KR20000075663A

KR20000075663A - 높은 항혈전용해 활성을 갖는 글리코스아미노글리칸

Info

Publication number: KR20000075663A
Application number: KR1019997007729A
Authority: KR
Inventors: 카수베니토; 나기안나마리아; 토리지안지아코모
Original assignee: 이날코에스피에이
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 2000-12-26
Also published as: JP2001518133A; DE69806468T2; WO1998042754A2; CA2285383A1; WO1998042754A3; EP0970130A2; ES2180161T3; EP0970130B1; DE69806468D1; ATE220410T1; US6197943B1; CA2285383C; DK0970130T3; AU7040598A; ITMI970678A1; IT1290814B1

Abstract

본 발명은 시험관내에서 높은 항혈전용해 활성을 갖는 글리코스아미노글리칸에 관한 것이다. 상기 글리코스아미노글리칸은, 출발 과황산화 글리코스아미노글리칸의 유기 염기의 염을 제조하고, 상기 염을 부분적으로 가용매 탈황산화한 다음, 상기 부분적으로 탈황산화된 생성물을 N-재황산화함으로써 여러가지 종류의 글리코스아미노글리칸으로부터 얻어진다.

Description

높은 항혈전용해 활성을 갖는 글리코스아미노글리칸{Glycosaminoglycans having high antithrombotic activity}

헤파린(heparin)은 항응고제 및 항혈전용해제로서 50년 이상동안 이용되어온 것으로, 동물의 기관으로부터 추출되는 다당류이다. 황산헤파란과 함께, 헤파린은 우론산(아이두론산 또는 글루쿠론산)과 글루코스아민으로 번갈은 서열로 이루어지는 글리코스아미노글리칸류에 속한다. 상기 글리코스아미노글리칸류는 이것이 얻어지는 조직 및 동물종에 따라, 그리고 어느 정도까지는 분리 과정에 따라, 여러가지로 황산화된다.

헤파린의 구조는 하기 일반식(I)으로 표시될 수 있다.

R=SO₃또는 H

R'=SO₃또는 Ac

상기 식에서, U 단위는 아이두론산(IdoA) 또는 글루쿠론산(GlcA)을 나타내고 A 단위는 N-황산화된 글루코스아민(GlcNAc)을 나타내며, R₂, R₃, 및 R₆는 황산기 또는 수소를 나타내고 R'은 SO₃또는 Ac를 나타낸다.

임상에서 사용되는 헤파린에서 가장 대표적인 서열은 삼황산화된 이당류(idoA2SO₃-GlcNSO₃6SO₃)를 가지는 것이다. 그와 반대로, 보통의 헤파린을 형성하는 사슬들의 약 1/3에만 함유되는 것으로, 위치 3에서 황산화되고 항트롬빈 III에 대한 헤파린 및 황산 헤파란의 활성 부위를 형성하는 글리코스아민 단위(GlcNSO₃3SO₃)에 특징이 있는 보다 적은 오당류 서열은, 중요한 항응고 및 항혈전용해 활성에 필수적인 것이다. 상기 3-O-황산화된 글루코스아민 단위는 상기 활성 부위의 표지(marker)로 간주된다. 그리고, X 활성화(Xa) 및 트롬빈(IIa) 응고 인자의 억제 능력으로 일반적으로 나타내어지는 항혈전용해 활성은 상기 헤파린에서 상기 글루코스아민 단위의 함량%와 상관될 수 있다.

또한, 헤파린 및 황산 헤파란의 항응고 및 항혈전용해 특성은 이들을 구성하는 다당류 사슬의 길이에 따라 조절될 수 있다.

예를들어, 저분자량을 갖는 헤파린(LMWH)은 통상적인 헤파린과 유사한 항혈전용해 활성 및 더욱 낮은 항응고 활성을 갖는다. 그리고 이러한 헤파린은 특히 출혈 위험 및 혈소판 감소증과 같은 헤파린의 다른 부작용을 감소시키기 위하여 몇 몇의 용도로 상기 통상적인 헤파린을 대체할 수 있다. 또한, 상기 LMWH는 정맥 혈전증의 방지에 일반적인 것이므로, 피하 경로로 투여되는 때 상기 통상적인 헤파린보다 더 좋은 생물학적이용효능을 가지는 점에서 특징이 있다. 참조 문헌[B. Casu Heparin structure, Hemostasis 20/1, 66-73(1990); 및 D.A. Lane, J.Bjork, U. Lindall(발행). Heparin and Related Polysaccharides, Plenum Press, New York, 1992].

상술한 바와같이, 항혈전용해 활성에 가장 신뢰할 수 있는 헤파린의 오당류 서열은 천연 헤파린 사슬의 약 1/3에만 함유되어 있기 때문에, 상기 서열을 함유하는 사슬을 농축하거나, 또는 활성 부위를 이미 함유하는 사슬 또는 상기 활성 부위가 없는 것들에서 새로운 활성 부위를 발생시킴으로써, 상기 항혈전용해 활성을 강화하는 것이 실제적으로 중요하다. 항트롬빈 III에서 친화성 크로마토그래피하거나 또는 덜 효과적이지만 헤파린을 양이온 수지로 처리함으로써 달성될 수 있는 상기 첫번째 목표(즉, 사슬 농축)는, 일반적인 헤파린의 실제적인 부분(약2/3)을 사용하지 못하기 때문에, 값비싼 것으로 판단된다.

다른 한편으로, 항트롬빈(antithrombin)에 대한 활성 부위를 발생하기 위한 상기 두번째 목표는 항트롬빈에 대한 활성 부위가 과량의 황산기에 의해 감추어지는 구조를 생성하는 고전적인 방법들을 이용하여 헤파린을 황화시키는 것에 의해서는 달성될 수 없다. 뜻밖에도 이와같은 생성물은 대부분 항트롬빈에 의해 조절되는 것들과 상이한 작용 매커니즘에 따라 출발 헤파린보다 더 높은 항응고 활성을 나타내지만, 상기 생성물은 항혈전용해제로서는 일반적으로 헤파린보다 활성이 작고, 또 이들은 다른 혈장 단백질과의 비특이적 상호작용으로 인해 바람직하지 않은 부작용을 발생할 수 있다. 참조문헌[B. Casu, Structure and biological activity of heparin, Advance Carbohydr. Chem. Biochem. 43, 51-134 (1985)].

다른 한편으로, 부분 또는 전체적으로 탈황산화된 헤파린을 재황산화함으로써 헤파린의 활성 서열을 재구성하게 되면, 항혈전용해 활성이 강화되기 보다는 오히려 감소한다. 이러한 결과는 아이두론 단위(iduronic unit)가 위치 2보다는 위치 3에서 황산화될 수 있고, 및/또는 글루코스아민 단위(glucosaminic unit)의 위치 3에서의 황산화가 불충분하기 때문이다. 참조문헌[R. N. Rej, K. G. Ludwig-Baxter, A.S. Perlin, Carbohydr. Res. 210, 299-310 (1991)].

본 발명은, 출발 과황산화 글리코스아미노글리칸의 유기 염기의 염을 제조하고, 상기 염을 부분적으로 가용매 탈황산화(solvolithic desulfation)하고 상기 부분적 탈황산화 생성물을 N-재황산화(N-resulfation)하여, 여러가지 종류의 과황산화된 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan)으로부터 얻은 것으로, 시험관내에서 높은 항혈전용해 활성(antitrombotic activity)을 갖는 글리코스아미노글리칸에 관한 것이다.

도 1a는 본 발명의 실시예 1에서 출발 물질로 사용되는 나트륨염의¹³C-NMR 스펙트럼을 보여준다.

도 1b는 본 발명의 실시예 1에 따라 탈황산화된 생성물의¹³C-NMR 스펙트럼을 보여준다.

도 1c는 본 발명의 실시예 2에 따라 탈황산화된 생성물의¹³C-NMR 스펙트럼을 보여준다.

도 1d는 실시예 3에 따라 탈황산화된 생성물의¹³C-NMR 스펙트럼을 보여준다.

본 발명을 예시하기 위하여 하기의 실시예가 주어진다.

본 발명의 발명자들은, 시험관내에서 높은 항혈전용해 활성을 가지며, 위치 2에서 황산화되고 위치 3에서 황산화되지 않은 아이두론 단위를 20% 이상 그리고 위치 3 및 위치 6에서 황산화된 설파미노글루코스아민 단위를 30% 이상 함유하고, 2.0 내지 3.5의 황산/카르복실 몰비를 갖는 글리코스아미노글리칸을 얻을 수 있는 방법을 발견하였다.

상기의 방법은 여러가지 종류의 과황산화된 글리코스아미노글리칸을 출발물질로 이용한다. 또한, 상기의 방법은,

a)출발 과황산화 글리코스아미노글리칸의 유기 염기의 염을 제조하는 단계와;

b)상기의 단계 a)의 유기 염기의 염을 부분적으로 가용매 탈황산화하는 단계와;

c)상기의 단계 b)의 부분적으로 탈황산화된 생성물을 N-재황산화화하는 단계와;

d)상기의 단계 c)의 생성물을 임의적으로 6-O-재황산화화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로한다.

본 발명에 따른 높은 항혈전용해 활성을 갖는 글리코스아미노글리칸의 특징 및 장점과 이와 관련된 제조 방법은 하기의 상세한 설명에서 대부분 예시된다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 출발 물질로서는 여러가지 종류의 과황산화된 글리코스아미노글리칸이 사용될 수 있는데, 특히 하기의 것들이 사용될 수 있다: 1,500 내지 8,000 달톤의 분자량을 갖는 저분자량 과황산화 헤파린(ssLMWH); 8,000 내지 20,000 달톤의 분자량을 갖는 고분자량 과황산화 헤파린; 1,500 내지 8,000 달톤의 분자량을 갖는 저분자량 과황산화 황산헤파란; 8,000 내지 25,000 달톤의 분자량을 갖는 고분자량 과황산화 황산헤파란; N-황산화된 K5 다당류로부터 얻은 에피머화 및 에피머화되지않은 생물공학적 과황산화 황산헤파란 및 헤파린.

알려진 바와같이, 상기 과황산화된 글리코스아미노글리칸은, 히드록실의 모든 수소 또는 대부분의 수소가 SO₃-기로 치환된 글리코스아미노글리칸이며, 이들은 다음문헌[M.L. Wolfrom등, J. Am. Chem. Soc. 75, 1519(1953); Nagasawa 등, Carbohydr. Res. 158, 183-190(1986); 유럽특허 제 214,879호(1986); 미합중국 특허 제 4,727,063호; Naggi 등, Biochem. Pharmacol. 36, 1895-1900(1987); Ogamo 등, Carbohydr. Res. 193, 165-172(1989)]에 설명된 방법에 따라 제조된다.

본 발명의 방법은 하기의 단계들에 따라 수행된다:

a)출발 과황산화 글리코스아미노글리칸의 유기 염기의 염의 제조.

상기 유기 염기는 피리딘, 테트라메틸 암모늄 및 테트라부틸 암모늄으로부터 선택된다. 나트륨 염 형태의 출발 과황산화 글리코스아미노글리칸을 증류수에 용해시키고 양이온 교환 칼럼에 통과시킨다. 얻어진 용액에, 실온에서, pH 9에 도달하도록 하는 양의 유기 염기를 부가하여 염을 얻은 다음, 상기 염을 냉동건조한다.

b)상기 단계 a)에서 얻은 염의 부분적 가용매 탈황산화.

상기 단계 a)에서 얻은 유기 염기의 염을 5 내지 10%의 메탄올 또는 H₂O를 함유하는 비양성자성 극성 용매의 용액, 바람직하게는 10%의 메탄올을 함유하는 DMSO의 용액으로 처리한다. 이때, 상기 용액과 상기 유기 염기사이의 중량비는 50:1 내지 100:1 이다. 얻어진 용액을, 50 내지 90℃의 온도에서 5 내지 480분동안 교반하면서 가열하여 상기 염을 부분적으로 탈황산화시킨다. 이어서, 상기 반응 혼합물에 중성 pH가 되도록 물 및 0.25N NaOH를 부가하고, 얻어지는 생성물에 pH 9가 되도록, 아세트산나트륨 포화 EtOH를 부가하여 침전시킨다. 이어서, 상기 생성물을 컷-오프(cut-off) 2000 막을 통해 투석한 다음, 겔 여과로 탈염한다.

c)상기 단계 b)에서 얻은 생성물의 N-재황산화.

상기 단계 b)에서 얻은 생성물을 10/0.1 내지 10/1 ml/g의 양으로 물에 용해시키고 얻어진 용액에 pH 9가 되도록 NaHCO₃를 부가한 다음, 상기 생성물과 동일한 중량의 삼산화황 트리메틸아민을 부가한다. 얻어지는 혼합물을 50-60℃까지 2시간동안 가열하고 다시 동일한 양의 삼산화황 트리메틸아민을 부가한 다음, 동일 온도에서 24시간동안 가열을 계속한다. 얻어지는 생성물에 아세트산나트륨 포화 EtOH를 부가하여 침전시킨 다음, 처음에는 NaCl 용액에서 그리고 나중에는 증류수에 용해시켜서 컷-오프 2000 막을 통해 투석하고 끝으로 겔 여과하여 탈염시킨다.

d)상기 단계c)에서 얻은 생성물의 임의적인 6-O-재황산화.

NMR 분석 결과에 따라 글루코스아민의 위치 6에서 30%이상 황산화된 생성물은 공지의 방법에 따라 6-O-재황산화될 수 있다. 참조문헌[K. Nagasawa, H. Vchiyama 및 N. Wajiama, Carbohydr. Res. 158(1986)183-190].

얻어진 생성물은 하기와 같은 특징을 나타낸다:

-위치 2에서 황산화되고 위치 3에서 황산화되지 않은 아이두론 단위가 20% 이상이다.

-천연 헤파린의 항트롬빈에 대한 활성 부위에서와 같이, 위치 3 및 위치 6에서 황산화된 설파미노글루코스아민 단위가 30% 이상이다.

-황산/카르복실 몰비가 2.0 내지 3.5이다.

-시험관내에서 항-Xa 활성이 100 내지 150U/mg 이다.

위치 2에서 황산화되고 위치 3에서 황산화되지 않은 아이두론 단위의 함량 및 위치 3에서 황산화된 설파미노글루코스아민 단위의 함량은 측정된 단위 및 측정된 황산화 유형에 구체적으로 기인할 수 있는 신호들의 통합에 기초한 NMR 분석에 따라 측정되었다. 참조문헌[E. A. Yates, F. Santini, M. Guerrini, A. Naggi, G.Torri, B. Casu:¹H and¹³C NMR spectral assignments of the major sequences of twelve systematically modified heparin derivates, Carbohydr. Res. 294, 15-27(1996)]. 황산/카르복실 몰비는 전기전도도법에 따라 측정되었다. 참조문헌[B.Casu and U. Gennaro: A simple conductometric method for determning the sulfate and carboxylate groups of heparin and chondroitin sulfate, Carbohydr. Res. 39, 168-176(1975)]. 시험관내에서 항-Xa 활성은 발색 방법에 따라 측정되었다. 참조문헌[A. N. Teien 등, Thrombosis Res. 8, 168-176(1975)].

특히 본 발명은 저분자량 헤파린(1,500 내지 8,000 달톤), 고분자량 헤파린(8,000 내지 18,000 달톤), 저분자량 황산 헤파란(1,500 내지 8,000 달톤), 고분자량 황산 헤파란(8,000 내지 25,000 달톤), 및 K5 다당류로부터 얻은 황산헤파란 및 헤파린으로 이루어진 그룹에 속하는 글리코스아미노글리칸에 관한 것이다. 그 특성때문에, 본 발명에 따른 글리코스아미노글리칸은 항혈전용해를 위한 치료에 적당한 제약 조성물의 제조를 위하여, 약리학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제와 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 1,500mg/day 투여량의 상기 글리코스아미노글리칸을 투여하는 것으로 이루어지는, 혈전 용해의 치료 및 방지를 위한 치료법에 관한 것이다.

실시예 1:높은 항혈전용해 활성을 갖는 저분자량 헤파린의 제조.

a)과황산화된 저분자량 헤파린(ssLMWH)(G1074/4)의 피리딘 염의 제조.

미합중국 특허 제 4,727,063호 및 다음문헌[Naggi 등, Biochem. Pharmacol. 36, 1895-1900(1987)]에 설명된 방법에 따라 돼지의 장 점막으로부터 유도한 상업적인 헤파린으로부터 얻은 것으로, 87U/mg 의 항-Xa 활성 및 도 1a의¹³C NMR 스펙트럼을 갖는 5,000 달톤 분자량의 ssLMWH의 나트륨 염 360mg을, 증류수(30ml)에 용해시키고 양이온 교환 칼럼(H⁺형태의 AMBERLITE IR 120)에 통과시켰다. 얻어진 용액을 피리딘을 이용하여 pH 9로 조절하였다. 이와같이 얻어진 과황산화된 저분자량 헤파린의 피리딘 염을 냉동 건조시켰다.

b)ssLMWH의 피리딘 염의 탈황산화.

상기에서 얻은 과황산화된 저분자량 헤파린의 피리딘 염을 10% DMSO/MeOH(25ml)의 용액에 용해시켰다. 얻어진 용액을 80℃로 15분동안 오일 중탕에서 교반하면서 가열하였다. 반응의 종료시에 15ml의 물을 부가하고 그 용액을 0.25 N NaOH를 이용하여 중화시켰다. 상기 반응 생성물에 60ml의 아세트산나트륨 포화 EtOH를 부가하여 침전시키고, 증류수에 용해시켜서 컷-오프 2000 막을 통해 48 시간동안 투석한 다음, Sephadex G25상에서 겔 여과하여 탈염시켰다. 얻어진 생성물은 아래와 같은 특징을 나타낸다: 도 1b의¹³C NMR 스펙트럼으로부터, 전체적으로 N-황산화되고(C₂NH₂:56ppm) 부분적으로 6-O-탈황산화된(C₆OH:62 ppm) 헤파린의 특징적인 신호가 확인된다. 또한, 상기 스펙트럼은 위치 3에서 황산화되지 않고 위치 2에서 황산화된 아이두론 단위의 특징적인 65ppm 신호를 보여준다.

c)상기 단계 b)의 부분적으로 탈황산화된 생성물(G2291)의 N-재황산화.

상기 단계 b)에서 얻은 생성물 100mg을 10ml의 물에 용해시키고 NaHCO₃를 이용하여 pH 9로 조절했다. 이어서, 동일 중량의 삼산화황 트리에틸아민(TMA.SO₃)을 부가하고 그 용액을 55℃로 오일 중탕에서 교반하면서 가열하였다. 2시간후, 동일 중량의 (TMA.SO₃)를 더 부가하여 24시간동안 반응시켰다. 반응의 종료시에 상기 혼합물을 pH9로 조절했다. 상기 시료에 4배 부피의 아세트산포화 EtOH를 부가하여 침전시키고, 1N NaCl에 용해시켜서 24시간동안, 0.5N NaCl에 용해시켜서 24 시간동안, 그리고 증류수에 용해시켜서 24시간동안 컷-오프 2000 막을 통해 투석하고, Sephadex G25상에서 겔 여과하여 탈염시켰다. 얻어진 생성물은 하기와 같은 특징을 나타낸다: 황산/카르복실 몰비: 3.22, 항-Xa 활성: 152U/mg.¹H NMR 스펙트럼으로부터 충분한 N-황산화를 확인했다.

실시예 2(G2309)

30분의 탈황산화 반응 시간을 이용하여 실시예 1을 반복했다. 상기 탈황산화로부터 얻은 생성물은 도 1c에서 기록된¹³C-NMR 스펙트럼을 나타내는데, 실시예 1의 b)에서 기술된 특징을 가졌다. N-재황산화한 후 얻어진 생성물은 110U/mg의 항-Xa 활성을 나타냈다.¹H NMR 스펙트럼으로부터 충분한 N-황산화를 확인했다.

실시예 3(G2301)

a)45분의 탈황산화 반응 시간을 이용하여 실시예 1을 반복했다. 상기 탈황산화로부터 얻은 생성물은 도 1d에서 기록된¹³C-NMR 스펙트럼을 나타내는데, 실시예 1의 b)에서 기술된 특징을 가졌다. N-재황산화한 후,¹H NMR 스펙트럼으로부터 충분한 N-황산화를 확인했다.

b)상기 N-재황산화된 생성물을 상기의 상세한 설명에서 기재된 방법에 따라 6-O-재황산화시켰다.

실시예 4

실시예 1의 b)에서의 시간 및 온도를 변화시키고 65℃에서 1.5시간동안 정밀하게 조작하면서 실시예 1을 반복했다. 탈황산화로부터 얻은 생성물은 도 1b, 1c 및 1d와 유사한¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 위치 3에서 탈황산화되고 위치 2에서 황산화된 아이두론 단위의 특징적인 65ppm에서의 신호가 상당한 양으로 존재하지만, 실시예 1의 b)의 조건하에서 얻은 양보다는 낮다.

실시예 5

a)45분의 탈황산화 반응 시간 및 90℃의 탈황산화 온도를 이용하여 실시예 1을 반복했다. 상기 탈황산화로부터 얻은 생성물은 실시예 1의 b)에서 기술된 것과 유사한 특징을 갖는¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 그러나, 위치 6에서 황산화된 글루코스아민의 신호 특징은 더 높은 온도 및 더 짧은 시간으로 얻은 생성물의 스펙트럼과 비교하여 현저하게 더 낮고, 상기 위치에서 황산화되지 않은 글루코스아민의 신호 특징은 현저하게 높다.

b)상기 생성물을 상기의 상세한 설명에서 기재된 방법에 따라 6-O-재황산화시켰다.

실시예 6

과황산화된 고분자량 헤파린(12,000 달톤)으로부터 출발하고, 그 피리딘 염을 SO₃/피리딘 첨가생성물(유리 히드록실에 대한 몰비 3:1)을 이용하여 55℃로 5시간동안 DMF에서 처리하여 실시예 1을 반복했다. 얻어진 생성물(황산/카르복실 몰비 3이상; 위치 2에서 황산화되고 위치 3에서 황산화되지 않은 아이두론 단위의 특징적인 75ppm에서의¹³C-NMR 신호)을 실시예 1c)에서 설명된 바와같이 N-재황산화했다. 저분자량 헤파린에 대하여 다음 표 1에서 예시한 바와같이, 얻어진 생성물의 항혈전용해 활성(시험관내에서 Xa 인자의 억제로 나타내어짐)은, 상기 출발 과황산화 생성물 또는 오늘날 상업적으로 입수가능하고 치료에 사용되는 저분자량 헤파린과 비교하여 현저하게 높다.

표 1: 항-Xa 활성*

	제 1 세트	제 2 세트
LMW-H	-	100
ssLMWH(G1074/4)	100	-
G1074/4로부터 15'탈황산화(G2281)	175	162
G1074/4로부터 30'탈황산화(G2309)	125	125

*U/mg. 과황산화된 저분자량 헤파린(ssLMWH)에 대하여 제 1 세트에서 표준화된 값 및 상업적인 제품인 "Fraxieparin" 과 "Lovenox"의 1:1 중량비의 혼합물(LMWH)에 대하여 제 2 세트에서 표준화된 값.

실시예 7-17

사용되는 글리코스아미노글리칸의 설명.

-돼지의 장 점막으로부터 얻은 고분자량 HMWH를 갖는 상업적인 헤파린(Mw=12,000 Da, 항-Xa 활성 192 U/mg)(실시예 7,8,9,10)

-상업적인 황산 헤파란(HS). 아이두론 산과 글루쿠론산 사이의 비는 사용되는 헤파란에 따라 변화한다:

30% 아이두론산, 70% 글루쿠론산(실시예 11)

40% 아이두론산, 60% 글루쿠론산(실시예 12)

-K5 다당류(K5-PS)(실시예 13,14)

-에피머화된 K5 다당류(eK5-PS). 에피머화도는 사용되는 eK5-PS에 따라 변화한다.

30% 아이두론산, 70% 글루쿠론산(실시예 15)

60% 아이두론산, 30% 글루쿠론산(실시예 16,17)

a)과황산화된 기질의 제조.

사용되는 기질의 나트륨 염 1.5g을 증류수(30ml)에 용해시키고 양이온 교환 칼럼(H⁺형태의 AMBERITE IR 120)에 통과시켰다. 얻어진 용액을, 에탄올에 용해된 10% 수산화암모늄 테트라부틸 용액을 이용하여 pH 9로 조절했다. 이렇게 얻은 테트라부틸 암모늄 염을 냉동건조했다. 상기 기질의 테트라부틸 암모늄 염을 DMF(60ml)에 용해한 다음, 삼산화황 피리딘(Py.SO₃)을 유리 히드록실에 대하여 3 당량의 양으로 부가하고, 그 용액을 55℃로 오일 중탕에서 밤새 교반하면서 가열했다. 반응의 종료시에, 5ml의 물을 부가하고 그 반응 생성물에, 200ml의 아세트산나트륨 포화 EtOH를 부가하여 침전시키고, 증류수에 용해시켜 48시간동안 컷-오프 6000-8000 투석 막을 통해 투석한 다음, Sephadex G25상에서 겔 여과하여 탈염했다. 얻어진 생성물은 하기의 특징을 나타낸다.

¹³C-NMR 스펙트럼은 완전히 N-탈황산화된(A2NH2)C2:56ppm 글루코스아민 및 전체적으로 6-O-황산화된(A6S)C6 69ppm의 특징적인 신호, 및 동일한 잔기(U2,3S)상의 위치 2 및 3에서 황산화된 우론 단위 C1 A 101ppm의 특징적인 신호를 나타낸다. 우론 단위에서 얻은 황산화 정도는 사용되는 글리코스아미노글리칸에 따라 변화한다. 얻어진 과황산화 생성물에 대한 데이터가 표 2에서 제시된다.

b)과황산화 기질(ssHMWH0의 피리딘 염의 제조.

상기 단계 a)에서 기술된 방법에 따라 얻은 나트륨 염 1g을 증류수(30ml)에 용해시키고 양이온 교환 칼럼(H⁺형태의 AMBERITE IR 120)에 통과시켰다. 얻어진 용액을 피리딘을 이용하여 pH 9로 조절했다. 이렇게 얻은 피리딘 염을 냉동건조했다.

c)과황산화된 기질의 피리딘 염의 탈황산화.

상기와 같이 얻은 피리딘 염 100mg을 DMSO/MeOH 10%(10ml)의 용액에 용해했다. 그 용액을 표 3에서 제시한 온도 및 시간을 이용하여 오일 중탕에서 교반하면서 가열했다. 반응의 종료시에, 5ml의 물을 부가하고 그 반응 생성물에, 100ml의 아세트산나트륨 포화 EtOH를 부가하여 침전시키고, 증류수에 용해시켜 48시간동안 컷-오프 6000-8000 투석 막을 통해 투석한 다음, Sephadex G25상에서 겔 여과하여 탈염했다. 얻어진 생성물은 표 3에서 기술된 특징을 나타낸다.

d)단계 a)로부터 얻은 부분적으로 탈황산화된 생성물의 N-재황산화

단계 c)에서 얻은 생성물 100mg을 물 10ml에 용해시키고 NaHCO₃를 이용하여 pH 9로 조절했다. 이어서, 동일한 중량의 삼산화황 트리메틸아민(TMA.SO₃)를 부가하고 그 용액을 55℃로 오일 중탕에서 교반하면서 가열했다. 2 시간후, 동일 중량의 TMA.SO₃를 더 부가하고, 24시간동안 반응했다. 반응의 종료시에, 5ml의 물을 부가하고 그 반응 생성물에, 50ml의 아세트산나트륨 포화 EtOH를 부가하여 침전시키고, 증류수에 용해시켜 48시간동안 컷-오프 6000-8000 투석 막을 통해 투석한 다음, Sephadex G25상에서 겔 여과하여 탈염했다.

¹³C-NMR 스펙트럼은 얻어진 생성물이 완전히 N-재황산화 되었음을 나타낸다. 얻어진 생성물에 있어서, 황산/카르복실 비(DS)로 표시되는 황산화도, 분자량(Mw) 및 생물학적 활성(aPTT, 항IIa 및 항 Xa)을 측정하였다. 얻어지는 데이터가 표 4에서 제시된다.

표2: a)에서 설명한 바와같이 얻은 과황산화 글리코스아미노글리칸의 설명

실시예	기질	GAC	% A6S	% UOH+U3S	% U2S+U2,3S
7,8,9,10	ss-HMWH	2522	100	0	100
11	ss-LMWH	1079/4	100	5	95
12	ss-HS	2460	100	50	50
13	ss-HS	2648	n.a.	n.a.	n.a.
14-15	ss-K5-PS	2444	100	0	100
16	ss-eK5-PS	2611	100	0	100
17	ss-eK5-PS	2721	n.a.	n.a.	n.a.

표 3:사용되는 반응 조건(기질, 온도 및 시간) 및 얻어진 생성물의 특징의 설명

실시예	기질	GAG	온도℃	시간(h)	%A6S	%UOH+U3S	%12S	%G3S
7	HMWHep	2541A	65	4	39	35	54	n.a.
8	HMWHep	2632A	65	8	30	44	54	n.a.
9	HMWHep	2632B	65	16	5	50	54	n.a.
10	HMWHep	2541B	65	24	5	59	42	n.a.
11	LMWHep	2474	65	4	25	54	46	n.a.
12	HS	2556	65	4	50	60	20	25
13	HS	2734	80	30분	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.
14	K5-PS	2451A	80	45분	40	48	-	52
15	K5-PS	2451B	80	75분	20	50	-	50
16	eK5-PS	2622	65	4	30	n.a.	n.a.	20
17	eK5-PS	2737	80	30분	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.

표 4:N-재황산화후에 얻은 생성물 및 그 특징의 설명

실시예	GAG	DS	Mw	aPTT	항 IIa	항 Xa
7	2557	1.8	12000	n.a.	n.a.	110
8	2632BNS	n.a.	10300	n.a.	n.a.	99
9	2632ANS	n.a.	7600	n.a.	n.a.	7
10	2565	1	11000	n.a.	n.a.	3
11	2374NS	1.5	7400	10	273	130
12	2556NS	n.a.	n.a.	70	1230	65
13	2734NS	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.
14	2459A	2.4	n.a.	97	470	10
15	2459B	2.3	n.a.	32	114	5
16	2822NS	n.a.	n.a.	48	500	13
17	2737NS	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.

Claims

위치 2에서 황산화되고 위치 3에서 황산화되지 않은 아이두론 단위를 20% 이상, 그리고 위치 3 및 위치 6에서 황산화된 설파미노글루코스아민 단위를 30% 이상 함유하고, 2.0 내지 3.5의 황산/카르복실 몰비를 갖으며, 시험관내에서 높은 항혈전용해 활성을 갖는 글리코스아미노글리칸.
제 1 항에 있어서, 저분자량 헤파린(1,500 내지 8,000 달톤)으로 이루어지는 글리코스아미노글리칸.
제 1 항에 있어서, 고분자량 헤파린(8,000 내지 18,000 달톤)으로 이루어지는 글리코스아미노글리칸.
제 1 항에 있어서, 저분자량 황산헤파란(1,500 내지 8,000 달톤)으로 이루어지는 글리코스아미노글리칸.
제 1 항에 있어서, 고분자량 황산헤파란(8,000 내지 25,000 달톤)으로 이루어지는 글리코스아미노글리칸.
제 1 항에 있어서, 황산헤파란 및 K5 다당류로부터 얻은 헤파린으로 이루어지는 글리코스아미노글리칸.
여러가지 종류의 과황산화된 글리코스아미노글리칸으로부터 출발하여 제 1 항의 글리코스아미노글리칸을 제조하는 방법으로서,

a)상기 출발 과황산화 글리코스아미노글리칸의 유기 염기의 염을 제조하는 단계와;

b)상기 단계 a)의 유기 염기의 염을 부분적으로 가용매 탈황산화하는 단계와;

c)상기 단계 b)의 부분적으로 탈황산화된 생성물을 N-재황산화하는 단계와;

d)상기 단계 c)의 생성물을 임의적으로 6-O-재황산화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 출발 과황산화된 글리코스아미노글리칸은 저분자량의 과황산화된 헤파린(1,500 내지 8,000 달톤), 고분자량의 과황산화된 헤파린(8,000 내지 20,000 달톤), 저분자량의 과황산화된 황산헤파란(1,500 내지 8,000 달톤), 고분자량의 과황산화된 황산헤파란(8,000 내지 25,000 달톤), 및 에피머화되었거나 에피머화되지않은 N-황산화 K5 다당류로부터 얻은 생물공학적 과황산화 황산헤파란 및 헤파린으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단계 a)는 상기 출발 글리코스아미노글리칸의 나트륨 염 용액을 유기 염기를 이용하여 pH 9가 되도록 처리함으로써 달성되는 것을 특징으로하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단계 b)의 탈황산화는, 상기 단계 a)에서 얻은 유기 염기의 염을, 50 내지 80℃의 온도에서 5 내지 480분동안, 용매와 상기 유기 염기사이의 중량비가 50:1 내지 100:1이 되도록하는 하는 양의 메탄올 또는 H₂O 함유 비양성자성 극성 용매로 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단계 c)의 N-재황산화는, 상기 단계 b)에서 얻은 생성물의 수용액을, 동일한 중량의 삼산화황 트리메틸아민을 이용하여 pH 9가 되도록 처리한 다음, 50-60℃의 온도까지 가열하고 이어서 다시 동일한 중량의 삼산화황 트리메틸아민을 부가함으로써 수행되는 것을 특징으로하는 방법.
제 1 항의 글리코스아미노글리칸을 1 내지 1,500 mg/day의 양으로 투여하는 것을 포함하는 혈전용해의 치료를 치료 방법.