JP2009538147A - プラスミドdna調製物およびそれらの作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の様々な実施形態は、一般的に、プラスミドDNA調製物ならびにそれらの作製方法および使用方法に関する。
プラスミドDNAは、ヒトおよび動物の多くの疾患に有望な治療薬である。これらのプラスミドDNAの多くは、化学合成によって作製するには大きすぎ、したがって、宿主細胞において増殖させることによって最も効率よく産生され、この宿主は栄養培地上で高密度になるまで増殖する。このDNAは、その後宿主細胞から回収される。複雑な混合物からのプラスミドDNAの単離および精製には、多数の精製段階が関与する。最初の段階は、消費されなかった栄養分ならびに細胞老廃物から構成される発酵培地からの細胞の濃縮を含む。次の段階には、細胞を溶解または破壊することが必要であり、これによって対象のプラスミドDNAを含む細胞構成物の複雑な生化学的混合物が生じる。これらは通常、プラスミドDNAを分解し得る酵素活性を最小限に抑えるため、カオトロピック塩の存在下で行うか、またはDNA分解を最小限にする酵素阻害剤と併用した圧力セル、超音波処理器、流体力学的剪断装置、もしくはビーズビーターなどを用いた機械的手段によって実現することができる。プラスミド調製の次の段階では、遠心、示差的沈殿(differential precipitation)もしくは濾過によって膜、変性タンパク質および大きな染色体DNA断片などの不溶性物質から可溶性プラスミドDNAを物理的に分離する。これによってプラスミドDNAを含有する透明な溶解物が生じ、これはさらに、直接沈殿、相分配または様々な樹脂にイオン交換もしくは疎水性相互作用法およびそれらの組合せによって吸着させることによって精製することができ、その後プラスミドDNAを沈殿もしくは相分配することができる。クロマトグラフィー精製は、バッチもしくはカラムクロマトグラフィー法によって実施することができ、適合イオンによる間接的、または直接的吸着法が関与し得る。これらの方法は全て、当業者には公知であり、各段階は不純物およびプラスミドDNAから混入物を除去するように設計される。精製法は全て、プラスミドDNAを単離する材料の量および複雑さを低下させることによって改善することができる。これには、培地中の潜在的な混入物および宿主細胞によって産生された物質が含まれる。
一実施形態では、本発明はプラスミドDNA調製物を提供する。他の実施形態では、プラスミドDNAは、低下した内毒素レベルを含む。このようなプラスミドDNA調製物の作製方法および使用方法も提供する。一実施形態では、プラスミドDNAは、a)多重欠失株細菌においてプラスミドDNAを増殖させるステップと、b)多重欠失株細菌を溶解して溶解物を生成するステップと、c)溶解物からプラスミドDNAの少なくとも一部を単離し、単離プラスミドDNAを精製するステップとを含む方法によって調製される。リポ多糖および/または腸内共通抗原の産生に関与する遺伝子を欠如している多重欠失株細菌も提供する。
本発明は、様々な形態で実施することができるが、本発明の開示は本発明の例としてみなすべきものであって、例示した特定の実施形態に本発明を限定するものではないことを理解して、以下にいくつかの実施形態を説明する。表題は、都合上付けられているだけであって、本発明をどのような方法によっても制限するものではない。表題の下に例示した実施形態は、その他の表題の下に例示した実施形態と一緒にすることができる。
細胞は、1リットル振盪フラスコ内で酵母抽出物、トリプトンをベースにした培地中で37℃で増殖させた。精製されたスーパーコイルプラスミドは、当技術分野で周知の方法を使用して、低速遠心、細胞溶解および不溶性残渣の除去によって調製した(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley and Sons、2001年を参照のこと)。プラスミドDNAは、イオン交換クロマトグラフィー、次いで疎水性樹脂による適合イオン分離によってさらに精製した。得られたプラスミドDNA中の内毒素のレベルは、表1に示した様に、LAL色素発色速度アッセイ(Endochrome−K(商標)、Charles River Laboratories)によって試験した。
CMVプロモーターおよびアミノグリコシドG418に対する耐性をコードする遺伝子に転写的に結合させた緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子を含有するプラスミドを、吸着精製段階でシリカゲル膜を使用する市販のプラスミド単離キット(QIAprep Spin column、Qiagen、Valencia、CA)によって様々な細菌宿主株から単離した。これらのプラスミド調製物の毒性をCOS1サル腎細胞形質移入アッセイで試験した。このアッセイでは、COS1細胞2.5×104個に添加したプラスミドDNA4μgのリポソーム媒介形質移入、その後選択培地での24時間増殖を行う。リポソーム媒介形質移入反応は、当技術分野では周知で、多くの資料、例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley and Sons、2001年)に記載されている。各培養皿から顕微鏡の視野を無作為に10カ所選択して、各視野内の全細胞数を計数した。FITCフィルター(488nmカットオフ)を使用して各視野内のGFPを発現する細胞を識別し、GFP発現細胞の数を細胞の全数で除することによって全形質転換効果を算出した。試験を2回行い、結果を表2に示す。
内毒素に関連した毒性について、実施例2で説明したのと同じプラスミドおよび組織培養系でさらに試験を実施した。この場合、COS1細胞1.0×105個にリポフェクション試薬に溶かしたプラスミドDNA4μgを添加して、その後非選択培地で24時間増殖させることによって形質移入を実施した。培養物を0.3%トリパンブルー色素で染色し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄して死細胞を除去した。各培養皿から顕微鏡の視野を無作為に10カ所選択して、各視野内の全細胞数を計数した。試験を2回実施し、結果を表3に示す。
Claims (21)
- 内毒素レベルの低下したプラスミドDNAの作製方法であって、
a)多重欠失株細菌において前記プラスミドDNAを増殖させるステップと、
b)前記多重欠失株細菌を溶解して溶解物を生成するステップと、
c)前記溶解物から前記プラスミドDNAを単離して、単離プラスミドDNAを形成するステップと、
d)前記単離プラスミドDNAを精製するステップと
を含む方法。 - 前記多重欠失株細菌が大腸菌多重欠失株である、請求項1に記載の方法。
- 前記大腸菌多重欠失株が機能的msbB遺伝子を欠如している、請求項2に記載の方法。
- 前記大腸菌株が最小培地中で原栄養性である、請求項3に記載の方法。
- 前記多重欠失株が、リポ多糖の産生に関与する1種または複数種の遺伝子を欠如している、請求項1に記載の方法。
- 前記大腸菌多重欠失株が、腸内共通抗原の産生に関与する1種または複数種の遺伝子を欠如している、請求項2に記載の方法。
- 前記プラスミドDNAが、内毒素除去剤でプラスミドDNAを精製する前に、内毒素を200EU/mgDNA未満含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記プラスミドDNAが、内毒素除去剤で前記プラスミドDNAを精製する前に、内毒素を50EU/mgDNA未満含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記プラスミドDNAが、内毒素除去剤でプラスミドDNAを精製する前に、内毒素を0.1EU/mgDNA未満含有する、請求項1に記載の方法。
- リポ多糖の産生に関連した1種または複数種の遺伝子を欠如している大腸菌多重欠失株。
- 腸内共通抗原の産生に関与する1種または複数種の遺伝子を欠如している大腸菌多重欠失株。
- 機能的msbB遺伝子を欠如している大腸菌多重欠失株。
- リポ多糖の産生に必要な1種または複数種の遺伝子を欠如している大腸菌。
- 腸内共通抗原の産生に必要な1種または複数種の遺伝子を欠如している大腸菌。
- 請求項1に記載の方法によって調製されたプラスミドDNA。
- 前記プラスミドDNAが、前記多重欠失株細菌と同種の非多重欠失株細菌で増殖させた、その他の点では類似しているプラスミドDNAと比較して、少なくとも5%低下した内毒素レベルを含有する、請求項15に記載のプラスミドDNA。
- 前記プラスミドDNAが、前記多重欠失株細菌と同種の非多重欠失株細菌で増殖させた、その他の点では類似しているプラスミドDNAと比較して、少なくとも50%低下した内毒素レベルを含有する、請求項15に記載のプラスミドDNA。
- 前記プラスミドDNAが、前記多重欠失株細菌と同種の非多重欠失株細菌で増殖させた、その他の点では類似しているプラスミドDNAと比較して、少なくとも95%低下した内毒素レベルを含有する、請求項15に記載のプラスミドDNA。
- プラスミドDNAと任意の内毒素除去剤との任意の接触の前に、内毒素濃度が約100U/mg未満である細菌産生プラスミドDNA。
- プラスミドDNAと任意の内毒素除去剤との任意の接触の前に、内毒素濃度が約5EU/mg未満である、請求項19に記載の細菌産生プラスミドDNA。
- プラスミドDNAと任意の内毒素除去剤との任意の接触の前に、内毒素濃度が約0.2EU/mg未満である、請求項19に記載の細菌産生プラスミドDNA。
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