CN105602980B - 一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，所述方法为敲除产荚膜多糖细菌waaR基因，获得细菌突变株；将细菌突变株经发酵培养，取培养液分离纯化，得到降低分子量的多糖；本发明提供了一种通过基因工程手段改造产荚膜多糖细菌，以获得更低分子量的多糖产物，该方法可适用于E.coli，所述方法为敲除产荚膜多糖细菌waaR基因，实现保持多糖产能而降低了目的多糖平均分子量。

Description

一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种降低多糖分子量的方法，通过基因工程手段敲除细菌waaR基因，通过多糖电泳、GPC检测验证，发现突变菌株合成的多糖分子量比改造前低，实现了在保持多糖产量的同时进一步获得更低分子量产物的目的。
(二)背景技术
肝素(heparin)是一种含硫酸酯的粘多糖，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，具有抗凝血和抗血栓作用。肝素虽然广泛应用于抗凝血，但是会对人体产生一定的副作用，例如造成出血并发症以及血小板减少等症状，这在一定程度上限制了它的应用。而低分子量的肝素(low molecular weight heparin，LMWH，分子量小于8000Da，平均大小为5000Da)不仅保持了抗凝血的功能，而且产生的副作用也大大减小。由于分子量低以及多分散性程度的下降，低分子量肝素表现出了更好的药代动力学特征，半衰期变长，生物利用率高，使用也更安全，更重要的是大大降低了肝素药物易导致出血、血小板减少和骨质疏松等副作用。因此，低分子量肝素已经逐渐替代传统的肝素，更广泛的应用于临床治疗，目前低分子肝素类在肝素类药物用量比重中占了80％以上。
从制备方法来看，低分子量肝素可以通过物理法，化学法以及酶法得到。物理分离法是从未分级的肝素(Unfractionated Heparin，UFH)中分离得到低分子量肝素，但是该方法需要添加有机溶剂，会影响产物的质量。而且在UFH中，低分子量肝素含量有限，因此该方法不适合应用于低分子量肝素的大规模生产。利用过氧化氢和亚硝酸化学解聚生产低分子量肝素已经广泛应用于工业生产，但是仍然存在很多缺点，例如造成环境污染，过程不易控制，氧化剂与heparin分子硫酸基团之间的剧烈反应会造成低分子量肝素药用活性的降低等。Escherchia.coli K5的荚膜多糖中有结构为(-GlcUA-1,4-GlcNAc-1,4-)n，其二糖骨架结构与脊椎动物中的肝素类似，但未硫酸化，也没有将葡糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸，故又称为肝素前体(heparosan)。1992年，Nielesen等应用肝素酶I解聚高分子量肝素成功制得LMWH，证明了应用酶法制备低分子量肝素的可行性。相对于化学法，酶法具有反应条件温和，特异性强，环境友好型等优点，目前酶法制备仍处于实验室研究阶段，但以heparosan为合成前体进行化学或酶法修饰得到特定功能肝素及其衍生物是越来越受到关注。通过不同的解聚方法制成的不同品种的低分子肝素，其药物动力学特性和抗凝谱有不同程度的差别，在临床上不能相互代替。目前，已开发出十几种低分子肝素产品，如已在临床应用的依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙、舍托肝素钠、亭扎肝素钠、瑞肝素钠等。
大肠杆菌细胞表面有脂多糖，肠杆菌共同抗原以及荚膜多糖或者K抗原。这些多糖分子之间相互作用，共同维持细胞表面多糖组织结构的稳定。waaR基因编码α-1,2-糖基转移酶，能够将第三个葡萄糖残基(GLcIII)添加到外核。waaR基因功能缺失的突变株合成的外核将缺失GicIII和HepIV末端残基片段，影响脂多糖结构的稳定。E.coli K5多糖通过其还原端的脂质替代物与外膜磷脂酸分子结合连接于细胞表面。磷酸二酯键的不稳定会导致heparosan从细胞表面脱落，富集于培养基中。目前已有研究证明waaR基因的缺失不会影响E.coli K5多糖的合成，但对于具体缺失后是否会对其多糖产量和多糖物质结构变化的深入研究未有相关报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，即利用Escherichia coli K5 △waaR制备低分子量heparosan的方法，实现保存多糖产能而降低了目的多糖平均分子量。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，所述方法为敲除产荚膜多糖细菌waaR基因，获得细菌突变株；将细菌突变株经发酵培养，取培养液分离纯化，得到降低分子量的多糖(即肝素前体)。
进一步，所述waaR基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述细菌为大肠杆菌，优选为E.coli K5。
进一步，所述敲除产荚膜多糖细菌waaR基因的方法为：将质粒pKD46电转入细菌细胞(优选E.coli K5)，在含50-100μg/mL(优选100μg/mL)氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，获得含pKD46的细菌细胞；以质粒pKD4为模板，在引物P1、P2作用下，PCR合成两端为waaR基因同源臂，中间为抗性标记的打靶片段，获得打靶DNA；将打靶DNA与含pKD46的细菌感受态细胞进行电转化，并在含50-100μg/mL(优选100μg/mL)卡那霉素的LB平板上进行抗性筛选，获得敲除waaR基因的细菌突变株；
P1：
TTATTTACGGTAATATTTTCGGCAAAGATAACACACTCCTGCAATGAGTCCTGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC；
P2：
GTGGACTCATTTCCTGCCATAGAGATAGATAAAGTTAAAGCCTGGGATTTTAGGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC。
进一步，所述发酵培养方法为：将细菌突变株接种至发酵培养基，在30-37℃、120-200rpm培养24-33小时(优选37℃、200rpm培养24小时)，发酵结束后将发酵液在8000-10000rpm离心10-30min(优选10000rpm离心30min)，弃去菌体，得发酵上清液，将发酵上清液分离提取，获得降低分子量的肝素前体；所述发酵培养基：十二水合磷酸氢二钠10-25g/L，磷酸氢二钾0.2-2g/L，氯化铵2-6g/L，葡萄糖10-30g/L，盐酸硫胺素5-100mg/L，5-20mL/L痕量元素，pH 7.0～7.2，溶剂为水(优选去离子水)；痕量元素组成为:七水合硫酸亚铁2-20g/L，氯化钙0.2-4g/L，七水合硫酸锌0.2-10g/L，四水合硫酸锰0.1-2g/L，五水合硫酸铜0.2-2.0g/L，四水合钼酸铵0-0.2g/L，十水合四硼酸钠0-0.2g/L，溶剂为5mol/L HCl水溶液；优选所述发酵培养基终浓度组成为：十二水合磷酸氢二钠22.60g/L，磷酸氢二钾0.45g/L，氯化铵4g/L，葡萄糖20g/L，盐酸硫胺素10mg/L，10.0mL/L痕量元素，pH 7.0～7.2，溶剂为水；痕量元素组成为:七水合硫酸亚铁10.0g/L，氯化钙2.0g/L，七水合硫酸锌2.2g/L，四水合硫酸锰0.5g/L，五水合硫酸铜1.0g/L，四水合钼酸铵0.1g/L，十水合四硼酸钠0.02g/L，溶剂为5mol/L HCl水溶液。
进一步，所述发酵上清液分离纯化的方法为：将发酵上清液用体积浓度1.0-2.0％(优选1.5％)的过氧化氢水溶液脱色，4-25℃(优选4℃)过夜后，离心去除沉淀，取上清用质量浓度50-70％(优选65％)饱和硫酸铵进行发酵液盐析，4-25℃(优选4℃)存放过夜；次日8000-10000rpm，10-30min(优选10000rpm，30min)离心，沉淀物用200-3000Da(优选500Da)透析袋进行透析脱盐，浓缩并冻干，获得降低分子量的肝素前体。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种通过基因工程手段改造产荚膜多糖细菌，以获得更低分子量的肝素前体，该方法可适用于E.coli，所述方法为敲除产荚膜多糖细菌waaR基因，突变菌株进行发酵培养，保持多糖产能而降低了目的多糖平均分子量。
(四)附图说明
图1为突变菌株PCR验证，泳道1为E.coli K5出发菌株的PCR产物，泳道2为E.coliK5ΔwaaR(简称为E.coli KT)突变菌株的PCR产物，泳道3为Marker。
图2为E.coli K5(A)和突变菌株E.coli KT(B)的电镜图。
图3为E.coli K5菌株和突变菌株E.coli KT发酵情况的比较图。
图4为多糖PAGE图谱，1为突变菌株0.6mg/mL E.coli KT多糖样品；2&3分别为0.5mg/mL和1mg/mL E.coli K5多糖样品；4为2mg/mL Heparin Sodium；5为1mg/mL HeparinSodium样品。
图5为E.coli K5多糖GPC分子量分布图。
图6为E.coli KT多糖GPC分子量分布图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：E.coli K5 waaR基因敲除
按照说明书(E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit)进行E.coli K5基因组提取。根据NCBI上提交的E.coli strain F632waaR基因(GenBank:AF019375.1)以及该基因的附近碱基序列，分别从离该基因上游65bp和下游58bp处设计引物WY1和WY2用于扩增E.coli K5waaR基因，并使该基因两端带有额外碱基序列，以用于测序。以E.coli K5基因组为模板，在引物WY1和WY2作用下，PCR扩增获得E.coli K5 waaR基因(SEQ ID NO.1所示)。设计敲除引物P1和P2用于扩增卡那霉素抗性基因(加有下划线的序列为同源臂，小写字母为扩增pKD4上kan基因的引物)，并使扩增片段两侧带有56bp的waaR基因同源臂。
按照说明进行质粒pKD46与质粒pKD4提取(E.Z.N.ATM Plasmid Mini Kit，OMEGA)，用电转化仪(Gene Pulser Xcell，BIO-RAD)将质粒pKD46转入E.coli K5，进行E.coli K5/pKD46的制备(电转化参数2500V，25μF，200Ω)，100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行抗性筛选。以质粒pKD4为模板，在引物P1、P2的作用下，PCR合成含有两端waaR基因同源臂，中间为抗性标记的打靶片段，以制备打靶DNA，与E.coli K5/pKD46感受态细胞进行电转化(电转化参数2500V，25μF，200Ω)，并在100μg/mL卡那霉素的LB平板上进行抗性筛选，获得敲除waaR基因的E.coli K5突变株E.coli KT。
打靶DNA PCR合成体系为：5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP mixture 4μL，P1和P2各1.50μL，模板0.40μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.60μL，用灭菌蒸馏水补足至50μL。
打靶DNA PCR合成条件为：
Step 1：95℃5min；
Step 2：94℃50s，65℃45s(-0.5℃，R＝3.0°/s，touch down65-55℃)，72℃90s，20个循环；
Step 3：94℃50s，55℃45s，72℃90s，20个循环；
Step 4：72℃，10min；Hold 16℃。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳法验证，并结合切胶回收DNA片段，进行测序和序列比对，结果见图1。E.coli K5中WY1和WY2引物之间的碱基长1140bp，而突变株E.coli KT中该对引物之间的碱基长1731bp。从图1可以发现，突变株E.coli KT的条带位于1500-2000bp之间，明显大于E.coli K5出发株的条带大小，与理论结果相符合，初步验证基因的置换成功。
表1引物序列
注：表1中加有下划线的序列为同源臂，小写字母为扩增pKD4上kan基因的引物。引物WY1和WY2用于扩增E.coli K5 waaR基因和检测重组菌株。
实施例2：电镜验证突变菌株的细胞形态
采用负染色法对突变菌株E.coli KT的细胞形态进行观察。将实施例1中制备的突变菌株E.coli KT和出发菌株E.coli K5接种在LB琼脂糖培养基中，在37℃培养16-18h，取在LB琼脂糖培养基中生长的出发株和突变株菌体少许，用1-2％的磷钨酸(PTA，pH6.5-7.0)染色5-10秒后，透射电镜观察，拍照，结果见图2。
通过比较出发株和突变株细胞表面形态，发现出发株细胞表面存在一层毛绒状的物质，应为荚膜多糖层，而突变株表面较为光滑，未见荚膜。这与突变株waaR基因缺失相关，该菌株未能表达脂多糖(LPS)α-1,2-葡萄糖糖基转移酶，破坏脂多糖外核生物合成，影响了荚膜多糖在细胞表面的连接。
实施例3：突变菌株的发酵情况
采用葡萄糖合成培养基(即发酵培养基)进行突变菌株E.coli KT的发酵培养，将实施例2筛选的突变菌株E.coli KT接种至葡萄糖合成培养基，培养温度37℃，培养时间24小时，转速200rpm，发酵结束后，在10000rpm，30min进行发酵液菌液分离，弃去菌体，得发酵上清液。发酵上清液用体积浓度1.5％的过氧化氢水溶液脱色，4℃过夜后，离心去除沉淀，再分别用质量浓度65％饱和硫酸铵进行发酵液盐析，防爆冰箱存放过夜。次日10000rpm，30min离心，沉淀物进行透析脱盐(500Da透析袋)，浓缩并冻干得多糖粗品，并对其多糖含量进行测定，heparosan产量为0.45g/gDCW，结果见图3。
发酵培养基组成为(1L DI water):十二水合磷酸氢二钠22.60g/L，磷酸氢二钾0.45g/L，氯化铵4g/L，葡萄糖20g/L，盐酸硫胺素10mg/L，10.0mL/L痕量元素，pH 7.0～7.2，溶剂为去离子水；痕量元素组成为:七水合硫酸亚铁10.0g/L，氯化钙2.0g/L，七水合硫酸锌2.2g/L，四水合硫酸锰0.5g/L，五水合硫酸铜1.0g/L，四水合钼酸铵0.1g/L，十水合四硼酸钠0.02g/L，溶剂为5mol/L HCl水溶液。
同样条件下，将E.coli K5进行发酵提取，获得K5多糖。
实施例4：凝胶多糖电泳验证突变菌株E.coli KT多糖结构
将实施例3从E.coli K5和E.coli KT发酵并分离纯化获得的K5多糖、KT多糖以及Heparin Sodium(MW 6000-20000Da，购自生工生物工程有限公司)分别与上样缓冲液制备0.6mg/mL E.coli KT多糖样品，0.5mg/mL K5多糖样品、1mg/mL E.coli K5多糖样品；2mg/mL Heparin Sodium样品，1mg/mL Heparin Sodium样品，35μL上样电泳，电泳仪为PROTEANII xi Cell(BIO-RAD,USA)，电源为Power PacTM Universal Power Supply(BIO-RAD,USA)。多糖的PAGE试验如下描述：
1)将洗净的玻璃板置于制胶器中，注满蒸馏水检漏。
2)制备不同浓度的分离胶：35mL 22％的分离胶缓冲液，500μL 10％的过硫酸铵，50μL 10％的TEMED。混合均匀后缓缓加入到胶槽中，注满蒸馏水于室温下凝聚。
3)制备浓缩胶：将分离胶上层的蒸馏水尽量吸干，将梳子插入胶槽中。配制浓缩胶：15mL 5％的浓缩胶缓冲液，500μL 10％的过硫酸铵，50μL 10％的TEMED。充分混匀后向胶槽中缓慢加入浓缩胶，于室温下凝聚。
4)待浓缩胶凝聚后，小心将梳子从胶槽中拔出。
5)将胶板从制胶器中取出放于电泳主体两侧，加入电极缓冲液注满胶孔。
6)上样后，200V恒压电泳。
7)待电泳至胶板最底部2～4cm时，停止电泳。小心从玻璃板中剥取凝胶。
8)凝胶于0.5％Alcian Blue中染色30min，并清水脱色过夜后进行凝胶扫描。
其中电泳所需溶液配制情况如下：
Tris-硼酸缓冲液(1L)：6.183g硼酸，12.11g Tris，3.72g EDTA-Na2，加入900mL蒸馏水，调pH至8.3后再定容到1L。
22％分离胶缓冲液(1L)：200.20g丙烯酰胺，20.00g甲叉双丙烯酰胺，加Tris-硼酸缓冲液定容到1L。
5％浓缩胶缓冲液(1L)：47.50g丙烯酰胺，2.50g甲叉双丙烯酰胺，加入800mLTris-硼酸缓冲液，调pH至6.3后定容到1L。
10％过硫酸铵(1mL)：0.1g过硫酸铵，加1mL蒸馏水。
10％TEMED(10mL)：1mL过硫酸铵，加9mL蒸馏水。
0.5％爱尔新蓝(250mL)：1.25g Alcian Blue，加1.5％乙酸溶解定容到250mL。
0.1％苯酚红：0.01g苯酚红加入10mL蒸馏水。
上样缓冲液：2mL的0.1％苯酚红，8mL的25％蔗糖。
电泳缓冲液(1L)：93g甘氨酸，24.2g Tris用900mL蒸馏水溶解后定容到1L。
从图4可以看出，E.coli K5多糖呈现清晰的电泳条带，从分子量高至低分别展开，而E.coli KT多糖明显在高分子量区域比例低，而较多集中在低分子量区域，尤其在尾端有较大的集中。并且也可以看出适当提高分离胶浓度能让E.coli KT电泳条带更清晰。
实施例5：GPC测定突变菌株E.coli KT多糖分子量
将实施例3方法制备的K5多糖和KT多糖分别用纯水配制成2mg/mL的样品溶液，进行GPC的测定(Agilent1100)。液相条件为：以纯水为流动相、流速1min/mL，上样量20uL，保留时间20min，柱子为PL aquagel-OH，RID检测器进行检测。
E.coli K5制备的K5多糖样品进样浓度为2mg/mL，在5.176min出峰，占62.5031％，且没有其他很明显的杂峰，表明是分子量较均一，样品中杂质较少，结果见图5。突变菌株E.coli KT制备的KT多糖样品2mg/mL，在6.758min出峰，占总峰面积的77.93％，结果见图6。根据GPC原理，随着出峰时间的推移，物质分子量随之变小，从而可以表明突变菌株E.coliKT多糖平均分子量比E.coli K5为小。

Claims (2)

1.一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，其特征在于所述方法为敲除E.coli K5的waaR基因，获得E.coli K5突变株；将E.coli K5突变株接种至发酵培养基，在30-37℃、120-200rpm培养24-33小时，发酵结束后将发酵液在8000-10000rpm离心10-30min，弃去菌体，得发酵上清液，将发酵上清液用体积浓度1.0-2.0％的过氧化氢水溶液脱色，4-25℃过夜后，离心去除沉淀，取上清液用质量浓度50-70％饱和硫酸铵进行盐析，4-25℃存放过夜；次日8000-10000rpm离心10-30min，沉淀物用200-3000Da透析袋进行透析脱盐，浓缩并冻干，得到降低分子量的肝素前体；所述发酵培养基组成为：十二水合磷酸氢二钠10-25g/L，磷酸氢二钾0.2-2g/L，氯化铵2-6g/L，葡萄糖10-30g/L，盐酸硫胺素5-100mg/L，5-20mL/L痕量元素，pH 7.0～7.2，溶剂为水；痕量元素组成为:七水合硫酸亚铁2-20g/L，氯化钙0.2-4g/L，七水合硫酸锌0.2-10g/L，四水合硫酸锰0.1-2g/L，五水合硫酸铜0.2-2.0g/L，四水合钼酸铵0-0.2g/L，十水合四硼酸钠0-0.2g/L，溶剂为1-5mol/L HCl水溶液。
2.如权利要求1所述降waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，其特征在于所述敲除E.coli K5waaR基因的方法为：将质粒pKD46电转入E.coli K5细胞，在含50-100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，获得含pKD46的E.coli K5细胞；以质粒pKD4为模板，在引物P1、P2作用下，PCR合成两端为waaR基因同源臂，中间为抗性标记的打靶片段，获得打靶DNA；将打靶DNA与含pKD46的E.coli K5感受态细胞进行电转化，并在含50-100μg/mL卡那霉素的LB平板上进行抗性筛选，获得敲除waaR基因的E.coli K5突变株；
P1：
TTATTTACGGTAATATTTTCGGCAAAGATAACACACTCCTGCAATGAGTCCTGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC；
P2：
GTGGACTCATTTCCTGCCATAGAGATAGATAAAGTTAAAGCCTGGGATTTTAGGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC。
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