。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｆｅｐＥおよびｐＢＡＤ３３−ＯＡｇプラスミドの同時発現は、Ｏ１、Ｏ２（４つのうち２つのクローン）、Ｏ１６、Ｏ２１、およびＯ７５の各血清型に対応する検出可能な長鎖ＬＰＳをもたらした。理由は明らかではないが、ｐＢＡＤ３３−Ｏ６プラスミドは、試験した４つすべての分離株で検出可能なＬＰＳを産生できなかった。発現レベルは様々であったが、この結果は、共通の宿主における長鎖Ｏ抗原の発現が実現可能であることを示す。しかしながら、場合によっては、発現を向上させるために、例えばプラスミドプロモーター配列の修飾による、さらなる最適化が必要でありうる。

ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＬＴ２ｆｅｐＥプラスミドありまたはなしの、異なる血清型Ｏ２５Ｅ．ｃｏｌｉ株のＬＰＳのプロファイルを、図１８に示す。Ｏ抗原の発酵、抽出、および精製について、天然の短鎖Ｏ２５ｂＯＡｇの産生のためのＧＡＲ２８３１と、長鎖Ｏ２５ｂＯＡｇの産生のためのＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥとの２つの株を研究した。図１８のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに示される、対応する短鎖型および長鎖型のＬＰＳは、赤で強調されている。酢酸を用いて発酵した細菌から多糖を直接抽出し、精製した。精製された短鎖および長鎖または超長鎖のＯ２５ｂ多糖のサイズ排除クロマトグラフィプロファイルを、図１９Ａ〜１９Ｂに示す。２ロットの短鎖多糖（ＧＡＲ２８３１由来）の特性が、単一の超長鎖多糖調製物（株ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥ由来）と比較されている。長鎖Ｏ抗原の分子質量は、短鎖Ｏ抗原の分子質量と比べて３．３倍高く、繰り返し単位数は、約６５（超長鎖）対約２０と推定された。表１３を参照されたい。

従来の還元的アミノ化プロセスを使用し、超長鎖Ｏ２５ｂＯ抗原多糖をジフテリアトキソイドＣＲＭ_１９７にコンジュゲートした。中（５．５％）、低（４．４％）、および高（８．３％）の異なる過ヨウ素酸活性化度で、３つの異なるロットのグリココンジュゲートを調製した。結果として得られた調製物およびコンジュゲートされていない多糖には、内毒素の混入がないことが示された（表１４）。

一群４匹のウサギ（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄＷｈｉｔｅ雌）のそれぞれに、図２０Ａに示すスケジュールに従い、１０ｍｃｇのグリココンジュゲートおよび２０ｍｃｇのＱＳ２１アジュバントを接種し、血清をサンプリングした（ＶＡＣ−２０１７−ＰＲＬ−ＥＣ−０７２３）。１０ｍｃｇ用量は、細菌グリココンジュゲートの評価でウサギに慣例的に投与される範囲において低い方であることは特筆に値する（２０〜５０ｍｃｇがより典型的である）。別の研究（ＶＡＣ−２０１７−ＰＲＬ−ＧＢ−０６９８）では、同じ用量（多糖１０ｍｃｇ＋ＱＳ２１アジュバント２０ｍｃｇ）および同一の投与スケジュールを使用して、一群のウサギにコンジュゲートされていない多糖も接種した。

３つのＯ２５ｂグリココンジュゲート調製物に対するウサギの抗体応答をＬＵＭＩＮＥＸアッセイで評価した。このアッセイでは、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖多糖に予め結合した、メチル化したヒト血清アルブミンをカルボキシビーズにコーティングした。血清サンプル中のＯ２５ｂ特異的ＩｇＧ抗体の存在を、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識した抗ＩｇＧ二次抗体で検出した。最も良好に応答したウサギ（各群４匹中１匹）から第０週（免疫前）、第６週（２投与後（ｐｏｓｔ−ｄｏｓｅ２）、ＰＤ２）、第８週（３投与後、ＰＤ３）、および第１２週（４投与後、ＰＤ４）でサンプリングした血清において観察された免疫応答のプロファイルを図２１Ａ〜２１Ｃに示す。１２匹のウサギのいずれからも、有意な免疫前血清ＩｇＧ力価は検出されなかった。対照的に、接種後のウサギの血清では、３群すべてでＯ２５ｂ抗原特異的抗体応答が検出され、低活性化グリココンジュゲート群の応答は、中活性化グリココンジュゲート群または高活性化グリココンジュゲート群よりもわずかに高い傾向にあった。最大の応答は、３投与後の時点までに観察された。低活性化群のウサギ１匹および高活性化群のウサギ１匹は、接種に応答しなかった（ノンレスポンダー）。

ＣＲＭ_１９７担体タンパク質コンジュゲーションが長鎖Ｏ２５ｂＯＡｇ多糖の免疫原性に及ぼす影響を評価するために、コンジュゲートされていない多糖を接種したウサギの血清中の抗体の存在を、低活性化ＣＲＭ_１９７グリココンジュゲートを接種したウサギの血清と比較した（図２２Ａ〜２２Ｆ）。注目すべきことに、遊離多糖には免疫原性がなく、免疫前血清と比べて免疫血清ではＩｇＧ応答を実質的に生じさせなかった（図２２Ａ）。対照的に、一連の血清希釈度（１：１００〜１：６４００）で、Ｏ２５ｂＯＡｇ−ＣＲＭ_１９７を接種したウサギ４匹中３匹のＰＤ４血清中では、免疫前血清レベルのおよそ１０倍高いＯ２５ｂＯＡｇ特異的ＩｇＧの平均蛍光強度値（ＭＦＩ）が観察された。これらの結果は、１０ｍｃｇの用量レベルでＯ２５ｂＯＡｇ多糖に対するＩｇＧ抗体を生成する担体タンパク質コンジュゲーションの必要性を示す。

ＴＳＡプレートで増殖させた細菌を、ＰＢＳに懸濁し、ＯＤ_６００を２．０に調整し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した。４％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロッキングした後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の免疫前血清およびＰＤ３免疫血清の段階希釈物とともに細菌をインキュベートし、結合したＩｇＧをＰＥ標識二次Ｆ（ａｂ）抗体で検出した。

Ｏ２５ｂＯＡｇ−ＣＲＭ_１９７により生じたＯ２５ｂ抗体の特異性が、インタクトな細菌を用いたフローサイトメトリー実験で示された。Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターで、ＰＥコンジュゲートＦ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧにより、全細胞へのＩｇＧの結合が検出された。

図２３Ａ〜２３Ｃに示されるように、免疫前ウサギ抗体は、野生型血清型Ｏ２５ｂ分離株のＧＡＲ２８３１およびＧＡＲ２４０１またはＫ−１２Ｅ．ｃｏｌｉ株に結合できなかったが、対応するＰＤ３抗体は、濃度依存的様式でＯ２５ｂ菌を染色した。ＯＡｇを発現する能力を欠く陰性対照のＫ−１２株は、ＰＤ３抗体の極めて弱い結合しか示さなかった。これは、その表面に露出した内側コアオリゴ糖エピトープが存在することに起因する可能性が極めて高い。野生型Ｏ２５ｂ分離株へのＳａｌｍｏｎｅｌｌａｆｅｐＥプラスミドの導入は、大幅に向上した染色をもたらし、このことは、より長いＯＡｇ多糖によりもたらされる免疫原性エピトープの密度が比較的高いことと整合する。

結論：記載した結果は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｆｅｐＥがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種における超長鎖Ｏ抗原多糖の決定要因であるだけでなく、超長鎖ＯＡｇを作る能力を異なるＯ抗原血清型のＥ．ｃｏｌｉ株に与えることもできることを示す。この特性は、精製および適切な担体タンパク質への化学的コンジュゲーションを容易にし、より分子量の高い複合体の形成によって免疫原性を潜在的に向上させることにより、バイオプロセス開発のための特性が向上したＯ抗原ワクチン多糖を生成するために活用されうる。

初期ウサギ研究は、ＲＡＣＯ２５ｂＯＡｇ−ＣＲＭ_１９７に対する第１のポリクローナル抗体試薬およびＩｇＧ応答を生成した。
過ヨウ素酸酸化を使用した後、還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）を使用したコンジュゲーションを行うことで、長鎖Ｏ２５ｂ多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを生成した（表１４）。表２４も参照されたい。

ウサギ研究１（ＶＡＣ−２０１７−ＰＲＬ−ＥＣ−０７２３）（上記の実施例１３にも記載）では、ウサギ５匹／群に、図２０Ａに示されるスケジュールに従い、低（Ｌ）活性化、中（Ｍ）活性化、または高（Ｈ）活性化ＲＡＣ各１０μｇ（＋ＱＳ２１）を含む組成物を投与した。コンジュゲートされていない遊離Ｏ２５ｂ多糖には免疫原性がないことが、後続のウサギ研究（ＶＡＣ−２０１７−ＰＲＬ−ＧＢ−０６９８）において観察された（図２５を参照されたい）。

ウサギ研究２（ＶＡＣ−２０１８−ＰＲＬ−ＥＣ−０７７）では、ウサギ２匹／群に、図２０Ｂに示されるスケジュールに従い、Ｌ−ＲＡＣ（ＡｌＯＨ_３、ＱＳ２１、またはアジュバントなし）を含む組成物を投与した。

ウサギ４−１、４−２、５−１、５−２、６−１、および６−２には、実施例１３に記載した超長鎖のコンジュゲートされていないＯ２５ｂ多糖を投与し、第１８週の血清を試験した。

より詳細には、ウサギ４−１には、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ５０μｇ、ＡｌＯＨ_３アジュバント１００μｇを含む組成物を投与した。ウサギ４−２には、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ５０μｇ、ＡｌＯＨ_３アジュバント１００μｇを含む組成物を投与した。ウサギ５−１には、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ５０μｇ、ＱＳ−２１アジュバント５０μｇを含む組成物を投与した。ウサギ５−２には、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ５０μｇ、ＱＳ−２１アジュバント５０μｇを含む組成物を投与した。ウサギ６−１には、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ５０μｇを含み、アジュバントを含まない組成物を投与した。ウサギ６−２には、コンジュゲートされていないＯ２５ｂ５０μｇを含み、アジュバントを含まない組成物を投与した。

Ｏ２５ｂＲＡＣコンジュゲートを用いたウサギ研究：ｄＬＩＡ血清希釈力価
ウサギ研究２（ＶＡＣ−２０１８−ＰＲＬ−ＥＣ−０７７）：研究１（ＶＡＣ−２０１７−ＰＲＬ−ＥＣ−０７２３）で最も良好に応答したウサギに対する、Ｏ２５ｂｄＬＩＡ血清希釈力価。これらの実験では、改変された直接結合Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを実施した。このアッセイでは、先述のメチル化した血清アルブミン長鎖Ｏ抗原混合物の代わりに、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原のポリリジンコンジュゲートをＬｕｍｉｎｅｘカルボキシビーズに受動的に吸着させた。ポリリジン−Ｏ２５ｂコンジュゲートの使用は、アッセイの感度およびＩｇＧ濃度依存的応答の質を向上させ、曲線の当てはめ（４つのパラメータを用いる非線形方程式）の使用による血清希釈力価の決定を可能にした。表１５では、第１の研究における最も力価の高いウサギ血清中のＯ２５ｂＩｇＧ力価を、第２の研究のウサギの血清と比較している。

第２のウサギ研究における比較的高い用量（１０μｇに対して５０／２０μｇ）は、ＩｇＧ力価を向上させなかった。
２か月の休止は、ＩｇＧ応答を高める（より短い間隔では観察されない）。

ミョウバンは、ＱＳ２１を用いた場合またはアジュバントなしの場合と比較して、ウサギにおけるＩｇＧ応答を増強させるようである。
仔ウサギ補体（ＢＲＣ）および好中球源としてのＨＬ６０細胞を用いたオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）を確立して、Ｏ抗原グリココンジュゲートの機能的免疫原性を測定した。予め凍結させたＥ．ｃｏｌｉＧＡＲ２８３１菌ストックを、３７℃のＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）培地で増殖させた。細胞をペレット化し、２０％グリセロールを補ったＰＢＳ１ｍｌ当たり１ＯＤ_６００単位の濃度に懸濁し、凍結させた。予め滴定し、解凍した細菌を、１％ゼラチンを含むＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）中で０．５×１０^５ＣＦＵ／ｍｌに希釈し、１０μＬ（１０^３ＣＦＵ）をＵ底組織培養マイクロプレートで段階希釈血清２０μＬと混合し、この混合物を５％ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃で３０分、７００ｒｐｍ（ＢＥＬＬＣＯＳｈａｋｅｒ）で振とうした。２．５％補体１０μｌ（仔ウサギ血清、ＰＥＬ−ＦＲＥＥＺ３１０６１−３、ＨＢＧに予め希釈した）と、ＨＬ−６０細胞２０μＬ（０．７５×１０^７／ｍｌ）と、ＨＢＧ４０μＬとをＵ底組織培養マイクロプレートに加え、この混合物を、５％ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃で４５分、７００ｒｐｍ（ＢＥＬＬＣＯＳｈａｋｅｒ）で振とうした。その後、水１００μＬを適用し、フィルターを真空処理し、１５０μＬの５０％ＬＢを適用することにより準備した、予め湿らせたＭＩＬＬＩＰＯＲＥＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮＨＴＳＨＶフィルタープレートの対応するウェルに、各反応物１００μＬのうち１０μＬを移した。フィルタープレートを真空濾過し、５％ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃で一晩インキュベートした。翌日、固定、ＣＯＯＭＡＳＳＩＥ色素による染色、および脱染液による脱染の後、ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）アナライザーおよびＩＭＭＵＮＯＣＡＰＴＵＲＥソフトウェアを使用し、コロニーを計数した。ＯＰＡ活性の特異性を確立するために、免疫血清を、ＯＰＡ反応において他のアッセイ成分と合わせる前に、精製された長鎖Ｏ２５ｂＯ抗原１００μｇ／ｍＬとともにプレインキュベートした。ＯＰＡアッセイは、観察される殺傷のＨＬ６０細胞または補体への依存性を示すために、これらの成分を含まない対照反応物を含む。

両方のウサギ研究の代表的なウサギから得た対応する免疫前および接種後の血清サンプルをアッセイで評価し、血清希釈力価を決定した（表１６、図２６Ａ〜２６Ｂ）。コンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖とのプレインキュベーションは、殺菌活性をブロックし、ＯＰＡの特異性を示した（図１９Ｃ、表１６、ＯＰＡ力価）。

ウサギ２−３への投与は次のように行った。ウサギ２−３への投与：１０／１０／１０／１０μｇのＲＡＣコンジュゲート＋ＱＳ２１、４投与後（ＰＤ４）に採血。ウサギ１−２への投与は次のように行った。５０／２０／２０／２０μｇのＲＡＣコンジュゲート＋Ａｌ（ＯＨ）３、ＰＤ４採血。

コンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖、および得られたＯ２５ｂＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲートにより生じるＯ抗原Ｏ２５ｂＩｇＧレベル。

第０週、第５週、および第１３週において、一群１０匹のＣＤ−１マウスに、１匹当たり０．２μｇまたは２．０μｇのＯ２５ｂＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原グリココンジュゲートを皮下注射し、免疫原性試験のため、第３週（１投与後、ＰＤ１）、第６週（２投与後、ＰＤ２）、および第１３週（３投与後、ＰＤ３）の各時点で採血した。Ｏ２５ｂ特異的マウスｍＡｂを内部標準として用いる定量的Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（詳細については実施例１５を参照のこと）により、抗原特異的ＩｇＧのレベルを決定した。ベースラインのＩｇＧレベル（点線）は、ランダムに選択された接種をしていないマウス２０匹からプールされた血清で決定した。コンジュゲートされていない遊離Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖免疫原は、いずれの時点でもベースラインレベルを超えるＩｇＧを誘発しなかった。対照的に、Ｏ２５ｂ−ＣＲＭ１９７ＲＡＣ長鎖コンジュゲートグリココンジュゲートでは、２回の投与後にＩｇＧ応答が観察された。堅実で均一なＩｇＧ応答がＰＤ３までに観察され、ＰＤ２では中等度かつより可変性の高いＩｇＧレベルが観察された。ＧＭＴＩｇＧ値（ｎｇ／ｍｌ）は９５％ＣＩエラーバーとともに示されている。図２７Ａ〜２７Ｃを参照されたい。

Ｏ２５ｂ仔ウサギ補体（ＢＲＣ）のＯＰＡ特異性。
Ａ−Ｂ）ウサギ２−３および１−２のＯ２５ｂＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原免疫後の血清は、殺菌性ＯＰＡ活性を示す（しかし、対応する免疫前の対照血清はこれを示さない）。Ｃ）ウサギ１−２の免疫血清のＯＰＡ活性は、長鎖Ｏ抗原Ｏ２５ｂ多糖１００μｇ／ｍＬとのプレインキュベーションによってブロックされた。株ＧＡＲ２８３１の細菌をＨＬ６０、２．５％ＢＲＣ、および血清の段階希釈物とともに１時間３７℃でインキュベートし、フィルタープレート上の微小コロニー（ＣＦＵ）を数えることにより、生存した細菌を計数した。図２６Ａ〜２６Ｃを参照されたい。

ＲＡＣおよびｅＴＥＣＯ２５ｂ長鎖グリココンジュゲートは、単一末端グリココンジュゲートよりも免疫原性が高い。
カルバペネム耐性フルオロキノロン耐性ＭＤＲ株Ａｔｌａｓ１８７９１３を用いたＢＲＣＯＰＡアッセイ。一群２０匹のＣＤ−１マウスに、図２８Ａ〜２８Ｂに示したものと同じスケジュールに従い、２μｇのグリココンジュゲートを接種し、ＯＰＡ応答を２投与後（ＰＤ２）（図２８Ａ）および３投与後（ＰＤ３）（図２８Ｂ）の各時点で決定した。バーは９５％ＣＩのＧＭＴを示す。接種をしていないベースラインを超えるレスポンダー率が示されている。Ｗｅｌｃｈ補正を用いた独立ｔ検定（ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ）を使用し、異なる群のログ変換データを評価して、差が統計的に有意であったかどうかを評価した。結果を表１７にまとめる。図２８Ａ〜２８Ｂを参照されたい。ｅＴＥＣＯ１ａ長鎖グリココンジュゲート２μｇを接種したマウスでは、ＰＤ２およびＰＤ３のＯ１ａに対するＯＰＡ力価（データは示さない）は、それぞれ、表１７に示す、ＰＤ２およびＰＤ３のＯ２５ｂに対するＯＰＡ力価よりも高いことが観察された。

ｅＴＥＣ化学のＯＰＡ免疫原性は、多糖活性化レベルの変化によって向上しうる。
カルバペネム耐性フルオロキノロン耐性ＭＤＲ株Ａｔｌａｓ１８７９１３を用いたＢＲＣＯＰＡアッセイ。一群２０匹のＣＤ−１マウスに、示される長鎖Ｏ２５ｂｅＴＥＣグリココンジュゲート０．２μｇまたは２μｇを接種し、ＰＤ２時点のＯＰＡ応答を決定した。Ｗｅｌｃｈ補正を用いた独立ｔ検定（ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ）を使用し、４％活性化群と１７％活性化群との集約したログ変換データを評価して、ＯＰＡ応答の差が統計的に有意であったことを確認した。個々の群のＧＭＴおよびレスポンダー率を表１８にまとめる。図２９を参照されたい。

負荷試験は、長鎖Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５ｂｅＴＥＣコンジュゲートが３回の投与後に防御を生じることを示す。
示されたスケジュールに従い、２μｇ用量で免疫処置した一群２０匹のＣＤ−１マウスに、株ＧＡＲ２８３１の細菌１×１０^９個を腹腔内（ＩＰ）負荷した。その後の生存率を６日間モニタリングした。４％、１０％または１７％のレベルで活性化されたｅＴＥＣグリココンジュゲートを接種したマウス群は致死的な感染から防御されたが、接種をしていない対照マウスまたはコンジュゲートされていないＯ２５ｂ長鎖多糖２μｇを接種したマウスは防御されなかった。図３０Ａ〜３０Ｂを参照されたい。

ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの調製プロセス
糖類の活性化およびシスタミン二塩酸塩によるチオール化。糖類を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再構成する。溶液の含水量はＫａｒｌＦｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）解析によって決定し、０．１〜１．０％、典型的には０．５％の含水量に達するように調整する。

活性化を開始するには、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖類を様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル当量）で活性化させ、反応を室温または３５℃で１〜５時間続ける。活性化反応液中にＣＤＩ／ＣＤＴが残存していた場合は水を加えてクエンチした。計算を行って加える水の量を決定し、最終的な含水量を水溶液全体の２〜３％にする。反応を室温で０．５時間にわたって続けた。シスタミン二塩酸塩を、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で無水ＤＭＳＯ中において新たに調製する。活性化型糖類を１〜２ｍｏｌ当量のシスタミン二塩酸塩と反応させる。あるいは、活性化型糖類を１〜２ｍｏｌ当量のシステアミン塩酸塩と反応させる。チオール化反応を室温で５〜２０時間続けて、チオール化糖類を生成する。加えたＣＤＴ／ＣＤＩの量により、チオール化レベルを決定する。

活性化型チオール化糖類の還元および精製。チオール化糖類の反応混合物に、３〜６ｍｏｌ当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）溶液を加え、室温で３〜５時間反応させる。次いでこの反応混合物を、予め冷却した１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウムに添加することによって５〜１０倍に希釈し、５μｍフィルターで濾過する。３０〜４０倍の透析濾過容量の予め冷却した１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウムに対して、チオール化糖類の透析濾過を行う。活性化型チオール化糖類残余分のアリコートを取り、糖類濃度およびチオール含量を決定する（Ｅｌｌｍａｎアッセイ）。

ブロモアセチル化担体タンパク質の活性化および精製。担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）、ブロモアセチルブロミド、または別の好適な試薬などのブロモアセチル化剤との反応によってブロモアセチル化する。

担体タンパク質（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を、活性化前に、まず約ｐＨ７で８±３℃に保つ。このタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）として０．２５〜０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質比（ｗ／ｗ）で加える。この反応物を５±３℃で３０〜６０分間穏やかに混合する。結果として得られたブロモアセチル化（活性化）タンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を使用し、１０ｋＤａＭＷＣＯの膜を使用した限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度をＬｏｗｒｙタンパク質アッセイによって推定する。

活性化の程度を、抑制伝導率検出と連動したイオン交換液体クロマトグラフィ（イオンクロマトグラフィ）による全ブロミドアッセイによって決定する。活性化したブロモアセチル化タンパク質に結合したブロミドをアッセイサンプル調製物中のタンパク質から切断し、存在しうるあらゆる遊離ブロミドとともに定量化する。タンパク質に共有結合した残存するブロミドがあれば、サンプルをアルカリ性２−メルカプトエタノール中で加熱することにより、臭化物イオンへの変換によって遊離させる。

ブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７の活性化および精製。ＣＲＭ_１９７をｐＨ７の１０ｍＭリン酸緩衝０．９％ＮａＣｌ（ＰＢＳ）で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、１Ｍストック溶液を使用してｐＨ７．０の０．１ＭＮａＨＣＯ_３を作った。ＤＭＳＯ１ｍＬ当たり２０ｍｇのＢＡＡＮＳストック溶液を使用し、１：０．３５（ｗ：ｗ）のＣＲＭ_１９７：ＢＡＡＮＳ比でＢＡＡＮＳを添加した。この反応混合物を３℃〜１１℃で３０分〜１時間インキュベートしてから、１０ＫＭＷＣＯの膜および１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を使用した限外濾過／透析濾過によって精製した。精製された活性化型ＣＲＭ_１９７をＬｏｗｒｙアッセイによりアッセイして、タンパク質濃度を決定し、次いでＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈した。スクロースを凍結保護物質として５％重量／体積で添加し、活性化型タンパク質を凍結させ、コンジュゲーションに必要になるまで−２５℃で保管した。ＣＲＭ_１９７のリジン残基のブロモアセチル化は一貫性が非常に高く、利用可能な３９個のリジン中１５〜２５個のリジンの活性化をもたらした。この反応は、高い収量の活性化型タンパク質を生成した。

活性化型チオール化糖類のブロモアセチル化担体タンパク質へのコンジュゲーション。ブロモアセチル化担体タンパク質および活性化型チオール化糖類を後に加える。糖類／タンパク質の投入比は０．８±０．２である。反応物のｐＨを１ＭＮａＯＨ溶液で９．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を５℃で２０±４時間続ける。

残存する反応性官能基のキャッピング。担体タンパク質の未反応のブロモアセチル化残基を、キャッピング試薬としての２ｍｏｌ当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと３〜５時間５℃で反応させることによってクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を５℃で２０〜２４時間、４ｍｏｌ当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）でキャッピングする。

ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの精製。コンジュゲーション反応（ＩＡＡキャッピング後）混合物を０．４５μｍフィルターで濾過する。ｐＨ６．０の５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水に対して、グリココンジュゲートの限外濾過／透析濾過を行う。次いで、グリココンジュゲートの残余分を０．２μｍフィルターで濾過する。グリココンジュゲートのアリコートをアッセイのために取る。残りのグリココンジュゲートを５℃で保管する。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。

Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ＢｅＴＥＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス：Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂリポ多糖の活性化。凍結乾燥したＥ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再構成した。凍結乾燥Ｏ２５ｂ／ＤＭＳＯ溶液の含水量をＫａｒｌＦｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）解析によって決定した。０．５％の含水量に達するようにＷＦＩをＯ２５ｂ／ＤＭＳＯ溶液に加えることにより、含水量を調整した。

活性化を開始するために、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を、１００ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ溶液中において新たに調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂ多糖を、チオール化ステップの前に様々な量のＣＤＩで活性化させた。ＣＤＩでの活性化は、室温または３５℃で１〜３時間にわたって行った。活性化反応液中にＣＤＩが残存していた場合は水を加えてクエンチした。計算を行って加える水の量を決定し、最終的な含水量を水溶液全体の２〜３％にする。反応を室温で０．５時間にわたって続けた。

活性化型Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂ多糖のチオール化。シスタミン二塩酸塩を、無水ＤＭＳＯ中において新たに調製し、活性化型多糖反応液に１〜２ｍｏｌ当量のシスタミン二塩酸塩を添加した。反応を室温で２０±４時間にわたって続けた。

活性化型チオール化Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂ多糖の還元および精製。チオール化糖類の反応混合物に、３〜６ｍｏｌ当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）溶液を加え、室温で３〜５時間反応させた。次いでこの反応混合物を、予め冷却した１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウムに添加することによって５〜１０倍に希釈し、５μｍフィルターで濾過した。５ＫＭＷＣＯの限外濾過膜カセットを用い、４０倍の透析濾過容量の予め冷却した１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウムに対して、チオール化糖類の透析濾過を行った。チオール化Ｏ２５ｂ多糖の残余分を、糖類濃度アッセイおよびチオールアッセイ（Ｅｌｌｍａｎ）の両方のために取った。活性化プロセスのフロー図を図３２Ａに提示する。

コンジュゲーションプロセス：チオール化Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂ多糖のブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーション。実施例２１に記載のように、ＣＲＭ_１９７担体タンパク質をブロモアセチル化により別々に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のために活性化型Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂ多糖と反応させた。ブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７およびチオール化Ｏ２５ｂ多糖を反応容器内でひとつに混合した。糖類／タンパク質の投入比は０．８±０．２であった。反応物のｐＨを８．０〜１０．０に調整した。コンジュゲーション反応を５℃で２０±４時間続けた。

ブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７およびチオール化Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂ多糖の反応性基のキャッピング。ＣＲＭ_１９７タンパク質の未反応のブロモアセチル化残基を、２ｍｏｌ当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと３〜５時間５℃で反応させることによってキャッピングし、その後、チオール化Ｏ２５ｂ−多糖に遊離スルフヒドリル基が残存していれば、４ｍｏｌ当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）により５℃で２０〜２４時間キャッピングする。

ｅＴＥＣ結合Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂグリココンジュゲートの精製。コンジュゲーション溶液を０．４５μｍまたは５μｍのフィルターで濾過した。１００ＫＭＷＣＯの限外濾過膜カセットを用い、Ｏ２５ｂグリココンジュゲートの透析濾過を行った。ｐＨ６．０の５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水に対して、透析濾過を行った。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂグリココンジュゲートの１００Ｋの残余分を、０．２２μｍフィルターで濾過し、５℃で保管した。
コンジュゲーションプロセスのフロー図を図３２Ｂに提示する。

結果
いくつかのバッチのＥ．ｃｏｌｉ−Ｏ２５ｂｅＴＥＣグリココンジュゲートの反応パラメータおよび特性評価データを表１９に示す。ＣＤＩでの活性化と、シスタミン二塩酸塩でのチオール化は、４１〜９２％の糖類収率および＜５〜１４％の遊離糖類を有するグリココンジュゲートを生成した。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５も参照されたい。

Ｅ．ｃｏｌｉＯ抗原多糖−ＣＲＭ１９７ｅＴＥＣコンジュゲートの調製手順（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のＯ抗原に適用される）
多糖の活性化。

Ｅ．ｃｏｌｉＯ抗原多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再構成する。活性化を開始するために、様々な量の１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１〜１０モル当量）を多糖溶液に添加し、反応を室温または３５℃で１〜５時間続ける。次いで、活性化反応液中にＣＤＩが残存していた場合は水（２〜３％、ｖ／ｖ）を加えてクエンチした。反応を室温で０．５時間にわたって続けた後、１〜２ｍｏｌ当量のシスタミン二塩酸塩を添加する。反応を室温で５〜２０時間続けてから、３〜６ｍｏｌ当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理して、チオール化糖類を生成する。加えたＣＤＩの量により、チオール化レベルを決定する。

次いでこの反応混合物を、予め冷却した１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウムに添加することによって５〜１０倍に希釈し、５μｍフィルターで濾過する。３０〜４０倍の透析濾過容量の予め冷却した１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウムに対して、チオール化糖類の透析濾過を行う。活性化型チオール化糖類残余分のアリコートを取り、糖類濃度およびチオール含量を決定する（Ｅｌｌｍａｎアッセイ）。

担体タンパク質（ＣＲＭ_１９７）の活性化
ＣＲＭ_１９７（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を、活性化前に、まず約ｐＨ８で８±３℃に保つ。このタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）として０．２５〜０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質比（ｗ／ｗ）で加える。この反応物を５±３℃で３０〜６０分間穏やかに混合する。結果として得られたブロモアセチル化（活性化）タンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を使用し、１０ｋＤａＭＷＣＯの膜を使用した限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度をＬｏｗｒｙタンパク質アッセイによって推定する。

コンジュゲーション
その後、活性化型ＣＲＭ_１９７および活性化型Ｅ．ｃｏｌｉＯ抗原多糖をリアクターに加え、混合する。糖類／タンパク質の投入比は１±０．２である。反応物のｐＨを１ＭＮａＯＨ溶液で９．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を５℃で２０±４時間続ける。担体タンパク質の未反応のブロモアセチル化残基を、キャッピング試薬としての２ｍｏｌ当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと３〜５時間５℃で反応させることによってクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を５℃で２０〜２４時間、４ｍｏｌ当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）でキャッピングする。次いで、ｐＨ６．０の５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水に対して行われる限外濾過／透析濾過を使用して、反応混合物を精製する。次いで、精製されたコンジュゲートを０．２μｍフィルターで濾過する。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。

一般的手順−還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）によるＯ抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ６、２５ｂ由来）多糖のコンジュゲーション
ジメチルスルホキシドにおけるコンジュゲーション（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）
多糖の活性化
１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．２）において、計算された量の５００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）および注射用水（ＷＦＩ）を連続的に添加して多糖の最終濃度を２．０ｇ／Ｌとすることにより、多糖の酸化を行った。必要に応じて、反応物のｐＨをおよそｐＨ６．０に調整した。ｐＨ調整後、反応物の温度を４℃に冷ました。およそ０．０９〜０．１３モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムの添加により酸化を開始した。酸化反応をおよそ５±３℃で２０±４時間行った。

５ＫＭＷＣＯの限外濾過カセットを使用し、活性化型多糖の濃縮および透析濾過を行った。透析濾過は、２０倍の透析濾過容量のＷＦＩに対して行った。次いで、精製された活性化型多糖を５±３℃で保管した。精製された活性化型糖類は、とりわけ、（ｉ）比色アッセイによる糖類濃度、（ｉｉ）比色アッセイによるアルデヒド濃度、（ｉｉｉ）酸化度、および（ｉｖ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性評価される。

活性化型多糖とスクロース賦形剤の複合、および凍結乾燥
活性化型多糖をスクロースと複合して、活性化型多糖１グラム当たりスクロース２５グラムの比にした。次いで、複合した混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥した活性化型多糖を含むボトルを−２０±５℃で保管した。計算された量のＣＲＭ_１９７タンパク質を別々にシェル凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥したＣＲＭ_１９７を−２０±５℃で保管した。

凍結乾燥した活性化型多糖および担体タンパク質の再構成
凍結乾燥した活性化型多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再構成した。多糖が完全に溶解したら、凍結乾燥したＣＲＭ_１９７に等量の無水ＤＭＳＯを添加して再構成した。

コンジュゲーションおよびキャッピング
再構成された活性化型多糖を、再構成されたＣＲＭ_１９７と反応容器内で合わせた後、十分に混合して透明な溶液を得てから、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いたコンジュゲーションを開始した。反応液中の多糖の最終濃度はおよそ１ｇ／Ｌであった。反応混合物に０．５〜２．０ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３±２℃で２０〜４８時間インキュベートすることにより、コンジュゲーションを開始した。２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）を添加して未反応のアルデヒドをキャッピングすることにより、コンジュゲーション反応を停止させた。このキャッピング反応は、２３±２℃で３±１時間にわたって続いた。

コンジュゲートの精製
コンジュゲート溶液を、冷却した５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水（ｐＨ６．０）で１：１０に希釈し、１００〜３００ＫＭＷＣＯの膜を使用した接線流濾過による精製の準備をした。希釈したコンジュゲート溶液を５μｍフィルターに通し、５ｍＭコハク酸／０．９％食塩水（ｐＨ６．０）を媒体として使用して透析濾過を行った。透析濾過が完了した後、コンジュゲート残余分を０．２２μｍフィルターに通して移した。コンジュゲートをおよそ０．５ｍｇ／ｍＬの標的糖類濃度まで５ｍＭコハク酸／０．９％食塩水（ｐＨ６）でさらに希釈した。あるいは、２０ｍＭヒスチジン−０．９％食塩水（ｐＨ６．５）を使用し、１００〜３００ＫＭＷＣＯの膜を使用した接線流濾過により、コンジュゲートを精製する。最終の０．２２μｍ濾過ステップを完了して、免疫原性コンジュゲートを得た。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。

Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２、およびＯ６に適用される、水性バッファーにおけるコンジュゲーション（ＲＡＣ／水性）
多糖の活性化および透析濾過を、ＤＭＳＯに基づくコンジュゲーションのためのものと同じ様式で行った。

濾過した活性化型糖類を、血清型に応じて０．４〜２ｗ／ｗの範囲の多糖対タンパク質の質量比で、ＣＲＭ_１９７と複合した。この投入比は、結果として得られるコンジュゲートの多糖対ＣＲＭ_１９７比を制御するように選択した。

次いで、複合した混合物を凍結乾燥した。コンジュゲーション後、多糖とタンパク質の混合物を、血清型に応じて５〜２５ｇ／Ｌの範囲の多糖濃度で０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーに溶解し、ｐＨを血清型に応じて６．０〜８．０に調整した。反応混合物に０．５〜２．０ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３±２℃で２０〜４８時間インキュベートすることにより、コンジュゲーションを開始した。１〜２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）を添加して未反応のアルデヒドをキャッピングすることにより、コンジュゲーション反応を停止させた。

あるいは、濾過した活性化型糖類および計算された量のＣＲＭ_１９７タンパク質を別々にシェル凍結し、凍結乾燥してから、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーに溶解することで合わせ、次いで、後続のコンジュゲーションを上述のように進めてもよい。

Ｅ．ｃｏｌｉＯ抗原多糖−ＣＲＭ_１９７単一末端コンジュゲートの調製手順
グラム陰性菌の外膜の一般的な成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、リピドＡ、コア領域、およびＯ抗原（Ｏ特異的多糖またはＯ多糖とも呼ばれる）を含む。異なる血清型のＯ抗原繰り返し単位は、組成、構造、および血清学的特長において異なる。本発明で使用されるＯ抗原は、その鎖末端において、２−ケト−３−デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）と呼ばれる糖単位を含むコアドメインに結合している。多糖鎖のランダムな活性化（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムまたはカルボジイミドによる活性化）に基づくいくつかのコンジュゲーション方法とは異なる。本発明は、ジスルフィドアミンリンカーによるＫＤＯの選択的活性化を含むコンジュゲーションプロセスを開示し、この糖単位は、チオール官能基が露出されると、図３１（単一末端コンジュゲートの調製）に示されるように、ブロモ活性化型ＣＲＭ_１９７タンパク質にコンジュゲートされる。

シスタミンリンカー（Ａ１）に基づくコンジュゲーション
Ｏ抗原多糖およびシスタミン（ＫＤＯの５０〜２５０ｍｏｌ当量）をリン酸バッファー中で混合し、ｐＨを６．０〜７．０に調整した。この混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）（ＫＤＯの５〜３０ｍｏｌ当量）を添加し、この混合物を３７℃で４８〜７２時間撹拌した。室温に冷まし、等量のリン酸バッファーで希釈した後、混合物をトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（添加したシスタミンの１．２ｍｏｌ当量）で処理した。次いでこの混合物を、５ＫＤａＭＷＣＯの膜を使用した１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム溶液に対する透析濾過によって精製して、チオール含有Ｏ抗原多糖を得た。チオール含量は、Ｅｌｌｍａｎアッセイによって決定されうる。

次いで、上記のチオール活性化型Ｏ抗原多糖をブロモ活性化型ＣＲＭ_１９７タンパク質と０．５〜２．０の比で混合することにより、コンジュゲーションを進めた。反応混合物のｐＨを１ＭＮａＯＨ溶液で８．０〜１０．０に調整する。コンジュゲーション反応を５℃で２４±４時間続けた。担体タンパク質の未反応のブロモ残基を、２ｍｏｌ当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと５℃で３〜５時間反応させることによってクエンチした。次いで、３ｍｏｌ当量のヨードアセトアミド（添加したＮ−アセチル−Ｌ−システインに関連する）を加え、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を５℃でさらに３〜５時間続け、１ＭＮａＯＨの添加によって両方のキャッピングステップのｐＨを８．０〜１０．０に維持した。３０ＫＤａＭＷＣＯの膜を使用した５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水（ｐＨ６．０）に対する限外濾過／透析濾過の後に、結果として生じたコンジュゲートを得た。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。

３，３’−ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカー（Ａ４）に基づくコンジュゲーション
Ｏ抗原多糖および３，３’−ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）（ＫＤＯの５〜５０ｍｏｌ当量）を酢酸バッファー中で混合し、ｐＨを４．５〜５．５に調整した。この混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）（ＫＤＯの５〜３０ｍｏｌ当量）を添加し、この混合物を２３〜３７℃で２４〜７２時間撹拌した。次いでこの混合物を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（添加した３，３’−ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカーの１．２ｍｏｌ当量）で処理した。次いでこの混合物を、５ＫＤａＭＷＣＯの膜を使用した１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム溶液に対する透析濾過によって精製して、チオール含有Ｏ抗原多糖を得た。チオール含量は、Ｅｌｌｍａｎアッセイによって決定されうる。

次いで、上記のチオール活性化型Ｏ抗原多糖をブロモ活性化型ＣＲＭ_１９７タンパク質と０．５〜２．０の比で混合することにより、コンジュゲーションを進めた。反応混合物のｐＨを１ＭＮａＯＨ溶液で８．０〜１０．０に調整する。コンジュゲーション反応を５℃で２４±４時間続けた。担体タンパク質の未反応のブロモ残基を、２ｍｏｌ当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと５℃で３〜５時間反応させることによってクエンチした。次いで、３ｍｏｌ当量のヨードアセトアミド（添加したＮ−アセチル−Ｌ−システインに関連する）を加え、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を５℃でさらに３〜５時間続け、１ＭＮａＯＨの添加によって両方のキャッピングステップのｐＨを８．０〜１０．０に維持した。３０ＫＤａＭＷＣＯの膜を使用した５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水（ｐＨ６．０）に対する限外濾過／透析濾過の後に、結果として生じたコンジュゲートを得た。

２，２’−ジチオ−Ｎ，Ｎ’−ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２−（アミノオキシ）アセトアミド）リンカー（Ａ６）に基づくコンジュゲーション
Ｏ抗原多糖および２，２’−ジチオ−Ｎ，Ｎ’−ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２−（アミノオキシ）アセトアミド）（ＫＤＯの５〜５０ｍｏｌ当量）を酢酸バッファー中で混合し、ｐＨを４．５〜５．５に調整した。次いでこの混合物を２３〜３７℃で２４〜７２時間撹拌し、その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）（ＫＤＯの５〜３０ｍｏｌ当量）を添加し、この混合物をさらに３〜２４時間撹拌した。次いでこの混合物を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（添加したリンカーの１．２ｍｏｌ当量）で処理した。次いでこの混合物を、５ＫＤａＭＷＣＯの膜を使用した１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム溶液に対する透析濾過によって精製して、チオール含有Ｏ抗原多糖を得た。チオール含量は、Ｅｌｌｍａｎアッセイによって決定されうる。

ブロモ活性化型ＣＲＭ_１９７の調製
ＣＲＭ_１９７を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０±０．２の溶液中において調製し、５±３℃に冷却した。このタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）として０．２５〜０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質比（ｗ／ｗ）で加える。この反応物を５±３℃で３０〜６０分間穏やかに混合する。結果として得られたブロモアセチル化（活性化）タンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を使用し、１０ｋＤａＭＷＣＯの膜を使用した限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度をＬｏｗｒｙタンパク質アッセイによって推定する。

Ｅ．ｃｏｌｉＯ−Ａｇ−ＴＴコンジュゲートの調製
凍結乾燥したＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５ｂ長鎖多糖、ロット番号７０９７６６−３０（約６．９２ｍｇ／ｍＬ、ＭＷ：約３９ｋＤａ）、５０ｍｇを破傷風トキソイド（ＴＴ）コンジュゲーションに使用した。

Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１ａ長鎖多糖７１０９５８−１４２−３（約６．３ｍｇ／ｍＬ、ＭＷ：約４４．３ｋＤａ）（５０ｍｇ、７．９４ｍＬ）を凍結乾燥した。
Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６長鎖多糖、７１０７５８−１２１−１（約１６．８ｍｇ／ｍＬ、ＭＷ：約４４ｋＤａ）（５０ｍｇ、２．９８ｍＬ）を凍結乾燥した。

上記の凍結乾燥した多糖のそれぞれをＷＦＩに溶解しておよそ５〜１０ｍｇ／ｍＬにし、これに、０．５ｍＬ（１００ｍｇの（１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を１ｍＬのアセトニトリルに含む溶液）を添加し、室温で撹拌した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）０．２Ｍ（２ｍＬ）を添加し、室温で撹拌した。

破傷風トキソイド（ＴＴ）の調製：ＴＴ（１００ｍｇ、４７ｍｌ）をおよそ２０ｍＬに濃縮し、濾過管を使用して食塩水（２×５０ｍＬ）で２回洗浄した。その後、ＨＥＰＥＳおよび食塩水でこれを希釈し、ＨＥＰＥＳの最終濃度を約０．２５Ｍにした。

ＴＴを上述のように調製し、反応物のｐＨを約９．１〜９．２に調整した。この反応混合物を室温で撹拌した。
２０〜２４時間後、反応をグリシン（０．５ｍＬ）でクエンチした。その後、ＭＷＣＯ再生セルロース膜を使用してこれを濃縮し、食塩水に対する透析濾過を行った。濾過して解析した。表２６を参照されたい。

Ｏ抗原の発酵、精製、およびコンジュゲーションのさらなる結果
下記の例示的なプロセスは、概して、すべてのＥ．ｃｏｌｉ血清型に適用可能である。各多糖の生成は、バッチ生成発酵の後、下流精製の前に化学的不活性化を行うことを含んだ。

株および保管。短鎖Ｏ抗原の生合成に用いた株は、Ｅ．ｃｏｌｉの野生型臨床株であった。天然ｗｚｚｂ遺伝子の欠失を有するようにＷａｎｎｅｒ−Ｄａｔｓｅｎｋｏ法によって工学操作され、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ由来の「長鎖」伸長機能ｆｅｐＥによって補完された短鎖産生株の誘導体を用い、長鎖Ｏ抗原を生成した。ｆｅｐＥ機能は、高コピーのｃｏｌＥ１に基づく「ｔｏｐｏ」ベクター、または、ｃｏｌＥ１に基づくベクターｐＥＴ３０ａからＴ７プロモーター領域が欠失した低コピー誘導体のいずれかで、その天然のプロモーターから発現された。

動物質を含まないＬＢまたは最少培地のいずれかにおいて、少なくとも３．０のＯＤ_６００まで細胞を増殖させることにより、細胞バンクを調製した。次いで、ブロスを新鮮な培地で希釈し、８０％グリセロールと合わせて、２．０ＯＤ_６００／ｍＬで２０％のグリセロール最終濃度を得た。

シード培養および発酵に使用した培地。用いられたシードおよび発酵培地には、次の処方が共通する：ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４−２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２−４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２、およびＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ。

シードおよび発酵条件。単一のシードバイアルから０．１％でシードを播種した。シードのフラスコを３７℃で１６〜１８時間インキュベートし、典型的に１０〜２０ＯＤ_６００／ｍＬを達成した。

発酵は、１０Ｌのステンレス鋼定置蒸気滅菌型発酵装置で行った。
発酵装置の播種は、典型的には、１０ＯＤ_６００のシードから１：１０００であった。バッチフェーズは、１０ｇ／Ｌのバッチグルコースで増殖が進む期間であり、通常は８時間持続する。グルコースの枯渇後、溶解酸素の急激な上昇があり、この時点でグルコースを発酵物に供給した。次いで、発酵は通常１６〜１８時間続き、収量は１２０ＯＤ_６００／ｍＬを超える。

血清型Ｏ１ａ、Ｏ２、Ｏ６およびＯ２５ｂの短鎖／長鎖Ｏ抗原の生成の初期評価。Ｏ１ａ、Ｏ２、Ｏ６、およびＯ２５ｂの野生型株を、添加最少培地においてバッチモードでＯＤ_６００＝１５〜２０まで発酵させた。酸素消費量の急激な減少をもたらすグルコースの枯渇後、増殖を制限するグルコースの供給を、グルコース溶液から１６〜１８時間にわたって適用した。細胞密度は１２４〜１４５ＯＤ_６００単位／ｍＬに達した。その後、回収ブロスのｐＨを約３．８に調整し、２時間にわたって９５℃に加熱した。次いで、加水分解したブロスを２５℃に冷まし、ｐＨ６．０にし、遠心分離して固体を除去した。結果として得られた上清を、次いで、Ｏ抗原の定量化のためにＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムにロードした。２２４０〜４１８０ｍｇ／Ｌの範囲の生産性が得られた。これらのバッチの精製された短鎖Ｏ抗原の分子量は、１０〜１５ｋＤａの範囲であることが見出された。また、Ｏ２およびＯ６の加水分解産物のＳＥＣクロマトグラフィは、Ｏ１ａおよびＯ２５ｂの加水分解産物には顕在しなかった特徴的かつ分離可能な混入多糖を明らかにしたことも認められた。

Ｏ１ａ、Ｏ２、Ｏ６およびＯ２５ｂＯ抗原の長鎖型は、異種の相補的なｆｅｐＥ遺伝子を高コピーのカナマイシン選択可能なｔｏｐｏプラスミドに搭載した各株のｗｚｚｂ欠失型の発酵によって得られた。カナマイシン選択にもかかわらず、短鎖について発酵が行われた。１２４〜１７７ＯＤ_６００／ｍＬで観察された最終的な細胞密度は、３５００〜９８５０ｍｇ／ＬのＯ抗原生産性に関連付けられた。長鎖Ｏ抗原の相補性に基づく合成は、親短鎖株と少なくとも同程度に生産性があり、場合により、その生産性は親短鎖株よりも高かった。精製されたＯ抗原多糖の分子量は３３〜４９ｋＤａ、または対応する短鎖のサイズの約３倍であった。

Ｏ２およびＯ６の長鎖加水分解産物は混入多糖ピークの証拠を示したことが認められ、このピークは、長鎖抗原の場合には、Ｏ抗原のメインピークのショルダーとして観察された。Ｏ１およびＯ２５ｂは、短鎖の親で以前に見られたような混入多糖の産生の証拠を示さなかった。

増殖速度の抑制は、ｆｅｐＥが存在しないｔｏｐｏレプリコンの存在に関連することが見出された。さらに、Δｗｚｚｂ変異自体は、増殖速度に有害作用を及ぼさなかった。このことは、増殖速度の乱れがプラスミドベクターによってもたらされたことを示す。

Ｏ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５Ｏ抗原の生成についての株の評価。血清型Ｏ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５の複数の野生型株が、発酵において不要な多糖を産生する傾向を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した。Ｏ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５の各株を、混入多糖が存在せず、１０００ｍｇ／Ｌ超のＯ抗原を産生する能力があり、Δｗｚｚｂ形質の導入のためのＷａｎｎｅｒ−Ｄａｔｓｅｎｋｏリコンビニアリングを可能にする抗生物質感受性プロファイルを提示するものについて選択した。

カナマイシン耐性があることが一般に見出されるＯ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５のΔｗｚｚｂ株へのｆｅｐＥの導入を可能にする、クロラムフェニコール選択可能なｔｏｐｏ−ｆｅｐＥおよびｐＥＴ−ｆｅｐＥを構築した。結果として得られたｔｏｐｏ−ｆｅｐＥおよびｐＥＴ−ｆｅｐＥを有する株をクロラムフェニコール選択で発酵させ、酸加水分解したブロスの上清をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した。高コピー（ｔｏｐｏ）と低コピー（ｐＥＴ）の両方のｆｅｐＥ構築物が、それぞれ親野生型と同様の生産性でＯ抗原の合成を指示した。干渉する可能性のある多糖の発現は観察されなかった。

ｗｚｚｂプラスミド保有株の増殖速度の評価は、Ｏ１１、Ｏ１３およびＯ２１がｔｏｐｏ−ｆｅｐＥの存在によって抑制されることはなかったが、ｐＥＴ−ｆｅｐＥによって抑制されたことを示した。Ｏ１６株およびＯ７５株は、レプリコンの選択とは無関係に許容可能な増殖速度を示した。

多糖の精製プロセスは、Ｏ抗原を遊離させるための酸加水分解を含んだ。発酵リアクター内の血清型特異的Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の粗懸濁物を、酢酸で直接処理して最終ｐＨを３．５±０．５にし、酸性化したブロスを少なくとも１時間にわたって９５±５℃の温度に加熱した。この処理は、オリゴ糖の近位末端にあるＫＤＯとリピドＡとの間の不安定な結合を切断し、したがってＯ−Ａｇ鎖を遊離させる。遊離したＯ−Ａｇを含む酸性化したブロスを２０±１０℃に冷ました後、ＮＨ_４ＯＨを使用してｐＨ７±１．０に中和した。このプロセスは、いくつかの遠心分離、濾過、および濃縮／透析濾過作業ステップをさらに含んだ。

試験したＯ抗原（Ｏ４、Ｏ１１、Ｏ２１、Ｏ７５）に対するコンジュゲーション（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）

調製したＰＬＬコンジュゲート

哺乳動物細胞におけるＥ．ｃｏｌｉポリペプチドの安定発現。ＦｉｍＨＧＳＤまたはＦｉｍＨＬＤを発現する安定なＣＨＯクローンを、ＳＳＩ（部位特異的組み込み）安定発現系の使用により生成した。

宿主ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯＫ１ＳＶＧＳ−ＫＯバックグラウンドから工学操作された細胞株である（ＣＨＯＫ１ＳＶＧＳ−ＫＯ宿主細胞株の説明については、例えば、米国特許出願第２０２００００２７２７号を参照されたい）。簡潔に述べると、２つのＦＲＴ部位に囲まれた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むランディングパッドを、宿主細胞のゲノム内の転写ホットスポットに標的挿入した。ＧＦＰ遺伝子は、フリッパーゼリコンビナーゼ（ＦＬＰｅ）と同時発現されるＬＶＥＣベクターのＦＲＴ部位にも囲まれているＧＳ遺伝子および目的の遺伝子と交換されうる。この系は、ランダムな組み込みと好ましく匹敵する増殖プロファイルおよび生産性プロファイルを有するだけでなく、少なくとも１００世代にわたる遺伝子型および表現型の安定性も提示する。

本明細書で言及される場合、「ＦＲＴ部位」という用語は、酵母の２μｍプラスミドのフリッパーゼ（ＦＬＰ）遺伝子の産物であるＦＬＰリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒しうるヌクレオチド配列を意味する。多様な非同一のＦＲＴ部位が当技術分野で公知である。様々なＦＲＴ部位の配列は、そのすべてが、組換えが生じる８塩基対の非対称性コア領域にフランキングする同一の１３塩基対の逆方向反復を含むという点で類似している。部位の方向性、および異なるＦＲＴ部位間の多様性に関与するのは、この非対称性コア領域である。これらの実例（非限定的な例）は、天然に存在するＦＲＴ（Ｆ）、ならびにＦＲＴＦ１およびＦＲＴＦ２などのいくつかの変異型またはバリアントＦＲＴ部位を含む。

本明細書で言及される場合、「ランディングパッド」という用語は、宿主細胞の染色体に組み込まれる第１の組換え標的部位を含む核酸配列を意味する。いくつかの態様において、ランディング部位は、宿主細胞の染色体に組み込まれる組換え標的部位を２つ以上含む。いくつかの態様において、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、または８個のランディングパッドを含む。いくつかの態様において、細胞は、１、２、または３個のランディングパッドを含む。いくつかの態様において、細胞は、４個のランディングパッドを含む。いくつかの態様において、ランディングパッドは、最大１、２、３、４、５、６、７、または８個の異なる染色体座に組み込まれる。いくつかの態様において、ランディングパッドは、最大１、２、または３個の異なる染色体座に組み込まれる。いくつかの態様において、ランディングパッドは、４個の異なる染色体座に組み込まれる。

ＦｉｍＨＧＳＤまたはＦｉｍＨＬＤのＬＶＥＣ発現ベクターおよびＦＬＰｅ発現ベクターを、ＢｉｏＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌまたはＡｍａｘａ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのいずれかを用いた電気穿孔により、ＳＳＩ宿主細胞にコトランスフェクトした。次いで、グルタミンを含まない培地で細胞を培養して、ＧＳ遺伝子がランディングパッド部位で組み込まれた細胞を選択した。通常、細胞は２〜３週間で回復する。次いで、ＦＡＣＳまたは限界希釈のいずれかにより、９６ウェルプレートで単細胞クローニングを行った。細胞を含むウェルの力価をランク付けして、上位４８クローンまで絞り込んだ。２４ディープウェルプレートで２回目のフェドバッチスクリーニングを行って、上位１２クローンまで絞り込んだ。Ａｍｂｒ１５で３回目のフェドバッチスクリーニングを実行して、上位３クローンまで絞り込んだ。Ａｍｂｒ２５０実験を使用して、最も良好なクローンを同定した。最上位のクローンについて、その同定後、マスター細胞バンクおよびワーキング細胞バンクを生成した。

細胞株の開発ならびにＦｉｍＨ−ＤＳＧＷＴタンパク質およびＦｉｍＨ_ＬＤＷＴタンパク質の生産リアクターにおける発現
ここに記載する実施例は、ＦｉｍＨ−ＤＳＧＷＴおよびＦｉｍＨ_ＬＤＷＴの各タンパク質のコード配列がＣＨＯゲノムに安定に組み込まれている安定なＣＨＯ細胞株から両タンパク質を産生する例について説明する。

生産バイオリアクターの設定において、選択された安定なＣＨＯ細胞株は、ＦｉｍＨ−ＤＳＧＷＴについては培養物１リットル当たり約１グラム、ＦｉｍＨ_ＬＤＷＴについては培養物１リットル当たり２５０ミリグラムで、標的タンパク質を産生することができた。生産リアクターのシード株は、ワーキング細胞バンクを解凍したバイアルから連続的にスケールアップし、生産リアクターに十分な細胞を供給するため、振とうフラスコ内で３回の継代を経て、０．３×１０^６細胞／ｍｌの播種生細胞密度を使用して増殖させた。細胞は３６．５℃、５％ＣＯ_２で３〜４日間増殖させた。

生産リアクターは、１×１０^６細胞／ｍｌの播種細胞密度を標的として、最終の振とうフラスコから播種した。生産リアクターは、３６．５℃で７日間、７．０５（±０．１５）のｐＨを使用し、５〜１０％のＣＯ_２飽和度を標的として増殖させた。ｐＨは、塩基制御では炭酸水素ナトリウム／カリウム、酸制御ではＣＯ_２散布によって制御する。溶解酸素は、散布による純酸素を使用し、４０％の設定値に制御する。７日目に温度を３１℃に調整した。１日目に、生細胞密度に相関してフィードを加えるフィード戦略を使用し、リアクターへの供給を行った。これは、フィード成分が実行中に尽きないことを確実にするために、０．７５のフィード係数を使用して達成される。次いで、フィードを連続的に加えて、１日を通じて所望の量のフィードを供給する。

生産リアクターを１３日目に回収し、回収された培養物を遠心分離し、０．２２μｍフィルターにかけた後、下流処理を行った。
以下の条項は、本発明のさらなる態様を説明する。

Ｃ１。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３−１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１〜１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む糖類とを含む組成物。

Ｃ２。糖類が、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３−１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、式６２Ｄ_１、式Ｏ２２、式Ｏ３５、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ８３、式Ｏ９１、式Ｏ１０５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１３９、式Ｏ１５３、式Ｏ１６７、および式Ｏ１７２（式中、ｎは、２０〜１００の整数である）から選択される構造を含む、条項Ｃ１に記載の組成物。

Ｃ３。糖類が、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３−１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、および式６２Ｄ_１（式中、ｎは、２０〜１００の整数である）から選択される構造を含む、条項Ｃ２に記載の組成物。

Ｃ４。式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ２１、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、および式Ｏ７５から選択される構造を含む、条項Ｃ２に記載の組成物。

Ｃ５。式Ｏ４、式Ｏ１１、式Ｏ２１、および式Ｏ７５から選択される構造を含む、条項Ｃ２に記載の組成物。
Ｃ６。糖類が、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１から選択される構造を含まない、条項Ｃ１に記載の組成物。

Ｃ７。糖類が、式Ｏ１２から選択される構造を含まない、条項Ｃ１に記載の組成物。
Ｃ８。糖類が、グラム陰性菌においてｗｚｚファミリータンパク質を発現させて前記糖類を生成することによって産生される、条項Ｃ４に記載の組成物。

Ｃ９。ｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１、およびｗｚｚ２からなる群から選択される、条項Ｃ８に記載の組成物。

Ｃ１０。ｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢである、条項Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１１。ｗｚｚファミリータンパク質が、ｆｅｐＥである、条項Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１２。ｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢおよびｆｅｐＥである、条項Ｃ８に記載の組成物。

Ｃ１３。ｗｚｚファミリータンパク質が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａに由来する、条項Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１４。ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つから選択される配列を含む、条項Ｃ８に記載の組成物。

Ｃ１５。ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、条項Ｃ８に記載の組成物。

Ｃ１６。ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つから選択される配列を含む、条項Ｃ８に記載の組成物。

Ｃ１７。糖類が、合成的に合成されている、条項Ｃ１に記載の組成物。
Ｃ１８。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１部分をさらに含む、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ１９。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２部分をさらに含む、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２０。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３部分をさらに含む、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ２１。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４部分をさらに含む、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２２。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２部分をさらに含む、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ２３。糖類が、３−デオキシ−ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含む、条項Ｃ１〜Ｃ２２のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２４。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１部分をさらに含まない、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ２５。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２部分をさらに含まない、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２６。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３部分をさらに含まない、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ２７。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４部分をさらに含まない、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２８。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２部分をさらに含まない、条項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ２９。糖類が、３−デオキシ−ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含まない、条項Ｃ１〜Ｃ２２のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３０。糖類が、リピドＡを含まない、条項Ｃ１〜Ｃ２３のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ３１。多糖が、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、または５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの分子量を有する、条項Ｃ１〜Ｃ３０のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３２。糖類が、２０〜４０ｋＤａの平均分子量を有する、条項Ｃ１〜Ｃ３１のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ３３。糖類が、４０，０００〜６０，０００ｋＤａの平均分子量を有する、条項Ｃ１〜Ｃ３２のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３４。ｎが、３１〜９０の整数である、条項Ｃ１〜Ｃ３３のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ３５。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する組成物。

Ｃ３６。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した条項Ｃ１〜条項Ｃ３４のいずれか一項に記載の糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物。

Ｃ３７。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、条項Ｃ３５または条項Ｃ３６に記載のコンジュゲートとを含む組成物であって、担体タンパク質が、ポリ（Ｌ−リジン）、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無毒化された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの無毒化された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＡｃｒＡ、ならびにＣ．ｊｅｊｕｎｉの天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、組成物。

Ｃ３８。担体タンパク質が、ＣＲＭ_１９７である、条項Ｃ３５〜条項Ｃ３７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３９。担体タンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）である、条項Ｃ３５〜条項Ｃ３７のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ４０。担体タンパク質が、ポリ（Ｌ−リジン）である、条項Ｃ３５〜条項Ｃ３７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４１。コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される、条項Ｃ３５〜条項Ｃ３９のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ４２。コンジュゲートが、ＣＤＡＰ化学によって調製される、条項Ｃ３５〜条項Ｃ３９のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４３。コンジュゲートが、単一末端結合コンジュゲート糖類である、条項Ｃ３５〜条項Ｃ３９のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ４４。糖類が、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項Ｃ３５〜条項Ｃ３９のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ４５。糖類が、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされており、糖類が、カルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合している、条項Ｃ４４に記載の組成物。

Ｃ４６。ＣＲＭ_１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合したリジン残基を２〜２０個、または４〜１６個含む、条項Ｃ４４または条項Ｃ４５に記載の組成物。
Ｃ４７。糖類：担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）が、０．２〜４である、条項Ｃ３５〜条項Ｃ４６のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ４８。糖類のタンパク質に対する比が、０．５以上２以下である、条項Ｃ３５〜条項Ｃ４６のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４９。糖類のタンパク質に対する比が、０．４〜１．７である、条項Ｃ３５〜条項Ｃ４６のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ５０。糖類が、３−デオキシ−ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項Ｃ４３〜条項Ｃ４９のいずれか一項に記載の組成物。

Ｃ５１。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖類が、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは、１〜１０の整数である）から選択される構造を含む組成物。

Ｃ５２。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、条項Ｃ１〜条項Ｃ３４のいずれか一項に記載の糖類と、薬学的に許容される希釈剤とを含む組成物。
Ｃ５３。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、条項Ｃ３５〜条項Ｃ５１のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤とを含む組成物。

Ｃ５４。組成物中の糖類の総量と比較して最大で約２５％の遊離糖類を含む、条項Ｃ５３に記載の組成物。
Ｃ５５。アジュバントをさらに含む、条項Ｃ５２または条項Ｃ５３に記載の組成物。

Ｃ５６。アルミニウムをさらに含む、条項Ｃ５２または条項Ｃ５３に記載の組成物。
Ｃ５７。ＱＳ−２１をさらに含む、条項Ｃ５２または条項Ｃ５３に記載の組成物。
Ｃ５８。ＣｐＧオリゴヌクレオチドをさらに含む、条項Ｃ５２または条項Ｃ５３に記載の組成物。

Ｃ５９。アジュバントを含まない、条項Ｃ５２または条項Ｃ５３に記載の組成物。
Ｃ６０。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する糖類とを含む組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合している、組成物。

Ｃ６１。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＯ抗原である、条項Ｃ６０に記載の組成物。
Ｃ６２。薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含む、条項Ｃ６０に記載の組成物。

Ｃ６３。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＯ抗原である、条項Ｃ６０に記載の組成物。
Ｃ６４。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた条項Ｃ１〜条項Ｃ１７のいずれか一項に記載の糖類とを含む組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合している、組成物。

Ｃ６５。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片、ならびに（ｉ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＥ．ｃｏｌｉＯ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＥ．ｃｏｌｉＯ１Ａ抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＥ．ｃｏｌｉＯ２抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＯ６抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５Ｂ抗原が、式Ｏ２５Ｂ（式中、ｎは、３０超の整数である）の構造を含む組成物。

Ｃ６６。前記担体タンパク質が、ポリ（Ｌ−リジン）、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無毒化された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの無毒化された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＡｃｒＡ、ならびにＣ．ｊｅｊｕｎｉの天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、条項６５に記載の組成物。

Ｃ６７。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片、ならびに（ｉ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＥ．ｃｏｌｉＯ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＥ．ｃｏｌｉＯ４抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＥ．ｃｏｌｉＯ１１抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＯ２１抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５Ｂ抗原が、式Ｏ７５（式中、ｎは、３０超の整数である）の構造を含む組成物。

Ｃ６８。前記担体タンパク質が、ポリ（Ｌ−リジン）、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無毒化された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの無毒化された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＡｃｒＡ、ならびにＣ．ｊｅｊｕｎｉの天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、条項６７に記載の組成物。

Ｃ６９。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物を作製する方法であって、ａ）糖類を有機溶媒中で１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）と反応させて、活性化型糖類を生成するステップと、ｂ）活性化型糖類をシスタミンもしくはシステアミンまたはそれらの塩と反応させて、チオール化糖類を生成するステップと、ｃ）チオール化糖類を還元剤と反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化型チオール化糖類を生成するステップと、ｄ）活性化型チオール化糖類を、１つまたは複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化型担体タンパク質と反応させて、チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化型担体タンパク質のコンジュゲートされていないα−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬、および／または（ｉｉ）コンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させることにより、ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートを生成するステップとを含み、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを組換え哺乳動物細胞で発現させるステップと、前記ポリペプチドまたはその断片を単離するステップとをさらに含み、糖類がＥ．ｃｏｌｉに由来する方法。

Ｃ７０。条項Ｃ１〜条項Ｃ３４のいずれか一項に記載の組成物を作製するステップを含む、条項Ｃ６９に記載の方法。
Ｃ７１。キャッピングステップｅ）が、チオール化糖類−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）第１のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、および／または（ｉｉ）第２のキャッピング試薬としてのヨードアセトアミドと反応させるステップを含む、条項Ｃ６９または条項Ｃ７０に記載の方法。

Ｃ７２。トリアゾールまたはイミダゾールとの反応によって糖類を複合して、複合糖類を用意し、複合糖類をシェル凍結し、凍結乾燥し、有機溶媒中で再構成するステップを、ステップａ）の前にさらに含む、条項Ｃ６９〜条項Ｃ７１のいずれか一項に記載の方法。

Ｃ７３。ステップｃ）で生成されたチオール化多糖の精製をさらに含み、精製ステップが透析濾過を含む、条項Ｃ６９〜条項Ｃ７２のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ７４。透析濾過によるｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの精製をさらに含む、条項Ｃ６９〜条項Ｃ７３のいずれか一項に記載の方法。

Ｃ７５。ステップａ）の有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、およびヘキサメチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）、またはそれらの混合物のいずれか１つから選択される極性非プロトン溶媒である、条項Ｃ６９〜条項Ｃ７４のいずれか一項に記載の方法。

Ｃ７６。ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４−２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２−４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２、およびＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏを含む培地。

Ｃ７７。Ｅ．ｃｏｌｉを培養するために使用される、条項Ｃ７６に記載の培地。
Ｃ７８。条項Ｃ１〜条項Ｃ３４のいずれか一項に記載の糖類を生成する方法であって、組換えＥ．ｃｏｌｉを培地中で培養するステップと、前記細胞を前記培地中で培養することで、前記細胞が前記糖類を産生することにより、前記糖類を生成するステップとを含む方法。

Ｃ７９。培地が、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４−２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２−４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２、およびＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む、条項Ｃ７８に記載の方法。

Ｃ８０。培地が、ダイズ加水分解産物を含む、条項Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８１。培地が、酵母エキスを含む、条項Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８２。培地が、ダイズ加水分解産物および酵母エキスをさらに含まない、条項Ｃ７８に記載の方法。

Ｃ８３。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１、およびｗｚｚ２のいずれか１つから選択される異種ｗｚｚファミリータンパク質を含む、条項Ｃ７８に記載の方法。

Ｃ８４。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１、およびｗｚｚ２のいずれか１つから選択されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａのｗｚｚファミリータンパク質を含む、条項Ｃ７８に記載の方法。

Ｃ８５。ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つから選択される配列を含む、条項Ｃ８４に記載の方法。

Ｃ８６。培養ステップが、１２０ＯＤ_６００／ｍＬを超える収量をもたらす、条項Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８７。糖類を精製するステップをさらに含む、条項Ｃ７８に記載の方法。

Ｃ８８。精製ステップが、透析、濃縮作業、透析濾過作業、接線流濾過、沈殿、溶出、遠心分離、沈殿、限外濾過、深層濾過、およびカラムクロマトグラフィ（イオン交換クロマトグラフィ、マルチモーダルイオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ、および疎水性相互作用クロマトグラフィ）のいずれか１つを含む、条項Ｃ７８に記載の方法。

Ｃ８９。条項Ｃ１〜条項Ｃ６８のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法。
Ｃ９０。免疫応答が、抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ特異的多糖血清抗体の誘発を含む、条項Ｃ８９に記載の方法。

Ｃ９１。免疫応答が、抗Ｅ．ｃｏｌｉＩｇＧ抗体の誘発を含む、条項Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９２。免疫応答が、Ｅ．ｃｏｌｉに対する殺菌活性の誘発を含む、条項Ｃ８９に記載の方法。

Ｃ９３。免疫応答が、Ｅ．ｃｏｌｉに対するオプソニン食作用性抗体の誘発を含む、条項Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９４。免疫応答が、初回投与後の少なくとも１，０００〜２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルを含む、条項Ｃ８９に記載の方法。

Ｃ９５。組成物が、式Ｏ２５（式中、ｎは、４０〜１００の整数である）を含む糖類を含み、免疫応答が、初回投与後の少なくとも１，０００〜２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルを含む、条項Ｃ８９に記載の方法。

Ｃ９６。哺乳動物に、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿路性敗血症、腹腔内感染症、髄膜炎、複雑性肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児／乳児敗血症、好中球減少性発熱、および他の血流感染、肺炎、菌血症、ならびに敗血症から選択される状態のいずれか１つのリスクがある、条項Ｃ８９に記載の方法。

Ｃ９７。哺乳動物が、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿路性敗血症、腹腔内感染症、髄膜炎、複雑性肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児／乳児敗血症、好中球減少性発熱、および他の血流感染、肺炎、菌血症、ならびに敗血症から選択される状態のいずれか１つを有する、条項Ｃ８９に記載の方法。

Ｃ９８。（ｉ）対象において、腸管外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに対する免疫応答を誘発する、（ｉｉ）対象において、腸管外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに対する免疫応答を誘発する、または（ｉｉｉ）対象において、腸管外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに特異的なオプソニン食作用性抗体の産生を誘発する方法であって、条項Ｃ１〜条項Ｃ６８のいずれか一項に記載の組成物を有効量で対象に投与するステップを含む方法。

Ｃ９９。対象に、尿路感染を発症するリスクがある、条項Ｃ９８に記載の方法。
Ｃ１００。対象に、菌血症を発症するリスクがある、条項Ｃ９８に記載の方法。
Ｃ１０１。対象に、敗血症を発症するリスクがある、条項Ｃ９８に記載の方法。

Ｃ１０２。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片、ならびに（ｉ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＥ．ｃｏｌｉＯ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＥ．ｃｏｌｉＯ１Ａ抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＥ．ｃｏｌｉＯ２抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有結合的にカップリングされたＯ６抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、Ｅ．ｃｏｌｉＯ２５Ｂ抗原が、式Ｏ２５Ｂ（式中、ｎは、３０超の整数である）の構造を含む組成物。

Ｃ１０３。担体タンパク質が、ポリ（Ｌ−リジン）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無毒化された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの無毒化された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化されたバリアント、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＡｃｒＡ、ならびにＣ．ｊｅｊｕｎｉの天然糖タンパク質からなる群から選択される、条項Ｃ１０２に記載の組成物。

Ｃ１０４。（ｉ）対象において、腸管外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに対する免疫応答を誘発する、（ｉｉ）対象において、腸管外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに対する免疫応答を誘発する、または（ｉｉｉ）対象において、腸管外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに特異的なオプソニン食作用性抗体の産生を誘発する方法であって、条項Ｃ１に記載の組成物を有効量で対象に投与するステップを含む方法。

Ｃ１０５。対象に、尿路感染を発症するリスクがある、条項Ｃ１０４に記載の方法。
Ｃ１０６。対象に、菌血症を発症するリスクがある、条項Ｃ１０４に記載の方法。
Ｃ１０７。対象に、敗血症を発症するリスクがある、条項Ｃ１０４に記載の方法。

Ｃ１０８。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、Ｅ．ｃｏｌｉの対応する野生型Ｏ多糖と比較して少なくとも５個多い繰り返し単位を含む糖類とを含む組成物。
Ｃ１０９。糖類が式Ｏ２５ａを含み、Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５ａである、条項Ｃ１０８に記載の組成物。

Ｃ１１０。糖類が式Ｏ２５ｂを含み、Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２５ｂである、条項Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１１。糖類が式Ｏ２を含み、Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ２である、条項Ｃ１０８に記載の組成物。

Ｃ１１２。糖類が式Ｏ６を含み、Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ６である、条項Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１３。糖類が式Ｏ１を含み、Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１である、条項Ｃ１０８に記載の組成物。

Ｃ１１４。糖類が式Ｏ１７を含み、Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１７である、条項Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１５。糖類が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、５〜１０００の整数である）から選択される構造を含む、条項Ｃ１０８に記載の組成物。

Ｃ１１６。Ｅ．ｃｏｌｉが、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３、Ｏ２４、Ｏ２５、Ｏ２５ｂ、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、Ｏ１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７からなる群から選択されるＥ．ｃｏｌｉ血清型である、条項Ｃ１０８に記載の組成物。

Ｃ１１７。糖類が、グラム陰性菌においてｗｚｚファミリータンパク質を過剰発現させて前記糖類を生成することを含む培養下のグラム陰性菌によって産生されるＯ多糖の繰り返し単位を増大させることによって産生される、条項Ｃ１０８に記載の組成物。

Ｃ１１８。過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１、およびｗｚｚ２からなる群から選択される、条項Ｃ１１７に記載の組成物。

Ｃ１１９。過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢである、条項Ｃ１１７に記載の組成物。
Ｃ１２０。過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質が、ｆｅｐＥである、条項Ｃ１１７に記載の組成物。

Ｃ１２１。過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢおよびｆｅｐＥである、条項Ｃ１１７に記載の組成物。
Ｃ１２２。糖類が、合成的に合成されている、条項Ｃ１０８に記載の組成物。

Ｃ１２３。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質に共有結合した条項Ｃ１０８に記載の糖類を含むコンジュゲートとを含む組成物。
Ｃ１２４。担体タンパク質が、ＣＲＭ_１９７である、条項Ｃ１２３に記載の組成物。

Ｃ１２５。糖類が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、５〜１０００の整数である）から選択される構造を含む、条項Ｃ１２３に記載の組成物。

Ｃ１２６。前記糖類が、対応する野生型Ｏ多糖と比較して少なくとも５個多い繰り返し単位を含む、条項Ｃ１２３に記載の組成物。
Ｃ１２７。薬学的に許容される希釈剤をさらに含む、条項Ｃ１に記載の組成物。

Ｃ１２８。アジュバントをさらに含む、条項Ｃ１２７に記載の組成物。
Ｃ１２９。アルミニウムをさらに含む、条項Ｃ１２７に記載の組成物。
Ｃ１３０。ＱＳ−２１をさらに含む、条項Ｃ１２７に記載の組成物。

Ｃ１３１。アジュバントを含まない、条項Ｃ１２７に記載の組成物。
Ｃ１３２。条項Ｃ１２７に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。

Ｃ１３３。薬学的に許容される希釈剤をさらに含む、条項Ｃ１２３に記載の組成物。
Ｃ１３４。条項Ｃ１３３に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。

Ｃ１３５。免疫応答が、抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ特異的多糖血清抗体の誘発を含む、条項Ｃ１３２またはＣ１３４に記載の方法。
Ｃ１３６。抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ特異的多糖血清抗体が、ＩｇＧ抗体である、条項Ｃ１３５に記載の方法。

Ｃ１３７。抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ特異的多糖血清抗体が、Ｅ．ｃｏｌｉに対する殺菌活性を有するＩｇＧ抗体である、条項Ｃ１３５に記載の方法。
Ｃ１３８。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する糖類とを含む免疫原性組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合しており、担体タンパク質が、アミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合している、免疫原性組成物。

Ｃ１３９。薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含む、条項Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４０。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＯ抗原である、条項Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１４１。糖類が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、５〜１０００の整数である）から選択される構造を含む、条項Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１４２。糖類が、７５〜１００％のＯ−アセチル化度を有する、条項Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４３。担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、条項Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１４４。ＣＲＭ１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合したリジン残基を２〜２０個含む、条項Ｃ１４３に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４５。ＣＲＭ１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合したリジン残基を４〜１６個含む、条項Ｃ１４３に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１４６。追加の抗原をさらに含む、条項Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４７。アジュバントをさらに含む、条項Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４８。アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである、条項Ｃ１４７に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１４９。アジュバントを含まない、条項Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５０。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、担体タンパク質にコンジュゲートされたＥ．ｃｏｌｉに由来する糖類を含むグリココンジュゲートとを含む免疫原性組成物であって、グリココンジュゲートが、還元的アミノ化を使用して調製される、免疫原性組成物。

Ｃ１５１。薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含む、条項Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５２。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＯ抗原である、条項Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１５３。糖類が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、５〜１０００の整数である）から選択される構造を含む、条項Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１５４。糖類が、７５〜１００％のＯ−アセチル化度を有する、条項Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５５。担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、条項Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１５６。追加の抗原をさらに含む、条項Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５７。アジュバントをさらに含む、条項Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５８。アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである、条項Ｃ１５７に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１５９。アジュバントを含まない、条項Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１６０。条項Ｃ１３８〜Ｃ１５９のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。

Ｃ１６１。免疫応答が、抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ特異的多糖血清抗体の誘発を含む、条項Ｃ１６０に記載の方法。
Ｃ１６２。抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ特異的多糖血清抗体が、ＩｇＧ抗体である、条項Ｃ１３５に記載の方法。

Ｃ１６３。抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ特異的多糖血清抗体が、Ｅ．ｃｏｌｉに対する殺菌活性を有するＩｇＧ抗体である、条項Ｃ１３５に記載の方法。
Ｃ１６４。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７、（式中、ｎは、対応する野生型Ｅ．ｃｏｌｉ多糖における繰り返し単位数よりも大きい）のいずれか１つから選択される構造を含む糖類とを含む組成物。

Ｃ１６５。ｎが、３１〜１００の整数である、条項Ｃ１６４に記載の組成物。
Ｃ１６６。糖類が、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ６、ならびに式Ｏ２５Ｂのいずれか１つによる構造を含む、条項Ｃ１６４に記載の組成物。

Ｃ１６７。糖類が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するｗｚｚファミリータンパク質を発現する組換え宿主細胞において産生される、条項Ｃ１６４に記載の組成物。

Ｃ１６８。タンパク質が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４のいずれか１つを含む、条項Ｃ１６７に記載の組成物。
Ｃ１６９。糖類が、合成的に合成されている、条項Ｃ１６４に記載の糖類。

Ｃ１７０。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片と、糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、前記糖類が、式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７、（式中、ｎは、１〜１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む、組成物。

Ｃ１７１。糖類が、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ１Ａ、式Ｏ２、および式Ｏ６のいずれか１つを含む、条項Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７２。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１部分、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２部分、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３部分、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４部分、およびＥ．ｃｏｌｉＫ−１２部分のいずれか１つをさらに含む、条項Ｃ１７０に記載の組成物。

Ｃ１７３。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ１部分、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２部分、Ｅ．ｃｏｌｉＲ３部分、Ｅ．ｃｏｌｉＲ４部分、およびＥ．ｃｏｌｉＫ−１２部分のいずれか１つをさらに含まない、条項Ｃ１７０に記載の組成物。糖類が、Ｅ．ｃｏｌｉＲ２部分をさらに含まない、条項Ｃ１７０に記載の組成物。

Ｃ１７４。糖類が、３−デオキシ−ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含む、条項Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７５。担体タンパク質が、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無毒化された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの無毒化された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＡｃｒＡ、ならびにＣ．ｊｅｊｕｎｉの天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、条項Ｃ１７０に記載の組成物。

Ｃ１７６。担体タンパク質が、ＣＲＭ_１９７である、条項Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７７。担体タンパク質が、破傷風トキソイドである、条項Ｃ１７０に記載の組成物。

Ｃ１７８。糖類のタンパク質に対する比が、０．５以上２以下である、条項Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７９。コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される、条項Ｃ１７０に記載の組成物。

Ｃ１８０。糖類が、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項Ｃ１７０に記載の組成物。

Ｃ１８１。糖類が、単一末端結合コンジュゲート糖類である、条項Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１８２。糖類が、３−デオキシ−ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項Ｃ１７４に記載の組成物。

Ｃ１８３。コンジュゲートが、ＣＤＡＰ化学によって調製される、条項Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１８４。ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片、ならびに（ａ）式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、３１〜９０の整数である）を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、（ｂ）式Ｏ１Ａ（式中、ｎは、３１〜９０の整数である）を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、（ｃ）式Ｏ２（式中、ｎは、３１〜９０の整数である）を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、および（ｄ）式Ｏ６（式中、ｎは、３１〜９０の整数である）を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートを含む組成物。

Ｃ１８５。式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、および式Ｏ７５（式中、ｎは、３１〜９０の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む糖類に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートをさらに含む、条項Ｃ１８４に記載の組成物。

Ｃ１８６。組成物中の糖類の総量と比較して最大で２５％の遊離糖類を含む、条項Ｃ１８４に記載の組成物。
Ｃ１８７。条項Ｃ１８４〜Ｃ１８６のいずれか一項に記載の組成物を有効量で哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに対する免疫応答を生じさせる方法。

Ｃ１８８。免疫応答が、Ｅ．ｃｏｌｉに対するオプソニン食作用性抗体を含む、条項Ｃ１８７に記載の方法。
Ｃ１８９。免疫応答が、Ｅ．ｃｏｌｉ感染から哺乳動物を防御する、条項Ｃ１８７に記載の方法。

Ｃ１９０。（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードする第１の目的の遺伝子であって、少なくとも２つの組換え標的部位（ＲＴＳ）の間に組み込まれている遺伝子を含む哺乳動物細胞。

Ｃ１９１。２つのＲＴＳが、ＮＬ１座位またはＮＬ２座位で染色体に組み込まれている、条項Ｃ１９０に記載の態様。
Ｃ１９２。第１の目的の遺伝子が、レポーター遺伝子、発現困難なタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせをさらに含む、条項Ｃ１９０に記載の態様。

Ｃ１９３。（ａ）の座位とは異なる第２の染色体座に組み込まれた第２の目的の遺伝子をさらに含む、条項Ｃ１９０に記載の態様であって、第２の目的の遺伝子が、レポーター遺伝子、発現困難なタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む態様。

Claims

Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞。
前記ポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ線毛Ｈ（ＦｉｍＨ）に由来する、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのＮ末端にフェニルアラニン残基を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、Ｎ末端の最初の２０残基以内の位置にフェニルアラニン残基を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの１位にフェニルアラニン残基を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの１位にあるフェニルアラニン残基の直前にグリシン残基を含まない、請求項５に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの７位にＮ−グリコシル化部位を含まない、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの７位にＡｓｎ残基を含まない、請求項６に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎからなる群から選択される残基を７位に含む、請求項８に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの７０位にＮ−グリコシル化部位を含まない、請求項５に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの７０位にＡｓｎ残基を含まない、請求項１０に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの７０位にＳｅｒ残基を含まない、請求項１０に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位に、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎからなる群から選択される残基置換を含む、請求項１に記載の組換え細胞。
前記Ｎ−グリコシル化部位が、前記ポリペプチドのＮ２３５位を含む、請求項１３に記載の組換え細胞。
前記Ｎ−グリコシル化部位が、前記ポリペプチドのＮ２２８位を含む、請求項１３に記載の組換え細胞。
前記Ｎ−グリコシル化部位が、前記ポリペプチドのＮ２３５位およびＮ２２８位を含む、請求項１３に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、配列番号３を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、配列番号２を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの１位に脂肪族疎水性アミノ酸残基を含む、請求項１に記載の組換え細胞。
前記脂肪族疎水性アミノ酸残基が、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌからなる群から選択される、請求項１９に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、ＦｉｍＨの断片を含む、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、ＦｉｍＨのレクチンドメインを含む、請求項２１に記載の組換え細胞。
前記レクチンドメインが、約１７０２２ダルトンの質量を備える、請求項２２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、ＦｉｍＣポリペプチドまたはその断片と複合体を形成している、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ＦｉｍＣポリペプチドまたはその断片が、前記ＦｉｍＣポリペプチドまたはその断片の３７位にグリシン残基を含む、請求項２４に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、低親和性の立体構造にある、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、ＦｉｍＧによって安定化されている、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、ＦｉｍＧのドナー鎖ペプチド（ＤｓＧ）によって安定化されている、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリヌクレオチド配列が、リンカー配列をさらにコードする、請求項２８に記載の組換え細胞。
前記リンカーが、４個以上１５個以下のアミノ酸残基を含む、請求項２９に記載の組換え細胞。
前記リンカーが、５個以上１０個以下のアミノ酸残基を含む、請求項２９に記載の組換え細胞。
前記リンカーが、７個のアミノ酸残基を含む、請求項２９に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、天然のＦｉｍＨリーダーペプチド、インフルエンザ血球凝集素シグナルペプチド、およびヒト呼吸器多核体ウイルスＡ（Ａ２株）融合糖タンパク質Ｆ０シグナルペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチドを含まない、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、マウスＩｇＫシグナルペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ受容体ＦｃＲｎ大サブユニットｐ５１のシグナルペプチドおよびヒトＩＬ１０タンパク質のシグナルペプチドから選択されるいずれか１つのシグナルペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、配列番号３の番号付けによるアミノ酸６０位のアルギニンからプロリンへの変異（Ｒ６０Ｐ）を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドの発現レベルが、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の周辺質で発現する対応する野生型ポリペプチドの発現レベルよりも高い、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドの発現レベルが、１０ｍｇ／Ｌよりも高い、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリヌクレオチド配列が、前記哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリヌクレオチド配列が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１に記載の組換え細胞。
前記細胞が、ヒト胎児由来腎臓細胞である、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ヒト胎児由来腎臓細胞が、ＨＥＫ２９３細胞を含む、請求項４０に記載の組換え細胞。
前記ＨＥＫ２９３細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３ＴＳ細胞、およびＨＥＫ２９３Ｅ細胞のうちのいずれか１つから選択される、請求項４２に記載の組換え細胞。
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、またはＣＨＯ−Ｓ細胞である、請求項４４に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが可溶性である、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが前記細胞から分泌される、請求項１に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによるＮ２８Ｑ置換を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによるＮ２８Ｄ置換を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによるＮ２８Ｓ置換を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによるＮ２８Ｑ、Ｖ４８Ｃ、およびＬ５５Ｃのいずれか１つから選択される置換を含む、請求項２に記載の組換え細胞。
前記ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによる置換Ｎ９２Ｓを含む、請求項２に記載の組換え細胞。
ＦｉｍＨに由来する前記ポリペプチドまたはその断片が、配列番号１の番号付けによるＶ４８ＣおよびＬ５５Ｃのいずれか１つから選択される置換を含む、請求項１に記載の組換え細胞。
請求項１に記載の組換え細胞を含み、少なくとも５リットルのサイズである、培養物。
前記ポリペプチドまたはその断片の収量が、少なくとも０．０５ｇ／Ｌである、請求項４９に記載の培養物。
前記ポリペプチドまたはその断片の収量が、少なくとも０．１０ｇ／Ｌである、請求項５５に記載の培養物。
Ｅ．ｃｏｌｉに由来するポリペプチドまたはその断片を生成する方法であって、請求項１に記載の組換え哺乳動物細胞を好適な条件下で培養することにより、前記ポリペプチドまたはその断片を発現させるステップと、前記ポリペプチドまたはその断片を回収するステップとを含む方法。
前記ポリペプチドまたはその断片を精製するステップをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
前記細胞が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号２７のいずれか１つをコードする核酸を含む、請求項５７に記載の方法。
前記ポリペプチドまたはその断片の収量が、少なくとも０．０５ｇ／Ｌである、請求項５７に記載の方法。
前記ポリペプチドまたはその断片の収量が、少なくとも０．１０ｇ／Ｌである、請求項５７に記載の方法。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む組成物。
表１のいずれか１つの式から選択される構造を含む糖類をさらに含む、請求項６２に記載の組成物。
前記糖類が担体タンパク質に共有結合している、請求項６３に記載の組成物。
前記担体タンパク質が、ポリ（Ｌ−リジン）、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無毒化された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの無毒化された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅニューモリシンおよびその無毒化されたバリアント、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＡｃｒＡ、ならびにＣ．ｊｅｊｕｎｉの天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、請求項６４に記載の組成物。
前記担体タンパク質が、ＣＲＭ_１９７である、請求項６４に記載の組成物。
前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）である、請求項６４に記載の組成物。
前記担体タンパク質が、ポリ（Ｌ−リジン）である、請求項６４に記載の組成物。
前記糖類が、還元的アミノ化によって担体タンパク質に共有結合している、請求項６４に記載の組成物。
前記糖類が、ＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質に共有結合している、請求項６４に記載の組成物。
前記糖類が、単一末端結合コンジュゲーションによって担体タンパク質に共有結合している、請求項６４に記載の組成物。
前記糖類が、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合している、請求項６４に記載の組成物。
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。